CN107576803A - 一种s100蛋白检测试剂盒及其制备和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及免疫检测分析技术领域，具体涉及一种S100蛋白检测试剂盒，包括以下组分：S100包被板条、S100参考品及质控品、S100酶结合物、浓缩洗涤液、发光底物液A和发光底物液B。本发明还涉及S100蛋白检测试剂盒的制备及使用方法。本发明中检测试剂盒具有高敏感性、特异性和较宽的线性范围，将其用来检测S100可大大提高检测率。
Description
技术领域
本发明涉及免疫检测分析技术领域，具体涉及一种S100蛋白检测试剂盒及其制备和使用方法。
背景技术
理想的脑损伤标记物应对脑组织具有高度特异性，对脑损伤高度敏感，损伤后在血清中迅速出现，且随病程变化而变化，并与年龄、性别无关，以确保其能准确地预测神经系统的损伤程度。近年来，对脑组织损伤的神经化学标志物的研究正在逐步深入，这些标志物主要为S100蛋白家族和神经元特异性烯醇化酶(NSE)等。研究表明，在人或动物的脑梗塞、脑外伤或心脏外科手术时，血清S100和NSE的浓度均有所升高。因此，测定S100蛋白浓度有助于临床上判断神经组织的病灶大小、治疗效果和判断病人的预后等。
S100蛋白是一种酸性钙结合蛋白，分子量为21000，主要存在于中枢神经系统各部的星状神经胶质细胞的胞液中，因其在饱和硫酸铵中能够100％溶解而得名。S100蛋白由α和β两种亚基组成三种不同的形式：S100ββ(S100b)主要存在于神经胶质细胞和施万细胞，S100αα(S100a0)主要存在于神经胶质细胞，S100αβ(S100a)主要存在于横纹肌、心脏和肾脏。S100蛋白通过钙离子信号传导途径在细胞增殖、分化、肌肉收缩、基因表达及细胞凋亡中发挥重要作用。低浓度的S100蛋白具有神经营养作用，神经胶质细胞可以以旁分泌和自分泌的形式分泌S100蛋白，以促进神经的生长和修复，高浓度的S100蛋白具有神经毒性。一般认为，当中枢神经系统细胞损伤时S100蛋白从胞液中渗出进入脑脊液，再经受损的血脑屏障进入血液。因此，脑脊液和血液中S100蛋白增高是中枢神经系统损伤特异和灵敏的生化标志。
目前，市场上S100蛋白检测主要采用免疫学方法，常用方法有胶体金法、乳胶增强免疫比浊法、酶联免疫法等，其中胶体金法、乳胶增强免疫比浊法和酶联免疫法存在特异性差、敏感度低、只能用于定性操作等缺点；因此寻找一种更有效的检测方式就成了临床应用的关键。
发明内容
本发明的第一个目的在于是：针对现有技术存在的不足，提供一种可定量检测、具有较宽线性范围、高敏感性、高特异性的S100蛋白检测试剂盒。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：
一种S100蛋白检测试剂盒，所述试剂盒包括以下组分：S100包被板条、S100参考品及质控品、S100酶结合物、浓缩洗涤液、发光底物液A和发光底物液B。
作为一种优选的技术方案，所述S100包被板条为包被有S100抗体的化学发光板，所述S100抗体为鼠源的单克隆抗体，所述S100抗体的包被浓度为1-5μg/mL；
所述S100酶结合物为辣根过氧化酶标记的S100单克隆抗体，所述S100酶结合物的浓度按照其与酶结合物稀释液1:1000-1:2000的比例稀释；
所述S100参考品及质控品均由S100标准品和参考品稀释液配制而成，所述S100参考品的浓度分别为0ng/mL、0.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL；
所述S100质控品的浓度分别为0.5ng/mL、2ng/mL、10ng/mL。
作为一种优选的技术方案，所述S100抗体的包被浓度为3μg/mL。
作为一种优选的技术方案，所述S100酶结合物的浓度按照其与酶结合物稀释液1:1500的比例稀释；
作为一种优选的技术方案，所述浓缩洗涤液为pH7.4磷酸盐缓冲液，且每1L磷酸盐缓冲液中还含有0.1％-0.2％v/v吐温-20和0.6％-0.8％v/v Proclin-300。
作为一种优选的技术方案，所述发光底物液A为每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.3-2.6g、三羟甲基氨基甲烷1.3-1.6g、3-氨基邻苯二甲酰肼0.03-0.06和对位碘酚0.006-0.008g；所述发光底物液B为每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.3-2.6g、三羟甲基氨基甲烷1.3-1.6g和过氧化氢0.15-0.3ml。
本发明的第二个目的在于是：针对现有技术存在的不足，提供S100蛋白检测试剂盒的制备方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：
一种S100蛋白检测试剂盒的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)配制浓缩洗涤液
称取NaCl 240g、Na2HPO4.12H2O 107.4g、NaH2PO4.2H2O 8.1g、KCl 6.0g用纯水溶解，再量取1.5mL吐温-20、7.5mL Proclin-300分别放入容量瓶，搅拌均匀，以纯水定容至1000mL，即得浓缩洗涤液；
(2)制备S100包被板条
用pH9.6的碳酸盐缓冲液将S100单克隆抗体稀释至浓度为1-5μg/mL作为包被液，按100μL/孔对微孔板进行包被，室温放置3-3.5h后在2～8℃条件下静置21-23h，将S100单克隆抗体吸附于微孔板上，用步骤(1)中浓缩洗涤液进行洗涤，再用含有小牛血清180-210ml/L，且pH7.3-7.5、0.05-0.15M的磷酸盐缓冲液进行封闭和保护，经过干燥制得S100包被板条；
(3)配制S100参考品和质控品
用参考品稀释液将S100标准品按比例稀释成0ng/mL、0.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL的系列浓度，建立定量参考品；用参考品稀释液将S100标准品稀释成0.5ng/mL、2ng/mL、10ng/mL的系列浓度，建立定量质控品；
(4)配制S100酶结合物
将辣根过氧化酶标记的S100单克隆抗体溶液与酶结合物稀释液稀释按照1:1000-1:2000的比例配制；
(5)配制发光底物液A和发光底物液B
发光底物液A：按照每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.3-2.6g、三羟甲基氨基甲烷1.3-1.6g、3-氨基邻苯二甲酰肼0.03-0.06g、对位碘酚0.006-0.008g进行配制，调节pH至9；
发光底物液B：按照每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.3-2.6g、三羟甲基氨基甲烷1.3-1.6g、过氧化氢0.15-0.3ml进行配制，调节pH至9；
(6)将所述步骤(1)、(3)、(4)和(5)中配制的酶结合物、参考品、质控品、浓缩洗涤液、发光底物液A和发光底物液B分别进行分装。
作为一种优选的技术方案，所述步骤(3)中参考品稀释液为pH为7.5的Tris-HCl缓冲溶液，且每1LTris-HCl缓冲溶液中还含有18-22g牛血清白蛋白、14-15g乙二胺四乙酸、3.8-4g 2-巯基乙醇和0.3-0.5mL的Proclin-300。
作为一种优选的技术方案，所述步骤(4)中酶结合物稀释液为pH7.5的PBS缓冲液，且每1LPBS缓冲液中还含有8-11g牛血清白蛋白、5-6g氯化钙、3-6％v/v的小牛血清、0.02-0.04％v/v的Proclin-300和0.3～1.0％v/v的AES。
本发明的第三个目的在于是：针对现有技术存在的不足，提供一种S100蛋白检测试剂盒检测S100蛋白的检测方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：
一种S100蛋白检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(1)样品收集
取待测者血液，静置待测血清30min，对所述待测血清进行离心处理10～20分钟；
(2)加样检测
S1.将在冷藏环境中贮存的试剂室温平衡15分钟以上；
S2.将浓缩洗涤液按1:40的比例稀释，摇匀备用，作为应用洗涤液；
S3.根据S100参考品、质控品及待测标本确定所需孔数；
S4.取S100参考品、质控品及样本各50μL加入相应孔内；
S5.取50μL S100酶结合物加入各孔，用振荡器振荡25-30秒，盖上封板膜，置37℃水浴25分钟；
S6.取出微孔板，用应用洗涤液洗板3-5次，洗涤时每孔注满洗涤液，停留10秒后吸尽拍干；
S7.根据使用量，将发光底物液A、B按1:1混匀，每孔加入100μL，用振荡器振荡20-25秒，设定每孔测量时间为1秒，于5分钟内测定结果；
(3)检测结果
根据各参考品溶液发光值，借助微孔板化学发光仪分析软件进行四参数Logistic拟合，坐标选择X-Y，得标准曲线；也可采用双对数Log(X)-Log(Y)线性分析方法，得标准曲线；最后根据标准曲线即可计算出样本中S100的浓度。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有以下优点：
(1)本发明试剂盒是将双抗体夹心法免疫测定原理与酶标记技术和酶催化化学发光免疫分析相结合的定量检测产品，由于本发明试剂盒体系中所采用的各溶液配方和各组分的制备方法均是该反应体系下的最优方案，为试剂盒的检测性能和使用有效期提供了有力保障，使得本发明试剂盒具有较宽的线性范围，在0.05ng/mL～20ng/mL之间成良好的线性关系；检测灵敏度小于0.05ng/mL，而且批内和批间差均符合检测标准，准确程度优于目前市场上其它类型的S100试剂盒，检测时间与目前市场上其它类型的S100试剂盒相比至少缩短了5分钟，大大提高了检测效率。
(2)本发明试剂盒具有无创、线性范围宽、特异性好、准确性高(相关性r为0.9995)等优点，而且能够对S100进行快速、准确的检测，而且误差小、检测灵敏度高、对检测设备要求低。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种S100蛋白检测试剂盒，包括以下组分：S100包被板条、S100参考品及质控品、S100酶结合物、浓缩洗涤液、发光底物液A和发光底物液B。其中S100包被板条为包被有S100抗体的化学发光板，S100抗体为鼠源的单克隆抗体，S100抗体的包被浓度为1-5μg/mL(优选包被浓度为3μg/mL)；S100酶结合物为辣根过氧化酶标记的S100单克隆抗体，S100酶结合物的浓度按照其与酶结合物稀释液1:1000-1:2000的比例稀释(优选工作浓度为1:1500)；S100参考品由S100标准品和参考品稀释液配制而成，S100参考品的浓度分别为0ng/mL、0.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL；S100质控品由S100标准品和参考品稀释液配制而成，所述S100质控品的浓度分别为0.5ng/mL、2ng/mL、10ng/mL。
浓缩洗涤液为含有0.15％v/v吐温20和0.75％v/v Proclin-300的pH7.4磷酸盐缓冲液。
发光底物液A为每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.5g、三羟甲基氨基甲烷1.5g、3-氨基邻苯二甲酰肼0.05g、对位碘酚0.0075g；发光底物液B为每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.5g、三羟甲基氨基甲烷1.5g、过氧化氢0.25ml。
实施例2
一种S100蛋白检测试剂盒的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)配制浓缩洗涤液
称取NaCl 240g、Na2HPO4.12H2O 107.4g、NaH2PO4.2H2O 8.1g、KCl 6.0g用纯水溶解，再量取1.5mL吐温-20、7.5mL Proclin-300分别放入容量瓶，搅拌均匀，以纯水定容至1000mL，即得浓缩洗涤液；
(2)制备S100包被板条
用pH9.6的碳酸盐缓冲液将S100单克隆抗体稀释至浓度为1-5μg/mL作为包被液，按100μL/孔对微孔板进行包被，室温放置3-3.5h后在2～8℃条件下静置21-23h，将S100单克隆抗体吸附于微孔板上，用步骤(1)中浓缩洗涤液进行洗涤、用再用含有小牛血清200ml/L，且pH7.4、0.1M的磷酸盐缓冲液进行封闭和保护，经过干燥制得S100包被板条；
(3)配制S100参考品和质控品
用参考品稀释液将S100标准品按一定的比例稀释成0ng/mL、0.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL的系列浓度，建立定量参考品；用参考品稀释液将S100标准品稀释成0.5ng/mL、2ng/mL、10ng/mL的系列浓度，建立定量质控品；
其中参考品稀释液的配制：称取6.057g Tris溶于1L纯水中，用盐酸调节pH为7.5；称取20g牛血清白蛋白、14.612g乙二胺四乙酸(EDTA)、3.907g 2-巯基乙醇溶于1L的Tris-HCl缓冲液中，再加入0.3mL的Proclin-300。
(4)配制S100酶结合物
用酶结合物稀释液将辣根过氧化酶标记的S100单克隆抗体溶液稀释配制为1:1000-1:2000的工作浓度；
其中酶结合物稀释液的配制：准确称量NaCl 9.0g、Na2HPO4.12H2O 29.0g、NaH2PO4.2H2O 2.96g加入容量瓶，先加适量纯水，轻摇使之溶解完全，以纯水定容至1000mL；然后再称取10g牛血清白蛋白、5.55g氯化钙溶于1L的PBS缓冲液中，再加入5％v/v的小牛血清和0.03％v/v的Proclin-300，经过滤除菌后，加入0.3～1.0％v/v的AES；
(5)配制发光底物液A和发光底物液B
发光底物液：按照每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.5g、三羟甲基氨基甲烷1.5g、3-氨基邻苯二甲酰肼0.05g、对位碘酚0.0075g进行配制，并调pH至9；
发光底物液B：按照每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.5g、三羟甲基氨基甲烷1.5g、过氧化氢0.25ml进行配制，调pH至9；
(6)将所述步骤(1)、(3)、(4)和(5)中配制的酶结合物、参考品、质控品、浓缩洗涤液、发光底物液A和发光底物液B分别进行分装。
实施例3
一种S100蛋白检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(1)样品收集
取待测者血液，静置待测血清30min，对所述待测血清进行离心处理10～20分钟，即可进行检测。
(2)加样检测步骤
S1、将在冷藏环境中贮存的试剂室温平衡15分钟以上；
S2、将浓缩洗涤液按1：40的比例稀释，摇匀备用，作为应用洗涤液；
S3、根据S100参考品、质控品及待测标本确定所需孔数；
S4、直接取S100参考品、质控品及样本各50μL加入相应孔内；
S5、取50μL S100酶结合物加入各孔，用振荡器振荡30秒，盖上封板膜，置37℃水浴25分钟；
S6、取出微孔板，用应用洗涤液洗板5次，洗涤时每孔注满洗涤液，停留10秒后吸尽拍干；
S7、根据使用量，将底物液A、B按1：1混匀，每孔加入100μL，用振荡器振荡20秒钟，设定每孔测量时间为1秒，于5分钟内测定结果。
(3)检测结果
根据各参考品溶液发光值，借助微孔板化学发光仪分析软件进行四参数Logistic拟合，坐标选择X-Y，得标准曲线；也可采用双对数Log(X)-Log(Y)线性分析方法，得标准曲线。最后根据标准曲线即可计算出样本中S100的浓度。
(4)结果分析
正常参考值:＜0.2ng/mL。
实施例4
一种S100蛋白检测试剂盒的主要产品性能指标为：
(1)试剂盒的最低检测限(灵敏度)
10孔平行测定样本稀释液，计算测定结果的平均数(M)与标准差(SD)，得出M+2SD对应的发光值，代入剂量-反应曲线，计算出相应的浓度值，该浓度值即为本试剂盒的最低检测限，本试剂盒的最低检测限指标检测结果见表1。
表1 试剂盒最低检测限的测定
结论：测定的S100样本稀释液的平均发光值M＝3712.60，SD＝279.10，将(M+2SD)的值带入此次反应曲线，得其灵敏度为：0.009ng/mL(<0.05ng/mL)，符合要求。
(2)试剂盒的剂量-反应曲线的线性
复孔测定试剂盒的参考品(S0-S5，浓度依次为0、0.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL和20ng/mL)，用四参数进行拟合，剂量-反应曲线线性相关系数(r)应不小于0.9900；本试剂盒的剂量-反应曲线的线性检测结果见表2。
表2 试剂盒剂量-反应曲线的线性
结论：测定的S100剂量-反应曲线线性相关系数(r)为：0.9995(>0.9900)，符合要求。
(3)试剂盒的准确度
检测浓度为2ng/mL和10ng/mL的参考品，每浓度参考品检测3次，计算测定结果的均值M，测定值与靶值的相对偏差(Bias％)应不超过15.0％，本试剂盒的准确度检测结果见表3。
表3 试剂盒的准确度
结论：测定的2ng/mL和10ng/mL准确度参考品的相对偏差(Bias％)分别为：2.00％和2.80％(均<15.0％)，符合要求。
(4)试剂盒的精密度
a.分析内精密度：浓度分别为2ng/mL和10ng/mL的参考品重复检测，其
变异系数(CV)均应不高于15.0％；本试剂盒的分析内精密度检测结果见表4。
表4 试剂盒分析内精密度的测定
| 编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | CV |
| 2ng/mL | 1.93 | 2.08 | 1.87 | 2.07 | 1.92 | 1.92 | 1.96 | 1.97 | 2.18 | 2.07 | 4.88％ |
| 10ng/mL | 10.12 | 10 | 10.28 | 9.47 | 9.78 | 10.05 | 10.31 | 9.86 | 9.97 | 10.06 | 2.46％ |
结论：测定的2ng/mL和10ng/mL精密度参考品的分析内变异系数(CV)分别为：4.88％和2.46％(均<15.0％)，符合要求。
b、分析间精密度：同一批号试剂盒，用浓度分别为2ng/mL和10ng/mL的参考品检测，3次独立分析，其变异系数(CV)均应不高于20.0％；本试剂盒的分析间精密度检测结果见表5。
表5 试剂盒分析间精密度的测定
结论：测定的2ng/mL和10ng/mL精密度参考品的分析间变异系数(CV)分别为：4.47％和3.75％(均<20.0％)，符合要求。
c、批间精密度：用3个批号的试剂盒分别检测浓度为2ng/mL和10ng/mL的参考品，各重复10次，则3个批号试剂盒之间的批间变异系数(CV)均应不高于20.0％。本试剂盒的分析间精密度检测结果见表6。
表6 试剂盒批间精密度的测定
结论：测定的2ng/mL和10ng/mL精密度参考品的批间变异系数(CV)分别为：5.63％和2.00％(均<20.0％)，符合要求。
通过上述检测结构可以得出，本发明设计的一种S100蛋白检测试剂盒在灵敏度、准确度、精密度等各项质量参数均处于领先地位。
实施例5
一种S100蛋白检测试剂盒的临床检测实例如下：
采用本发明试剂盒进行检测，总共检测样本240例。其中阳性样本约80例(用罗氏诊断产品(上海)有限公司的S100检测试剂盒(电化学发光法)确诊为S100阳性的血清样本)；阴性样本约160例(体检后经证实无脑炎、脑血栓、脑血管类疾病、脑损伤及中枢神经类疾病的人群)，其中包含干扰因素及交叉反应样本40例(高脂血样本、溶血样本、高胆红素样本、类风湿因子阳性样本各10例)，检测结果见表7。
表7 S100考核试剂与对比试剂检测结果比较
结论：t值＜t0.05,500＝1.965＜t0.05,239，P＞0.05，两种试剂差别无显著性，说明两试剂测定结果高度相关，具有等效性。
S100考核试剂与对比试剂阳性符合率为97.5％，阴性符合率为99.375％，总符合率为98.75％。通过相关性分析、卡方检验及配对t检验，说明考核试剂和临床诊断不存在显著性差异，具有很好的相关性。
本专利不局限于上述具体的实施方式，本领域的普通技术人员从上述构思出发，不经过创造性的劳动，所作出的种种变换，均落在本专利的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种S100蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：S100包被板条、S100参考品及S100质控品、S100酶结合物、浓缩洗涤液、发光底物液A和发光底物液B。
2.根据权利要求1所述的一种S100蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述S100包被板条为包被有S100抗体的化学发光板，所述S100抗体为鼠源的单克隆抗体，所述S100抗体的包被浓度为1-5μg/mL；
所述S100酶结合物为辣根过氧化酶标记的S100单克隆抗体，所述S100酶结合物的浓度按照其与酶结合物稀释液1:1000-1:2000的比例稀释；
所述S100参考品及S100质控品分别由S100标准品和参考品稀释液配制而成，所述S100参考品的浓度分别为0ng/mL、0.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL；
所述S100质控品的浓度分别为0.5ng/mL、2ng/mL、10ng/mL。
3.根据权利要求2所述的一种S100蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述S100抗体的包被浓度为3μg/mL。
4.根据权利要求2所述的一种S100蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述S100酶结合物的浓度按照其与酶结合物稀释液1:1500的比例稀释。
5.根据权利要求1所述的一种S100蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述浓缩洗涤液为pH7.4的磷酸盐缓冲液，且每1L磷酸盐缓冲液中还含有0.1％-0.2％v/v吐温-20和0.6％-0.8％v/v Proclin-300。
6.根据权利要求1所述的一种S100蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述发光底物液A为每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.3-2.6g、三羟甲基氨基甲烷1.3-1.6g、3-氨基邻苯二甲酰肼0.03-0.06和对位碘酚0.006-0.008g；所述发光底物液B为每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.3-2.6g、三羟甲基氨基甲烷1.3-1.6g和过氧化氢0.15-0.3ml。
7.一种如权利要求1所述S100蛋白检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述制备方法包括下列步骤：
(1)配制浓缩洗涤液
称取NaCl 240g、Na2HPO4.12H2O 107.4g、NaH2PO4.2H2O 8.1g、KCl 6.0g用纯水溶解，再量取1.5mL吐温-20、7.5mL Proclin-300分别放入容量瓶，搅拌均匀，以纯水定容至1000mL，即得浓缩洗涤液；
(2)制备S100包被板条
用pH9.6的碳酸盐缓冲液将S100单克隆抗体稀释至浓度为1-5μg/mL作为包被液，按100μL/孔对微孔板进行包被，室温放置3-3.5h后在2～8℃条件下静置21-23h，将S100单克隆抗体吸附于微孔板上，用步骤(1)中浓缩洗涤液进行洗涤，再用含有小牛血清180-210ml/L，且pH7.3-7.5、0.05-0.15M的磷酸盐缓冲液进行封闭和保护，经过干燥制得S100包被板条；
(3)配制S100参考品和S100质控品
用参考品稀释液将S100标准品按比例稀释成0ng/mL、0.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL的系列浓度，建立定量参考品；用参考品稀释液将S100标准品稀释成0.5ng/mL、2ng/mL、10ng/mL的系列浓度，建立定量质控品；
(4)配制S100酶结合物
将辣根过氧化酶标记的S100单克隆抗体溶液与酶结合物稀释液按照1:1000-1:2000的比例配制；
(5)配制发光底物液A和发光底物液B
发光底物液A：按照每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.3-2.6g、三羟甲基氨基甲烷1.3-1.6g、3-氨基邻苯二甲酰肼0.03-0.06g、对位碘酚0.006-0.008g进行配制，调节pH至9；
发光底物液B：按照每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.3-2.6g、三羟甲基氨基甲烷1.3-1.6g、过氧化氢0.15-0.3ml进行配制，调节pH至9；
(6)将所述步骤(1)、(3)、(4)和(5)中配制的酶结合物、参考品、质控品、浓缩洗涤液、发光底物液A和发光底物液B分别进行分装。
8.根据权利要求7所述的一种S100蛋白检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中参考品稀释液为pH为7.5的Tris-HCl缓冲溶液，且每1LTris-HCl缓冲溶液中还含有18-22g牛血清白蛋白、14-15g乙二胺四乙酸、3.8-4g 2-巯基乙醇和0.3-0.5mL的Proclin-300。
9.根据权利要求7所述的一种S100蛋白检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中酶结合物稀释液为pH7.5的PBS缓冲液，且每1LPBS缓冲液中还含有8-11g牛血清白蛋白、5-6g氯化钙、3-6％v/v的小牛血清、0.02-0.04％v/v的Proclin-300和0.3～1.0％v/v的AES。
10.一种如权利要求1所述S100蛋白检测试剂盒的使用方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)样品收集
取待测者血液，静置待测血清30min，对所述待测血清进行离心处理10～20分钟；
(2)加样检测
S1.将在冷藏环境中贮存的试剂室温平衡15分钟以上；
S2.将浓缩洗涤液按1:40的比例稀释，摇匀备用，作为应用洗涤液；
S3.根据S100参考品、质控品及待测标本确定所需孔数；
S4.取S100参考品、质控品及样本各50μL加入相应孔内；
S5.取50μL S100酶结合物加入各孔，用振荡器振荡25-30秒，盖上封板膜，置37℃水浴25分钟；
S6.取出微孔板，用应用洗涤液洗板3-5次，洗涤时每孔注满洗涤液，停留10秒后吸尽拍干；
S7.根据使用量，将发光底物液A、B按1:1混匀，每孔加入100μL，用振荡器振荡20-25秒，设定每孔测量时间为1秒，于5分钟内测定结果；
(3)检测结果
根据各参考品溶液发光值，借助微孔板化学发光仪分析软件进行四参数Logistic拟合，坐标选择X-Y，得标准曲线；或采用双对数Log(X)-Log(Y)线性分析方法，得标准曲线；最后根据标准曲线即可计算出样本中S100的浓度。
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