CN203479810U - 小鼠s100钙结合蛋白b酶联免疫吸附测定试剂盒 - Google Patents

Abstract

本实用新型公开了小鼠S100钙结合蛋白B联免疫吸附测定试剂盒，包括酶标板，所述酶标板包括固相载体和包被层，其特征在于：所述固相载体上设置有多个微孔，所述包被层附着在所述固相载体的微孔表面，所述包被层是由抗小鼠S100钙结合蛋白B抗体和牛血清白蛋白依次涂布在所述固相载体的微孔表面上形成的复合层。本实用新型的试剂盒操作简便，成本低，稳定性好，可以满足普通实验室的要求。

Description

小鼠S100钙结合蛋白B酶联免疫吸附测定试剂盒

技术领域

本实用新型属于涉及生物技术领域，具体而言，涉及小鼠S100钙结合蛋白B酶联免疫吸附测定试剂盒。

背景技术

S100钙结合蛋白B(S100B)由Moore等于1965年首先在牛脑组织中发现，S100B蛋白是S100蛋白的家族成员之一，属于EF-hand超家族，是一种分子量较小的酸性钙结合蛋白。主要由星形胶质细胞合成并分泌，但少突胶质细胞、小胶质细胞、神经元室管膜细胞、淋巴细胞、脉络丛上皮细胞也会少量合成S100B。

S100B蛋白被认为是一种钙传感器蛋白，通过钙离子信号转导途径在细胞增殖、分化、肌肉收缩、基因表达及细胞凋亡中发挥重要作用。S100B蛋白在脑、软骨、骨骼肌细胞的生长及修复过程中可激活细胞增殖与迁移，抑制细胞凋亡和分化；在颅脑损伤及神经变性过程中可活化星形胶质细胞；在心肌梗死后可调节心肌细胞的重塑；调节细胞内Ca2+的内稳态；在黑色素瘤及胶质瘤的发病过程抑制P53的磷酸化。S100B蛋白作为中枢神经系统损伤的重要血清学标志物研究得较为广泛。S100B蛋白作为星型胶质细胞活跃的标志物，对精神疾病患者尤其是精神分裂症患者的病情评估具有指导性意义。S100B蛋白对其他系统疾病也有着重要的研究价值。S100B蛋白的检测有助于多种疾病的诊断、病情进展评估、治疗检测及预后判断，有着更为广阔的应用前景。

S100B蛋白的检测主要采用免疫学方法，常用方法有放射免疫分析法(RIA)，免疫放射测定法(IRMA)，高效液相色谱法(HPLC)，荧光免疫法(FIA)，免疫组织化学法(IHC)，聚合酶链式反应法(PCR)，酶联免疫吸附试验(ELISA)。

RIA和IRMA由于存在放射污染和危害,常用核素的半衰期短,试剂盒稳定期不长及不易快速、灵活的自动化分析等诸多不足而应用受限。Wiesmann等建立的荧光双抗体夹心法灵敏度较高,可达到0.015μg/L,具有良好的可重复性,能实现自动化检测,但仪器设备价格昂贵,因此不易于普及。而使用免疫组织染色检测S100B虽然也可以测得μg/ml以上的含量，但由于现今免疫组织染色中还存在着一些问题，比如说组织固定问题，抗原修复问题以及阳性对照问题等，这些问题也严重制约了免疫组织染色方法的发展和普及；RT-PCR主要通过检测mRNA来预测S100B的量，需要使用荧光定量PCR仪，一次性投资大，价格昂贵，不适合一般实验室使用。

高效液相色谱法（HPLC）具有灵敏度高、准确性和重复性好等优势，但需要昂贵的仪器设备，而且检测过程繁琐、样本前处理的技术要求很高，难于操作。检测人员需要具备专业的检测技能和丰富的实验经验。

酶联免疫吸附测定（ELISA）检测技术是在RIA基本理论的基础上发展起来的一种非放射性标记免疫分析技术。利用抗原-抗体之间特异性的免疫反应识别生物液体中的靶分子，并利用酶-底物的显色反应定量的反应待测样本中靶分子的含量。由于其特异性强、灵敏度、操作简便及不需大型仪器等优点，现广泛用于生物样本的定量检测实验中。ELISA检测试剂盒中的关键因素是获得高特异性、高亲和力的单克隆抗体。目前小鼠是科研实验室最常用的实验动物，但由于S100B来源于小鼠，所以常规的小鼠单克隆抗体的制备方法在这里是行不通的。而大鼠单抗的制备则可以解决这个问题，同时大鼠抗体具有一些小鼠抗体不具备的特点，大鼠抗体分子的轻链95%为κ型。因此可以利用小鼠抗大鼠抗体Igκ-1a抗体，高度特异性地结合杂交瘤产生的Igκ-1a的单克隆抗体，然后达到去除宿主大鼠产生的非特异性Igκ-1b抗体的目的，从而分离纯化得到高纯度的抗体。

因此，有必要选用一种快速、简便能够定量且灵敏度、准确度和特异性高的方法来进行小鼠S100钙结合蛋白B的检测。

实用新型内容

本实用新型目的制备是小鼠S100钙结合蛋白B酶联免疫吸附测定试剂盒，其具备操作简便，成本低，稳定性好，可以满足普通实验室的要求的特点。为了实现本实用新型的目的，拟采用如下技术方案：

本实用新型一方面涉及一种小鼠S100钙结合蛋白B酶联免疫吸附测定试剂盒，包括酶标板，所述酶标板包括固相载体和包被层，其特征在于：所述固相载体上设置有多个微孔，所述包被层附着在所述固相载体的微孔表面，所述包被层是由小鼠S100钙结合蛋白B抗体和牛血清白蛋白依次涂布在所述固相载体的微孔表面上形成的复合层。

在本实用新型的一个优选实施方式中，所述的多个微孔是指96个微孔。

在本实用新型的一个优选实施方式中，所述的固相载体是聚苯乙烯试剂板。

本专利通过高效的偶联方法的得到稳定性好的小鼠S100钙结合蛋白B，并通过免疫动物得到特异性高及亲和力强的抗体，用来制备小鼠S100钙结合蛋白B酶联免疫吸附测定试剂盒。通过与HCLP检测方法比较，其灵敏度、精密度、准确性和试剂盒有效期等方面均优于HPLC法，更适用于基层实验室。同时试剂盒具有稳定性高和低毒性的优点，且实验操作较RIA法及质谱法简单、不需特殊防护、周期短，可以满足普通实验室的要求。

附图说明

图1为本实用新型一具体实施例酶标板结构示意图。

1固相载体，2微孔，3包被层。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本实用新型作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本实用新型并能予以实施，但所举实施例不作为对本实用新型的限定。

如图1所示，本实用新型试剂盒的酶标板，其包括固相载体1和包被层3，固相载体1采用96孔聚苯乙烯试剂板(PS)。固相载体1上有多个微孔2，包被层3附着在固相载体上的微孔2上。包被层3是包括小鼠S100钙结合蛋白B和牛血清白蛋白的复合层。

具体实施方式：

主要的技术路线如下：

小鼠S100钙结合蛋白B酶联免疫试剂盒的制备方法，其具体步骤为

a、小鼠S100钙结合蛋白B抗原的制备：

采用分子克隆技术，设计引物、酶切、转化、表达以及SDS-PAGE电泳鉴定获得小鼠S100钙结合蛋白B重组蛋白。

b、抗小鼠S100钙结合蛋白B多克隆抗体的制备：

健康雄性新西兰大白兔1只，用小鼠S100钙结合蛋白B重组蛋白免疫。将重组的小鼠S100钙结合蛋白B重组蛋白调整至1mg/ml，取1ml蛋白，加入等体积的弗氏完全佐剂充分乳化混匀。兔后足垫、背部皮下多点免疫，每只500ul。14d后，以小鼠S100钙结合蛋白B重组蛋白溶液加等体积的弗氏不完全佐剂进行加强免疫，剂量与基础免疫剂量相同。每两周免疫一次，共免疫四次，第四次免疫后14天，从颈动脉取全血，测定抗体效价。

c、抗小鼠S100钙结合蛋白B大鼠单克隆抗体的制备：

1)细胞培养

小鼠SP2/0骨髓瘤细胞细胞培养于10%新生牛血清的RPMIl640培养液中，培养条件为：5%CO₂，37℃。

2)免疫动物

选用3月雌性裸大鼠，从浓度为1mg/ml的小鼠S100钙结合蛋白B重组蛋白溶液中取0.4ml与等体积的完全Freund’s佐剂混合，在0、15和28d大鼠后足足底免疫，10d后用琼脂糖双向扩散法检测，等到抗体浓度达到1mg/ml时，即完成免疫。在最后一次免疫后3天后取腹股沟淋巴结B细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合。

3)试剂

HAT选择性培养液，Hypoxanthine-aminopterin-thymidine(HAT)(50X)，HyPoxanthine-thymidine(HT)(50X)。

PEG融合剂:5g的PEG-4000溶解于7ml的EMEM培养液中，56℃10min，120℃15min除菌，加入lmlDMSO，经0.22μM的Millipore过滤除菌，分装成每管2ml，于37℃保存。

滋养细胞:融合前2d取大鼠腹腔巨噬细胞，浓度为2.0×10⁵cell/ml，每孔0.1ml接种于96孔板内。

4)细胞融合

取对数生长期的SP2/0细胞和免疫的大鼠B细胞，用融合液EMEM洗两次，计数细胞，以1个SP2/0细胞和5个B细胞的比例混合细胞，离心1000rpm，5min，移去上清，轻轻打松细胞团块，在37℃、90秒内加入lml的PEG，经过30秒摇动，在90秒内逐滴加入lml的融合液，最后加入20mlEMEM培养液稀释PEG，800rpm离心5min，重悬细胞于选择性HAT培养液中，调节细胞密度为10⁶脾细胞/ml，每孔0.lml接种于铺有滋养细胞的96孔板中。

5)筛选及抗休的制备:

融合后14d，可见克隆形成，待克隆长大至相当1/3孔时，用ELISA检测有杂交瘤细胞的培养上清，阳性孔进行两次的有限稀释法进行克隆，获得稳定分泌抗休的杂交瘤细胞株，并将杂交瘤细胞接种于裸大鼠的腋窝皮下，3星期后长成一个2×2cm³以上的实休瘤，研磨制成杂交瘤细胞悬液，接种于裸大鼠大鼠腹腔内，产生含有单克隆抗休的腹水。

6）免疫亲和柱的制备:

用硫酸铵沉淀法粗提单抗，用亲和层析法纯化分离得到特异性高的抗S100B的抗体。采用亲和层析法纯化大鼠腹水中的特异性抗体。将上述重组蛋白偶联到亲和层析柱上，制备成能分离抗小鼠S100钙结合蛋白B抗体的亲和层析柱。

抗小鼠S100钙结合蛋白B抗体的纯化具体步骤如下：将200-300ml大鼠腹水样本直接从小鼠S100钙结合蛋白B抗原偶联的层析柱进样口上样，流速为1ml/min。用0.1mol/LpH8.0磷酸缓冲液（30-40ml）洗脱杂蛋白后，再用0.01mol/LpH8.0磷酸缓冲液（20-30ml）洗脱，流速为2ml/min。最后用0.1mol/LGly-HCl洗脱缓冲液洗脱，流速为1.5ml/min，收集样本洗脱液，透析浓缩后备用。采用间接ELISA法进行鉴定，抗体效价为1:1000000-1:2500000。

1、ELISA试剂盒的研制：

本试剂盒应用双抗体夹心酶联免疫分析法测定小鼠血清或血浆样本中S100钙结合蛋白B的水平。制备过程如下：使用96孔聚苯乙烯试剂板（PS）作为固相载体，先将其置于紫外光下辐照2h，使PS板活化。在试剂板微孔条上预先包被一定浓度的抗小鼠S100钙结合蛋白B大鼠单克隆抗体，4℃过夜，经洗板及牛血清白蛋白封闭处理后制成包被好的酶标板。检测时，向微孔中依次加入标准品和标本，其中的S100钙结合蛋白B与连接于固相载体上的抗体结合，洗板之后加入生物素化的抗小鼠S100钙结合蛋白B多克隆抗体，将未结合的生物素化抗体洗净后，加入HRP标记的亲和素，再通过亲和素化辣根过氧化物酶（HRP)放大信号，以3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）及硫酸分别作为底物及终止液，完成小鼠S100钙结合蛋白B的酶联吸附测定试剂盒的制备。

经过对试剂盒一系列的质量指标检测，包括灵敏度、重复性、特异性、回收率及线性测定，表明该检测体系成熟，本试剂盒各项指标检测结果：

a.标准曲线

b.灵敏度：ELISA法检测小鼠血清标本时最低检测限为5.1pg/ml；

c.回收率：用同一血清样本分别添加不同量的定值标准品，作回收试验（n=5）。平均回收率96.87%（表2）。

表2ELISA法测定S100B的回收试验

定值标准品(pg/ml)	回收率（%）
		800	98.75
350	94.23
		40	97.62
平均回收率	96.87

3、发明专利技术路线1中所述的小鼠S100钙结合蛋白B酶联免疫吸附测定试剂盒的研制方法，其特征在于：本发明的利用新的免疫方法、新的制备大鼠杂交瘤细胞方法制备针对小鼠蛋白的单抗和试剂盒的制备方法，比常规的检测方法灵敏度更高、特异性好，弥补了小鼠单抗的局限性。技术效果

我们对比了ELISA法（本公司生产的小鼠S100钙结合蛋白B酶联免疫吸附测定试剂盒）和HPLC法定量检测，可见ELISA法有操作简单、快捷、试验成本低、安全、灵敏度高的特点。

表3ELISA法和HPLC法比较

1.精密度实验：

用两法对高、中、低值质控品分别进行精密度实验，实验方法为分别用这两个试剂盒测定三个定值样本800pg/ml、350pg/ml、40pg/ml，每个样本重复测定20次，表4中结果可见ELISA方法精密度较好。

表4ELISA法和HPLC法精密度测试

2.回收实验：

取不同浓度的标准品溶液（小鼠S100钙结合蛋白B钙结合蛋白B浓度为500pg/ml、350pg/ml、40pg/ml），分别加入定值血清（270pg/ml），用HPLC法和ELISA法检测，并比较测定值和预期值得到回收率（见表5）。

	ELISA法（%）	HPLC法（%）
			800pg/ml	98.63	86.25
350pg/ml	95.62	77.85
			40pg/ml	96.33	85.62

表5ELISA法和HPLC法回收率测试

当理解的是，上述具体实施方式仅仅是举例性说明，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本实用新型所附权利要求的保护范围。

Claims (3)

1.小鼠S100钙结合蛋白B酶联免疫吸附测定试剂盒，包括酶标板，所述酶标板包括固相载体和包被层，其特征在于：所述固相载体上设置有多个微孔，所述包被层附着在所述固相载体的微孔表面，所述包被层是由小鼠S100钙结合蛋白B抗体和牛血清白蛋白依次涂布在所述固相载体的微孔表面上形成的复合层。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，所述的多个微孔是指96个微孔。

3.根据权利要求1所述的小鼠S100钙结合蛋白B酶联免疫吸附测定试剂盒，所述的固相载体是聚苯乙烯试剂板。

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