KR20050103483A - 아밀로이드 β(1-42) 올리고머, 이의 유도체, 이에 대한항체, 이의 제조 방법 및 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 아밀로이드 β(1-42) 단백질의 신경조절 올리고머, 재현가능한 방식으로 상기 올리고머를 고 수율로 얻을 수 있는 특별한 제조 방법, 진단제 및 치료제로서의, 올리고머 특이적 항체의 형성을 위한, 올리고머와 상호작용하여 이를 형성할 수 있는 물질의 발견을 위한 상기 올리고머의 용도에 관한 것이다. 항체 그 자체와, 진단제 및 치료제로서의 항체 또는 물질의 용도와 함께, 상응하는 항체의 제조 방법 및 물질의 발견 방법이 개시되어 있다. 또한, 본 발명은 아밀로이드 β(1-42) 단백질의 단축 형태에 기초한 올리고머 및 올리고머의 유도체, 이의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.

Description

아밀로이드 β(1-42) 올리고머, 이의 유도체, 이에 대한 항체, 이의 제조 방법 및 용도{AMYLOID β(1-42) OLIGOMERS, DERIVATIVES THEREOF, ANTIBODIES FOR THE SAME, METHOD FOR PRODUCTION AND USE THEREOF}
본 발명은 아밀로이드 β(1-42) 단백질의 신경조절 올리고머, 재현가능한 방식으로 상기 올리고머를 높은 수율로 얻을 수 있는 특정 제조 방법, 및 진단제 및 치료제로서의, 올리고머-특이적 항체의 생성을 위한, 상기 올리고머와 상호작용하여 이를 형성할 수 있는 물질의 발견을 위한 상기 올리고머의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 올리고머 유도체, 특히 가교된 올리고머 및 아밀로이드 β(1-42) 단백질의 절두형(truncated form)에 기초한 올리고머, 이의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.
항체 그 자체와 진단제 및 치료제로서의 상기 항체 및 물질의 용도와 같이 상응하는 항체 형성 방법 및 물질 발견 방법도 개시되어 있다.
간단히 Aβ(1-42) 라고도 하는 아밀로이드 β(1-42) 단백질은, 알츠하이머 및 다운 증후군 환자의 뇌에서 단백질, 지질, 탄수화물 및 염으로 구성된 불용성 세포외 침착물(노인성 반 또는 신경반)의 중심 성분이다(C. L. Masters et al. PNAS 82, 4245-4249, 1985). 수성 환경에서 중합하는 경향이 있는 단백질은 매우 다른 분자 형태로 존재할 수 있다.
알츠하이머병과 같은 치매 질환의 발생 또는 진행과 불용성 단백질의 침착간의 단순한 상관관계는 설득력이 없는 것으로 판명되었다(R. D. Terry et al Ann. Neurol. 30. 572-580 (1991), D. W. Dickson et al. Neurobiol. Aging 16, 285-298 (1995)). 대조적으로, 시냅스 및 지적 인식의 상실과 Aβ(1-42)의 가용성 형태의 상관관계는 더 양호한 것으로 보인다(L. F. Lue et al. Am. J. Pathol. 155, 853-862, (1999), C. A. McLean et al. Ann. Neurol. 46, 860-866(1999)).
Aβ(1-42)의 가용성 형태에 대해서, 알츠하이버병과 같은 치매 질환의 원인이라고 추정되는 분자 형태에 관해 실질적으로 2 가지 다른 가설이 있다.
첫째로, Aβ(1-42) 원섬유(protofibril)의 세포독성 작용이 가정된다. 이것은 분자량이 150∼250 kDa인 가용성, 소섬유의 비교적 고도로 응집된 Aβ(1-42) 형태(Arispe et al. PNAS 90. 567 (1993), Lashuel et al., Nature 418, 291(2002))로서, 기공 형성 성질로 인하여 뉴런 세포의 막을 통해 비제어된 칼슘 유입을 유발하는 것이 명백하다.
둘째, 분자량이 15∼30 kDa인 올리고머 Aβ(1-42) 유도체가 개시되어 있다(M. P. Lambert et al. PNAS 95, 6448-6453 (1998)). 아밀로이드 유도된 확산 가능한 치매성 리간드라고도 하는(ADDL's for Amyloid Derived Dementing Ligands, cf. US-A 6,218,506 및 WO 01/10900호, 또는 for Amyloid Derived Diffusible Ligands, cf. Lambert et al., supra) 비섬유성 올리고머는 해마 절편에서 뉴런의 장기 강화 속도(the rate of long-term potentiation)에 대해 억제 영향을 나타내는 제제에서 발견할 수 있다.
그러나, 올리고머에 대한 이전 연구 결과는 실제로 관련된 종에 대한 불확실성이 크다는 것이 특징이다. 문헌에 제시된 정보는 상당히 다르다. 따라서, US-A 6,218,506호는 3∼12개 서브유닛을 갖는 ADDL을 개시하는 반면, WO 01/10900에 개시된 ADDL은 최대 24개 서브유닛을 가질 수 있다.
더욱 구체적으로, 비변성 조건 하의 겔 전기영동 분석에서 분자량이 27∼28 kDa 및 23∼24 kDa(US-A 6,218,506호) 또는 약 26∼28 kDa(WO 01/10900호)이고, 각각 17 kDa 및 27 kDa(M. P. Lambert et al. PNAS 95, 6448-6453(1998))이며, 변성 조건 하에 SDS 겔 전기영동 분석에서 분자량이 17 kDa 및 22 kDa(M. P. Lambert et al. PNAS 95, 6448-6453(1998))이고, 각각 약 22 kDa∼24 kDa 및 약 18 kDa∼약 19 kDa (WO01/10900호)인 2가지 이상의 형태가 논의되어 있다. 분자량이 8∼12 kDa인 SDS-안정한 Aβ(1-42) 올리고머는 알츠하이머 환자의 뇌에서 웨스턴 블롯 방법으로 이미 검출된 바 있다(C. A. McLean et al. Ann. Neurol. 46, 860-866(1999)).
개시된 제조 프로토콜은 불균질한 올리고머 제제를 생성하는 단점이 있다.
따라서, 신경조절(neuromodulation)을 담당하는 Aβ(1-42)의 분자 형태를 명백하게 확인할 수 없는 것은 물론이고, 재현가능한 방식으로 제공할 수 없었다.
그러나, 균질한 제제의 중요성은, 예를 들어 알츠하이머 환자에 대한 활성 면역화의 첫 임상 연구 과정에서 판단할 수 있다. 사전응집된 Aβ(1-42) 형태를 예방접종하면 일부 환자에서 상당한 부작용(mengioencephalitis, 출혈)이 생기는데, 그 이유는 형성된 항체가 세포주에 필요할 것 같은 Aβ(1-42) 형태를 인식하여 염증 반응을 일으키기 때문이다(D. Schenk.; Nat. Rev. Neurosci. 3, 824-828(2002)).
따라서, 실제로 손상 단백질 형태의 중화를 특별히 겨냥한 관용 요법은 그 동정 및 형성된(defined) 제제를 필요로 한다.
또한, 알츠하이머병과 관련하여 Aβ(1-42) 단백질의 N-말단 절두형의 형성이 보고된 바 있다. 1985년에, Aβ(1-42) 외에 N-말단 절두형이 사망한 알츠하이머 환자의 뇌의 침착물에서 검출된 적이 있다(C. Masters et al., PNAS 82, 4245-4249(1985)). 따라서, 네프릴리신 (NEP 24.11) 또는 IDE (인슐린 분해 효소를 위한 쇼트형)와 같은 뇌에 존재하는 특별한 프로테아제가 Aβ(1-42)를 분해할 수 있는 것으로 알려져 있다(D. J. Selkoe, Neuron 32, 177-180,(2001)).
그러나, 알츠하이머병의 발병에 있어서 N-말단 절두형의 중요성은 분명하지 않다(E. B. Lee et al, JBS 278, 4458-4466 (2003)). 점차로, 돌발성 또는 가족력 알츠하이머병 또는 다운 증후군이 있는 일부 환자는 오히려 이들 절두형을 축적한다(J. Naslund et al, PNAS 91, 8378-8382, (1994), C. Russo et al., Nature 405, 531-532, (2000), T. C. Saido et al, Neuron 14, 457-466, (1995)). 비교적 최근의 연구 결과(N. Sergeant et al, J. of Neurochemistry 85, 1581-1591,(2003)), 사망한 알츠하이머 환자 뇌의 모든 불용성 Aβ 펩티드의 60%가 N-말단 절두형에 기초한 것으로 확인되었다.
단량체 Aβ(1-42) 단백질 및 이의 특정 단편에 대한 항체는 이미 개시된 바 있다.
따라서, WO 03/016466 및 WO 03/016467은 CDR2 내의 특정 글리코실화 부위가 결여된 모노클로날 항체 266 및 그 유사체에 관한 것이다. 이의 인간화된 형태 (Hu-266)도 알려져 있다. 이들 문헌은, 항체 226과 같이 Aβ(1-42)의 아미노산 13-28 영역에서 에피토프를 인식하는 다른 모노클로날 항체를 언급하고 있다. 이들은 항체 4G8(상기 Lue et al. (1999)에서도 언급됨) 및 1C2를 포함한다. 또한, 상기 McLean 등의 문헌(1999)도 Aβ(1-42)의 아미노산 18-22 영역에서 에피토프를 확실히 인식하는 모노클로날 항체 1E8을 언급하고 있다.
또한, Aβ(1-42)의 N-말단 서열의 에피토프를 인식하는 다수의 추가 항체가 알려져 있다. 이들은 시판되는 모노클로날 항체 6E10 (WO01/10900호; Naslund et al. (1994), 상기 문헌; Sergeant et al. (2003), 상기 문헌에서도 언급됨) 및 모노클로날 항체 3D6 및 10D5 (WO03/016467호)와 Ban50 및 NAB228 (Lee et al. (2003), 상기 문헌에도 언급됨)을 포함한다.
또한, 모노클로날 항체 W02, 21F12 및 3D6과 폴리클로날 혈청 ADA42도 언급되어야 한다(Sergeant et al. (2003), supra).
현재 임상전 테스트를 받고 있는 항-Aβ(1-42) 항체에 대한 개략은 Schenk 등의 상기 문헌(2002)에서 찾을 수 있다.
도 1은 Aβ(1-42) 올리고머 A 제조물(레인 A); Aβ(1-42) 올리고머 B 제조물(레인 A); 표준 단백질(분자량 마커 단백질, 레인 C)의 SDS-PAGE를 보여준다.
도 2는 Aβ(1-42) 올리고머 A 제조물(레인 A); Aβ(1-42) 올리고머 A-CL 제조물(레인 A'); Aβ(1-42) 올리고머 B 제조물(레인 B); Aβ(1-42) 올리고머 B-CL 제조물(레인 B'); 표준 단백질(분자량 마커 단백질, 레인 C)의 SDS-PAGE를 보여준다.
도 3은 비오틴 Aβ(1-42) 올리고머 B 제조물(레인 A); 표준 단백질(분자량 마커 단백질, 레인 B)의 SDS-PAGE를 보여준다.
도 4는 플루오레세인 Aβ(1-42) 올리고머 B 제조물(레인 A); 표준 단백질(분자량 마커 단백질, 레인 B)의 SDS-PAGE를 보여준다.
도 5는 Aβ(1-42) 동결건조물을 함유하는 용액과 Aβ(1-42) 올리고머 B를 함유하는 제조물의 겔 투과 크로마토그래피를 비교하여 보여준다.
도 6은 Aβ(1-42) 올리고머 B 제조물(레인 A); 표준 단백질(분자량 마커 단백질, 레인 B)의 네이티브(NATIVE) PAGE를 보여준다.
도 7은 인간 신경모세포종 세포주 IMR-32의 표면에 대한 (A) 단량체 Aβ(1-42) 단백질, (B) Aβ(1-42) 올리고머 A 및 (C) Aβ(1-42) 올리고머 B의 결합을 보여준다.
도 8은 Aβ(1-42) 올리고머 B로 설치류 피질 뉴런을 처리한 후 %로 나타낸 신경독성 효과를 보여준다. 오차 막대는 95% 신뢰 수준에 해당한다.
도 9는 트립신(레인 2), 키모트립신(레인 3), 써몰리신(레인 4), 엘라스타제(레인 5), 파파인(레인 6)으로 처리된 Aβ(1-42) 제조물 또는 미처리 Aβ(1-42) 제조물(레인 7) 및 표준 단백질(분자량 마커 단백질, 레인 1)의 SDS-PAGE를 보여준다.
도 10은 실시예 6b의 Aβ(1-42) 올리고머 B 제조물(컬럼 1); 실시예 1a의 HFIP 처리된 Aβ(1-42) 단량체(컬럼 2); 실시예 15a의 써몰리신 분해된 Aβ(1-42) 올리고머 B 제조물(컬럼 3); 실시예 14a의 글루타르알데히드 가교된 Aβ(1-42) 올리고머 B 제조물(컬럼 4); 문헌[M.P. Lambert et al., J. Neurochem. 79, 595-605(2001)]에 따라 4℃ 또는 실온 또는 37℃에서 제조된 ADLL(각각 컬럼 5, 6 및 7); 0.1% NH4OH에 용해된 Aβ(1-42)(컬럼 8); 실시예 27의 Aβ(1-42) 피브릴 제조물(컬럼 9); 및 시그마로부터 입수한 PBS로 희석시킨 APP 컬럼(10) 100 pmol(A 열); 10 pmol(B 열); 1 pmol(C 열); 0.1 pmol(D 열) 및 0.01 pmol(E 열)과 a) 모노클로날 항체 6E10; b) 실시예 25d의 폴리클로날 항혈청(d1); c) 실시예 25c의 폴리클로날 항혈청(c1); d) 실시예 25a의 폴리클로날 항혈청(a1); 및 e) 실시예 25a의 폴리클로날 항혈청(a2)과의 반응성의 도트 블롯을 보여준다.
도 11은 실시예 15a의 Aβ(20-42) 올리고머 B 제조물(레인 B); 실시예 15b의 Aβ(12-42) 올리고머 B 제조물(레인 C); 실시예 6b의 Aβ(1-42) 올리고머 B 제조물(레인 A); 및 표준 단백질(분자량 마커, 레인 D)의 SDS-PAGE를 보여준다.
도 12는 실시예 6b의 Aβ(1-42) 올리고머 B 제조물과 실시예 14a의 Aβ(1-42) 올리고머 B-CL 제조물의 겔 투과 크로마토그래피를 비교하여 보여준다.
도 13은 단량체 Aβ(1-42) 단백질(좌측); Aβ(1-42) 올리고머(12량체, A); 및 Aβ(1-42) 올리고머(12량체, C) 및 Aβ(1-42) 올리고머(12량체, B)(둘 다 단백질 분해 절단에 의해 얻을 수 있음)의 도식을 보여준다.
도 14는 해마 절편에 대한 Aβ(1-42) 올리고머 B의 작용의 시간의 함수로서 분비성 시냅스 후 전위(fEPSP)를 보여준다.
도 15는 비특이적으로 결합된 형광(b)에 비교하여, 해마 래트 뉴런(a)에 대한 Aβ(1-42) 올리고머 B의 결합을 도시하는 면역형광 이미지를 보여준다.
달리 언급하지 않는다면, 본 발명 올리고머의 농도는 단량체 Aβ(1-42) 폴리펩티드의 몰(moles)로서 나타낸다. β 아밀로이드(1-42) 단백질이란 용어는 아밀로이드 β(1-42) 단백질을 의미한다. 달리 언급하지 않는다면, 사용된 단백질(폴리펩티드)은 인간 유래의 것이다.
본 발명은 Aβ(1-42)의 신경조절, 특히 신경 손상 작용을 유발하고, 다운증후군 및 알츠하이머병과 같은 치매 질환에서 증가되는 분자 형태를 제공하는 것을 목적으로 하며, 특별한 방법을 사용하여 단량체 Aβ(1-42) 단백질로부터 균질한 제제의 형태로 얻을 수 있는 특정한 Aβ(1-42) 올리고머에 의해, 그리고 상기 올리고머의 특정 유도체, 특히 절두형 Aβ(1-42) 형태를 기초로 한 올리고머 및 가교 올리고머에 의해 상기 목적을 실현한다. 이 제조 방법은 수성 매체에 잘 용해되지 않는 펩티드-합성 Aβ(1-42) 단백질을 소정의 가용성 올리고머로 고수율로 전환시킬 수 있다.
따라서, 본 발명은 특허청구범위 내에 정의된 청구대상에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 SDS 겔 전기영동에서 약 15 kDa, 20 kDa, 38 kDa 또는 48 kDa의 겉보기 분자량을 갖는 아밀로이드 Aβ(1-42) 단백질의 올리고머, 또는 유도체화에 따라 변할 수도 변하지 않을 수도 있는 분자량을 갖는 상기 올리고머의 유도체에 관한 것이다.
아밀로이드 β(1-42) 단백질은 단백분해 프로세싱에 의해 아밀로이드 전구체 단백질(APP)로부터 유도된 42개 아미노산을 갖는 폴리펩티드이다. 이것은 또한 인간 변형체 외에, 인간 이외의 유기체, 특히 다른 포유동물, 특별히 래트에 존재하는 아밀로이드 β(1-42) 단백질의 이소형을 포함한다.
특정 구체예에 따르면, 본 발명은 인간 아밀로이드 β(1-42) 단백질의 올리고머에 관한 것이다. 인간 아밀로이드 β(1-42) 단백질은 특히 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질과 아미노산 교환에 의해 상기 서열로부터 유도된 뮤테인 및 대립유전자 변형체를 포함한다. 이와 관련하여, 아미노산 치환 A21G, E22K, E22Q, E22G 및 D23N이 특별히 언급되어야 한다. 따라서, 아밀로이드 β(1-42) 단백질의 뮤테인 또는 대립유전자 변형체는, 본 발명에 따라 알라닌 21, 글루탐산 22 및 아스파르트산 23으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산이 바람직하게는 글리신, 리신, 글루타민 및 아스파라긴으로부터 선택된 상이한 아미노산에 의해 치환된 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 본 발명에 따르면 위치 22에서, 특히 글루타민 또는 글리신에 의한 치환이 특별히 중요하다.
또 다른 특정 구체예에 따르면, 본 발명은 래트 아밀로이드 β(1-42) 단백질의 올리고머에 관한 것이다. 래트 아밀로이드 β(1-42) 단백질은 특히 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질과, 아미노산 교환에 의해 상기 서열로부터 유도된 뮤테인 및 대립유전자 변형체를 포함한다. 이와 관련하여, 인간 서열에 대해 논의된 아미노산 치환에 해당하는 아미노산 치환이 특별히 언급되어야 한다.
아밀로이드 β(1-42) 단백질은 공지된 펩티드-합성 방법 또는 재조합으로 제조할 수 있다. 또한, 이들 단백질 다수는 시판된다. 뮤테인 및 대립유전자 변형체에도 동일하게 적용된다.
본 발명의 올리고머는 아밀로이드 β(1-42) 단백질의 올리고머화로 얻을 수 있다. 올리고머화는 단량체 아밀로이드 단백질의 비공유결합성 응집을 포함하므로 본 발명의 올리고머는 다수의 아밀로이드 β(1-42) 단백질 단량체로 구성된 것으로 추정할 수 있다.
올리고머화 정도에 따라서, 본 발명의 올리고머는 상이한 분자량을 갖는다. 따라서, 변성 겔 전기영동으로 상기 올리고머의 겉보기 분자량을 정할 수 있다. 겔 전기영동을 표준 변성 조건(Tris-glycin-gel, 4-20%, cf. Lammli UK, Nature 227, 680-685(1970)) 하에 실시한 경우, 분자량은 올리고머 A1의 경우 약 15 kDa, 올리고머 A2의 경우 약 20 kDa, 올리고머 B1의 경우 약 38 kDa 및 올리고머 B2의 경우 약 48 kDa이며, 하기 표준 단백질은 동일한 조건 하에서 하기와 같은 겉보기 분자량을 가진다: 미오신 250 kDa, 소 혈청 알부민 98 kDa, 글루타민 히드로게나제 64 kDa, 카르보안히드라제 36 kDa, 마이오글로빈 30 kDa, 리소자임 16 kDa, 아프로티닌 6 kDa, 인슐린 B-쇄 4 kDa(cf. Blue Pre-stained Standard). 또 다른 측면에 따르면, 겔 전기영동을 표준 천연 조건(Tris-glycin-gel, 4-20%) 하에 실시하는 경우 올리고머 B에 대한 분자량은 약 64∼90 kDa이며, 하기 표준 단백질은 동일한 조건 하에서 다음과 같은 겉보기 분자량을 갖는다: 미오신 250 kDa, 소 혈청 알부민 98 kDa, 글루타민히드로게나제 64 kDa, 카르보안히드라제 36 kDa, 마이오글로빈 30 kDa, 리소자임 16 kDa, 아프로티닌 6 kDa, 인슐린 B쇄 4 kDa(cf. Blue Pre-stained Standard).
또 다른 측면에 따르면, 본 발명의 올리고머는 뉴런 세포에 대한 친화력을 특징으로 한다. 상기 올리고머는 특정 세포 표면 단백질, 특히 수용체에 결합하는 것으로 추정할 수 있다.
따라서, 본 발명은 미리정해진 세포 구조에 대한 본 발명의 올리고머의 결합을 측정하는 방법에 관한 것으로서,
i) 본 발명의 올리고머가 상기 세포 구조 상에서 작용하도록 하는 단계, 및
ii) 상기 본 발명의 올리고머가 상기 세포 구조에 결합하는지 여부를 측정하는 단계
를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 올리고머는 신경조절 작용을 특징으로 한다. 본 발명의 하나 이상의 올리고머를 이들 세포의 배양물에 작용하도록 한 경우, 신경조절 작용은 뉴런 세포, 예를 들어 신경모세포종 세포(신경독성)의 생존력 감소로 증명할 수 있다. 자체 공지된 방법으로, 예컨대 본 발명의 올리고머 작용으로 유발된 아포토시스(apoptosis) 정도를 측정하여 상기 세포의 생존력을 평가할 수 있다. 이를 위해서, 적절한 분석법, 예컨대 3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐-테트라졸륨 브로마이드(MTT)를 기초로 한 비색 방법이 이용가능하다. 신경조절 작용은 특히 뉴런의 작동개시율(firing rate)의 조절로 생체 내에서 입증될 수 있다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 올리고머의 활성, 특히 신경독성을 측정하는 방법에 관한 것으로서,
i) 본 발명의 상기 올리고머가 세포 상에서 작용하도록 하는 단계, 및
ii) 상기 세포의 상태가 변형되었는지 여부를 측정하는 단계
를 포함한다.
상기 개시된 방식으로, 예를 들어 상기 임의의 조성물의 형태로 상기 방법을 위해 본 발명의 올리고머를 제공할 수 있다. 세포 또는 세포 구조물은 시험관내에서, 특히 세포 배양물 등으로서, 세포 구조물 내에서 균질물로서 편리하게 제공한다. 여기서, 뉴런 세포와 특히 신경모세포종 세포는 신경독성을 결정하는 작용을 한다. 대안적으로, 예컨대 실험 동물의 생체내에서, 특히 유기체의 일부로서, 또는 생체외에서 세포를 제공할 수 있다.
일반적으로, 올리고머의 작용 전에 적어도 1회, 그리고 그 후에 적어도 1회 세포 상태를 측정한다. 작용 전 상태와 작용 후 상태 간의 비교 결과 편차가 있으면, 테스트된 올리고머는 활성을 가진다.
측정하고자 하는 상태의 종류는 측정하고자 하는 활성의 종류에 따라 달라진다. 세포독성은 예를 들어 생존력을 측정하여 결정할 수 있다. 이를 위해서, 올리고머의 작용 전후에 세포의 총수를 기준으로 생세포의 비율을 측정하고 상호 비교한다.
결합 또는 활성을 측정하는 상기 방법을 기초로, 특정 구체예에 따라 본 발명의 올리고머의 결합을 억제하고/하거나 조절하는지 여부, 즉 활성을 감소시키거나 또는 실질적으로 완전히 저해하거나, 또는 증가시키는지 여부에 대해 물질을 테스트할 수 있다.
이를 위해서, 본 방법은 원칙적으로 테스트 물질의 존재 하에 한번, 테스트 물질의 부재 하에 한번 더, 적어도 2회 실시한다. 이 때문에, 상기 올리고머를 제공한 후에 일반적으로 상기 테스트 물질을 올리고머에 첨가한다.
그러나, 테스트하고자 하는 물질이 상기 올리고머 형성에 영향을 주는지 여부를 측정하고자 한다면, 상기 올리고머의 형성 이전에 미리, 즉 상기 올리고머가 제공되기 전에 미리, 올리고머 형성에 사용된 반응물(들)에 상기 물질을 적당히 첨가한다. 따라서, 테스트 물질을 첨가하여 본 발명의 제법을 실시한 다음 올리고머가 형성되는지 여부 및 그 정도를 결정할 수 있다. 이러한 목적으로, 이러한 방식으로 얻은 본 발명의 방법에 따른 생성물이 본 발명의 올리고머의 성질, 즉, 예를 들면 분자량, 결합능 및 활성을 갖는지 여부를 결정할 수 있다.
가능한 명백한 신경조절 작용을 위해서, 본 발명의 올리고머 B가 바람직하다. 이와 관련하여, 이들 올리고머의 유도체도 바람직하며, 특히 N-말단 절두된 Aβ(1-42) 단백질을 주성분으로 하는 올리고머가 강조된다.
처리 조작 이유로, 올리고머 A 및 올리고머 B는 올리고머 외에 다른 폴리펩티드, 특히 단량체 아밀로이드 β(1-42) 단백질과, 적절한 경우 응집된 아밀로이드 β(1-42) 단백질의 고 분자량 형태를 작은 비율로 더 포함하는 조성물의 형태로 혼합물로서 제조될 수 있다. 이러한 종류의 조성물은 본 발명의 청구대상이며, 본 발명의 올리고머(들)의 비율이 아밀로이드 β(1-42) 단백질로부터 유도된 총 단백질을 기준으로 70 중량% 이상, 바람직하게는 90 중량% 이상, 특히 95 중량% 이상인 것이 특징이다. 올리고머 A의 제조물에서, 올리고머 A2(SDS 겔에서의 20 kDa 밴드)의 비율이 50 중량% 이상, 바람직하게는 70 중량% 이상, 특히 85 중량% 이상이다. 올리고머 B의 제조물에서, 올리고머 B1 및 B2(SDS 겔에서의 38 kDa 및 48 kDa 밴드)의 비율은 60 중량% 이상, 바람직하게는 75 중량% 이상, 특히 90 중량% 이상이다.
본 발명의 올리고머는 유도체화될 수 있다. 그러한 유도체화의 목적은, 예를 들어 특히 생체이용성 측면에서 상기 올리고머의 물리화학적 성질을 조절하고, 검출가능한 표지를 갖는 상기 올리고머를 제공하거나 또는 상기 올리고머를, 예컨대 지지체에 커플링할 수 있도록 고정하는 것일 수 있다. 표지화 및 고정화는 진단 용도를 위해 특히 중요하다.
단백질 생화학 분야에 일반적인 적절한 표지가 당업자에게 잘 알려져 있다. 이들은 형광 표지, 예컨대 특별한 플루오레세인 및 테트라메틸로다민 유도체, 발광 표지, 비색 표지, 방사성 표지 및 자기 표지와, 비오틴 및 스트렙타비딘 유도체 등의 상보성 결합 쌍에 대한 친화력을 갖는 표지를 포함한다.
겉보기 분자량과 관련하여, 비유도체화된 올리고머와 비교하여 상응하여 증가될 수 있는 분자량을 갖지만 응집수는 동일한 올리고머 유도체를 고려할 수 있다. 따라서, 예를 들어 SDS 겔에서 분자량이 38 kDa인 Aβ(1-42) 올리고머 B1을 기초로 한 비오틴 유도체는 분자량이 42 kDa이다.
본 발명의 특정 구체예에 따르면, 올리고머는 가교된다. 적절한 가교자는 당업계에 공지되어 있으며, 일반적으로 이중작용성 시약, 예컨대 포름알데히드, 글루타르디알데히드, 디숙신이미딜 수베레이트, 디티오비스(숙신이미딜 프로피오네이트), 디숙신이미딜 타르타레이트, 디설포숙신이미딜 타르타레이트, 디메틸 아디피미데이트, 디메틸 피멜리데이트, 디메틸 수베르이미데이트, 디메틸 3,3'-디티오비스프로피온이미데이트, N-γ-말레인이미도부틸옥시-숙신이미드 에스테르, 숙신이미딜 4(N-말레인이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트, N-숙신이미딜(4-요오드아세틸)아미노벤조에이트 및 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)-프로피오네이트이다.
그러한 가교된 올리고머의 장점은, 안정화되고, 올리고머화가 일반적으로 더 이상 가역적이지 않다는 것을 포함한다. 따라서, 진단 테스트 시스템에 사용하기 위해, 또는 올리고머 특이적 항체의 생성을 위한 면역원으로서 특히 적절하다.
본 발명의 올리고머의 유도체는 아밀로이드 β(1-42) 단백질의 단편의 올리고머를 포함한다. 자연 발생 프로테아제의 작용에 의해 얻을 수 있는 단편이 바람직하다. 비변성 조건 하에 생리적 완충액 중에서 단백분해에 의해 얻을 수 있는 단편은, 특히 아밀로이드 β(1-42) 단백질과 비교하여 단백분해 안정성이 증가되어 있다. 엔도펩티다제의 작용에 의해 얻을 수 있는 단편이 바람직하다. 본 발명의 특정 구체예에 따르면, 상기 단편은 트립신, 키모트립신, 써모리신, 엘라스타제, 파파인 또는 엔도프로테인아제 GluC의 작용에 의해 얻을 수 있다. 또 다른 측면에 따르면, 신경조절 작용이 특징적인 본 발명의 올리고머를 갖는 단편이 바람직하다. 이 측면의 또 다른 예로서, 본 발명의 아밀로이드 β(1-42) 단백질의 올리고머의 신경조절 작용에 대한 상응하는 설명을 참조한다.
구조적으로, 바람직한 단편은 특히 N-말단 서열 제거에 의해 아밀로이드 β(1-42) 단백질로부터 유도된 것을 특징으로 한다. 일 측면에 따르면, 상기 N-말단 서열은 아밀로이드 β(1-42) 단백질의 N-말단 서열의 아미노산 23개 이하, 바람직하게는 21개 이하, 특히 19개 이하를 갖는 단편일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르면 연속 아미노산 24∼42, 바람직하게는 22∼42, 특히 20∼42를 포함하는 서열을 갖는 Aβ(1-42) 단백질 단편이 바람직하다. 또 다른 측면에 따르면, 제거하고자 하는 N-말단 서열은 아밀로이드 β(1-42) 단백질의 N-말단 서열의 아미노산 7개 이상, 바람직하게는 9개 이상, 특히 11개 이상을 갖는 서열일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르면 7∼23개 아미노산, 바람직하게는 9∼21개 아미노산, 특히 11∼19개 아미노산이 N-말단 절두된 아밀로이드 β(1-42) 단백질의 단편이 바람직하다. 이들 단편은 화학식 Aβ(x-42)에 해당하며, 이 때 x는 8∼24, 바람직하게는 10∼22, 특히 12∼20이다. 본 발명에 따르면, Aβ(x-42) 단편은 Aβ(8-42), Aβ(9-42), Aβ(10-42), Aβ(11-42), Aβ(12-42), Aβ(13-42), Aβ(14-42), Aβ(15-42), Aβ(16-42), Aβ(17-42), Aβ(18-42), Aβ(19-42), Aβ(20-42), Aβ(21-42), Aβ(22-42), Aβ(23-42) 및 Aβ(24-42)로부터 선택하는 것이 바람직하다. 특별한 단편은 써모리신의 작용에 의해 얻을 수 있는 아밀로이드 β(20-42) 단편 및 GluC 엔도프로테인아제의 작용에 의해 얻을 수 있는 아밀로이드 β(12-42) 단편이다.
본 발명의 유도체는 1 또는 2개의 추가 C-말단 아미노산을 갖는 아밀로이드 β(1-42) 단밸질로부터 유도된 형태이다. 이의 예는 상기 설명에 상응하는 Aβ(1-43) 단백질의 올리고머 또는 이의 유도체를 포함한다.
올리고머를 제조하는 본 발명의 방법은 실질적으로 3 단계를 포함할 수 있으며, 이중 제1 단계는 선택적이지만 유리하며, 제2 단계는 올리고머 A 및 B의 제조를 위해 절대적으로 필요하고, 제3 단계는 본 발명의 올리고머 B를 제조하는 작용을 한다.
단계 1은 단백질의 풀림(unfolding)에 관한 것이다. 이를 위해서, 예를 들어 헥사플루오로이소프로판올(HFIP)과 같은 수소 결합 파괴제를 단백질에 작용하게 할 수 있다. 작용 온도가 약 20∼50℃, 특히 약 35∼40℃인 경우 수 분의 작용 시간, 예컨대 약 10∼60분이면 충분하다. 수성 완충액과 혼화성인 적절한 유기 용매, 예컨대 디메틸 설폭시드(DMSO) 중에서 건조 형태, 바람직하게는 농축 형태로 증발시킨 잔류물을 후속 용해시키면 적어도 부분적으로 풀린 단백질의 현탁액을 얻을 수 있으며, 이를 본 발명의 방법의 제2 단계에서 사용할 수 있다. 필요에 따라, 저온, 예컨대 약 -20℃에서, 잠시 스톡 현탁액을 저장할 수 있다.
상기 제1 단계 대신에, 단백질을 약간 산성, 바람직하게는 수성 용액, 예컨대 약 10 mM HCl 수용액에 용해시킬 수 있다. 일반적으로 수 분의 항온처리 시간 후에, 원심분리에 의해 불용성 성분을 제거한다. 10,000 g에서 수 분이 적절하다. 본 방법의 단계들은 실온, 즉 20∼30℃의 온도에서 실시하는 것이 바람직하다. 원심 분리 후에 얻은 상청액은 아밀로이드 β(1-42) 단백질을 포함하며, 저온, 예컨대 약 -20℃에서 잠시 저장할 수 있다.
단계 2는 올리고머 A를 제공하는 단백질의 올리고머화에 관한 것이다. 이를 위해서, 경우에 따라 충분한 올리고머 A가 생성될 때가지 적어도 부분적으로 풀린 단백질에 세제를 작용시킬 수 있다.
이온성 세제, 특히 음이온성 세제를 사용하는 것이 바람직하다.
특정 구체예에 따라서, 하기 화학식 I로 표시되는 세제가 사용된다.
R-X
상기 식에서, R은 C6-20, 바람직하게는 C10-14의 비분지쇄 또는 분지쇄 알킬, 또는 C6-20, 바람직하게는 C10-14의 비분지쇄 또는 분지쇄 알케닐이고,
라디칼 X는 음이온성기 또는 이의 염으로서, X는 -COO-M+, -SO3 -M+로부터 선택되는 것이 바람직하며, 특별히 -OS03 -M+이며, M+는 바람직하게는 알칼리 금속 및 알칼리 토금속 양이온 및 암모늄 양이온으로부터 선택된 무기 또는 유기 양이온 또는 수소 양이온이다.
R이 비분지쇄 알킬이고, 특히 알크-1-일 라디칼인 화학식 I로 표시되는 세제가 유리하다. 나트륨 도데실 설페이트(SDS)가 특히 바람직하다. 라우르산 및 올레산을 유리하게 사용할 수 있다. 세제 라우로일사르코신의 나트륨염(사르코실 NL-30 또는 Gardol(등록상표)로도 알려져 있음)도 특히 유리하다.
세제 작용 시간은 특히, 올리고머화시킨 단백질이 풀리는지 여부 - 및, 만약 그렇다면 어느 정도인지- 에 따라 달라진다. 단계 1에 따라 단백질을 수소 결합 파괴제, 즉 특히 헥사플루오로이소프로판올로 미리 처리한 경우, 작용 온도가 약 20∼50℃, 특히 약 35∼40℃라면 작용 시간은 수 시간, 유리하게는 약 1∼20 시간, 특히 약 2∼10 시간이면 충분하다. 덜 풀리거나 또는 실질적으로 풀리지 않은 단백질이 출발점에 있다면, 이에 따라 작용 시간을 늘리는 것이 적절하다. 예컨대 단계 1에 대한 대체법으로서 상기 제시한 절차에 따라 아밀로이드 β(1-42) 단백질을 전처리하거나, 또는 상기 단백질을 단계 2에 직접 도입한 경우, 작용 온도가 약 20∼50℃, 특히 약 35∼40℃일 때 작용 시간은 약 5∼30 시간, 특히 약 10∼20 시간이면 충분하다. 항온처리 후에, 불용성 성분은 원심분리로 유리하게 제거한다. 10,000 g에서 수 분이면 적당하다.
선택할 세제 농도는 사용된 세제에 따라 달라진다. SDS가 사용된 경우, 0.01∼1 중량%, 바람직하게는 0.05∼0.5 중량%, 예컨대 약 0.2 중량% 범위의 농도가 적절한 것으로 판단된다. 라우르산 또는 올레산을 사용하는 경우, 0.05∼2 중량%, 바람직하게는 0.1∼0.5 중량%, 예컨대 약 0.5 중량% 등의 다소 높은 농도가 적당하다.
세제는 생리적 범위 내에서 대략 염 농도에서 작용해야 한다. 따라서, 특히 50∼500 mM, 바람직하게는 100∼200 mM, 특히 약 140 mM의 NaCl 농도가 적당하다.
올리고머 A, 특히 올리고머 A1 및/또는 A2를 함유하는 생성 용액은 저온, 예컨대 약 -20℃에서 잠시 저장할 수 있다. 상기 용액은 올리고머 B를 제공하기 위해 추가 반응시키거나 또는 본 발명에 사용하거나, 또는 본 발명의 올리고머 A 중 적어도 하나를 추가 농축시키기 위해서 제1회 후에 추가의 워크업 또는 정제 단계를 거치게 할 수 있다. 특히, 용액 내에 존재하는 다른 단백질 성분으로부터, 특히 아밀로이드 β(1-42) 단백질로부터 유도된 것들로부터 크로마토그래피 방법으로 본 발명의 올리고머를 분리할 수 있다. 예를 들어 특이적 항체, 즉, 특히 본 발명의 올리고머 특이적 항체를 사용할 수 있는 친화도 크로마토그래피 방법이 이러한 목적에 특히 적합하다.
단계 3은 올리고머 B를 제공하기 위한 올리고머화에 관한 것이다. 바람직하게는, 올리고머 A를 포함하는 조성물을 본 단계를 위한 반응물로서 선택한다. 이러한 측면에서, 본 발명에 따르면 올리고머 A는 올리고머 B의 제조를 위한 중요한 중간체이다. 상기 조성물이 단계 2로부터 유래한 것이라면, 보통 세제 및 염을 생리적 범위 내의 농도로 포함한다. 그 다음 세제 작용 및 염 농도를 감소시키는 것이 적당하다. 이것은, 예를 들어 물 또는 저염 농도의 완충액, 예컨대 트리스-HCl, pH 7.3으로 적당히 희석하여, 세제 및 염의 농도를 줄임으로써 실현할 수 있다. 약 2∼10, 유리하게는 약 3∼8, 특히 약 4의 희석 배수가 적절한 것으로 판단된다. 상기 세제 작용을 중화시킬 수 있는 물질을 첨가하여 세제 작용을 감소시킬 수 있다. 이들 물질의 예에는 세제를 착화시킬 수 있는 물질, 정제 및 추출 과정 중에 세포를 안정화시킬 수 있는 물질, 예컨대 특히 EO/PO 블록 공중합체, 특히 상표명 Pluronic (등록상표) F68의 블록 공중합체가 포함된다. 알콕실화된, 특히 에톡실화된 알킬 페놀, 예컨대 트리톤(등록상표) X 시리즈(특히 트리톤(등록상표) X100)의 에톡실화된 t-옥틸페놀, 3-(3-콜아미도프로필디메틸암모니오)-1-프로판설포네이트(CHAPS(등록상표))또는 알콕실화된, 특히 에톡실화된 소르비탄 지방 에스테르, 예컨대 트윈(등록상표) 시리즈, 특히 트윈(등록상표) 20의 것을, 특정 임계 미셀 농도 부근 또는 그 이상의 농도로 사용한다.
이어서, 충분한 올리고머 B가 생성될 때까지 용액을 항온처리한다. 작용 온도가 약 20∼50℃, 특히 약 35∼40℃일 때 수 시간 범위, 바람직하게는 약 10∼30 시간 범위, 특히 약 15∼25 시간 범위 내의 작용 시간이면 충분하다. 그 다음 용액을 농축하고, 가능한 잔류물을 원심분리로 제거할 수 있다. 여기서도 10,000 g에서 수 분이면 적당한 것으로 판단된다. 원심분리 후에 얻은 상청액은 올리고머 B를 포함한다.
올리고머 B, 특히 올리고머 B1 및/또는 B2를 포함하는 생성 용액을 저온, 예컨대 약 -80℃에서 잠시 저장할 수 있다. 상기 용액을 본 발명에 사용하거나, 또는 그 후에 추가의 워크업 또는 정제 단계를 실시할 수 있다. 이와 관련하여, 올리고머 A와 관련한 해당 조치에 대해 상기 설명한 내용을 참조한다.
추가의 워크업 또는 정제 단계는 올리고머를 제조하기 위해 사용된 세제를 거의 완전히 제거할 목적으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 올리고머 B를 세제 함유 용액으로부터 먼저 침전시킨 다음, 분리하고, 세제 무함유 매체에 재용해시킬 수 있다. 단백질을 침전시키는 조치는 당업자에게 충분히 알려져 있다. 본 발명에 따르면, 수성-메탄올성 아세트산의 첨가가 적당한 것으로 판단된다. 특정한 메카니즘에 구애받지 않으면서, 변성 또는 천연 겔 전기영동 또는 겔 침투 크로마토그래피에 의해 검출할 수 있는 바와 같이, 세제 또는 세제 및 염 농도의 변화는 단백질을, 수성 생리적 완충액에 용해된 단백질 출발 형태와는 분명히 다른 소정의 가용성 형태로 만드는 것으로 생각된다. 세제는 보통 단백질 응집물을 분해, 즉 서브유닛으로 해체할 수 있는 반면에, 본 발명에 따르면 소정의 올리고머를 응집하는 경향이 있는 단량체로부터 출발하여 얻기 때문에, 이것은 놀라운 일이다.
본 발명의 올리고머 유도체는, 미리 적절하게 유도체화된 아밀로이드 β(1-42) 단백질에 대해 상기 개시된 본 발명의 방법을 실시하여 적절하게 제조할 수 있다. 대안적으로, 올리고머를 유도체화할 수 있지만, 상기 올리고머의 구조를 변형시켜서는 안된다. 적절한 단백질-화학 조치는 당업자에게 알려져 있다.
본 발명의 올리고머 또는 이의 유도체의 가교는 당업계에 공지된 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 글루타르알데히드가 가교제로서 사용되는 경우, 본 발명의 방법의 단계 2 또는 3으로부터 얻은 용액을 글루타르디알데히드 용액으로 처리할 수 있다. 실온에서 수 시간 후에, 올리고머는 글루타르알데히드와 반응할 것이다. 과량의 글루타르알데히드를 이러한 목적으로 일반적으로 알려진 시약(예, 에탄올아민)과 반응시켜 자체 공지된 방법으로 반응을 중단시킬 수 있다. 본 발명의 올리고머 A 또는 B가 가교되는지 여부에 따라서, 각각 A-CL 및 B-CL이라고 하는 본 발명의 가교된 올리고머 용액이 얻어진다.
선택적으로 가교된 올리고머 B 또는 이의 유도체를 위해, 상기 올리고머의 안정성을 손상시키지 않으면서 합성 후에 염 농도를 다시 증가시킬 수 있다. 예를 들어 사용을 위해 생리적 조건이 적당한 경우(세포 용도, 생체내 용도), 이것은 상기 올리고머의 사용과 관련하여 중요하다.
아밀로이드 β(1-42) 단백질의 단편의 올리고머는 원칙적으로, 올리고머화에 의한 상응한 단량체 단편으로부터 출발하거나, 또는 단백분해에 의해 상기 아밀로이드 β(1-42) 단백질의 올리고머로부터 출발하여 제조할 수 있다. 따라서, 제2 변법에 따르면, 본 발명의 방법의 단계 2 또는 3으로부터 얻은 용액을 프로테아제로 처리할 수 있다. 단백분해가 소정의 정도에 도달하면, 일반적으로 알려진 방법으로 프로테아제를 비활성화시킨다. 본 명세서에 앞서 개시된 절차에 따라 생성된 올리고머를 분리하고, 필요에 따라 추가의 워크업 및 정제 단계로 추가 처리할 수 있다.
본 발명의 올리고머 및 이를 포함하는 조성물은 균질성 및 안정성에서 구별된다. 상기 올리고머 및 조성물은 생리 매체, 예컨대 생리 염수에 용해될 수 있고, 다소 구형의 외관에 의해 섬유상 형태와는 다르다. 이들은 다른 Aβ(1-42) 형태, 특히 단량체, 비독성 올리고머, Aβ(1-42)를 포함하는 전구체 분자 APP, 원섬유 및 소섬유와는 특징적으로 다른 공간 구조를 갖는 장점이 있다. 따라서, 생체내 및 시험관내에서 특이적 항체를 형성하는 데 특히 적절하고, 예를 들어 특이적 활성 면역화를 가능하게 할 수 있다. 질병을 일으키는 올리고머만을 면역화에 사용하는 것이 중요할 수 있다. 단량체 분자 또는 작은 올리고머와 같은 다른 형태의 Aβ(1-42)는 유기체에서 중요한 신호 작용에 필요할 수 있다. 마찬가지로, 세포 내층을 위해 중요할 것 같은 섬유상 침착물의 제거는 유기체를 손상시킬 수 있다.
동일한 방식으로, 본 발명의 균질한 올리고머 및 상기 올리고머를 포함하는 조성물, 올리고머 형태의 탈안정화제를 사용하고, 수용체 (부분) 작용물질 또는 길항물질을 사용하여 가능한 치료법, 예컨대 수동 면역화를 실시할 수 있다. 따라서, 균질한 올리고머 제제는 수동 면역을 위한 폴리클로날 또는 모노클로날 항체의 특이적 생성을 가능하게 한다. 질병과 관련되어 있고, 본 발명의 올리고머 및 이를 포함하는 조성물을 사용하여 상기 올리고머 형태에 의해 영향을 받는 수용체 분자 또는 신호 분자를 발견할 수 있다.
아밀로이드 β 단백질-관련 생리 과정에서의 그 연관성으로 인하여, 본 발명의 올리고머는 진단 및 치료 측면에서 가치가 있다. 따라서, 본 발명은 진단적 시험관내 진단 방법 및 생체내 검출 방법에 있어서의 본 발명의 올리고머 및 이의 유도체(경우에 따라서는 상응하는 조성물 형태임)의 용도에 관한 것이다.
아밀로이드 β 단백질 관련 생리 과정은 아밀로이드 단백질의 침착(아밀로이드증)과 관련된 것들을 포함한다. 이들은, 예컨대 알츠하이머병 및 다운 증후군에서 중요하고 신경 조직의 구조적 변형을 초래하는 과정과, 아밀로이드 미세혈관병증, 예컨대 콩고염색성 아밀로이드 혈관병(congophilic amyloid angiopathy(CAA))과 같이 다른 조직에 영향을 주는 과정을 모두 포함한다.
본 발명은 또한 올리고머 특이적 항체를 생성하는 본 발명의 올리고머 및 이의 유도체(경우에 따라서 상응하는 조성물 형태임)의 용도에 관한 것이다.
Aβ(1-42) 단백질의 절두형에 기초한 본 발명의 올리고머는 특히 중요하다: N-말단 결실로 인하여, 이들 올리고머는 Aβ(1-42) 단백질보다 뚜렷하게 더욱 선택적인 면역 반응을 형성할 수 있다. 고전적인 Aβ(1-42) 단백질에서는 고도의 면역원성 N-말단이 분자의 이 영역에 특이적인 항체, 예컨대 제조자의 정보에 따라 N-말단에 대해 유도된 항체 6E10(F.Signet) 및 BAM-10(Sigma, St. Louis) (6E10: Aβ(1-17) 및 BAM-10 Aβ(1-12))를 주로 생성하지만, 절두된 Aβ(1-42) 형태를 기초로 한 본 발명의 올리고머를 사용하여 얻을 수 있는 항체는 올리고머 특이적 영역을 인식하여 다른 Aβ(1-42) 형태와 비교하여 선택성을 실현한다. (APP, 단량체 형태, 원섬유, 소섬유, 반(plaque)에 대한) 예방접종 후에 생긴 더욱 선택적인 면역 반응은 부작용(예, 뇌 출혈, 동일계 단량체 형태의 생리적 신경영양성 활성의 손상)을 더 적게 수반하기 때문에, 특히 능동 예방접종의 경우 이러한 장점을 이용할 수 있다. 수동 면역, 즉 항체 요법의 경우 특히 모노클로날 항체의 우수한 생성 및 선택도 가능하다.
이러한 용도의 일 측면은 요법 구성 내에서의 올리고머 특이적 항체의 생성이다.
따라서, 본 발명은 또한 치료법 분야에서의, 특히 백신으로서의 본 발명의 올리고머 또는 이의 유도체의 용도에 관한 것이다.
그러한 백신은 일반적으로 본 발명의 하나 이상의 올리고머 및/또는 본 발명의 하나 이상의 유도체를 포함하는 약학 조성물이다. 이를 위해서, 특히 2 이상의 올리고머를 포함하는 본 발명의 임의의 조성물 또는 상이한 조성물의 조합을 사용할 수 있다. 따라서, 올리고머 B, 즉 B1 및 B2, 또는 이의 유도체를 사용하는 예방접종을 실시할 수 있다. 이 조성물은 생리적으로 적절한 담체 및 경우에 따라 추가의 부형제, 예컨대 면역자극제를 추가로 포함할 수 있다.
원칙적으로 임의의 적절한 담체를 선택할 수 있지만, 담체의 종류는 일반적으로 투여 경로에 따라 달라진다. 따라서, 본 발명의 백신은 비경구 투여, 예컨대 정맥내, 근육내 및 피하 투여에 적합한 형태로 제형화될 수 있다. 이 경우, 담체는 바람직하게는 물, 염수, 알코올, 지방, 왁스 및/또는 완충액을 포함한다.
본 발명의 백신 중 다수의 면역자극제 중 임의의 것을 사용할 수 있다. 예를 들어, 면역보강제가 포함될 수 있다. 대부분의 면역보강제(adjuvant)는 신속한 이화작용으로부터 항원을 보호하기 위한 물질, 예컨대 수산화알루미늄 또는 광유와, 지질 A, 보르타델라 퍼투시스(Bortadella pertussis) 또는 마이코박테리움 투버쿨로시스(Mycobacerium tuberculosis)로부터 유도된 단백질을 포함한다. 적절한 면역보강제는 일반적으로 시판되며, 예컨대 완전 또는 불완전 프로인트 면역보강제; AS-2; 수산화알루미늄(적절한 경우 겔로서) 또는 인산알루미늄과 같은 알루미늄염; 칼슘염, 철염 또는 아연염; 아세틸화된 티로신의 불용성 현탁액; 아세틸화된 당; 양이온 또는 음이온 유도체화된 다당류; 폴리포스파젠; 생물학적으로 분해가능한 미소구; 모노포스포릴 지질 A가 있다. GM-CSF 또는 인터루킨-2, -7 또는 -12와 같은 시토킨도 역시 면역보강제로서 사용할 수 있다.
또한 본 발명은 항체의 생성 방법에 관한 것으로서,
i) 본 발명의 하나 이상의 올리고머, 이의 유도체 또는 조성물로 숙주를 면역화하는 단계; 및
ii) 상기 면역화에 대한 반응으로서 생성된 항체-함유 숙주 혈청을 얻는 단계
를 포함한다.
항체를 생성하는 방법의 특정 구체예에 따르면, 본 발명의 각종 올리고머 또는 올리고머 유도체의 혼합물을 포함하는 면역화 칵테일을 투여하여 면역화시킨다. 특히, 올리고머 조성이 다른 복수의 면역화 칵테일을 상기 방법에서 투여하는 것이 적당할 수 있다.
사용할 올리고머 또는 올리고머 유도체가 면역원성이 아니거나 또는 약하게 면역원성인 경우, 담체, 바람직하게는 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 리물루스 폴리페누스 헤모시아닌(Limulus polyphenus hemocyanin(LPH)), 소 혈청 알부민(BSA) 또는 난알부민(OVA)과 같은 담체 단백질에 커플링시켜 면역원성을 증가시킬 수 있다. 이러한 목적으로, 당업자가 이용가능한 다수의 공지된 커플링이 있다. 가능한 적절한 예는, 예를 들어 물 또는 수성 용매 중에서 적절한 펩티드 또는 펩티드 혼합물과 올리고머 또는 올리고머 혼합물을 항온처리하여, 글루타르알데히드와 반응시키는 것이다. 이러한 반응은 상온, 즉 일반적으로 실온에서 편리하게 실시할 수 있다. 그러나, 온도를 감소시키거나 또는 약간 증가시키는 것이 적당할 수 있다. 반응은 일반적으로 수 시간 내에 목적하는 결과를 생성하며, 2 시간의 반응 시간은 일반적인 범위 내에 있다. 글루타르알데히드 농도는 일반적으로 ppm 내지 % 범위, 적절하게는 10 ppm 내지 1%, 바람직하게는 10 ppm 내지 0.5% 범위이다. 반응 매개변수의 최적화 방법은 당업자의 통상의 지식 내에 있으며, 올리고머 A 및 B 또는 올리고머 유도체가 선택된 반응 조건 하에 안정하다는 것을 고려해야 한다.
사용할 성분들을 먼저 조합하여 면역화 칵테일을 제조한다. 초기에 생성된 성분 혼합물을 항온처리하는 것이 유리하다. 이것은 상온, 즉 일반적으로 실온에서 편리하게 실시한다. 그러나, 상기 혼합물을 냉각하거나 또는 약간 가열하는 것이 적당할 수 있다. 항온처리 기간은 일반적으로 수 분 내지 수 시간이며, 1시간의 항온처리 시간이 유리한 것으로 판단된다.
면역화 칵테일은, 일반적으로 항원 외에 부형제, 특히 면역화를 위해 범용되는 면역보강제, 예컨대 프로인트 면역보강제를 추가로 포함한다. 더욱 구체적으로, 완전 프로인트 면역보강제를 제1 면역화에 사용하고, 불완전 프로인트 면역보강제로 임의의 추가의 면역화를 실시한다. 바람직하게는 상기 개시된 성분의 혼합물 형태의 항원(면역원)을 부형제(들)에 첨가하여 면역화 칵테일을 제조하며, 항원은 일반적으로 유화된다.
적절한 숙주에는 특히 설치류 또는 그 외에 토끼가 있다. 이들 또는 다른 적절한 숙주에게 면역화 칵테일을, 바람직하게는 피하로 주사한다. 면역분석, 예컨대 숙주 IgG 및 표지된 올리고머에 대해 유도된 양 항혈청을 경쟁적으로 사용하여 항체 역가를 측정할 수 있다. 따라서, 면역화가 끝날 무렵, 특정 숙주가 항체를 생성하는 데 적합한 지 여부를 결정할 수 있다. 예를 들어, 4회의 면역화를 실시하는 경우, 제3 면역화 후에 항체 역가를 결정한 다음, 충분한 항체 역가를 갖는 동물로부터 항체를 얻을 수 있다.
수 주 또는 수 개월 동안 숙주로부터 혈액을 채취하여 생성된 항체를 얻는 것이 바람직하다. 마지막으로, 숙주를 방혈시킬 수 있다. 목적하는 항체를 포함하는 혈청은, 자체 공지된 방법으로 얻은 혈액으로부터 얻을 수 있다. 그 결과 얻어진 전체 혈청을, 필요에 따라 당업자가 추가로 정제하여 그 내부에 존재하는 항체 분획, 특히 올리고머 인식 항체를 농축시킬 수 있다.
이 방법의 특정 구체예에 따르면, 혈청 중 하나 이상의 항체가 선택되는데, 이 항체는 면역원으로서 사용된 올리고머 또는 이의 유도체나, 또는 면역원으로서 사용된 조성물 내에 존재하는 하나 이상의 올리고머 또는 이의 유도체를 특이적으로 인식한다. 본 명세서에서, 특이성이란 다른 것에 대해서보다, 구체적으로 관련 단백질, 특히, 단량체 아밀로이드 β(1-42) 단백질 및 본 발명의 올리고머보다 분자량이 큰 올리고머 또는 다량체 아밀로이드 β(1-42) 단백질 응집물과 비교하여 면역원에 대한 항체의 결합 친화력이 더 높은 것을 의미한다. 또한, 이러한 방식으로 모노클로날 올리고머 특이적 항체를 얻을 수 있다. 그러나, 이를 위해서, 숙주로부터 비장 조직을 제거하고, 얻어진 비장 림프구로부터 출발하여 통상의 방식으로 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마를 생성하는 것이 바람직하다.
항체 생성의 상세한 설명
전체적으로, 수 억개의 상이한 항체 특이성으로 구성된 항체 레퍼토리(repertorie)를 포함하는 B 림프구는 포유류 면역계의 일부이다. 특정 항원에 대한 정상 면역 반응이란 상기 항원에 특이적으로 결합하는 레퍼토리 내의 하나 이상의 항체의 선택을 의미하는 것이며, 면역 반응의 성공 여부는 자극 항원을 특이적으로 인식(하고 궁극적으로 제거)하고 상기 항체의 환경 내의 다른 분자를 무시하는 상기 항체의 능력에 적어도 부분적으로 기초한다.
하나의 특정 표적 항원을 특이적으로 인식하는 항체의 유용성으로 인해 모노클로날 항체 기법이 개발되었다. 표준화된 하이브리도마 기법으로 관심 항원에 대해 하나의 특이성을 갖는 항체를 생성할 수 있게 되었다. 더욱 최근에는, 항체 라이브러리의 시험관내 스크리닝과 같은 재조합 항체 기법이 개발되었다. 또한 이들 기법으로 인해 관심 항원에 대한 단일 특이성을 갖는 항체를 생성할 수 있게 되었다.
본 발명의 방법에서, 관심 항원을 생체내 또는 시험관내에서 항체 레퍼토리에 작용하게 할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 항원으로 동물을 생체내 면역화시켜 상기 항원을 레퍼토리에 작용하게 할 수 있다. 이러한 생체내 방법은 동물의 림프구로부터 다수의 하이브리도마를 형성하는 단계 및 상기 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 분비하는 하이브리도마를 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다. 면역화할 동물은, 예컨대 마우스, 래트, 토끼, 닭, 카멜리드(camelid) 또는 양이거나, 또는 항원 자극 후에 인간 항체를 생성하는, 인간 면역글로불린 유전자를 갖는 트랜스게닉 마우스 등의 상기 언급된 임의의 동물의 트랜스게닉 형태일 수 있다. 면역화될 수 있는 다른 종류의 동물은 인간 말초 혈액 단핵 세포(키메라 hu-PBMC SCID 마우스) 또는 림프양 세포 또는 이의 전구체로 재구성된 중증 복합 면역결핍(SCID)이 있는 마우스와, 치사량의 전신 방사선 조사로 처리하고, 중증 복합 면역결핍(SCID) 마우스로부터 얻은 골수 세포를 이용하여 방사선에 대해 보호한 다음, 기능적 인간 림프구를 이용하여 이식한 마우스("Trimera" 시스템)를 포함한다. 면역화할 또 다른 종류의 동물은 예를 들어 상동성 재조합으로 그 게놈에서 관심 항원을 코딩하는 내인성 유전자를 제거(넉아웃)하여 항원으로 면역화시킨 후에 상기 동물이 상기 항원을 외인성인 것으로 인식하는 동물(예, 마우스)이다. 이러한 방법으로 생성된 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 특성화하고, 비제한적인 예로서 ELISA 기법 등의 기존 스크리닝 방법을 이용하여 선별하는 것이 당업자에게는 자명하다.
또 다른 구체예에 따르면, 상기 항원으로 재조합 항체 라이브러리를 스크리닝하여 항원을 시험관 내에서 항체 레퍼토리에 작용하도록 한다. 재조합 항체 라이브러리를 예컨대 박테리오파지 표면, 또는 효모 세포 표면, 또는 박테리아 세포 표면에서 발현시킬 수 있다. 각종 구체예에서, 재조합 항체 라이브러리는 예를 들어 scFv 라이브러리 또는 Fab 라이브러리이다. 또 다른 구체예에 따르면, 항체 라이브러리는 RNA 단백질 융합체로서 발현된다.
본 발명의 항체를 생성하는 또 다른 방법은 생체내 및 시험관내 방법의 조합을 포함한다. 예를 들어, 생체 내에서 항원으로 동물을 면역화시킨 다음, 상기 항원을 이용하여 상기 동물의 림프양 세포로부터 제조된 재조합 항체 라이브러리 또는 단일 도메인 항체 라이브러리(예, 중쇄 및/또는 경쇄 함유)를 시험관 내에서 스크리닝하여 항원을 항체 레퍼토리에 작용하게 할 수 있다. 또 다른 방법에 따르면, 생체 내에서 항원으로 동물을 면역화한 다음, 상기 동물의 림프양 세포로부터 생성된 단일 도메인 라이브러리 또는 재조합 항체 라이브러리를 친화력 증가(affinity maturation)시켜 상기 항원을 항체 레퍼토리에 작용하게 할 수 있다. 또 다른 방법에 따르면, 생체 내에서 항원으로 동물을 면역화하여 항원을 항체 레퍼토리에 작용하게 하고, 관심 항체를 분비하는 각 항체 생성 세포를 선택하고, (예컨대 PCR에 의해) 상기 선택된 세포로부터 중쇄 및 경쇄의 가변부에 대한 cDNA를 얻고, 시험관 내에서 포유류 숙주 세포에서 상기 중쇄 및 경쇄의 가변부를 발현하여(이것을 선택된 림프구 항체 방법, 즉 SLAM이라고 함), 선택된 항체 유전자 서열을 추가로 선택 및 조작할 수 있다. 또한, 포유류 세포에서 중쇄 및 경쇄에 대한 항체 유전자를 발현하고 목적하는 결합 친화력을 갖는 항체를 분비하는 포유류 세포를 선택함으로써 발현 클로닝에 의해 모노클로날 항체를 선택할 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 측면은 스크리닝 및 대비 스크리닝을 위한 소정의 항원을 제공하는 것이다. 따라서, 본 발명에 따르면, 본 발명의 올리고머 또는 이의 유도체에 결합하지만 다른 형태의 Aβ(1-42) 단백질, APP, 아밀로이드 소섬유 또는 아밀로이드반과 다수의 다른 비관련 항원 및 조직에는 결합하지 않는 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 선택할 수 있다.
항체 선별이 잘 규명된 항원을 기초로 이루어진다는 것은 당업자에게 충분히 알려져 있다. 대조적으로, 규명이 잘 되어 있지 않은 항원을 사용시에는 선택성이 충분하지 않다. 간단히 말하면, 시험관 내에서의 작용 및 선별은 친화도 크로마토그래피와 유사하고, 목적하는 항원에 대한 "리간드"를 불충분한 친화도로 항원과 결합한 리간드로부터 분리한다. 거대 푸울의 다른 항체로부터의 목적 항체의 농축 정도는 항원의 품질에 중요하다. 놀랍게도, 본 발명의 올리고머 및 이의 유도체는 선택적인 적절한 관련 항체를 농축하고, Aβ(1-42) 단백질과 관련된 다른 형태 및 기타 비관련 항원을 인식하는 항체로부터 이들을 효과적으로 분리하는 데 사용할 수 있는 항원이다.
항체를 생성하는 본 발명의 방법을 사용하여 각종 유형의 항체를 생성할 수 있다. 이들 항체는 주로 인간 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체 및 CDR 이식 항체와 이의 항원 결합 부분을 포함한다.
본 발명의 항체를 생성하는 방법은 하기에 논의되어 있다. 생체내 방법, 시험관내 방법 또는 양 방법의 조합 사이에 차이점이 있다.
생체내 방법
생체내 생성된 항체 생산 세포로부터, Kohler 및 Milstein의 문헌 (1975, Nature 256: 495-497)에 처음 개시된 하이브리도마 기법과 같은 표준화된 기법으로 모노클로날 항체를 생성할 수 있다(또한, Brown et al. (1981) J. Immunol 127:539-46; Brown et al (1980) J Biol Chem 255:4980-83; Yeh et al. (1976) PNAS 76:2927-31; 및 Yeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29: 269-75 참조). 모노클로날 항체 하이브리도마를 생성하는 기법은 충분히 공지되어 있다(일반적으로 R. H. Kenneth, in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980); E. A. Lerner (1981) Yale J. Biol. Med., 54:387-402; M. L. Gefter et al. (1977) Somatic Cell Genet., 3:231-36 참조). 간단히 요약하면, 무한증식 세포주(통상적으로 골수종)를 본 발명의 올리고머 또는 이의 유도체로 면역화된 동물의 림프구(통상적으로 비장세포 또는 림프절 세포 또는 말초 혈액 림프구)와 융합시키고, 생성된 하이브리도마 세포의 배양 상청액을 스크리닝하여 본 발명의 올리고머 또는 이의 유도체에 대한 특이성을 갖는 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마를 확인한다. 림프구와 무한증식 세포주를 융합시키는 여러가지 공지된 프로토콜 중 임의의 프로토콜을 이러한 목적으로 적용할 수 있다(또한 G. Galfre et al. (1977) Nature 266:550-52; Gefter et al. Somatic Cell Genet., cited supra; Lerner, Yale J. Biol. Med., cited supra; Kenneth, Monoclonal Antibodies, cited supra). 또한, 당업자는 그러한 방법의 다양한 변법이 있고, 이들 변법 역시 유용하다는 것을 알 것이다. 통상적으로, 무한증식 세포주(예, 골수종 세포주)는 림프구와 동일한 포유류 종으로부터 유도된다. 예를 들어, 본 발명의 면역원성 제조물로 면역화시킨 마우스로부터 얻은 림프구를 무한증식 마우스 세포주와 융합시켜 쥐 하이브리도마를 형성할 수 있다. 바람직한 무한증식 세포주는 하이포크산틴, 아미놉테린 및 티미딘를 포함하는 배양 배지(HAT 배지)에 민감한 마우스 골수종 세포주이다. 다수의 골수종 세포주 중 임의의 세포주, 예를 들어 P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 또는 Sp2/O-Ag14 골수종 세포주를 표준 방식으로 융합 파트너로서 사용할 수 있다. 이들 골수종 세포주는 미국 매릴랜드주 록빌의 미국 모식균 배양 수집소(ATCC)로부터 입수가능하다. 통상적으로, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 사용하여 HAT 민감성 마우스 골수종 세포를 마우스 비장세포에 융합시킨다. HAT 배지를 이용하여 융합체로부터 생성된 하이브리도마 세포를 선택하여, 비융합된 골수종 세포와 비생산적으로 융합된 골수종 세포를 죽인다(비융합된 비장세포는 형질전환되지 않았기 때문에 수 일 후에 죽는다). 본 발명의 올리고머 또는 이의 유도체를 특이적으로 인식하는 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마 세포는, 예컨대 본 발명의 올리고머 또는 이의 유도체에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 선별하기 위한 표준 ELISA 분석을 사용하여, 하이브리도마 배양 상청액을 그러한 항체에 대해 스크리닝하여 확인한다.
목적하는 항원의 종류에 따라서, 생체내 면역화를 위해 각종 숙주 동물을 사용할 수 있다. 관심 항원의 내인성 형태 그 자체를 발현하는 숙주를 사용할 수 있다. 대안적으로, 관심 항원의 내인성 형태가 결여된 숙주를 사용할 수 있다. 예를 들어, 상응하는 내인성 유전자에서 상동성 재조합을 통해 특정 내인성 단백질을 결핍시킨 마우스(즉, 넉아웃 마우스)는, 면역화에 사용된 단백질에 대한 체액 반응을 형성하고, 따라서 그 단백질에 대한 친화력 모노클로날 항체의 생성을 위해 사용할 수 있는 것으로 확인된 바 있다(예컨대, Roes, J. et al. (1995) J. Immunol. Methods 183:231-237; Lunn, M. P. et al. (2000) J. Neurochem. 75:404-412).
복수의 인간 이외의 포유류는 본 발명의 올리고머 또는 이의 유도체에 대한 비인간 항체를 생성하기 위한 항체 생성용으로 적당한 숙주이다. 이들 숙주는 마우스, 래트, 닭, 카멜리드, 토끼 및 염소(와 이의 넉아웃 형태)를 포함하지만, 하이브리도마 생성을 위해서는 마우스가 바람직하다. 또한, 인간 항체 레퍼토리를 발현하는 비인간 숙주 동물은, 이중 특이성을 갖는 인간 항원에 대한 실질적인 인간 항체를 생성하는 데 사용할 수 있다. 이러한 종류의 비인간 동물은 인간 면역글로불린 이식유전자(transgene)를 보유하는 트랜스게닉 동물(예, 마우스)(키메라 hu-PBMC SCID 마우스) 및 하기에 더욱 상세하게 개시된 인간/마우스 방사선 조사 키메라를 포함한다.
일 구체예에 따르면, 본 발명의 올리고머 또는 이의 유도체로 면역화시킨 동물은, 인간 면역글로불린 유전자로 인하여 상기 비인간 포유류가 항원 자극시 인간 항체를 생성하도록 트랜스게닉된 비인간 포유류, 바람직하게는 마우스이다. 통상적으로, 인간 배선 구성을 갖는 중쇄 및 경쇄에 대한 면역글로불린 이식유전자를, 내인성 중쇄 및 경쇄 좌가 비활성이 되도록 변형된 동물에게 도입한다. 그러한 동물을 항원(에, 인간 항원)으로 자극하는 경우, 인간 면역글로불린 서열(인간 항체)로부터 유도된 항체가 생성된다. 표준화된 하이브리도마 기법에 의해 상기 동물의 림프구로부터 인간 모노클로날 항체를 제조할 수 있다. 인간 면역글로불린을 갖는 트랜스게닉 마우스와 인간 항체의 생성에 있어서의 이의 용도에 대해서는, 예컨대 US 5,939,598, WO 96/33735, WO 96/34096, WO 98/24893 및 WO 99/53049 (Abgenix Inc.), 및 US 5,545,806, US 5,569,825, US 5,625,126, US 5,633,425, US 5,661,016, US 5,770,429, US 5,814,318, US 5,877,397 및 WO 99/45962 (Genpharm Inc.); 또한, MacQuitty, J. J. and Kay, R. M. (1992) Science 257:1188; Taylor, L. D.et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:6287-6295; Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368:856-859; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Int Rev. Immunol. 13:65-93; Harding, F. A. and Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546; Fishwild, D. M. et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851; Mendez, M. J. et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156; Green, L. L. and Jakobovits, A. (1998) J. Exp. Med. 188:483-495; Green, L. L. (1999) J. Immunol. Methods 231:11-23; Yang, X. D. et al. (1999) J. Leukoc. Biol. 66:401-410; Gallo, M. L. et al. (2000) Eur. J. Immunol. 30:534-540 참조.
또 다른 구체예에 따르면, 본 발명의 올리고머 또는 이의 유도체로 면역화시킨 동물은 말초 혈액 단핵 세포 또는 림프양 세포 또는 이의 전구체로 재구성한 중증 복합 면역결핍(SCID)을 갖는 마우스일 수 있다. 키메라 hu-PMBC SCID 마우스로서 언급되는 상기 마우스는, 입증된 바와 같이 항원 자극시 인간 면역글로불린 반응을 생성한다. 이들 마우스 및 항체를 생성하기 위한 이의 용도에 대한 추가의 설명은, 예를 들어 Leader, K. A. et al. (1992) Immunology 76:229-234; Bombil, F. et al. (1996) Immunobiol. 195:360-375; Murphy, W. J. et al. (1996) Semin. Immunol. 8:233-241; Herz, U. et al. (1997) Int. Arch. Allergy Immunol. 113:150-152; Albert, S. E. et al. (1997) J. Immunol. 159:1393-1403; Nguyen, H. et al. (1997) Microbiol. Immunol. 41:901-907; Arai, K. et al. (1998) J. Immunol. Methods 217:79-85; Yoshinari, K. and Arai, K. (1998) Hybridoma 17:41-45; Hutchins, W. A. et al. (1999) Hybridoma 18:121-129; Murphy, W. J. et al. (1999) Clin. Immunol. 90:22-27; Smithson, S.L. et al. (1999) Mol. Immunol. 36:113-124; Chamat, S.et al. (1999) J. Infect. Diseases 180:268-277; and Heard, C. et al. (1999) Molec. Med. 5:35-45 참조.
또 다른 구체예에 따르면, 본 발명의 올리고머 또는 이의 유도체로 면역화시킨 동물은, 치사량의 전신 방사선 조사로 처리하고, 중증 복합 면역결핍(SCID)이 있는 마우스로부터 얻은 골수 세포를 이용하여 방사선으로부터 보호한 다음, 기능적인 인간 림프구를 이식한 마우스이다. Trimera 시스템이라고도 하는 이러한 유형의 키메라를 사용하여, 표준화된 하이브리도마 기법을 사용하여 관심 항원으로 상기 마우스를 면역화시킨 다음 모노클로날 항체를 생성하여 인간 모노클로날 항체를 생성한다. 이들 마우스 및 항체를 생성하기 위한 이의 용도에 관한 추가의 설명은, 예컨대 Eren, R. et al. (1998) Immunology 93:154-161; Reisner, Y and Dagan, S. (1998) Trends Biotechnol. 16:242-246; Ilan, E. et al. (1999) Hepatology 29:553-562; and Bocher, W. O. et al. (1999) Immunology 96:634-641 참조.
시험관내 방법
면역화 및 선별로 본 발명의 항체를 생성하는 별법으로서, 본 발명의 올리고머 또는 이의 유도체로 재조합 조합 면역글로불린 라이브러리를 스크리닝하여 상기 올리고머 또는 이의 유도체에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 라이브러리 구성원을 분리함으로써, 본 발명의 항체를 동정 및 분리할 수 있다. 디스플레이 라이브러리를 생성 및 스크리닝하기 위한 키트는 시판된다(예, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, 카탈로그 번호 27-9400-01; 및 Stratagene SrufZAP(등록상표) Phage Display Kit, 카탈로그 번호 240612). 여러 구체예에서, 디스플레이 라이브러리는 scFv 라이브러리 또는 Fab 라이브러리이다. 재조합 항체 라이브러리를 스크리닝하기 위한 파지 디스플레이 방법이 적합하게 개시되어 있다. 항체 디스플레이 라이브러리를 형성 및 스크리닝하기에 특히 유리할 수 있는 방법 및 화합물의 예는, 예컨대 McCafferty et al. WO 92/01047, US 5,969,108 및 EP 589 877(특히 scFv 디스플레이를 개시함), Ladner et al. US 5,223,409, US 5,403,484, US 5,571,698, US 5,837,500 및 EP 436 597(예를 들어, pIII 융합체를 개시함); Dower et al. WO 91/17271, US 5,427,908, US 5,580,717 및 EP 527 839(특히 Fab 디스플레이를 개시함); Winter et al, 국제 공개 공보 WO 92/20791 및 EP 368,684(특히 면역글로불린 가변 도메인에 대한 서열의 클로닝을 개시함); Griffiths et al. US 5,885,793 및 EP 589 877(특히, 재조합 라이브러리를 사용한 인간 항원에 대한 인간 항체의 분리를 개시함); Gerrard et al. WO 92/09690 (특히, 파지 발현 기법을 개시함); Knappik et al. WO 97/08320(인간 재조합 항체 라이브러리 HuCal을 개시함); Salfeld et al. WO 97/29131 (특히, 인간 항원(인간 종양 괴사 인자 알파)에 대한 재조합 인간 항체의 생성과 재조합 항체의 시험관내 친화력 증가를 개시함), 및 Salfeld et al. 미국 가명세서 출원 60/126,603 및 이를 기초로 하는 특허 출원(마찬가지로 인간 항원(인간 인터루킨-12)에 대한 재조합 인간 항체의 생성과, 재조합 항체의 시험관내 친화력 증가를 개시함) 참조.
재조합 항체 라이브러리의 스크리닝의 추가 설명은 과학 문헌, 예컨대 Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clarkson et al (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982; McCafferty et al. Nature (1990) 348:552-554; 및 Knappik et al. (2000) J. Mol. Biol. 296:57-86 에서 찾아볼 수 있다.
박테리오파지 디스플레이 시스템을 사용한 별법으로서, 효모 세포 또는 박테리아 세포의 표면에서 재조합 항체 라이브러리를 발현시킬 수 있다. WO 99/36569는 효모 세포의 표면에서 발현된 라이브러리를 제조 및 스크리닝하는 방법을 개시한다. WO 98/49286은 박테리아 세포 표면에서 발현된 라이브러리를 제조 및 스크리닝하는 더욱 자세한 방법을 개시한다.
조합 라이브러리의 관심 항체가 확인되면, 표준 분자-생물 기법에 의해, 예컨대 라이브러리 스크리닝 과정에서 분리된 디스플레이 팩키지(예, 파지)로부터의 DNA의 PCR 증폭에 의해 상기 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA를 분리한다. PCR 프라이머를 제조하기 위해서 사용할 수 있는 경쇄 및 중쇄에 대한 유전자의 뉴클레오티드 서열은 당업자에게 공지되어 있다. 복수의 그러한 서열은, 예컨대 Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 및 인간 배선 VBASE의 서열 데이타베이스에 제시되어 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 부분은, 숙주 세포에서 경쇄 및 중쇄 면역글로불린에 대한 유전자를 재조합 발현시켜 제조할 수 있다. 항체를 재조합 발현하기 위해서, 상기 항체의 경쇄 및 중쇄 면역글로불린을 코딩하는 DNA 단편을 보유하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터로 숙주 세포를 형질감염시켜, 숙주 세포에서 경쇄 및 중쇄를 발현하고, 바람직하게는 상기 숙주 세포가 배양되는 배지로 분비시킨다. 이 배지로부터 항체를 분리할 수 있다. 항체의 중쇄 및 경쇄에 대한 유전자를 얻고, 그 유전자를 재조합 발현 벡터로 삽입하고, 상기 벡터를 숙주 세포로 도입하기 위해서 표준화된 재조합 DNA 방법을 사용한다. 이러한 종류의 방법은, 예컨대 Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds.), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N. Y., (1989), Ausubel, F. M. et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) 및 US 4,816,397(Boss et al.)에 개시되어 있다.
관심 항체의 VH 및 VL 단편을 코딩하는 DNA 단편이 얻어지면, 예컨대 가변부에 대한 유전자를 전길이 항체 쇄에 대한 유전자, Fab 단편에 대한 유전자 또는 scFv 유전자로 전환시키기 위해서 표준화된 재조합 DNA 기법를 사용하여 상기 DNA 단편을 추가로 조작할 수 있다. 이들 조작은 또 다른 단백질을 코딩하는 또 다른 DNA 단편, 예컨대 항체 불변부 또는 가요성 링커에 작동가능하게 VL- 또는 VH-코딩 DNA 단편을 연결하는 것을 포함한다. 용어 "작동가능하게 연결된"은 2개의 DNA 단편이 코딩하는 아미노산 서열이 프레임 내에 남게 되는 방식으로 2개의 DNA 단편을 상호 연결시키는 것을 의미하는 것으로 이해된다.
VH 영역을 코딩하는 분리된 DNA는, 중쇄 불변부(CH1, CH2 및 CH3)를 코딩하는 또 다른 DNA 분자와 VH-영역 코딩 DNA를 작동가능하게 연결하여 전길이 중쇄에 대한 유전자로 전환시킬 수 있다. 인간 중쇄 불변부 유전자의 서열은 공지되어 있으며(예컨대, Kabat, E. A., et al (1991) Sequences of Proteins of Immunological lnterest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), 상기 영역에 걸쳐있는 DNA 단편은 표준화된 PCR 증폭으로 얻을 수 있다. 중쇄 불변부는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM, 또는 IgD로부터 유래한 불변부일 수 있으며, IgG1 또는 IgG4로부터의 불변부가 바람직하다. 중쇄 Fab 단편에 대한 유전자를 얻기 위해서, VH-코딩 DNA를 중쇄 불변부 CH1만을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결할 수 있다.
경쇄 불변부 CL을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 VL-코딩 DNA를 작동가능하게 연결하여 VL 영역을 코딩하는 분리된 DNA를 전길이 경쇄에 대한 유전자(및 Fab 경쇄에 대한 유전자)로 전환시킬 수 있다. 인간 경쇄 불변부의 유전자 서열은 공지되어 있으며(예컨대 Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), 상기 영역에 걸쳐있는 DNA 단편은 표준화된 PCR 증폭으로 얻을 수 있다. 경쇄 불변부는 카파 불변부 또는 람다 불변부이며, 카파 불변부가 바람직하다.
scFv 유전자를 형성하기 위해서, VH- 및 VL-코딩 DNA 단편을 가요성 링커를 코딩하는 또 다른 단편, 예컨대 아미노산 서열 (Gly4-Ser)3 에 작동가능하게 연결하여, VH 및 VL 서열을 연속 단일쇄 단백질로서 발현시키며, VL 및 VH 영역은 상기 가요성 링커를 통해 상호 연결된다(Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Nail. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554 참조).
본 발명의 올리고머 또는 이의 유도체에 대한 특이성을 갖는 단일 도메인 VH 및 VL을 상기 개시된 방법으로 단일 도메인 라이브러리로부터 분리할 수 있다. 본 발명의 올리고머 또는 이의 유도체를 신체로부터 제거하기 위해서는 목적하는 특이성을 갖는 2개의 VH 단일 도메인 쇄(CH1의 존재 또는 부재) 또는 2개의 VL 쇄, 또는 하나의 VH쇄와 하나의 VL쇄의 쌍을 이용할 수 있다.
본 발명의 재조합 항체 또는 항체 부분을 발현하기 위해서, 부분 또는 전길이 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA를, 전사 및 번역 조절 서열에 유전자가 작동가능하게 결합되도록 발현 벡터에 삽입할 수 있다. 본 명세서에서, "작동가능하게 결합된"은, 벡터 내의 전사 및 번역 조절 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 목적하는 기능을 만족하는 방식으로 항체 유전자가 벡터 내에 결찰되는 것을 의미하는 것으로 이해된다.
발현 벡터 및 발현 조절 서열은, 사용된 발현 숙주 세포와 적합하도록 선택한다. 항체 경쇄에 대한 유전자 및 항체 중쇄에 대한 유전자를 별도의 벡터에 삽입하거나, 또는 양 유전자를 동일한 발현 벡터에 삽입하는 데, 이것이 일반적인 경우이다. 표준화된 방법으로 발현 벡터에 항체 유전자를 삽입한다(예를 들어, 제한 개열 부위가 존재하지 않는 경우, 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보성 제한 개열 부위의 결찰, 또는 평활 말단의 결찰). 발현 벡터는 경쇄 및 중쇄에 대한 서열을 삽입하기 전에 이미 항체 불변부에 대한 서열을 보유할 수 있다. 예를 들어, 한가지 방법은 VH 및 VL 서열을, 각각 중쇄 및 경쇄를 이미 코딩하는 발현 벡터로 삽입하고, 벡터 내에서 CH 분절(들)에 VH 분절을 작동가능하게 연결하고, 벡터 내에서 CL 분절에 VL 분절을 작동가능하게 연결하여 전길이 항체 유전자로 전환시킬 수 있다. 병행하여 또는 대안적으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 항체쇄의 분비를 촉진하는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 상기 항체쇄에 대한 유전자를 벡터 내로 클로닝하여, 항체 쇄에 대한 유전자의 N 말단에 프레임 내에서 신호 펩티드를 연결시킬 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종성 신호 펩티드(즉, 비면역글로불린 단백질로부터의 신호 펩티드)일 수 있다. 항체쇄에 대한 유전자 외에, 본 발명의 발현 벡터는 숙주 세포에서 항체쇄에 대한 유전자의 발현을 조절하는 조절 서열을 가질 수 있다. 용어 "조절 서열"은 프로모터, 인핸서, 및 항체쇄에 대한 유전자의 전사 또는 번역을 조절하는 추가의 발현 조절 성분(예, 폴리아데닐화 신호)을 포함하는 것이다. 이러한 종류의 조절 서열은, 예컨대 Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)에 개시되어 있다. 당업자라면 조절 서열의 선택을 포함하는 발현 벡터 디자인이 형질전환할 숙주 세포의 선택, 목적하는 단백질의 발현 강도 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있음을 알 것이다. 포유류 숙주 세포에서 발현을 위한 바람직한 조절 서열은 포유류 세포에서 강력하게 단백질을 발현시키는 바이러스 성분, 예컨대 시토메갈로바이러스(CMV)(예, CMV 프로모터/인핸서), 시미안 바이러스 40(SV40)(예, SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스(예, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(AdMLP)) 및 폴리오마로부터 유도된 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 바이러스 조절 성분 및 이의 서열에 대한 추가의 설명에 대해서는, 예컨대 US 5,168,062(Stinski), US 4,510,245(Bell 등) 및 US 4,968,615(Schaffner 등) 참조.
항체 사슬 및 조절 서열에 대한 유전자 이외에도, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포 내에서 벡터의 복제를 조절하는 서열(예, 복제 기점) 및 선별 마커 유전자와 같은 추가 서열을 가질 수 있다. 선별 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선별을 용이하게 한다(참고 문헌의 예: Axel 등의 미국 특허 제4,399,216호, 제4,634,665호 및 제5,179,017호). 예를 들어, 선별 마커 유전자가 벡터가 삽입된 숙주 세포를 G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 내성이 되도록 하는 것은 주지의 기술이다. 바람직한 선별 마커 유전자는 디히드로폴레이트 리덕타제(DHFR)에 대한 유전자(메토트렉세이트 선별/증폭과 함께 dhfr- 숙주 세포에 사용됨) 및 neo 유전자(G418 선별에 사용됨)를 포함한다.
경쇄 및 중쇄의 발현을 위해서는, 상기 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 발현 벡터(들)를 표준화된 기법에 의해 숙주 세포로 형질감염시킨다. "형질감염(transfection)"이란 용어의 다양한 형태가 원핵 또는 진핵 숙주 세포로 외인성 DNA를 도입하기 위해 통상적으로 이용되는 다수의 기법, 예를 들어 전기천공법, 인산칼슘 침전법, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포함하는 것으로 사용된다. 이론적으로는 본 발명의 항체를 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 발현시키는 것이 가능하지만, 진핵 세포, 특히 포유류 숙주 세포에서 항체를 발현시키는 것이 바람직한데, 그 이유는 정확하게 폴딩되고 면역학적 활성이 있는 항체가 어셈블링되어 분비될 가능성이 원핵 세포에서보다 그러한 진핵 세포, 특히 포유류 세포에서 더 높기 때문이다. 항체 유전자의 원핵 세포 발현은 고수율의 유효 항체 생산에 비효과적인 것으로 보고되어 있다(Boss, M.A. and Wood, C.R.(1985) Immunology Today 6:12-13).
본 발명의 재조합 항체를 발현시키기 위한 바람직한 포유류 숙주 세포는 CHO 세포(문헌[Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220]에 기재된 dhfr- CHO 세포를 포함함, 이 세포는, 예를 들어 문헌[R.J. Kaufman and P.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621]에 기재된 바와 같이 DHFR-선별 마커와 함께 사용됨), NS0 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 항체 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터를 포유류 숙주 세포로 도입할 경우, 항체가 상기 숙주 세포에서 발현될 때까지 또는 바람직하게는 항체가 숙주 세포가 생장하는 배양 배지로 분비될 때까지 상기 숙주 세포를 배양하여 생산한다. 항체는 표준화된 단백질 정제 방법을 이용하여 배양 배지로부터 분리할 수 있다.
완전한(intact) 항체의 일부분, 예컨대 Fab 단편 또는 scFv 분자를 생성하기위해 숙주 세포를 사용하는 것 역시 가능하다. 전술한 방법의 변형법 역시 본 발명에 포함된다. 예를 들어, 본 발명 항체의 경쇄 또는 중쇄(단, 둘 다는 아님)를 코딩하는 DNA로 숙주 세포를 형질감염시키는 것이 바람직할 수 있다. 관심있는 항원의 결합에 필요하지 않은 경쇄 또는 중쇄가 존재한다면, 그러한 경쇄 또는 그러한 중쇄 또는 둘 다를 코딩하는 DNA를 재조합 DNA 기법에 의해 부분적으로 또는 완전히 제거할 수 있다. 그러한 절두형 DNA 분자에 의해 발현된 분자들 역시 본 발명 항체에 포함된다. 또한, 표준화된 화학적 방법에 의해 본 발명의 항체를 제2의 항체에 가교시켜, 한 중쇄 및 한 경쇄는 본 발명의 항체이고 나머지 중쇄 및 나머지 경쇄는 관심있는 항원과는 상이한 항원에 대한 특이성을 보유하는 이중 특이적 항체를 생성하는 것도 가능하다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 재조합 발현을 위한 바람직한 시스템에서, 항체 중쇄 및 항체 경쇄 둘 다를 코딩하는 재조합 발현 벡터는 인산칼슘 매개 형질감염에 의해 dhfr- CHO 세포에 도입한다. 재조합 발현 벡터 내에서, 중쇄 및 경쇄 항체 사슬에 대한 유전자는 각각 상기 유전자의 활발한 전사가 이루어지도록 조절성 CMV 인핸서/AdMLP-프로모터 요소에 기능적으로 연결된다. 재조합 발현 벡터는 또한 메토트렉세이트 선별/증폭을 이용함으로써 벡터로 형질감염시킨 CHO 세포를 선별하기 위해 사용될 수 있는 DHFR 유전자를 보유한다. 중쇄 및 경쇄가 발현되도록 선별된 형질감염 숙주 세포를 배양하고, 완전한 항체를 그 배양 배지로부터 분리한다. 표준화된 분자생물학 기법을 이용하여 재조합 발현 벡터를 제조하고, 숙주 세포를 형질감염시키고, 형질전환체를 선별하고, 상기 숙주 세포를 배양하고, 배양 배지로부터 항체를 수득한다. 따라서 본 발명은 본 발명 재조합 항체가 합성될 때까지 적절한 배양 배지에서 본 발명의 숙주 세포를 배양함으로써 본 발명의 재조합 항체를 합성하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 상기 배양 배지로부터 상기 재조합 항체를 분리하는 것을 더 포함할 수 있다.
파지 디스플레이에 의한 재조합 항체 라이브러리의 스크리닝의 대안으로서, 본 발명의 항체를 동정하기 위해 대형 조합 라이브러리를 스크리닝하는 데 당분야에 공지된 다른 방법을 이용할 수 있다. 대안의 발현 시스템의 한 가지 유형에서는, 재조합 항체 라이브러리는 Szostak 및 Roberts의 WO 98/31700 및 Roberts, R.W. 및 Szostak, J.W.의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12297-12302 (1997)]에 기재된 바와 같이 RNA-단백질 융합체의 형태로 발현된다. 이 시스템에서, 그 3' 말단에 펩티딜 수용체 항생제인 퓨로마이신을 보유하는 합성 mRNA의 시험관내 번역은 mRNA와 이것에 의해 코딩되는 펩티드 또는 단백질의 공유결합 융합체를 생성시킨다. 따라서 mRNA의 복합 혼합물(예, 조합 라이브러리)의 특정한 mRNA는 (예를 들어, 항체 또는 이의 일부분의) 코딩된 펩티드 또는 단백질의 특성, 예컨대 본 발명 올리고머 또는 이의 유도체에 대한 상기 항체 또는 이의 일부분의 결합능에 기초하여 농축시킬 수 있다. 항체 또는 이의 일부분을 코딩하고 상기한 라이브러리의 스크리닝에 의해 얻어지는 핵산 서열은 전술한 방식으로(예를 들어 포유류 숙주 세포에서) 재조합 방법에 의해 발현시킬 수 있으며, 또한 추가 순회로 mRNA-펩티드 융합체를 스크리닝하여 최초에 선택된 서열(들)에 돌연변이를 도입하거나 또는 전술한 방식으로 재조합 항체를 시험관내 친화력 성숙을 위한 다른 방법을 이용하여 친화력을 추가로 성숙시킬 수 있다.
생체내 방법과 시험관내 방법의 조합법
본 발명의 항체는 또한 본 발명의 올리고머 또는 이의 유도체가, 먼저 올리고머- 또는 유도체-결합성 항체의 생산을 자극하기 위해 숙주 동물 생체내에서 항체 레퍼토리(repertoire)에 작용하도록 한 다음, 그 후 하나 이상의 시험관내 기법에 의해 항체 선택 및/또는 항체 성숙(즉, 최적화)이 일어나도록 하는 방법과 같은 생체내 및 시험관내 방법의 조합법을 이용하여 생산할 수도 있다. 한 구체예에 따르면, 이러한 유형의 조합법은 먼저 인간 이외의 동물(예, 마우스, 래트, 토끼, 닭, 카멜리드(camelid), 염소 또는 이들의 형질전환 동물 또는 키메라 마우스)을 본 발명의 상기 올리고머 또는 이의 유도체로 면역화하여 그 항원에 대한 항체 반응을 자극하는 단계, 그 후 상기 올리고머 또는 유도체의 작용에 의해 생체내에서 자극된 림프구의 면역글로불린 서열을 사용함으로써 파지 디스플레이 항체를 제조하고 스크리닝하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 조합법의 제1 단계는 생체내 방법과 관련하여 전술한 방식으로 수행할 수 있는 한편, 이 조합법의 제2 단계는 시험관내 방법과 관련하여 전술한 방식으로 수행할 수 있다. 인간 이외의 동물을 과면역화하고 이어서 상기 자극된 림프구로부터 제조된 파지 디스플레이 라이브러리를 시험관내 스크리닝하는 바람직한 방법에 대해서는 BioSite Inc.의 특허 출원들, 예를 들어 WO 98/47343, WO 91/17271, US 5,427,908 및 US 5,580,717에 기재된 방법들을 참조할 수 있다.
또 다른 구체예에 따르면, 조합법은 먼저, 인간 이외의 동물(예, 마우스, 래트, 토끼, 닭, 카멜리드, 염소 또는 이들의 넉아웃 및/또는 형질전환 동물, 또는 키메라 마우스)을 본 발명의 올리고머 또는 이의 유도체로 면역화하여 상기 올리고머 또는 이의 유도체에 대한 항체 반응을 자극하는 단계 및 (예를 들어 면역화된 동물로부터 제조된) 하이브리도마를 스크리닝함으로써 원하는 특이성을 갖는 항체를 생산하는 림프구를 선별하는 단계를 포함한다. 항체 또는 단일 도메인 항체에 대한 유전자는 (역전사 효소 폴리머라제 연쇄 반응과 같은 표준화된 클로닝 방법에 의해) 선택된 클론으로부터 분리하여 시험관내에서 친화력을 성숙시킴으로써 선택된 항체(들)의 결합 특성을 향상시킨다. 이러한 방법의 제1 단계는 생체내 방법과 관련하여 전술한 방식으로 수행할 수 있는 한편, 이러한 방법의 제2 단계는 시험관내 방법과 관련하여 전술한 방식으로, 특히 WO 97/29131 및 WO 00/56772에 기재된 방법과 같은 시험관내 친화력 성숙 방법을 이용하여 수행할 수 있다.
또 다른 조합법에서, 재조합 항체는 림프구 자체를 불멸화 시키는 방법(SLAM; Selected Lymphocyte Antibody Method)으로 당분야에 알려져 있고 US 5,627,052, WO 92/02551 및 Babcock, J.S. 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848 (1996)]에 기재되어 있는 방법을 이용하여 분리된 개별 림프구로부터 생성한다. 이 방법에서는, 먼저, 인간 이외의 동물(예, 마우스, 래트, 토끼, 닭, 카멜리드, 염소 또는 이들의 형질전환 동물, 또는 키메라 마우스)을 본 발명의 올리고머 또는 이의 유도체로 생체내 면역화하여 상기 올리고머 또는 유도체에 대한 면역 반응을 자극하고, 그 후 항원 특이적 용혈 플라크 분석을 이용하여 관심있는 항체를 분비하는 개별 세포들을 선별한다. 이를 위해, 올리고머 또는 이의 유도체 또는 구조적으로 관련된 관심있는 분자들을 비오틴과 같은 링커를 사용하여 양 적혈구에 커플링함으로써, 용혈 플라크 분석을 이용하여 적절한 특이성을 갖는 항체를 분비하는 개별 세포들을 확인할 수 있다. 관심있는 항체를 분비하는 세포를 확인한 후에, 경쇄 및 중쇄의 가변 영역에 대한 cDNA를 역전사 효소 PCR에 의해 세포로부터 얻고, 그 후 상기 가변 영역은 적합한 면역글로불린 불변 영역(예, 인간 불변 영역)과 회합된 상태로 포유류 숙주 세포(예, COS 또는 CHO 세포)에서 발현시킬 수 있다. 그 후 생체내 선택된 림프구로부터 유도된 증폭된 면역글로불린 서열로 형질감염시킨 숙주 세포는, 예를 들어 원하는 특이성을 갖는 항체를 발현하는 세포를 분리하기 위해, 형질감염된 세포를 증폭시킴으로써 추가의 시험관내 분석 및 시험관내 선별에 적용할 수 있다. 증폭된 면역글로불린 서열은 시험관내에서 추가 조작할 수 있다.
전술한 방법과 유사하게, 본 발명의 올리고머 또는 이의 유도체 및 구조적으로 관련된 합성 분자에 대한 특이성을 갖는 항체를 제조할 수도 있다. 이 방법은
i) 본 발명의 올리고머 또는 이의 유도체와 구조적으로 관련된 합성 분자가 공유하는 구조적 특징을 포함하는 항원을 제공하는 단계;
ii) 상기 항원에 항체 레퍼토리를 노출시키는 단계; 및
iii) 상기 레퍼토리로부터 구조적으로 관련된 두 분자에 결합하는 항체를 선별하여 원하는 특이성을 갖는 항체를 얻는 단계
를 포함한다.
본 발명은 상기 방법에 의해 얻을 수 있는 올리고머 특이 항체뿐 아니라 아밀로이드 β-관련 치매성 질환 치료용 약제의 제조 또는 아밀로이드 β-관련 치매성 질환 진단용 조성물의 제조에 사용되는 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따라 얻을 수 있는 항체는 특히 상기 방법에 의해 얻을 수 있는 항혈청을 포함한다. 상기 항혈청은 전혈청, 즉 세포 성분 및 응고성 성분을 제거한 후 숙주로부터 얻어지는 혈액, 또는 특히 농축된 면역글로불린 분획과 바람직하게는 농축된 올리고머 인식 면역글로불린 분획을 함유하는 상기 혈청의 분획일 수 있다. 이러한 종류의 분획은 항체 정제법과 관련하여 전술한 방법을 이용하여 얻을 수 있다.
본 발명의 항혈청은 폴리클로날로서, 즉 이는 일반적으로 상이한 클래스 및 서브클래스의 상이한 특이성을 갖는 항체들을 포함하며, 일반적으로 모든 L-사슬 동형체가 나타나고 다수의 단백질 에피토프가 인식된다.
본 발명의 다양한 올리고머를 면역원으로서 사용할 경우, 본 발명의 항혈청은 일반적으로 교차 반응성이다.
또 다른 양태에 따르면, 본 발명에 따라 얻을 수 있는 항체는 모노클로날 항체, 특히 키메라 및 인간화된 항체와 이의 올리고머 결합성 단편도 포함한다.
본 발명은 본 발명의 올리고머 또는 이의 유도체에 결합하는 단백질, 특히 항체, 즉 본 발명의 올리고머 또는 이의 유도체에 대한 특이성을 갖는 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 단백질 또는 항체의 일부분, 특히 이의 항원 결합성 부분, 즉 본 발명 올리고머 또는 이의 유도체에 결합성인 단백질 또는 항체 부분에 관한 것이다.
본 발명의 항체는 본 발명 올리고머 또는 이의 유도체에 대한 특이적 결합성에 대하여 특정 결합 역학(예, 고친화력, 저해리성, 저이탈속도, 강한 중화 활성)을 갖도록 선택하는 것이 바람직하다.
따라서 본 발명 올리고머 또는 이의 유도체에 대한 친화력이 KD = 1O-6∼10-12 M 범위인 단백질, 특히 항체가 바람직하다. 고친화력 단백질, 특히 결합 친화력이 Kd = 10-8 M 이상인 항체, Kd = 10-9 M 이상인 항체, Kd = 10-1O M 이상인 항체 또는 Kd = 10-11 M 이상인 항체가 특히 바람직하다.
또 다른 양태에 따르면, 비교적 낮은 친화력을 갖는, 특히 Kd = 10-8 M 미만의 친화력을 갖는 다른 Aβ(1-42) 형태, 특히 단량체 Aβ(1-42) 단백질 및/또는 단량체 Aβ(1-40) 단백질에 결합하는 단백질, 특히 항체가 바람직하다.
따라서, 단량체 Aβ(1-42) 단백질 및/또는 단량체 Aβ(1-40) 단백질보다 높은 친화력으로 올리고머 또는 이의 유도체에 결합하는 단백질, 특히 항체가 특히 바람직하다. 친화력 비가 10, 100 또는 1000인 것이 특히 바람직하다.
또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 항체는 0.1 s-1 이하의 koff 속도 상수로 올리고머 또는 이의 유도체에 결합하도록 선택할 수 있다. 속도 상수 koff는 1 x 10-2 s-1 이하, 1 x 10-3 s-1 이하, 1 x 10-4 s-1 이하, 또는 1 x 10-5 s-1 이하로, 뒤쪽으로 갈수록 더 바람직하다.
또한, 본 발명의 항체는 1 x 10-6 M 이하의 IC50으로 본 발명 올리고머 또는 이의 유도체의 활성, 특히 신경독성 활성을 억제하도록 선택할 수 있다. 억제 상수 IC50은 1 x 10-7 M 이하, 1 x 10-8 M 이하, 1 x 10-9 M 이하, 1 x 10-10 M 이하, 또는 1 x 10-11 M 이하로, 뒤쪽으로 갈수록 더 바람직하다.
항체는 분리된 항체인 것이 바람직하다. 또 다른 양태에 따르면, 항체는 중화 항체이다. 본 발명의 항체는 모노클로날 항체와 재조합 항체를 포함한다. 다수의 구체예에 따르면, 이 항체는 인간 항체 또는 마우스 항체와 같이 전적으로 단일종으로부터 유도된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 다른 구체예에 따르면, 항체는 키메라 항체 또는 CDR 그래프트 항체 또는 인간화된 항체의 또 다른 형태일 수 있다.
"항체"란 용어는 4개의 폴리펩티드 사슬, 즉 2개의 중쇄(H쇄) 및 2개의 경쇄(L쇄)로 이루어진 면역글로불린 분자를 지칭한다. 이 사슬은 일반적으로 이황화 결합에 의해 서로 연결된다. 각 중쇄는 상기 중쇄의 가변 영역(본원에서 HCVR 또는 VH로 약칭됨) 및 상기 중쇄의 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3로 구성된다. 각 경쇄는 상기 경쇄의 가변 영역(본원에서 LCVR 또는 VL로 약칭됨) 및 상기 경쇄의 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 CL 도메인으로 구성된다. VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역(CDR)이라 불리는 초가변 영역으로 더 세분될 수 있으며, 골격 영역(FR)이라 불리는 보존 영역에 산재될 수 있다. 각 VH 및 VL 영역은 다음과 같은 순서로 N 말단에서 C 말단으로 배열된 3개의 CDR과 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
항체의 "항원 결합 부분" (또는 간략히 "항체 부분")이란 용어는 본 발명 올리고머 또는 이의 유도체에 대한 특이성을 갖는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭하며, 상기 단편(들)은 여전히 상기 올리고머 또는 이의 유도체에 특이적으로 결합할 수 있다. 완전한 항체의 단편은 항체의 항원 결합 기능을 수행할 수 있는 것으로 확인되었다. 항체의 "항원 결합 부분"이란 용어에 따르면, 결합 단편의 예는 (i) Fab 단편, 즉 VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편, 즉 이황화 결합에 의해 힌지 영역 내에서 서로 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 한쪽 팔의 FL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) VH 도메인 또는 VH, CH1, CH2, DH3, 또는 VH, CH2, CH3로 이루어진 dAb 단편(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 분리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. Fv 단편의 2개의 도메인, 즉 VL 및 VH는 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 추가로 합성 링커 및 재조합 방법을 이용하여 서로 연결하여, 이들을 VL 및 VH 영역이 결합된 단일 단백질 사슬로서 제조하여 1가 분자[단일쇄 Fv(ScFv)로서 알려짐, 참조: Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883]를 형성하도록 할 수 있다. 항체의 "항원 결합 부분"이란 용어는 또한 그러한 단일쇄 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 단일쇄 항체의 다른 형태, 예컨대 "다이아바디(diabody)" 역시 여기에 포함된다. 다이아바디는 두 도메인이 동일 사슬 상에서 회합될 수 있기에는 너무 짧은 링커를 사용하여 VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩티드 사슬 상에서 발현되도록 함으로써 상기 도메인들이 다른 사슬의 상보성 도메인과 쌍을 이루고 2개의 항원 결합 부위를 형성하도록 한, 2가의 이중 특이적 항체이다(참고 문헌의 예: Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poijak, R.J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123).
또한, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 상기 항체 또는 항체 일부분과 하나 이상의 추가 단백질 또는 펩티드와의 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 형성된 더 큰 면역부착 분자의 일부일 수 있다. 4량체 scFv 분자를 제조하기 위해 스트렙타빈 코어 영역을 사용하는 것(Kipriyanov, S.M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) 및 2가 및 비오틴화 scFv 분자를 생성하기 위해 시스테인 잔기, 마커 펩티드 및 C-말단 폴리히스티딘 태그를 사용하는 것(Kipriyanov, S.M. et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058)이 그러한 면역부착 분자에 적절하다. Fab 및 F(ab')2 단편과 같은 항체 부분은 파파인 또는 펩신에 의한 분해와 같은 통상적인 기법을 이용하여 전체 항체로부터 생성할 수 있다. 또한, 항체, 항체 일부분 및 면역부착 분자는 표준화된 재조합 DNA 기법을 이용하여 얻을 수 있다. "본 발명 올리고머 또는 이의 유도체에 대한 특이성을 갖는 분리된 항체"란 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는, 본 발명 올리고머 또는 이의 유도체에 특이성을 갖는 항체, 즉 특히 전술한 바와 같이 Aβ(1-42) 단백질의 다른 형태에 특이적으로 결합하는 항체가 없는 항체를 의미한다.
"중화 항체"란 용어는 특정 항원에 대한 결합이 상기 항원의 생물학적 활성의 억제를 초래하는 항체를 의미한다. 항원의 생물학적 활성의 상기한 억제는 적절한 시험관내 또는 생체내 분석을 이용하여 항원의 상기 생물학적 활성에 대한 하나 이상의 지시 인자를 측정함으로써 평가할 수 있다.
"모노클로날 항체"는 하이브리도마로부터 유도된 항체(예를 들어, Kohler 및 Milstein에 따른 표준화된 하이브리도마 방법과 같은 하이브리도마 기법에 의해 제조된 하이브리도마에 의해 분비되는 항체)를 의미한다. 따라서 하이브리도마로부터 유도되고 본 발명 올리고머 또는 이의 유도체에 대해 특이성을 갖는 항체를 모노클로날 항체로 칭한다.
"재조합 항체"란 용어는 재조합 방법에 의해 생산, 발현, 생성 또는 분리된 항체로서, 예를 들어 숙주 세포로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체; 재조합 조합 항체 라이브러리로부터 분리된 항체; 인간 면역글로불린 유전자로 인하여 형질전환된 동물(예, 마우스)로부터 분리된 항체(참고 문헌의 예: Taylor, L.D. et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295); 또는 특정한 면역글로불린 유전자 서열(예컨대 인간 면역글로불린 유전자 서열)을 다른 DNA 서열과 어셈블링하는 임의의 다른 방식으로 생산, 발현, 생성 또는 분리된 항체를 의미한다. 재조합 항체는, 예를 들어 키메라 항체, CDR 그래프트 항체 및 인간화된 항체를 포함한다.
"인간 항체"란 용어는 Kabat 등의 문헌[Kabat 등 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]에 기재된 바와 같이, 그 가변 및 불변 영역이 인간 생식 세포의 면역글로불린 서열에 해당하거나 이로부터 유도된 항체를 의미한다. 그러나, 본 발명의 인간 항체는, 예를 들어 CDR 내에. 특히 CDR3 내에 인간 생식 세포 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이 유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함한다. 본 발명의 재조합 인간 항체는 가변 영역을 보유하며 인간 생식 세포의 면역글로불린 서열로부터 유도된 불변 영역 또한 포함한다(참고 문헌의 예: Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). 그러나 특정 구체예에 따르면, 그러한 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이 유발(또는 인간 Ig 서열로 인해 형질전환된 동물이 사용된다면, 생체내 체세포 돌연변이 유발)에 적용하여, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열이, 인간 생식 세포의 VH 및 VL 서열과 관련되거나 이로부터 유도될지라도, 생체내에서는 인간 항체 생식 세포 레퍼토리 내에 자연 발생되지 않는 서열이 되도록 한다. 특정 구체예에 따르면, 이러한 유형의 재조합 항체는 선택적 돌연변이 유발 또는 역 돌연변이 또는 둘 다에 의한 것이다.
"역 돌연변이"란 용어는 인간 항체의 체세포 돌연변이된 아미노산의 일부 또는 전부를 동종 생식 세포 항체 서열의 상응하는 생식 세포 잔기로 치환시키는 것을 포함하는 방법을 의미한다. 본 발명의 인간 항체의 중쇄 및 경쇄에 대한 서열은 최고 상동성을 갖는 서열을 확인하기 위해 VBASE 데이터베이스 내의 생식 세포 서열과 개별적으로 비교한다. 본 발명 인간 항체 상의 임프린트(imprint)는 그러한 변이(deviating) 아미노산을 코딩하는 소정의 뉴클레오티드 위치를 돌연변시켜 생식 세포 서열로 복귀시킨다. 이러한 방식에 의해 확인된 각 아미노산의, 항원 결합을 위한 역 돌연변이의 후보로서의 중요성을 조사하여야 하며, 돌연변이 후 상기 인간 항체의 소정의 특성을 손상시키는 아미노산은 최종 인간 항체 내에 포함되어서는 안된다. 역 돌연변이에 대한 아미노산의 수를 가능한 한 적게 유지하려면, 가장 가까운 생식 세포 서열로부터 변이될지라도, 제2의 생식 세포 서열의 상응하는 아미노산 서열과 동일한 그러한 아미노산 위치가 변화되지 않고 남아 있을 수 있다. 다만, 상기 제2의 생식 세포 서열은 해당 아미노산의 양 측에서 적어도 10개, 바람직하게는 12개 아미노산이 본 발명의 인간 항체의 서열과 동일하거나 균등해야 한다. 역 돌연변이는 항체 최적화의 임의의 단계에서 수행할 수 있다.
"키메라 항체"란 용어는 한 종으로부터 유래된 중쇄 및 경쇄의 가변 영역에 대한 서열을 포함하나, VH 및/또는 VL의 CDR 영역 중 하나 이상의 서열이 또 다른 종의 CDR 서열로 치환된 항체, 예컨대 마우스 CDR 중 하나(예, CDR 3) 이상이 인간 CDR 서열로 치환된 마우스로부터 유래된 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 갖는 항체를 의미한다.
"인간화된 항체"란 인간 이외의 종(예, 마우스, 래트, 토끼, 닭, 카멜리드, 염소)로부터 유래된 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 서열을 포함하나, VH 및/또는 VL 서열의 적어도 일부분이 더욱 "인간과 같이" 되도록, 즉 인간 생식 세포의 가변 서열과 더 유사하도록 변경된 항체를 의미한다. 인간화된 항체의 한 가지 유형은 인간 CDR 서열이 인간 이외의 VH 및 VL 서열로 삽입되어 상응하는 인간 이외의 CDR 서열을 치환한 CDR 그래프트 항체이다.
항체의 결합 역학을 측정하는 한 가지 방법은 표면 플라즈몬 공명을 이용하는 방법이다. "표면 플라즈몬 공명"이란 바이오센서 매트릭스를 사용하여, 예를 들어 BIAcore 시스템(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ)을 사용하여 단백질 농도의 변화를 검출함으로써 이중 특이적 상호작용을 분석할 수 있는 광학 현상이다. 추가 설명을 위해서는, 문헌[Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; and Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277]을 참조할 수 있다.
"Koff"란 용어는 항체/항원 복합체로부터의 항체의 해리에 대한 이탈 속도(off rate) 상수를 의미한다.
"Kd"란 용어는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 의미한다.
본 발명 항체의 결합 친화력은 ELISA 또는 BIAcore 분석과 같은 표준화된 시험관내 면역분석을 이용하여 평가할 수 있다.
단백질은 항체 이외에도 T 세포 수용체 유래 분자 또는 T 세포 유래 수용체 도메인 또는 상기 수용체 도메인과 면역글로불린의 Fc 부분의 융합 단백질일 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 단백질, 특히 본 발명의 항체와, 임의로 약학적으로 적합한 담체를 함유하는 약학 제제(조성물)에 관한 것이다. 본 발명의 약학 조성물은 1종 이상의 추가 치료제, 예를 들어 본 발명의 항체가 경감시키는 데 유용한 질병의 치료를 위한 1종 이상의 추가 치료제를 더 함유할 수 있다. 예를 들어 본 발명의 항체가 본 발명의 올리고머에 결합한다면, 약학 조성물은 상기 올리고머의 활성이 중요한 질환의 치료에 유용한 1종 이상의 추가 치료제를 더 함유할 수 있다.
약학적으로 적합한 담체는 생리학적으로 화합성인 한, 임의의 용매, 분산매, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡착 지연제 등을 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 담체는, 예를 들어 물, 염수, 인산염 완충 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등과 이들의 조합을 포함한다. 많은 경우, 등장제, 예를 들어 자당, 다가 알콜, 예컨대 만니톨 또는 솔비톨, 또는 염화나트륨을 추가로 사용하는 것이 바람직하다. 약학적으로 적합한 담체는 항체의 반감기 또는 효능을 증가시키는, 습윤제 또는 유화제, 보존제 또는 완충제와 같은 비교적 소량의 보조 물질을 더 함유할 수 있다.
본 약학 조성물은, 예를 들어 비경구 투여에 적합할 수 있다. 이 때 항체는 항체 함량이 0.1∼250 mg/ml인 주사액으로서 제조하는 것이 바람직하다. 주사액은 액체 또는 동결건조형으로 제조될 수 있으며, 제형은 플린트 유리(flint glass) 또는 바이알, 앰풀 또는 충전된 주사기이다. 완충액은 L-히스티딘(1∼50 mM, 바람직하게는 5∼10 mM)을 함유할 수 있으며, pH는 5.0∼7.0, 바람직하게는 6.0이다. 그 밖의 적합한 완충액은, 비제한적으로, 숙신산나트륨, 시트르산나트륨, 인산나트륨 또는 인산칼륨 완충액을 포함한다. 염화나트륨은 0∼300 mM(액체 제형의 경우 바람직하게는 150 mM)의 농도가 되도록 용액의 등장성을 조정하기 위해 사용될 수 있다. 동결방지제, 예를 들어 수크로스(예, 0∼10%, 바람직하게는 0.5∼1.0%) 역시 동결건조 제형에 포함될 수 있다. 다른 적합한 동결방지제는 트레할로스 및 락토스이다. 충전제, 예를 들어 만니톨(예, 1∼10%, 바람직하게는 2∼4%) 역시 동결건조 제형에 포함될 수 있다. 안정화제, 예를 들어 L-메티오닌(예, 51∼50 mM, 바람직하게는 5∼10 mM)은 액체 제형과 동결건조 제형 둘 다에 사용될 수 있다. 그 밖의 적합한 충전제는 글리신 및 아르기닌이다. 계면활성제, 예를 들어 폴리솔베이트 80(예, 0∼0.05%, 바람직하게는 0.005∼0.01%) 역시 사용될 수 있다. 그 밖의 계면활성제로는 폴리솔베이트 20 및 BRIJ 계면활성제가 있다.
본 발명의 조성물은 다수의 형태를 포함할 수 있다. 이들은 액체, 반고체 및 고체 제형, 예컨대 액체 용액(예, 주사액 및 주입액), 분산물 또는 현탁액, 정제, 환제, 분말, 리포좀 및 좌약을 포함한다. 의도된 투여 형태 및 치료 용도에 따라 바람직한 형태가 달라진다. 통상적으로, 주사액 또는 주입액 형태의 조성물, 예를 들어 인간의 수동 면역화를 위한 다른 항체와 유사한 조성물을 사용하는 것이 바람직하다. 바람직한 투여 경로는 비경구(예를 들어, 정맥내, 피하, 복강내, 근육내)경로이다. 바람직한 구체예에 따르면, 항체는 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여한다. 또 다른 바람직한 구체예에 따르면, 항체는 근육내 또는 피하 주사에 의해 투여한다.
치료 조성물은 통상적으로 멸균시켜야 하며 제조 및 보관 조건 하에서 안정하여야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀션, 분산물, 리포좀 또는 고활성 물질 농도에 적합한 다른 정렬된 구조체로서 제형화될 수 있다. 멸균 주사액은 소요량의 활성 화합물(즉, 항체)을, 적절한 경우 필요에 따라 전술한 성분 중 하나 또는 조합물과 함께 적합한 용매로 도입하고, 그 후 상기 용액을 멸균 여과하여 제조할 수 있다. 분산물은 통상적으로 염기성 분산매와, 적절한 경우 다른 필요한 성분들을 함유하는 멸균 부형제로 활성 화합물을 도입하여 제조한다. 멸균 주사액을 제조하기 위한 멸균 동결건조 분말의 경우, 활성 성분, 및 적절한 경우 사전에 멸균 여과된 용액으로부터 추가의 원하는 성분들의 분말을 생산하는 진공 건조 및 분말 건조가 바람직한 제조 방법이다. 용액의 적당한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅제를 사용하거나, 분산물의 경우 필요한 입자 크기로 유지하거나 또는 계면활성제를 사용하여 유지할 수 있다. 주사 가능한 조성물의 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물에 추가로 도입하여 연장시킬 수 있다.
본 발명의 항체는 당분야에 공지된 여러 방법에 의해 투여할 수 있으나, 다수의 치료 분야에 바람직한 투여 유형은 피하 주사, 정맥내 주사 또는 주입이다. 당업자라면 투여 경로 및/또는 유형이 원하는 결과에 따라 달라진다는 것을 이해할 것이다. 특정한 구체예에 따르면, 활성 화합물은 화합물이 급속 방출되는 것을 방지하는 담체, 예를 들어 임플란트, 경피 플라스터 및 미소캡슐화 방출 시스템을 포함하는 제어 방출성 제형을 사용하여 제조할 수 있다. 생분해성이고 생체적합성인 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 이용될 수 있다. 그러한 제형을 제조하는 방법은 당분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조할 수 있다.
특정 구체예에 따르면, 본 발명의 항체는, 예를 들어 비활성 희석제 또는 동화성이고 식이성인 담체에 혼입시켜 경구 투여될 수 있다. 항체(및 필요에 따라 추가 성분)는 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐 내에 봉입되거나, 정제로 압축되거나 또는 식품에 직접 첨가될 수도 있다. 치료제의 경구 투여를 위해서는, 항체를 부형제와 혼합하여 삼킬 수 있는 정제, 협측 정제, 캡슐, 엘릭서, 현탁제, 시럽 등의 형태로 사용할 수 있다. 본 발명 항체를 비경구 경로 이외의 경로를 통해 투여하고자 한다면, 항체의 불활성화를 방지하는 물질로부터 코팅제를 선택할 필요가 있다.
본 발명의 항체는 바람직하게는 이 항체가 결합하는 본 발명 올리고머 또는 이의 유도체의 활성을 시험관내와 생체내 둘 다에서 중화할 수 있다. 따라서 상기 항체는, 예를 들어 본 발명 올리고머 또는 이의 유도체를 함유하는 세포 배양물에서 또는 상기 올리고머 또는 이의 유도체가 존재하는 인간 또는 다른 포유류에서 본 발명 올리고머 또는 이의 유도체의 활성을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 한 구체예에 따르면, 본 발명은 본 발명 항체가 올리고머 또는 이의 유도체에 작용하여 상기 올리고머 또는 이의 유도체의 활성을 억제하도록 하는 것을 포함하는, 상기 올리고머 또는 이의 유도체의 활성을 억제하는 방법에 관한 것이다. 상기 활성은, 예를 들어 시험관내에서 억제될 수 있다. 예를 들어, 본 발명 항체는 본 발명 올리고머 또는 이의 유도체를 포함하거나 포함하는 것으로 생각되는 세포 배양물에 첨가하여, 상기 배양물 중의 상기 올리고머 또는 이의 유도체의 활성을 억제할 수 있다. 대안으로, 올리고머 또는 이의 유도체의 활성은 개체의 생체내에서 억제할 수 있다.
따라서 본 발명은 또한 β 아밀로이드 단백질이 관여하고, 특히 본 발명의 상기 올리고머 또는 이의 유도체의 활성이 중요하게 작용하는 질환을 앓고 있는 개체에서 본 발명 올리고머 또는 이의 유도체의 활성을 억제하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 항체가 결합하는 올리고머 또는 이의 유도체의 활성을 억제할 목적으로 본 발명의 하나 이상의 항체를 개체에 투여하는 것을 포함한다. 상기 개체는 바람직하게는 인간이다. 본 발명의 항체는 인간 개체에 치료 목적으로 투여할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 수의학적인 목적으로 또는 특정 질환에 대한 동물 모델인 인간을 제외한 포유류에 투여할 수 있다. 상기한 동물 모델은 본 발명 항체의 치료 효능을 평가하는 데(예를 들어 투여량 및 투여 시간 과정을 테스트하는 데) 유용할 수 있다.
본 발명의 올리고머 또는 이의 유도체가 작용할 수 있는 질환으로는 구체적으로 그 발병 및/또는 진행이 본 발명의 올리고머 또는 이의 유도체와 관련되어 있는 질환을 포함한다. 여기에는 특히 본 발명 올리고머 또는 이의 유도체가 상기 질환의 병리생리학적 과정에 명백히 또는 가능성 있게 관여하거나 상기 질환의 발병 및/또는 진행에 기여하는 인자인 질환들을 포함한다. 따라서 본 발명 올리고머 또는 이의 유도체의 활성의 억제가 그 질환의 증상 및/또는 진행을 경감시킬 수 있는 질환들이 여기에 포함된다. 그러한 질환들은, 예를 들어 특정 질환을 앓고 있는 개체의 생물학적 유체 중의 본 발명 올리고머 또는 이의 유도체의 증가된 농도(예를 들어, 혈청, 혈장, CSF, 뇨 등에서의 증가된 농도)에 의해 확인할 수 있다. 이는, 예를 들어 본 발명 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 본 발명 올리고머 및 이의 유도체는 신경퇴행성 인자, 인지 결함, 신경독성 인자 및 염증성 인자가 관여하는 다수의 질환과 관련된 병리 과정에서 중요한 역할을 한다.
본 발명의 항체는 전술한 질환들의 치료에 유용한 1종 이상의 추가 치료제와 함께 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 일반적으로 치료 유효량 또는 예방 유효량의 하나 이상의 본 발명의 항체를 함유한다. 원하는 치료에 따라, 예를 들어 치료가 필요한지 예방이 필요한지에 따라 투약 계획을 선택하여 적용할 수 있다. 예를 들어, 치료 상황의 요구에 따라 단일 투여량, 시간에 따라 분포된 다중 개별 투여량 또는 점증 또는 점감 투여량을 투여할 수 있다. 투여를 용이하게 하고 투여량의 균일성을 확보하기 위해 비경구 조성물을 단일 제형으로 제형하는 것이 특히 유익하다.
치료 유효량 또는 예방 유효량의 본 발명 항체는, 예를 들어 0.1∼20 mg/kg, 바람직하게는 1∼10 mg/kg일 수 있으나 이에 국한되는 것은 아니다. 유효량은 경감시키고자 하는 병태의 유형 및 심각성에 따라 당연히 달라질 수 있다.
항체의 진단 용도의 관점에서, 특정 올리고머의 정성적 또는 정량적 측정은 특히 질병 관련 아밀로이드 β(1-42) 형태를 진단하는 역할을 한다. 이러한 측면에서, 특이성은 충분한 감도를 가지고 특정 올리고머 또는 올리고머 혼합물을 검출할 수 있는 가능성을 의미한다. 본 발명의 항체는 샘플 1 ml당 10 ng 미만, 바람직하게는 샘플 1 mg당 1 ng 미만, 특히 바람직하게는 샘플 1 ml당 100 pg 미만의 감도를 가지며, 이는 각각 나타낸, 샘플 1 ml당 올리고머 농도 이상, 유리하게는 더 낮은 농도도 본 발명 항체에 의해 검출될 수 있음을 의미한다.
상기 측정은 면역학적으로 수행한다. 이것은 기본적으로, 응집 반응 및 침전 기법, 면역분석, 면역조직학적 방법 및 면역블롯 기법, 예를 들어 웨스턴 블로팅 또는 도트 블롯 방법을 비롯하여 항체가 사용되는 임의의 분석적 또는 진단적 분석 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 생체내 방법, 예를 들어 영상화 방법 역시 여기에 포함된다.
면역분석에 사용하는 것이 유익하다. 경쟁적 분석, 즉 항원과 표지화된 항원(트레이서)이 항체 결합에 대해 경쟁하는 분석과, 샌드위치 분석, 즉 항원에 대한 특이적 항체의 결합은 제2의, 일반적으로 표지화된 항체에 의해 검출되는 분석 모두 적합하다. 이들 분석은 동종성(homogeneous), 즉 고체상과 액체상으로 분리되지 않는 분석, 또는 혼성(heterogeneous), 즉, 예를 들어 고체상 결합된 항체에 의해 비결합 표지로부터 결합된 표지가 분리되는 분석일 수 있다. 표지화 및 측정 방법에 따라 다양한 동종성 및 혼성 면역분석 방법이 특정한 부류, 예를 들어 RIA(방사능 면역분석), ELISA(효소 결합 면역흡착 분석), FIA(형광 면역분석), LIA(발광 면역분석), TRFIA(시간 분해 FIA), IMAC(면역활성화), EMIT(효소 증폭 면역 테스트), TIA(터보디메트릭(turbodimetric) 면역분석), I-PCR(면역-PCR)로 분류될 수 있다.
본 발명의 올리고머 측정을 위해서는, 표지화된 올리고머(트레이서)가 사용된 항체에 대한 결합에 대해 샘플 중에서 정량될 수 있는 올리고머와 경쟁하는 경쟁적 면역분석이 바람직하다. 샘플 중의 항원의 양, 즉 올리고머의 양은 표준 곡선에 의해 치환된 트레이서의 양으로부터 결정할 수 있다.
이러한 목적에 유용한 표지 중에서 효소가 유익한 것으로 입증되었다. 예를 들어 퍼옥시다제, 특히 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제 및 β-D-갈락토시다제에 기초한 시스템이 이용될 수 있다. 예를 들어, 전환이 광측정 방식에 의해 모니터링될 수 있는 특이 기질이 상기 효소에 이용될 수 있다. 적합한 기질 시스템은 알칼라인 포스파타제의 경우, p-니트로페닐 포스페이트(p-NPP), 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트/니트로블루 테트라졸륨(BCIP/NPT), 패스트-레드(Fast-Red)/나프톨-AS-TS 포스페이트; 퍼옥시다제의 경우, 2,2-아지노비스(3-에틸-벤조티아졸린-6-설폰산)(ABTS), o-페닐렌디아민(OPT), 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB), o-디아니시딘, 5-아미노살리실산, 3-디메틸아미노-벤조산(DMAB) 및 3-메틸-2-벤조티아졸린히드라존(MBTH); β-D-갈락토시다제의 경우, o-니트로페닐-β-D-갈락토시드(o-NPG), p-니트로페닐-β-D-갈락토시드 및 4-메틸움벨리페닐-β-D-갈락토시드(MUG)에 기초한 것이다. 많은 경우, 상기 기질 시스템은 즉시 사용 가능한 형태, 예를 들어 적절한 완충액 등과 같은 추가 시약을 함유할 수도 있는 정제의 형태로 시판된다.
사용되는 트레이서는 표지화된 올리고머이다. 이러한 점에서, 특정 올리고머는 측정하고자 하는 이 올리고머를 표지화하고 이것을 트레이서로 사용하여 측정할 수 있다.
트레이서를 제조하기 위해 올리고머에 표지를 커플링하는 방법은 공지된 방식으로 수행할 수 있다. 본 발명 올리고머의 유도체화에 대한 상기한 설명을 유추하여 참조하면 된다. 또한, 단백질에 대한 접합을 위해 적절히 변형된 다수의 표지, 예를 들어 비오틴-, 아비딘-, 엑스트라비딘- 또는 스트렙타비딘-접합 효소, 말레이미드-활성화 효소 등이 이용될 수 있다. 이러한 표지들은 올리고머와 직접 반응시킬 수도 있고 또는 필요에 따라 적절히 유도체화된 올리고머와 반응시켜 트레이서를 제공할 수 있다. 예를 들어 스트렙타비딘-퍼옥시다제 접합체가 사용될 경우, 이는 먼저 올리고머의 비오틴화를 요한다. 이것은 반대 순서에도 그에 상응하게 적용된다. 역시 이를 위한 적절한 방법들이 당분야에 공지되어 있다.
혼성 면역분석 방법을 선택할 경우, 항원-항체 복합체는, 예를 들어 지지체에 커플링된 항-이디오타입 항체, 예를 들어 토끼 IgG에 대해 유도된 항체를 통해 지지체에 결합시켜 분리할 수 있다. 지지체, 특히 적절한 항체로 코팅된 미량적정 평판은 공지되어 있으며 일부는 시판된다.
본 발명은 또한 전술한 하나 이상의 항체 및 추가 성분들을 갖는 면역분석 세트에 관한 것이다. 상기 세트는, 일반적으로 본 발명 올리고머 측정을 수행하기 위한 수단들이 조합된 패키징 단위의 형태이다. 취급을 가능한 한 용이하게 하기 위해서, 상기 수단은 실질적으로 바로 사용이 가능한 형태로 제공되는 것이 바람직하다. 유리한 장치는 키트의 형태로 면역분석물을 제공한다. 키트는 일반적으로 성분들의 독립적인 배치를 위해 여러 개의 용기를 포함한다. 모든 성분들은 바로 사용이 가능한 희석액으로서, 희석을 위한 농축액으로서, 또는 건조물로서, 또는 용해 또는 현탁을 위한 동결건조물로서 제공될 수 있으며, 개별 또는 모든 성분들은 동결시키거나 사용 시까지 실온에서 저장할 수 있다. 혈청은 바람직하게는, 예를 들어 -20℃의 온도에서 급속 냉동시켜서, 이 경우 면역분석물이 바람직하게는 사용 전까지 동결 온도 이하의 온도로 유지되도록 한다.
면역분석물과 함께 공급되는 추가 구성요소들은 해당 면역분석의 유형에 따라 달라진다. 통상적으로, 표준 단백질, 경우에 따라 필요할 수 있는 트레이서 및 대조군 혈청이 항혈청과 함께 공급된다. 이에 더하여, 미량적정 평판, 바람직하게는 항체 코팅된 평판, 완충액, 예를 들어 기질의 테스트, 세척 또는 전환용 완충액 및 효소 기질 자체 역시 포함될 수 있다.
실험실 및 병원에서의 보조 수단로서의 면역분석과 항체의 생성 및 사용의 일반적 원리는, 예를 들어 문헌[Antibodies, A Laboratory Manual(Harlow, E., and Lane, D., Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1988)]을 참조할 수 있다.
또한, 본 발명 올리고머의 응집을 억제하거나 그 탈응집을 촉진하는 물질 역시 관심의 대상이 된다. 그러한 물질들은 특히 상기 아밀로이드 β-관련 질환, 예를 들어 알츠하이머병의 치료를 위한 가능한 치료제이다.
따라서 본 발명은 또한 물질 또는 물질 혼합물을 특성화하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은
i) 상기 물질 또는 상기 물질 혼합물을 적절한 방식으로 제공하는 단계;
ii) 상기 물질 또는 상기 물질 혼합물이 하나 이상의 본 발명 올리고머 또는 이의 유도체 또는 조성물에 작용하도록 하는 단계; 및
iii) 상기 물질 또는 상기 물질 혼합물의 특정한 일부가 상기 올리고머 또는 이의 유도체에 결합하는지 또는 상기 조성물 중에 존재하는 하나 이상의 올리고머 또는 이의 유도체에 결합하는지를 결정하는 단계
를 포함한다.
상기 방법은 또한 본 발명 올리고머에 대한 친화력을 갖는 천연 결합 파트너, 예를 들어 세포 표면 항원, 특히 수용체, 및 가용성 리간드, 예를 들어 특정 단백질 및 매개인자를 동정하기 위해 생물 유래의 혼합물, 예를 들어 세포 제조물 및 세포 추출물에 대하여 수행할 수 있다.
물질들의 단순한 결합 이외에도, 본 발명 올리고머와의 추가 상호작용 및 이에 대한 영향 역시 상기 방법의 대상이 될 수 있다. 따라서, 특히
- 물질이 본 발명의 올리고머에 대한 아밀로이드 β 단백질의 응집을 조절, 특히 억제할 수 있는지;
- 물질이 본 발명의 올리고머의 탈응집을 조절, 특히 촉진할 수 있는지;
- 본 발명의 올리고머가 결합 파트너의 기능적 변화를 유발하는지, 예를 들어 수용체에 대한 효현 효과, 부분적 효현 효과, 길항 효과 또는 역 효현 효과를 나타내는지
를 결정할 수 있다.
상기 방법은 통상적으로 후속 적용에 있어 가장 유망한 것으로 생각되는 다수의 상이한 물질들로부터 선택하는 데 이용될 수 있는 시험관내 스크리닝 방법이다. 예를 들어 다수의 잠재적인 활성 물질들을 포함하는 광범위한 물질 라이브러리를 조합 화학에 의해 확립할 수 있다. 원하는 활성을 갖는 물질에 대한 조합 물질 라이브러리의 스크리닝은 자동화될 수 있다. 스크리닝 로봇은 바람직하게는 미량적정 평판 상에 배열된 개별 분석물을 효율적으로 분석하는 역할을 한다. 따라서 본 발명은, 바람직하게는 후술하는 방법 중 하나 이상이 적용되는 스크리닝 방법, 즉 1차 스크리닝 방법과 2차 스크리닝 방법 둘 다에 관한 것이다. 몇 가지 방법이 적용된다면, 이 방법들은 시간 변화를 주거나 동시에 하나의 동일한 샘플에, 또는 테스트할 물질의 여러 샘플에 적용될 수 있다.
그러한 방법을 수행하기 위한 특히 효과적인 기법은 신틸레이션 프록시미티 분석(Scintillation Proximity Assay), 요약하면 SPA이며, 이 방법은 약물 스크리닝 분야에 공지되어 있다. 이 분석을 수행하기 위한 키트 및 성분들은, 예를 들어 아머샴 파마시아 바이오텍으로부터 구입할 수 있다. 기본적으로, 가용화된 수용체 또는 막 결합형 수용체를 섬광성 물질을 함유하는 작은 형광미소구에 고정화한다. 예를 들어 방사능 리간드가 고정화된 수용체에 결합할 경우, 상기 섬광성 물질은 섬광성 물질과 방사능 리간드의 공간적 근접성으로 인하여 자극되어 빛을 방출한다.
이러한 유형의 방법을 수행하기 위한 또 다른 특히 효과적인 기법은 약물 스크리닝 분야에 공지되어 있는 FlashPlateR 기법이다. 이 분석을 수행하기 위한 키트 및 성분들은, 예를 들어 NENR 라이프 사이언스 프로덕츠로부터 시판되는 것을 구입할 수 있다. 이 원리 역시 섬광성 물질로 코팅된 미량적정 평판(96웰 또는 364웰)에 기반을 둔 것이다.
본 발명은 본 방법에 따라 올리고머, 이의 유도체, 또는 해당 조성물 중에 존재하는 하나 이상의 올리고머 또는 이의 유도체에 결합하는 리간드로서 확인될 수 있는 물질 또는 물질 혼합물의 일부와, 아밀로이드 β-관련 질환, 특히 치매성 질환 치료용 약제와 아밀로이드 β-관련 질환, 특히 치매성 질환 진단용 조성물의 제조에 사용되는 그 용도에 관한 것이다.
하기 실시예는 본 발명의 범위를 제한함이 없이 본 발명을 예시하고자 한 것이다.
실시예 1
a) 인간 Aβ(1-42)의 모 현탁액의 제조법
인간 β-아밀로이드(1-42) 단백질(약칭: Aβ(1-42); 펩티드 합성 물질, 동결건조물, 독일 Bachem으로부터 입수) 2 mg을 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올 800 ㎕에 용해시키고, 에펜도르프 용기에 넣어 37℃에서 30분간 항온처리한다. 그 후 진공 농축기(Speed Vac)에서 증발 건조시킨다. 잔류물은 88 ㎕의 DMSO에 용해시켜 5 mM Aβ(1-42) 모 현탁액을 제조하고, 이 현탁액은 -20℃에 저장할 수 있다.
b) 래트 Aβ(1-42)의 모 현탁액의 제조법
래트 β-아밀로이드(1-42) 단백질(약칭: 래트 Aβ(1-42); 펩티드 합성 물질, 동결건조물, 독일 Bachem으로부터 입수) 2 mg을 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올 800 ㎕에 용해시키고, 에펜도르프 용기에 넣어 37℃에서 30분간 항온처리한다. 그 후 진공 농축기(Speed Vac)에서 증발 건조시킨다. 잔류물을 88 ㎕의 DMSO에 용해시켜 5 mM 래트 Aβ(1-42) 모 현탁액을 제조하고, 이 현탁액은 -20℃에 저장할 수 있다.
실시예 2
a) 분자량 15 kDa 및 20 kDa의 Aβ(1-42) 올리고머 [Aβ(1-42) 올리고머 A]의 제조법; SDS의 사용
PBS 완충액(20 mM 인산나트륨, 140 mM NaCl, pH 7.4) 690 ㎕를 실시예 1a의 모액 60 ㎕에 첨가하고, 2% 농도의 소듐 도데실 설페이트(SDS) 용액 75 ㎕를 첨가하여 이 혼합물의 SDS 함량을 0.2%로 조정한다. 그 후 37℃에서 5 시간 동안 항온처리하고, 10,000 g에서 10분간 원심분리한다. 이 Aβ(1-42) 올리고머 A 제조물(약 400 μM Aβ(1-42))은 -20℃에 저장할 수 있다.
b) 분자량 15 kDa 및 20 kDa의 래트 Aβ(1-42) 올리고머 [래트 Aβ(1-42) 올리고머 A]의 제조법; SDS의 사용
PBS 완충액(20 mM 인산나트륨, 140 mM NaCl, pH 7.4) 690 ㎕를 실시예 1b의 모액 60 ㎕에 첨가하고, 2% 농도의 소듐 도데실 설페이트(SDS) 용액 75 ㎕를 첨가하여 이 혼합물의 SDS 함량을 0.2%로 조정한다. 그 후 37℃에서 5 시간 동안 항온처리하고, 10,000 g에서 10분간 원심분리한다. 이 래트 Aβ(1-42) 올리고머 A 제조물(약 400 μM Aβ(1-42))은 -20℃에 저장할 수 있다.
c) 분자량 15 kDa 및 20 kDa의 Aβ(1-42) 올리고머 [Aβ(1-42) 올리고머 A]의 제조법; 라우르산의 사용
PBS 완충액(20 mM 인산나트륨, 140 mM NaCl, pH 7.4) 690 ㎕를 실시예 1a의 모액 60 ㎕에 첨가하고, 5% 농도의 라우르산 용액 75 ㎕를 첨가하여 이 혼합물의 라우르산 함량을 0.5%로 조정한다. 그 후 37℃에서 5 시간 동안 항온처리하고, 10,000 g에서 10분간 원심분리한다. 이 Aβ(1-42) 올리고머 A 제조물(약 400 μM Aβ(1-42))은 -20℃에 저장할 수 있다.
d) 분자량 15 kDa 및 20 kDa의 Aβ(1-42) 올리고머 [Aβ(1-42) 올리고머 A]의 제조법; 올레산의 사용
PBS 완충액(20 mM 인산나트륨, 140 mM NaCl, pH 7.4) 690 ㎕를 실시예 1a의 모액 60 ㎕에 첨가하고, 5% 농도의 올레산 용액 75 ㎕를 첨가하여 이 혼합물의 올레산 함량을 0.5%로 조정한다. 그 후 37℃에서 5 시간 동안 항온처리하고, 10,000 g에서 10분간 원심분리한다. 이 Aβ(1-42) 올리고머 A 제조물(약 400 μM Aβ(1-42))은 -20℃에 저장할 수 있다.
e) 분자량 15 kDa 및 20 kDa의 Aβ(1-42) 올리고머 [Aβ(1-42) 올리고머 A]의 제조법; 라우로일사코신의 사용
PBS 완충액(20 mM 인산나트륨, 140 mM NaCl, pH 7.4) 690 ㎕를 실시예 1a의 모액 60 ㎕에 첨가하고, 5% 농도의 라우로일사코신 용액 75 ㎕를 첨가하여 이 혼합물의 라우로일사코신 함량을 0.5%로 조정한다. 그 후 37℃에서 5 시간 동안 항온처리하고, 10,000 g에서 10분간 원심분리한다. 이 Aβ(1-42) 올리고머 A 제조물(약 400 μM Aβ(1-42))은 -20℃에 저장할 수 있다.
실시예 3
a) 분자량 15 kDa 및 20 kDa의 Aβ(1-42) 올리고머 [Aβ(1-42) 올리고머 A]의 대안의 제조법
인간 β-아밀로이드(1-42) 단백질(약칭: Aβ(1-42); 펩티드 합성 물질, 동결건조물, 독일 Bachem으로부터 입수) 1 mg을 10 mM HCl 수용액 220 ㎕에 용해시키고, 실온에서 10분간 항온처리한다. 10,000 g에서 5분간 원심분리하여 불용성 성분들을 제거한다. 상청액(1 mM Aβ(1-42))은 Aβ(1-42) 단백질을 함유하며, 다음과 같이 추가 처리한다:
PBS 완충액 9 ㎕ 및 2% 농도의 SDS 용액 1 ㎕를 상기 상청액 1 ㎕에 첨가하고, 이 혼합물을 37℃에서 16 시간 동안 항온처리한다. hAβ(1-42) 올리고머 A 제조물(100 μM)은 -20℃에 저장할 수 있다.
b) 분자량 15 kDa 및 20 kDa의 래트 Aβ(1-42) 올리고머 [래트 Aβ(1-42) 올리고머 A]의 대안의 제조법
래트 β-아밀로이드(1-42) 단백질(약칭: Aβ(1-42); 펩티드 합성 물질, 동결건조물, 독일 Bachem으로부터 입수) 1 mg을 10 mM HCl 수용액 220 ㎕에 용해시키고, 실온에서 10분간 항온처리한다. 10,000 g에서 5분간 원심분리하여 불용성 성분들을 제거한다. 상청액(1 mM 래트 Aβ(1-42))은 래트 아밀로이드-β(1-42) 단백질을 함유하며, 다음과 같이 추가 처리한다:
PBS 완충액 9 ㎕ 및 2% 농도의 SDS 용액 1 ㎕를 상기 상청액 1 ㎕에 첨가하고, 이 혼합물을 37℃에서 16 시간 동안 항온처리한다. 래트 Aβ(1-42) 올리고머 A 제조물(100 μM)은 -20℃에 저장할 수 있다.
실시예 4
a) 분자량 15 kDa 및 20 kDa의 Aβ(1-42) 올리고머 [Aβ(1-42) 올리고머 A]의 대안의 제조법
인간 β-아밀로이드(1-42) 단백질(약칭: Aβ(1-42); 펩티드 합성 물질, 동결건조물, 독일 Bachem으로부터 입수) 1 mg을 1% SDS/H2O(5 mM Aβ(1-42)) 44 ㎕에 용해시킨다. 용액 5 ㎕를 PBS 40 ㎕ 및 2% SDS 용액 5 ㎕와 혼합하고, 37℃에서 16 시간 동안 항온처리한다. 10,000 g에서 5분간 원심분리하여 불용성 성분들을 제거한다. 이렇게 얻은 Aβ(1-42) 올리고머 A 제조물(500 μM Aβ(1-42))은 -20℃에 저장할 수 있다.
b) 분자량 15 kDa 및 20 kDa의 래트 Aβ(1-42) 올리고머 [래트 Aβ(1-42) 올리고머 A]의 대안의 제조법
래트 β-아밀로이드(1-42) 단백질(약칭: Aβ(1-42); 펩티드 합성 물질, 동결건조물, 독일 Bachem으로부터 입수) 1 mg을 1% SDS/H2O(5 mM Aβ(1-42)) 44 ㎕에 용해시킨다. 용액 5 ㎕를 PBS 40 ㎕ 및 2% SDS 용액 5 ㎕와 혼합하고, 37℃에서 16 시간 동안 항온처리한다. 10,000 g에서 5분간 원심분리하여 불용성 성분들을 제거한다. 이렇게 얻은 래트 Aβ(1-42) 올리고머 A 제조물(500 μM Aβ(1-42))은 -20℃에 저장할 수 있다.
실시예 5
a) 분자량 38 kDa 및 48 kDa의 Aβ(1-42) 올리고머 [Aβ(1-42) 올리고머 B]의 제조법
실시예 2a에 따라 얻은 Aβ(1-42) 올리고머 A 용액을 2.475 ml의 물(SDS 함량 0.05%, 0.1 mM Aβ(1-42))로 희석시키고, 37℃에서 20 시간 동안 항온처리한다. 이 Aβ(1-42) 올리고머 B 제조물의 분액을 후속 연구를 위해 -80℃에서 동결시켜 저장할 수 있다.
b) 분자량 38 kDa 및 48 kDa의 래트 Aβ(1-42) 올리고머 [래트 Aβ(1-42) 올리고머 B]의 제조법
실시예 2a에 따라 얻은 래트 Aβ(1-42) 올리고머 A 용액을 2.475 ml의 물(SDS 함량 0.05%, 0.1 mM 래트 Aβ(1-42))로 희석시키고, 37℃에서 20 시간 동안 항온처리한다. 이 래트 Aβ(1-42) 올리고머 B 제조물의 분액을 후속 연구를 위해 -80℃에서 동결시켜 저장할 수 있다.
c) 분자량 38 kDa 및 48 kDa의 Aβ(1-42) 올리고머 [Aβ(1-42) 올리고머 B]의 대안의 제조법
실시예 2c에 따라 얻은 Aβ(1-42) 올리고머 A 용액을 2.475 ml의 물(라우르산 함량 0.125%, 0.1 mM Aβ(1-42))로 희석시키고, 37℃에서 20 시간 동안 항온처리한다. 이 Aβ(1-42) 올리고머 B 제조물의 분액을 후속 연구를 위해 -80℃에서 동결시켜 저장할 수 있다.
d) 분자량 38 kDa 및 48 kDa의 Aβ(1-42) 올리고머 [래트 Aβ(1-42) 올리고머 B]의 대안의 제조법
실시예 2d에 따라 얻은 래트 Aβ(1-42) 올리고머 A 용액을 2.475 ml의 물(올레산 함량 0.125%, 0.1 mM Aβ(1-42))로 희석시키고, 37℃에서 20 시간 동안 항온처리한다. 이 Aβ(1-42) 올리고머 B 제조물의 분액을 후속 연구를 위해 -80℃에서 동결시켜 저장할 수 있다.
e) 분자량 38 kDa 및 48 kDa의 Aβ(1-42) 올리고머 [Aβ(1-42) 올리고머 B]의 대안의 제조법
실시예 2e에 따라 얻은 Aβ(1-42) 올리고머 A 용액을 2.475 ml의 물(라우릴사코신 함량 0.125%, 0.1 mM Aβ(1-42))로 희석시키고, 37℃에서 20 시간 동안 항온처리한다. 이 Aβ(1-42) 올리고머 B 제조물의 분액을 후속 연구를 위해 -80℃에서 동결시켜 저장할 수 있다.
f) SDS를 함유하지 않는 분자량 38 kDa 및 48 kDa의 Aβ(1-42) 올리고머 B [ Aβ(1-42) 올리고머 B]의 제조법
실시예 6b에 따라 제조된 Aβ(1-42) 올리고머 B 제조물 10 ㎕를 4%/33%/63% 비의 아세트산/메탄올/물 혼합물 250 ㎕와 혼합하고, 0℃ 얼음 위에서 30분간 항온처리하였다. 원심분리(10,000 g, 10분) 후, 상청액을 제거하고, 침전된 단백질 잔류물을 완충액(20 mM 인산나트륨, 140 mM NaCl, pH 7.4) 200 ㎕에 용해시킨다. 이렇게 얻은 제조물은 용해된 SDS 무함유의 Aβ(1-42) 올리고머 B를 함유하며, -20℃에 저장할 수 있다.
실시예 6
a) 38 kDa 및 48 kDa의 Aβ(1-42) 올리고머 [Aβ(1-42) 올리고머 B]의 투석 및 농축
실시예 5a에 따라 제조된 Aβ(1-42) 올리고머 B 제조물을 0.1% Pluronic(등록상표) F68(BASF)을 함유하는 PBS 완충액 30 ml와 혼합하여 Amicon Centriprep YM, 30 kD에서 3 ml로 농축시켰다. 존재할 수 있는 잔류물은 원심분리(10,000 g, 5분)에 의해 제거한다. 상청액은 제거한다. 이 Aβ(1-42) 올리고머 B 제조물의 분액을 후속 연구를 위해 -80℃에 동결시켜 저장할 수 있다.
b) 38 kDa 및 48 kDa의 Aβ(1-42) 올리고머 B [Aβ(1-42) 올리고머 B]의 농축물의 제조법
실시예 5a에 따라 얻은 Aβ(1-42) 올리고머 B 제조물 72.6 ml를 30 kD Centriprep YM 튜브(Amicon)을 통해 2 ml로 농축시킨다. 이 농축물을 10,000 g에서 10분간 원심분리하여 제거한다. 상청액은 회수하여 투석 튜브에 넣고 1 L 완충액(5 mM 인산나트륨, 35 mM 염화나트륨, pH 7.4)에 대하여 6℃에서 16 시간 동안 투석한다. 투석물은 10,000 g에서 10분간 원심분리하여 제거한다. 상청액은 회수하여 후속 연구를 위해 -80℃에 저장할 수 있다.
실시예 7
비오틴-Aβ(1-42) 모 현탁액의 제조법
비오틴-β-아밀로이드(1-42) 단백질(약칭: Aβ(1-42); 펩티드 합성 물질, 동결건조물, 독일 Bachem으로부터 입수) 0.5 mg을 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올 200 ㎕에 용해시키고, 에펜도르프 용기에 넣어 37℃에서 30분간 항온처리한다. 그 후 진공 농축기(Speed Vac)에서 증발 건조시킨다. 잔류물은 20.5 ㎕의 DMSO에 용해시켜 5 mM 비오틴-Aβ(1-42) 모 현탁액을 제조하고, 이 현탁액은 -20℃에 저장할 수 있다.
실시예 8
17 kDa 및 22 kDa의 비오틴-Aβ(1-42) 올리고머 [비오틴-Aβ(1-42) 올리고머 A]의 제조법
실시예 7의 모 현탁액 2 ㎕를 PBS 완충액(20 mM 인산나트륨, 140 mM NaCl, pH 7.4) 23 ㎕와 혼합하고, 2% 농도의 SDS 용액 2.4 ㎕를 첨가하여 SDS 함량을 0.2%로 조정한다. 그 후 37℃에서 6 시간 동안 항온처리한다. 10,000 g에서 5분간 원심분리하여 불용성 성분들을 제거한다. 이렇게 얻은 비오틴-Aβ(1-42) 올리고머 A 제조물은 -20℃에 저장할 수 있다.
실시예 9
42 kDa 및 52 kDa의 비오틴-Aβ(1-42) 올리고머 [비오틴-Aβ(1-42) 올리고머 B]의 제조법
실시예 8에 따라 얻은 비오틴-Aβ(1-42) 올리고머 A를 물(SDS 함량 0.05%, 0.1 mM Aβ) 82 ㎕로 희석시키고, 37℃에서 16 시간 동안 항온처리한다. 10,000 g에서 5분간 원심분리하여 불용성 성분들을 제거한다. 비오틴-Aβ(1-42) 올리고머 B 제조물은 후속 연구를 위해 -20℃에서 동결시켜 저장할 수 있다(도 3).
실시예 10
플루오레세인-Aβ(1-42) 모 현탁액의 제조
플루오레세인 β-아밀로이드(1-42) 단백질(약칭: 플루오레세인-Aβ(1-42); 펩티드 합성 물질, 동결건조물, AnaSpec) 0.5 mg을 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올 200 ㎕에 용해시키고, 에펜도르프 용기에 넣어 37℃에서 30분간 항온처리한다. 그 후 진공 농축기(Speed Vac)에서 증발 건조시킨다. 잔류물은 20.5 ㎕의 DMSO에 용해시켜 5 mM 플루오레세인 Aβ(1-42) 모 현탁액을 제조하고, 이 현탁액은 -20℃에 저장할 수 있다.
실시예 11
17 kDa 및 22 kDa의 플루오레세인-Aβ(1-42) 올리고머 [플루오레세인-Aβ(1-42) 올리고머 A]의 제조법
실시예 10의 모 현탁액 2 ㎕를 PBS 완충액(20 mM 인산나트륨, 140 mM NaCl, pH 7.4) 23 ㎕와 혼합하고, 2% 농도의 SDS 용액 2.4 ㎕를 첨가하여 SDS 함량을 0.2%로 조정한다. 그 후 37℃에서 6 시간 동안 항온처리한다. 10,000 g에서 5분간 원심분리하여 불용성 성분들을 제거한다. 이렇게 얻은 플루오레세인-Aβ(1-42) 올리고머 A 제조물은 -20℃에 저장할 수 있다.
실시예 12
42 kDa 및 52 kDa의 플루오레세인-Aβ(1-42) 올리고머 [플루오레세인-Aβ(1-42) 올리고머 B]의 제조법
실시예 11에 따라 얻은 플루오레세인-Aβ(1-42) 올리고머 A 용액을 물(SDS 함량 0.05%, 0.1 mM Aβ) 82 ㎕로 희석시키고, 37℃에서 16 시간 동안 항온처리한다. 플루오레세인 Aβ(1-42) 올리고머 B 제조물은 후속 연구를 위해 -20℃에서 동결시켜 저장할 수 있다(도 4).
실시예 13
실시예 2a의 Aβ(1-42) 올리고머 A [Aβ(1-42) 올리고머 A-CL]의 가교
실시예 2a에 따라 제조된 Aβ(1-42) 올리고머 A 용액 10 ㎕를 PBS, 0.2% SDS 7.5 ㎕로 100 μM Aβ(1-42) 함량이 되도록 희석시킨다. 이 용액에 새로 제조한 10 mM 글루타르디알데히드 수용액 1 ㎕를 첨가하고, 그 후 실온에서 3 시간 동안 교반한다. 초과량의 글루타르디알데히드는, 10 mM 에탄올아민 수용액(pH 7.4) 1 ㎕를 상기 샘플에 첨가하고 1 시간 동안 교반하여 포화시킨다. 이렇게 얻어진 제조물은 Aβ(1-42) 올리고머 A를 함유하며, 이것을 Aβ(1-42) 올리고머 A-CL 제조물이라 칭한다.
실시예 14
a) 실시예 5a의 Aβ(1-42) 올리고머 B [Aβ(1-42) 올리고머 B-CL]의 가교
실시예 5a에 따라 제조된 Aβ(1-42) 올리고머 B 용액 10 ㎕를 새로 제조한 10 mM 글루타르디알데히드 수용액 1 ㎕와 혼합하고, 실온에서 3 시간 동안 교반한다. 초과량의 글루타르디알데히드는, 10 mM 에탄올아민 수용액(pH 7.4) 1 ㎕를 상기 샘플에 첨가하고 1 시간 동안 교반하여 포화시킨다. 이렇게 얻어진 제조물은 Aβ(1-42) 올리고머 B를 함유하며, 이것을 Aβ(1-42) 올리고머 B-CL 제조물이라 칭한다.
b) Aβ(1-42) 올리고머 [Aβ(1-42) 올리고머 B-CL]을 가교시키기 위한 대안의 방법
실시예 5a에 따라 제조된 Aβ(1-42) 올리고머 B 용액 72.6 ml를 새로 제조한 10 mM 글루타르디알데히드 수용액 7.26 ml와 혼합하고, 실온에서 2 시간 동안 교반한다. 초과량의 글루타르디알데히드는, 완충액(20 mM 인산나트륨, 140 mM NaCl, 500 mM 에탄올아민, pH 7.4) 726 ㎕를 상기 샘플에 첨가하고 30분간 교반하여 포화시킨다. 반응 혼합물은 15 ml 30 kDa Centriprep 튜브를 통해 3 ml로 농축시킨다. 이 농축물은 10,000 g에서 10분간 원심분리하여 제거한다. 상청액을 회수하여 튜석 튜브에 넣고 5 mM 인산나트륨, 35 mM NaCl, pH 7.4 1 L에 대하여 6℃에서 16 시간 동안 투석한다. 그 후 투석물은 10,000 g에서 10분간 원심분리하여 제거하고, 상청액은 회수하여 후속 연구를 위해 -80℃에 저장할 수 있다. 이렇게 얻어진 제조물은 가교된 Aβ(1-42) 올리고머 B를 함유하며, Aβ(1-42) 올리고머 B-CL 제조물이라 칭한다.
실시예 15
a) 써몰리신에 의한 분해에 의해, Aβ(1-42) 올리고머 B를 출발 물질로 한 절두형 Aβ(1-42) 올리고머의 제조법
실시예 6b에 따라 제조된 Aβ(1-42) 올리고머 B 제조물 1.59 ml를 완충액(50 mM MES/NaOH, pH 7.4) 38 ml 및 1 mg/ml 써몰리신 수용액(Roche) 200 ㎕와 혼합한다. 이 반응 혼합물을 실온에서 20 시간 동안 교반한다. 그 후 100 mM EDTA 수용액(pH 7.4) 80 ㎕를 첨가하고, 1% 농도의 SDS 용액 400 ㎕를 첨가하여 SDS 함량을 0.1%로 조정한다. 이 반응 혼합물을 15 ml 30 kDa Centriprep 튜브를 통해 약 1 ml로 농축시킨다. 농축물은 완충액(50 mM MES/NaOH, 0.02% SDS, pH 7.4) 9 ml와 혼합하고, 다시 1 ml로 농축시킨다. 농축물은 투석 튜브에 넣고 완충액(5 mM 인산나트륨, 35 mM NaCl) 1 L에 대하여 6℃에서 16 시간 동안 투석한다. 이 투석물은, 2% 농도의 SDS 수용액을 첨가하여 SDS 함량을 0.1%로 조정한다. 샘플은 10,000 g에서 10분간 원심분리하여 제거하고 상청액을 제거한다.
이렇게 얻어진 물질은 추가 분석한다(SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동; 도 11 참조). 생성된 절두형 올리고머의 질량 분광분석에 의하면 이 올리고머는 절두형 Aβ(1-42)로 구성된 것이다.
b) 엔도프로테인아제 GluC에 의한 분해에 의해, Aβ(1-42) 올리고머 B를 출발 물질로 한 절두형 Aβ(1-42) 올리고머의 제조법
실시예 6b에 따라 제조된 Aβ(1-42) 올리고머 B 제조물 2 ml를 완충액(50 mM 인산나트륨, 35 mM 염화나트륨, pH 7.4) 38 ml 및 1 mg/ml GluC 엔도프로테인아제(Roche) 150 ㎕와 혼합한다. 이 반응 혼합물을 실온에서 6 시간 동안 교반하고, 그 후 1 mg/ml GluC 엔도프로테인아제(Roche) 수용액 150 ㎕를 추가로 첨가한다. 이 반응 혼합물을 실온에서 16 시간 더 교반하고, 그 후 5 M DIFP 용액 8 ㎕를 첨가한다. 이 반응 혼합물을 15 ml 30 kDa Centriprep 튜브를 통해 약 1 ml로 농축시킨다. 농축물은 완충액(50 mM 인산나트륨, 35 mM 염화나트륨, pH 7.4) 9 ml와 혼합하고, 다시 1 ml로 농축시킨다. 농축물은 투석 튜브에 넣고 완충액(5 mM 인산나트륨, 35 mM NaCl) 1 L에 대하여 6℃에서 16 시간 동안 투석한다. 이 투석물은, 1% 농도의 SDS 수용액을 첨가하여 SDS 함량을 0.1%로 조정한다. 샘플은 10,000 g에서 10분간 원심분리하여 제거하고 상청액을 제거한다.
이렇게 얻어진 물질은 추가 분석한다(SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동; 도 11 참조). 생성된 절두형 올리고머의 질량 분광분석에 의하면 이 올리고머는 절두형 Aβ(1-42)로 구성된 것이다.
Aβ(12-42) 올리고머의 특성 규명
실시예 16
SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)
모두 올리고머 A 및 B를 함유하는, 실시예 2a, 5a, 9, 12, 13 및 14a의 제조물을 4∼20% 농도의 Tris-글리신 SDS-PAGE로 표준 조건에 따른 변성 조건 하에 분석함으로써 변성 조건 하에서의 분자량을 규명한다.
상기 SDS-PAGE 분석(도 1)에 의하면 올리고머 A 제조물 중에 여전히 존재하는 출발 단백질 Aβ(1-42)는 약 4 kDa에서 밴드로서 나타나는 반면, 도 1에서 각각 1 및 2로 표시한, 실시예 2a의 올리고머 A1 및 A2는 약 15 kDa(연한 밴드) 및 약 20 kDa(진한 밴드)에서 관찰할 수 있다.
올리고머 B 제조물에서는 출발 단백질 Aβ(1-42)를 비교적 거의 검출할 수 없다(약 4 kDa에서의 비교적 연한 밴드). 반면에, 도 1에서 각각 3 및 4로 표시한, 실시예 5a의 올리고머 B1 및 B2는 약 38 kDa 및 약 48 kDa(화살표 참조)에 존재하는 것으로 나타난다. 이에 상응하게, 실시예 9 및 12(도 3, 4)의 비오틴- 및 플루오레세인-유도체화된 올리고머 B에 대해서는 약 42 kDa 및 약 52 kDa의 더 큰 분자량이 관찰된다.
개개의 가교 생성물 A-CL 및 B-CL(실시예 13 및 14a 참조, 도 2)을 포함하는 제조물의 분석에 의하면, 상기 두 샘플은 실질적으로 올리고머화 정도를 유지하는 것으로 나타난다(레인 A와 A' 및 레인 B와 B' 참조). 올리고머 A 및 B와 비교하여 약간 상이한 이동 양상은 약간 변경된 SDS 결합능과 N 말단의 아미노기 및 개별적으로 리신 잔기의 변형에 의한 것일 수 있다.
(실시예 15a의) 절두형 Aβ(20-42) 올리고머의 분석에 의하면, 써몰리신에 의한 N-말단 펩티드의 단백질 분해 제거에 의해 38/48 kDa 이중 밴드(도 11, 레인 A)가 28/38 kDa 이중 밴드(도 11, 레인 B)로 전환되는 것으로 나타난다. 유사하게, (실시예 15b의) 절두형 Aβ(12-42) 올리고머의 분석에 의하면, Glu-C 엔도프로테아제에 의한 N-말단 펩티드의 단백질 분해 제거에 의해 38/48 kDa 이중 밴드(도 11, 레인 A)가 33/40 kDa 이중 밴드(도 11, 고리 C)로 전환되는 것으로 나타난다.
실시예 17
겔 투과 크로마토그래피
비변성 조건 하에서의 분자량 양상을 좀 더 상세히 조사하기 위해서, Superose 12 HR10/30 컬럼을 사용하여 FPLC 공정에 의해 겔 투과 크로마토그래피(GPC)를 수행한다. GPC는 4℃에서 수행한다.
컬럼을 5배 부피의 PBS 완충액(유속: 0.5 ml/분, UV 검출, 214 nm)로 평형화시키고, 먼저 단백질 표준물을 사용하여 보정한다. 그 후, 10,000 g에서 5분간 원심분리하여 불용성 성분들을 제거한 후에, 실시예 5a의 Aβ(1-42) 올리고머 B 제조물(도 5, 아랫 부분)과, 비교용으로, PBS에 용해된 동일한 농도의 새로 칭량된 Aβ(1-42) 동결건조물을 분석한다.
평가에 의하면, Aβ(1-42) 올리고머 B 제조물이 약 50 kDa의 분자량 범위에서 주 피크를 갖는 것을 특징으로 하는 단백질 분획을 갖는 것으로 나타난다. SDS- PAGE에서의 변성 조건 하에서와 마찬가지로, 이 단백질 분획은 약 16 kDa의 분자량 범위에서 주 피크를 갖는 것을 특징으로 하는 단량체 Aβ(1-42) 단백질과는 현저히 상이하다.
비변성 조건 하에서의 실시예 6b의 Aβ(1-42) 올리고머 B의 분자량 양상 및 Aβ(1-42) 올리고머 B-CL의 분자량 양상을 조사하기 위해서, Superose 12 HR10/30 컬럼을 사용하여 실온에서 FPLC 공정에 의해 겔 투과 크로마토그래피(GPC)를 수행한다. 이 컬럼은 5배 부피의 PBS 완충액(유속: 0.5 ml/분, UV 검출, 214 nm)로 평형화시키고, 먼저 단백질 표준물을 사용하여 보정한다. 그 후, 실시예 6b의 Aβ(1-42) 올리고머 B를 PBS 완충액으로 1 mg/ml로 희석시키고, 실시예 14a의 Aβ(1-42) 올리고머 B-CL을 PBS 완충액으로 1 mg/ml로 희석시켜서 두 혼합물 다 분석한다(도 12).
평가에 의하면, 감소된 SDS 함량을 갖는 Aβ(1-42) 올리고머 B 제조물이 약 100 kDa의 분자량 범위에서 주 피크를 갖는 것을 특징으로 하는 단백질 분획을 갖는 것으로 나타난다. 이와 비교하여, 감소된 SDS 함량을 갖는 Aβ(1-42) 올리고머 B-CL 제조물은 약 60 kDa의 분자량 범위에서 주 피크를 갖는 것을 특징으로 하는 단백질 분획을 갖는다.
실시예 18
실시예 5a의 Aβ(1-42) 올리고머 B의 네이티브 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(NATIVE PAGE)
네이티브(native) 상태에서의 분자량은 4∼20% Tris-글리신 겔로 비변성 조건 하에 실시예 5a의 올리고머 B 함유 제조물을 분석함으로써 규명한다.
제조물 중에 존재하는 세제는 비이온성 세제 Triton X-100으로 중화시킨다. 이를 위해, 1 ㎕(4% Triton X-100)를 실시예 5a의 제조물 10 ㎕에 피펫으로 분주하여 실온에서 5분간 항온처리한다. 그 후, 10 ㎕를 동부피의 네이티브 샘플 완충액[1 M Tris(pH 6.8) 1 ml, 글리세롤 8 ml, 50 ml H2O 중의 브로모페놀 블루 1 ml]과 혼합하고 전기영동한다(러닝 완충액: H2O 2.5 L에 Tris 7.5 g, 글리신 36 g 함유).
NATIVE PAGE 평가에 의하면, 올리고머 B 제조물 중에 여전히 존재하는 출발 펩티드 Aβ(1-42)는 약 28 kDa(레인 A, 1로 표시)에서 밴드로서 나타나는 반면, 실시예 5a의 제조물의 주 밴드는 겉보기 분자량 64∼90 kDa(레인 A, 2로 표시)로서 관찰된다(도 6).
겔 투과 크로마토그래피(실시예 17 참조) 또는 네이티브 겔 전기영동(실시예 18 참조)과 같이 네이티브 분자량 분석 방법에서도, 본 발명의 올리고머, 특히 올리고머 B에 분자량이 할당될 수 있다는 것은 중요하다.
SDS와 복합체화한 후 SDS-PAGE에서 약 38 kDa 및 48 kDa의 분자량이 할당될 수 있는 올리고머 B는 네이티브 겔 전기영동에서 선택된 표준 단백질을 기준으로, 약 64∼90 kDa의 분자량 범위의 밴드로서 검출된다. 올리고머의 이동 양상은 크기 외에도 실질적으로 그 고유 전하에 의해 결정되기 때문에, 이 방법에 의해서는 분자량을 정확히 판독할 수 없는 것으로 예상된다. 그러나, 이 결과는 소정의 올리고머 종들이 존재한다는 결론을 유도한다.
실시예 19
a) 생리 완충액 중 다양한 단백질 농도의 Aβ(1-42) 올리고머 B의 안정성
실시예 6b에 따라 얻은 Aβ(1-42) 올리고머 B는 하기 조건 하에 PBS 완충액 중에서의 안정성을 테스트한다.
5 mg/ml를 PBS를 사용하여 2 x 희석 단계로 0.08 mg/ml로 희석시킨다. 제조된 모든 용액은 실온에서 24 시간 동안 항온처리한다. 그 후, 동결된 대조군 제조물과 비교하여 SDS-PAGE로 밴드 패턴을 분석한다. 밴드 패턴은 모든 샘플에 있어 동일하다.
b) 생리 완충액 중 다양한 온도에서 다양한 시간 후의 Aβ(1-42) 올리고머 B의 안정성
실시예 6b에 따라 얻은 Aβ(1-42) 올리고머 B를 PBS 완충액에 0.5 mg/ml로 희석시키고 실온 또는 37℃에서 24 시간 또는 96 시간 동안 항온처리한다. 그 후, SDS-PAGE로 밴드 패턴을 분석한다. 밴드 패턴은 모든 샘플에 있어 동일하다.
실시예 20
다양한 프로테아제(트립신, 키모트립신, 써몰리신, 엘라스타제, 파파인)에 의한 Aβ(1-42) 올리고머 B의 단백질 분해
실시예 6b에 따라 얻은 Aβ(1-42) 올리고머 B 제조물의 분액을 완충액(20 mM 인산나트륨, 140 mM NaCl, pH 7.4)로 0.5 mg/ml로 희석시키고, 각각 도 9에 표시된 프로테아제 용액의 중량의 1/50과 함께 하기 조건 하에 37℃ 및 pH 7.4에서 20 시간 동안 항온처리한다. 그 후 반응 혼합물 분액 1 ㎍을 SDS-PAGE로 분석한다(도 9).
SDS-PAGE에 의하면, Aβ(1-42) 올리고머 B 제조물에서 출발하여, 모든 프로테아제는 선택된 제한된 단백질 분해 조건 하에 약 38/48 kDa의 이중 밴드를 약 32/28 kDa의 이중 밴드로 복귀시키는 것으로 확인된다.
실시예 21
래트 혈장 내 Aβ(1-42) 올리고머 B의 안정성
실시예 6b에 따라 제조된 Aβ(1-42) 올리고머 B 제조물 4 ㎕를 래트 혈장 76㎕와 실온에서 0 시간, 1 시간, 2 시간, 4 시간 및 8 시간 동안 항온처리한다. 항온처리는 드라이아이스에서 동결시켜 중단한다.
그 후, SDS 샘플 완충액을 첨가한 후 모든 샘플을 SDS-PAGE로 분석한다. 이어서, 웨스턴 블롯으로 Aβ(1-42) 올리고머 B의 염색을 통해 안정성을 평가한다. 항-Aβ(1-42) 항체 6E10(Signet)은 검출을 위해 사용하였다. 밴드는 알칼리포스파타제에 커플링된 항-마우스 IgG 항체 및 기질 NBT/BCIP 첨가에 의해 가시화한다. 관찰된 밴드 패턴의 분자량 및 강도는 2 시간, 4 시간 및 8 시간에 대하여 거의 불변 상태이다.
이 결과는 Aβ(1-42) 올리고머 B가 높은 혈장 안정성을 보유한다는 것을 제시한다. 이에 따르면, 혈장 중의 생물학적 반감기는 약 8 시간 이상이다.
실시예 22
인간 뉴런 세포 표면에 대한, 분자량 17 kDa 및 22 kDa의 비오틴-Aβ(1-42) 올리고머 [비오틴-Aβ(1-42) 올리고머 A], 및 분자량이 각각 42 kDa 및 52 kDa인 비오틴-Aβ(1-42) 올리고머 [비오틴-Aβ(1-42) 올리고머 B]의 결합
인간 신경모세포종 세포주 IMR-32(ATCC 번호: CCL-127)에 대한 인간 β-아밀로이드(1-42) 단백질 및 2개의 Aβ(1-42) 올리고머 A 및 Aβ(1-42) 올리고머 B 제조물의 결합을, FACScan(Beckton Dickinson)에 의해 조사한다. IMR-21 세포(1.5 x 106 세포/0.1 ml PBS)의 현탁액을 비오틴 표지화된 인간 β-아밀로이드(1-42) 단백질(펩티드 합성 물질, 동결건조물, AnaSpec) 및 비오틴 표지화된 올리고머 A 및 B를 함유하는 제조물(각각 실시예 8 및 9)과 37℃에서 20분간 항온처리한다. 그 후 세포를 완충액(PBS + 1% BSA)으로 세척하고, 실온에서 스트렙타비딘 이소티오시아네이트에 커플링된 플루오레세인(Sigma)과 항온처리한다. 완충액 세척 단계 수행 후, IMR-32 세포의 표면에 대한 결합을 FACScan으로 분석하였다. 파선은 비오틴으로 표지화된 성분 부재 시의 바탕값 형광을 나타낸다. 개별 제조물의 첨가는 세포 관련 형광을 크게 증가시켰으며, 진한선으로 표시하였다. 세포 표면에 대한 올리고머 A(도 7B) 및 B(도 7C)의 결합은 단량체 β-아밀로이드(1-42) 단백질의 결합과는 현저히 상이하다(도 7A). 이 데이터는 인간 세포 표면에 대한 상기 올리고머의 특이적 결합 부위를 나타낸다.
실시예 23
icv 투여 후 래트 뇌 균질물 중의 Aβ(1-42) 올리고머 B의 검출
실시예 6b에 따라 얻은 10 nmol의 Aβ(1-42) 올리고머 B 제조물을 icv-일시 주사(icv-bolus)로서 래트에 투여한다. 각각 15분 및 120분 후에 뇌를 처리한다. 미처리 대조군 동물의 뇌 역시 처리한다. 이를 위해, 각 경우 래트 뇌 1 g을 분쇄 완충액 A[5 mM 인산나트륨 200 ml, 35 mM NaCl, 300 mM 수크로스(pH 7.4로 조정)를 Roche로부터 입수한 Complete(등록상표) 프로테아제 억제제 칵테일 4정과 혼합함] 9 ml와 50 ml 팰콘 튜브에서 혼합하여, 얼음 위에서 초음파(Ultra Turrax) 처리로 2분간 분쇄한다. 이 용액을 20분간 정치시킨 후 살짝 흔들어 8 x 1 ml 분액(= 균질물)으로 나눈다.
정량적 검출을 수행하기 위해, 먼저, 1.58 ng/㎕∼0.005 ng/㎕의 농도 범위로 일련의 PBS 중 Aβ(1-42) 올리고머 B 제조물들을 제조한다.
또한, 양성 대조군으로서, 미처리 래트의 대조군 뇌로부터의 균질물 역시 처리하고, Aβ(1-42) 올리고머 B 제조물의 일련의 표준물을 동일한 방식으로 상기 뇌 균질물에서 제조한다. 그 후 이 균질물을 100,000 g에서 1 시간 동안 한외 원심분리하고, 상청액은 후속 분석에 사용한다.
상기 양자의 일련의 표준물(PBS 대 대조군 뇌 균질물 상청액)에 대해 측정된 값을 비교하여, 먼저 양성 대조군의 Aβ(1-42) 올리고머 B 함량을 측정하고, 그 후, 그것과 비교하여, 처리된 래트의 뇌 샘플 중의 Aβ(1-42) 올리고머 B 함량을 측정함으로써 써 Aβ(1-42) 올리고머 B 함량을 정량적으로 측정할 수 있다.
1) 도트 블롯에 의한 검출
일련의 표준 샘플 소적 1 ㎕와 처리된 동물 유래의 샘플 추출물 소적 1 ㎕ 를 니트로셀룰로스 페이퍼에 적용하고, 항체 6E10(항-Aβ(1-42); Signet)을 사용하여 Aβ(1-42)를 검출한다. 염색은 항-마우스 IgG에 커플링된 알칼리포스파타제를 사용하고 염색 시약 NBT/BCIP를 첨가하여 수행한다.
염색 강도를 양성 대조군의 상응하는 농도와 비교하였을 때 미처리 래트의 뇌 추출물에서는 Aβ(1-42) (0.01 nmol/g)이 전혀 검출되지 않은 반면, 처리한 지 15분 후 희생시킨 래트에서는 약 0.4 nmol/g의 Aβ(1-42)를 검출할 수 있으며, 처리한 지 120분 후 희생시킨 래트에서도 동일한 방법으로 약 0.2 nmol/g이 검출 가능하다. 이것은 외부에서 투여한 Aβ(1-42) 올리고머 B에 대한 평균 생물학적 반감기가 약 105분임을 의미한다.
2) 웨스턴 블롯에 의한 검출
모든 도트 블롯 분석 샘플을 웨스턴 블롯으로도 분석한다. 웨스턴 블롯 역시 mMAb 6E10(항-Aβ(1-42); Signet)을 사용하고, 추가로 항-마우스 IgG에 커플링된 알칼리포스파타제를 사용하고 염색 시약 NBT/BCIP를 첨가하여 발색시킨다.
항-Aβ(1-42) 반응성 밴드는 Aβ(1-42) 올리고머 B의 겉보기 분자량에 해당하는 38/48 kDa 영역에서만 나타나는데, 즉, 올리고머 구조는 생체내 투여 시에, 심지어 2 시간 후에도 여전히 유지된다.
게다가, 도트 블롯 방법에서도, 염색 강도를 양성 대조군의 Aβ(1-42) 올리고머 B의 상응하는 진하게 염색된 밴드와 비교함으로써 15분 래트(0.4 nmol/g)의 뇌와 120분 래트(0.2 nmol/g)의 뇌에서 동일한 농도를 추정할 수 있다.
실시예 24
래트 피질 뉴런에 대한 분자량 38 kDa 및 48 kDa의 Aβ(1-42) 올리고머 [Aβ(1-42) 올리고머 B]의 신경독성 작용
래트 피질 뉴런을 준비하여 문헌[Choi et al. (1987) J. Neurosci. 7, 357-368)]에 따라 신경교 세포와 혼합된 배양물로서 배양한다. 발생 14∼15일째의 배아 피질을 뇌막 및 뇌 하부 영역으로부터 물리적으로 적출한다. 세포를 0.05% 농도의 트립신 용액 중에서 37℃에서 5∼7분간 항온처리하여 서로 분리한 후, 상기 용액을 입구가 좁은 파스테르 피펫을 통해 수차례 피펫팅한다. 세포수를 측정한 후, 430,000개 세포를 폴리-L-오르니틴 및 라미닌으로 코팅된 세포 배양 재료 상에 2 cm2당 0.5 ml의 유지 배지(0.8 mM 글루타민, 18 mM 글루코스, 23 mM NaHCO3 및 10% 말 혈청을 함유하는 최소 필수 배지)에 접종한다. 세포의 배양 및 후속 항온처리는 37℃, 5% CO2의 함습 세포 배양기에서 실시한다. 배양 3∼5일 후, (+)-5-플루오로-2'-데옥시유리딘/유리딘(각 10 μM)의 혼합물과 함께 1일간 항온처리하여 신경교 세포의 증폭을 중단시켰다. 배양 14일 후, Aβ(1-42) 올리고머 B의 독성 작용을 조사한다. 이를 위해, 세포를 뇌 세포 완충액(120 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 15 mM 글루코스, 25 mM HEPES, pH 7.2) 중에서 15분간 항온처리한다. 대조군 세포 1을 뇌 세포 완충액 중의 300 μM의 L-글루타메이트와 함께 동시에 항온처리한다. Aβ-올리고머 모액을 무혈청 배지(0.8 mM 글루타민, 20 mM 글루코스, 26 mM NaHCO3를 함유하는 최소 필수 배지)를 사용하여 다양한 최종 농도로 희석시키고 24 시간 동안 항온처리한다. L-글루타메이트 처리 대조군 세포 1은 동시에 무혈청 배지에서도 배양한다. 또 다른 세포군(대조군 세포 2)은 뇌 세포 완충액과 무혈청 배지만으로 처리한다. 24 시간 후 세포 배양물 상청액을 제거하고, 남아 있는 세포는 증류수에서 20분간 항온처리하여 파괴하고, 효소 락테이트 탈수소효소(LDH)의 활성은 상기 두 용액 중에서 효소적으로 측정한다. 평가를 위해, 상청액의 LDH 활성 + 남아 있는 세포의 LDH 활성의 합에 대한 세포 배양물 상청액의 LDH 활성의 비를 측정하고, 4회 측정값의 평균을 구한다. 3회의 실험을 수행하며, 각 실험 조건은 4번 거듭한다(n = 12). 글루타메이트 처리 세포(대조군 세포 1)에 대한 평균은 뉴런 사멸률 100%로 하고, L-글루타메이트로도 Aβ 올리고머로도 처리하지 않은 세포(대조군 세포 2)의 평균은 뉴런 사멸률 0%로 하며, Aβ 올리고머로 처리한 세포의 값은 그에 따라 변환된다. 각 경우 사용된 농도에서의 모든 측정값의 신경독성 평균은 분자량 38 kDa 및 48 kDa의 Aβ(1-42) 올리고머 [Aβ(1-42) 올리고머 B]의 특징적인 독성 작용을 나타낸다. 도 8 참조.
실시예 25
항체의 생산
면역화에 사용된 칵테일은 모든 경우에 실질적으로 하기 성분들을 갖는 면역 보조제(Biogenes)를 함유한다:
95% 파라핀 오일
2.4% Tween 40
0.1% 콜레스테롤
0.1% 리포폴리사카라이드
안정한 에멀션이 형성될 때까지 면역보조제를 2:1의 비로 항원 용액과 혼합한다. 에멀션을 주사하고, 상기 항원이 지속적으로 방출되는 데포를 형성한다.
a) 실시예 15a의 절두형 Aβ(20-42) 올리고머 B로 토끼를 면역화하여 폴리클로날 항혈청을 생성함
두 마리의 토끼를 표준 프로토콜에 따라 실시예 15a의 비접합 Aβ(20-42) 올리고머 B 제조물로 면역화한다:
1일 1차 면역화 및 면역전 혈청을 얻음
7일 1차 재접종
14일 2차 재접종
28일 3차 재접종 및 채혈
35일 채혈
35일째 채혈한 혈액을 실온에 두었다가 실온에서 원심분리하여 토끼 혈액으로부터 항혈청을 얻는다. 이렇게 얻은 혈청을 혈청 (a1)이라 칭한다.
표준 조건 하에 글루타르디알데히드를 사용하여 실시예 15a의 Aβ(20-42) 올리고머 B 제조물 2 mg을 LPH에 커플링하고, 이렇게 접합된 Aβ(20-42) 올리고머 B로 표준 프로토콜에 따라 두 마리 토끼를 더 면역화한다:
1일 1차 면역화 및 면역전 혈청을 얻음
7일 1차 재접종
14일 2차 재접종
28일 3차 재접종 및 채혈
35일 채혈
35일째 채혈한 혈액을 실온에 두었다가 실온에서 원심분리하여 토끼 혈액으로부터 항혈청을 얻는다. 이렇게 얻은 혈청을 혈청 (a2)라 칭한다.
b) 실시예 15b의 절두형 Aβ(12-42) 올리고머 B로 토끼를 면역화하여 폴리클로날 항혈청을 생성함
두 마리의 토끼를 표준 프로토콜에 따라 실시예 15a의 비접합 Aβ(12-42) 올리고머 B 제조물로 면역화한다:
1일 1차 면역화 및 면역전 혈청을 얻음
7일 1차 재접종
14일 2차 재접종
28일 3차 재접종 및 채혈
35일 채혈
35일째 채혈한 혈액을 실온에 두었다가 실온에서 원심분리하여 토끼 혈액으로부터 항혈청을 얻는다. 이렇게 얻은 혈청을 혈청 (b1)이라 칭한다.
표준 조건 하에 글루타르디알데히드를 사용하여 실시예 15b의 Aβ(12-42) 올리고머 B 제조물 2 mg을 LPH에 커플링하고, 이렇게 접합된 Aβ(12-42) 올리고머 B로 표준 프로토콜에 따라 두 마리 토끼를 더 면역화한다:
1일 1차 면역화 및 면역전 혈청을 얻음
7일 1차 재접종
14일 2차 재접종
28일 3차 재접종 및 채혈
35일 채혈
35일째 채혈한 혈액을 실온에 두었다가 실온에서 원심분리하여 토끼 혈액으로부터 항혈청을 얻는다. 이렇게 얻은 혈청을 혈청 (b2)라 칭한다.
c) 실시예 14a의 Aβ(1-42) 올리고머 제조물 B-CL로 토끼를 면역화하여 폴리클로날 항혈청을 생성함
두 마리의 토끼를 표준 프로토콜에 따라 실시예 14a의 비접합 Aβ(1-42) 올리고머 B-CL 제조물로 면역화한다:
1일 1차 면역화 및 면역전 혈청을 얻음
7일 1차 재접종
14일 2차 재접종
28일 3차 재접종 및 채혈
35일 채혈
35일째 채혈한 혈액을 실온에 두었다가 실온에서 원심분리하여 토끼 혈액으로부터 항혈청을 얻는다. 이렇게 얻은 혈청을 혈청 (c1)이라 칭한다.
d) 실시예 6b의 Aβ(1-42) 올리고머 제조물 B로 토끼를 면역화하여 폴리클로날 항혈청을 생성함
두 마리의 토끼를 표준 프로토콜에 따라 실시예 6b의 비접합 Aβ(1-42) 올리고머 B 제조물로 면역화한다:
1일 1차 면역화 및 면역전 혈청을 얻음
7일 1차 재접종
14일 2차 재접종
28일 3차 재접종 및 채혈
35일 채혈
35일째 채혈한 혈액을 실온에 두었다가 실온에서 원심분리하여 토끼 혈액으로부터 항혈청을 얻는다. 이렇게 얻은 혈청을 혈청 (d1)이라 칭한다.
표준 조건 하에 글루타르디알데히드를 사용하여 실시예 6b의 Aβ(1-42) 올리고머 B 제조물 2 mg을 LPH에 커플링하고, 이렇게 접합된 Aβ(1-42) 올리고머 B 제조물로 표준 프로토콜에 따라 두 마리 토끼를 더 면역화한다:
1일 1차 면역화 및 면역전 혈청을 얻음
7일 1차 재접종
14일 2차 재접종
28일 3차 재접종 및 채혈
35일 채혈
35일째 채혈한 혈액을 실온에 두었다가 실온에서 원심분리하여 토끼 혈액으로부터 항혈청을 얻는다. 이렇게 얻은 혈청을 혈청 (d2)라 칭한다.
실시예 26
다양한 Aβ(1-42) 형태와의 교차 반응에 대한, 실시예 25의 면역화로부터 얻은 폴리클로날 항혈청의 특성 규명
폴리클로날 항혈청의 특성을 규명하기 위해, PBS 중에서 다양한 Aβ(1-42) 형태의 100 pmol/㎕∼0.01 pmol/㎕ 범위의 연속 희석액을 제조하였다. 각 경우, 샘플 1 ㎕를 니트로셀룰로스 멤브레인에 적용하였다: 검출은 실시예 25의 적절한 토끼 혈청을 사용하여 수행하였다. mMAb 6E10(Signet)을 사용한 검출은 비교를 위해 수행하였다. 항-토끼 IgG에 커플링된 알칼리포스파타제(비교용: 항-마우스 IgG에 커플링된 알칼리포스파타제)를, 염색 시약 NBT/BCIP의 첨가와 함께 염색에 이용하였다. 도 10은 이러한 방식으로 얻은 도트 블롯을 나타내며, 이것은 다음과 같이 수치로 평가할 수 있다.
항원 6E10 혈청 (a1) 혈청 (a2) 혈청 (d1) 혈청 (c1)
올리고머 0.1 0.5 10 0.1 0.5
단량체 0.1 10 100 0.1 1
피브릴 1 100 > 100 0.5 1
APP 0.01 > 1 1 0.1 0.1
Aβ(1-40)* 0.1 100 n.d. 0.5 10
* 도 10에 나타내지 않음
상기 표에 기재된 수치는 관찰이 가능한 항원의 최소량[단위 pmol; APP를 제외하고, 각 경우 단량체를 기준으로 함](검출 한계)을 나타낸다.
실시예 15a의 비접합 Aβ(20-42) 올리고머를 사용한 면역화에 의해 얻은 토끼 혈청 (a1)과의 면역 반응의 비교는, 이들 올리고머에 대해 유도된 항체들이 피브릴, APP 및 단량체와 같은 다른 형태와는 단지 약하게 교차 반응한다는 것을 분명히 나타낸다. 이와는 달리, Aβ(1-42) 올리고머 B와의 현저히 더 강한 교차 반응(1행 참조)과, 또한 안정화된 CL 항원과의 교차 반응이 관찰된다. 이러한 데이터는 APP, 단량체 및 피브릴 구조와 비교하여, 여기에 존재하는 올리고머 형태의 구조가 매우 상이한 구조임을 나타낸다. 상기 항체들은 올리고머 특이 구조에 결합한다.
실시예 15a의 접합 Aβ(20-42) 올리고머를 사용한 면역화에 의해 얻은 토끼 혈청 (a2)와의 면역 반응 역시, 이들 올리고머에 대해 유도된 항체들이 피브릴 및 단량체와 같은 다른 형태와는 단지 약하게 교차 반응한다는 것을 보여준다. 이와는 달리, Aβ(1-42) 올리고머 B와의 약한 교차 반응(1행 참조)과, 또한 안정화된 CL 항원 및 APP와의 교차 반응이 관찰된다. 이러한 데이터는 단량체 및 피브릴 구조와 비교하여, 여기에 존재하는 올리고머 형태의 구조가 매우 상이한 구조임을 나타낸다.
이들과의 비교로서, 실시예 6b의 Aβ(1-42) 올리고머를 사용한 면역화에 의해 얻은 토끼 혈청 (d1)과의 면역 반응과 실시예 14a의 Aβ(1-42) 올리고머 B-CL을 사용한 면역화에 의해 얻은 토끼 혈청 (c1)과의 면역 반응은, 이들 올리고머에 대해 유도된 항체들이 Aβ(1-42) 올리고머 B와의 반응과 유사한 정도로 강하게 피브릴, APP 및 단량체와 같은 다른 형태와 교차 반응한다는 것을 나타낸다. 상기 항체들은 mMAb 6E10(Signet)의 면역 반응과 유사한 면역 반응을 나타내며, 올리고머 특이 구조에는 결합하지 않는다.
이에 따라, 마우스를 실시예 6b의 Aβ(1-42) 올리고머로 면역화하고, 공지된 방식으로 모노클로날 항체를 생성하였다. 이 때, 10개의 하이브리도마 중 2개는 결합 프로필, 특히 상기에서 분석된 반응성에 있어서 항혈청 (a1)의 것과 유사한 모노클로날 항체를 분비하였다.
실시예 27
Aβ(1-42) 피브릴의 제조
0.1% NH4OH 중의 2 mg/ml Aβ(1-42) 용액 100 ㎕를 완충액(20 mM 인산나트륨, 140 mM NaCl, pH 7.4) 300 ㎕로 희석시켜 0.5 mg/ml가 되게 하고, 0.1 M HCl로 pH 7.4로 조정하였다(100 μM Aβ(1-42)). 샘플을 37℃에서 24 시간 동안 항온처리하고, 그 후 10,000 g로 10분간 원심분리하여 제거하였다. 얻어진 단백질 잔류물은 완충액(20 mM 인산나트륨, 140 mM NaCl, pH 7.4) 400 ㎕로 재현탁시켰다. 이렇게 얻은 Aβ(1-42) 피브릴 제조물은 -20℃에서 저장하여 후속 연구에 사용할 수 있다.
실시예 28
해마 절편에 대한 (실시예 14b의) Aβ(1-42) 올리고머 B-CL의 영향
400 μM 두께의 해마 횡절편을 공기가 채워진 링거액(NaCl 124 mM, KCl 4.9 mM, MgS04 1.3 mM, CaCl2 2.5 mM, KH2P04 1.2 mM, NaHCO3 25.6 mM, 글루코스 10 mM)에 의한 관류 하에 34℃의 침지 슬라이스 챔버에 넣었다. 그 후, 축삭의 샤퍼 곁가지(Schaffer collateral)를 단극성 자극 전극으로 자극하고, 방사층에서의 흥분성 시냅스 후 전위(fEPSP)를 기록하였다. 테스트 펄스는 최대 fEPSP를 생성하는 자극 수준의 30%로 제공하였다. 장기 증강(long term potentiation)은, 폭 200 μs(강한 강직경련)의 단일 펄스로, 매 10분마다 3회씩 100회 펄스를 적용하여 유도하였다. fEPSP의 최종 증강은 최소 240분 동안 기록하였다. 실시예 14b의 올리고머 B-CL(500 nM)의 헹굼(rinsing-in)은 최초 강직경련 20분 전에 시작하고, 마지막 강직경련 10분 후에 중단하였다. rEPSP의 증가량(기울기)을 측정하여 시간의 함수로서 그래프를 작도하였다.
도 14는 해마에서, 특히 유지기에서 Aβ(1-42) 올리고머의 세척(washing-in)이 장기 증강을 억제한다는 것을 나타낸다. 따라서, Aβ(1-42) 올리고머 BCL은 신경 세포에 의한 정보의 저장(세포 기억)에 영향을 준다.
실시예 29
래트 1차 해마 절편에 대한 (실시예 5b의) Aβ(1-42) 올리고머 B의 결합
래트 1차 해마 뉴런에 대한 실시예 5b의 래트 Aβ(1-42) 올리고머 B의 결합을 조사하였다. 해마 뉴런을 폴리-L-리신 코팅된 커버 슬립 상에서 B27 보충물이 첨가된 신경 세포 배양 배지(neurobasal medium)에서 배양하고, 배양 14일째 사용하였다. 새로운 배양 배지에 200 nM(총 단량체 Aβ 농도)의 올리고머를 첨가하고 37℃에서 15분간 항온처리하여 뉴런의 세포막에 올리고머를 결합시켰다. Aβ 함유 배지를 제거한 후, 배지를 사용하여 두 단계의 세척을 실시하고, 그 후 세포를 3.5% 포름알데히드에서 고정시켰다. 세포를 추가 세척한 후, 비특이적 결합 부위를 PBS 완충액 중 10% 정상 당나귀 혈청으로 실온에서 90분간 차단하였다. 6E10(마우스 유래)을 1:2000으로 희석시켜 1차 항체로서 실온에서 2 시간 동안 적용하였다. 세포를 다시 세척하고, 마우스에 대해 유도되고 형광 염료 Cy3에 커플링된 2차 항체(당나귀 유래)와 실온에서 2 시간 동안 항온처리한다. 세포를 다시 세척한 후, 뉴런을 포함한 커버 슬립을 포매 매질을 함유한 슬라이드에 고정시켰다. 결합된 Aβ 올리고머를 갖는 해마 뉴런을 형광 현미경으로 관찰하였다. 사용된 대조군은 1차 항체 6E10이 생략된 혼합물이었다. 따라서 이 대조군은 Aβ에 의한 것이 아닌 비특이적 형광을 나타낸다.
도 15a에 도시한 바와 같이, 올리고머는 뉴런의 세포 표면에 점과 같은 형태로 결합한다. 이와는 달리, 1차 항체 6E10이 없는 대조군은 뉴런에 대한 2차 항체의 결합으로 인하여 단지 약한 비특이적 형광만을 나타낸다(도 15b).
서열 목록

Claims (74)

  1. SDS 겔 전기영동에서 겉보기 분자량이 약 15 kDa인 아밀로이드 β(1-42) 단백질의 올리고머 또는 이의 유도체.
  2. SDS 겔 전기영동에서 겉보기 분자량이 약 20 kDa인 아밀로이드 β(1-42) 단백질의 올리고머 또는 이의 유도체.
  3. SDS 겔 전기영동에서 겉보기 분자량이 약 38 kDa인 아밀로이드 β(1-42) 단백질의 올리고머 또는 이의 유도체.
  4. SDS 겔 전기영동에서 겉보기 분자량이 약 48 kDa인 아밀로이드 β(1-42) 단백질의 올리고머 또는 이의 유도체.
  5. 제1항의 올리고머 및 제2항의 올리고머의 혼합물 또는 이의 유도체의 혼합물을 포함하는 조성물.
  6. 제3항의 올리고머 및 제4항의 올리고머의 혼합물 또는 이의 유도체의 혼합물을 포함하는 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 유도체는 검출가능한 표지를 갖는 것이 특징인 올리고머 또는 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 표지는 형광, 발광, 비색, 방사성 또는 자기 표지이거나, 또는 상보성 결합 파트너에 대한 친화력을 갖는 표지인 것이 특징인 올리고머 또는 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 올리고머 또는 유도체는 가교된 것이 특징인 올리고머 또는 조성물.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 유도체는 올리고머의 단백질 분해 절단에 의해 얻을 수 있는 것이 특징인 올리고머 또는 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 유도체는 Aβ(x-42) 단편의 올리고머이고, 이 때 x는 8∼24, 바람직하게는 10∼22, 특히 12∼20인 것이 특징인 올리고머 또는 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 유도체는 Aβ(12-42) 단편 또는 Aβ(20-42) 단편의 올리고머인 것이 특징인 올리고머 또는 조성물.
  13. 유도체화 또는 비유도체화 아밀로이드 β(1-42) 단백질의 올리고머의 제조 방법으로서, 단량체 아밀로이드 β(1-42) 단백질 또는 이의 유도체를 세제에 노출시키고, 선택적으로, 하나 이상의 올리고머 또는 이의 유도체를 자체 공지된 방식으로 얻는 것이 특징인 방법.
  14. 유도체화 또는 비유도체화 아밀로이드 β(1-42) 단백질의 올리고머의 제조 방법으로서, 단량체 아밀로이드 β(1-42) 단백질 또는 이의 유도체를 세제에 노출시키고, 세제 작용을 감소시키고, 항온처리를 계속하고, 선택적으로, 하나 이상의 올리고머 또는 이의 유도체를 자체 공지된 방식으로 얻는 것이 특징인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 세제는 이온성인 것이 특징인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 세제는 나트륨 도데실 설페이트인 것이 특징인 방법.
  17. 제13항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 있어서, 세제에의 노출 시간은 약 1∼20 시간인 것이 특징인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 노출 온도가 약 20∼50℃인 것이 특징인 방법.
  19. 제14항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항온처리 계속 시간이 10∼30 시간인 것이 특징인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 노출 온도는 약 20∼50℃인 것이 특징인 방법.
  21. 제13항 내지 제20항 중 어느 하나의 항에 있어서, 아밀로이드 β(1-42) 단백질은 적어도 부분적으로 미리 푸는(unfolded) 것이 특징인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 풀기 위한 목적으로 단백질을 수소 결합 파괴제, 바람직하게는 HFIP에 노출시키는 것이 특징인 방법.
  23. 제13항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 올리고머는 가교제에 노출시키는 것이 특징인 방법.
  24. 제13항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 올리고머는 프로테아제에 노출시키는 것인 방법.
  25. 시험관내 진단 검출 방법에 있어서의 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항의 올리고머, 이의 유도체 또는 조성물의 용도.
  26. 생체내 진단 검출 방법에 있어서의 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항의 올리고머, 이의 유도체 또는 조성물의 용도.
  27. 올리고머 특이적 항체를 형성하기 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항의 올리고머, 이의 유도체 또는 조성물의 용도.
  28. i) 물질 또는 물질 혼합물을 제공하는 단계;
    ii) 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항의 올리고머, 이의 유도체 또는 조성물을 상기 물질 또는 물질 혼합물에 노출시키는 단계; 및
    iii) 상기 물질 또는 상기 물질 혼합물의 특정 부분이 상기 올리고머, 이의 유도체 또는 상기 조성물 내에 존재하는 하나 이상의 올리고머 또는 이의 유도체에 결합하는지를 결정하는 단계
    를 포함하는, 물질 또는 물질 혼합물을 특성규명하는(characterizing) 방법.
  29. 제28항의 방법으로 물질 또는 물질 혼합물의 일부가, 올리고머, 이의 유도체 또는 조성물 내에 존재하는 하나 이상의 올리고머 또는 이의 유도체에 결합하는 리간드로서 동정될 수 있는 것이 특징인, 물질 또는 물질 혼합물의 일부.
  30. 아밀로이드 β-관련 질병, 특히 치매성 질병 치료용 약제의 제조를 위한 제29항의 물질 또는 물질 혼합물의 일부의 용도.
  31. 아밀로이드 β-관련 질병, 특히 치매성 질병 진단용 조성물의 제조를 위한 제29항의 물질 또는 물질 혼합물의 일부의 용도.
  32. i) 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항의 하나 이상의 올리고머, 이의 유도체 또는 조성물로 숙주를 면역화하는 단계; 및
    ii) 상기 면역화에 대한 반응으로 생성된 항체 함유 숙주 혈청을 얻는 단계
    를 포함하는 항체의 생성 방법.
  33. 제32항에 있어서, 면역원으로서 사용된 올리고머 또는 이의 유도체 또는 면역원으로서 사용된 조성물 내에 존재하는 하나 이상의 올리고머 또는 이의 유도체를 인식하는 혈청 중의 하나 이상의 항체를 선별하는 것이 특징인 방법.
  34. 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항의 올리고머 또는 이의 유도체에 대한 특이성을 갖는 항체의 제조 방법으로서,
    i) 상기 올리고머 또는 이의 유도체를 포함하는 항원을 제공하는 단계;
    ii) 항체 레퍼토리(repertoire)를 상기 항원에 노출시키는 단계; 및
    iii) 상기 올리고머 또는 이의 유도체에 특이적으로 결합하는 항체를 상기 레퍼토리로부터 선별하는 단계
    를 포함하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 항원으로 동물을 면역화시킴으로써 항체 레퍼토리를 생체 내에서 상기 항원에 노출시키는 것인 방법.
  36. 제34항에 있어서, 추가로 동물의 림프구로부터 다수의 하이브리도마를 형성하고, 올리고머 또는 이의 유도체에 특이적으로 결합하는 항체를 분비하는 하이브리도마를 선별하는 것인 방법.
  37. 제34항에 있어서, 상기 동물은 마우스, 래트, 닭, 카멜리드(camelid), 사이노몰거스 원숭이, 토끼 및 염소 중에서 선택되는 것인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 동물은 APP 결핍성 넉아웃(knockout) 마우스인 방법.
  39. 제37항에 있어서, 상기 동물은 인간 면역글로불린 유전자를 갖고 항원 자극 후에 인간 항체를 생성하는 트랜스게닉 마우스인 방법.
  40. 제37항에 있어서, 상기 동물은 인간 말초 혈액 단핵 세포 또는 림프양 세포 또는 이의 전구체로 재구성된 중증 복합 면역결핍(SCID) 마우스인 방법.
  41. 제37항에 있어서, 상기 동물은, 치사량의 전신 방사선 조사(lethal total body irradiation)로 처리하고 중증 복합 면역결핍(SCID) 마우스로부터 유래한 골수 세포로 방사선에 대해 방어한 후 기능적 인간 림프구 또는 이의 전구체를 이식한 마우스인 방법.
  42. 제34항에 있어서, 항원으로 재조합 항체 라이브러리를 스크리닝함으로써 항체 레퍼토리를 시험관 내에서 상기 항원에 노출시키는 것인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 재조합 항체 라이브러리를 박테리오파지 표면 상에 노출시키는 것인 방법.
  44. 제42항에 있어서, 재조합 항체 라이브러리를 효모 세포 표면 상에 노출시키는 것인 방법.
  45. 제42항에 있어서, 재조합 항체 라이브러리를 박테리아 세포 표면 상에 노출시키는 것인 방법.
  46. 제42항에 있어서, 재조합 항체 라이브러리를 RNA-단백질 융합체로서 발현시키는 것인 방법.
  47. 제42항에 있어서, 재조합 항체 라이브러리는 scFv 라이브러리 또는 Fab 라이브러리인 방법.
  48. 제42항에 있어서, 재조합 항체 라이브러리는 단일 도메인 라이브러리인 방법.
  49. 제34항에 있어서, 항원으로 생체 내에서 동물을 면역화시킴으로써 항체 레퍼토리를 상기 항원에 노출시키고, 상기 동물의 림프양 세포로부터 제조된 재조합 항체 라이브러리를 상기 항원으로 스크리닝하는 것인 방법.
  50. 제34항에 있어서, 항원으로 생체 내에서 동물을 면역화시킴으로써 항체 레퍼토리를 상기 항원에 노출시키고, 상기 동물의 림프양 세포로부터 제조된 재조합 항체 라이브러리를 시험관 내에서 친화력 증가시키는 것인 방법.
  51. 제34항에 있어서, 항원으로 동물을 면역화시킴으로써 항체 레퍼토리를 상기 항원에 노출시키고, 항원 결합 항체를 분비하는 각 세포를 선별하고, 중쇄 및 경쇄의 가변부에 대한 cDNA를 단세포로부터 얻는 것인 방법.
  52. 제32항 내지 제51항 중 어느 하나의 항의 방법으로 얻을 수 있는 항체.
  53. 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항의 올리고머 또는 이의 유도체에 특이적으로 결합하는 단백질.
  54. 제53항에 있어서, Kd=10-6∼10-12 M의 친화력으로 올리고머 또는 이의 유도체에 결합하는 단백질.
  55. 제54항에 있어서, Kd=10-8 M보다 큰 친화력으로 올리고머 또는 이의 유도체에 결합하는 단백질.
  56. 제54항에 있어서, Kd=10-9 M보다 큰 친화력으로 올리고머 또는 이의 유도체에 결합하는 단백질.
  57. 제54항에 있어서, Kd=10-10 M보다 큰 친화력으로 올리고머 또는 이의 유도체에 결합하는 단백질.
  58. 제54항에 있어서, Kd=10-11 M보다 큰 친화력으로 올리고머 또는 이의 유도체에 결합하는 단백질.
  59. 제53항 내지 제58항 중 어느 하나의 항에 있어서, Kd=10-8 M 미만의 친화력으로 단량체 Aβ(1-42) 단백질 및/또는 단량체 Aβ(1-40) 단백질에 결합하는 단백질.
  60. 제53항 내지 제59항 중 어느 하나의 항에 있어서, 올리고머 또는 이의 유도체에 대한 상기 단백질의 친화력이 단량체 Aβ(1-42) 단백질 및/또는 단량체 Aβ(1-40) 단백질에 대한 친화력보다 10배 이상 큰 것인 단백질.
  61. 제53항 내지 제59항 중 어느 하나의 항에 있어서, 올리고머 또는 이의 유도체에 대한 상기 단백질의 친화력이 단량체 Aβ(1-42) 단백질 및/또는 단량체 Aβ(1-40) 단백질에 대한 친화력보다 100배 이상 큰 것인 단백질.
  62. 제53항 내지 제59항 중 어느 하나의 항에 있어서, 올리고머 또는 이의 유도체에 대한 상기 단백질의 친화력이 단량체 Aβ(1-42) 단백질 및/또는 단량체 Aβ(1-40) 단백질에 대한 친화력보다 1000배 이상 큰 것인 단백질.
  63. 제53항 내지 제62항 중 어느 하나의 항에 있어서, 표면 플라즈몬 공명으로 측정시 0.1 s-1 이하의 속도 상수 koff로 올리고머 또는 이의 유도체에 결합하는 단백질.
  64. 제53항 내지 제63항 중 어느 하나의 항에 있어서, 1 x 10-5 이하의 억제 상수 IC50으로 올리고머 또는 이의 유도체의 활성을 억제하는 단백질.
  65. 제53항 내지 제64항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분인 단백질.
  66. 제65항에 있어서, 실질적으로 인간 항체 또는 이의 항원 결합 부분인 항체.
  67. 제65항에 있어서, 키메라 항체 또는 이의 항원 결합 부분인 항체.
  68. 제65항에 있어서, CDR 이식 항체 또는 이의 항원 결합 부분인 항체.
  69. 제53항 내지 제64항 중 어느 하나의 항에 있어서, T-세포 수용체로부터 유도된 분자 또는 T-세포 수용체로부터 유도된 수용체 도메인 또는 면역글로불린의 Fc 부분과 상기 수용체 도메인의 융합 단백질인 단백질.
  70. 제53항 내지 제69항 중 어느 하나의 항의 단백질과, 선택적으로 약학적 허용 담체를 포함하는 약학 제제.
  71. 아밀로이드 β-관련 질병, 특히 치매성 질병 치료용 약제의 제조를 위한 제53항 내지 제69항 중 어느 하나의 항의 단백질의 용도.
  72. 아밀로이드 β-관련 질병, 특히 치매성 질병 진단용 조성물의 제조를 위한 제53항 내지 제69항 중 어느 하나의 항의 단백질의 용도.
  73. 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항의 하나 이상의 올리고머 또는 하나 이상의 이의 유도체 또는 조성물을 포함하는 백신.
  74. 아밀로이드 β-관련 질병, 특히 치매성 질병 치료용 백신의 제조를 위한 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항의 올리고머 또는 이의 유도체 또는 조성물의 용도.
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