DE102017130356A1

DE102017130356A1 - Verfahren zur Auftrennung verschiedener Abeta-Peptide durch Gelelektrophorese

Info

Publication number: DE102017130356A1
Application number: DE102017130356.1A
Authority: DE
Inventors: Jens Wiltfang; Hans-Wolfgang Klafki; Petra Rieper
Original assignee: Universitaetsmedizin Goettingen Georg August Universitaet
Current assignee: Universitaetsmedizin Goettingen Georg August Universitaet
Priority date: 2017-12-18
Filing date: 2017-12-18
Publication date: 2019-06-19
Also published as: WO2019121263A1

Abstract

Zur Auftrennung von carboxyterminalen Varianten von Abeta-Peptiden wird Gelelektrophorese in Anwesenheit von Natriumlauroylsarcosin (Sarkosyl) durchgeführt. Das Sarkosyl kann in einer Konzentration zwischen 0,1 % und 0,8 % (w/v) in einem Sammelgel (2) und/oder in einem Trenngel (3) und/oder in einem Kathodenpuffer (7) und/oder in einem Anodenpuffer (4) der Gelelektrophorese vorliegen.

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Auftrennung von carboxyterminalen Varianten von Abeta-Peptiden durch Gelelektrophorese. Insbesondere geht es um die Trennung der Abeta-Peptide, d. h. Amyloid-Beta Peptide, Aß1-37, Aß1-38, Aß1-39, Aß1-40 und Aß1-42, die insbesondere in Form ihrer relativen Konzentrationen Potential als Biomarker für verschiedene neurodegenerative Erkrankungen sind.
STAND DER TECHNIK
Als Verfahren zur Auftrennung von carboxyterminalen Varianten von Abeta-Peptiden durch Gelelektrophorese ist eine SDS-PAGE in der Anwesenheit von 8 M Harnstoff bekannt, siehe H. W. Klafki et al., Anal. Biochem., 1996, 15; 237(1): 24-29, PubMed PMID: 8660532 und J. Wiltfang et al., Electrophoresis, 1997, 18 (3-4): 527-532, PubMed PMID: 9150936. Die Trennung der carboxyterminalen Varianten von Abeta-Peptiden, die sich nur in ein oder zwei Aminosäuren voneinander unterscheiden, beruht auf ungewöhnlichen elektrophoretischen Laufeigenschaften unter den speziellen Bedingungen dieser SDS-PAGE (engl. sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis). Die hohen Konzentrationen des Harnstoffs reduzieren die Affinität von SDS (Natriumdodecylsulfat) für Polypeptide, was eine unvollständige und über die Peptidkette ungleichmäßige Beladung der Abeta-Peptide in der SDS-PAGE zur Folge hat. Die stöchiometrische Beladung der Abeta-Peptide mit SDS (molarer SDS/Abeta-Quotient) in der Gegenwart von 8 M Harnstoff ist proportional zur Länge des carboxyterminalen, hydrophoben Bereichs der Abeta-Peptide. Damit lässt sich erklären, warum carboxyterminal längere Varianten der Abeta-Peptide höhere elektrophoretische Mobilität zeigen, d. h. bei der SDS-PAGE in gleichen Zeiten weitere Strecken in dem Trenngel zurücklegen als kürzere Varianten der Abeta-Peptide.
AUFGABE DER ERFINDUNG
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Auftrennung von carboxyterminalen Varianten von Abeta-Peptiden durch Gelelektrophorese aufzuzeigen, das ohne hohe Konzentrationen von Harnstoff auskommt und vorzugsweise ganz ohne Harnstoff durchführbar ist, weil Harnstoff in gelöster Form nicht stabil ist, was die Lagerfähigkeit der für die Durchführung der SDS-PAGE verwendeten Gele und Puffer beeinträchtigt.
LÖSUNG
Die Aufgabe der Erfindung wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 1 gelöst. Die abhängigen Patentansprüche 2 bis 10 betreffen bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens. Die Patentansprüche 11 bis 20 sind auf ein Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens gerichtet.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Auftrennung von carboxyterminalen Varianten von Abeta-Peptiden durch Gelelektrophorese wird die Gelelektrophorese in der Anwesenheit von Natriumlauroylsarcosin (Sarkosyl) durchgeführt.
Überraschenderweise können carboxyterminale Varianten von Abeta-Peptiden dann, wenn eine Gelelektrophorese in der Anwesenheit von Sarkosyl durchgeführt wird, aufgetrennt werden, ohne dass es der gleichzeitigen Anwesenheit von Harnstoff bedarf. Dabei scheint sich eine stöchiometrische Beladung der Abeta-Peptide mit Sarkosyl proportional zur Länge des carboxyterminalen, hydrophoben Bereichs der Abeta-Peptide zu ergeben, so dass auch bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die carboxyterminal längeren Varianten der Abeta-Peptide eine höhere elektrophoretische Mobilität zeigen als kürzere Formen.
WEITERER STAND DER TECHNIK
Aus Drug Test Analysis 2009, 1, 494-504 und Protein Electrophoresis, Methods in Molecular Biology, 2012, 869, 65-79 ist ein MIRCERA (methoxy-polyethylenglycolum epoetinum beta) bzw. EPO-Nachweis mittels Sarkosyl-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SAR-PAGE) bekannt, bei der Sarkosyl als Detergens verwendet wird. Anders als SDS bindet Sarkosyl nur an den Proteinanteil von MIRCERA, nicht an Polyethyleneglycol (PEG)-Ketten, wodurch die Nachweisempfindlichkeit mittels eines Antikörpers im Westernblot deutlich verbessert wird. In „Ultrastructure and Biochemical Composition of Paired Helical Filaments in Corticobasal Degeneration“, AmJ Pathol 1994, 145:1496-1508 und „GSPE interferes with tau aggregation in vivo: implication for treating tauopathye“, Neurobiol. Aging 2012, 33, 2072, „Aggregation of detergentinsoluble Tau is involved in neuroal loss but not in synaptic loss“, J. Biol. Chem. 2010, 285, 38692 wird die Verwendung von Sarkosyl bei der Aufarbeitung von Proben beschrieben, um diese in eine Sarkosyl-lösliche und eine Sarkosyl-unlösliche Tau-Fraktion aufzutrennen. Es handelt sich um eine seit vielen Jahren bekannte Methode, um das in Form von „Paired Helical Filaments“ aggregierte Tau Protein („PHF-Tau“) anzureichern. Die Unlöslichkeit von verschiedenen anderen aggregierten Proteinen in Sarkosyl oder anderen Detergenzien kann in ähnlicher Weise für deren Anreicherung und / oder biochemische Charakterisierung eingesetzt werden. Ein Beispiel ist in Yeast [PSI+] prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hsp104*“, J. Biol. Chem. 2003, 278, 49636 beschrieben.
Aus „Motor impairment and aberrant production of neurochemicals in human alpha-synuclein A30P+A53T transgenic mice with alpha-synuclein pathology“, Brain Research 2009, 1250, 232 ist es bekannt, Sarkosyl zu verwenden, um aggregierte bzw. posttranslational modifizierte Formen des Alpha-Synucleins anzureichern. Auch hier wird wieder die schlechte Löslichkeit der aggregierten Proteine in dem Detergenz genutzt.
Kushnirov et al.: „Purification and analysis of prion and amyloid aggregates", Methods 2006, 39, 50 beschreiben ein Verfahren, um Amyloid- und Prion-Polymere aufgrund ihrer schlechten Löslichkeit in gekühlten SDS oder Sarkosyllösungen aufzureinigen. Dabei wird die Probe in SDS- oder Sarkosyl-lösliche und -nichtlösliche Fraktionen aufgeteilt. Die aufgeteilten Fraktionen werden anschließend z. B. mittels Elektrophorese analysiert. Dabei wird neben SDS-PAGE bevorzugt ein Agarose-Gel verwendet, da Amyloide zu groß für Polyacrylamid-Gele sind. In der Elektrophorese wird kein Sarkosyl verwendet.
Aus „Interdependence of amyloid formation in yeast“, Prion 2010, 4, 1, 45 ist eine Substitution von SDS in einer SDD-AGE (semi-denaturing detergent agarose gel electrophoresis) durch Sarkosyl bekannt, um solche Amyloid-Proteinaggregate zu analysieren, die sich in SDS lösen, nicht aber im milderen Detergens Sarkosyl. Auch hier wird also die schlechte Löslichkeit bestimmter Proteinpolymere oder Aggregate in Sarkosyl genutzt, um sie biochemisch zu charakterisieren oder anzureichern.
Aus der WO 03/096023 A1 sind Sarkosylpuffer und deren Verwendung für die Reinigung von Prionen-Proteinen bekannt. Anschließend werden die gereinigten Prionen-Proteine einer SDS-PAGE unterworfen, in der längere Proteine eine geringere elektrophoretische Mobilität zeigen als kürzere Proteine.
Der zu Sarkosyl vorliegende Stand der Technik ließ nicht erkennen, dass eine Auftrennung von nicht aggregierten carboxyterminalen Varianten von Abeta-Peptiden durch Gelelektrophorese in Anwesenheit von Sarkosyl möglich ist, wobei auf die hohen Harnstoffkonzentrationen verzichtet werden kann, die bei der bekannten Harnstoff-SDS-PAGE zur Auftrennung von carboxyterminalen Varianten von Abeta-Peptiden erforderlich sind.
WEITERE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann das Sarkosyl in ein Sammelgel und/oder in ein Trenngel und/oder in einen Kathodenpuffer und/oder in einen Anodenpuffer der Gelelektrophorese eingebracht werden. Vorzugsweise wird das Sarkosyl sowohl in das Sammelgel als auch in das Trenngel als auch zumindest in den Kathodenpuffer eingebracht. Dabei kann das Einbringen des Sarkosyls in das Sammelgel und das Trenngel in üblicher Weise bedeuten, dass das Sarkosyl bereits beim Polymerisieren des jeweiligen Gels in dem Gel vorliegt, d. h. in das jeweilige Gel einpolymerisiert wird.
Die Konzentration, in der das Sarkosyl bei dem erfindungsgemäßen Verfahren in der Gelelektrophorese vorliegt, fällt typischerweise in einen Bereich von 0,1 % und 0,8 % (w/v). Eine Konzentration von etwa 0,25 % (w/v) hat sich als besonders praktikabel erwiesen. In dieser Konzentration kann das Sarkosyl in das Sammelgel und/oder in das Trenngel und/oder in den Kathodenpuffer und/oder in den Anodenpuffer der Gelelektrophorese eingebracht werden. Der Zusatz „(w/v)“ bei der Konzentration des Sarkosyls verweist darauf, dass die prozentuale Konzentrationsangabe dem Gewicht des Sarkosyls in Gramm bezogen auf das Volumen des jeweiligen Gels oder Puffers in 100 ml entspricht. Im Folgenden werden auch Konzentrationen mit dem Zusatz „(v/v)“ angegeben. Diese Konzentrationen sind entsprechend in Volumenprozent angegeben bzw. in ml der jeweiligen Substanz in 100 ml des jeweiligen Gels oder Puffers.
Die Aufgabe der Erfindung, ohne Harnstoff, insbesondere ohne Harnstoff in höheren Konzentrationen, auszukommen, wird von dem erfindungsgemäßen Verfahren vollständig gelöst. So können das Sammelgel, das Trenngel, der Kathodenpuffer, der Anodenpuffer und auch ein Probenpuffer der Gelelektrophorese Harnstoff-frei sein. Dabei bedeutet „Harnstoff-frei“, dass keine funktionalen Mengen an Harnstoff vorhanden sind. Die genannten Gele oder Puffer müssen nicht von Harnstoff rein sein, d. h. auch frei von Harnstoff-Spuren.
In praktischen Erprobungen des erfindungsgemäßen Verfahrens hat es sich als günstig herausgestellt, wenn der Kathodenpuffer und/oder der Anodenpuffer ein Tris-HEPES-Puffer ist. Demgegenüber ist als Probenpuffer ein Tris-HCI-Puffer günstig. Das Sammelgel und/oder das Trenngel der Gelelektrophorese können entsprechend Tris-HCI-Polyacrylamidgele sein. Grundsätzlich können aber auch andere Puffer und Gele verwendet werden, beispielsweise Bistris-HCI-Polyacrylamidgele.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt die Gelelektrophorese in der Anwesenheit von Sarkosyl, und es wird davon ausgegangen, dass das Sarkosyl die Abeta-Peptide stöchiometrisch in Abhängigkeit von der Länge ihres jeweiligen carboxyterminalen Bereichs belädt und so zu deren unterschiedlicher elektrophoretischen Mobilität in der Gelelektrophorese führt. Obwohl Sarkosyl ein Detergens ist, dient es insoweit zumindest nicht primär zum Aufschluss der jeweiligen Probe. Tatsächlich wird zum Aufschluss der jeweiligen, die Abeta-Peptide enthaltenden Probe vorzugsweise ein Probenpuffer für die Gelelektrophorese verwendet, der Sarkosyl-frei ist und in den SDS oder LDS als aufschließendes Detergens eingebracht wird. Das Sammelgel und das Trenngel sowie der Kathodenpuffer und der Anodenpuffer der Gelelektrophorese können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren hingegen als solche SDS- und LDS-frei sein, was auch bevorzugt ist.
In den Probenpuffer der Gelelektrophorese wird das SDS und/oder LDS in einer typischen Konzentration zwischen 0,5 % und 2 % (w/v), d. h. von etwa 1 % (w/v) eingebracht.
Als günstig erweist es sich darüber hinaus, in den Probenpuffer der Gelelektrophorese Glycerin und/oder Saccharose einzubringen, wobei das Glycerin in einer Konzentration zwischen 5 % und 20 % (v/v) und/oder die Saccharose in einer Konzentration zwischen 5 % und 20 % (w/v) in den Probenpuffer eingebracht wird/werden. Tendenziell ist der Einsatz von Saccharose gegenüber demjenigen von Glycerin bevorzugt, weil er zu schärferen Banden führt, in denen sich die einzelnen carboxyterminalen Varianten der Abeta-Peptide nach der Gelelektrophorese zeigen.
Als günstig bei der praktischen Erprobung des erfindungsgemäßen Verfahrens hat sich weiterhin ein Sprung des pH-Werts zwischen dem Sammelgel und dem Trenngel der Gelelektrophorese erwiesen. Dieser Sprung des pH-Werts kann insbesondere 1,5 bis 2,5, d. h. etwa 2, betragen und konkret von pH 6,5 bis pH 7,0 auf pH 8,5 bis pH 9,0 erfolgen, beispielsweise also von pH 6,8 auf pH 8,8. Grundsätzlich können die Funktionsunterschiede zwischen Sammelgel und Trenngel aber auch auf andere Weise als durch den Sprung im pH-Wert erreicht werden. So unterscheiden sich neutrale SDS-Polyacrylamidgele nach Graham et al., Proteomics 2005, 5, 2309-2314 in den Konzentrationen von Bis-Tris-HCl und Acrylamid, nicht aber im pH-Wert, was grundsätzlich auch auf eine Polyacrylamid-Gelelektrophorese in der Anwesenheit von Sarkosyl übertragbar sein sollte.
Ein erfindungsgemäßer Kit zum Auftrennen von carboxyterminalen Varianten von Abeta-Peptiden durch Gelelektrophorese unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst zumindest ein Sammelgel und ein Trenngel, die Sarkosyl aufweisen. Zusätzlich kann der Kit einen Sarkosyl enthaltenden Kathodenpuffer und/oder einen Sarkosyl enthaltenden Anodenpuffer umfassen. Das Sarkosyl kann in einer Konzentration zwischen 0,1 % und 0,8 % (w/v) in dem Sammelgel und/oder in dem Trenngel und/oder in dem Kathodenpuffer und/oder dem Anodenpuffer des Kits vorhanden sein. Die Gele und Puffer des Kits, einschließlich eines Probenpuffers, können frei von funktionalem Harnstoff sein, was besonders bevorzugt ist. Der Kathodenpuffer und/oder der Anodenpuffer des Kits können ein Tris-HEPES-Puffer sein, während der Probenpuffer des Kits ein Tris-HCI-Puffer sein kann und das Sammelgel und/oder das Trenngel Tris-HCI-Polyacrylamidgele sein können. Der Probenpuffer des Kits ist typischerweise Sarkosyl-frei und weist stattdessen SDS und/oder LDS als aufschließendes Detergens auf. Konkret kann das SDS und/oder LDS in einer Konzentration zwischen 0,5 % und 2 % (w/v) in dem Probenpuffer enthalten sein. Weiterhin kann in dem Probenpuffer des Kits Glycerin und/oder Saccharose enthalten sein, insbesondere in einer Konzentration zwischen 5 % und 10 % (v/v) Glycerin und/oder in einer Konzentration zwischen 5 % und 20 % (w/v) Saccharose). Zwischen dem Sammelgel und dem Trenngel kann ein Sprung des pH-Werts um 1,5 bis 2,5 und/oder von pH 6,6 bis pH 7,0 auf pH 8,5 bis pH 9,0 ausgebildet sein. Abweichend von diesen Angaben, die sich auf erprobte Ausführungsformen des Kits konzentrieren, gibt es verschiedene Variationsmöglichkeiten, wie sie im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bereits angesprochen wurden.
Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den Patentansprüchen, der Beschreibung und den Zeichnungen. Die in der Beschreibung genannten Vorteile von Merkmalen und von Kombinationen mehrerer Merkmale sind lediglich beispielhaft und können alternativ oder kumulativ zur Wirkung kommen, ohne dass die Vorteile zwingend von erfindungsgemäßen Ausführungsformen erzielt werden müssen. Ohne dass hierdurch der Gegenstand der beigefügten Patentansprüche verändert wird, gilt hinsichtlich des Offenbarungsgehalts der ursprünglichen Anmeldungsunterlagen und des Patents Folgendes: weitere Merkmale sind den Zeichnungen - insbesondere den dargestellten Geometrien und den relativen Abmessungen mehrerer Bauteile zueinander sowie deren relativer Anordnung und Wirkverbindung - zu entnehmen. Die Kombination von Merkmalen unterschiedlicher Ausführungsformen der Erfindung oder von Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche ist ebenfalls abweichend von den gewählten Rückbeziehungen der Patentansprüche möglich und wird hiermit angeregt. Dies betrifft auch solche Merkmale, die in separaten Zeichnungen dargestellt sind oder bei deren Beschreibung genannt werden. Diese Merkmale können auch mit Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche kombiniert werden. Ebenso können in den Patentansprüchen aufgeführte Merkmale für weitere Ausführungsformen der Erfindung entfallen.
Die in den Patentansprüchen und der Beschreibung genannten Merkmale sind bezüglich ihrer Anzahl so zu verstehen, dass genau diese Anzahl oder eine größere Anzahl als die genannte Anzahl vorhanden ist, ohne dass es einer expliziten Verwendung des Adverbs „mindestens“ bedarf. Wenn also beispielsweise von einem Puffer die Rede ist, ist dies so zu verstehen, dass genau ein Puffer, zwei Puffer oder mehr Puffer vorhanden sind. Die in den Patentansprüchen angeführten Merkmale können durch weitere Merkmale ergänzt werden oder die einzigen Merkmale sein, die das jeweilige Verfahren oder Kit aufweist.
Die in den Patentansprüchen enthaltenen Bezugszeichen stellen keine Beschränkung des Umfangs der durch die Patentansprüche geschützten Gegenstände dar. Sie dienen lediglich dem Zweck, die Patentansprüche leichter verständlich zu machen.
Figurenliste
Im Folgenden wird die Erfindung anhand in den Figuren dargestellter bevorzugter Ausführungsbeispiele weiter erläutert und beschrieben.

1 zeigt schematisch die Durchführung einer Gelelektrophorese gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren, und
2 zeigt ein erfindungsgemäßes Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

FIGURENBESCHREIBUNG
1 zeigt schematisch die Durchführung einer Gelelektrophorese. Dazu werden Probentaschen (siehe 2 BZ 10) im oberen Ende eines Sammelgels 2 zunächst mit einem Kathodenpuffer 7 gespült, und ein an das obere Ende des Sammelgels 2 angrenzendes Kathodenreservoir 6 wird mit Kathodenpuffer 7 befüllt. Dann werden die aufzutrennenden carboxyterminalen Varianten von Abeta-Peptiden in einem Probenpuffer 1 von oben, unterschichtend in die Probentaschen 10 gegeben. An das Sammelgel 2 schließt nach unten ein Trenngel 3 an, das mit seinem unteren Ende in einen Anodenpuffer 4 in einem Anodenreservoir 5 eintaucht. Nach dem Auftragen der in dem Probenpuffer 1 gelösten Proben auf das wird ein elektrisches Feld 8 über das Sammelgel 2 und das Trenngel 3 hinweg angelegt. Dieses elektrische Feld führt dazu, dass sich die Abeta-Peptide durch die Gele 2, 3 hindurch nach unten bewegen. Dabei bewegen sich in dem Trenngel 3 verschiedene carboxyterminale Varianten der Abeta-Peptide unterschiedlich schnell, weil ihre elektrophoretische Mobilität neben ihrer Größe auch von ihrer Beladung mit Ladungsträgern abhängt. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist ein stöchiometrische Beladung der carboxyterminalen, hydrophoben Bereiche der Abeta-Peptide für ihre elektrophoretische Mobilität dominant, so dass sich die carboxyterminal längeren Varianten schneller durch das Trenngel 3 bewegen als die carboxyterminal kürzeren Varianten. Dies ist in 1 dadurch angedeutet, dass sich die carboxyterminale Variante Aß1-42 am weitesten fortbewegt hat und dahinter auch die carboxyterminalen Varianten Aß1-40, Aß1-39, Aß1-38 und Aß1-37 aufgetrennt sind. Die stöchiometrische Beladung der carboxyterminalen hydrophoben Bereiche der Abeta-Peptide mit Sarkosyl wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren dadurch erreicht, dass in das Sammelgel 2 und in das Trenngel 3 Sarkosyl in einer Konzentration von etwa 0,2 % (w/v) Sarkosyl einpolymerisiert ist und dass zumindest auch der Kathodenpuffer 7 Sarkosyl in dieser Konzentration enthält. Der Probenpuffer 1 enthält hingegen kein Sarkosyl, sondern SDS oder LDS zum Aufschluss der Abeta-Peptide. Es versteht sich, dass sich die in 1 illustrierten Banden der verschiedenen carboxyterminalen Varianten Aß1-37, Aß1-38, Aß1-39, Aß1-40 und Aß1-42 erst nach ihrer Sichtbarmachung, beispielsweise durch farbliche oder fluoreszente Markierung, mit einem an alle carboxyterminalen Varianten gleichermaßen anbindenden Antikörper zeigen.
2 zeigt ein erfindungsgemäßes Kit 9 zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Dieses Kit 9 weist das Sammelgel 2 und das Trenngel 3 auf, die jeweils Sarkosyl enthalten. Dabei sind im oberen Bereich des Sammelgels 2 in der Seitenansicht gemäß 2 nicht sichtbare Probentaschen 10 ausgebildet, um verschiedene Proben und Vergleichsmischungen oder Standards auf das Sammelgel 2 aufgeben zu können. Neben den Gelen 2, 3 umfasst der Kit 9 den SDS oder LDS enthaltenden Probenpuffer 1 sowie Sarkosyl enthaltenden Laufpuffer 11, der sowohl als Kathodenpuffer 7 als auch als Anodenpuffer 4 gemäß 1 eingesetzt werden kann.
Ausführungsbeispiele:
Sarkosyl-Polyacrylamidgelektrophorese zur hochauflösenden Auftrennung von carboxyterminalen Varianten von Amyloid-β-Peptiden
Lösungen

• 40 % Acrylamid-, Bisacrylamid-Stammlösung im Verhältnis 19:1 (40 % T / 5 %), z.B. Roth Katalognummer 3030.2 Rotiphorese Gel 40 19:1
• 40 % Acrylamid-, Bisacrylamid-Stammlösung im Verhältnis 29:1 (40 % T / 3,4 % C), z. B. Roth Katalognummer A515.1, Rotiphorese Gel 40 29:1
• Trenngelpuffer: 1,5 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan / HCl, pH 8,8
• Sammelgelpuffer: 0,5 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan / HCl, pH 6,8
• Kathodenpuffer: 100 mM Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, 100 mM HEPES, 0,25 % (w/v) N-Lauroylsarcosine sodium salt
• Anodenpuffer: 100 mM Tris, 100 mM HEPES
• Ammonium-Persulfat: 10 % (w/v) in Reinstwasser
• TEMED: N, N, N', N'-Tetramethylethylendiamin
• Sarkosyl-Stammlösungen: 10 % (w/v) und 5 % (w/v) Lauroylsarcosine Natriumsalz (in Reinstwasser) (hergestellt aus: z. B. N-Lauroylsarcosine sodium salt (Sigma Kat. Nr. 61745) oder z.B. N-Lauroylsarcosine sodium salt solution 30% (Sigma Kat. Nr. 61747))

Herstellung der Trenngellösung

Zum Gießen von 2 Mini-Trenngelen mit den Dimensionen H: 8,5 cm, B: ca. 5,5 cm, T: 0,75 mm werden 10 ml Trenngellösung nach folgendem Pipettierschema hergestellt:

		Endkonzentration im Trenngel
40% Acrylamid-, Bisacrylamid Stammlösung 19:1	3 ml	12% T, 5% C
Trenngelpuffer	3ml	0,45 M Tris-HCI, pH 8,8
5% (w/v) Sarkosyl in H2O	0,5 ml	0,25%
Reinstwasser	3,41 ml
10% (w/v) Ammonium-Persulfat	80 µl	0,08%
N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin	10 µl	0,1%

Gießen des Trenngels
Die Polymerisation von Acrylamid und Bisacrylamid wird durch Zugabe von Ammonium-Persulfat und N, N ,N', N'-Tetramethylethylendiamin gestartet. Unmittelbar danach wird die Trenngellösung gut gemischt und unter Verwendung des Mini Protean Tetra Cell Vertikal-Gelelektrophoresesystems der Firma BioRad zwischen zwei durch 0,75 mm starke Abstandshalter auseinandergehaltene Glasplatten bis zur gewünschten Höhe (ca. 5,5 cm) gegossen und mit 70 % 2-Propanol überschichtet.
Herstellung der Sammelgellösung

Die Sammelgellösung für 2 Minigele (5 ml) wird zum Beispiel nach folgendem Pipettierschema hergestellt:

40% Acrylamid-, Bisacrylamid Stammlösung 19:1	0,5 ml	4% T/5% C
Sammelgelpuffer	1,25 ml	0,125 M Tris-HCI, pH 6,8
5% (w/v) Sarkosyl	0,25 ml	0,25%
Reinstwasser	2,95 ml
10% (w/v) Ammonium-Persulfat	40 µl	0,08%
TEMED	10 µl	0,2%

Die Konzentration an Acrylamid + Bisacrylamid sowie der relative Anteil an Bisacrylamid (Quervernetzungsgrad) im Sammelgel können variiert werden. In einigen Ausführungsbeispielen wurden Sammelgele mit einer Acrylamid + Bisacrylamidkonzentration von 4,8 % im Verhältnis 29:1 (= 3,4 % C) verwendet.
Gießen des Sammelgels
Nach der Polymerisierung des Trenngels (mindestens 2 Stunden - über Nacht) wird die über dem Gel stehende Flüssigkeit entfernt, die Polymerisierung des Sammelgels durch Zugabe von Ammonium-Persulfat und TEMED (s. o.) gestartet, die Sammelgellösung zwischen die Glasplatten eingefüllt und ein Probenkamm zur Ausformung der Probentaschen eingeführt. Zur Auspolymerisierung des Sammelgels sollte das Gel für mindestens eine Stunde stehen gelassen werden.
Anmerkungen:
Für die hochauflösende gelelektrophoretische Auftrennung der in biologischen Proben häufig vorkommenden Amyloid-β Peptidvarianten Aß(1-37), Aß(1-38), Aß(1-39), Aß(1-40) und Aß(1-42) ist die Verwendung eines Sarkosyl-Polyacrylamidgels mit einer Gesamtkonzentration von 12 % Acrylamid + Bisacrylamid (12 % T) und ein Verhältnis von Acrylamid zu Bisacrylamid von 19:1 (5% C) geeignet. Für spezielle Fragestellungen, z.B. die Untersuchung von aminoterminal veränderten Aß Varianten, die andere elektrophoretische Wanderungsgeschwindigkeiten zeigen, kann die Gesamtkonzentration an Acrylamid plus Bisacrylamid oder u. U. der relative Anteil an Bisacrylamid (Quervernetzungsgrad) modifiziert werden. Gesamtkonzentrationen von Acrylamid + Bisacrylamid zwischen ca. 8 % und 16 % und Mischungsverhältnisse Acrylamid: Bisacrylamid zwischen 37,5:1 und 19:1 können Anwendung finden. Neben homogenen Trenngelen mit einer Gesamtkonzentration von Acrylamid + Bisacrylamid von ca. 8 - 16 % in einem Verhältnis zwischen 1:37,5 bis 1:19 sind auch Gradientengele für spezifische Fragestellungen geeignet.
Entscheidend für die Auftrennung der genannten Aß-Peptidvarianten in Abwesenheit von Harnstoff ist es, dem Kathodenpuffer, dem Sammelgel und dem Trenngel anstelle von Natriumdodecylsulfat (wie bei der klassischen SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese) das Detergens Sarkosyl zuzusetzen.
Herstellung der Proben
Die Proben werden in einem Probenpuffer, der Natrium-Dodecylsulfat (SDS) oder LithiumDodecylsulfat (LDS) enthält gelöst und zur Denaturierung der Aß-Peptide für 5 Minuten auf 95 °C erhitzt.
Mit den folgenden Probenpuffern wurden akzeptable bis gute Auftrennungen von synthetischen Aß-Peptiden beobachtet:

A) 63-250 mM Tris-HCI, pH 6,8
- 1 % SDS oder 1% Lithiumdodecylsulfat (LDS)
- 15 % (w/v) Sucrose
- 0,02 % Bromphenolblau (oder 0,02 % Brilliant Blue G250)
B) 3 - 250 mM Tris-HCI, pH 6,8
- 1 % SDS oder 1% Lithiumdodecylsulfat (LDS)
- 10 % Glycerin
- 0,02 % Bromphenolblau (oder 0,02 % Brilliant Blue G250)
C) 100mM Tris, 100 mM HEPES
- 1 % SDS oder 1 % LDS
- 10 % Glycerin
- 02 % Bromphenolblau oder 0,02 % Brilliant Blue G250
D) 100mM Tris, 100 mM HEPES
- 1 % SDS oder 1 % LDS
- 15 % SucroseGlycerin
- 0,02 % Bromphenolblau oder 0,02 % Brilliant Blue G250

Es ist davon auszugehen, dass auch andere Variationen an Probenpuffern eine Auftrennung ermöglichen!
Laufbedingungen:
Die Trennung erfolgte bei konstant 160 V für ca. 40-55 Minuten 100 mM Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, 100 mM HEPES, 0,25 % (w/v) N-Lauroylsarcosine sodium salt als Kathodenpuffer und 100 mM Tris, 100 mM HEPES als Anodenpuffer. Es ist davon auszugehen, dass auch andere Elektrophoresepuffer verwendet werden können.
Detektion:
Die Detektion der Aß Peptide kann durch Peptid / Proteinfärbungen im Gel (z.B. Coomassie-Färbung oder Silberfärbungen oder immunologisch nach Western blot erfolgen.
Bezugszeichenliste

1: Probenpuffer
2: Sammelgel
3: Trenngel
4: Anodenpuffer
5: Anodenreservoir
6: Kathodenreservoir
7: Kathodenpuffer
8: elektrisches Feld
9: Kit
10: Probentasche
11: Laufpuffer

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

WO 03/096023 A1 [0011]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Kushnirov et al.: „Purification and analysis of prion and amyloid aggregates“, Methods 2006, 39, 50 [0009]
Graham et al., Proteomics 2005, 5, 2309-2314 [0020]

Claims

Verfahren zur Auftrennung von carboxyterminalen Varianten von Abeta-Peptiden durch Gelelektrophorese, dadurch gekennzeichnet, dass die Gelelektrophorese in Anwesenheit von Natriumlauroylsarcosin (Sarkosyl) durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Sarkosyl in ein Sammelgel (2) und/oder in ein Trenngel (3) und/oder in einen Kathodenpuffer (7) und/oder in einen Anodenpuffer (4) der Gelelektrophorese eingebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Sarkosyl in einer Konzentration zwischen 0,1 % und 0,8 % (w/v) in das Sammelgel (2) und/oder in das Trenngel (3) und/oder in den Kathodenpuffer (7) und/oder in den Anodenpuffer (4) der Gelelektrophorese eingebracht wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das oder ein Sammelgel (2) und/oder das oder ein Trenngel (3) und/oder der oder ein Kathodenpuffer (7) und/oder der oder ein Anodenpuffer (4) und/oder der oder ein Probenpuffer (1) der Gelelektrophorese Harnstoff-frei sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der oder ein Kathodenpuffer (7) und/oder der oder ein Anodenpuffer (4) ein Tris-HEPES-Puffer ist und/oder der oder ein Probenpuffer (1) ein Tris-HCI-Puffer ist und/oder das oder ein Sammelgel (2) und/oder das oder ein Trenngel (3) der Gelelektrophorese ein Tris-HCI-Polyacrylamidgel ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der oder ein Probenpuffer (1) der Gelelektrophorese Sarkosyl-frei und dass in den Probenpuffer (1) der Gelelektrophorese SDS und/oder LDS eingebracht wird/werden.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das SDS und/oder LDS in einer Konzentration zwischen 0,5 % und 2% (w/v) in den Probenpuffer (1) der Gelelektrophorese eingebracht wird/werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in einen oder den Probenpuffer (1) der Gelelektrophorese Glycerin und/oder Saccharose eingebracht wird/werden.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Glycerin in einer Konzentration zwischen 5 % und 20 % (v/v) und/oder die Saccharose in einer Konzentration zwischen 5 % und 20 % (w/v) in den Probenpuffer (1) der Gelelektrophorese eingebracht wird/werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen dem oder einem Sammelgel (2) und/oder dem oder einem Trenngel (3) der Gelelektrophorese ein Sprung des pH-Werts um 1,5 bis 2,5 und/oder von pH 6,5 bis pH 7,0 auf pH 8,5 bis pH 9,0 ausgebildet wird.
Kit (9) zur Auftrennung von carboxyterminalen Varianten von Abeta-Peptiden durch Gelelektrophorese unter Anwendung des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, mit - einem Sammelgel (2) und - einem Trenngel (3), dadurch gekennzeichnet, dass das Sammelgel (2) und das Trenngel (3) Sarkosyl aufweisen.
Kit (9) nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Kit (9) weiterhin einen Sarkosyl enthaltenden Kathodenpuffer (7) und/oder einen Sarkosyl enthaltenden Anodenpuffer (4) umfasst.
Kit (9) nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Sarkosyl in einer Konzentration zwischen 0,1 % und 0,8 % (w/v) in dem Sammelgel (2) und/oder in dem Trenngel (3) und/oder in dem oder einem Kathodenpuffer (7) und/oder in dem oder einem Anodenpuffer (4) des Kits (9) vorhanden ist.
Kit (9) nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Sammelgel (2) und/oder das Trenngel (3) und/oder der oder ein Kathodenpuffer (7) und/oder der oder ein Anodenpuffer (4) und/oder ein Probenpuffer (1) des Kits (9) Harnstoff-frei sind.
Kit (9) nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass der oder ein Kathodenpuffer (7) und/oder der oder ein Anodenpuffer (4) des Kits (9) ein Tris-HEPES-Puffer ist und/oder der oder ein Probenpuffer (1) des Kits (9) ein Tris-HCI-Puffer ist und/oder das Sammelgel (2) und/oder das Trenngel (3) ein Tris-HCI-Polyacrylamidgel ist.
Kit (9) nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass der oder ein Probenpuffer (1) des Kits (9) Sarkosyl-frei ist und SDS und/oder LDS aufweist.
Kit (9) nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das SDS und/oder LDS in einer Konzentration zwischen 0,5 % und 2 % (w/v) in dem Probenpuffer (1) enthalten ist/sind.
Kit (9) nach einem der Ansprüche 11 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass in dem oder einem Probenpuffer (1) des Kits Glycerin und/oder Saccharose enthalten ist/sind.
Kit (9) nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Glycerin in einer Konzentration zwischen 5 % und 20 % (v/v) und/oder die Saccharose in einer Konzentration zwischen 5 % und 20 % (w/v) in dem Probenpuffer (1) enthalten ist/sind.
Kit (9) nach einem der Ansprüche 11 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen dem Sammelgel (1) und/oder dem Trenngel (3) ein Sprung des pH-Werts um 1,5 bis 2,5 und/oder von pH 6,5 bis pH 7,0 auf pH 8,5 bis pH 9,0 ausgebildet ist.