CN113960313A - 一种外泌体alk融合蛋白磁免疫化学发光检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种外泌体ALK融合蛋白磁免疫化学发光检测试剂盒。所述检测试剂盒包括：磁珠悬液、ALK蛋白抗体工作液、发光激发液、标准品、稀释液、洗涤液；所述磁珠悬液中的磁珠微球包被有外泌体CD81/CD63抗体；所述ALK蛋白抗体工作液含有吖啶酯标记的ALK蛋白抗体；所述ALK蛋白抗体为ALK蛋白胞外肽段抗体1和ALK蛋白胞内肽段抗体2的组合，其中，胞外肽段抗体1与胞内肽段抗体2的比例为1～10：1，优选为4～6：1。本发明优化筛选的ALK蛋白抗组合体可特异性识别外泌体膜表面所有ALK蛋白，实现了肿瘤患者血浆中微量ALK融合蛋白的超敏检测。

Description

一种外泌体ALK融合蛋白磁免疫化学发光检测试剂盒
技术领域
本发明属于外泌体检测技术领域，具体涉及一种外泌体ALK融合蛋白磁免疫化学发光检测试剂盒。
背景技术
外泌体(exosome)是活细胞释放到细胞外的微小囊泡，直径在30-160 nm。外泌体含有细胞特异性的蛋白质、脂质和遗传物质可被运送到其他的细胞，从而改变它们的功能和生理特征。目前，越来越多的科学家们也对肿瘤细胞分泌的外泌体越来越感兴趣。血液循环中的肿瘤细胞（CTC）要到达新的位点，肿瘤细胞分泌的外泌体发挥的作用至关重要。肿瘤外泌体是肿瘤细胞与其微环境之间相互作用的重要介质，它们通过共享遗传信息或功能蛋白来调节细胞行为。肿瘤外泌体参与上皮间质转化（EMT）、肿瘤血管生成、肿瘤转移和放化疗抗性的调节。
许多研究表明，癌症患者血浆中外泌体浓度明显升高，而外泌体可表达特异性的蛋白质和RNA、DNA等，具有肿瘤生物标志物的潜能，因而被广泛应用于肿瘤液体活检中，与TCT、ctDNA一起作为液体活检的重要项目。在前列腺癌、非小细胞肺癌、鼻咽癌、结肠癌、肝癌等肿瘤中，也都发现各具特征的外泌体成分，特别是外泌体蛋白，都具有潜在的诊断价值。
ALK最早是在间变性大细胞淋巴瘤（ALCL）的一个亚型中被发现的，因此定名为间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）。ALK融合基因的产物是分子量为80KD的融合肿瘤蛋白。ALK基因融合突变是非小细胞肺癌（NSCLC）常见的一种驱动基因，中国非小细胞肺腺癌中ALK融合突变阳性的比例为5.3%。目前已经上市的ALK TKI包括克唑替尼（Crizotinib）、塞瑞替尼（Ceritinib）、阿来替尼（Alectinib）、布加替尼（Brigatinib）、以及3代的劳拉替尼（Lorlatinib）。
外泌体ALK蛋白检测属于液态活检范畴，能反映患者体内ALK蛋白表达的真实状态，可以作为预后判断和用药指导。
目前，临床上针对ALK的检测有基因水平和蛋白水平的检测，基因检测主要通过实时荧光定量PCR、FISH、二代测序，蛋白检测主要针对FFPE组织的免疫组化检测。
实时荧光定量PCR的方法：先提取患者肿瘤组织中RNA，通过逆转录转化成cDNA，在扩增反应体系中加入ALK基因的相关引物和探针，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量，通过内参或者外参法对待测样品中的ALK序列进行定量分析。该方法操作步骤繁琐、耗时长、需要昂贵的荧光定量PCR仪，只能检测到已知的ALK融合基因。
二代测序的方法：先提取患者肿瘤组织中RNA或DNA，通过多重PCR的方法或探针捕获法进行文库构建，将合格的文库进行上机测序，将待测样本的测序数据对比到人类参考基因组，分析样本中是否含有ALK融合基因以及融合基因的比例。二代测序方法操作步骤繁琐、耗时长、成本高，需要核酸抽提，文库构建，测序等复杂的步骤，必须由专业的技术人员才能完成，不适合自动化操作。
FISH的方法：将离体的肿瘤组织依次进行固定、石蜡包埋、切片、烤片、脱蜡，采用ALK融合基因的探针杂交，染色之后，在荧光显微镜下判读阳性信号与阴性信号。该方法操作步骤繁琐、耗时长、价格高，只能检测到已知的ALK融合基因，灵敏度相对较低，且只能检测组织样本。
免疫组化的方法：将离体的肿瘤组织进行固定包埋，对切片进行抗原表位修复和非特异性背景封闭后，通过ALK蛋白特异性抗体与与ALK蛋白结合，化学标记的抗抗体与ALK蛋白特异性抗体结合，最后通过显色反应确定组织细胞内ALK蛋白的量。免疫组化的方法操作步骤繁琐、耗时长、灵敏度相对较低，且只能检测组织样本。
总之，现有的ALK融合蛋白的检测方法存在诸多缺陷，ALK融合基因的检测存在成本高，操作复杂等缺点，目前临床上ALK融合蛋白的检测只针对组织样本，且存在灵敏度低等缺点。
发明内容
本发明的目的是，提供一种外泌体ALK融合蛋白磁免疫化学发光检测试剂盒。主要解决现有技术中ALK融合蛋白检测成本高、操作复杂、灵敏度低的缺点。
本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
一种外泌体ALK融合蛋白磁免疫化学发光检测试剂盒，包括：磁珠悬液、ALK蛋白抗体工作液、发光激发液、标准品、稀释液、洗涤液；所述磁珠悬液中的磁珠微球包被有外泌体CD81/CD63抗体；所述ALK蛋白抗体工作液含有吖啶酯标记的ALK蛋白抗体；所述ALK蛋白抗体为ALK蛋白胞外肽段抗体1和ALK蛋白胞内肽段抗体2的组合，其中，胞外肽段抗体1与胞内肽段抗体2的比例为1～10：1；所述胞外肽段抗体1选自ALK蛋白胞外区19-1038区间肽段的抗体；所述胞内肽段抗体2选自ALK蛋白胞内区域1060-1620区间肽段的抗体。
作为优选实施方案，所述胞外肽段抗体1与胞内肽段抗体2的比例为4～6：1，优选为5：1。
作为优选实施方案，所述胞外肽段抗体1选自以下其中之一的抗体：
序列如SEQ ID NO：1所示的ALK蛋白胞外区19-1038肽段的抗体；
序列如SEQ ID NO：2所示的ALK蛋白胞外区251-350肽段的抗体；
序列如SEQ ID NO：5所示的ALK蛋白胞外区19-300肽段的抗体；
序列如SEQ ID NO：6所示的ALK蛋白胞外区400-1038肽段的抗体。
作为优选实施方案，所述胞内肽段抗体2选自以下其中之一的抗体：
序列如SEQ ID NO：3所示的ALK蛋白胞内区域1060-1620肽段的抗体；
序列如SEQ ID NO：4所示的ALK蛋白胞内区域1366-1468肽段的抗体；
序列如SEQ ID NO：7所示的ALK蛋白胞内区域1060-1400肽段的抗体；
序列如SEQ ID NO：8所示的ALK蛋白胞内区域1400-1620肽段的抗体。
作为优选实施方案，所述磁珠悬液中含有鼠IgG抗体、多聚鼠IgG抗体、多聚兔IgG抗体、人IgG1抗体、嗜异性阻断剂HBR。
作为优选实施方案，所述磁珠悬液含有0.4-0.6 mg/mL CD81/CD63抗体包被的磁珠微球，100-200 mg/L 鼠IgG抗体、50-70mg/L多聚鼠IgG抗体、50-70mg/L多聚兔IgG抗体、80-120 mg/L 的人IgG1抗体、50-70mg/L嗜异性阻断剂HBR、8-9 g/L 氯化钠、5-7 g/L三羟甲基氨基甲烷Tris，0.04-0.06%的叠氮化钠，pH 7.2-7.8。
作为优选实施方案，所述磁珠悬液中的磁珠微球粒径为1～3 μm，所述磁珠微球采用化学偶联剂N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐活化。
具体地，所述磁珠悬液的制备方法包含以下步骤：
1）选择粒径为1～3 μm的磁珠微球；
2）磁珠微球使用含2-（N-吗啉）乙磺酸（MES）的缓冲液洗涤一遍；
3）加入化学偶联剂N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐将磁珠微球活化；优选的，N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基 丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1：1；
4）将活化好的磁珠微球中加入外泌体特异性蛋白CD81和CD63抗体；优选的，反应时间为2-3小时；
5）用含有BSA的缓冲液将抗体包被的磁珠洗涤3遍；
6）用含有鼠IgG抗体，多聚鼠IgG抗体，多聚兔IgG抗体，人IgG1抗体，嗜异性阻断剂HBR的缓冲液重悬CD81/CD63偶联的磁珠微球，得到所述磁珠悬液。该磁珠悬液含有0.4-0.6mg/mL的磁珠微球（磁珠微球上偶联有CD81/CD63抗体），100-200 mg/L 鼠IgG抗体、50-70mg/L多聚鼠IgG抗体、50-70mg/L多聚兔IgG抗体、80-120 mg/mL人IgG1抗体、50-70mg/L嗜异性阻断剂HBR、8-9 g/L 氯化钠、5-7 g/L三羟甲基氨基甲烷Tris，0.04-0.06%的叠氮化钠，pH 7.2-7.8。
作为优选实施方案，所述ALK蛋白抗体工作液中吖啶酯标记的ALK蛋白抗体的浓度为0.01-0.05 μg/mL，工作液的pH值为6.0～6.5。
作为优选实施方案，所述ALK蛋白抗体工作液的溶液体系为5-7g/L磷酸二氢钠、3-5 g/L磷酸氢二钠、6-8 g/L氯化钠、0.1-0.4g/L Pluronic® F-127、pH6.0～6.5的缓冲液。
具体地，所述ALK蛋白抗体工作液的制备方法包含以下步骤：
1）将ALK蛋白抗体用NaHCO3缓冲液溶解；优选的，NaHCO3缓冲液的pH8.5～9.0；
2）加入10～15倍质量浓度吖啶酯；优选的，加入10倍质量浓度吖啶酯；
3）避光孵育2～3小时；
4）脱盐柱先用含5-8g/L的三羟甲基氨基甲烷（Tris）、pH7.0-7.5的缓冲液平衡脱盐纯化柱；用脱盐纯化柱过滤掉游离的吖啶酯。
5）过滤得到的ALK蛋白抗体采用ALK蛋白工作液的缓冲液稀释，该缓冲液体系为5-7g/L磷酸二氢钠、 3-5 g/L磷酸氢二钠、6-8 g/L氯化钠、0.1-0.4g/L Pluronic® F-127，pH6.0～6.5，溶剂为水，得到pH6.0～6.5的ALK蛋白抗体工作液。
作为优选实施方案，所述发光激发液包括激发液A和激发液B；所述激发液A包含0.1～0.2M HNO3、和体积浓度0.3～0.6%的H2O2，溶剂为水；所述激发液B包含0.25～0.5M的NaOH，溶剂为水。
作为优选实施方案，所述标准品包含标准品S1和S2，所述标准品S1的外泌体浓度为2×109～5×109个外泌体/mL，标准品S2的外泌体浓度为2×1011～5×1011个外泌体/mL。优选地，所述标准品的外泌体为H3122细胞系培养上清液超速离心获得的外泌体，采用NTA进行定量检测。所述标准品的溶液体系为0.0040～0.0045 g/mL的NaH2PO4，0.020～0.023g/mL的Na2HPO4，0.174～0.180 g/mL的NaCl和8-12g/L的小牛血清蛋白。
作为优选实施方案，所述稀释液包括0.0040～0.0045 g/mL的NaH2PO4，0.020～0.023 g/mL的Na2HPO4，0.174 ～0.180 g/mL的NaCl，溶剂为水。
作为优选实施方案，所述洗涤液包括0.0040～0.0045 g/mL的NaH2PO4，0.020～0.023 g/mL的Na2HPO4，0.174～0.180 g/mL的NaCl，0.05%～0.07%的吐温-20，溶剂为水。
本发明提供的所述检测试剂盒检测血浆外泌体中ALK蛋白的方法，包括如下步骤：
1) 将标准品S1和S2，用稀释液稀释100倍；
2) 向标准品和待测血浆样本中加入磁珠悬液，充分混匀，37℃孵育30分钟；
3) 将2）所得的混合液中加入金属棒，并将磁棒套入金属棒里，在磁棒的作用下磁珠会吸附于金属棒上；
4) 将3）中的金属棒和磁棒转入另一个加有洗涤液的离心管中，抽掉磁棒，使磁珠充分散落在洗涤液中，再次套入磁棒，磁珠又重新吸附于金属棒，重复洗涤一遍；
5) 将4）所得的磁珠加入ALK蛋白抗体工作液，37℃孵育10分钟；
6 )将5）所得的混合液中加入金属棒，并将磁棒套入金属棒里，在磁棒的作用下磁珠会吸附于金属棒上；
7) 将6）中的金属棒和磁棒转入另一个加有洗涤液的离心管中，抽掉磁棒，使磁珠充分散落在洗涤液中，再次套入磁棒，磁珠又重新吸回金属棒，重复洗涤一遍；
8) 向7）所得的磁珠加入稀释液重悬；
9) 向8）所得的混合液依次加入激发液A和激发液B；
10) 将9）所得的混合液采用化学发光仪进行检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1）本发明试剂盒的检测方法创新性的实现了血浆外泌体ALK蛋白的检测，与常规方法相比，灵敏度高，还可实现自动化检测。
2）本发明试剂盒采用外泌体特异性的CD81/CD63抗体捕获外泌体，这种特异性的捕获降低了化学发光的本底效应，吖啶酯标记的ALK蛋白抗体捕获信号，实现了肿瘤患者血浆中微量ALK融合蛋白的超敏检测。
3）本发明试剂盒采用ALK蛋白抗体为经筛选优化的针对ALK蛋白胞外肽段的抗体1和ALK蛋白胞内肽段的抗体2组合，胞外肽段抗体1与胞内肽段抗体2的比例为1～10：1 ，优选为4～6：1进一步优选为5：1。本发明优化筛选的ALK蛋白抗组合体可特异性识别外泌体膜表面所有ALK蛋白，实现了肿瘤患者血浆中微量ALK融合蛋白的超敏检测。
4）本发明试剂盒中的磁珠悬液中含有鼠IgG抗体，多聚鼠IgG抗体，多聚兔IgG抗体，人IgG1抗体，嗜异性阻断剂HBR，降低了试剂盒检测的假阳性。
5）本发明方法中采用金属棒套磁棒吸磁珠的洗涤方式，其中金属棒能增大磁吸效率，这种洗涤方式避免了未结合的ALK蛋白抗体残留，降低本底效应，避免了假阳性。
附图说明
图1是本发明试剂盒检测方法的流程图。
图2A是实施例2中本发明方法中样本稀释倍数与检测的发光值之间的关系图。
图2B是实施例2中ELISA试剂盒检测方法中样本稀释倍数与检测的发光值之间的关系图。
图3是实施例3中试剂盒中的磁珠悬液中添加鼠IgG抗体，多聚鼠IgG抗体，多聚兔IgG抗体，人IgG1抗体，嗜异性阻断剂HBR与不添这些组分的检测结果比较示意图；具体分为实验组1、实验组2、对照组。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。
实施例1：ALK蛋白抗体工作液中含有不同种类的ALK蛋白抗体的检测效果比较
步骤一：将标准品S1和S2，S1的外泌体浓度为2×109个外泌体/mL，标准品S2的外泌体浓度为2×1011个外泌体/mL，分别用稀释液将标准品S1和S2稀释100倍，稀释液中含有0.0045 g/mL的NaH2PO4，0.023 g/mL的Na2HPO4，0.180 g/mL的NaCl，溶剂为水；
步骤二：取六组100 μL标准品，阴性对照样本（PBS），分别转至1.5 mL离心管中，加入50 μL磁珠悬液，磁珠悬液中含有0.4 mg/mL CD81/CD63抗体包被的磁珠微球，80 mg/L人IgG1抗体、70 mg/L嗜异性阻断剂HBR、8 g/L 氯化钠、7 g/L三羟甲基氨基甲烷Tris，0.05%的叠氮化钠，pH 7.2，充分混匀，37℃孵育30分钟；
步骤三：所得的混合液中加入金属棒，并将磁棒套入金属棒里，此时，在磁棒的作用下磁珠会吸附于金属棒上；
步骤四：将金属棒和磁棒转入另一个加有洗涤液的离心管中，抽掉磁棒，使磁珠充分散落在洗涤液中，洗涤液中含有0.0042 g/mL的NaH2PO4，0.021 g/mL的Na2HPO4，0.174 g/mL的NaCl，0.05%的吐温-20，溶剂为水，再次套入磁棒，磁珠又重新吸回金属棒；
步骤五：重复步骤四一遍；
步骤六：洗涤后的磁珠分别加入50 μL六组不同的ALK蛋白抗体工作液，这六组ALK蛋白抗体工作液具体为：第一组，含有0.01 μg/mL吖啶酯标记的ALK (D5F3)抗体；第二组，含有0.01 μg/mL吖啶酯标记的ALK (4F6)抗体（ALK (4F6)是针对ALK胞外蛋白的251-350肽段，厂家：NOVUSBIOLOGICALS，货号：H00000238-M02）；第三组，含有0.01 μg/mL吖啶酯标记的ALK (7A11A4)抗体（ALK (7A11A4)是针对ALK胞内蛋白1366-1468的肽段，厂家：NOVUSBIOLOGICALS，货号：NBP2-61845）；第四组，含有0.01 μg/mL吖啶酯标记的ALK (4F6)抗体和ALK (7A11A4)抗体，ALK (4F6)抗体和ALK (7A11A4)抗体质量浓度比为1：1；第五组，含有0.01 μg/mL吖啶酯标记的ALK (4F6)抗体和ALK (7A11A4)抗体，ALK (4F6)抗体和ALK(7A11A4)抗体质量浓度比为5：1；第六组，含有0.01 μg/mL吖啶酯标记的ALK (4F6)抗体和ALK (7A11A4)抗体，ALK (4F6)抗体和ALK (7A11A4)抗体质量浓度比为10：1，37℃孵育10分钟；
步骤七：所得的混合液中加入金属棒，并将磁棒套入金属棒里，此时，在磁棒的作用下磁珠会吸附与金属棒上；
步骤八：将金属棒和磁棒转入另一个加有洗涤液的离心管中，抽掉磁棒，使磁珠充分散落在洗涤液中，再次套入磁棒，磁珠又重新吸回金属棒；
步骤九：重复步骤八一遍；
步骤十：洗涤后的磁珠加入400 μL稀释液重悬；
步骤十一：所得的混合液依次加入100 μL激发液A和激发液B；激发液A包含0.1MHNO3、和体积浓度0.4%的H2O2，溶剂为水；激发液B包含0.23M的NaOH，溶剂为水。
步骤十二：上SMART 6500化学发光仪检测吖啶酯发光值。对标准品S1和S2的检测结果见表1。
表1
Figure 248817DEST_PATH_IMAGE001
从表1中的结果来看，当ALK抗体为D5F3型别时，标准品的发光值很低，S1低于阈值线（1000RLU）。当ALK抗体分别为4F6和7A11A4型别时，可以检测出S1和S2的值，但灵敏度较低。当ALK抗体4F6与7A11A4的质量浓度比例为5：1时检测的发光值最高。因此，ALK抗体4F6与7A11A4按质量浓度比例为5：1混合是本发明方法的最优选择。
进一步，选用不同肽段的ALK胞外抗体，ALK胞内抗体，以及胞外抗体与胞内抗体按5:1的比例进行混合；将这些抗体分为不同组别按照上述同样方法对标准品S1和S2进行检测。具体抗体组别如下：
第七组：含有0.01μg/mL吖啶酯标记的ALK抗体4（针对ALK胞外蛋白19-300肽段，厂家：ABclonal，货号 ：A0766)；
第八组：含有0.01μg/mL吖啶酯标记的ALK抗体5（针对ALK胞外蛋白400-1038肽段，厂家：ABclonal，定制款)；
第九组：含有0.01μg/mL吖啶酯标记的ALK抗体6（针对ALK胞外蛋白19-1038肽段，厂家：NOVUSBIOLOGICALS，货号：AF4210）；
第十组：含有0.01μg/mL吖啶酯标记的ALK 抗体7（针对ALK胞内蛋白1060-1620肽段，厂家：NOVUSBIOLOGICALS，货号：NBP2-77424）；
第十一组：含有0.01μg/mL吖啶酯标记的ALK 抗体8（针对ALK胞内蛋白1060-1400肽段，厂家：ABclonal，定制款)；
第十二组：含有0.01μg/mL吖啶酯标记的ALK 抗体9（针对ALK胞内蛋白1400-1620肽段，厂家：ABclonal，定制款)；
第十三组：含有0.01 μg/mL吖啶酯标记的ALK抗体6和ALK抗体7，ALK抗体6和ALK抗体7质量浓度比为5：1；
第十四组：含有0.01 μg/mL吖啶酯标记的ALK抗体4和ALK抗体8，ALK抗体4和ALK抗体8质量浓度比为5：1；
第十五组：含有0.01 μg/mL吖啶酯标记的ALK抗体5和ALK抗体9，ALK抗体5和ALK抗体9质量浓度比为5：1
上述检测结果如表2所示。
表2
组别 S1 S2
第七组（抗体4） 1362 8321
第八组（抗体5） 1257 9353
第九组（抗体6） 1148 7960
第十组（抗体7） 1042 3098
第十一组（抗体8） 1123 3765
第十二组（抗体9） 1179 3860
第十三组（抗体6与抗体7混合） 1921 18913
第十四组（抗体4与抗体8混合） 1798 19124
第十五组（抗体5与抗体9混合） 1836 18853
由表2可以看出：当ALK抗体分别为ALK抗体4、ALK抗体5、ALK抗体6、ALK抗体7、ALK抗体8、ALK抗体9型别时，可以检测出S1和S2的值，但灵敏度都较低；其中ALK抗体7的S1检测值接近阈值。胞外抗体和胞内抗体按5：1组合时可以很大程度提高灵敏度。
实施例2 本发明试剂盒中的磁珠悬液中添加鼠IgG抗体，多聚鼠IgG抗体，多聚兔IgG抗体，人IgG1抗体，嗜异性阻断剂HBR与不添这些组分的检测特异性比较
步骤一：临床样本预处理：采集治疗前10例ALK阴性的非小细胞肺癌患者全血，1600g，4℃，离心10分钟，取上清液，将上清液分为三份，一份用于实验组1（磁珠悬液中添加鼠IgG抗体（厂家：宝德康体，货号：3BM245）、多聚鼠IgG抗体（厂家：罗氏，货号：11939661103）、多聚兔IgG抗体（厂家：R&D，货号：VC003）、人IgG1抗体（厂家：abcam，货号：ab125912）、嗜异性阻断剂HBR（厂家：宝德康体，货号：3KC533）），一份用于实验组2（磁珠悬液中添加鼠IgG抗体、多聚鼠IgG抗体、多聚兔IgG抗体、嗜异性阻断剂HBR、未添加人IgG1抗体），一份用于对照组（磁珠悬液中未添加鼠IgG抗体、多聚鼠IgG抗体、多聚兔IgG抗体、人IgG1抗体、嗜异性阻断剂HBR）；
步骤二：将标准品S1和S2，S1的外泌体浓度为2×109个外泌体/mL，标准品S2的外泌体浓度为2×1011个外泌体/mL，分别用稀释液将标准品S1和S2稀释100倍，稀释液中含有0.0045 g/mL的NaH2PO4，0.023 g/mL的Na2HPO4，0.180 g/mL的NaCl，溶剂为水；
取100 μL标准品，阴性对照样本（PBS），100 μL ALK阴性血浆分别转至1.5 mL离心管中，实验组1：加入50 μL磁珠悬液，磁珠悬液中含有0.4 mg/mL CD81/CD63抗体包被的磁珠微球，100 mg/L 鼠IgG抗体、50 mg/L多聚鼠IgG抗体、50 mg/L多聚兔IgG抗体、100mg/L人IgG1抗体，70 mg/L嗜异性阻断剂HBR、8 g/L 氯化钠、7 g/L三羟甲基氨基甲烷Tris，0.05%的叠氮化钠，pH 7.2，充分混匀，37℃孵育30分钟；实验组2：加入50 μL磁珠悬液，磁珠悬液中含有0.4 mg/mL CD81/CD63抗体包被的磁珠微球，100 mg/L 鼠IgG抗体、50 mg/L多聚鼠IgG抗体、50 mg/L多聚兔IgG抗体、70 mg/L嗜异性阻断剂HBR、8 g/L 氯化钠、7 g/L三羟甲基氨基甲烷Tris，0.05%的叠氮化钠，pH 7.2，充分混匀，37℃孵育30分钟；对照组：加入50 μL磁珠悬液，磁珠悬液中含有0.4 mg/mL CD81/CD63抗体包被的磁珠微球，8 g/L 氯化钠、7g/L三羟甲基氨基甲烷Tris，0.05%的叠氮化钠，pH 7.2，充分混匀，37℃孵育30分钟；
步骤三：所得的混合液中加入金属棒，并将磁棒套入金属棒里，此时，在磁棒的作用下磁珠会吸附于金属棒上；
步骤四：将金属棒和磁棒转入另一个加有洗涤液的离心管中，抽掉磁棒，使磁珠充分散落在洗涤液中，洗涤液中含有0.0042 g/mL的NaH2PO4，0.021 g/mL的Na2HPO4，0.174 g/mL的NaCl，0.05%的吐温-20，溶剂为水，再次套入磁棒，磁珠又重新吸回金属棒；
步骤五：重复步骤四一遍；
步骤六：洗涤后的磁珠加入50 μL ALK蛋白抗体工作液，ALK蛋白抗体工作液中含有0.01 μg/mL吖啶酯标记的ALK蛋白抗体混合液，其中ALK/CD246 antibody (4F6) 与ALK/CD246 antibody (7A11A4)的质量浓度比为6：1，pH6.0，37℃孵育10分钟；
步骤七：所得的混合液中加入金属棒，并将磁棒套入金属棒里，此时，在磁棒的作用下磁珠会吸附与金属棒上；
步骤八：将金属棒和磁棒转入另一个加有洗涤液的离心管中，抽掉磁棒，使磁珠充分散落在洗涤液中，再次套入磁棒，磁珠又重新吸回金属棒；
步骤九：重复步骤八一遍；
步骤十：洗涤后的磁珠加入400 μL稀释液重悬；
步骤十一：所得的混合液依次加入100 μL激发液A和激发液B；激发液A包含0.1MHNO3、和体积浓度0.4%的H2O2，溶剂为水；激发液B包含0.23M的NaOH，溶剂为水。
步骤十二：上SMART 6500化学发光仪检测吖啶酯发光值。
本实施例方法检测血浆样本的数据见表3。
表3
Figure 149908DEST_PATH_IMAGE002
上述表3中，实验组1为：磁珠悬液中添加鼠IgG抗体、多聚鼠IgG抗体、多聚兔IgG抗体、人IgG1抗体、嗜异性阻断剂HBR。实验组2为：磁珠悬液中添加鼠IgG抗体，多聚鼠IgG抗体，多聚兔IgG抗体，嗜异性阻断剂HBR，未添加人IgG1抗体。对照组为：磁珠悬液中不添这些组分。分别检测治疗前的非小细胞肺癌（NSCLC） ALK阴性血浆样本，对比结果参见图3；发光值1000RLU作为阈值线，低于1000为阴性，大于等于1000为阳性，在检测10例ALK阴性的血浆样本中，实验组1有9例都在阈值线以下，有一例接近阈值线（981）但未超过阈值线；实验组2有2例大于阈值线（假阳性）；对照组有3例大于阈值线（假阳性），一例在阈值线附近（1023）；从以上结果来看：磁珠悬液中添加鼠IgG抗体、多聚鼠IgG抗体、多聚兔IgG抗体、人IgG1抗体、嗜异性阻断剂HBR能降低假阳性提高检测的特异性，其中人IgG1抗体起着关键作用。
实施例3 本发明方法检测非小细胞肺癌患者ALK阳性及阴性血浆样本外泌体中ALK蛋白
步骤一：将标准品S1和S2，S1的外泌体浓度为2×109个外泌体/mL，标准品S2的外泌体浓度为2×1011个外泌体/mL，分别用稀释液将标准品S1和S2稀释100倍，稀释液中含有0.0045 g/mL的NaH2PO4，0.023 g/mL的Na2HPO4，0.180 g/mL的NaCl，溶剂为水；
步骤二：取100 μL标准品，100 μL ALK阳性和阴性血浆分别转至1.5 mL离心管中，加入50 μL磁珠悬液，磁珠悬液中含有0.4 mg/mL CD81/CD63抗体包被的磁珠微球，100 mg/L 鼠IgG抗体、50 mg/L多聚鼠IgG抗体、50 mg/L多聚兔IgG抗体、100 mg/L人IgG1抗体、70mg/L嗜异性阻断剂HBR、8 g/L 氯化钠、7 g/L三羟甲基氨基甲烷Tris，0.05%的叠氮化钠，pH7.2，充分混匀，37℃孵育30分钟；
步骤三：所得的混合液中加入金属棒，并将磁棒套入金属棒里，此时，在磁棒的作用下磁珠会吸附于金属棒上；
步骤四：将金属棒和磁棒转入另一个加有洗涤液的离心管中，抽掉磁棒，使磁珠充分散落在洗涤液中，洗涤液中含有0.0042 g/mL的NaH2PO4，0.021 g/mL的Na2HPO4，0.174 g/mL的NaCl，0.05%的吐温-20，溶剂为水，再次套入磁棒，磁珠又重新吸回金属棒；
步骤五：重复步骤四一遍；
步骤六：洗涤后的磁珠加入50 μLALK蛋白抗体工作液，ALK蛋白抗体工作液中含有0.01 μg/mL吖啶酯标记的ALK蛋白抗体，其中ALK蛋白抗体中ALK/CD246抗体(4F6) 与ALK/CD246抗体(7A11A4)的质量浓度比为6：1；pH6.0，37℃孵育10分钟；
步骤七：所得的混合液中加入金属棒，并将磁棒套入金属棒里，此时，在磁棒的作用下磁珠会吸附与金属棒上；
步骤八：将金属棒和磁棒转入另一个加有洗涤液的离心管中，抽掉磁棒，使磁珠充分散落在洗涤液中，再次套入磁棒，磁珠又重新吸回金属棒；
步骤九：重复步骤八一遍；
步骤十：洗涤后的磁珠加入400 μL稀释液重悬；
步骤十一：所得的混合液依次加入100 μL激发液A和激发液B；激发液A包含0.1MHNO3、和体积浓度0.4%的H2O2，溶剂为水；激发液B包含0.23M的NaOH，溶剂为水。
步骤十二：上SMART 6500化学发光仪检测吖啶酯发光值。
参见图1，为本发明试剂盒检测方法的流程图，检测流程如下：
（1）样本与磁珠孵育：通过磁珠上包被的CD81/CD63抗体捕获样本中的外泌体；
（2）洗涤：采用金属棒套磁棒吸取磁珠的洗涤方式，洗去磁珠上的残留液；
（3）吸附外泌体的磁珠与ALK蛋白抗体工作液孵育：吖啶酯偶联的ALK蛋白胞外肽段抗体1和吖啶酯偶联的ALK蛋白胞内肽段抗体2与磁珠外泌体形成三明治夹心；
（4）洗涤：采用金属棒套磁棒吸取磁珠的洗涤方式，洗去磁珠上的残留液；
（5）加激发液A和B检测吖啶酯发光值。
本实施例方法检测血浆样本的数据见表4。
表4
编号 发光值(RLU)
标准品S1 2580
标准品S2 23890
ALK阳性样本检测值 3783
ALK阴性样本检测值 857
空白对照 752
实施例4 本发明方法检测非小细胞肺癌患者ALK阳性血浆样本外泌体中ALK蛋白与商业化的PathScan® Total ALK Chemiluminescent Sandwich ELISA Kit的对比效果验证
设计对比试验，比较市面上的ALK蛋白ELISA定量试剂盒与本发明检测方法的灵敏度。ALK蛋白ELISA定量试剂盒购买自Cell Signaling。
本发明方法的操作步骤如下：
步骤一：将标准品S1和S2，S1的外泌体浓度为2×109个外泌体/mL，标准品S2的外泌体浓度为2×1011个外泌体/mL，分别用稀释液稀释100倍，稀释液中含有0.0045 g/mL的NaH2PO4，.023 g/mL的Na2HPO4， 0.180 g/mL的NaCl，溶剂为水；将ALK阳性血浆用PBS缓冲液按下表的方式稀释5个梯度。取400μLALK阳性血浆样本作为第一个浓度样品，然后从第一个浓度样品中取出200μL加入200μL稀释液作为第二个浓度样品，后续从第二个浓度样品中取出200μL加入200μL稀释液作为第三个浓度样品，依次按2倍浓度梯度稀释5个梯度，具体数据见表5。
表5
Tube 稀释倍数 ALK阳性血浆样本 稀释液
Tube1 Blank - 400μL
Tube2 1 400 μL -
Tube3 1:2 200 μL 200 μL
Tube4 1:4 200 μL 200 μL
Tube5 1:8 200 μL 200 μL
Tube6 1:16 200 μL 200 μL
Tube7 1:32 200 μL 200 μL
步骤二：取100 μL标准品，不同浓度的ALK阳性血浆样本各100 μL，转至1.5 mL离心管中，加入50 μL磁珠悬液，磁珠悬液中含有0.4 mg/mL CD81/CD63抗体包被的磁珠微球，100 mg/L 鼠IgG抗体、50 mg/L多聚鼠IgG抗体、50 mg/L多聚兔IgG抗体、100 mg/L人IgG1抗体、70 mg/L嗜异性阻断剂HBR、8 g/L 氯化钠、7 g/L三羟甲基氨基甲烷Tris，0.05%的叠氮化钠，pH 7.2，充分混匀，37℃孵育30分钟；
步骤三：所得的混合液中加入金属棒，并将磁棒套入金属棒里，此时，在磁棒的作用下磁珠会吸附于金属棒上；
步骤四：将金属棒和磁棒转入另一个加有洗涤液的离心管中，洗涤液中含有0.0042 g/mL的NaH2PO4，0.021 g/mL的Na2HPO4，0.174 g/mL的NaCl，0.05%%的吐温-20，溶剂为水，抽掉磁棒，使磁珠充分散落在洗涤液中，再次套入磁棒，磁珠又重新吸回金属棒；
步骤五：重复步骤四一遍；
步骤六：加入50 μL的ALK蛋白抗体工作液，ALK蛋白抗体工作液中含有0.01 μg/mL吖啶酯标记的ALK蛋白抗体，其中ALK蛋白抗体中ALK/CD246抗体(4F6) 与ALK/CD246抗体(7A11A4)的质量浓度比为6：1；pH6.0，37℃孵育10分钟；
步骤七：所得的混合液中加入金属棒，并将磁棒套入金属棒里，此时，在磁棒的作用下磁珠会吸附与金属棒上；
步骤八：将金属棒和磁棒转入另一个加有洗涤液的离心管中，抽掉磁棒，使磁珠充分散落在洗涤液中，再次套入磁棒，磁珠又重新吸回金属棒；
步骤九：重复步骤八一遍；
步骤十：加入400 μL稀释液重悬；
步骤十一：所得的混合液依次加入100 μL激发液A和激发液B，激发液A包含0.1MHNO3、和体积浓度0.4%的H2O2，溶剂为水；激发液B包含0.23M的NaOH，溶剂为水。；
步骤十二：上SMART 6500化学发光仪检测吖啶酯发光值。
PathScan® Total ALK Chemiluminescent Sandwich ELISA Kit的实验步骤如下：
步骤一：向微量滴定板依次加入50 μL稀释的ALK阳性血浆样品；
步骤二：将微量滴定板用膜密封；
步骤三：室温震荡孵育2小时；
步骤四：将微量滴定板翻转弃去液体；
步骤五：用150 μL洗涤液清洗微量滴定板4次，每次5分钟；
步骤六：将检测抗体用检测抗体缓冲液按1:10的比例稀释，各加入50 μL;
步骤七：室温震荡孵育1小时；
步骤八：将微量滴定板翻转弃去液体；用150 μL洗涤液清洗微量滴定板4次，每次5分钟；
步骤九：加入50 μL 辣根过氧化物酶连接的二抗，室温震荡孵育30分钟；
步骤十：将微量滴定板翻转弃去液体；用150 μL洗涤液清洗微量滴定板4次，每次5分钟。
步骤十一：加入50 μL 底物工作液，5-10分钟后于酶标仪（425 nm）上读取数值。
本发明方法与ELISA试剂盒检测的灵敏度对比实验结果见表6。
表6
Figure 682520DEST_PATH_IMAGE003
参见图2A和图2B，为本发明方法与ELISA试剂盒检测的灵敏度对比实验结果；其中图2A为本发明方法中样本稀释倍数与检测的发光值之间的关系图；图2B为ELISA试剂盒检测方法中样本稀释倍数与检测的发光值之间的关系图。由图2A和图2B可以看到：本发明方法检测按梯度稀释的ALK阳性血浆样本时，在血浆样本稀释8倍（Tube5）时仍可以准确检测到其阳性值（阈值线之上）；而PathScan® Total ALK Chemiluminescent Sandwich ELISAKit检测按梯度稀释的ALK阳性血浆样本时，在血浆样本不稀释（Tube2）时可以准确检测到其阳性值，在血浆样本稀释2倍（Tube3）时OD值在灰区地带（靠近阈值线），在血浆样本稀释4倍（Tube4）时已检测不到其阳性（阈值线以下）。由此可见，本发明方法检测血浆外泌体中的ALK蛋白的灵敏度高于商品化的ELISA Kit。
上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。
序列表
<110> 上海思路迪医学检验所有限公司
<120> 一种外泌体ALK融合蛋白磁免疫化学发光检测试剂盒
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1019
<212> PRT
<213> 人(Human)
<400> 1
Gly Ser Gly Met Gly Thr Gly Gln Arg Ala Gly Ser Pro Ala Ala Gly
1 5 10 15
Pro Pro Leu Gln Pro Arg Glu Pro Leu Ser Tyr Ser Arg Leu Gln Arg
20 25 30
Lys Ser Leu Ala Val Asp Phe Val Val Pro Ser Leu Phe Arg Val Tyr
35 40 45
Ala Arg Asp Leu Leu Leu Pro Pro Ser Ser Ser Glu Leu Lys Ala Gly
50 55 60
Arg Pro Glu Ala Arg Gly Ser Leu Ala Leu Asp Cys Ala Pro Leu Leu
65 70 75 80
Arg Leu Leu Gly Pro Ala Pro Gly Val Ser Trp Thr Ala Gly Ser Pro
85 90 95
Ala Pro Ala Glu Ala Arg Thr Leu Ser Arg Val Leu Lys Gly Gly Ser
100 105 110
Val Arg Lys Leu Arg Arg Ala Lys Gln Leu Val Leu Glu Leu Gly Glu
115 120 125
Glu Ala Ile Leu Glu Gly Cys Val Gly Pro Pro Gly Glu Ala Ala Val
130 135 140
Gly Leu Leu Gln Phe Asn Leu Ser Glu Leu Phe Ser Trp Trp Ile Arg
145 150 155 160
Gln Gly Glu Gly Arg Leu Arg Ile Arg Leu Met Pro Glu Lys Lys Ala
165 170 175
Ser Glu Val Gly Arg Glu Gly Arg Leu Ser Ala Ala Ile Arg Ala Ser
180 185 190
Gln Pro Arg Leu Leu Phe Gln Ile Phe Gly Thr Gly His Ser Ser Leu
195 200 205
Glu Ser Pro Thr Asn Met Pro Ser Pro Ser Pro Asp Tyr Phe Thr Trp
210 215 220
Asn Leu Thr Trp Ile Met Lys Asp Ser Phe Pro Phe Leu Ser His Arg
225 230 235 240
Ser Arg Tyr Gly Leu Glu Cys Ser Phe Asp Phe Pro Cys Glu Leu Glu
245 250 255
Tyr Ser Pro Pro Leu His Asp Leu Arg Asn Gln Ser Trp Ser Trp Arg
260 265 270
Arg Ile Pro Ser Glu Glu Ala Ser Gln Met Asp Leu Leu Asp Gly Pro
275 280 285
Gly Ala Glu Arg Ser Lys Glu Met Pro Arg Gly Ser Phe Leu Leu Leu
290 295 300
Asn Thr Ser Ala Asp Ser Lys His Thr Ile Leu Ser Pro Trp Met Arg
305 310 315 320
Ser Ser Ser Glu His Cys Thr Leu Ala Val Ser Val His Arg His Leu
325 330 335
Gln Pro Ser Gly Arg Tyr Ile Ala Gln Leu Leu Pro His Asn Glu Ala
340 345 350
Ala Arg Glu Ile Leu Leu Met Pro Thr Pro Gly Lys His Gly Trp Thr
355 360 365
Val Leu Gln Gly Arg Ile Gly Arg Pro Asp Asn Pro Phe Arg Val Ala
370 375 380
Leu Glu Tyr Ile Ser Ser Gly Asn Arg Ser Leu Ser Ala Val Asp Phe
385 390 395 400
Phe Ala Leu Lys Asn Cys Ser Glu Gly Thr Ser Pro Gly Ser Lys Met
405 410 415
Ala Leu Gln Ser Ser Phe Thr Cys Trp Asn Gly Thr Val Leu Gln Leu
420 425 430
Gly Gln Ala Cys Asp Phe His Gln Asp Cys Ala Gln Gly Glu Asp Glu
435 440 445
Ser Gln Met Cys Arg Lys Leu Pro Val Gly Phe Tyr Cys Asn Phe Glu
450 455 460
Asp Gly Phe Cys Gly Trp Thr Gln Gly Thr Leu Ser Pro His Thr Pro
465 470 475 480
Gln Trp Gln Val Arg Thr Leu Lys Asp Ala Arg Phe Gln Asp His Gln
485 490 495
Asp His Ala Leu Leu Leu Ser Thr Thr Asp Val Pro Ala Ser Glu Ser
500 505 510
Ala Thr Val Thr Ser Ala Thr Phe Pro Ala Pro Ile Lys Ser Ser Pro
515 520 525
Cys Glu Leu Arg Met Ser Trp Leu Ile Arg Gly Val Leu Arg Gly Asn
530 535 540
Val Ser Leu Val Leu Val Glu Asn Lys Thr Gly Lys Glu Gln Gly Arg
545 550 555 560
Met Val Trp His Val Ala Ala Tyr Glu Gly Leu Ser Leu Trp Gln Trp
565 570 575
Met Val Leu Pro Leu Leu Asp Val Ser Asp Arg Phe Trp Leu Gln Met
580 585 590
Val Ala Trp Trp Gly Gln Gly Ser Arg Ala Ile Val Ala Phe Asp Asn
595 600 605
Ile Ser Ile Ser Leu Asp Cys Tyr Leu Thr Ile Ser Gly Glu Asp Lys
610 615 620
Ile Leu Gln Asn Thr Ala Pro Lys Ser Arg Asn Leu Phe Glu Arg Asn
625 630 635 640
Pro Asn Lys Glu Leu Lys Pro Gly Glu Asn Ser Pro Arg Gln Thr Pro
645 650 655
Ile Phe Asp Pro Thr Val His Trp Leu Phe Thr Thr Cys Gly Ala Ser
660 665 670
Gly Pro His Gly Pro Thr Gln Ala Gln Cys Asn Asn Ala Tyr Gln Asn
675 680 685
Ser Asn Leu Ser Val Glu Val Gly Ser Glu Gly Pro Leu Lys Gly Ile
690 695 700
Gln Ile Trp Lys Val Pro Ala Thr Asp Thr Tyr Ser Ile Ser Gly Tyr
705 710 715 720
Gly Ala Ala Gly Gly Lys Gly Gly Lys Asn Thr Met Met Arg Ser His
725 730 735
Gly Val Ser Val Leu Gly Ile Phe Asn Leu Glu Lys Asp Asp Met Leu
740 745 750
Tyr Ile Leu Val Gly Gln Gln Gly Glu Asp Ala Cys Pro Ser Thr Asn
755 760 765
Gln Leu Ile Gln Lys Val Cys Ile Gly Glu Asn Asn Val Ile Glu Glu
770 775 780
Glu Ile Arg Val Asn Arg Ser Val His Glu Trp Ala Gly Gly Gly Gly
785 790 795 800
Gly Gly Gly Gly Ala Thr Tyr Val Phe Lys Met Lys Asp Gly Val Pro
805 810 815
Val Pro Leu Ile Ile Ala Ala Gly Gly Gly Gly Arg Ala Tyr Gly Ala
820 825 830
Lys Thr Asp Thr Phe His Pro Glu Arg Leu Glu Asn Asn Ser Ser Val
835 840 845
Leu Gly Leu Asn Gly Asn Ser Gly Ala Ala Gly Gly Gly Gly Gly Trp
850 855 860
Asn Asp Asn Thr Ser Leu Leu Trp Ala Gly Lys Ser Leu Gln Glu Gly
865 870 875 880
Ala Thr Gly Gly His Ser Cys Pro Gln Ala Met Lys Lys Trp Gly Trp
885 890 895
Glu Thr Arg Gly Gly Phe Gly Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ser Ser Gly
900 905 910
Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Ile Gly Gly Asn Ala Ala Ser Asn Asn Asp
915 920 925
Pro Glu Met Asp Gly Glu Asp Gly Val Ser Phe Ile Ser Pro Leu Gly
930 935 940
Ile Leu Tyr Thr Pro Ala Leu Lys Val Met Glu Gly His Gly Glu Val
945 950 955 960
Asn Ile Lys His Tyr Leu Asn Cys Ser His Cys Glu Val Asp Glu Cys
965 970 975
His Met Asp Pro Glu Ser His Lys Val Ile Cys Phe Cys Asp His Gly
980 985 990
Thr Val Leu Ala Glu Asp Gly Val Ser Cys Ile Val Ser Pro Thr Pro
995 1000 1005
Glu Pro His Leu Pro Leu Ser Leu Ile Leu Ser
1010 1015
<210> 2
<211> 100
<212> PRT
<213> 人(Human)
<400> 2
Asp Ser Phe Pro Phe Leu Ser His Arg Ser Arg Tyr Gly Leu Glu Cys
1 5 10 15
Ser Phe Asp Phe Pro Cys Glu Leu Glu Tyr Ser Pro Pro Leu His Asp
20 25 30
Leu Arg Asn Gln Ser Trp Ser Trp Arg Arg Ile Pro Ser Glu Glu Ala
35 40 45
Ser Gln Met Asp Leu Leu Asp Gly Pro Gly Ala Glu Arg Ser Lys Glu
50 55 60
Met Pro Arg Gly Ser Phe Leu Leu Leu Asn Thr Ser Ala Asp Ser Lys
65 70 75 80
His Thr Ile Leu Ser Pro Trp Met Arg Ser Ser Ser Glu His Cys Thr
85 90 95
Leu Ala Val Ser
100
<210> 3
<211> 561
<212> PRT
<213> 人(Human)
<400> 3
Arg Arg Lys His Gln Glu Leu Gln Ala Met Gln Met Glu Leu Gln Ser
1 5 10 15
Pro Glu Tyr Lys Leu Ser Lys Leu Arg Thr Ser Thr Ile Met Thr Asp
20 25 30
Tyr Asn Pro Asn Tyr Cys Phe Ala Gly Lys Thr Ser Ser Ile Ser Asp
35 40 45
Leu Lys Glu Val Pro Arg Lys Asn Ile Thr Leu Ile Arg Gly Leu Gly
50 55 60
His Gly Ala Phe Gly Glu Val Tyr Glu Gly Gln Val Ser Gly Met Pro
65 70 75 80
Asn Asp Pro Ser Pro Leu Gln Val Ala Val Lys Thr Leu Pro Glu Val
85 90 95
Cys Ser Glu Gln Asp Glu Leu Asp Phe Leu Met Glu Ala Leu Ile Ile
100 105 110
Ser Lys Phe Asn His Gln Asn Ile Val Arg Cys Ile Gly Val Ser Leu
115 120 125
Gln Ser Leu Pro Arg Phe Ile Leu Leu Glu Leu Met Ala Gly Gly Asp
130 135 140
Leu Lys Ser Phe Leu Arg Glu Thr Arg Pro Arg Pro Ser Gln Pro Ser
145 150 155 160
Ser Leu Ala Met Leu Asp Leu Leu His Val Ala Arg Asp Ile Ala Cys
165 170 175
Gly Cys Gln Tyr Leu Glu Glu Asn His Phe Ile His Arg Asp Ile Ala
180 185 190
Ala Arg Asn Cys Leu Leu Thr Cys Pro Gly Pro Gly Arg Val Ala Lys
195 200 205
Ile Gly Asp Phe Gly Met Ala Arg Asp Ile Tyr Arg Ala Ser Tyr Tyr
210 215 220
Arg Lys Gly Gly Cys Ala Met Leu Pro Val Lys Trp Met Pro Pro Glu
225 230 235 240
Ala Phe Met Glu Gly Ile Phe Thr Ser Lys Thr Asp Thr Trp Ser Phe
245 250 255
Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile Phe Ser Leu Gly Tyr Met Pro Tyr Pro
260 265 270
Ser Lys Ser Asn Gln Glu Val Leu Glu Phe Val Thr Ser Gly Gly Arg
275 280 285
Met Asp Pro Pro Lys Asn Cys Pro Gly Pro Val Tyr Arg Ile Met Thr
290 295 300
Gln Cys Trp Gln His Gln Pro Glu Asp Arg Pro Asn Phe Ala Ile Ile
305 310 315 320
Leu Glu Arg Ile Glu Tyr Cys Thr Gln Asp Pro Asp Val Ile Asn Thr
325 330 335
Ala Leu Pro Ile Glu Tyr Gly Pro Leu Val Glu Glu Glu Glu Lys Val
340 345 350
Pro Val Arg Pro Lys Asp Pro Glu Gly Val Pro Pro Leu Leu Val Ser
355 360 365
Gln Gln Ala Lys Arg Glu Glu Glu Arg Ser Pro Ala Ala Pro Pro Pro
370 375 380
Leu Pro Thr Thr Ser Ser Gly Lys Ala Ala Lys Lys Pro Thr Ala Ala
385 390 395 400
Glu Ile Ser Val Arg Val Pro Arg Gly Pro Ala Val Glu Gly Gly His
405 410 415
Val Asn Met Ala Phe Ser Gln Ser Asn Pro Pro Ser Glu Leu His Lys
420 425 430
Val His Gly Ser Arg Asn Lys Pro Thr Ser Leu Trp Asn Pro Thr Tyr
435 440 445
Gly Ser Trp Phe Thr Glu Lys Pro Thr Lys Lys Asn Asn Pro Ile Ala
450 455 460
Lys Lys Glu Pro His Asp Arg Gly Asn Leu Gly Leu Glu Gly Ser Cys
465 470 475 480
Thr Val Pro Pro Asn Val Ala Thr Gly Arg Leu Pro Gly Ala Ser Leu
485 490 495
Leu Leu Glu Pro Ser Ser Leu Thr Ala Asn Met Lys Glu Val Pro Leu
500 505 510
Phe Arg Leu Arg His Phe Pro Cys Gly Asn Val Asn Tyr Gly Tyr Gln
515 520 525
Gln Gln Gly Leu Pro Leu Glu Ala Ala Thr Ala Pro Gly Ala Gly His
530 535 540
Tyr Glu Asp Thr Ile Leu Lys Ser Lys Asn Ser Met Asn Gln Pro Gly
545 550 555 560
Pro
<210> 4
<211> 108
<212> PRT
<213> 人(Human)
<400> 4
Ile Met Thr Gln Cys Trp Gln His Gln Pro Glu Asp Arg Pro Asn Phe
1 5 10 15
Ala Ile Ile Leu Glu Arg Ile Glu Tyr Cys Thr Gln Asp Pro Asp Val
20 25 30
Ile Asn Thr Ala Leu Pro Ile Glu Tyr Gly Pro Leu Val Glu Glu Glu
35 40 45
Glu Lys Val Pro Val Arg Pro Lys Asp Pro Glu Gly Val Pro Pro Leu
50 55 60
Leu Val Ser Gln Gln Ala Lys Arg Glu Glu Glu Arg Ser Pro Ala Ala
65 70 75 80
Pro Pro Pro Leu Pro Thr Thr Ser Ser Gly Lys Ala Ala Lys Lys Pro
85 90 95
Thr Ala Ala Glu Ile Ser Val Arg Val Pro Arg Gly
100 105
<210> 5
<211> 282
<212> PRT
<213> 人(Human)
<400> 5
Val Gly Ser Gly Met Gly Thr Gly Gln Arg Ala Gly Ser Pro Ala Ala
1 5 10 15
Gly Pro Pro Leu Gln Pro Arg Glu Pro Leu Ser Tyr Ser Arg Leu Gln
20 25 30
Arg Lys Ser Leu Ala Val Asp Phe Val Val Pro Ser Leu Phe Arg Val
35 40 45
Tyr Ala Arg Asp Leu Leu Leu Pro Pro Ser Ser Ser Glu Leu Lys Ala
50 55 60
Gly Arg Pro Glu Ala Arg Gly Ser Leu Ala Leu Asp Cys Ala Pro Leu
65 70 75 80
Leu Arg Leu Leu Gly Pro Ala Pro Gly Val Ser Trp Thr Ala Gly Ser
85 90 95
Pro Ala Pro Ala Glu Ala Arg Thr Leu Ser Arg Val Leu Lys Gly Gly
100 105 110
Ser Val Arg Lys Leu Arg Arg Ala Lys Gln Leu Val Leu Glu Leu Gly
115 120 125
Glu Glu Ala Ile Leu Glu Gly Cys Val Gly Pro Pro Gly Glu Ala Ala
130 135 140
Val Gly Leu Leu Gln Phe Asn Leu Ser Glu Leu Phe Ser Trp Trp Ile
145 150 155 160
Arg Gln Gly Glu Gly Arg Leu Arg Ile Arg Leu Met Pro Glu Lys Lys
165 170 175
Ala Ser Glu Val Gly Arg Glu Gly Arg Leu Ser Ala Ala Ile Arg Ala
180 185 190
Ser Gln Pro Arg Leu Leu Phe Gln Ile Phe Gly Thr Gly His Ser Ser
195 200 205
Leu Glu Ser Pro Thr Asn Met Pro Ser Pro Ser Pro Asp Tyr Phe Thr
210 215 220
Trp Asn Leu Thr Trp Ile Met Lys Asp Ser Phe Pro Phe Leu Ser His
225 230 235 240
Arg Ser Arg Tyr Gly Leu Glu Cys Ser Phe Asp Phe Pro Cys Glu Leu
245 250 255
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260 265 270
Arg Arg Ile Pro Ser Glu Glu Ala Ser Gln
275 280
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<212> PRT
<213> 人(Human)
<400> 6
Phe Arg Val Ala Leu Glu Tyr Ile Ser Ser Gly Asn Arg Ser Leu Ser
1 5 10 15
Ala Val Asp Phe Phe Ala Leu Lys Asn Cys Ser Glu Gly Thr Ser Pro
20 25 30
Gly Ser Lys Met Ala Leu Gln Ser Ser Phe Thr Cys Trp Asn Gly Thr
35 40 45
Val Leu Gln Leu Gly Gln Ala Cys Asp Phe His Gln Asp Cys Ala Gln
50 55 60
Gly Glu Asp Glu Ser Gln Met Cys Arg Lys Leu Pro Val Gly Phe Tyr
65 70 75 80
Cys Asn Phe Glu Asp Gly Phe Cys Gly Trp Thr Gln Gly Thr Leu Ser
85 90 95
Pro His Thr Pro Gln Trp Gln Val Arg Thr Leu Lys Asp Ala Arg Phe
100 105 110
Gln Asp His Gln Asp His Ala Leu Leu Leu Ser Thr Thr Asp Val Pro
115 120 125
Ala Ser Glu Ser Ala Thr Val Thr Ser Ala Thr Phe Pro Ala Pro Ile
130 135 140
Lys Ser Ser Pro Cys Glu Leu Arg Met Ser Trp Leu Ile Arg Gly Val
145 150 155 160
Leu Arg Gly Asn Val Ser Leu Val Leu Val Glu Asn Lys Thr Gly Lys
165 170 175
Glu Gln Gly Arg Met Val Trp His Val Ala Ala Tyr Glu Gly Leu Ser
180 185 190
Leu Trp Gln Trp Met Val Leu Pro Leu Leu Asp Val Ser Asp Arg Phe
195 200 205
Trp Leu Gln Met Val Ala Trp Trp Gly Gln Gly Ser Arg Ala Ile Val
210 215 220
Ala Phe Asp Asn Ile Ser Ile Ser Leu Asp Cys Tyr Leu Thr Ile Ser
225 230 235 240
Gly Glu Asp Lys Ile Leu Gln Asn Thr Ala Pro Lys Ser Arg Asn Leu
245 250 255
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Arg Gln Thr Pro Ile Phe Asp Pro Thr Val His Trp Leu Phe Thr Thr
275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Leu Lys Gly Ile Gln Ile Trp Lys Val Pro Ala Thr Asp Thr Tyr Ser
325 330 335
Ile Ser Gly Tyr Gly Ala Ala Gly Gly Lys Gly Gly Lys Asn Thr Met
340 345 350
Met Arg Ser His Gly Val Ser Val Leu Gly Ile Phe Asn Leu Glu Lys
355 360 365
Asp Asp Met Leu Tyr Ile Leu Val Gly Gln Gln Gly Glu Asp Ala Cys
370 375 380
Pro Ser Thr Asn Gln Leu Ile Gln Lys Val Cys Ile Gly Glu Asn Asn
385 390 395 400
Val Ile Glu Glu Glu Ile Arg Val Asn Arg Ser Val His Glu Trp Ala
405 410 415
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Thr Tyr Val Phe Lys Met Lys
420 425 430
Asp Gly Val Pro Val Pro Leu Ile Ile Ala Ala Gly Gly Gly Gly Arg
435 440 445
Ala Tyr Gly Ala Lys Thr Asp Thr Phe His Pro Glu Arg Leu Glu Asn
450 455 460
Asn Ser Ser Val Leu Gly Leu Asn Gly Asn Ser Gly Ala Ala Gly Gly
465 470 475 480
Gly Gly Gly Trp Asn Asp Asn Thr Ser Leu Leu Trp Ala Gly Lys Ser
485 490 495
Leu Gln Glu Gly Ala Thr Gly Gly His Ser Cys Pro Gln Ala Met Lys
500 505 510
Lys Trp Gly Trp Glu Thr Arg Gly Gly Phe Gly Gly Gly Gly Gly Gly
515 520 525
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Ile Gly Gly Asn Ala Ala
530 535 540
Ser Asn Asn Asp Pro Glu Met Asp Gly Glu Asp Gly Val Ser Phe Ile
545 550 555 560
Ser Pro Leu Gly Ile Leu Tyr Thr Pro Ala Leu Lys Val Met Glu Gly
565 570 575
His Gly Glu Val Asn Ile Lys His Tyr Leu Asn Cys Ser His Cys Glu
580 585 590
Val Asp Glu Cys His Met Asp Pro Glu Ser His Lys Val Ile Cys Phe
595 600 605
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610 615 620
Ser Pro Thr Pro Glu Pro His Leu Pro Leu Ser Leu Ile Leu Ser
625 630 635
<210> 7
<211> 341
<212> PRT
<213> 人(Human)
<400> 7
Arg Arg Lys His Gln Glu Leu Gln Ala Met Gln Met Glu Leu Gln Ser
1 5 10 15
Pro Glu Tyr Lys Leu Ser Lys Leu Arg Thr Ser Thr Ile Met Thr Asp
20 25 30
Tyr Asn Pro Asn Tyr Cys Phe Ala Gly Lys Thr Ser Ser Ile Ser Asp
35 40 45
Leu Lys Glu Val Pro Arg Lys Asn Ile Thr Leu Ile Arg Gly Leu Gly
50 55 60
His Gly Ala Phe Gly Glu Val Tyr Glu Gly Gln Val Ser Gly Met Pro
65 70 75 80
Asn Asp Pro Ser Pro Leu Gln Val Ala Val Lys Thr Leu Pro Glu Val
85 90 95
Cys Ser Glu Gln Asp Glu Leu Asp Phe Leu Met Glu Ala Leu Ile Ile
100 105 110
Ser Lys Phe Asn His Gln Asn Ile Val Arg Cys Ile Gly Val Ser Leu
115 120 125
Gln Ser Leu Pro Arg Phe Ile Leu Leu Glu Leu Met Ala Gly Gly Asp
130 135 140
Leu Lys Ser Phe Leu Arg Glu Thr Arg Pro Arg Pro Ser Gln Pro Ser
145 150 155 160
Ser Leu Ala Met Leu Asp Leu Leu His Val Ala Arg Asp Ile Ala Cys
165 170 175
Gly Cys Gln Tyr Leu Glu Glu Asn His Phe Ile His Arg Asp Ile Ala
180 185 190
Ala Arg Asn Cys Leu Leu Thr Cys Pro Gly Pro Gly Arg Val Ala Lys
195 200 205
Ile Gly Asp Phe Gly Met Ala Arg Asp Ile Tyr Arg Ala Ser Tyr Tyr
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Arg Lys Gly Gly Cys Ala Met Leu Pro Val Lys Trp Met Pro Pro Glu
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275 280 285
Met Asp Pro Pro Lys Asn Cys Pro Gly Pro Val Tyr Arg Ile Met Thr
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Gln Cys Trp Gln His Gln Pro Glu Asp Arg Pro Asn Phe Ala Ile Ile
305 310 315 320
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Ala Leu Pro Ile Glu
340
<210> 8
<211> 221
<212> PRT
<213> 人(Human)
<400> 8
Glu Tyr Gly Pro Leu Val Glu Glu Glu Glu Lys Val Pro Val Arg Pro
1 5 10 15
Lys Asp Pro Glu Gly Val Pro Pro Leu Leu Val Ser Gln Gln Ala Lys
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Arg Glu Glu Glu Arg Ser Pro Ala Ala Pro Pro Pro Leu Pro Thr Thr
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Ser Ser Gly Lys Ala Ala Lys Lys Pro Thr Ala Ala Glu Ile Ser Val
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Arg Val Pro Arg Gly Pro Ala Val Glu Gly Gly His Val Asn Met Ala
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Phe Ser Gln Ser Asn Pro Pro Ser Glu Leu His Lys Val His Gly Ser
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165 170 175
His Phe Pro Cys Gly Asn Val Asn Tyr Gly Tyr Gln Gln Gln Gly Leu
180 185 190
Pro Leu Glu Ala Ala Thr Ala Pro Gly Ala Gly His Tyr Glu Asp Thr
195 200 205
Ile Leu Lys Ser Lys Asn Ser Met Asn Gln Pro Gly Pro
210 215 220

Claims (15)

1.一种外泌体ALK融合蛋白磁免疫化学发光检测试剂盒，包括：磁珠悬液、ALK蛋白抗体工作液、发光激发液、标准品、稀释液、洗涤液；所述磁珠悬液中的磁珠微球包被有外泌体CD81/CD63抗体；所述ALK蛋白抗体工作液含有吖啶酯标记的ALK蛋白抗体；所述ALK蛋白抗体为ALK蛋白胞外肽段抗体1和ALK蛋白胞内肽段抗体2的组合，其中，胞外肽段抗体1与胞内肽段抗体2的比例为1～10：1；所述胞外肽段抗体1选自ALK蛋白胞外区19-1038区间肽段的抗体；所述胞内肽段抗体2选自ALK蛋白胞内区域1060-1620区间肽段的抗体。
2.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述胞外肽段抗体1与胞内肽段抗体2的比例为4～6：1。
3.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述胞外肽段抗体1与胞内肽段抗体2的比例为5：1。
4.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述胞外肽段抗体1选自以下其中之一的抗体，
序列如SEQ ID NO：1所示的ALK蛋白胞外区19-1038肽段的抗体；
序列如SEQ ID NO：2所示的ALK蛋白胞外区251-350肽段的抗体；
序列如SEQ ID NO：5所示的ALK蛋白胞外区19-300肽段的抗体；
序列如SEQ ID NO：6所示的ALK蛋白胞外区400-1038肽段的抗体。
5.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述胞内肽段抗体2选自以下其中之一的抗体，
序列如SEQ ID NO：3所示的ALK蛋白胞内区域1060-1620肽段的抗体；
序列如SEQ ID NO：4所示的ALK蛋白胞内区域1366-1468肽段的抗体；
序列如SEQ ID NO：7所示的ALK蛋白胞内区域1060-1400肽段的抗体；
序列如SEQ ID NO：8所示的ALK蛋白胞内区域1400-1620肽段的抗体。
6.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述磁珠悬液中含有鼠IgG抗体、多聚鼠IgG抗体、多聚兔IgG抗体、人IgG1抗体、嗜异性阻断剂HBR。
7.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述磁珠悬液含有0.4-0.6 mg/mLCD81/CD63抗体包被的磁珠微球，100-200 mg/L 鼠IgG抗体、50-70mg/L多聚鼠IgG抗体、50-70mg/L多聚兔IgG抗体、80-120 mg/L 的人IgG1抗体、50-70mg/L嗜异性阻断剂HBR、8-9 g/L氯化钠、5-7 g/L三羟甲基氨基甲烷Tris，0.04-0.06%的叠氮化钠，pH 7.2-7.8。
8.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述磁珠悬液中的磁珠微球粒径为1～3 μm，所述磁珠微球采用化学偶联剂N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐活化。
9.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述ALK蛋白抗体工作液中含有吖啶酯标记的ALK蛋白抗体的浓度为0.01-0.05 μg/mL，工作液的pH值为6.0～6.5。
10.如权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于：所述ALK蛋白抗体工作液的溶液体系为5-7g/L磷酸二氢钠、3-5 g/L磷酸氢二钠、6-8 g/L氯化钠、0.1-0.4g/L Pluronic® F-127、pH6.0～6.5的缓冲液。
11.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述发光激发液包括激发液A和激发液B；所述激发液A包含0.1～0.2M HNO3、和体积浓度0.3～0.6%的H2O2，溶剂为水；所述激发液B包含0.25～0.5M的NaOH，溶剂为水。
12.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述标准品包含标准品S1和S2，所述标准品S1的外泌体浓度为2×109～5×109个外泌体/mL，标准品S2的外泌体浓度为2×1011～5×1011个外泌体/mL。
13.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述稀释液包括0.0040～0.0045 g/mL的NaH2PO4，0.020～0.023 g/mL的Na2HPO4，0.174 ～0.180 g/mL的NaCl，溶剂为水。
14.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述洗涤液包括0.0040～0.0045 g/mL的NaH2PO4，0.020～0.023 g/mL的Na2HPO4，0.174～0.180 g/mL的NaCl，0.05%～0.07%的吐温-20，溶剂为水。
15.权利要求1-14任一项所述的检测试剂盒检测血浆外泌体中ALK蛋白的方法，包括如下步骤：
1) 向标准品和待测血浆样本中加入磁珠悬液，充分混匀，孵育；
2) 将1）所得的混合液中加入金属棒，并将磁棒套入金属棒里，在磁棒的作用下磁珠会吸附于金属棒上；
3) 将2）中的金属棒和磁棒转入另一个加有洗涤液的离心管中，抽掉磁棒，使磁珠充分散落在洗涤液中，再次套入磁棒，磁珠又重新吸附于金属棒，重复洗涤一遍；
4) 将3）所得的磁珠加入ALK蛋白抗体工作液，孵育；
5 ) 将4）所得的混合液中加入金属棒，并将磁棒套入金属棒里，在磁棒的作用下磁珠会吸附于金属棒上；
6）将5）中的金属棒和磁棒转入另一个加有洗涤液的离心管中，抽掉磁棒，使磁珠充分散落在洗涤液中，再次套入磁棒，磁珠又重新吸回金属棒，重复洗涤一遍；
7）向6）所得的磁珠加入稀释液重悬；
8）向7）所得的混合液依次加入激发液A和激发液B；
9）将8）所得的混合液采用化学发光仪进行检测。
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