JP2009533016A - プレセニリン１特異的阻害剤及びそれらの使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、薬剤がプレセニリン２含有γ−セクレターゼに対してプレセニリン１含有γ−セクレターゼを優先的に阻害するかどうかを確定する方法を提供する。本発明はまた、プレセニリン２含有γ−セクレターゼに対してプレセニリン１含有γ−セクレターゼを優先的に阻害する薬剤、このような化合物を含む医薬組成物、このような化合物を使用するアルツハイマー病の治療方法を提供する。本発明は更に、プレセニリン１及びプレセニリン２のＮ末端ドメインがＰＳ１含有γ−セクレターゼ及びＰＳ２含有γ−セクレターゼによるＡβの産生における差を確定することを開示する。この発見により、ＰＳ１含有γ−セクレターゼ及びＰＳ２含有γ−セクレターゼによるＡβの産生において観察された差に関する構造的決定要因が特定された。このような構造決定要因は、以前は特定されていなかった。本発明はまた、薬剤がＰＳ１のＮ末端に特異的に結合するかどうかの確定方法を提供する。本発明は更に、ＰＳ１に特異的に結合し、その結果ＰＳ１の活性を阻害する薬剤の有効量を投与することによる、アルツハイマー病の治療方法を提供する。

Description

本出願は、２００６年２月６日に提出された米国仮出願第６０／７７１，１１７号及び２００６年４月２１日に提出された米国特許出願第６０／７４５，３４４号の利益を主張し、これらの各開示の全体を参照により本明細書に組み込む。

本発明は、プレセニリン２含有γ−セクレターゼに対してプレセニリン１含有γ−セクレターゼを優先的に阻害する化合物を特定する方法に関する。本発明はまた、プレセニリン２含有γ−セクレターゼに対してプレセニリン１含有γ−セクレターゼを優先的に阻害する薬剤、このような化合物を含む医薬組成物並びにこのような化合物及び医薬組成物を使用してアルツハイマー病を治療する方法に関する。

本発明は更に、ＰＳ１のＮ末端部分に特異的に相互に作用し、その結果ＰＳ２に対してＰＳ１を優先的に阻害する薬剤に関する。本発明はまた、このような薬剤を含む医薬組成物、細胞内でＰＳ２に対してＰＳ１を優先的に阻害する方法並びにこのような薬剤及び医薬組成物を使用してアルツハイマー病を治療する方法に関する。

本発明は更に、プレセニリン２含有γ−セクレターゼに対してＰＳ１含有γ−セクレターゼ活性を特異的に阻害するいくつかの化合物による、ＰＳ１の選択的阻害に関する構造決定要因の特定に関する。

アルツハイマー病（ＡＤ）は、認知症の最も一般的な形態の１つであり、米国における主な死因の１つである。全８５歳の３０％近くがＡＤを有しており（Ｂｒｕｎｋａｎ Ａ．Ｌ．＆ Ｇｏａｔｅ Ａ．Ｍ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．（２００５）９３：７６９〜７９２）、ＡＤは、脳における神経細胞の損失及び神経原線維変化及び老人斑の蓄積によって特徴付けられる。

老人斑の主原因はアミロイドβペプチド（Ａβ）であり、Ａβはアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のタンパク質分解性プロセッシングによって産生される。ＡＰＰは、普遍的に発現される内在性膜タンパク質であり、多様な経路で、セクレターゼによってタンパク質分解的にプロセッシングされる。α部位におけるＡＰＰの切断は良性である。しかし、β部位及びγ部位における切断は、Ａβペプチドの形成をもたらし、Ａβの長さは４０、４２又は４３残基であり得る。

プレセニリン（ＰＳ）は、Ａβペプチドを産生するγ−セクレターゼ複合体の触媒サブユニットを形成することが示されている。ＡＰＰ及びＰＳにおける大部分の突然変異体は、Ａβの４２残基形態（Ａβ４２）の４０残基のＡβ（Ａβ４０）に対する比率が増加し、したがってＡＰＰ、ＰＳ１及びＰＳ２の突然変異体により生じる、共通のＡＤ表現型が規定される（Ｓｃｈｅｕｎｅｒ Ｄら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：８６４〜８７０）。４２又は４３残基で終了するＡβペプチド（末端が長いＡβ）は、４０残基で終了するＡβより、線維形成性であり、神経毒性であると思われ、これはβＡＰＰが正常に代謝される際に産生される主なアイソフォームである（Ｓｔ．Ｇｅｏｒｇｅ−Ｈｙｓｌｏｐ，Ｐ．Ｈ．，＆ Ｐｅｔｉｔ，Ａ．、Ｃ．Ｒ．Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ（２００４）３２８：１１９〜１３０）。Ａβ４２ペプチドは、神経毒事象の病理学的系統であるアミロイドカスケードを開始すると考えられており、これは最終的にはアルツハイマー病において神経変性を引き起こす（Ｓｅｌｋｏｅ，Ｄ．Ｊ．、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ（２００２）１１０：１３７５〜１３８１）。Ａβは、直接的又は間接的のいずれかで酸化的ストレスを促進する（Ｋａｎｓｋｉ Ｊら、Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００２）４：２１９〜２２３）。

プレセニリンは、β−カテニン安定性の制御、膜タンパク質の輸送及びγ−セクレターゼによるＡＰＰ及び他の基質の切断に関与することが公知である。ＡＤに随伴する全てのＰＳ１変異体は、γ−セクレターゼによるβＡＰＰの切断を増加させ、残基４２で終了する末端の長いＡβペプチドの産生を優先的に増やす。しかしＰＳ２変異体もまた、Ａβペプチドを含む多様な因子により誘導されるアポトーシスに対して細胞感受性を調節することによって、神経変性を起こしうると信じる人もいる（Ｍａｒｔｉｎｓ Ｒ．Ｎ．ら、（１９９５）「Ｓ１８２（Ｇｌｕ２４６）家族性アルツハイマー細胞由来の高濃度のアミロイドβタンパク質（Ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ Ｓ１８２（Ｇｌｕ２４６）ｆａｍｉｌｉａｌ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｃｅｌｌｓ）」、ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ ７、２１７〜２２０、Ｄｕｆｆ Ｋ．ら、（１９９６）「突然変異体プレセニリン１を発現するマウスの脳におけるアミロイドβタンパク質４２（４３）の増加（Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ ｐｒｏｔｅｉｎ ４２（４３）ｉｎ ｂｒａｉｎｓ ｏｆ ｍｉｃｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｍｕｔａｎｔ ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ １）」Ｎａｔｕｒｅ ３８３：７１０〜７１３、Ｃｉｔｒｏｎ Ｍ．ら、（１９９７）「アルツハイマー病の突然変異体プレセニリンは、形質移入細胞及びトランスジェニックマウスの両方において、４２残基のアミロイドβタンパク質の産生を増加する（Ｍｕｔａｎｔ ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎｓ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｅａｓｅ ｉｎｃｒａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ４２ ｒｅｓｉｄｕｅ ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ ｐｉｏｔｅｉｎ ｉｎ ｂｏｔｈ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ）」Ｎａｔ Ｍｅｄ．３：６７〜７２、Ｒｏｇａｅｖ Ｅ．Ｉ．ら、（１９９５）「染色体１上の新規の遺伝子においてミスセンス変異がある、親族における家族性アルツハイマー病は、アルツハイマー病３型遺伝子に関連していた（Ｆａｍｉｌｉａｌ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｋｉｎｄｒｅｄｓ ｗｉｔｈ ｍｉｓｓｅｎｓｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａ ｎｏｖｅｌ ｇｅｎｅ ｏｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ｔｙｐｅ ３ ｇｅｎｅ．）」Ｎａｔｕｒｅ ３７６：７７５〜７７８）。γ−セクレターゼがＡＰＰ及びノッチ（Ｎｏｔｃｈ）の両方を切断するアスパルチルプロテアーゼのようである。

大部分の細胞は、ＰＳ１含有γ−セクレターゼ及びＰＳ２含有γ−セクレターゼを発現し、ＰＳ１含有γ−セクレターゼはＡβの産生及びおそらく更にノッチ（Ｎｏｔｃｈ）シグナル伝達の主な原因である（Ｓｈｅｎら（１９９７）「プレセニリン１−欠損マウスにおける骨格及びＣＮＳの欠陥（Ｓｋｅｌｅｔａｌ ａｎｄ ＣＮＳ ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ−１−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ．）」Ｃｅｌｌ ８９：６２９〜３９；Ｗｏｎｇら（１９９７）。プレセニリン１は、沿軸中胚葉においてノッチ１及びＤＩＩ１の発現に必要である。Ｎａｔｕｒｅ ３８７：２８８〜９２；Ｄｅ Ｓｔｒｏｏｐｅｒら（１９９８）「プレセニリン１の欠損によりアミロイド前駆体タンパク質の正常な切断が阻害される（Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ−１ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ ｎｏｒｍａｌ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）」Ｎａｔｕｒｅ ３９１：３８７〜９０）。ノッチタンパク質は、発生において細胞運命決定の複合体を仲介する、高分子量の細胞表面膜受容体である（Ｃｈｅｎ Ｑ．、Ｓｃｈｕｂｅｒｔ Ｄ．、（２００２）「プレセニリン相互作用タンパク質（Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ２００２：１〜１８）。γ−セクレターゼはまた、上皮型カドヘリン（Ｃａ^２＋依存性細胞間接着及び細胞間認識を仲介する１回膜貫通型タンパク質）、ＥｒｂＢ−４（細胞の増殖及び分化を調節する表皮成長因子である）及びＣＤ４４（細胞接着を仲介する別の受容体）を切断すると考えられる（Ｋｉｍｂｅｒｌｙ Ｗ．Ｔ．、Ｗｏｌｆｅ Ｍ．Ｓ．、（２００３）「γセクレターゼの特定及び機能（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ γ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ）」Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓ ７４：３５３〜２６０）。したがって、ＡＤ治療のための治療法の開発における大きな挑戦は、ノッチなどの他のγ−セクレターゼの基質の切断に有意に作用することなく、ＡＰＰからアミロイドペプチドの産生を減少させるγ−セクレターゼの阻害剤を特定することである。

しかし、培養細胞系におけるＰＳ１及びＰＳ２の活性の最近の研究は、低濃度のγ−セクレターゼ活性でもＡＰＰ以外のγ−セクレターゼの基質の適切な機能、例えばノッチシグナル伝達を支持するためには十分であり得ることを示している。これらの研究は、ＰＳ１含有γ−セクレターゼの選択的阻害がＡβの産生を有意に減少させ、残りのＰＳ２含有γ−セクレターゼのγ−セクレターゼ活性がノッチなどの他の本質的なγ−セクレターゼの基質の切断を支持するために十分であろうことを示唆する。実際に、脳におけるＰＳ１遺伝子の発現が削除されている、条件付きノックアウトマウスを使用した実験は、このようなマウスが、解剖学的、生理学的及び行動的レベルにおいて正常な特性を際立って示すことを示す。これらの実験は、成人期におけるＰＳ１含有γ−セクレターゼの選択的阻害が、副作用をほとんど起こさないと思われることを示唆している。

当分野において、他のγ−セクレターゼの基質及び経路に有意に作用せずに、Ａβの産生を減少できる方法及び薬剤の必要性がある。この必要性と取り組む１つの方法は、ＰＳ１と特異的に結合することによって、ＰＳ２に対してＰＳ１を優先的に阻害するγ−セクレターゼの阻害剤を特定することである。具体的には、当分野において、ＰＳ１の活性領域を特異的に標的にし、構造的にＰＳ２とは異なる薬剤の特定及び／又は設計のために、ＰＳ１の活性領域を特定する必要性がある。このような領域を標的とする阻害剤は、ＰＳ１含有γ−セクレターゼ活性を特異的に阻害できるが、ＰＳ２含有γ−セクレターゼ活性は阻害しない。したがって、ＰＳ１活性領域及びこれらの阻害剤の特定は、副作用のプロフィールを減少させる又は最小にする、ＡＤ治療における使用のための治療用候補化合物を提供する。

したがって、他のγ−セクレターゼの基質に有意に作用せずに、Ａβの産生を減少できる１つの方法は、プレセニリン２含有γ−セクレターゼに対してプレセニリン１含有γ−セクレターゼを優先的に阻害するγ−セクレターゼの阻害剤の特定である。このような阻害剤の特定は、ＡＤ治療における使用のための、許容される副作用を有する追加の治療用候補を提供するであろう。

本発明は、プレセニリン２含有γ−セクレターゼに対してプレセニリン１含有γ−セクレターゼを優先的に阻害する化合物の特定方法を提供する。該方法は、プレセニリン１を発現するがプレセニリン２を発現しない第１細胞型及びプレセニリン２を発現するが、プレセニリン１を発現しない第２細胞型を、該化合物と共に個別にインキュベートするステップと、Ａβ４０／４２を含むＡβ１−ｘの量を、各細胞型において測定するステップと、各細胞型におけるＡβ１−ｘに関するＥＣ_５０値を算出するステップと、第１細胞型に関して算出されたＥＣ_５０値が、第２細胞型に関して算出されたＥＣ_５０値より小さい場合、該化合物がプレセニリン２含有γ−セクレターゼに対してプレセニリン１含有γ−セクレターゼを優先的に阻害することを確定するステップを含む。

本発明は、プレセニリン２含有γ−セクレターゼに対してプレセニリン１含有γ−セクレターゼを優先的に阻害する化合物、非毒性治療有効量の、プレセニリン２含有γ−セクレターゼに対してプレセニリン１含有γ−セクレターゼを優先的に阻害する化合物及び医薬として許容される担体を含むアルツハイマー病治療用医薬組成物、並びに治療を必要とする患者に、非毒性治療有効量の、プレセニリン２含有γ−セクレターゼに対してプレセニリン１含有γ−セクレターゼを優先的に阻害する化合物及び医薬として許容される担体を含む医薬組成物を投与することを含むアルツハイマー病の治療法を更に提供する。

一態様において、本発明はＰＳ１の生物活性を調節できる、プレセニリン１含有γ−セクレターゼ（ＰＳ１）特異的結合剤を提供する。

一態様において、本発明はＰＳ１特異的結合剤及び医薬として許容されるこれらの塩を含む組成物に関する。

別の態様において、本発明は、ＰＳ１を、ＰＳ１のＮ末端の１／３（アミノ酸残基１〜１２７；配列番号８）に結合するＰＳ１特異的結合剤と、特異的な阻害のための有効量で接触させることを含む、ＰＳ１の特異的阻害方法を提供する。

別の態様において、本発明は、ＰＳ１−γセクレターゼの低分子阻害剤による、ＰＳ１の選択的阻害に関する構造決定要因を提供する。より具体的には、本発明は低分子阻害剤によるＰＳ１−γセクレターゼ活性の分化阻害に関与する、ＰＳ１に関する構造決定要因を提供する。本発明は、ＰＳ１選択的阻害剤が、ＰＳ１の中間の１／３部分（残基１２８〜２９８）（配列番号９）、より具体的には、残基Ｌ１７２、Ｔ２８１及びＴ２８２と相互に作用することを更に実証する。

別の態様において、本発明は、ＰＳ１特異的結合剤又はその医薬として許容される塩を、アルツハイマー病（ＡＤ）の治療又は予防に有効な量で対象に投与することを含む、対象におけるＡＤの治療又は予防の方法を提供する。

更なる態様において、本発明は、細胞を、ＰＳ１γ−セクレターゼ活性を阻害するが、ＰＳ２γ−セクレターゼ活性を阻害しない有効量のＰＳ１特異的結合剤と接触させることを含む、細胞においてＡ−ベータ（Ａβ）の産生を阻害する方法に関する。

更に別の態様において、本発明は、ＰＳ１の末端の１／３の、Ｎ末端１２７アミノ酸（配列番号８）を含む、単離ポリペプチドを提供する。

本発明の具体的実施形態は、以下の発明の詳細な説明及び添付の特許請求の範囲により明らかになるであろう。

項の表題は、本明細書中では構成の目的のためだけに使用し、記載の題材を多少なりとも限定すると解釈されるべきではない。本明細書中の全引用参考文献をその全体を参照により組み込む。

標準的な技術を、組換えＤＮＡ分子、タンパク質、及び抗体産生並びに組織培養及び細胞の形質転換のために使用できる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（下記）又は「分子生物学における最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ １９９４）を参照されたし。酵素反応及び精製技術は製造業者の指示書に従って、又はＳａｍｂｒｏｏｋら（「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９））で説明される手順、又は本明細書中に記載されるような手順などの従来の手順を使用して、当分野において一般に達成するように通常実施する。具体的な定義が提供されない限り、本明細書中に記載の、関連して使用する命名法、並びに分析化学、合成有機化学並びに医薬及び薬剤の化学の実験手順及び技術は、当分野において周知であり、一般的に使用される。化学合成、化学分析、薬剤の調製、形成及び送達並びに患者の治療のために、標準的技術が使用できる。

一態様において、本発明はプレセニリン２含有γ−セクレターゼに対してプレセニリン１含有γ−セクレターゼを優先的に阻害する化合物を特定する方法を提供する。該方法は（ａ）化合物と共に第１細胞型及び第２細胞型を個別にインキュベートし、ここで第１細胞型はプレセニリン１を発現するがプレセニリン２を発現せず、第２細胞型はプレセニリン２を発現するが、プレセニリン１を発現しないインキュベートステップと、（ｂ）Ａβ４０及び４２を含むＡβ１−ｘの量を、各細胞型において測定するステップと、（ｃ）各細胞型におけるＡβ１−ｘに関するＥＣ_５０値を算出するステップと、（ｄ）第１細胞型に関して算出されたＥＣ_５０値が、第２細胞型に関して算出されたＥＣ_５０値より小さい場合、該化合物がプレセニリン２含有γ−セクレターゼに対してプレセニリン１含有γ−セクレターゼを優先的に阻害することを確定するステップを含む。

この態様のある実施形態において、プレセニリン２含有γ−セクレターゼを含む細胞に関するＥＣ_５０値とプレセニリン１含有γ−セクレターゼを含む細胞に関するＥＣ_５０値との比が１より大きい場合、化合物はプレセニリン２−含有γ−セクレターゼに対してプレセニリン１含有γ−セクレターゼを「優先的に」阻害する。好ましい実施形態において、ＥＣ_５０値の比は約３〜５、より好ましくは約５〜１０、更により好ましくは約１０〜１５、更により好ましくは約１５〜２０及び最も好ましくは約２０を超える。

Ａ．定義
本明細書中で使用する場合、「特異的結合剤」の用語は、本明細書中に記載のように、ＰＳ１の認識及びＰＳ１との結合に関する特異性を有する分子（ｍｏｌｅｃｕｌｅ又はｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）を指す。適切な特異的結合剤は、限定するものではないが、抗体及びこれらの誘導体、ポリペプチド（抗体など）、化合物（化学化合物など）並びに低分子を含む。適切な特異的結合剤は、当分野において公知の方法を使用して、及び本明細書中に記載したように調製できる。本発明のＰＳ１特異的結合剤は、ＰＳ１の特定部分と結合でき、好ましくはＰＳ１の活性又は機能を調節できる。本発明の典型的なＰＳ１特異的結合剤は、ＰＳ２に対してＰＳ１の特定部分と優先的に結合でき、ＰＳ１の活性又は機能を調節できるが、ＰＳ２の活性又は機能は調節できないことが好ましい。

本明細書で使用する場合、「低分子」という用語は約１５００ｇ／モル未満の分子量を有する分子を指す。例えば低分子は、有機低分子、ペプチド又はペプチド様分子であってよい。

本明細書中で使用する場合、「抗体」という用語は、抗原に特異的に結合でき、抗原の生物活性を阻害又は調節できると思われる、１種又は複数種のポリペプチド鎖を含む、単量体又は多量体のタンパク質を指す。したがって、本明細書中で使用する場合、該用語は無傷の免疫グロブリンの任意のアイソタイプ又は標的抗原に対して特異的に結合する無傷の抗体と競合できるその断片を含み、例えば、キメラ、ヒト化、完全ヒト型及び二重特異性の抗体を含む。無傷の抗体は一般的に少なくとも２本の完全長重鎖及び２本の完全長軽鎖を含むが、時にはラクダ科の動物において天然発生的に生じる、重鎖のみを含むことのできる抗体のように、より少数の鎖も含み得る。抗体は、単一源から単独で誘導されてもよく、又は「キメラ」であってもよい、即ち、抗体の異なる部分が２種の異なる抗体から誘導されてもよい。例えば、ＣＤＲ領域がラット又はネズミ源から誘導されてもよく、一方Ｖ領域のフレームワーク領域がヒトなどの異なる動物源から誘導されてもよい。本明細書中に記載したような、抗体又は結合断片は、組換えＤＮＡ技術により、或いは無傷の抗体の酵素的又は化学的切断により、ハイブリドーマにおいて産生できる。特に明記しない限り、「抗体」という用語は、２本の完全長重鎖及び２本の完全長軽鎖を含む抗体に加えて、これらの誘導体、変異体、断片及び突然変異タンパク質を含み、これらの例は以下に記載する。したがって、該用語は、抗原（例えば、グルカゴン）に特異的に結合できる軽鎖及び／又は重鎖の可変領域の全て又は一部を含むポリペプチドを含む。したがって、抗体という用語は、免疫学的に機能的な断片を含み、例えばＦ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ及び一本鎖Ｆｖ断片を含む。

「抗原」という用語は、選択的結合剤、例えば抗体が結合でき、更に動物において使用し、その抗原のエピトープに結合できる抗体を産生できる分子又は分子の一部を指す。抗原は、１種又は複数種のエピトープを有することができる。好ましくは、本明細書中で使用する抗原はＰＳ１のＮ末端の１２７アミノ酸、又は動物において抗体を産生できる、これらの任意の適切な部分を含む。ある実施形態において、抗原は、ＰＳ１のアミノ末端の少なくとも一部分（アミノ酸１〜１２７）に含まれる、少なくとも５個の連続したアミノ酸、例えばアミノ酸１〜５、２〜６、３〜７、４〜８、５〜９、６〜１０、７〜１１、８〜１２、９〜１３、１０〜１４、１１〜１５、１２〜１６、１３〜１７、１４〜１８、１５〜１９、１６〜２０、１７〜２１、１８〜２２、１９〜２３、２０〜２４、２１〜２５、２２〜２６、２３〜２７、２４〜２８、２５〜２９、２６〜３０、２７〜３１、２８〜３２、２９〜３３、３０〜３４、３１〜３５、３２〜３６、３３〜３７、３４〜３８、３５〜３９、３６〜４０、３７〜４１、３８〜４２、３９〜４３、４０〜４４、４１〜４５、４２〜４６、４３〜４７、４４〜４８、４５〜４９、４６〜５０、４７〜５１、４８〜５２、４９〜５３、５０〜５４、５１〜５５、５２〜５６、５３〜５７、５４〜５８、５５〜５９、５６〜６０、５７〜６１、５８〜６２、５９〜６３、６０〜６４、６１〜６５、６２〜６６、６３〜６７、６４〜６８、６５〜６９、６６〜７０、６７〜７１、６８〜７２、６９〜７３、７０〜７４、７１〜７５、７２〜７６、７３〜７７、７４〜７８、７５〜７９、７６〜８０、７７〜８１、７８〜８２、７９〜８３、８０〜８４、８１〜８５、８２〜８６、８３〜８７、８４〜８８、８５〜８９、８６〜９０、８７〜９１、８８〜９２、８９〜９３、９０〜９４、９１〜９５、９２〜９６、９３〜９７、９４〜９８、９５〜９９、９６〜１００、９７〜１０１、９８〜１０２、９９〜１０３、１００〜１０４、１０１〜１０５、１０１〜１０５、１０２〜１０６、１０３〜１０７、１０４〜１０８、１０５〜１０９、１０６〜１１０、１０７〜１１１、１０８〜１１２、１０９〜１１３、１１０〜１１４、１１１〜１１５、１１２〜１１６、１１３〜１１７、１１４〜１１８、１１５〜１１９、１１６〜１２０、１１７〜１２１、１１８〜１２２、１１９〜１２３、１２０〜１２４、１２１〜１２５、１２２〜１２６、１２３〜１２７、１２４〜１２８、１２５〜１２９、１２６〜１３０、又は１２７〜１３１を含む。

本明細書で使用する場合、「特異的結合」は表面上又はくぼみ内に特異的に結合する範囲を有する、２つの異なる分子間の相互作用に関し、その結果、他の分子の特有の空間的及び物理的構成と相補的であると定義される。特異的結合を示す分子の型は、リガンド及び受容体（抗リガンド）と称することができる。このような分子は、抗原−抗体のような免疫学的ペアのメンバーであり得るが、特異的結合は他の分子との間にも起こり得る。「特異的結合」それ自体は、２つ（又は複数）の分子の結合一定性により特定できる。

Ｂ．特異的結合剤
ある実施形態において、本発明はＰＳ１の生物活性を調節できる、プレセニリン１含有γ−セクレターゼ（ＰＳ１）特異的結合剤を提供する。特定の実施形態において、特異的結合剤はＰＳ１のＮ末端部分に結合する。この実施形態の一態様において、特異的結合はＰＳ１のＮ末端部分にであり、プレセニリン２含有γ−セクレターゼ（ＰＳ２）のＮ末端部分にではない。

別の実施形態において、特異的結合剤は、ＰＳ１に対する特異的結合活性を有する少なくとも１種のペプチド又はその断片を含む。好ましい実施形態において、特異的結合剤は、配列番号２に対する特異的結合活性を有する少なくとも１種のペプチド又はその断片を含む。好ましい一実施形態において、特異的結合剤は抗体である。この実施形態の好ましい抗体は、ＰＳ１のＮ末端部分を認識すると思われる。より好ましくは、抗体は配列番号８のアミノ酸配列、即ちＰＳ１の初めの１２７アミノ酸（図１を参照されたし）認識し、結合すると思われる。好ましい抗体は、ＰＳ１（配列番号８）のアミノ末端の少なくとも一部分（アミノ酸１〜１２７）に含まれる、少なくとも５個の連続したアミノ酸のエピトープを認識すると思われる。本発明の好ましい実施形態において、抗体は、少なくともアミノ酸１〜５、２〜６、３〜７、４〜８、５〜９、６〜１０、７〜１１、８〜１２、９〜１３、１０〜１４、１１〜１５、１２〜１６、１３〜１７、１４〜１８、１５〜１９、１６〜２０、１７〜２１、１８〜２２、１９〜２３、２０〜２４、２１〜２５、２２〜２６、２３〜２７、２４〜２８、２５〜２９、２６〜３０、２７〜３１、２８〜３２、２９〜３３、３０〜３４、３１〜３５、３２〜３６、３３〜３７、３４〜３８、３５〜３９、３６〜４０、３７〜４１、３８〜４２、３９〜４３、４０〜４４、４１〜４５、４２〜４６、４３〜４７、４４〜４８、４５〜４９、４６〜５０、４７〜５１、４８〜５２、４９〜５３、５０〜５４、５１〜５５、５２〜５６、５３〜５７、５４〜５８、５５〜５９、５６〜６０、５７〜６１、５８〜６２、５９〜６３、６０〜６４、６１〜６５、６２〜６６、６３〜６７、６４〜６８、６５〜６９、６６〜７０、６７〜７１、６８〜７２、６９〜７３、７０〜７４、７１〜７５、７２〜７６、７３〜７７、７４〜７８、７５〜７９、７６〜８０、７７〜８１、７８〜８２、７９〜８３、８０〜８４、８１〜８５、８２〜８６、８３〜８７、８４〜８８、８５〜８９、８６〜９０、８７〜９１、８８〜９２、８９〜９３、９０〜９４、９１〜９５、９２〜９６、９３〜９７、９４〜９８、９５〜９９、９６〜１００、９７〜１０１、９８〜１０２、９９〜１０３、１００〜１０４、１０１〜１０５、１０１〜１０５、１０２〜１０６、１０３〜１０７、１０４〜１０８、１０５〜１０９、１０６〜１１０、１０７〜１１１、１０８〜１１２、１０９〜１１３、１１０〜１１４、１１１〜１１５、１１２〜１１６、１１３〜１１７、１１４〜１１８、１１５〜１１９、１１６〜１２０、１１７〜１２１、１１８〜１２２、１１９〜１２３、１２０〜１２４、１２１〜１２５、１２２〜１２６、１２３〜１２７、１２４〜１２８、１２５〜１２９、１２６〜１３０、又は１２７〜１３１を認識する。

別の実施形態において、特異的結合剤はＰＳ１に対する特異的結合活性を有する低分子を含む。好ましい実施形態において、該低分子はＰＳ２のＮ末端部分に対してＰＳ１のＮ末端部分に特異的に結合する。

様々な実施形態において、本発明は、ＰＳ２含有γ−セクレターゼに対してＰＳ１含有γ−セクレターゼを優先的に阻害する特異的結合剤の特定及び／又は公知の特異的結合剤の新規な使用（即ち、ＰＳ２含有γ−セクレターゼに対するＰＳ１含有γ−セクレターゼの優先的阻害）の特定のための方法を提供する。本発明の方法で特定された化合物は、当業者には公知である標準的な有機合成技術を使用して製造できる。

本発明は、本発明の結合剤を含む医薬組成物、このような結合剤を使用してアルツハイマー病を治療する方法、このような結合剤を使用してＰＳ２含有γ−セクレターゼに対してＰＳ１含有γ−セクレターゼを選択的に阻害する方法を、更に提供する。

一態様において、本発明はプレセニリン２含有γ−セクレターゼに対してプレセニリン１含有γ−セクレターゼを優先的に阻害する化合物を提供する。一実施形態において、本発明は、ＰＳ１に特異的に結合することによって、プレセニリン２含有γ−セクレターゼに対してプレセニリン１含有γ−セクレターゼを優先的に阻害する化合物を含む。該化合物がＰＳ１のＮ末端部分に結合することが好ましく、ＰＳ１のＮ末端の１〜１２７アミノ酸の少なくとも一部分に結合することが最も好ましい。

ある実施形態において、本発明は、ＰＳ１を優先的に阻害できる化合物を特定する方法を提供する。一実施形態において、該方法は、試験化合物を、プレセニリン１を発現するがプレセニリン２を発現しない第１の形質移入ダブルノックアウト細胞（以後「第１細胞型」）及びプレセニリン２を発現するが、プレセニリン１を発現しない第２の形質移入ダブルノックアウト細胞（以後「第２細胞型」）と共に個別にインキュベートするステップと、Ａβ１−ｘ（Ａβ１−ｘは、Ａβ１−２３より長い、Ａβ３８、Ａβ４０及びＡβ４２を含む任意のＡβペプチドを表す）の量を各細胞系において測定するステップと、各細胞系におけるＡβ１−ｘの量を使用してＥＣ_５０を算出するステップと、プレセニリン２含有γ−セクレターゼに対してプレセニリン１含有γ−セクレターゼを優先的に阻害する化合物を特定するステップとを含む。本発明の化合物は、第１細胞型に関して算出されたＥＣ_５０値が、第２細胞型に関して算出されたＥＣ_５０値より小さい場合、プレセニリン２含有γ−セクレターゼに対してプレセニリン１含有γ−セクレターゼを優先的に阻害する。本発明の化合物は、ＰＳ２に対してＰＳ１を、少なくとも３〜５倍阻害することが好ましい。更により好ましくは、該化合物はＰＳ２に対してＰＳ１を５〜１０倍阻害する。更により好ましくは、該化合物はＰＳ２に対してＰＳ１を１０〜１５倍、更により好ましくは１５〜２０倍阻害する。更になお一層より好ましくは、該化合物はＰＳ２に対してＰＳ１を、２０倍を超えて阻害する。該方法を同じ様式で使用して、ＰＳ２活性に対してＰＳ１活性を優先的に阻害する本発明の抗体を更に特定でき、試験する抗体を試験化合物の代わりに使用する。

他の実施形態において、ＰＳ１を阻害する化合物及び抗体は、以下の実施例において記載したようにプレセニリンのキメラを使用して特定できる。特定の実施形態において該方法は、ＰＳ１のＮ末端部分に構築されたプレセニリンのキメラと、試験化合物又は抗体とを接触させるステップと、前記キメラの相対活性を測定するステップとを含む。本方法の限定されない実施例を、以下の実施例１〜３に記載する。ＰＳ１のＮ末端部分は、配列番号７（ＰＳ１のアミノ酸１〜７０）、配列番号８（ＰＳ１のアミノ酸１〜１２７）に示したアミノ酸配列、或いは配列番号７又は配列番号８の任意の一部分であってよい。

Ｃ．ＰＳ１特異的結合剤の特定方法
細胞におけるＡβ４０及び／又はＡβ４２の量を測定できる、当分野で公知の任意の型の試験を、化合物がＰＳ２に対してＰＳ１（特に、ＰＳ１のＮ末端）と特に結合するかどうかを確定するために使用できる。一実施形態において、該試験は任意の型の結合試験であり、好ましくは免疫結合試験である。このような免疫結合試験は当分野では公知である（例えば、Ａｓａｉ編、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＶｏＬ３７、「細胞生物学における抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）を参照されたし）。免疫結合試験は通常捕捉剤を使用し、検体である標的抗原に特異的に結合し、多くの場合固定化する。捕捉剤は、検体に特異的に結合する成分である。本発明の一実施形態において、捕捉剤は、Ａβに特異的に結合する抗体又はその断片である。捕捉剤は、Ａβの４０個のアミノ酸残基中に位置するエピトープに特異的に結合する、抗体又はその断片である。好ましい実施形態において、捕捉剤は、Ａβの初めの２３個のアミノ酸残基（即ち、Ａβ１〜２３）中に位置するエピトープに特異的に結合する、抗体又はその断片である。

免疫結合試験はしばしば、捕捉剤及び抗原により形成される結合複合体の存在をシグナル伝達する、標識剤を使用する。標識剤は、結合複合体を含む分子の１つであってよい、即ち、標識された特異的結合剤又は標識された抗特異的結合剤抗体であってよい。或いは標識剤は、結合複合体に結合する第３の分子、一般には別の抗体であってよい。標識剤は、例えば標識を有する抗特異的結合剤抗体であってよい。結合複合体に特異的な第２の抗体は、標識を持たないこともあるが、第２の抗体をメンバーとする抗体種に特異的な、第４の分子と結合できる。例えば第２の抗体は、ビオチンなどの検出可能な成分により修飾でき、これをその後酵素で標識されたストレプトアビジンなどの、第４の分子と結合できる。タンパク質Ａ又はタンパク質Ｇなどの、免疫グロブリン不変領域と特異的に結合できる他のタンパク質もまた、標識剤として使用できる。これらの結合タンパク質は、連鎖球菌の細胞壁の普通の構成要素であり、様々な種由来の免疫グロブリン不変領域に対して強い非免疫原性反応性を示す（例えば、Ａｋｅｒｓｔｒｏｍ、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３５：２５８９〜２５４２（１９８５）及びＣｈａｕｂｅｒｔ、Ｍｏｄ Ｐａｔｈｏｌ、１０：５８５〜５９１（１９９７）を参照されたし）。本発明の一実施形態において、標識剤はＡβの初めの２３個のアミノ酸残基（Ａβ１〜２３）と特異的に結合する抗体又はその断片を含む。好ましい実施形態において、標識剤はＡβの初めの３個のアミノ酸残基（即ち、Ａβ１〜３）中に位置するエピトープと特異的に結合する抗体又はその断片を含む。本発明の一実施形態において、標識剤はＡβの初めの２３個のアミノ酸残基（Ａβ１〜２３）と特異的に結合する抗体又はその断片を含む。好ましい実施形態において、標識剤はＡβの初めの３個のアミノ酸残基（即ち、Ａβ１〜３）中に位置するエピトープと特異的に結合する抗体又はその断片を含む。

試験の間を通して、薬剤を組み合わせるごとに、その後インキュベートする及び／又は洗浄するステップが必要と思われる。インキュベートするステップは、約５秒〜数時間まで変更可能であり、約５分〜約２４時間までが好ましい。しかし、インキュベートする時間は、試験のフォーマット、検体、溶液の容量、濃度などに依存するであろう。普通、試験は周囲温度において実施するが、ある範囲の温度にわたって実施可能である。

γ−セクレターゼの仲介によるＡＰＰの切断の阻害を実証する試験は、限定されない例であるＫａｎｇら、１９８７、Ｎａｔｕｒｅ ３２５：７３３〜６により述べられた６９５アミノ酸の「正常」なアイソタイプ、Ｋｉｔａｇｕｃｈｉら、１９８１、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：５３０〜５３２により述べられた７７０アミノ酸アイソタイプ並びにスウェーデン変異（ＫＭ６７０−１ＮＬ）（ＡＰＰｓｗｅ）、ロンドン変異（Ｖ７１７６Ｆ）などの変異体を含む、ＡＰＰの公知の形態のいずれかを使用できる。例えば、米国特許第５，７６６，８４６号及びＨａｒｄｙ、１９９２、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．１：２３３〜２３４を、公知の突然変異体の再検討に関して参照されたし。更なる有用な基質は、二塩基性アミノ酸改変体、例えば国際公開番号ＷＯ００／１７３６９に開示されたＡＰＰ−ＫＫ、ＡＰＰの断片及びγ−セクレターゼ切断部位を含む合成ペプチド、例えば米国特許第５，４４１，８７０号、５，６０５，８１１号、５，７２１，１３０号、６，０１８，０２４号、５，６０４，１０２号、５，６１２，４８６号、５，８５０，００３号及び６，２４５，９６４号に記載のような、野生型（ＷＴ）又は突然変異体、例えばＡＰＰｓｗｅを含む。

ある実施形態において、ＡＰＰの形態をコードするｃＤＮＡを、プレセニリン１及び／又はプレセニリン２ノックアウト線維芽細胞を作製するための、本明細書中に開示の高効率形質移入法によって、細胞系に形質移入できる。簡潔に言うと、プレセニリン１／プレセニリン２ノックアウト線維芽細胞の高効率形質移入は、ＡＰＰｓｗｅのｃＤＮＡ（例えば、図４における配列番号６のタンパク質をコードするｃＤＮＡ）及びプレセニリン１のｃＤＮＡ又はプレセニリン２のｃＤＮＡのどちらかを、エレクトロポレーション（Ａｍａｘａ，Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）により、又はＧｅｎｅＰｏｒｔｅｒ２（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用することにより、同時に又は連続してのどちらかで導入することにより達成できる。プレセニリン１又はプレセニリン−２のどちらかを発現する、プレセニリン１／プレセニリン２ノックアウト線維芽細胞を、その後プレセニリン２含有γ−セクレターゼに対してプレセニリン１含有γ−セクレターゼを優先的に阻害する化合物の特定に使用できる。ＡＰＰｓｗｅの配列を開示し、参照としてその全体を本明細書に組み込む、Ｍｕｌｌａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９２）；１：３４５〜３４７もまた参照されたし。

１．非競合的結合試験
免疫結合試験は、非競合型であってよい。これらの試験は、直接測定される、一定量の捕捉検体を有する。例えば、１つの好ましい「サンドウィッチ」試験において、捕捉剤（抗体）は、固定先である固体基質に直接結合できる。これらの固定化抗体は、その後試験試料中に存在する抗原を捕捉（と結合）する。このように固定化されたタンパク質は、その後標識剤、標識を有する第２の抗体などと結合する。別の企図される「サンドウィッチ」試験において、第２の抗体は標識を欠いているが、第２の抗体が由来する種の抗体に特異的な標識抗体と結合できる。第２の抗体はまたビオチンなどの検出可能な成分を用いて修飾でき、この成分がストレプトアビジンなどの第３の標識分子に特異的に結合できる。（参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、「抗体、実験室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、Ｃｈ １４、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮＹ（１９８８）を参照されたし）。

２．競合的結合試験
免疫結合試験は競合型であってよい。試料中に存在する検体の量を、試料中に存在する検体と置き換えられた、試料中に存在する検体と競合し、捕捉剤から離れた加えられた検体の量を測定することによって、間接的に測定する。１つの好ましい競合結合試験において、既知量の検体（普通は標識してある）を試料に加え、その後試料を抗体（捕捉剤）に接触させる。抗体に結合した標識検体の量は、試料中に存在する検体の濃度に反比例する。（Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、「抗体、実験室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｈ １４、ｐｐ．５７９〜５８３、上記を参照されたし）。

別の企図された競合結合試験において、抗体は固体基質に固定化する。抗体に結合したタンパク質の量は、タンパク質／抗体複合体に存在するタンパク質の量を測定すること、又は複合体を形成しない残りのタンパク質の量を測定することのどちらかによって測定できる。タンパク質の量は、標識タンパク質を提供することによって検出できる。（Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、「抗体、実験室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｈ １４、ｐｐ．５７９〜５８３、上記を参照されたし）。

更に別の企図された競合結合試験において、ハプテン阻害を利用する。ここで、公知の検体を固体基質に固定化する。既知量の抗体を試料に加え、試料を固定化された検体に接触させる。固定化検体に結合した抗体の量は、試料中に存在する検体の量に反比例する。固定化抗体の量は、抗体の固定化画分又は溶液中に残存する画分のどちらかを検出することによって検出できる。上記のように、抗体が標識されている場合は直接検出でき、又は抗体に特異的に結合する標識成分を、後から加えることによって間接的に検出できる。

３．競合結合試験の利用
競合結合試験は、交差反応の確定に使用でき、当業者に、本発明の特異的結合剤により認識されるタンパク質又は酵素の複合体が所望のタンパク質であり、交差反応をしない分子であるかの確定、又は抗体が抗原に特異的であり、関連のない抗原と結合しないかどうかの確定を可能にする。この型の試験において、抗原は固体の支持体に固定化でき、特異的結合剤の固定化タンパク質に対する結合と競合すると思われる、未知のタンパク質混合物を試験に加える。競合分子もまた、該抗原とは関連のない１種又は複数種の抗原と結合する。固定化抗原に対する特異的結合剤／抗体の結合と競合するタンパク質の能力を、固体支持体に固定化された同じタンパク質による結合と比較し、タンパク質混合物の交差反応性を確定する。

４．他の結合試験
Ａβ特異的抗体の使用を必要としない、Ａβ及びＡβの断片を検出する他の非免疫技術もまた用いることができる。例えば、二次元ゲル電気泳動を用いて、液体試料中に存在する密接に関係がある可溶性タンパク質を分離できる。Ａβを含む、ＡＰＰの多くの断片と交差反応性の抗体を、その後ゲルの探索に使用でき、Ａβのゲル上の正確な位置に基づきその存在を特定できる。培養細胞の場合、細胞タンパク質を代謝的に標識し、場合により最初の分離ステップとして免疫沈降を用いて、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離できる。

本発明はまた、試料中のＡβの存在を検出又は定量化するためのウェスタンブロット法を提供する。該技術は、分子量に基づきゲル電気泳動により試料タンパク質を分離するステップと、タンパク質をニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター又は誘導体化ナイロンフィルターなどの適切な固体支持体に転写するステップとを、一般的に含む。試料を、Ａβと特異的に結合する抗体又はその断片と共にインキュベートし、得られた複合体を検出する。これらの抗体は直接標識でき、又は抗体に特異的に結合する標識抗体を使用して、後で検出できる。

Ｄ．ＰＳ１特異的結合剤の有効性の確定試験
一実施形態において、本発明の方法はＡβに対する特異的結合剤を含む。好ましい実施形態において、該方法はＡβに対する少なくとも１種の抗体、より好ましくはＡβに対する少なくとも２種の抗体を含む。該方法がＡβに対する少なくとも２種の抗体を含む場合、１種の抗体は「捕捉」分子として作用し、一方他の抗体は検出分子又は「標識された」分子として作用することが好ましい。ある実施形態において、捕捉抗体は、アミノ酸配列のＮ末端部分に位置する、Ａβのエピトープを認識できる（図３を参照されたし）。より詳細には、捕捉抗体がＡβのアミノ酸１〜２３内のエピトープを認識することが好ましい。

ＡＰＰの切断による特徴的産物を、例えばＰｉｒｔｔｉｌａら、１９９９、Ｎｅｕｒｏ Ｌｅｔｔ．２４９：２１〜４、及び米国特許第５，６１２，４８６号（両方とも参照によりその全体を組みこむ）に記載の抗体などの、多様な抗体を使用した免疫試験により測定できる。Ａβの検出に有用な抗体には、例えばＡβペプチドのアミノ酸１〜１６上のエピトープを特異的に認識する、モノクロナール抗体６Ｅ１０（Ｓｅｎｅｔｅｋ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）；それぞれヒトＡβ１−４０及び１−４２に特異的である、抗体１６２及び１６４（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｓｔａｔｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂａｓｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔａｔｅｎ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）；及び米国特許第５，５９３，８４６号に記載の、残基１６から１７の部位である、β−アミロイドペプチドの結合領域を認識する抗体が挙げられる。ＡＰＰの残基５９１〜５９６の合成ペプチドに対して産生された抗体及びスウェーデン変異体の５９０〜５９６に対して産生されたＳＷ１９２抗体は、米国特許第５，６０４，１０２号及び５，７２１，１３０号に記載のように、ＡＰＰ及びその切断産物の免疫試験においてもまた有用である。

Ｅ．抗体の調製
ある実施形態において、本発明はＰＳ１のＮ末端部分に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、本明細書中に記載の従来の技術を使用して作製可能である。本発明の抗体の作製に適切な抗原（本明細書中では「免疫原」とも称する）は、上に記載する。

Ａβに特異的な抗体は、アミノ酸残基１３〜２８からなる結合領域、約アミノ酸残基２９〜４２又は４３からなるＣ末端及びアミノ酸残基１〜１６からなるアミノ末端などの所望の標的エピトープを含む、適切な抗原又はハプテンに対して調製できる。

都合の良いことに、抗体調製用の合成ペプチドは、適切な免疫原に結合した従来の固相技術によって調製でき、従来技術による抗血清又はモノクロナール抗体の調製に使用できる。適切なペプチドハプテンはＡβ内に通常少なくとも５個の連続した残基を含むと思われ、６残基より多くを含み得る。

合成ポリペプチドハプテンは、アミノ酸を成長鎖に連続的に加える、周知のメリーフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）の固相合成技術によって作製できる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９〜２１５６）。アミノ酸配列は、上で説明したβＡＰの配列に基づいてよい。

十分量のポリペプチドハプテンが一度得られたら、それを、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニンなどの適切な免疫原性担体又は、その開示を参照により本明細書に組み込む、Ｈｕｄｓｏｎ ａｎｄ Ｈａｙ、「実践免疫学（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｃｈａｐｔｅｒ １．３、１９８０に一般的に記載されたような他の適切なタンパク質担体に接合できる。有用である例示的免疫原担体はαＣＤ３κ抗体である（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｃｌｏｎｅ Ｎｏ．１４５−２Ｃ１１）。

十分量の免疫原が一度得られたら、所望のエピトープに特異的な抗体をインビトロ又はインビボの技術により作製できる。インビトロ技術は、リンパ球の免疫原への暴露を含み、一方インビボ技術は適切な脊椎動物宿主に免疫原を注射することが必要である。適切な脊椎動物宿主は、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギなどを含む、非ヒトである。免疫原を、所定のスケジュールに従って動物に注射し、動物を定期的に出血させ、連続した出血により力価及び特異性が改善される。注射は、筋肉、腹腔内、皮下などに実施でき、フロインドの不完全アジュバント（ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ）などのアジュバントを用いることができる。

所望により、所望の特異性を有する抗体を産生できる固定化細胞系を調製することによって、モノクロナール抗体を得ることができる。このような固定化細胞系は、様々な方法で作製できる。都合の良いことに、マウスなどの小型脊椎動物は、今記載した方法により所望の免疫原を用いて高度に免疫化される。その後、脊椎動物を殺し（普通は最終免疫化の数日後）、脾臓細胞を取り外し、脾臓細胞を固定化する。固定化の方法は重要ではない。本発明において有用なモノクロナール抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ４：７２（１９８３）；Ｃｏｔｅら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ）８０：２０２６〜２０３０（１９８３）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、「モノクロナール抗体作製技術及び適用（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、ｐｐ ５１〜６３、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｃｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、（１９８７））及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（ＥＢＶ−ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）（Ｃｏｌｅ ら、「モノクロナール抗体及び癌治療（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ）」、Ａｌａｎ Ｒ Ｌｉｓｓ Ｉｎｃ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｎ．Ｙ．、ｐｐ ７７〜９６、（１９８５））に記載されたようなハイブリドーマ法により作製できる。

ハイブリドーマ技術を用いる場合、骨髄腫細胞系が使用できる。ハイブリドーマ作製融合手順における使用に適したこのような細胞系は、非抗体産生であり、高融合効率を有し、所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの成長を支持する特定の選択培地において、それらを成長できない状態にする酵素を欠いていることが好ましい。例えば、マウスの融合に使用した細胞系はＳｐ−２０、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ４１、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ１．７及びＳ１９４／５ＸＸ０Ｂｕｌ；ラットの融合に使用した細胞系はＲ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ１．２．３、ＩＲ９８３Ｆ及び４Ｂ２１０である。細胞融合に有用な他の細胞系は、Ｕ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２及びＵＣ７２９−６である。モノクロナール抗体を産生するハイブリドーマ及び他の細胞系は、本発明の新規な組成物であることを企図される。

ファージディスプレイ法もまた、モノクロナール抗体を任意の種から作製するために使用できる。この技術を、一本鎖Ｆａｂ又はＦｖ抗体断片をコードするポリヌクレオチドがファージ粒子の表面上で発現する、完全ヒトモノクロナール抗体の作製に使用することが好ましい（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２２：５８１（１９９１）；米国特許第５，８８５，７９３号もまた参照されたし）。各ファージを本明細書中に記載した結合試験を使用して「スクリーニング」し、Ａβに親和性を有するそれらの抗体断片を特定できる。したがって、これらの方法は、線維状バクテリオファージの表面上の抗体断片レパートリーの提示を介した免疫選択及び続いてそれらがＡβに結合することによるファージの選択を模倣する。このような手順の１つが、Ａｄａｍｓらの名前で提出されたＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／１７３６４に記載されており、この出願は、このような手法を使用する、高親和性で機能的な、ＭＰＬ−及びｍｓｋ−受容体に対するアゴニスト抗体断片の単離を記載している。このアプローチにおいて、ヒト抗体遺伝子の完全レパートリーを、先に述べたように末梢血リンパ球から天然に再構成されたヒトＶ遺伝子のクローン化により作成できる（Ｍｕｌｌｉｎａｘら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ）８７：８０９５〜８０９９（１９９０））。モノクロナール抗体を調製する具体的な技術は、「抗体：実験室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８、に記載されており、その全開示を参照により本明細書に組み込む。

モノクロナール抗体及びポリクロナール抗体（抗血清）に加えて、本発明の検出技術は、Ｆ（ａｂ）、Ｆｖ、Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈなどの抗体断片及び他の断片も使用できるであろう。しかし、ポリクロナール抗体の使用において、単一特異的抗体群を作製するために、標的エピトープに対する抗血清を吸着する必要があると思われる。現在特許文献及び科学文献によく記載されているように、組み換え的に作製された抗体（免疫グロブリン）及びこれらの変異体を用いることも可能であると思われる。例えば、欧州出願番号ＥＰＯ８４３０２６８．０、ＥＰＯ８５１０２６６５．８、ＥＰＯ８５３０５６０４．２、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ８５／００３９２、欧州出願番号ＥＰＯ８５１１５３１１．４、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８６／００２２６９及び日本出願番号８５２３９５４３を参照されたし。これらの開示を、参照により本明細書に組み込む。今記載したように調製した抗体の結合特異性を模倣するであろう、他の組換えタンパク質の調製も可能であろう。

Ｆ．ノックアウト細胞の作製
本発明に使用できる細胞型は、天然発生的又は人工的のどちらかで構築された、プレセニリン１を発現するがプレセニリン２は発現しない、又はプレセニリン−２を発現するがプレセニリン１は発現しない任意の細胞型を含む。一実施形態において細胞型は、プレセニリン１及びプレセニリン２のダブルノックアウト遺伝型を含む細胞から構築する。公知の方法又は本明細書に開示した方法を使用して、当業者はこのようなダブルノックアウト細胞に、プレセニリン１又はプレセニリン２のどちらかをコードするｃＤＮＡを形質転換／形質移入でき、プレセニリン１を発現するがプレセニリン２は発現しない、又はプレセニリン２を発現するがプレセニリン１は発現しない細胞型、並びにγ−セクレターゼ基質をコードするｃＤＮＡを、連続して又は同時のどちらかで構築できる。組換え核酸技術、遺伝子操作（即ち、ノックアウト株の作製）及び細胞形質転換／形質移入の任意の公知の方法を使用でき、並びに本明細書に詳細に記載した方法も使用できる。

本発明のある実施形態において、ＰＳ１／ＰＳ２ノックアウト細胞を、Ａｎ Ｈｅｒｒｅｍａｎら、「プレセニリン欠損胚幹細胞におけるγ−セクレターゼ活性の全不活性化（Ｔｏｔａｌ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｇａｍｍａ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）」Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２、４６１〜４６２（２０００）（参照によりその全体を本明細書に組み込む）に記載のように作製する。マウスの線維芽細胞は、Ａｎ Ｈｅｒｒｅｍａｎら、「プレセニリン２の欠損は軽い肺表現型を引き起こし、アミロイド前駆体タンパク質のプロセッシングに変化はないが、プレセニリン１欠損の胚致死表現型を増強する（Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ ２ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｃａｕｓｅｓ ａ ｍｉｌｄ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ａｎｄ ｎｏ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｂｕｔ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｌｅｔｈａｌ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｏｆ ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ １ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）」、ＰＮＡＳ １９９９；９６：１１８７２〜１１８７７（参照によりその全体を本明細書に組み込む）に記載のようなノックアウト細胞系に由来する。ノックアウト細胞系の作製は当業者には公知であり、例えば米国特許出願第１０／０８２，８０４号（参照によりその全体を本明細書に組み込む）に記載されている。本発明の好ましい実施形態において、第１細胞型は、プレセニリン１ｃＤＮＡを含むベクターを形質移入したプレセニリン１／プレセニリン２ダブルノックアウト細胞系であり、第２細胞型は、プレセニリン２を含むベクターを形質移入したプレセニリン１／プレセニリン２ダブルノックアウト細胞系である。１種の適切なベクター及び実施例において詳しく述べる例示的実施形態のために選択されたベクターはｐＣＦであり、これを、アデノウィルス三分節系リーダー配列を、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｉｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてＣＭＶプロモーターとＥｃｏＲ１部位との間に挿入することによって、修飾した（Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ Ｌら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ（１９８７）６１：１２１３〜１２２０を参照されたし）。

他の態様において、本発明はプレセニリン２含有γ−セクレターゼに対してプレセニリン１含有γ−セクレターゼを優先的に阻害する化合物、このような化合物を含む医薬組成物、このような化合物を使用してアルツハイマー病を治療する方法及びこのような化合物を使用してＰＳ２含有γ−セクレターゼに対してＰＳ１含有γ−セクレターゼを選択的に阻害する方法を提供する。

したがって、一態様において、本発明はプレセニリン２含有−γ−セクレターゼに対してプレセニリン１含有γ−セクレターゼを優先的に阻害する化合物に関する。一実施形態において、プレセニリン２含有−γ−セクレターゼに対してプレセニリン１含有γ−セクレターゼを優先的に阻害する化合物は、本発明の試験方法、例えば化合物と共に、プレセニリン１を発現するがプレセニリン２は発現しない、第１の形質移入ダブルノックアウト細胞（以降「第１細胞型」）及びプレセニリン２を発現するがプレセニリン１は発現しない第２の形質移入ダブルノックアウト細胞（以降「第２細胞型」）を別々にインキュベートするステップと、各細胞系におけるＡβ１−ｘの量を測定するステップと、各細胞系におけるＡβ１−ｘの量を使用してＥＣ５０を算出するステップと、プレセニリン２含有γ−セクレターゼに対してプレセニリン１含有γ−セクレターゼを優先的に阻害する化合物を特定するステップとにより、特定される。一実施形態において、第１細胞型に関して算出されたＥＣ_５０値が、第２細胞型に関して算出されたＥＣ_５０値より小さい場合、本発明の化合物はプレセニリン２含有γ−セクレターゼに対してプレセニリン１含有−γ−セクレターゼを優先的に阻害する。本発明の化合物が、ＰＳ２に対してＰＳ１を、少なくとも３〜５倍阻害することが好ましい。更により好ましくは、該化合物はＰＳ２に対してＰＳ１を５〜１０倍阻害する。更により好ましくは、該化合物はＰＳ２に対してＰＳ１を１０〜１５倍、更により好ましくは１５〜２０倍阻害する。更になお一層より好ましくは、該化合物はＰＳ２に対してＰＳ１を、２０倍を超えて阻害する。

別の実施形態において、本発明の化合物はスルホンアミド官能基を含む。好ましい実施形態において、本発明の化合物は、スルホンアミド系のγ−セクレターゼ阻害剤から選択される。したがって、様々な実施形態において本発明は、ＰＳ２含有γ−セクレターゼに対してＰＳ１含有γ−セクレターゼを優先的に阻害する新規な化合物の特定及び／又は新規な使用（即ち、ＰＳ２含有γ−セクレターゼに対するＰＳ１含有γ−セクレターゼの優先的阻害）のための公知の化合物の特定を提供する。このような任意の化合物は、商業的供給源から購入しても、及び／又は当業者に公知の標準的有機合成技術を使用して作製しても、どちらでもよい。

Ｇ．治療方法
ある実施形態において、本発明は上記の特異的結合剤を、医薬として許容される塩、媒体、担体、希釈剤及び／又はアジュバントと組み合わせて含む組成物を提供する。

本発明の組成物は、経口、経腸、非経口（ＩＶ、ＩＭ、デポーＩＭ、ＳＱ及びデポーＳＱ）、舌下、鼻空内（吸入）、髄腔内、局所的又は直腸内に投与できる。当業者に公知の剤形が、本発明の特異的結合剤の送達に適切である。

本発明の特異的結合剤の治療有効量を含む組成物を提供する。特異的結合剤は、経口投与用の錠剤、カプセル又はエリキシル剤、或いは非経口投与用の殺菌した溶液又は懸濁液などの適切な医薬調製品に処方することが好ましい。通常、上記の特異的結合剤は、当分野で周知の技術及び手順を使用して、医薬組成物に処方する。

約１〜５００ｍｇの、本発明の特異的結合剤の化合物又は混合物或いは生理学的に許容される塩又はエステルを、生理学的に許容される媒体、担体、賦形剤、結合剤、保存料、安定剤、香味料などと、許容された医薬の実践により必要とされる単位剤形中に組み合わせる。それらの組成物又は調製品中の活性物質の量は、表示した範囲の適切な用量が得られるほどである。組成物は好ましくは単位剤形中に処方され、各用量は約２〜約１００ｍｇ、より好ましくは約１０〜約３０ｍｇの活性成分を含む。「単位剤形」という用語は、ヒト対象及び他の哺乳動物の単位用量として適切な、物理的に分離した単位を指し、各単位は所望の治療効果を生み出すために算出された、所定量の活性材料を、適切な医薬賦形剤と併せて含む。

組成物の調製のために、１種又は複数種の本発明の特異的結合剤を適切な医薬として許容される担体と混合する。化合物の混合又は添加に際して、得られた混合物は溶液、懸濁液、乳剤などであってよい。リポソーム懸濁液もまた医薬として許容される担体として適切であると思われる。これらは当業者に公知の方法に従って調製できる。得られた混合物の形態は、意図する投与様式及び選択した担体又は媒体における化合物の溶解度を含む、多くの要因に依存する。有効濃度は、治療される疾患、障害又は病態の少なくとも１つの症状を軽減させる又は改善するために十分であり、実験的に確定できる。

本明細書で提供される特異的結合剤の投与に適切な医薬担体又は媒体は特定の投与様式に適切であり、当業者に公知の任意のこのような担体を含む。更に、活性材料もまた、所望の作用を損なわない他の活性材料、或いは所望の作用を補足する又は別の作用を有する材料と混合できる。特異的結合剤は、組成物中の単一の医薬活性成分として処方でき、又は他の活性成分と併用もできる。

特異的結合剤の溶解度が不十分である場合、可溶化する方法を使用できる。このような方法は公知であり、限定するものではないが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のような共溶媒の使用、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）のような界面活性剤の使用、及び重炭酸ナトリウム水溶液への溶解を含む。塩又はプロドラッグなどの特異的結合剤の誘導体はまた、有効な医薬組成物の処方に使用できる。

化合物の濃度は、化合物を投与する目的である障害の、少なくとも１つの症状を軽減させる又は改善する投与量の送達に有効である。通常、組成物は単回投与用に処方する。

本発明の特異的結合剤は、それらが体から迅速に放出されることを防止する担体、例えば持続放出型製剤又はコーティングなどと共に調製できる。このような担体は、放出制御製剤、例えば限定するものではないが、マイクロカプセル化送達系を含む。治療対象に望ましくない副作用を起こさずに、治療的に有用な効果を発揮するために十分な量の活性化合物を、医薬として許容される担体に包含させる。治療的有効濃度は、公知のインビボ及びインビトロのモデル系において、治療する障害に関して特異的結合剤を試験することによって実験的に確定できる。

本発明の特異的結合剤及び組成物は、複数回投与又は単回投与用の容器に封入できる。封入した特異的結合剤及び組成物は、例えば組み立てて使用できる部品を含むキットで提供できる。例えば、凍結乾燥形態の化合物阻害剤と、適切な希釈剤とを、使用前に組み合わせるための分離した成分として提供できる。キットは、化合物阻害剤及び共投与用の第２の治療薬を含み得る。阻害剤及び第２の治療薬は、分離した成分として提供できる。キットは、複数の容器を含むことができ、各容器は本発明の化合物の１つ又は複数の単位用量を保持する。容器は、所望の投与様式に合わせることが好ましく、限定するものではないが、経口投与用には錠剤、ゲルカプセル、持続放出カプセルなど、非経口投与用には、デポー製剤、プレフィルドシリンジ、アンプル、バイアルなど、局所投与用にはパッチ、メディパッド、クリームなどを含む。

薬剤組成物中の活性化合物の濃度は、活性化合物の吸着、不活性化及び排出の比率、投与計画及び投与量並びに当業者に公知の他の要因に依存するであろう。

活性成分は、一回で投与してもよく、又は時間の間隔をあけて投与すべき多数の少用量に分割してもよい。正確な容量及び治療期間は治療する疾患の関数であり、公知の試験プロトコルを使用して実験的に、或いはインビボ又はインビトロの試験データから補外法によって確定できると理解するべきである。濃度及び用量の値は、軽減されるべき病態の重篤性によってもまた変更可能であることに留意されるべきである。任意の特定の対象に関して、特定の用法用量は個人の必要性及び投与する、又は組成物の投与を管理する人の専門的な判断に従って、時間と共に調整すべきであること、並びに本明細書中に説明した濃度範囲は単なる例示であり、特許請求する組成物の範囲又は実践を限定するつもりではないことを更に理解すべきである。

経口投与を望む場合、化合物は、胃の酸性環境から化合物が保護されるような組成物中に提供されるべきである。例えば、組成物はその完全性を胃の中で維持し、活性化合物を腸内で放出する腸溶性コーティングで処方できる。組成物はまた、制酸剤又は他のこのような成分と併用して処方できる。

経口組成物は、一般に不活性な希釈剤又は食用の担体を含み、錠剤に固めたり、又はゼラチンカプセルに封入したりできる。経口投与治療の目的で、活性特異的結合剤（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｇｅｎｔ又はｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）は、賦形剤に組み込むことができ、錠剤、カプセル又はトローチの形態で使用できる。医薬として混合可能な結合剤及びアジュバント材料も、組成物の一部として含み得る。

錠剤、ピル、カプセル、トローチなどは、任意の以下の成分又は性質の似通った特異的結合剤を含むことができる：限定するものではないが、トラガカントガム、アカシア、コーンスターチ又はゼラチンなどの結合剤、微結晶セルロース、デンプン又は乳糖などの賦形剤、限定するものではないが、アルギン酸及びコーンスターチなどの崩壊剤、限定するものではないが、ステアリン酸マグネシウムなどの滑剤、限定するものではないが、コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤、ショ糖又はサッカリンなどの甘味料並びにペパーミント、サリチル酸メチル又はフルーツの香りなどの香味料。

単位剤形がカプセルの場合、上記の型の材料に加えて、油脂などの流動担体を含むことができる。更に、単位剤形は、単位剤形の物理的形態を修正する様々な他の材料、例えば糖衣及び他の腸溶剤を含むことができる。特異的結合剤はまた、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、オブラート、チューイングガムなどの成分として投与できる。シロップは、活性特異的結合剤に加えて、甘味料としてショ糖及び特定の保存料、染料及び着色料並びに香味料を含むことができる。

活性材料はまた、所望の作用を損なわない他の活性材料又は所望の作用を補足する材料と混合できる。

非経口、皮内、皮下又は局所適用に使用する溶液又は懸濁液は、任意の以下の成分を含むことができる：注射用の水、生理食塩水、固定油、ゴマ油、ココナッツ油、ピーナッツ油、綿実油、などの天然植物油、又はオレイン酸エチルなどの合成脂質媒体、ポリエチレングリコール、グリセリンプロピレングリコール又は他の合成溶媒などの殺菌した希釈剤；ベンジルアルコール及びメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸及び亜硫酸水素ナトリウムなどの酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）なとのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩及びリン酸塩などのバッファー；並びに塩化ナトリウム及びデキストロースなどの張性を修正する薬剤。非経口の製剤は、アンプル、使い捨て注射器又は複数回投与の、ガラス製、プラスチック製又は他の適切な材料で作られたバイアルに封入できる。バッファー、保存料、酸化防止剤などは必要に応じて組み込むことができる。

静脈内投与する場合、適切な担体には生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及びグルコース、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール及びこれらの混合物などの増粘剤及び可溶化剤を含む溶液が挙げられる。組織標的リポソームを含むリポソーム懸濁液もまた、医薬として許容される担体として適切である。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載の公知の方法に従って調製できる。

活性特異的結合剤は、化合物が体から迅速に放出されることを防止する担体、例えば持続放出型製剤又はコーティングなどと共に調製できる。このような担体は、放出制御製剤、例えば限定するものではないが、インプラント及びマイクロカプセル化送達系並びに生分解性、生体適合性のポリマー、例えばコラーゲン、エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル、ポリ乳酸などを含む。このような製剤の調製方法は、当業者には公知である。

本発明の組成物は、経口、非経口（ＩＶ、ＩＭ、デポーＩＭ、ＳＱ及びデポーＳＱ）、舌下、鼻空内（吸入）、髄腔内、局所的又は直腸内に投与できる。当業者に公知の剤形が、本発明の化合物の送達に適切である。

本発明の化合物は、経腸的に又は非経口で投与できる。経口投与する場合、本発明の特異的結合剤は、当業者に周知の経口投与用の普通の剤形で投与できる。これらの剤形は、錠剤及びカプセルの普通の固体単位剤形並びに溶液、懸濁液及びエリキシル剤などの液体剤形を含む。固体剤形を使用する場合、本発明の特異的結合剤を１日に１回又は２回のみ投与する必要があるように、持続放出型であることが好ましい。

経口剤形は１日に１、２、３又は４回、対象に投与することができる。本発明の特異的結合剤は、１日に３回又はそれより少ない回数のどれかで投与することが好ましく、１日に１回又は２回がより好ましい。したがって、本発明の特異的結合剤は経口剤形で投与することが好ましい。経口剤形を使用するならどれであっても、本発明の特異的結合剤を胃の酸性環境から保護するように設計することが好ましい。腸溶性コーティング錠剤は当業者に周知である。更に、酸性の胃から保護するために、それぞれがコーティングされた小球を詰めたカプセルもまた当業者に周知である。

上で述べたように、不斉炭素原子が存在するかどうかに依存して、本発明の特異的結合剤は、異性体の混合物として、ラセミ化合物として、又は純粋な異性体の形態で存在できる。

特異的結合剤の塩は、好ましくは医薬として許容される又は非毒性の塩である。合成目的又は精製目的では、医薬として許容されない塩もまた使用可能である。

ある実施形態において、組成物は当業者に公知の、アルツハイマー病の治療に有効な追加の薬剤を含むことができる。

一態様において、本発明は、本発明の試験方法により特定される有効量の化合物又はこれらの塩を対象に投与するステップを含む、このような治療を必要とする対象におけるアルツハイマー病の治療及び／又は予防方法を提供する。一態様において、対象がアルツハイマー病と診断された場合に、この治療方法が使用できる。別の態様において、この治療方法はアルツハイマー病の発症を防ぐ又は遅らせるのに役立ち得る。別の態様において、この治療方法は、アルツハイマー病の進行を遅くするのに役立ち得る。別の態様において、この治療方法は上記疾患が発現する又は進行することを予防し得る。

この態様の実施形態において、本発明の試験方法により発見された化合物の有効量は、医薬として許容される塩、担体、媒体、アジュバント又は希釈剤を含む組成物中に含まれる。

本発明の方法の好ましい態様において、対象はヒトである。

治療方法は、治療有効量：経口投与用では約０．１ｍｇ／日〜約１０００ｍｇ／日；非経口、舌下、経鼻的、髄腔内投与では約０．５〜約１００ｍｇ／日；デポー投与及びインプラントでは約０．５ｍｇ／日〜約５０ｍｇ／日；局所投与では０．５ｍｇ／日〜約２００ｍｇ／日；直腸投与では約０．５ｍｇ〜約５００ｍｇを用いる。好ましい態様において、経口投与のための治療有効量は約１ｍｇ／日〜約１００ｍｇ／日であり、非経口投与では約５〜約５０ｍｇ／日である。より好ましい態様において、経口投与のための治療有効量は約５ｍｇ／日〜約５０ｍｇ／日である。

別の実施形態において、本発明は、細胞を、プレセニリン２含有γ−セクレターゼに対してプレセニリン１含有γ−セクレターゼを選択的に阻害するために有効であると本発明の試験により特定された化合物に接触させるステップを含む、細胞内でプレセニリン２含有γ−セクレターゼに対してプレセニリン１含有γ−セクレターゼを選択的に阻害する方法を提供する。一実施形態において、該方法はプレセニリン２含有γ−セクレターゼに対してプレセニリン１含有γ−セクレターゼを約３〜５倍阻害する。更により好ましくは、該方法はＰＳ２に対してＰＳ１を約５倍〜約１０倍、更に好ましくは約１０倍〜１５倍、更により好ましくは約１５倍〜約２０倍阻害する。更になおより好ましくは、該方法はＰＳ２に対してＰＳ１を、約２０倍を超えて阻害する。

一実施形態において、細胞は哺乳動物細胞である。好ましい実施形態において、細胞はヒト細胞である。他の実施形態において、細胞は単離哺乳動物細胞であり、好ましくは単離ヒト細胞である。

一実施形態において、このプレセニリン２含有γ−セクレターゼに対してプレセニリン１含有γ−セクレターゼを選択的に阻害する方法は、プレセニリン１含有γ−セクレターゼの活性に関連のある疾患又は障害を有する対象の治療に使用できる。一実施形態において、対象はプレセニリン１含有γ−セクレターゼに関連する疾患又は障害の臨床的兆候をはっきり示す。別の実施形態において、対象はプレセニリン１含有γ−セクレターゼに関連する疾患又は障害と診断される。好ましい実施形態において、疾患及び障害はプレセニリン１含有γ−セクレターゼに関連するが、プレセニリン２含有γ−セクレターゼには関連しない。この方法において有用な特異的結合剤が、本発明の試験によって、このプレセニリン２含有γ−セクレターゼに対するプレセニリン１含有γ−セクレターゼの選択的阻害剤として特定された場合、プレセニリン１含有γ−セクレターゼに関連する疾患及び障害の治療法は、プレセニリン２含有γ−セクレターゼの活性（例えば、ノッチシグナル伝達）に悪影響を与えずに治療できる。

以下の実施例は、本発明の具体的な実施形態の単なる例示であり、添付の特許請求の範囲により規定される発明を限定すると解釈するべきではない。

（実施例１）
ＰＳ１及びＰＳ２により産生されるＡβの違いに関与する構造的要素の特定
本発明者らは、ＰＳ１形質移入ダブルＫＯ細胞は、ＰＳ２形質移入細胞より数倍多くの全Ａβ（Ａβ４０＋Ａβ４２）を産生することを見出した。ＰＳ１及びＰＳ２単独ノックアウト細胞と比較した場合、３８倍差までが他者により報告された。Ｌａｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、Ｊｕｎ ２００３；２７８：２２４７５〜２２４８１を参照されたし。Ａβの産生におけるこの違いに関する根拠を理解するために、本発明者らは、それぞれにおいてＡβ産生活性を与える、ＰＳ１及びＰＳ２における具体的な構造要素を特定した。

全Ａβ濃度を確定する構造要素を探すために、本発明者らは、ＰＳ１及びＰＳ２の部分に由来する様々なキメラプレセニリン分子を調製し、それらをｐＣＦベクターにサブクローン化した。様々なキメラ分子を、図５に例示し、ＰＳ１又はＰＳ２部分の配列起源もまた図５に示した。

ＰＳ１／ＰＳ２ダブルノックアウト細胞と、ＡＰＰｓｗに加えてＰＳ１又はＰＳ２のどちらか或いはキメラ分子についての、一過性形質移入をその後実施した（図５に示した）。Ａβ１−ｘの濃度を、条件培地においてそれぞれの形質移入細胞から測定した。ＰＳ１及びＰＳ２ノックアウト細胞型の作製方法並びにＰＳ１、ＰＳ２又はキメラの形質移入方法は、上に記載している。

キメラの分子クローン化及び構築
ヒトＰＳ１、ＰＳ２及びＡＰＰｓｗ ｃＤＮＡインサートを、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｉｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、アデノウィルス三分節系リーダー配列（Ｂｅｒｋｎｅｒら、（１９８７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ａｐｒ；６１（４）：１２１３〜２０、「アデノウィルス組換え体における、ポリオーマウィルス中型Ｔ抗原及びジヒドロ葉酸還元酵素の豊富な発現（Ａｂｕｎｄａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ ｍｉｄｄｌｅ Ｔ ａｎｔｉｇｅｎ ａｎｄ ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｉｎ ａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）」）を、ＡＴＧ開始コドンの３８ｂｐ上流の、ＣＭＶプロモーターとＥｃｏＲ１部位との間に挿入することによって修飾された、ｐＣＦベクターにサブクローン化した。プレセニリンキメラの構築は、ＰＣＲに基づいた。ＰＳ１骨格とＰＳ２断片を含むキメラの作製のために、本発明者らは、全ｐＣＦベクターに加えて保持されるべき全ＰＳ１配列と、最終キメラにおいて使用されるＰＳ２断片のみを含む小型ＰＣＲ断片とを含む、大型ＰＣＲ断片をまず作製した。２つのＰＣＲ断片を、平滑末端法において、ラピッドＤＮＡライゲーションキット（Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ）（Ｒｏｃｈｅ、ＩＮ、ＵＳＡ）によってその後連結した。本発明者らは、全てのＰＣＲ反応に関してｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡ ポリメラーゼキット（ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｋｉｔ）（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用した。ＰＣＲにより導入される突然変異体の可能性を避けるために、本発明者らはまず両方の鎖において全インサートを配列決定した。本発明者らは、その後ＰＣＲ作製ベクターから配列確認インサートを取り出し、それをＰＣＲを介さなかった別のｐＣＦベクターにサブクローン化した。ＰＳ２骨格とＰＳ１断片を含むキメラの作製のために、本発明者らは、全ｐＣＦベクターに加えて保持されるべき全ＰＳ２配列と、最終キメラにおいて使用されるＰＳ１断片のみを含む小型ＰＣＲ断片とを含む、大型ＰＣＲ断片をまず作製した。他の全てのクローン化手順は、上記と同じであった。

（実施例２）
標準曲線の作製
Ａβ濃度の差は、プレセニリン活性又はプレセニリン発現濃度における差のどちらかによると思われるので、本発明者らは異なるプレセニリン分子の相対発現濃度を解明し、その後相対タンパク質濃度によりＡβ濃度を標準化する必要があった。標準化Ａβ濃度は、異なるプレセニリン構築体の相対活性又は酵素回転率を反映するはずである。

しかし、主に単独のＰＳ１又はＰＳ２抗体はＰＳ１及びＰＳ２の両方並びに全キメラを検出できないため、異なるキメラの相対発現濃度の測定は容易な課題ではなかった。例えば、Ｍａｂ１５６３（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）により製造されたウェスタンブロット上の、ＰＳ１Ｎ末端に関するシグナルと、ＰＣ２３５Ｔ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）によるＰＳ２ Ｃ末端に関するシグナルとは、容易に検出できるが、２種の抗体からのシグナルは、抗体特性、例えば親和性における固有の差のため、ＰＳ１及びＰＳ２タンパク質の相対発現濃度を測定するための比較はできない。これにより、ＰＳ１及びＰＳ２抗体による、それらそれぞれの抗原に対して産生されるシグナル間の相関関係の確定における問題が例示された。

この問題はＰＳ１２Ｂ（Ｎ末端がＰＳ１由来であり、Ｃ末端がＰＳ２由来であるプレセニリンキメラ分子）に焦点を合わせることにより解決した。ＰＳ１２Ｂは、最初に一本鎖ポリペプチドとして合成し、続けてＭａｂ１５６３により認識される成熟ＰＳ１Ｎ末端、及びＰＣ２３５Ｔにより認識される成熟ＰＳ２Ｃ末端に切断する。ＮＴＦ（Ｎ末端断片、ＰＳ１エピトープ）及びＣＴＦ（Ｃ末端断片、ＰＳ２エピトープ）の両方が同じポリペプチド鎖に由来するため、２つの断片の間には一定の比率があるはずである。ＮＴＦ及びＣＴＦが細胞内で同じ安定性を有すると仮定すると、比率は１：１であると思われ、それは、ＮＴＦ及びＣＴＦは細胞内で等モル濃度で存在することを暗示する。したがって、ウェスタン上の両方のＭａｂ１５６３及びＰＣ２３５Ｔの検出バンドが似たような強度である場合、２種の抗体は特定の実験条件の下で、２種の異なる抗原に対して類似の感受性を有し、シグナルを比較できるという結論を出せる。

ウェスタンブロットでＰＳ１及びＰＳ２抗体に関する同一のシグナルが得られることは必ずしも実践的ではないので、実際にはゲルに異なる量のＰＳ１２Ｂを載せて、Ｍａｂ１５６３及びＰＣ２３５Ｔ両方のシグナルを同じブロットで検出した。ＰＳ１２Ｂからのウェスタンシグナルは、他のキメラ或いはＰＳ１又はｐＳ２の相対量に由来する標準曲線の確立に使用できる。

（実施例３）
発現濃度の比較
標準曲線を用いて試料を同じウェスタンゲル上に載せて、ＰＳ１２Ｂを標準として、異なるキメラの相対発現濃度が比較できる。図６は、異なるキメラに関する相対タンパク質発現濃度をどのように測定するかの例を示す。実験において、各プレセニリンｃＤＮＡ構築体を、ＡＰＰｓｗを用いてダブルＫＯ細胞に同時形質移入した。一晩インキュベートした後で、細胞を溶解し、それぞれの形質移入細胞からタンパク質を抽出した。ウェスタン分析のために、５μｇのタンパク質調製品を載せ、プレセニリンのＮＴＦ及びＣＴＦを、ＭＡＢ１５６３及びＰＣ２３５Ｔを用いて、同じブロット上で検出した（標準として、様々な量のＰＳ１２Ｂを同じゲルに載せたが、表示を明瞭にするためにここには示していない）。ウェスタンシグナルをまずフィルム（Ａ）をスキャンすることにより定量し、その後シグナルを各抗体に関して標準曲線と比較し、ウェスタンにおいて同じ量のシグナルを発生するであろう、ＰＳ１２Ｂ形質移入細胞から等量のタンパク質調製品として発現させた。

以下の実施例２〜４に記載の方法を使用して、キメラ構築体の相対活性（Ａβ産生として測定）を測定した。表１は、図６に示した様々なプレセニリンキメラ構築体の相対活性の測定を例示する。基本的には、図（６Ｂ）において測定したタンパク質濃度を、ＰＳ２の濃度を１に適宜割り当てることによって標準化し、値は表１の３番目の列に示した。最後に、まずＡβ濃度（表１の２列目）を相対タンパク質量（表１の３列目）で割ることによって相対活性を得、ＰＳ２の相対活性を１に割り当てることによって、再度標準化した。

表１は、Ａβ濃度を相対タンパク質量で割り、ＰＳ２の相対活性を１に適宜割り当てることによる、様々なプレセニリン構築体の相対活性の測定を、具体的に説明するための例を提供する。

上に例示した相対活性の導き方を、他の実験において追加のキメラに適用し、他のいくつかの反復実験による全関連データを図７に要約した。

図７より、キメラＰＳ１２Ａ、Ｃ及びＥの全てがＰＳ１と同様の相対活性を有し、ＰＳ１２ＢはＰＳ１よりわずかに低いが、ＰＳ２よりはるかに高い相対活性を有することが明らかである。

図７は、ＰＳ１２Ａ、ＰＳ１２Ｂ及びＰＳ１２ＣがＰＳ１と同様の活性を有し、一方ＰＳ２１Ａ及びＰＳ２１ＣはＰＳ２と同様の活性を有し、ＰＳ１２Ｄ及びＰＳ２１ＤはＰＳ１とＰＳ２との中間であることを示し、したがって、ＰＳ１のＮ末端の１／３は高い相対活性を授かり、この領域の前半（ＰＳ１のアミノ酸残基１〜７０）は、後半（ＰＳ１のアミノ酸残基７１〜１２７）よりわずかに重要であるという結論を引き出す。ＰＳ２１Ｆについてのデータは、Ｎ末端の１／６はＮ末端の１／３による活性の全ての貢献を占めることを示唆できるが、ＰＳ１２Ｄ及びＰＳ２１Ｄについてのデータは、この観察と矛盾する。したがって全体では、高いＡβ又は低いＡβγ−セクレターゼ活性を授かるように思われるのは、Ｎ末端の１／３（ＰＳ１のアミノ酸残基１〜１２７）である。

（実施例４）
Ａβ１−ｘに関するＥＬＩＳＡ試験
Ａβ１−ｘは、捕捉用に専売抗体ｍＡｂ２６６及び検出用に専売抗体ｍＡｂ３Ｄ６を使用するＥＬＩＳＡ試験により、操作的に定義されるので、Ａβ１−ｘは、Ａβ３８、Ａβ４０及びＡβ４２を含む、Ａβ１−２３より長い、任意のＡβペプチドを表す。ｍＡｂ２６６に関するエピトープはＡβ１６−２３であり、ｍＡｂ３Ｄ６に関するエピトープはＡβ１−５である。Ａβのペプチド配列は、図３に見出すことができる。Ａβ４０のＥＬＩＳＡには、捕捉用に抗体ｍＡｂ２６６及び検出用に２Ｇ３（Ａβ４０に特異的）をそれぞれ用いた。更に、Ａβ４２のＥＬＩＳＡには、捕捉用に抗体ｍＡｂ２６６及び検出用に抗体２１Ｆ１２をそれぞれ用いた。Ａβ１６−２３に対する抗体を産生するハイブリドーマを、参照によりその全体を本明細書に組み込む、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５ １９７５）及び米国特許第４，６６６，８２９号に述べられた、標準的ネズミ融合手順により作製した。本明細書中の「発明を実施するための最良の形態」も参照されたい。簡潔には、Ａβ１３−２８を用いて免疫化し、２Ｃ−１１（Ｔ細胞受容体モノクロナール抗体）に接合した２匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを犠牲にし、脾臓を取り出した。３０メッシュのステンレス製の篩に脾臓を押圧して通すことにより、混合した脾細胞を得た。これらをＰ３Ｘ６３Ａｇ８ネズミ骨髄腫細胞（アミノプテリン感受性）と、３５％ポリエチレングリコールにおいて融合比１０：１で融合した。これらの細胞を、２×１０^６胸腺細胞／ｍｌの存在下で、９６ウェル組織培養プレートに播種した。アミノプテリンの存在で毒を加え、ヒポキサンチン、チミン及び１０％ウシ胎児血清を用いて増強したダルベッコ変法イーグル培地における細胞の成長により、ハイブリドーマを選択した。ハイブリドーマを、ＥＬＩＳＡを介したＡβ１３−２８及びＡＰＰタンパク質に対する反応性に関してスクリーニングした。陽性クローンを、２回サブクローン化した。クローンのアリコートを凍結し、液体窒素中で保存した。陽性クローンの上清を、モノクロナール抗体の更なる精製のために多量に作製した。同様の方法を、Ａβ１−３に対するモノクロナール抗体の作製のために使用し、ここではマウスを初めはＡβ１−５を用いて免疫化し、ポリクロナール羊抗マウス抗体に接合した。

ＥＬＩＳＡ試験のために、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの各ウェルを、ウェルコーティングバッファー（ｐＨ８．５）中に１０μｇ／ｍｌの２６６の１００μｌを用いて４℃で一晩コーティングし、０．２５％ヒトＢＳＡ溶液を用いて２５℃で１２０分間ブロッキングした。ブロッキング溶液を除去した後、プレートは洗浄せずにそのまま使用できる。

ＥＬＩＳＡ試験を室温で実施した。γ−セクレターゼ阻害剤と共に又はなしで一晩培養した形質移入細胞の条件培地５０μｌを、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに加え、１時間インキュベートした。プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を加えたＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）を用いて洗浄した後で、５０μｌのビオチン化３Ｄ６抗体（０．５μｇ／ｍｌ）を各ウェルに加えて４５分間インキュベートした。その後プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を加えたＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）を用いて洗浄し、５０μｌのストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲート（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）（１：５０００希釈、Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ、ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｎｕｍｂｅｒ：ＲＰＮ４４０１）を各ウェルに加え、３０分間インキュベートした。次にプレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を加えたＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）を用いて洗浄し、５０μｌの基質（１ステップスローＴＭＢ−Ｅｌｉｓａ（１−ｓｔｅｐ ｓｌｏｗ ＴＭＢ−Ｅｌｉｓａ）Ｐｉｅｒｃｅ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ、ＵＳＡ、ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｎｕｍｂｅｒ：３４０２４）を各ウェルに加え、１５分間インキュベートした。最後に、基質反応を、各ウェルに１５μｌ、２ＮのＨ_２ＳＯ_４を加えることによって終了し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）でＯＤの測定値を得た。その後試料のＯＤ測定値と標準の測定値を比較することによって、試料のＡβ濃度を得た。

様々な濃度のγ−セクレターゼ阻害剤で処理した試料に関して、ＸＬフィットソフトウェアプログラム（ＸＬｆｉｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐｒｏｇｒａｍ）（ＩＤＢＳ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、ＥＣ_５０値を、Ａβ１−ｘの濃度に適合した曲線より導いた。試験化合物に暴露した、プレセニリン１形質移入細胞及びプレセニリン２形質移入細胞に関して得られたＥＣ_５０値の差は、阻害の差の指標として機能した。

（実施例５）
プレセニリン２含有γ−セクレターゼに対してプレセニリン１含有γ−セクレターゼを優先的に阻害する化合物の特定
プレセニリン２含有γ−セクレターゼに対してプレセニリン１含有γ−セクレターゼを優先的に阻害する化合物を特定するために、公知のγ−セクレターゼ阻害化合物を、プレセニリン１形質移入細胞及びプレセニリン２形質移入細胞の両方と共に、様々な濃度で一晩インキュベートした。ＰＳ１／ＰＳ２ダブルノックアウト細胞に由来する、形質移入マウスの線維芽細胞を３７℃、１０％ＣＯ_２において、２〜１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）と、１００μｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｐ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）において成長させる。

細胞培養培地を、形質移入細胞系からその後除去し、実施例１に記載したように、ＥＬＩＳＡ試験によりＡβ１−ｘの濃度に関して分析した。Ａβペプチドを補足するためにｍＡｂ２６６でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを使用し、その後ビオチン化ｍＡｂ３Ｄ６を用いてＡβペプチドを検出することにより、ＥＬＩＳＡ試験を実施する。ＥＣ_５０値を、全ての試験化合物に関して得た。試験化合物に暴露した、プレセニリン１形質移入細胞及びプレセニリン２形質移入細胞に関して得られたＥＣ_５０値の差は、阻害の差の指標として機能する。

（実施例６）
ＧｅｎｅＰｏｒｔｅｒ２を用いた形質移入
約３００００個の細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに入れた。２０時間後、培養培地を、各ウェルにおいて６０μｌのＯｐｔｉｍｅｍ ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）に交換した。それと同時に、以下の２の混合物を調製した。混合物Ａ：１８μｌのＧｅｎｅＰｏｒｔｅｒ２に８１μｌのＯｐｔｉｍｅｍを加える；混合物Ｂ：２μｇのプラスミドＤＮＡに１００μｌの希釈剤Ｂ（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を加える。その後、３３μｌの混合物Ａを６６μｌの混合物Ｂに加え、５〜１５分間インキュベートすることによってマスター混合物を調製した。最終的に、１４μｌのマスター混合物を各ウェルの細胞に加えた。

５時間後、各ウェルの培地と形質転換混合物を、２％ＦＢＳを加えた、Ｐｅｎ／ＳｔｒｐのないＤＭＥＭと交換した。γ−セクレターゼ阻害剤を、阻害の研究のために細胞にもまた加えた。

（実施例７）
ヌクレオフェクター（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ）ＩＩを用いた形質移入
約５００〜１０００万個（又は１００〜１０００万）の細胞をＴ−１５０プレートから収穫し、２００×ｇで７分間遠心分離にかけることによって回収した。その後、細胞ペレットを１０ｍｌの温ＲＰＭＩ培地ですすぎ、２００×ｇで５分間再度遠心分離にかけた。次に、細胞ペレットを１００μｌの溶液Ｒに再懸濁した。この細胞懸濁液に、１〜２μｇのＤＮＡを加え、細胞−ＤＮＡ混合物を、Ａｍａｘａエレクトロポレーション装置（Ａｍａｘａ Ｉｎｃ．、Ｇａｔｈｅｒｓｂｅｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）にあらかじめセットしたプログラムＴ−２０を用いて、直ちにエレクトロポレーションにかけた。１度エレクトロポレーションを行ったら、１ｍｌの室温のＲＰＭＩを、エレクトロポレーションを行った細胞に加えた。ＲＰＭＩ添加の２〜５分後、混合物を５〜１０ｍｌの１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭに移し、９６ウェルプレートに播種した。１〜３時間後、γ−セクレターゼ阻害剤を、阻害の研究のために細胞に加えた。

表１は、多数の公知のγ−セクレターゼ阻害化合物を使用して得た結果を要約する。例えば、いくつかの試験済み化合物はスルホンアミド化合物であり、一方いくつかは非スルホンアミド化合物である。プレセニリン２形質移入細胞及びプレセニリン１形質移入細胞に関して得られたＥＣ_５０値（表１の最後の列に示した）の比は、試験化合物がプレセニリン１を優先的に阻害できる度合いを示す。例えば、表１は、試験したスルホンアミド化合物は、プレセニリン２含有γ−セクレターゼに対するプレセニリン１含有γ−セクレターゼの阻害において、１．５〜６１倍強力であり、試験した非スルホンアミド化合物は、わずか１．５〜２倍強力であったことを示している。表２において、Ａ、Ｂ及びＣの列に示した値はＥＣ_５０値（ｎＭ）である。阻害が非常に低かった場合、ＥＣ_５０値はプログラムにより発生されなかった。したがって、ＥＣ_５０値は提供されない。むしろ、阻害の割合は、プログラムによって作り出された阻害曲線に基づいて確立された。割合は、化合物の濃度が１０μＭにおける阻害の割合を表す。

（実施例８）
低分子阻害剤のＰＳ１選択性に関する構造的基礎の特定
上で述べたように、特定の低分子阻害剤、具体的にはスルホンアミドはＰＳ１含有γ−セクレターゼの優先的阻害を示し、一方非スルホンアミド阻害剤は、ＰＳ１対ＰＳ２γ−セクレターゼに関して少量の選択性を有するだけである。代表的実験からの用量反応曲線及びＥＣ_５０値を図９に示す。阻害剤のＰＳ１／ＰＳ２選択性についての２つの独立した実験からの平均値を図１１に示す。ＣＯＭＰＯＵＮＤ Ｓ−１は、ＰＳ１に関して約５１倍選択的であり、ＢＭＳ２９９８９７はＰＳ１に関して約３５倍選択的であり、一方Ｌ−６８５，４５８はＰＳ１に関してわずか約３倍選択的であり、ＤＡＰＴは実質的にはＰＳ２に関して２倍選択的である。Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｓ−１で表される型の更なるスルホンアミド阻害剤もまた、優先的ＰＳ１選択性を示す（データ非掲載）。主にスルホンアミド系の阻害剤による、ＰＳ２とＰＳ１との阻害の差の観察を基に、本発明者らは、この阻害の差に関する構造的基礎の調査をすすめた。本発明者らは、キメラＰＳ１／ＰＳ２分子（図１０に例示）を用い、阻害剤の有効性における差に関連するＰＳ１のドメインをマッピングした。初めの一組のキメラプレセニリン分子を評価することにより、ＰＳ１の中間の１／３（残基１２８〜２９８）が、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｓ−１及びＢＭＳ２９９８９７による高い阻害能に関して必要且つ十分であることが明らかになった（図１１）。Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｓ−１及びＢＭＳ２９９８９７の両方に関して、ＰＳ１／２ＢのＥＣ_５０値はＰＳ１のＥＣ_５０値と同様であり、一方ＰＳ１／２Ａ及びＰＳ１／２ＣのＥＣ_５０値はＰＳ２のＥＣ_５０値と同様である。更に言えば、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｓ−１及びＢＭＳ２９９８９７による阻害の点から見ると、この構築体の大部分がＰＳ２配列に含まれるという事実にもかかわらず、ＰＳ２／１Ｃに対する阻害剤の有効性は、まさにＰＳ１のように作用した。前記のように（図９）、ＤＡＰＴ及びＬ−６８５，４５８などの非スルホンアミド阻害剤は、ＰＳ１に対しても、ＰＳ２に対しても、３倍を超える選択性を示さず、キメラはこの選択性の低さに関する一貫したいかなる根拠も明らかにしなかった。更に、詳細な分析（キメラ構築体及び点突然変異を用いた技術を使用）により、ＰＳ１のアミノ酸残基Ｌ１７２、Ｔ２８１及びＬ２８２を、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｓ−１によるＰＳ１の選択的阻害のために必要且つ十分であると特定した。これらの残基はまた、ＢＭＳ２９９８９７によるＰＳ１の選択的阻害にも一部貢献している。

前述の開示は、本発明のある具体的な実施形態を強調するものであり、これらと同等の全ての改善又は改変は、添付の特許請求の範囲において説明したように、本発明の精神及び範囲内であると理解すべきである。

プレセニリン１（ＰＳ１）アミノ酸配列（配列番号２）及びＰＳ１アミノ酸配列をコードする核酸配列（配列番号１）を表す図である。 プレセニリン１（ＰＳ１）アミノ酸配列（配列番号２）及びＰＳ１アミノ酸配列をコードする核酸配列（配列番号１）を表す図である。 プレセニリン１（ＰＳ１）アミノ酸配列（配列番号２）及びＰＳ１アミノ酸配列をコードする核酸配列（配列番号１）を表す図である。 プレセニリン２（ＰＳ２）アミノ酸配列（配列番号４）及びＰＳ２アミノ酸配列をコードする核酸配列（配列番号３）を表す図である。 プレセニリン２（ＰＳ２）アミノ酸配列（配列番号４）及びＰＳ２アミノ酸配列をコードする核酸配列（配列番号３）を表す図である。 プレセニリン２（ＰＳ２）アミノ酸配列（配列番号４）及びＰＳ２アミノ酸配列をコードする核酸配列（配列番号３）を表す図である。 Ａβ４３（Ａβ４３）アミノ酸配列（配列番号５）を表す図である。 スウェーデン変異アミロイド前駆体タンパク質（Ｓｗｅｄｉｓｈ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ａｍｙｌｏｉｄ Ｐｉｅｃｕｒｓｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＡＰＰｓｗｅ）（配列番号６）に関するアミノ酸配列を表す図である。 ＰＳ１／ＰＳ２キメラの配列起源を示し、異なるキメラの相対タンパク質発現濃度の測定を表す図である。 図５において例示した様々なプレセニリン構築体の相対活性の測定を示す図である。 ＰＳ１及びＰＳ２のどちらのセグメントがＡβの産生に大きく関与するかの測定に使用したＰＳ１／ＰＳ２のキメラ分子を表す図である。これにより、ＰＳ１２Ａ、ＰＳ１２Ｂ及びＰＳ１２ＣがＰＳ１と同様の活性を有し、一方ＰＳ２１Ａ及びＰＳ２１ＣはＰＳ２と同様の活性を有し、ＰＳ１２Ｄ及びＰＳ２１Ｄは、ＰＳ１及びＰＳ２の中間であることが実証され、したがってＰＳ１のＮ末端の１／３が高い相対活性を与え、この領域の前半（ＰＳ１におけるアミノ酸残基１〜７０）が後半（ＰＳ１におけるアミノ酸残基７１〜１２７）と比べてわずかに重要であるという結論が引き出された。ＰＳ２１Ｆについてのデータにより、Ｎ末端からの１／６がＮ末端からの１／３による活性に対する全貢献を占めることが示唆され得るが、ＰＳ１２Ｄ及びＰＳ２１Ｄのキメラからのデータはこの観察と矛盾する。したがって全体としては、γ−セクレターゼ活性を刺激するほぼ全ての能力を有すると思われるのは、Ｎ末端からの１／３（ＰＳ１におけるアミノ酸残基１〜１２７）である。 ＰＳ１の中間の１／３部分をコードするプレセニリン１（ＰＳ１）アミノ酸配列（配列番号９）を表す図である。 ＰＳ１γ−セクレターゼの阻害に関する、異なる化合物の実験による用量反応曲線及びＥＣ_５０値の図である。 キメラＰＳ１／ＰＳ２分子のマッピングの図である。 様々な阻害剤のＰＳ１／ＰＳ２選択性についての２つの独立した実験の平均値を示す表である。

Claims (50)

1. 化合物がプレセニリン２含有γ−セクレターゼに対してプレセニリン１含有γ−セクレターゼを優先的に阻害するかどうかを確定する方法であって、
   （ａ）プレセニリン１を発現するがプレセニリン２を発現しない第１細胞型及びプレセニリン２を発現するが、プレセニリン１を発現しない第２細胞型を、前記化合物と共に個別にインキュベートするステップと、
   （ｂ）Ａβ４０／４２の量を、各細胞系において測定するステップと、
   （ｃ）各細胞系におけるＡβ４０／４２に関するＥＣ_５０値を算出するステップと、
   （ｄ）第１細胞型に関して算出されたＥＣ_５０値が、第２細胞型に関して算出されたＥＣ_５０値より小さい場合、前記化合物がプレセニリン２含有γ−セクレターゼに対してプレセニリン１含有γ−セクレターゼを優先的に阻害することを確定するステップと
   を含む方法。
2. 第１細胞型が、プレセニリン１ｃＤＮＡを含むベクターを形質移入したプレセニリン１／プレセニリン２ダブルノックアウト細胞系であり、第２細胞型が、プレセニリン２を含むベクターを形質移入したプレセニリン１／プレセニリン２ダブルノックアウト細胞系である、請求項１に記載の方法。
3. 請求項１に記載の方法により特定される化合物。
4. 非毒性治療有効量の請求項３に記載の化合物と、医薬として許容される担体とを含む、アルツハイマー病治療用医薬組成物。
5. 治療を必要とする患者に、請求項４に記載の医薬組成物を投与することを含む、アルツハイマー病の治療方法。
6. スルホンアミド化合物が、プレセニリン２含有γ−セクレターゼに対してプレセニリン１含有γ−セクレターゼを優先的に阻害するかどうかを確定する方法であって、
   （ａ）プレセニリン１を発現するがプレセニリン２を発現しない第１細胞型及びプレセニリン２を発現するが、プレセニリン１を発現しない第２細胞型を、前記化合物と共に個別にインキュベートするステップと、
   （ｂ）Ａβ４０／４２の量を、各細胞系において測定するステップと、
   （ｃ）各細胞系におけるＡβ４０／４２に関するＥＣ_５０値を算出するステップと、
   （ｄ）第１細胞型に関して算出されたＥＣ_５０値が、第２細胞型に関して算出されたＥＣ_５０値より小さい場合、前記化合物がプレセニリン２含有γ−セクレターゼに対してプレセニリン１含有γ−セクレターゼを優先的に阻害することを確定するステップと
   を含む方法。
7. 第１細胞型が、プレセニリン１ｃＤＮＡを含むベクターを形質移入したプレセニリン１／プレセニリン２ダブルノックアウト細胞系であり、第２細胞型が、プレセニリン２を含むベクターを形質移入したプレセニリン１／プレセニリン２ダブルノックアウト細胞系である、請求項６に記載の方法。
8. 請求項６に記載の方法により特定される化合物。
9. 非毒性治療有効量の請求項８に記載の化合物と、医薬として許容される担体とを含む、アルツハイマー病治療用医薬組成物。
10. 治療を必要とする患者に、請求項９に記載の医薬組成物を投与することを含む、アルツハイマー病の治療方法。
11. 請求項９に記載の医薬組成物を投与することを含む、細胞においてＰＳ２に対してＰＳ１を選択的に阻害する方法。
12. ＰＳ１に特異的に結合する単離抗体であって、前記特異的結合によりプレセニリン１含有γ−セクレターゼ（ＰＳ１）の活性を調節する抗体。
13. ＰＳ１のＮ末端部分に結合する、請求項１２に記載の抗体。
14. ＰＳ１のＮ末端の半分に結合する、請求項１２に記載の抗体。
15. プレセニリン２に結合しない、請求項１２に記載の抗体。
16. ＰＳ１のＮ末端の１／６に結合する、請求項１２に記載の抗体。
17. 前記特異的結合がＡβの産生を減少させる、請求項１２に記載の抗体。
18. プレセニリン１（ＰＳ１）又はその断片に対する特異的結合活性を有し、プレセニリン２には結合しない、単離抗体。
19. 前記単離抗体が配列番号８又はその断片に対する特異的結合活性を有する、請求項１８に記載の特異的結合剤。
20. ＰＳ１の断片が、ＰＳ１の少なくとも５個の連続したアミノ酸を含む、請求項１８に記載の特異的結合剤。
21. ＰＳ１の少なくとも５個の連続したアミノ酸の一部が、ＰＳ１のＮ末端の半分内に位置する、請求項２０に記載の特異的結合剤。
22. ＰＳ１の少なくとも５個の連続したアミノ酸の一部が、配列番号８のアミノ酸配列内に位置する、請求項２１に記載の特異的結合剤。
23. 配列番号８からなる単離ポリペプチド。
24. ＰＳ１を、ＰＳ１のＮ末端の半分に結合する化合物と、特異的阻害に関する有効量で接触させることを含む、ＰＳ１の特異的阻害方法。
25. 前記化合物が、ＰＳ１のＮ末端の１／３に結合する、請求項２４に記載の方法。
26. 前記化合物が、ＰＳ１のＮ末端の１／６に結合する、請求項２４に記載の方法。
27. 前記接触を細胞内で実施する、請求項２４に記載の方法。
28. 前記細胞がインビトロである、請求項２７に記載の方法。
29. 前記細胞が培養細胞である、請求項２７に記載の方法。
30. 前記化合物がプレセニリン２含有γ−セクレターゼの活性を阻害しない、請求項２７に記載の方法。
31. 前記接触によりＡの産生が減少する、請求項２７に記載の方法。
32. ＰＳ１に対する特異的結合活性を有する特異的結合剤又はその医薬として許容される塩を、アルツハイマー病（ＡＤ）の治療又は予防に有効な量で対象に投与することを含む、対象におけるＡＤの治療又は予防の方法。
33. ＰＳ１に対する特異的結合活性を有する特異的結合剤を、医薬として許容される塩、担体、希釈剤又はアジュバントと組み合わせて含む組成物。
34. 請求項３３に記載の組成物をアルツハイマー病（ＡＤ）の治療又は予防に有効な量で対象に投与することを含む、対象におけるＡＤの治療又は予防の方法。
35. 前記対象が哺乳動物である、請求項３４に記載の方法。
36. 前記哺乳動物がヒトである、請求項３５に記載の方法。
37. 配列番号７からなる単離ポリペプチド。
38. ＰＳ１及びＰＳ２を含む細胞を、ＰＳ１に対する特異的結合活性を有する特異的結合剤と、ＰＳ１γ−セクレターゼ活性を阻害するが、ＰＳ２γ−セクレターゼ活性は阻害しない有効量で接触させることを含む、Ａβの産生の阻害方法。
39. 前記接触がインビトロである、請求項３８に記載の方法。
40. 前記接触が培養細胞においてである、請求項３８に記載の方法。
41. 前記接触がインビボである、請求項３８に記載の方法。
42. ＰＳ１のＮ末端部分に構築したプレセニリンのキメラを、前記化合物と接触させるステップと、前記キメラの相対活性を測定するステップとを含む、ＰＳ１活性を阻害する化合物を特定する方法。
43. 前記プレセニリンキメラが配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項４２に記載の方法。
44. 前記プレセニリンキメラが配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項４２に記載の方法。
45. ＰＳ２に対してＰＳ１活性を優先的に阻害する化合物の特定方法であって、
    ａ）ＰＳ１を発現するがＰＳ２を発現しない第１細胞型を提供するステップと、
    ｂ）ＰＳ２を発現するがＰＳ１を発現しない第２細胞型を提供するステップと、
    ｃ）第１細胞型を試験化合物に接触させるステップと、
    ｄ）第２細胞型を同じ試験化合物に接触させるステップと、
    ｅ）第１及び第２の細胞型におけるＡβペプチドの量を測定するステップと、
    ｆ）各細胞型におけるＡβペプチドの量に基づいて、各細胞型に関するＥＣ_５０を算出するステップと、
    ｇ）第１細胞型に関するＥＣ_５０が第２細胞型に関するＥＣ_５０より小さい場合、試験化合物をＰＳ１活性を優先的に阻害する化合物として特定するステップと
    を含む方法。
46. 前記ＡβペプチドがＡβ３８である、請求項４５に記載の方法。
47. 前記ＡβペプチドがＡβ４０である、請求項４５に記載の方法。
48. 前記ＡβペプチドがＡβ４２である、請求項４５に記載の方法。
49. 配列番号９からなる単離ポリペプチド。
50. 前記単離抗体が配列番号９又はその断片に対する特異的結合活性を有する、請求項１８に記載の特異的結合剤。

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