CN113125749A - 一种用于检测血清糖化白蛋白的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及体外诊断领域，具体涉及一种用于检测血清糖化白蛋白的试剂盒，包括试剂R1、试剂R2、校准品，试剂R1包括第一缓冲液、生物素标记的抗人糖化白蛋白抗体、FITC标记的抗人糖化白蛋白抗体、第一稳定剂、第一防腐剂以及第一表面活性剂；试剂R2包括第二缓冲液、链霉亲和素修饰胶乳微球、Anti‑FITC修饰胶乳微球、第二稳定剂、螯合剂、第二防腐剂、第二表面活性剂、增溶剂以及促聚剂；校准品包括第三缓冲液、人糖化白蛋白、第三稳定剂以及第三防腐剂。该试剂盒灵敏度高、准确度高、稳定性好。

Description

一种用于检测血清糖化白蛋白的试剂盒
技术领域
本发明涉及体外诊断领域，具体涉及一种用于检测血清糖化白蛋白的试剂盒。
背景技术
人体中的葡萄糖与血清蛋白的N-末端发生非酶促的糖基化反应过程中，90％的葡萄糖与血清蛋白链内第189位赖氨酸结合形成高分子的酮胺结构，称为糖化血清蛋白，而其中90％以上为糖化白蛋白(Glycated Albumin,GA)，因此糖化白蛋白可以作为反映糖化血清蛋白的总体水平的标志。
白蛋白半衰期短(17-20天)，GA反映测定前2-3周血糖的平均水平。GA是在GSP(糖化血清蛋白)基础上进行定量测定，利用血清GA与血清白蛋白的百分比来表示GA的水平，去除血清白蛋白水平对检测结果的影响，因此较GSP更精确。GA临床应用于评价短期糖代谢控制情况，辅助鉴别应激性高血糖，筛查糖尿病。已有证据表明GA作为一种重要的糖基化产物，与糖尿病肾病、视网膜病变及动脉粥样硬化等慢性并发症具有良好相关性。
GA检测方法主要有阴离子交换层析法、高效液相色谱法、酶法等分析法。其中阴离子交换层析法、高效液相色谱法需要对GA进行复杂的样品前处理，同时仪器昂贵，耗资大，不适合临床常规分析。酶法虽好，但检测时需要两步酶解，而应用于全自动生化分析仪时却需要酶解率达到90％以上，这就要求加大酶量，但同时会使试剂粘度加大，出现检测灵敏度降低等影现象，响检测结果，同时还会使稳定性降低，使实际有效期缩短。因此针对上述问题，研发了一种用于检测血清糖化白蛋白的试剂盒。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种用于检测血清糖化白蛋白的试剂盒，该试剂盒灵敏度高、准确度高、稳定性好。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种用于检测血清糖化白蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括：
试剂R1，所述试剂R1包括第一缓冲液、生物素标记的抗人糖化白蛋白抗体、FITC标记的抗人糖化白蛋白抗体、第一稳定剂、第一防腐剂以及第一表面活性剂；
试剂R2，所述试剂R2包括第二缓冲液、链霉亲和素修饰胶乳微球、Anti-FITC修饰胶乳微球、第二稳定剂、螯合剂、第二防腐剂、第二表面活性剂、增溶剂以及促聚剂；
校准品，所述校准品包括第三缓冲液、人糖化白蛋白、第三稳定剂以及第三防腐剂。
作为一种改进的技术方案，所述第一缓冲液为磷酸盐缓冲液、TRIS缓冲液、CAPSO缓冲液、MOPS缓冲液、Hepes缓冲液，所述第一缓冲液的浓度为30-500mM，pH为6.0-9.5；所述第二缓冲液为TRIS缓冲液、硼砂-氢氧化钠缓冲液、CAPSO缓冲液、MOPS缓冲液、Hepes缓冲液，所述第二缓冲液的浓度为30-500mM，pH为6.0-9.5；所述第三缓冲液为磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、CAPSO缓冲液、MOPS、Hepes缓冲液，所述第三缓冲液的浓度为30-500mM，pH为6.0-9.5。
作为一种改进的技术方案，所述第一稳定剂、第二稳定剂以及第三稳定剂分别为牛血清白蛋白、甘油、乙二醇、丙氨酸、聚氧乙烯-8-辛基苯基醚、明胶、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、硼酸、氮氧自由基哌啶醇中的一种或多种组合；所述第一稳定剂、第二稳定剂或第三稳定剂的浓度为0.01-10％w/v。
作为一种改进的技术方案，所述第一防腐剂、第二防腐剂或第三防腐剂为叠氮钠、硫柳汞、Proclin-300中的一种或多种，所述第一防腐剂、第二防腐剂或第三防腐剂的浓度为0.05-3％w/v。
作为一种改进的技术方案，所述第一表面活性剂和第二表面活性剂为乙基苯基聚乙二醇(NP40)、吐温20、十二烷基硫酸钠(SDS)、山梨醇酐单硬脂酸(S-40)、山梨醇酐单硬脂酸(S-60)、聚乙二醇辛基苯基醚-100、十二烷基羟丙基磷酸酯甜菜碱中的一种或多种，所述第一表面活性剂或第二表面活性剂的浓度为0.1-3.5％w/v。
作为一种改进的技术方案，所述增溶剂为聚氧乙烯多环苯醚，其浓度为0.5-3.2％w/v；所述螯合剂为EDTA、EGTA、乙二胺、草酸、山梨糖醇中的一种或多种，所述螯合剂的浓度为0.05-2.5％w/v；所述促聚剂为聚乙二醇-6000、聚乙二醇-8000、聚乙二醇-10000、聚乙二醇-20000中的一种或多种，所述促聚剂的浓度为0.5-4％w/v。
作为一种改进的技术方案，所述第一防腐剂、所述第二防腐剂以及所述第三防腐剂分别为叠氮钠、硫柳汞、Proclin-300、苯酚、Krovin600中的一种、两种或两种以上的组合；所述第一防腐剂、第二防腐剂以及第三防腐剂的浓度为0.05-5％w/v。
作为一种改进的技术方案，所述生物素标记的抗人糖化白蛋白抗体的浓度为1-200μg/ml，所述FITC标记的抗人糖化白蛋白抗体的浓度为1-200μg/ml。
作为一种改进的技术方案，链霉亲和素(SA)修饰胶乳微球的浓度为0.1-2mg/ml，链霉亲和素(SA)修饰的胶乳微球的粒径为50-200nm；Anti-FITC修饰胶乳微球的浓度为0.1-2mg/ml，Anti-FITC修饰的胶乳微球的粒径200-400nm。
采用了上述技术方案后，本发明的有益效果是：
(1)本发明引入了SA-生物素-抗体(抗原)-抗原(抗体)-抗体(抗原)-FITC-anti-FITC多重级联放大系统，由于SA结合生物素很易与蛋白质(如抗体等)以共价键结合，结合了胶乳微球的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，其中一个抗体可以和多个生物素结合，一个生物素分子又可以和四个链霉亲和素分子结合，起到了多级放大作用，达到检测未知抗原(或抗体)分子的目的。FITC能很好的与各种抗体结合，不影响结合后的抗体与抗原结合的特异性，这样结合胶乳微球的anti-FITC能更好的与结合抗体的FITC特异的反应，检测时抗原(抗体)与SA-生物素-抗体、抗体-FITC-anti-FITC反应，反应复合物进一步增大，进一步起到多级放大系统的作用，提高试剂的灵敏度；
(2)本发明选择小粒径胶乳微球结合链霉亲和素，小粒径微球检测线性较好，大粒径胶乳微球结合FITC，大粒径胶乳微球检测灵敏度高。可以保证试剂有良好的线性的情况下最大程度的提高其灵敏度。
附图说明
图1为本发明试剂盒的标准曲线图；
图2为本发明试剂盒的线性关系图；
图3为本发明实施例4与进口试剂测定结果的对照分析图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，结合以下实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种用于检测血清糖化白蛋白的试剂盒包括：
试剂R1的pH为6.0，其配方组分如下：
第一缓冲液(磷酸盐缓冲液，30mM)、生物素标记的抗人糖化白蛋白抗体(100μg/ml)、FITC标记的抗人糖化白蛋白抗体(50μg/ml)、第一稳定剂(0.05％w/v的半乳糖)、第一防腐剂(0.05％w/v的叠氮钠)以及第一表面活性剂(0.5％w/v的乙基苯基聚乙二醇)；
试剂R2的pH为6.0，其配方组分如下：
第二缓冲液(TRIS缓冲液，30mM)、链霉亲和素修饰胶乳微球(0.1mg/ml，粒径为150nm)、Anti-FITC修饰胶乳微球(0.1mg/ml，粒径为300nm)、第二稳定剂(0.05％w/v抗坏血栓氧化酶)、螯合剂(0.05％w/v的EDTA)、第二防腐剂(0.05％w/v的叠氮钠)、第二表面活性剂(0.5％w/v的S-40)、增溶剂(聚氧乙烯多环苯醚，其浓度为0.5％w/v)以及促聚剂(0.5％w/v的聚乙二醇-6000)；
校准品的pH为6.0，其配方组分如下：
第三缓冲液(磷酸盐缓冲液，30mM)、人糖化白蛋白(浓度梯度为0g/L、2.87g/L、5.73g/L、11.46g/L、22.93g/L、45.86g/L、91.71g/L)、第三稳定剂(0.3％w/v甘油)以及第三防腐剂(0.05％w/v的叠氮钠)。
实施例2
一种用于检测血清糖化白蛋白的试剂盒包括：
试剂R1的pH为6.5，其配方组分如下：
第一缓冲液(MOPS缓冲液，80mM)、生物素标记的抗人糖化白蛋白抗体(60μg/ml)、FITC标记的抗人糖化白蛋白抗体(50μg/ml)、第一稳定剂(0.1％w/v的丙氨酸)、第一防腐剂(0.1％w/v的硫柳汞)以及第一表面活性剂(1％w/v的十二烷基硫酸钠)；
试剂R2的pH为6.5，其配方组分如下：
第二缓冲液(硼砂-氢氧化钠缓冲液，80mM)、链霉亲和素修饰胶乳微球(3mg/ml，粒径为100nm)、Anti-FITC修饰胶乳微球(1mg/ml，粒径250nm)、第二稳定剂(0.1％w/v牛血清白蛋白)、螯合剂(0.05％w/v的EDTA)、第二防腐剂(0.05％w/v的叠氮钠)、第二表面活性剂(1％w/v的十二烷基硫酸钠)、增溶剂(聚氧乙烯多环苯醚，其浓度为1％w/v)以及促聚剂(1％w/v的聚乙二醇-8000)；
校准品的pH为6.5，其配方组分如下：
第三缓冲液(甘氨酸缓冲液，80mM)、人糖化白蛋白(浓度梯度为0g/L、2.87g/L、5.73g/L、11.46g/L、22.93g/L、45.86g/L、91.71g/L)、第三稳定剂(0.3％w/v的牛血清白蛋白)以及第三防腐剂(0.1％w/v的硫柳汞)。
实施例3
一种用于检测血清糖化白蛋白的试剂盒包括：
试剂R1的pH为7，其配方组分如下：
第一缓冲液(Hepes缓冲液，120mM)、生物素标记的抗人糖化白蛋白抗体(60μg/ml)、FITC标记的抗人糖化白蛋白抗体(30μg/ml)、第一稳定剂(0.5％w/v的聚氧乙烯-8-辛基苯基醚和0.5％w/v的海藻糖)、第一防腐剂(0.3％w/v的Proclin-300)以及第一表面活性剂(1.5％w/v的十二烷基羟丙基磷酸酯甜菜碱)；
试剂R2的pH为7，其配方组分如下：
第二缓冲液(MOPS缓冲液，120mM)、链霉亲和素修饰胶乳微球(1mg/ml，粒径为100nm)、Anti-FITC修饰胶乳微球(1mg/ml，粒径为200nm)、第二稳定剂(0.5％w/v的明胶)、螯合剂(0.1％w/v的乙二胺)、第二防腐剂(0.05％w/v的苯酚)、第二表面活性剂(1.5％w/v的十二烷基羟丙基磷酸酯甜菜碱)、增溶剂(聚氧乙烯多环苯醚，其浓度为2％w/v)以及促聚剂(2％w/v的聚乙二醇-10000)；
校准品的pH为7，其配方组分如下：
第三缓冲液(MOPS，120mM)、人糖化白蛋白(浓度梯度为0g/L、2.87g/L、5.73g/L、11.46g/L、22.93g/L、45.86g/L、91.71g/L)、第三稳定剂(0.6％w/v山梨醇)以及第三防腐剂(0.05％w/v的Proclin-300)。
实施例4
一种用于检测血清糖化白蛋白的试剂盒包括：
试剂R1的pH为7.5，其配方组分如下：
第一缓冲液(TRIS缓冲液，50mM)、生物素标记的抗人糖化白蛋白抗体(100μg/ml)、FITC标记的抗人糖化白蛋白抗体(50μg/ml)、第一稳定剂(1％w/v的甘氨酸、0.05％w/v牛血清白蛋白和7.5％w/v的麦芽糖)、第一防腐剂(1％w/v的叠氮钠)以及第一表面活性剂(0.75g/ml的SDS和0.5％w/v聚乙二醇对异辛基苯基醚-100)；
FITC标记抗人糖化白蛋白抗体：取抗人糖化白蛋白抗体(鼠抗人、兔抗人、羊抗人或者牛抗人糖化白蛋白抗体)适量，加人缓冲液搅拌混匀，得到抗体浓度为20mg/ml的溶液；将FITC加入抗体溶液中，4℃条件下避光搅拌12h进行第一次透析，再经过离心(2500r/min，20min)，将上清液装入透析袋中用pH8.0缓冲盐水在0～4℃的条件下进行第二次透析过夜，取透析过夜后的标记物通过葡聚糖凝胶SephadexG-25或G—50柱，经过分离后收集的FITC标记抗人糖化白蛋白抗体备用。
生物素标记抗人糖化白蛋白抗体：将抗人糖化白蛋白抗体用0.1mol/L缓冲液(pH8.0)稀释到1mg/ml，向1ml抗体溶液中(即含抗体1mg)加入120μl，浓度为1mg/ml的NHSB溶液,搅拌保温2-4h，再加入9.6μL1 mol/L NH4Cl(按照每25μg NHSB加1μlNH4Cl的量加入)，在室温下搅拌10分钟，然后在4℃条件下充分透析，以除去游离的生物素，将样品上1ml的分子筛柱，以PBS缓慢洗脱，收集1ml/管，蛋白质在1-3ml之间洗下，将样品加入叠氮钠(终浓度0.5g/L)及1.0g/L BSA。将结合产物置4℃，避光保存，亦可加入50％重蒸甘油，置-20℃保存。
生物素标记抗人糖化白蛋白抗体和FITC标记糖化白蛋白抗体按照1-3:1的比例混合均匀，加入相应量的稳定剂、防腐剂、表面活性剂制成试剂R1；
试剂R2的pH为7.5，其配方组分如下：
第二缓冲液(TRIS缓冲液，60mM)、链霉亲和素修饰胶乳微球(0.9mg/ml，胶乳微球的粒径为100nm)、Anti-FITC修饰胶乳微球(0.9mg/ml，胶乳微球的粒径为300nm)、第二稳定剂(2％w/v的硼酸和7.5％w/v的海藻糖)、螯合剂(0.5％w/v的EDTA)、第二防腐剂(1％w/v的叠氮钠)、第二表面活性剂(0.3％w/v的吐温20)、增溶剂(聚氧乙烯多环苯醚，其浓度为0.5％w/v)以及促聚剂(1％w/v的聚乙二醇-6000)；
链霉亲和素修饰胶乳微球：反应缓冲液(TRIS缓冲液)稀释SA至10mg/ml，反应缓冲液稀释胶乳微球至1％,按照每10ml胶乳微球溶液加入1mlSA溶液的量将SA加入胶乳微球溶液中，室温搅拌孵育2h，离心/超滤，除去未结合SA，得到了SA修饰胶乳微球用TRIS缓冲液储存备用。
Anti-FITC修饰胶乳微球：反应缓冲液(TRIS缓冲液)稀释Anti-FITC至10mg/ml，反应缓冲液稀释胶乳微球至1％,将FITC抗体加入胶乳微球溶液种，按照每10ml胶乳微球溶液加入1mlAnti-FITC溶液的量将Anti-FITC溶液加入胶乳微球溶液中，室温搅拌孵育2h，离心/超滤，除去未结合Anti-FITC抗体，得到Anti-FITC修饰胶乳微球储存备用。
SA修饰胶乳微球和Anti-FITC修饰胶乳微球按照2-3:1的比例混合均匀，加入相应量的稳定剂、盐离子化合物、螯合剂、防腐剂制成试剂R2。
校准品的pH为7.5，其配方组分如下：
第三缓冲液(TRIS缓冲液，60mM)、人糖化白蛋白(浓度梯度为0g/L、2.87g/L、5.73g/L、11.46g/L、22.93g/L、45.86g/L、91.71g/L)、第三稳定剂(1％w/v牛血清白蛋白)以及第三防腐剂(1％w/v的叠氮钠)。
实施例5
一种用于检测血清糖化白蛋白的试剂盒包括：
试剂R1的pH为8.0，其配方组分如下：
第一缓冲液(Hepes缓冲液，50mM)、生物素标记的抗人糖化白蛋白抗体(110μg/ml)、FITC标记的抗人糖化白蛋白抗体(60μg/ml)、第一稳定剂(1％w/v的甘氨酸、0.05％w/v牛血清白蛋白和7.5％w/v的甘油)、第一防腐剂(1％w/v的Prolin-300)以及第一表面活性剂(0.75g/ml的SDS和0.5％w/v聚乙二醇对异辛基苯基醚-100)；
试剂R2的pH为8.0，其配方组分如下：
第二缓冲液(TRIS缓冲液，30mM)、链霉亲和素修饰胶乳微球(0.2mg/ml，胶乳微球的粒径为100nm)、Anti-FITC修饰胶乳微球(0.2mg/ml，胶乳微球的粒径为250nm)、第二稳定剂(2％w/v的甘油)、螯合剂(0.5％w/v的EDTA)、第二防腐剂(1％w/v的Prolin-300)、第二表面活性剂(0.3％w/v的吐温20)、增溶剂(聚氧乙烯多环苯醚，其浓度为0.5％w/v)以及促聚剂(1％w/v的聚乙二醇-6000)；
校准品的pH为8.0，其配方组分如下：
第三缓冲液(Hepes缓冲液，30mM)、人糖化白蛋白(浓度梯度为0g/L、2.87g/L、5.73g/L、11.46g/L、22.93g/L、45.86g/L、91.71g/L)、第三稳定剂(1％w/v牛血清白蛋白)以及第三防腐剂(1％w/v的Prolin-300)。
实施例6
一种用于检测血清糖化白蛋白的试剂盒包括：
试剂R1的pH为8.5，其配方组分如下：
第一缓冲液(Hepes缓冲液，50mM)、生物素标记的抗人糖化白蛋白抗体(40μg/ml)、FITC标记的抗人糖化白蛋白抗体(80μg/ml)、第一稳定剂(0.8％w/v牛血清白蛋白)、第一防腐剂(1％w/v的叠氮钠)以及第一表面活性剂(0.5％w/v聚乙二醇对异辛基苯基醚-100)；
试剂R2的pH为8.5，其配方组分如下：
第二缓冲液(TRIS缓冲液，30mM)、链霉亲和素修饰胶乳微球(0.6mg/ml，胶乳微球的粒径为100nm)、Anti-FITC修饰胶乳微球(0.6mg/ml，胶乳微球的粒径为250nm)、第二稳定剂(2％w/v的甘氨酸)、螯合剂(0.5％w/v的EDTA)、第二防腐剂(1％w/v的Prolin-300)、第二表面活性剂(0.3％w/v的吐温20)、增溶剂(聚氧乙烯多环苯醚，其浓度为0.5％w/v)以及促聚剂(1％w/v的聚乙二醇-6000)；
校准品的pH为8.5，其配方组分如下：
第三缓冲液(甘氨酸缓冲液，30mM)、人糖化白蛋白(浓度梯度为0g/L、2.87g/L、5.73g/L、11.46g/L、22.93g/L、45.86g/L、91.71g/L)、第三稳定剂(1％w/v牛血清白蛋白)以及第三防腐剂(1％w/v的硫柳汞)。
实施例7
一种用于检测血清糖化白蛋白的试剂盒包括：
试剂R1的pH为9，其配方组分如下：
第一缓冲液(Hepes缓冲液，300mM)、生物素标记的人糖化白蛋白抗体(150μg/ml)、FITC标记的抗人糖化白蛋白抗体(80μg/ml)、第一稳定剂(2％w/v乙二醇、2％w/v山梨醇和4％w/v蔗糖)、第一防腐剂(2％w/v的叠氮钠)以及第一表面活性剂(2％w/v吐温-40和1％w/v吐温-80)；
试剂R2的pH为9，其配方组分如下：
第二缓冲液(TRIS缓冲液，300mM)、链霉亲和素修饰胶乳微球(0.5mg/ml，胶乳微球的粒径为100nm)、Anti-FITC修饰胶乳微球(0.5mg/ml，胶乳微球的粒径为250nm)、第二稳定剂(2％w/v的聚氧乙烯-8-辛基苯基醚、2％w/v的海藻糖和2％w/v的山梨醇)、螯合剂(2％w/v的EDTA)、第二防腐剂(2.5％w/v的Prolin-300)、第二表面活性剂(0.3％w/v的吐温20)、增溶剂(聚氧乙烯多环苯醚，其浓度为0.5％w/v)以及促聚剂(3％w/v的聚乙二醇-6000)；
校准品的pH为9，其配方组分如下：
第三缓冲液(甘氨酸缓冲液，300mM)、人糖化白蛋白(浓度梯度为0g/L、2.87g/L、5.73g/L、11.46g/L、22.93g/L、45.86g/L、91.71g/L)、第三稳定剂(2％w/v牛血清白蛋白、2％w/v甘油和2％w/v丙氨酸)以及第三防腐剂(2.5％w/v的硫柳汞)。
实施例8
一种用于检测血清糖化白蛋白的试剂盒包括：
试剂R1的pH为9.5，其配方组分如下：
第一缓冲液(Hepes缓冲液，500mM)、生物素标记的抗人糖化白蛋白抗体(160μg/ml)、FITC标记的抗人糖化白蛋白抗体(100μg/ml)、第一稳定剂(2％w/v乙二醇、2％w/v甘油、2％w/v山梨醇和4％w/v甘氨酸)、第一防腐剂(2％w/v的叠氮钠)以及第一表面活性剂(2％w/v乙基苯基聚乙二醇)；
试剂R2的pH为9.5，其配方组分如下：
第二缓冲液(TRIS缓冲液，500mM)、链霉亲和素修饰胶乳微球(0.6mg/ml，胶乳微球的粒径为100nm)、Anti-FITC修饰胶乳微球(0.6mg/ml，胶乳微球的粒径为250nm)、第二稳定剂(2％w/v的甘氨酸聚氧乙烯-8-辛基苯基醚、2％w/v的海藻糖和2％w/v的蔗糖)、螯合剂(2％w/v的EDTA)、第二防腐剂(3％w/v的Prolin-300)、第二表面活性剂(0.3％w/v的吐温20)、增溶剂(聚氧乙烯多环苯醚，其浓度为0.5％w/v)以及促聚剂(3％w/v的聚乙二醇-6000)；
校准品的pH为9.5，其配方组分如下：
第三缓冲液(甘氨酸缓冲液，500mM)、人糖化白蛋白(浓度梯度为0g/L、2.87g/L、5.73g/L、11.46g/L、22.93g/L、45.86g/L、91.71g/L)、第三稳定剂(2％w/v牛血清白蛋白、2％w/v甘油和2％w/v甘氨酸)以及第三防腐剂(3％w/v的硫柳汞)。
其中需要说明的一点是，本发明实施例1-3以及5-8中生物素标记的抗人糖化白蛋白抗体、FITC标记的抗人糖化白蛋白抗体、链霉亲和素修饰胶乳微球、Anti-FITC修饰胶乳微球的具体操作与实施例4中的操作大体相同，因此省略。
为了更好的证明本发明的试剂盒具有较好的性能，进行了以下考察。
1.试剂校准曲线
按照需要的人糖化白蛋白参考校准品浓度将相应的人糖化白蛋白纯品加入校准品稀释液的缓冲液中，配制7个不同浓度的参考校准品，其浓度分别为：0g/L、2.87g/L、5.73g/L、11.46g/L、22.93g/L、45.86g/L、91.71g/L。校准曲线见表1和图1。
表1
浓度 0g/L 2.87g/L 5.73g/L 11.46g/L 22.93g/L 45.86g/L 91.71g/L
吸光度 0 199 320.5 574.5 1061 2003.5 3846
2.灵敏度实验
使用实施例4中的试剂选，用5ng/l浓度的样本作为样本测试，在全自动生化分析仪测试(日立全自动生化仪7080)，温度37℃，波长700纳米，测试吸光度。用95％可信限计算：重复测定空白样本20次，计算20次反应测得的均值(平均值(x))和标准差(SD)，以平均值(x)+2SD(夹心法)计算出相应的浓度，即为试剂的分析灵敏度，测试结果见表2。
表2
Figure BDA0002999384840000101
Figure BDA0002999384840000111
表1结果可以发现本发明试剂的分析灵敏度为0.1ng/mL
3.抗干扰实验
采用本发明实施例4中的试剂盒测试已知靶值且加入干扰物质的5个样本，5个样本中加入的干扰物质分别为15mg/dl胆红素F、15mg/dl胆红素C、200mg/dl血红蛋白、50mg/dl抗坏血酸和10mg/dl乳糜，浓度值见表3。
表3
Figure BDA0002999384840000112
Figure BDA0002999384840000121
实验结果显示，相对偏差均小于10％，说明采用本发明试剂盒检测含有干扰物质的样本，影响在可接受范围内。说明本发明试剂盒具有较好的抗干扰能力。
4.稳定性试验
检测本发明实施例4中的试剂盒及进口试剂(酶法)的稳定性，两种试剂每月选取同一样本(样本中GA的量是19.5g/l)测定三次，取平均值，与新鲜的本发明实施例4中试剂盒检测结果进行比对，从而确定试剂的稳定时间。检测结果如表4。
表4
时间 对照试剂(g/L) 实施例4(g/L) 新配置实施例4(g/L)
10个月 16.67 18.06 19.43
11个月 16.14 17.54 19.31
12个月 16.09 17.44 19.57
13个月 16.09 17.31 19.87
14个月 15.45 16.63 19.28
15个月 15.16 16.31 19.65
实验结果显示，本发明试剂实施例4在2-8℃、密封避光的条件下，贮存15个月稳定性高于酶法试剂盒。
5.线性范围实验
测定10个不同GA浓度的样本，检测各浓度，每个样本测试3次，求取平均值，按照判定依据R2>＝0.990进行判定。测定结果见表5、图2。
表5
Figure BDA0002999384840000122
Figure BDA0002999384840000131
将测定浓度的平均值与理论浓度进行线性回归分析，计算回归方程为y＝1.0442x-0.3686，相关系数为R2＝0.9991，表明本发明基于SA-生物素-抗体(抗原)-抗原(抗体)-抗体(抗原)-FITC-anti-FITC多重级联放大系统的试剂盒在0.00-33.38g/L线性范围内相关性较好。此外，以上实验是采用日立公司制造的7080全自动生化仪进行的，但本发明的试剂不限于上述仪器，还适用于其他全自动或半自动生化分析仪。
6.相关性考察
用本发明试剂盒实施例4与进口对照试剂盒(酶法)分别测试50例临床样本，以本发明试剂盒实施例4检测的结果为横坐标，以进口对照试剂盒(酶法)检测的结果为纵坐标，做回归分析，其结果如表6和图3所示。
表6
Figure BDA0002999384840000132
Figure BDA0002999384840000141
Figure BDA0002999384840000151
相关方程为y＝0.7969x+0.1838，相关系数为0.9983，说明本发明试剂盒实施例4与进口对照试剂盒(酶法)对于临床样本测值的相关性良好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种用于检测血清糖化白蛋白的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括：
试剂R1，所述试剂R1包括第一缓冲液、生物素标记的抗人糖化白蛋白抗体、FITC标记的人糖化白蛋白抗体、第一稳定剂、第一防腐剂以及第一表面活性剂；
试剂R2，所述试剂R2包括第二缓冲液、链霉亲和素修饰胶乳微球、Anti-FITC修饰胶乳微球、第二稳定剂、螯合剂、第二防腐剂、第二表面活性剂、增溶剂以及促聚剂；
校准品，所述校准品包括第三缓冲液、人糖化白蛋白、第三稳定剂以及第三防腐剂，所述人糖化白蛋白的浓度梯度为0g/L、2.87g/L、5.73g/L、11.46g/L、22.93g/L、45.86g/L、91.71g/L。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测血清糖化白蛋白的试剂盒，其特征在于：所述第一缓冲液为磷酸盐缓冲液、TRIS缓冲液、CAPSO缓冲液、MOPS缓冲液、Hepes缓冲液，所述第一缓冲液的浓度为30-500mM，pH为6.0-9.5；所述第二缓冲液为TRIS缓冲液、硼砂-氢氧化钠缓冲液、CAPSO缓冲液、MOPS缓冲液、Hepes缓冲液，所述第二缓冲液的浓度为30-500mM，pH为6.0-9.5；所述第三缓冲液为磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、CAPSO缓冲液、MOPS、Hepes缓冲液，所述第三缓冲液的浓度为30-500mM，pH为6.0-9.5。
3.根据权利要求1所述的一种用于检测血清糖化白蛋白的试剂盒，其特征在于：所述第一稳定剂、第二稳定剂以及第三稳定剂分别为牛血清白蛋白、甘油、乙二醇、丙氨酸、聚氧乙烯-8-辛基苯基醚、明胶、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、硼酸、氮氧自由基哌啶醇中的一种或多种；所述第一稳定剂、第二稳定剂或第三稳定剂的浓度为0.01-10％w/v。
4.根据权利要求1所述的一种用于检测血清糖化白蛋白的试剂盒，其特征在于：所述第一防腐剂、第二防腐剂或第三防腐剂为叠氮钠、硫柳汞、Proclin-300中的一种、两种或两种以上的组合，所述第一防腐剂、第二防腐剂或第三防腐剂的浓度为0.05-3％w/v。
5.根据权利要求1所述的一种用于检测血清糖化白蛋白的试剂盒，其特征在于：所述第一表面活性剂和第二表面活性剂为乙基苯基聚乙二醇、吐温20、十二烷基硫酸钠、山梨醇酐单硬脂酸、聚乙二醇辛基苯基醚-100、十二烷基羟丙基磷酸酯甜菜碱中的一种或多种，所述第一表面活性剂和第二表面活性剂的浓度为0.1-3.5％w/v。
6.根据权利要求1所述的一种用于检测血清糖化白蛋白的试剂盒，其特征在于：所述增溶剂为聚氧乙烯多环苯醚，其浓度为0.5-3.2％w/v；所述螯合剂为EDTA、EGTA、乙二胺、草酸、山梨糖醇中的一种或多种，所述螯合剂的浓度为0.05-2.5％w/v；所述促聚剂为聚乙二醇-6000、聚乙二醇-8000、聚乙二醇-10000、聚乙二醇-20000中的一种或多种，所述促聚剂的浓度为0.5-4％w/v。
7.根据权利要求1所述的一种用于检测血清糖化白蛋白的试剂盒，其特征在于：所述第一防腐剂、所述第二防腐剂以及所述第三防腐剂分别为叠氮钠、硫柳汞、Proclin-300、苯酚、Krovin600中的一种或多种；所述第一防腐剂、第二防腐剂以及第三防腐剂的浓度为0.05-5％w/v。
8.根据权利要求1所述的一种用于检测血清糖化白蛋白的试剂盒，其特征在于：所述生物素标记的抗人糖化白蛋白抗体的浓度为1-200μg/ml，所述FITC标记的抗人糖化白蛋白抗体的浓度为1-200μg/ml。
9.根据权利要求1所述的一种用于检测血清糖化白蛋白的试剂盒，其特征在于：链霉亲和素修饰胶乳微球的浓度为0.1-2mg/ml，链霉亲和素修饰的胶乳微球的粒径为50-200nm；Anti-FITC修饰胶乳微球的浓度为0.1-2mg/ml，Anti-FITC修饰的胶乳微球的粒径200-400nm。
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