CN105974121B

CN105974121B - 一种含鱼明胶的生物制品稳定剂

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Publication number: CN105974121B
Application number: CN201610278247.9A
Authority: CN
Inventors: 杨娟; 李庆; 项乾; 刘卫; 姚雯; 何峰容; 李华渊; 孙颖; 乐音谱
Original assignee: Cloud-Clone Corp Wuhan
Current assignee: Cloud-Clone Corp Wuhan
Priority date: 2016-04-18
Filing date: 2016-04-29
Publication date: 2018-02-06
Anticipated expiration: 2036-04-29
Also published as: CN105974121A

Abstract

本发明公开了一种含鱼明胶的生物制品稳定剂，其包括鱼明胶、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸钠、海藻糖、Tween‑80、生物防腐剂Proclin 300。该含鱼明胶的生物制品稳定剂配方简单，价格低廉，适用范围广泛，不存在安全性隐患、具有良好的稳定效果。该稳定剂可有效增强蛋白、抗体、以及样本中检测物等的稳定性，同时还可以作为ELISA专用稳定剂。在用于ELISA技术时，不仅能确保各核心试剂组分的稳定性，又能确保结果准确性和稳定性。

Description

一种含鱼明胶的生物制品稳定剂

技术领域

本发明涉及生物材料保存技术领域，具体涉及一种含鱼明胶的常规蛋白、抗原、抗体、生物检测诊断试剂盒等生物制品稳定剂。

背景技术

随着生物技术的不断发展，生物制品在疾病的诊断、治疗，以及人类对生命本质的追寻等领域发挥了主要作用。但是一些常规蛋白、抗原、抗体、生物检测诊断试剂盒等生物制品容易受外界因素的影响，失去活性，这就需要一种优良的保护剂降低外界环境变化对这类生物制品的影响。

蛋白质作为“中心法则”的最后一环，是生物体最为重要的结构物质也是各种生命活动的基础。目前对于生命活动微观领域的研究，主要还是以研究蛋白质的结构和功能为主。但是有些蛋白在体外环境分子结构不稳定，容易被破坏而丧失生物活性，这就需要一种稳定剂来保持蛋白结构的稳定性，维持其原有活性。

抗体作为医学诊断、治疗、检测领域应用最为广泛的蛋白产品，也是最具有市场价值前景的蛋白产品之一。ELISA(酶联免疫吸附试验)技术是抗体在诊断和检测领域应用最为成功的技术，目前广泛用于临床疾病的诊断以及生物学基础研究。ELISA技术从出现到今天，为人类疾病的诊断以及相关基础学科的发展做出了不可磨灭的贡献。

目前市场上一般的ELISA试剂盒，在排除人为操作以及原材料造成的影响外，普遍存在稳定性差、检测结果不准确等问题。而造成这些问题的绝大多数原因是试剂盒中包含的抗体、抗原等物质由于受外界金属离子、pH变动、温度变化等的影响而导致的活性或者结合能力下降。稳定剂的使用可以明显提高蛋白的稳定性，从而增加ELISA试剂盒的检测稳定性。传统的ELISA试剂盒稳定剂通常包含海藻糖、BSA等物质，这些稳定剂存在价格昂贵，配制过程繁琐，并且适用范围有限等缺陷。例如：对于含有BSA(小牛血清蛋白)成分的ELISA试剂盒，一方面不能用于牛以及与其亲缘关系较近物种的ELISA检测，另一方面可能存在疯牛病病原体，具有潜在的生物危险性。

发明内容

本发明要解决的技术问题是现有的一些常规蛋白、抗原、抗体、生物检测诊断试剂盒等生物制品稳定剂价格昂贵、配制过程繁琐，适用范围受限等，提供一种新的含鱼明胶的生物制品稳定剂。

本发明提供的含鱼明胶的生物制品稳定剂，包括鱼明胶、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸钠、海藻糖、Tween-80、生物防腐剂Proclin 300。

本发明所述的生物制品，是指包括抗原、抗体、2个以上氨基酸残基构成的多肽等蛋白以及氨基酸在内的生物制品。

鱼明胶是一种常见的生物高聚物，以鱼皮和鱼骨为原料提取，然后加工成的高分子多肽聚合物。组成鱼明胶的氨基酸一般有20多种，以甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸和丙氨酸为主。鱼明胶一方面抗原性差，另一方面与哺乳动物的物种亲缘性远，这决定了鱼明胶取代ELISA试剂盒中BSA的优越性。鱼明胶具有良好的乳化性，以及通过增加溶液的相黏度来降低气液相的表面张力而表现出来的发泡性和成膜性，能够保护蛋白的结构不被破坏，增强蛋白的稳定性。

生物防腐剂Proclin 300(英文名Proclin300)是美国SUPELCO公司推出的新一代高效生物防腐剂，可以有效控制体外诊断试剂中微生物的生长。

优选地，各成分含量为：鱼明胶15～25g/L、三羟甲基氨基甲烷4.526～5.045g/L、乙二胺四乙酸钠14～22g/L、海藻糖25～30g/L、Tween-80 3～6g/L、生物防腐剂Proclin300 0.5～2.0g/L，余量为水。优选使用双蒸水。

更优选地，上述含鱼明胶的生物制品稳定剂，其各成分含量为：鱼明胶25g/L、三羟甲基氨基甲烷5.045g/L、乙二胺四乙酸钠20g/L、海藻糖25g/L、Tween-80 3～6g/L、生物防腐剂Proclin 300 0.5～2.0g/L，余量为水。

本发明还提供了以上任一所述的含鱼明胶的生物制品稳定剂的制备方法，是将鱼明胶、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸钠、海藻糖、Tween-80和生物防腐剂Proclin 300溶于水，配制成溶液，过滤灭菌。

本发明还提供了一种蛋白保存液，其含有以上任一所述的含鱼明胶的生物制品稳定剂。蛋白的保存通常保存在蛋白保存液中，本发明的含鱼明胶的生物制品稳定剂可以添加在蛋白保存液中延长蛋白保存期限。

优选地，上述蛋白保存液，所述含鱼明胶的生物制品稳定剂的添加量占蛋白保存液总体积的5％。

本发明还提供了一种ELISA专用稳定剂，其含有以上任一所述的含鱼明胶的生物制品稳定剂。

本发明还提供了一种ELISA试剂盒，包括样品稀释液、抗体稀释液、标准品稀释液、洗液和终止液，其中，所述样品稀释液、抗体稀释液和标准品稀释液中，均含有体积浓度5％的以上任一所述的含鱼明胶的生物制品稳定剂。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的含鱼明胶的生物制品稳定剂，配方简单，价格低廉，适用范围广泛，不存在安全性隐患、具有良好的稳定效果。

本发明的含鱼明胶的生物制品稳定剂用于ELISA技术时，不仅能确保测定结果准确度，而且稳定性更好，可以有效增强ELISA中抗体、抗原以及样本中检测物的稳定性。

附图说明

图1：不同的保存液对抗体保存效果的影响western-blot检测图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1

取鱼明胶15～25g/L、三羟甲基氨基甲烷4.526～5.045g/L、乙二胺四乙酸钠14～22g/L、海藻糖25～30g/L、Tween-80 3～6g/L、生物防腐剂Proclin 300 0.5～2.0g/L，利用双蒸水按比例配制成溶液，过滤灭菌，得稳定剂，4度保存。BCA蛋白浓度测定试剂盒(采购与碧云天、产品编号：P0011)。酶标仪(ELx808 Biotek)。

蛋白冻存液A：常规蛋白冻存液(40％甘油水溶液，v/v)；

蛋白冻存液B：常规蛋白冻存液加入5％稳定剂(v/v)。

在蛋白库中随机取6个蛋白编号1、2、3、4、5、6号，每种蛋白按50μg/ml将样品分装成20管，各取一半，分别加入蛋白冻存液A和B，-20℃保存一段时间后，根据BCA蛋白浓度测定试剂盒中所规定的方法测定蛋白浓度。

表1：蛋白冻存液A对蛋白冻存的影响结果

表2：蛋白冻存液B对蛋白冻存的影响结果

由表1和表2可知，常规蛋白冻存液在-20℃保存，保存0～3个月蛋白少量降解，保存3～30个月蛋白出现严重降解。这说明常规蛋白冻存液只能短暂的保存蛋白。在常规蛋白冻存液中加入稳定剂后，蛋白的稳定性显著增强，0～9月内基本上不出现降解，9～30个月出现少量的降解，这说明在常规蛋白冻存液中加入稳定剂后，明显增强了蛋白的稳定性，可作为长期的蛋白保存液。

实施例2

取鱼明胶25g/L、三羟甲基氨基甲烷5.045g/L、乙二胺四乙酸钠20g/L、海藻糖25g/L、Tween-80 3～6g/L、生物防腐剂Proclin 300 0.5～2.0g/L，利用双蒸水按比例配制成溶液，过滤灭菌，得稳定剂。BCA蛋白浓度测定试剂盒(采购于碧云天、产品编号：P0011)。酶标仪(ELx808 Biotek)。

蛋白冻存液A：常规蛋白冻存液加2％稳定剂(v/v)；

蛋白冻存液B：常规蛋白冻存液加5％稳定剂(v/v)；

蛋白冻存液C：常规蛋白冻存液加10％稳定剂(v/v)。

在蛋白库中随机取3个蛋白编号1、2、3号，每种蛋白按50μg/ml将样品分装成15管，分成3组，加入蛋白冻存液A、B和C，-20℃保存一段时间后，根据BCA蛋白浓度测定试剂盒中所规定的方法测定蛋白浓度。

表3 添加不同比例稳定剂蛋白冻存的影响结果

由表3可知在蛋白冻存液A、B、C中含有不同体积比的稳定剂，对蛋白的保护作用存在差异，最适浓度为占保存液体积比的5％。另外，在同是5％比例的用量下，本实施例各成分用量配比所得稳定剂的保存效果优于实施例1中稳定剂的各成分用量配比。

实施例3

取鱼明胶15～25g/L、三羟甲基氨基甲烷4.526～5.045g/L、乙二胺四乙酸钠14～22g/L、海藻糖25～30g/L、Tween-80 3～6g/L、生物防腐剂Proclin 300 0.5～2.0g/L，利用双蒸水按比例配制成溶液，过滤灭菌。BCA蛋白浓度测定试剂盒(采购于碧云天、产品编号：P0011)。酶标仪(ELx808 Biotek)。

蛋白冻存液：常规蛋白冻存液加5％稳定剂(v/v)。

在蛋白库中随机取3个蛋白编号1、2、3号，每种蛋白按50μg/ml将样品分装成15管，分成3组，加入蛋白冻存液，4℃、25℃、37℃保存一段时间后，根据BCA蛋白浓度测定试剂盒中所规定的方法测定蛋白浓度。

表4 温度对添加稳定剂后蛋白冻存的影响结果

由表4可知，虽然高温不利于蛋白的保存，但是在加入稳定剂后，蛋白的稳定性都保持在比较好的状态，只有少量蛋白的降解。

实施例4

取鱼明胶15～25g/L、三羟甲基氨基甲烷4.526～5.045g/L、乙二胺四乙酸钠14～22g/L、海藻糖25～30g/L、Tween-80 3～6g/L、生物防腐剂Proclin 300 0.5～2.0g/L，利用双蒸水按比例配制成溶液，过滤灭菌。

蛋白保存液A：常规蛋白冻存液加入5％稳定剂(v/v)；

蛋白保存液B：常规蛋白冻存液(40％甘油水溶液，v/v)。

随机选取3种抗体，编号为1、2、3，按浓度为1mg/ml分别分装成8管，分成两组，分别加入蛋白保存液A和B，4℃保存0、1、3、6个月。western-blot实验通过曝光胶片条带的明暗，可以半定量检测抗原的含量，也可以半定量检测抗体的含量。在保证抗原过量的情况下，抗体和抗原的结合量，决定于抗体的多少，通过western-blot实验中曝光胶片条带的亮暗便能反应结合抗体的多少，进而反应出抗体浓度的高低。

通过图1可知，在4℃情况下，利用蛋白保存液A和蛋白保存液B保存抗体1、2、3，抗体保存在蛋白保存液A中的，抗体与抗原的结合量基本保持不变，具有很好的抗体保护作用，可以作为抗体长期储存的保护剂；而利用传统的蛋白保存液B，发现抗体与抗原的结合量变小，这种现象的发生与抗体的降解和失活是密不可分，不适和用于抗体的长期保存。

实施例5

取鱼明胶15～25g/L、三羟甲基氨基甲烷4.526～5.045g/L、乙二胺四乙酸钠14～22g/L、海藻糖25～30g/L、Tween-80 3～6g/L、生物防腐剂Proclin 300 0.5～2.0g/L，利用双蒸水按比例配制成溶液，过滤灭菌。酶标仪(ELx808 Biotek)。

10×TBS配方：Tris(MW121.14)：24.2g；NaCl：80.0g，用蒸馏水定容至1000mL，室温调pH＝7.6。

试剂A:标准品稀释液：质量体积比2％的BSA+0.02％叠氮化钠，溶于TBS工作液中。

试剂B：抗体稀释液：质量体积比2％的BSA+0.01％叠氮化钠，溶于TBS工作液中。

随机购买5个ELISA试剂盒作为实验对象，检测在样品稀释液以及抗体和标准品稀释液加入或不加入体积比为5％的稳定剂对ELISA试剂盒稳定性的影响。ELISA试剂盒稳定性的好坏与检测标曲的R2(决定系数)正相关，可以利用R2来反映试剂盒的稳定性。

表5 添加稳定剂对ELISA试剂盒稳定性的影响结果

从表5的结果可以发现，无论是试剂A还是试剂B在实验过程中添加了5％的稳定剂后，试剂盒的稳定性相比较于不添加稳定剂的稳定性有所提高，在试剂A和试剂B中都添加5％的稳定剂后，试剂盒的稳定性在上述方案中达到最优，但是与方案5中的结果相差不大，这说明该稳定剂无论作为ELISA试剂盒的稳定性，还是作为标准品、抗体和样品的稀释液，效果同样显著。

实施例6

取鱼明胶15～25g/L、三羟甲基氨基甲烷4.526～5.045g/L、乙二胺四乙酸钠14～22g/L、海藻糖25～30g/L、Tween-80 3～6g/L、生物防腐剂Proclin 300 0.5～2.0g/L，利用双蒸水按比例配制成溶液，过滤灭菌。酶标仪(ELx808 Biotek)。配制不同的封闭液：

1、常规封闭液：0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)+2.0％BSA(w/v)；

2、常规封闭液+5％的稳定剂(v/v)；

3、蒸馏水+5％的稳定剂(v/v)。

购买重组人生长激素标准品(中检所，编号140635)，与重组人生长激素的单抗和多抗组合成双抗夹心ELISA检测试剂盒1。购买维生素D3标准品(中检所，编号100061)，与维生素D3的抗体组合竞争抑制ELISA检测试剂盒2。随机选取一个蛋白标准品，与该蛋白的单抗和多抗组合成双抗夹心ELISA检测试剂盒3。ELISA检测过程中，封闭的好坏与ELISA试剂盒的质量密切相关。对于试剂盒1、2、3同时分别制作ELISA检测板5块，分别4℃，密封保存，在规定时间内完成对标准品(50μg/ml)的测定，选取多个孔同时测定，分析批内差(CV％)，来反映ELISA测值的稳定性。

批内差测定：选取高、中、低样品浓度，在同一检测板分别做20次重复检测，CV(％)＝SD/meanX100进行测算。

表6 不同的封闭试剂对ELISA实验结果的影响(CV％)

如表6可知，采用常规封闭液作为封闭液，ELISA测试板的批内差相比于常规封闭液+5％稳定剂和蒸馏水+5％稳定剂作为封闭液的ELISA测试板的批内差明显高一些，而且随着时间的变化，批内差值会不断变大，而以常规封闭液+5％稳定剂和蒸馏水+5％稳定剂作为封闭液的ELISA测试板的批内差随时间也会出现变大，但是变化不明显，同时以蒸馏水+5％稳定剂作为封闭液也具有优良的效果。这说明，该稳定济不仅可以维持包埋抗体的稳定性减小批内差，而且可以单独作为封闭液在ELISA试剂盒中使用。

实施例7

处理1：封闭液、样品稀释液、标准品和抗体稀释液都采用蒸馏水+5％稳定剂(v/v)。

处理2：封闭液、样品稀释液、标准品和抗体稀释液都采用传统试剂：

1、常规封闭液：0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)+2.0％BSA(w/v)。

2、样品稀释液：质量体积比2％的BSA+0.02％叠氮化钠，溶于TBS工作液中。

3、抗体和标准品稀释液：质量体积比2％的BSA+0.01％叠氮化钠，溶于TBS工作液中。

购买重组人生长激素标准品(中检所，编号140635)，与重组人生长激素的单抗和多抗组合成双抗夹心ELISA检测试剂盒1。购买维生素D3标准品(中检所，编号100061)，与维生素D3的抗体组合成竞争抑制ELISA检测试剂盒2。随机选取一个蛋白标准品，与该蛋白的单抗和多抗组合成双抗夹心ELISA检测试剂盒3。批间差和批内差是反映一个ELISA试剂盒是否合格的重要标准，一方面能够反映ELISA试剂盒测值的准确性，另一方面也能反映出ELISA试剂盒的稳定性。

批内差测定：选取高、中、低样品浓度，在同一检测板分别做20次重复检测，CV(％)＝SD/mean×100进行测算，目前批内差＜10％作为合格的标准。

批间差测定：选取高、中、低样品浓度，随机3块不同的检测板，每板分别做8次重复检测，CV(％)＝SD/mean×100进行测算，目前批间差＜12％作为合格的标准。

表7 不同的试剂对ELISA实验结果的影响(批内CV％)

表8 不同的试剂对ELISA实验结果的影响(批间CV％)

表9 不同的试剂对ELISA实验结果的影响(线性R²)

如表7、8、9显示的数据可知，采用蒸馏水+5％稳定剂取代传统封闭液、样品稀释液、抗体和标准品稀释液后，组装的检测试剂盒测值更为稳定和准确，并且可以延长试剂盒的质保期限，方便试剂盒在长途运输。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims

1.一种含鱼明胶的生物制品稳定剂，其特征在于，由鱼明胶、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸钠、海藻糖、Tween-80、生物防腐剂Proclin 300和水组成；

各成分含量为：鱼明胶15～25g/L、三羟甲基氨基甲烷4.526～5.045g/L、乙二胺四乙酸钠14～22g/L、海藻糖25～30g/L、Tween-80 3～6g/L、生物防腐剂Proclin 300 0.5～2.0g/L，余量为水。

2.根据权利要求1所述的含鱼明胶的生物制品稳定剂，其特征在于，各成分含量为：鱼明胶25g/L、三羟甲基氨基甲烷5.045g/L、乙二胺四乙酸钠20g/L、海藻糖25g/L、Tween-80 3～6g/L、生物防腐剂Proclin 300 0.5～2.0g/L，余量为水。

3.权利要求1～2任一所述的含鱼明胶的生物制品稳定剂的制备方法，其特征在于，是将鱼明胶、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸钠、海藻糖、Tween-80和生物防腐剂Proclin300溶于水，配制成溶液，过滤灭菌。

4.一种蛋白保存液，其特征在于，含有权利要求1～2任一所述的含鱼明胶的生物制品稳定剂。

5.根据权利要求4所述的蛋白保存液，其特征在于，所述含鱼明胶的生物制品稳定剂的添加量占蛋白保存液总体积的5％。

6.一种ELISA专用稳定剂，其特征在于，含有权利要求1～2任一所述的含鱼明胶的生物制品稳定剂。

7.一种ELISA试剂盒，包括样品稀释液、抗体稀释液、标准品稀释液、洗液和终止液，其特征在于，所述样品稀释液、抗体稀释液和标准品稀释液中，均含有体积浓度5％的权利要求1～2任一所述的含鱼明胶的生物制品稳定剂。