CN116008567A - 一种胃泌素17检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种胃泌素17检测试剂盒。该试剂盒包含第一试剂、第二试剂。第一试剂包含缓冲液、防腐剂、促凝剂、表面活性剂、离散剂、阻断剂；第二试剂包含缓冲液、稳定剂、防腐剂、聚苯乙烯胶乳颗粒、抗胃泌素17抗体。本申请的试剂盒具有稳定性好、特异性强等优点，适用于各大类型的生化仪，能够以更快的速度进行胃泌素17的检测。
Description
技术领域
本申请属于体外诊断领域，具体涉及免疫比浊法的胃泌素17检测试剂盒。
背景技术
胃泌素-17主要是由胃窦G细胞分泌，其促进消化道平滑肌的收缩，促进壁细胞分泌胃酸，营养胃肠道黏膜和促进胃黏膜上皮多种类型细胞(如ECL细胞)的增殖。
胃泌素-17在筛查萎缩性胃炎和胃癌方面有重要地位。此外，胃泌素-17与糖尿病之间也有密切的相关性，糖尿病是一种常见的由遗传和环境因素相互作用所致的代谢性疾病，由于胰岛素分泌缺乏和/或胰岛素抵抗导致的糖代谢紊乱。据报道，胃泌素-17可改善糖尿病患者的血糖控制。2型糖尿病患者起病比较隐蔽，但在早期无症状阶段仍有相关并发症进展的风险。
目前的医疗手段尚无根治糖尿病的可能，所以及时发现并采取有效控制措施是预防和治疗糖尿病及其并发症的最佳方法。越来越多的研究发现胃泌素-17与糖尿病相关并发症的发生发展或预测密不可分。
因此，本领域仍需要一种有效检测胃泌素17的试剂盒。
发明内容
鉴于本领域的需求，本申请提供了一种胃泌素17的乳胶增强免疫比浊法检测试剂盒，其包含：
第一试剂、和
第二试剂。
在一些实施方案中，所述第一试剂包含：
在一些实施方案中，所述第二试剂包含：
在一些实施方案中，所述第一试剂的缓冲液选自以下任一项：甘氨酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、MES缓冲液；优选MES缓冲液。
在一些实施方案中，所述第二试剂的缓冲液选自以下任一项：甘氨酸缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液；优选甘氨酸缓冲液。
在一些实施方案中，所述促凝剂选自以下任一项：PEG6000、PEG8000、PEG20000；优选PEG8000。
在一些实施方案中，所述防腐剂选自以下任一项：叠氮钠、硫柳汞、ProClin300；优选叠氮钠。
在一些实施方案中，所述阻断剂为抗人IgM或羊抗鼠IgG。
在一些实施方案中，所述稳定剂选自以下任一项：蔗糖、甘油、海藻糖、葡萄糖；优选海藻糖。
在一些实施方案中，所述胶乳颗粒的表面修饰有选自以下的任一项：氨基、羧基、氯甲基；优选羧基。
在一些实施方案中，抗胃泌素17抗体包含单克隆抗体或其抗原结合片段。单克隆抗体指基本上均质的抗体的群，即在该群中包含的抗体分子的氨基酸序列是相同的，除了可能少量存在的天然突变以外。术语“抗原结合片段”是指抗体的抗原结合片段及抗体类似物，其通常包括至少部分母体抗体的抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)。抗体片段保留母体抗体的至少某些结合特异性。抗原结合片段实例包括但不限于：Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、线性抗体、单链抗体、纳米抗体、结构域抗体和多特异性抗体。
在一些实施方案中，所述胶乳颗粒的平均粒径不低于360nm且不超过400nm。
技术人员理解，胶乳颗粒的平均粒径不能理解为试剂中的每一个粒子都是指定的粒径值，而是指统计学意义上胶乳颗粒的粒径集中在390nm呈正态分布。平均粒径也被作为市售胶乳颗粒的规格。
在一些实施方案中，所述胶乳颗粒的平均粒径是390nm。
在一些实施方案中，所述第一试剂的pH为7.0。
在一些实施方案中，提供了一种胃泌素17的乳胶增强免疫比浊法检测试剂盒，其中：
所述第一试剂包含/由以下组成：
所述第二试剂包含/由以下组成：
所述胶乳颗粒是羧基修饰的聚苯乙烯胶乳颗粒；所述胶乳颗粒的平均粒径是390nm。
附图说明
图1.定标曲线。
具体实施方式
实施例1.第一试剂的制备
1.称取16.00g MES、13.15g NaCl、3.75g PEG8000、1.5g叠氮钠、15mL阻断剂(5mg/mL)，溶于1.0L双蒸水中，调节pH至6.0，定容至1.5L即得试剂第一试剂(1)：
2.称取16.00g MES、13.15g NaCl、3.75g PEG8000、1.5g叠氮钠、15mL阻断剂(5mg/mL)，溶于1.0L双蒸水中，调节pH至7.0，定容至1.5L即得试剂第一试剂(2)：
3.称取16.00g MES、13.15g NaCl、3.75g PEG8000、1.5g叠氮钠、15mL阻断剂(5mg/mL)，溶于1.0L双蒸水中，调节pH至8.0，定容至1.5L即得试剂第一试剂(3)：
实施例2.制备抗体包被的颗粒
A：粒径为300nm胶乳制备
1.用HEPES缓冲液将颗粒(300nm，羧基)稀释至1％(w/v)；
2.用HEPES缓冲液将抗体(小鼠单抗)稀释至0.5mg/ml；
3.将浓度为0.1％至1％(w/v)的EDAC水溶液加入至步骤1的颗粒中，在恒温摇床中37℃反应30min；
4.反应结束后，加入步骤2的抗体，在恒温摇床中37℃反应3h；
5.再加入封闭剂，常温过夜放置；
6.将封闭过夜的颗粒，加入清洗液清洗离心3次，保存，备用。
B：粒径为350nm胶乳制备
1.用HEPES缓冲液将颗粒(350nm，羧基)稀释至1％(w/v)；
2.用HEPES缓冲液将抗体(小鼠单抗)稀释至0.5mg/ml；
3.将浓度为0.1％至1％(w/v)的EDAC水溶液加入至步骤1的颗粒中，在恒温摇床中37℃反应30min；
4.反应结束后，加入步骤2的抗体，在恒温摇床中37℃反应3h；
5.再加入封闭剂，常温过夜放置；
6.将封闭过夜的颗粒，加入清洗液清洗离心3次，保存，备用。
C：粒径为390nm胶乳制备
1.用HEPES缓冲液将颗粒(390nm，羧基)稀释至1％(w/v)；
2.用HEPES缓冲液将抗体(小鼠单抗)稀释至0.5mg/ml；
3.将浓度为0.1％至1％(w/v)的EDAC水溶液加入至步骤1的颗粒中，在恒温摇床中37℃反应30min；
4.反应结束后，加入步骤2的抗体，在恒温摇床中37℃反应3h；
5.再加入封闭剂，常温过夜放置；
6.将封闭过夜的颗粒，加入清洗液清洗离心3次，保存，备用。
D：粒径为500nm胶乳制备
1.用HEPES缓冲液将颗粒(500nm，羧基)稀释至1％(w/v)；
2.用HEPES缓冲液将抗体(小鼠单抗)稀释至0.5mg/ml；
3.将浓度为0.1％至1％(w/v)的EDAC水溶液加入至步骤1的颗粒中，在恒温摇床中37℃反应30min；
4.反应结束后，加入步骤2的抗体，在恒温摇床中37℃反应3h；
5.再加入封闭剂，常温过夜放置；
6.将封闭过夜的颗粒，加入清洗液清洗离心3次，保存，备用。
实施例3.第二试剂的制备
将实施例2制备的各种颗粒按如下配制，超声至主波长吸光度相对变化率不超过2％，即得第二试剂：
实施例2中的A：第二试剂(1)；
实施例2中的B：第二试剂(2)；
实施例2中的C：第二试剂(3)；
实施例2中的D：第二试剂(4)。
实施例4.试剂盒的组装
按照下表将前述试剂组装成试剂盒。
表1.试剂盒的组装
测试例
测试例1.定标吸光度
对上述试剂盒2采用全自动生化仪(比如，日立7180)进行测试。测定波长为660nm，样本取样量为15μL，在加入150μL的第一试剂，37℃恒温5min，然后加入50μL的第二试剂，42秒后读取吸光度A1，37℃孵育4分18秒后读取吸光度A2，反应吸光度为ΔA＝A2-A1；其定标结果参见图1。
测试例2.不同pH对灵敏度的影响
按照实施例4中表1的组合验证灵敏度。结果如下，出乎意料地发现：
1.第一试剂pH为7.0时灵敏度最优；pH6.0或8.0时，灵敏度有限(表1)；
2.当第一试剂PEG8000替换为2g/L PEG20000或4g/L的PEG6000时，pH 7.0也显著优于6.0、8.0时的LOQ(数据未显示)。
3.如果将第二试剂的粒径替换为300nm、350nm或500nm，未发现第一试剂的pH 7.0带来灵敏度改善(数据未显示)。
表2.灵敏度
| pH | LOQ(pg/mL) |
| 6 | 6.64 |
| 7 | 2.08 |
| 8 | 4.77 |
测试例3.粒径对稳定性的影响
按照实施例4的各组合验证稳定性。
表3.稳定性
结果可见，仅在平均粒径为390nm时观察到稳定性的改善，而其他粒径时变化率均大于10％。然而，如果将第一试剂的pH替换为6.0或8.0，则无法观察到390nm平均粒径对稳定性的改善作用。
Claims (4)
1.一种胃泌素17的乳胶增强免疫比浊法检测试剂盒，其包含：
第一试剂、和
第二试剂，
其中，所述第一试剂包含：
pH 6.0至8.0；
其中，所述第二试剂包含：
pH 7.5至8.5；
其中：
所述第一试剂的缓冲液选自以下任一项：甘氨酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、MES缓冲液；优选MES缓冲液；
所述第二试剂的缓冲液选自以下任一项：甘氨酸缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液；优选甘氨酸缓冲液；
所述促凝剂选自以下任一项：PEG6000、PEG8000、PEG20000；优选PEG8000；
所述防腐剂选自以下任一项：叠氮钠、硫柳汞、ProClin300；优选叠氮钠；
所述阻断剂为抗人IgM或羊抗鼠IgG；
所述稳定剂选自以下任一项：蔗糖、甘油、海藻糖、葡萄糖；优选海藻糖；
所述胶乳颗粒的表面修饰有选自以下的任一项：氨基、羧基、氯甲基；优选羧基；
所述胶乳颗粒的平均粒径不低于360nm且不超过400nm。
2.根据权利要求1所述的胃泌素17的乳胶增强免疫比浊法检测试剂盒，所述胶乳颗粒的平均粒径是390nm。
3.根据权利要求1所述的胃泌素17的乳胶增强免疫比浊法检测试剂盒，所述第一试剂的pH为7.0。
4.根据权利要求1所述的胃泌素17的乳胶增强免疫比浊法检测试剂盒，其中：
所述第一试剂包含或由以下组成：
pH 7.0；
所述第二试剂包含或由以下组成：
pH 8.0；
所述胶乳颗粒是羧基修饰的聚苯乙烯胶乳颗粒；
所述胶乳颗粒的平均粒径是390nm。
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