JP2009533016A - プレセニリン1特異的阻害剤及びそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本明細書中で使用する場合、「特異的結合剤」の用語は、本明細書中に記載のように、PS1の認識及びPS1との結合に関する特異性を有する分子(molecule又はmolecules)を指す。適切な特異的結合剤は、限定するものではないが、抗体及びこれらの誘導体、ポリペプチド(抗体など)、化合物(化学化合物など)並びに低分子を含む。適切な特異的結合剤は、当分野において公知の方法を使用して、及び本明細書中に記載したように調製できる。本発明のPS1特異的結合剤は、PS1の特定部分と結合でき、好ましくはPS1の活性又は機能を調節できる。本発明の典型的なPS1特異的結合剤は、PS2に対してPS1の特定部分と優先的に結合でき、PS1の活性又は機能を調節できるが、PS2の活性又は機能は調節できないことが好ましい。
ある実施形態において、本発明はPS1の生物活性を調節できる、プレセニリン1含有γ−セクレターゼ(PS1)特異的結合剤を提供する。特定の実施形態において、特異的結合剤はPS1のN末端部分に結合する。この実施形態の一態様において、特異的結合はPS1のN末端部分にであり、プレセニリン2含有γ−セクレターゼ(PS2)のN末端部分にではない。
細胞におけるAβ40及び/又はAβ42の量を測定できる、当分野で公知の任意の型の試験を、化合物がPS2に対してPS1(特に、PS1のN末端)と特に結合するかどうかを確定するために使用できる。一実施形態において、該試験は任意の型の結合試験であり、好ましくは免疫結合試験である。このような免疫結合試験は当分野では公知である(例えば、Asai編、Methods in Cell Biology、VoL37、「細胞生物学における抗体(Antibodies in Cell Biology)」、Academic Press,Inc.、New York(1993)を参照されたし)。免疫結合試験は通常捕捉剤を使用し、検体である標的抗原に特異的に結合し、多くの場合固定化する。捕捉剤は、検体に特異的に結合する成分である。本発明の一実施形態において、捕捉剤は、Aβに特異的に結合する抗体又はその断片である。捕捉剤は、Aβの40個のアミノ酸残基中に位置するエピトープに特異的に結合する、抗体又はその断片である。好ましい実施形態において、捕捉剤は、Aβの初めの23個のアミノ酸残基(即ち、Aβ1〜23)中に位置するエピトープに特異的に結合する、抗体又はその断片である。
免疫結合試験は、非競合型であってよい。これらの試験は、直接測定される、一定量の捕捉検体を有する。例えば、1つの好ましい「サンドウィッチ」試験において、捕捉剤(抗体)は、固定先である固体基質に直接結合できる。これらの固定化抗体は、その後試験試料中に存在する抗原を捕捉(と結合)する。このように固定化されたタンパク質は、その後標識剤、標識を有する第2の抗体などと結合する。別の企図される「サンドウィッチ」試験において、第2の抗体は標識を欠いているが、第2の抗体が由来する種の抗体に特異的な標識抗体と結合できる。第2の抗体はまたビオチンなどの検出可能な成分を用いて修飾でき、この成分がストレプトアビジンなどの第3の標識分子に特異的に結合できる。(参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Harlow及びLane、「抗体、実験室マニュアル(Antibodies、A Laboratory Manual)、Ch 14、Cold Spring Harbor Laboratory、NY(1988)を参照されたし)。
免疫結合試験は競合型であってよい。試料中に存在する検体の量を、試料中に存在する検体と置き換えられた、試料中に存在する検体と競合し、捕捉剤から離れた加えられた検体の量を測定することによって、間接的に測定する。1つの好ましい競合結合試験において、既知量の検体(普通は標識してある)を試料に加え、その後試料を抗体(捕捉剤)に接触させる。抗体に結合した標識検体の量は、試料中に存在する検体の濃度に反比例する。(Harlow及びLane、「抗体、実験室マニュアル(Antibodies、A Laboratory Manual)」、Ch 14、pp.579〜583、上記を参照されたし)。
競合結合試験は、交差反応の確定に使用でき、当業者に、本発明の特異的結合剤により認識されるタンパク質又は酵素の複合体が所望のタンパク質であり、交差反応をしない分子であるかの確定、又は抗体が抗原に特異的であり、関連のない抗原と結合しないかどうかの確定を可能にする。この型の試験において、抗原は固体の支持体に固定化でき、特異的結合剤の固定化タンパク質に対する結合と競合すると思われる、未知のタンパク質混合物を試験に加える。競合分子もまた、該抗原とは関連のない1種又は複数種の抗原と結合する。固定化抗原に対する特異的結合剤/抗体の結合と競合するタンパク質の能力を、固体支持体に固定化された同じタンパク質による結合と比較し、タンパク質混合物の交差反応性を確定する。
Aβ特異的抗体の使用を必要としない、Aβ及びAβの断片を検出する他の非免疫技術もまた用いることができる。例えば、二次元ゲル電気泳動を用いて、液体試料中に存在する密接に関係がある可溶性タンパク質を分離できる。Aβを含む、APPの多くの断片と交差反応性の抗体を、その後ゲルの探索に使用でき、Aβのゲル上の正確な位置に基づきその存在を特定できる。培養細胞の場合、細胞タンパク質を代謝的に標識し、場合により最初の分離ステップとして免疫沈降を用いて、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離できる。
一実施形態において、本発明の方法はAβに対する特異的結合剤を含む。好ましい実施形態において、該方法はAβに対する少なくとも1種の抗体、より好ましくはAβに対する少なくとも2種の抗体を含む。該方法がAβに対する少なくとも2種の抗体を含む場合、1種の抗体は「捕捉」分子として作用し、一方他の抗体は検出分子又は「標識された」分子として作用することが好ましい。ある実施形態において、捕捉抗体は、アミノ酸配列のN末端部分に位置する、Aβのエピトープを認識できる(図3を参照されたし)。より詳細には、捕捉抗体がAβのアミノ酸1〜23内のエピトープを認識することが好ましい。
ある実施形態において、本発明はPS1のN末端部分に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、本明細書中に記載の従来の技術を使用して作製可能である。本発明の抗体の作製に適切な抗原(本明細書中では「免疫原」とも称する)は、上に記載する。
本発明に使用できる細胞型は、天然発生的又は人工的のどちらかで構築された、プレセニリン1を発現するがプレセニリン2は発現しない、又はプレセニリン−2を発現するがプレセニリン1は発現しない任意の細胞型を含む。一実施形態において細胞型は、プレセニリン1及びプレセニリン2のダブルノックアウト遺伝型を含む細胞から構築する。公知の方法又は本明細書に開示した方法を使用して、当業者はこのようなダブルノックアウト細胞に、プレセニリン1又はプレセニリン2のどちらかをコードするcDNAを形質転換/形質移入でき、プレセニリン1を発現するがプレセニリン2は発現しない、又はプレセニリン2を発現するがプレセニリン1は発現しない細胞型、並びにγ−セクレターゼ基質をコードするcDNAを、連続して又は同時のどちらかで構築できる。組換え核酸技術、遺伝子操作(即ち、ノックアウト株の作製)及び細胞形質転換/形質移入の任意の公知の方法を使用でき、並びに本明細書に詳細に記載した方法も使用できる。
ある実施形態において、本発明は上記の特異的結合剤を、医薬として許容される塩、媒体、担体、希釈剤及び/又はアジュバントと組み合わせて含む組成物を提供する。
PS1及びPS2により産生されるAβの違いに関与する構造的要素の特定
本発明者らは、PS1形質移入ダブルKO細胞は、PS2形質移入細胞より数倍多くの全Aβ(Aβ40+Aβ42)を産生することを見出した。PS1及びPS2単独ノックアウト細胞と比較した場合、38倍差までが他者により報告された。Laiら、J.Biol.Chem.、Jun 2003;278:22475〜22481を参照されたし。Aβの産生におけるこの違いに関する根拠を理解するために、本発明者らは、それぞれにおいてAβ産生活性を与える、PS1及びPS2における具体的な構造要素を特定した。
ヒトPS1、PS2及びAPPsw cDNAインサートを、pcDNA3(Invitiogen、CA、USA)を用いて、アデノウィルス三分節系リーダー配列(Berknerら、(1987)J.Virol.Apr;61(4):1213〜20、「アデノウィルス組換え体における、ポリオーマウィルス中型T抗原及びジヒドロ葉酸還元酵素の豊富な発現(Abundant expression of polyomavirus middle T antigen and dihydrofolate reductase in an adenovirus recombinant)」)を、ATG開始コドンの38bp上流の、CMVプロモーターとEcoR1部位との間に挿入することによって修飾された、pCFベクターにサブクローン化した。プレセニリンキメラの構築は、PCRに基づいた。PS1骨格とPS2断片を含むキメラの作製のために、本発明者らは、全pCFベクターに加えて保持されるべき全PS1配列と、最終キメラにおいて使用されるPS2断片のみを含む小型PCR断片とを含む、大型PCR断片をまず作製した。2つのPCR断片を、平滑末端法において、ラピッドDNAライゲーションキット(Rapid DNA ligation kit)(Roche、IN、USA)によってその後連結した。本発明者らは、全てのPCR反応に関してpfu Turbo DNA ポリメラーゼキット(pfu Turbo DNA polymerase kit)(Strategene、CA、USA)を使用した。PCRにより導入される突然変異体の可能性を避けるために、本発明者らはまず両方の鎖において全インサートを配列決定した。本発明者らは、その後PCR作製ベクターから配列確認インサートを取り出し、それをPCRを介さなかった別のpCFベクターにサブクローン化した。PS2骨格とPS1断片を含むキメラの作製のために、本発明者らは、全pCFベクターに加えて保持されるべき全PS2配列と、最終キメラにおいて使用されるPS1断片のみを含む小型PCR断片とを含む、大型PCR断片をまず作製した。他の全てのクローン化手順は、上記と同じであった。
標準曲線の作製
Aβ濃度の差は、プレセニリン活性又はプレセニリン発現濃度における差のどちらかによると思われるので、本発明者らは異なるプレセニリン分子の相対発現濃度を解明し、その後相対タンパク質濃度によりAβ濃度を標準化する必要があった。標準化Aβ濃度は、異なるプレセニリン構築体の相対活性又は酵素回転率を反映するはずである。
発現濃度の比較
標準曲線を用いて試料を同じウェスタンゲル上に載せて、PS12Bを標準として、異なるキメラの相対発現濃度が比較できる。図6は、異なるキメラに関する相対タンパク質発現濃度をどのように測定するかの例を示す。実験において、各プレセニリンcDNA構築体を、APPswを用いてダブルKO細胞に同時形質移入した。一晩インキュベートした後で、細胞を溶解し、それぞれの形質移入細胞からタンパク質を抽出した。ウェスタン分析のために、5μgのタンパク質調製品を載せ、プレセニリンのNTF及びCTFを、MAB1563及びPC235Tを用いて、同じブロット上で検出した(標準として、様々な量のPS12Bを同じゲルに載せたが、表示を明瞭にするためにここには示していない)。ウェスタンシグナルをまずフィルム(A)をスキャンすることにより定量し、その後シグナルを各抗体に関して標準曲線と比較し、ウェスタンにおいて同じ量のシグナルを発生するであろう、PS12B形質移入細胞から等量のタンパク質調製品として発現させた。
Aβ1−xに関するELISA試験
Aβ1−xは、捕捉用に専売抗体mAb266及び検出用に専売抗体mAb3D6を使用するELISA試験により、操作的に定義されるので、Aβ1−xは、Aβ38、Aβ40及びAβ42を含む、Aβ1−23より長い、任意のAβペプチドを表す。mAb266に関するエピトープはAβ16−23であり、mAb3D6に関するエピトープはAβ1−5である。Aβのペプチド配列は、図3に見出すことができる。Aβ40のELISAには、捕捉用に抗体mAb266及び検出用に2G3(Aβ40に特異的)をそれぞれ用いた。更に、Aβ42のELISAには、捕捉用に抗体mAb266及び検出用に抗体21F12をそれぞれ用いた。Aβ16−23に対する抗体を産生するハイブリドーマを、参照によりその全体を本明細書に組み込む、Kohler and Milstein(Nature 256:495 1975)及び米国特許第4,666,829号に述べられた、標準的ネズミ融合手順により作製した。本明細書中の「発明を実施するための最良の形態」も参照されたい。簡潔には、Aβ13−28を用いて免疫化し、2C−11(T細胞受容体モノクロナール抗体)に接合した2匹のBALB/cマウスを犠牲にし、脾臓を取り出した。30メッシュのステンレス製の篩に脾臓を押圧して通すことにより、混合した脾細胞を得た。これらをP3X63Ag8ネズミ骨髄腫細胞(アミノプテリン感受性)と、35%ポリエチレングリコールにおいて融合比10:1で融合した。これらの細胞を、2×106胸腺細胞/mlの存在下で、96ウェル組織培養プレートに播種した。アミノプテリンの存在で毒を加え、ヒポキサンチン、チミン及び10%ウシ胎児血清を用いて増強したダルベッコ変法イーグル培地における細胞の成長により、ハイブリドーマを選択した。ハイブリドーマを、ELISAを介したAβ13−28及びAPPタンパク質に対する反応性に関してスクリーニングした。陽性クローンを、2回サブクローン化した。クローンのアリコートを凍結し、液体窒素中で保存した。陽性クローンの上清を、モノクロナール抗体の更なる精製のために多量に作製した。同様の方法を、Aβ1−3に対するモノクロナール抗体の作製のために使用し、ここではマウスを初めはAβ1−5を用いて免疫化し、ポリクロナール羊抗マウス抗体に接合した。
プレセニリン2含有γ−セクレターゼに対してプレセニリン1含有γ−セクレターゼを優先的に阻害する化合物の特定
プレセニリン2含有γ−セクレターゼに対してプレセニリン1含有γ−セクレターゼを優先的に阻害する化合物を特定するために、公知のγ−セクレターゼ阻害化合物を、プレセニリン1形質移入細胞及びプレセニリン2形質移入細胞の両方と共に、様々な濃度で一晩インキュベートした。PS1/PS2ダブルノックアウト細胞に由来する、形質移入マウスの線維芽細胞を37℃、10%CO2において、2〜10%のウシ胎児血清(FBS)と、100μg/mlのペニシリン/ストレプトマイシン(Pen/Strp)(Invitrogen Corporation、Carlsbad、CA、USA)を含むダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)において成長させる。
GenePorter2を用いた形質移入
約30000個の細胞を96ウェルプレートの各ウェルに入れた。20時間後、培養培地を、各ウェルにおいて60μlのOptimem medium(Invitrogen Corporation、Carlsbad、CA、USA)に交換した。それと同時に、以下の2の混合物を調製した。混合物A:18μlのGenePorter2に81μlのOptimemを加える;混合物B:2μgのプラスミドDNAに100μlの希釈剤B(Gene Therapy Systems、San Diego、CA)を加える。その後、33μlの混合物Aを66μlの混合物Bに加え、5〜15分間インキュベートすることによってマスター混合物を調製した。最終的に、14μlのマスター混合物を各ウェルの細胞に加えた。
ヌクレオフェクター(Nucleofector)IIを用いた形質移入
約500〜1000万個(又は100〜1000万)の細胞をT−150プレートから収穫し、200×gで7分間遠心分離にかけることによって回収した。その後、細胞ペレットを10mlの温RPMI培地ですすぎ、200×gで5分間再度遠心分離にかけた。次に、細胞ペレットを100μlの溶液Rに再懸濁した。この細胞懸濁液に、1〜2μgのDNAを加え、細胞−DNA混合物を、Amaxaエレクトロポレーション装置(Amaxa Inc.、Gathersberg、MD、USA)にあらかじめセットしたプログラムT−20を用いて、直ちにエレクトロポレーションにかけた。1度エレクトロポレーションを行ったら、1mlの室温のRPMIを、エレクトロポレーションを行った細胞に加えた。RPMI添加の2〜5分後、混合物を5〜10mlの10%FBS含有DMEMに移し、96ウェルプレートに播種した。1〜3時間後、γ−セクレターゼ阻害剤を、阻害の研究のために細胞に加えた。
低分子阻害剤のPS1選択性に関する構造的基礎の特定
上で述べたように、特定の低分子阻害剤、具体的にはスルホンアミドはPS1含有γ−セクレターゼの優先的阻害を示し、一方非スルホンアミド阻害剤は、PS1対PS2γ−セクレターゼに関して少量の選択性を有するだけである。代表的実験からの用量反応曲線及びEC50値を図9に示す。阻害剤のPS1/PS2選択性についての2つの独立した実験からの平均値を図11に示す。COMPOUND S−1は、PS1に関して約51倍選択的であり、BMS299897はPS1に関して約35倍選択的であり、一方L−685,458はPS1に関してわずか約3倍選択的であり、DAPTは実質的にはPS2に関して2倍選択的である。Compound S−1で表される型の更なるスルホンアミド阻害剤もまた、優先的PS1選択性を示す(データ非掲載)。主にスルホンアミド系の阻害剤による、PS2とPS1との阻害の差の観察を基に、本発明者らは、この阻害の差に関する構造的基礎の調査をすすめた。本発明者らは、キメラPS1/PS2分子(図10に例示)を用い、阻害剤の有効性における差に関連するPS1のドメインをマッピングした。初めの一組のキメラプレセニリン分子を評価することにより、PS1の中間の1/3(残基128〜298)が、Compound S−1及びBMS299897による高い阻害能に関して必要且つ十分であることが明らかになった(図11)。Compound S−1及びBMS299897の両方に関して、PS1/2BのEC50値はPS1のEC50値と同様であり、一方PS1/2A及びPS1/2CのEC50値はPS2のEC50値と同様である。更に言えば、Compound S−1及びBMS299897による阻害の点から見ると、この構築体の大部分がPS2配列に含まれるという事実にもかかわらず、PS2/1Cに対する阻害剤の有効性は、まさにPS1のように作用した。前記のように(図9)、DAPT及びL−685,458などの非スルホンアミド阻害剤は、PS1に対しても、PS2に対しても、3倍を超える選択性を示さず、キメラはこの選択性の低さに関する一貫したいかなる根拠も明らかにしなかった。更に、詳細な分析(キメラ構築体及び点突然変異を用いた技術を使用)により、PS1のアミノ酸残基L172、T281及びL282を、Compound S−1によるPS1の選択的阻害のために必要且つ十分であると特定した。これらの残基はまた、BMS299897によるPS1の選択的阻害にも一部貢献している。
Claims (50)
- 化合物がプレセニリン2含有γ−セクレターゼに対してプレセニリン1含有γ−セクレターゼを優先的に阻害するかどうかを確定する方法であって、
(a)プレセニリン1を発現するがプレセニリン2を発現しない第1細胞型及びプレセニリン2を発現するが、プレセニリン1を発現しない第2細胞型を、前記化合物と共に個別にインキュベートするステップと、
(b)Aβ40/42の量を、各細胞系において測定するステップと、
(c)各細胞系におけるAβ40/42に関するEC50値を算出するステップと、
(d)第1細胞型に関して算出されたEC50値が、第2細胞型に関して算出されたEC50値より小さい場合、前記化合物がプレセニリン2含有γ−セクレターゼに対してプレセニリン1含有γ−セクレターゼを優先的に阻害することを確定するステップと
を含む方法。 - 第1細胞型が、プレセニリン1cDNAを含むベクターを形質移入したプレセニリン1/プレセニリン2ダブルノックアウト細胞系であり、第2細胞型が、プレセニリン2を含むベクターを形質移入したプレセニリン1/プレセニリン2ダブルノックアウト細胞系である、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法により特定される化合物。
- 非毒性治療有効量の請求項3に記載の化合物と、医薬として許容される担体とを含む、アルツハイマー病治療用医薬組成物。
- 治療を必要とする患者に、請求項4に記載の医薬組成物を投与することを含む、アルツハイマー病の治療方法。
- スルホンアミド化合物が、プレセニリン2含有γ−セクレターゼに対してプレセニリン1含有γ−セクレターゼを優先的に阻害するかどうかを確定する方法であって、
(a)プレセニリン1を発現するがプレセニリン2を発現しない第1細胞型及びプレセニリン2を発現するが、プレセニリン1を発現しない第2細胞型を、前記化合物と共に個別にインキュベートするステップと、
(b)Aβ40/42の量を、各細胞系において測定するステップと、
(c)各細胞系におけるAβ40/42に関するEC50値を算出するステップと、
(d)第1細胞型に関して算出されたEC50値が、第2細胞型に関して算出されたEC50値より小さい場合、前記化合物がプレセニリン2含有γ−セクレターゼに対してプレセニリン1含有γ−セクレターゼを優先的に阻害することを確定するステップと
を含む方法。 - 第1細胞型が、プレセニリン1cDNAを含むベクターを形質移入したプレセニリン1/プレセニリン2ダブルノックアウト細胞系であり、第2細胞型が、プレセニリン2を含むベクターを形質移入したプレセニリン1/プレセニリン2ダブルノックアウト細胞系である、請求項6に記載の方法。
- 請求項6に記載の方法により特定される化合物。
- 非毒性治療有効量の請求項8に記載の化合物と、医薬として許容される担体とを含む、アルツハイマー病治療用医薬組成物。
- 治療を必要とする患者に、請求項9に記載の医薬組成物を投与することを含む、アルツハイマー病の治療方法。
- 請求項9に記載の医薬組成物を投与することを含む、細胞においてPS2に対してPS1を選択的に阻害する方法。
- PS1に特異的に結合する単離抗体であって、前記特異的結合によりプレセニリン1含有γ−セクレターゼ(PS1)の活性を調節する抗体。
- PS1のN末端部分に結合する、請求項12に記載の抗体。
- PS1のN末端の半分に結合する、請求項12に記載の抗体。
- プレセニリン2に結合しない、請求項12に記載の抗体。
- PS1のN末端の1/6に結合する、請求項12に記載の抗体。
- 前記特異的結合がAβの産生を減少させる、請求項12に記載の抗体。
- プレセニリン1(PS1)又はその断片に対する特異的結合活性を有し、プレセニリン2には結合しない、単離抗体。
- 前記単離抗体が配列番号8又はその断片に対する特異的結合活性を有する、請求項18に記載の特異的結合剤。
- PS1の断片が、PS1の少なくとも5個の連続したアミノ酸を含む、請求項18に記載の特異的結合剤。
- PS1の少なくとも5個の連続したアミノ酸の一部が、PS1のN末端の半分内に位置する、請求項20に記載の特異的結合剤。
- PS1の少なくとも5個の連続したアミノ酸の一部が、配列番号8のアミノ酸配列内に位置する、請求項21に記載の特異的結合剤。
- 配列番号8からなる単離ポリペプチド。
- PS1を、PS1のN末端の半分に結合する化合物と、特異的阻害に関する有効量で接触させることを含む、PS1の特異的阻害方法。
- 前記化合物が、PS1のN末端の1/3に結合する、請求項24に記載の方法。
- 前記化合物が、PS1のN末端の1/6に結合する、請求項24に記載の方法。
- 前記接触を細胞内で実施する、請求項24に記載の方法。
- 前記細胞がインビトロである、請求項27に記載の方法。
- 前記細胞が培養細胞である、請求項27に記載の方法。
- 前記化合物がプレセニリン2含有γ−セクレターゼの活性を阻害しない、請求項27に記載の方法。
- 前記接触によりAの産生が減少する、請求項27に記載の方法。
- PS1に対する特異的結合活性を有する特異的結合剤又はその医薬として許容される塩を、アルツハイマー病(AD)の治療又は予防に有効な量で対象に投与することを含む、対象におけるADの治療又は予防の方法。
- PS1に対する特異的結合活性を有する特異的結合剤を、医薬として許容される塩、担体、希釈剤又はアジュバントと組み合わせて含む組成物。
- 請求項33に記載の組成物をアルツハイマー病(AD)の治療又は予防に有効な量で対象に投与することを含む、対象におけるADの治療又は予防の方法。
- 前記対象が哺乳動物である、請求項34に記載の方法。
- 前記哺乳動物がヒトである、請求項35に記載の方法。
- 配列番号7からなる単離ポリペプチド。
- PS1及びPS2を含む細胞を、PS1に対する特異的結合活性を有する特異的結合剤と、PS1γ−セクレターゼ活性を阻害するが、PS2γ−セクレターゼ活性は阻害しない有効量で接触させることを含む、Aβの産生の阻害方法。
- 前記接触がインビトロである、請求項38に記載の方法。
- 前記接触が培養細胞においてである、請求項38に記載の方法。
- 前記接触がインビボである、請求項38に記載の方法。
- PS1のN末端部分に構築したプレセニリンのキメラを、前記化合物と接触させるステップと、前記キメラの相対活性を測定するステップとを含む、PS1活性を阻害する化合物を特定する方法。
- 前記プレセニリンキメラが配列番号8のアミノ酸配列を含む、請求項42に記載の方法。
- 前記プレセニリンキメラが配列番号7のアミノ酸配列を含む、請求項42に記載の方法。
- PS2に対してPS1活性を優先的に阻害する化合物の特定方法であって、
a)PS1を発現するがPS2を発現しない第1細胞型を提供するステップと、
b)PS2を発現するがPS1を発現しない第2細胞型を提供するステップと、
c)第1細胞型を試験化合物に接触させるステップと、
d)第2細胞型を同じ試験化合物に接触させるステップと、
e)第1及び第2の細胞型におけるAβペプチドの量を測定するステップと、
f)各細胞型におけるAβペプチドの量に基づいて、各細胞型に関するEC50を算出するステップと、
g)第1細胞型に関するEC50が第2細胞型に関するEC50より小さい場合、試験化合物をPS1活性を優先的に阻害する化合物として特定するステップと
を含む方法。 - 前記AβペプチドがAβ38である、請求項45に記載の方法。
- 前記AβペプチドがAβ40である、請求項45に記載の方法。
- 前記AβペプチドがAβ42である、請求項45に記載の方法。
- 配列番号9からなる単離ポリペプチド。
- 前記単離抗体が配列番号9又はその断片に対する特異的結合活性を有する、請求項18に記載の特異的結合剤。
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