PT1114861E

PT1114861E - Gene ly6h

Info

Publication number: PT1114861E
Application number: PT99943357T
Authority: PT
Inventors: Masato Horie; Keiichi Okutomi; Yoshihiro Taniguchi; Mikio Suzuki; Yutaka Ohbuchi
Original assignee: Otsuka Pharma Co Ltd
Priority date: 1998-09-17
Filing date: 1999-09-16
Publication date: 2007-01-31
Also published as: DE69934239D1; AU5651899A; BR9913850A; US20100261880A1; US7582732B2; US20090017479A1; CN1240834C; EP1114861B8; US20040254340A1; US20080275218A1; DE69934239T8; AU767878B2; CY1107552T1; WO2000017345A1; ATE346923T1; DK1114861T3; EP1114861A4; US7432363B2; EP1114861A1; JP4403443B2

Description

DESCRIÇÃO

GENE LY6H

ÂMBITO TÉCNICO A presente invenção tem por objecto um gene expresso com elevada especificidade a um nível elevado do cérebro, mais particularmente um gene que codifica para uma nova proteína que pertence à família Ly6 (ver a literatura citada a seguir), que tinha sido utilizada na purificação de células indiferenciadas do sangue, em estudos sobre a diferenciação das células do sangue, na activação de células imunitárias, na inibição da produção de células imunitárias activas, no tratamento de tumores e similares. A presente invenção ainda tem por objecto uma nova proteína codificada pelo referido gene e o seu anticorpo específico. Além disso, a presente invenção ainda tem por objecto uma composição terapêutica e profiláctica para doenças neurodegenerativas tal como a doença de Alzheimer.

TÉCNICA ANTERIOR

As proteínas da família Ly6 têm uma estrutura de baixo peso molecular, ancorada em GPI e têm sido identificadas como uma classe de glicoproteínas da superfície das células que formam um conjunto de genes no cromossoma 15 de ratos [Proc. Natl. Acad. Sei., EUA., 84, 1638-1643 (1987)]. A família de Ly6 é especificamente expressa em níveis elevados nas células da medula óssea e nas células linfoides e, por isso, tem sido utilizada como um marcador para a diferenciação das células T e das células indiferenciadas hematopoiéticas [Immunol. Cell Biol., 73, 277-296 (1995)]. 1

Embora ainda falte conhecer muito sobre as suas funções in vivo, a verificação de que a sua expressão é altamente modulada no sistema linfocitico sugere que estas proteínas estão a desempenhar papéis importantes no sistema imunitário, particularmente na diferenciação e na função das células T. Já foi referido que o gene Ly6c, por exemplo, medeia o alojamento das células T de CD8+ nos nódulos linfáticos através da adesão dependente de integrina [Proc. Natl. Acad. Sei., EUA., 94, 6898-6903 (1997)].

Além disso, muitas proteínas ancoradas a GPI são conhecidas por interagirem com proteína cinases [Science, 254, 1016-1019 (1991)]. Por exemplo, a interaeção de Ly6 com p561ck e p59fyn sugere a probabilidade do seu envolvimento na transdução do sinal das células T [Eur. J. Immunol., 23, 825-831 (1993)]. Também já foi referido que as células T

derivadas de ratos a que falta Ly6a melhoraram na sua capacidade para proliferar em resposta a uma estimulação antigénica [J. Exp. Med., 186, 705-717 (1997)]. A possibilidade da sua regulação não só na activação das células T mas também na das células B também tem sido sugerida [J. Immunol., 144, 2197-2204 (1990)].

Além disso, várias proteínas ancoradas em GPI são conhecidas por terem sido expressas e por funcionarem tanto no sistema linfocitico como no sistema nervoso [Nature, 379, 826-829 (1996); Curr. Biol., 7, 705-708 (1997)]. Na família de Ly6, Ly6a.2 e Ly6E são relatadas como estando presentes e funcionando em ambos os sistemas [Proc. Natl. Acad. Sei., USA., 85, 2255-2259 (1996); J. Immunol, 157, 969-973 (1996)]. A elucidação dos papéis desempenhados por essas proteínas da família de Ly6 e os genes que codificam para as proteínas e a informação resultante são consideradas como 2 podendo ser utilizadas nos domínios da investigação científica fundamental assim como no domínio farmacêutico em ligação com a purificação das células indiferenciadas do sangue, estudos sobre diferenciação das células do sangue, activação das células imunitárias, inibição da produção de células imunitárias activas, terapia de tumores e similares.

Recentemente, relatou-se, em pacientes com doença de Alzheimer, uma atrofia excessiva do lóbulo temporal cerebral guando comparada com a atrofia cerebral associada à idade [Jobst, K. A., et al. , Lancet, 343, 829-830 (1994)], sugerindo que o mesmo gene ou genes com suporte no lóbulo temporal do cérebro estão de alguma forma associados com o início e a progressão da doença de Alzheimer. É lógico assumir que esse gene tem de ser identificado ou caracterizado, o que pode permitir assim obter informação útil para a terapia e a profilzxia da doença de Alzheimer. A patente de invenção WO 97/18224 tem por objecto um polipéptido do antigénio 2 de uma célula humana indiferenciada e o ADN (ARN) que codifica esse polipéptido e um processo para a produção desse polipéptido por técnicas recombinantes, processos para a utilização desse polipéptido para a estimulação da maturação e diferenciação timocítica, protecção das células dos neurónios, prevenção da rejeição durante a transplantação do órgão, tratamento de PNH, doença de Alzheimer e inflamação, assim como ensaios de diagnóstico para a identificação de mutações na sequência de ácido nucleico que codifica o referido polipéptido e para a detecção de níveis alterados do polipéptido para a detecção da doença, por exemplo, o cancro.

Brackenhoff et al. , The Journal of Cell Biology, vol. 129, n° 6, Junho de 1995, páginas 1677-1689, é uma publicação 3 científica relacionada com o antigénio E48 humano que é referido como sendo altamente homólogo do antigénio ThB de murino, um membro da família de antigénios de Ly-6 e que está envolvido na adesão célula-célula de queratinócitos.

Mao et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, vol. 93, Junho de 1996, páginas 5910-5914 é uma publicação científica relacionada com RIG-E, um homólogo humano da família de Ly-6 de murino, que é induzido por ácido retinoico durante a diferenciação das células de leucemia promielocítica aguda. A regulação e a expressão selectiva de Ly-6A/E, uma molécula de activação de linfócitos no sistema nervoso central, foram referenciadaa por Cray et al., Molecular Brain Research, vol. 8, 1990, páginas 9-15. A análise das três sequências distintas de ADNc relacionadas com Ly-6, isoladas de rim de rato, que estão mais fortemente relacionadas com Ly-6A do que com Ly-6C, foram relatadas por Friedman et al., Immunogenetics, vol. 31, 1990, páginas 104-111. A expressão, estrutura e função do tecido da família Ly-6 de murino das moléculas foi revista por Gumley et al., Immunology and Cell Biology, vol. 73, 1995, páginas 277-296, embora as funções de moléculas de Ly-6 in vivo não sejam conhecidas até agora.

Por isso, um dos objectos da presente invenção consiste em providenciar a informação anterior necessária aos que dela precisam, particularmente uma nova proteína humana pertencendo à família de Ly6 e um gene que codifica para a proteína.

Um outro objecto da presente invenção consiste em providenciar uma composição farmacêutica para a terapia e a profilaxia de várias doenças neurodegenerativas, representadas pela doença de Alzheimer. 4 O requerente explorou os genes derivados de vários tecidos humanos e teve sucesso no isolamento e na caracterização de um novo gene específico do cérebro que verifica os objectos anteriores. O requerente ainda verificou que o nível de expressão deste gene que acabou de ser isolado está marcadamente diminuído no lóbulo temporal, inclusive do hipocampo e do córtex entorinal de um paciente com doença de Alzheimer, isto é, um factor causador do início e da progressão da doença de Alzheimer e da demência e outros distúrbios e que este gene e o produto da sua expressão podem ser explorados com vantagem na terapia e na profilaxia da doença de Alzheimer. A presente invenção foi realizada com base nestas verificações.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO A presente invenção providencia um gene que compreende uma sequência de nucleótido que codifica uma das proteínas de (a) ou de (b) . (a) uma proteína que tem a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1 (b) uma proteína que tem a sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1 por eliminação, substituição ou adição de um ou vários aminoácidos e tendo actividade de mnemónica, em que a referida sequência de aminoácidos é pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO: 1. A presente invenção também tem por objecto o gene anterior em que a sequência de nucleótidos está indicada na SEQ ID NO: 2, em particular em que o gene é humano. 5

Além disso, a presente invenção tem por objecto um gene que compreende os polinucleótidos de (a) e (b) que se seguem, particularmente o gene humano correspondente. (a) um polinucleótido contendo a sequência de nucleótidos mostrada na SEQ ID NO: 3 (b) um polinucleótido que híbrida em condições severas com um ADN comportando a sequência de nucleótidos mostrada na SEQ ID NO: 3, em que o referido polinucleótido codifica uma sequência de aminoácidos que composta actividade de mnemónica. A presente invenção tem ainda por objecto um vector de expressão de genes que comporta o referido gene; uma célula hospedeira que comporta o referido vector de expressão do gene; uma proteína codificada pelo gene da presente invenção; e um anticorpo que liga o referido produto de expressão ou a referida proteína. A presente invenção tem ainda por objecto uma composição terapêutica e profiláctica para as doenças degenerativas, que compreende a referida proteína ou um seu equivalente ou o referido produto de expressão como um ingrediente activo em combinação com um veículo farmacêutico. Mais particularmente, a presente invenção tem por objecto a composição terapêutica e profiláctica para doenças neuro-degenerativas, em que o referido ingrediente activo é uma proteína com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID n° 1 ou uma sequência equivalente ou um produto de gene que se obtém por expressão do todo ou de parte de um gene que compreende uma sequência de nucleótidos mostrada na SEQ ID NO:2 e comportando a acção de formação da memória do cérebro (mnemónica, codificação). 6

Especialmente, a presente invenção tem por objecto a composição terapêutica e profiláctica da doença de Alzheimer, a demência do tipo de Alzheimer, a isquémia do cérebro e a doença de Parkinson.

Além disso, a presente invenção tem por objecto um processo de rastreio de compostos candidatos que ou são capazes de se ligar à referida proteína, o seu equivalente ou produto de expressão ou que influencia a sua actividade que compreende a utilização da referida proteína, equivalente ou produto de expressão; um kit para a referida análise; e o referido composto assim rastreado. A representação dos aminoácidos, péptidos, sequências de nucleótidos, nucleótidos, etc., por abreviaturas, na descrição, está de acordo com as regras recomendadas pela IUPAC -IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138, 9 (1984)], "Guideline for drafting patent specifications relative to nucleotide sequences and/or amino acid sequences" (editado pelo Instituto de Patentes do Japão) e as convenções estão relacionadas com a utilização de códigos ou símbolos da técnica.

Um exemplo específico do gene da presente invenção é o gene deduzido da sequênacia de aDN do produto de RCP designado por "LY6H", tal como descrito no exemplo que aparecerá aqui à frente. A sua sequência de nucleótidos está indicada na SEQ ID NO: 3. O gene LY6H é um ADNc que contém um fragmento de leitura aberta (FLA) do codão 420, codificando para uma nova proteína específica do cérebro (proteína de LY6H) compostando uma sequência de 140 resíduos de aminoácidos como se mostra na 7 SEQ ID NO: 1 e comportando uma sequência de comprimento completo com 854 nucleótidos.

Verificou-se que a proteína do LY6H, que é o produto de expressão do gene da presente invenção, tem uma elevada homologia com as proteínas da família Ly6 de rato [Immunol. Cell Biol. , 7_3, 277-295 (1995)] por meio de uma pesquisa numa base de dados do GenBank/EMBL utilizando o programa FASTA (Person, W. R. et al. , Proc. Natl. Acad. Sei., USA., 85, 2444-2448 (1988)). Além disso, reconheceu-se uma elevada homologa de gene para gene. Por isso, o gene da presente invenção é considerado como um novo gene humano de Ly6. O gene de Ly6 da presente invenção é foi identificado como sendo um gene que é especificamente expresso no cérebro pela sequenciação de mais do que 28000 clones de ADNc seleccionados aleatoriamente a partir de uma biblioteca de ADNc de cérebro humano. Por meio do mapeamento dos cromossomas de RH [Hum. Mol. Genet., 5, 339-346 (1996)], verificou-se que o locus do gene no cromossoma era 8q24. 3.

Assim, o gene e o produto de expressão da presente invenção contribuem para a detecção da expressão do gene em vários tecidos, para a produção de proteína humana LY6H por meio de técnicas de engenharia genética e para a construção de um seu anticorpo, permitindo assim a purificação de células indiferenciadas hematopoiéticas, estudos de diferenciação de células de sangue, activação ou supressão de células imunitárias, terapia de tumores e similares.

Além disso, o produto de expressão (polipéptido) da presente invenção, assim providenciado, permite a provisão de um fármaco para a profilaxia e a terapia de doenças neuro-degenerativas tal como doença de Alzheimer, demência do tipo 8 de Alzheimer, doença de Parkinson e isquémia cerebral. Além disso, a estrutura helicoidal no sentido do gene, de acordo com a presente invenção, pode ser utilizada como uma composição farmacêutica para a terapia de genes, com a qual o início e a progressão das doenças neuro-degenerativas mencionadas antes podem ser inibidas ou paradas. A presente invenção ainda tem por objecto um processo de rastreio para compostos que ou se ligam ou influenciam a actividade do produto de expressão (polipéptido) da presente invenção e um kit relevante para o rastreio, assim como também os compostos assim rastreados. Para a identificação desses compostos rastreados, pode-se utilizar um anticorpo que se liga ao produto de expressão do gene da presente invenção.

Na descrição, o termo "gene" é utilizado para significar um ADN de estrutura helicoidal dupla e o seu ADN constituído por uma estrutura helicoidal de ADN simples, quer num sentido quer no sentido inverso, independentemente do seu comprimento. Por isso, a menos que seja indicado de outra forma, o gene (ADN) da presente invenção inclui um ADN de estrutura helicoidal dupla contendo um ADN genómico, humano, um ADN de estrutura helicoidal simples (estrutura helicoidal num sentido) inclusivé do ADNc, um ADN de estrutura helicoidal simples (estrutura helicoidal num sentido inverso) com uma sequência complementar da referida estrutura helicoidal no mesmo sentido e fragmentos dos referidos ADNs. O gene (ADN) da presente invenção pode conter uma sequência leader, uma região de codificação, exões e intrões. O polinucleótido inclui tanto ARN como ADN. 0 ADN inclui ADNc, ADN genómico e ADN sintético. O polipéptido inclui os seus fragmentos, homólogos, derivados e mutantes. Os mutantes 9 incluem alelos que ocorrem naturalmente, mutantes que não existem naturalmente, mutantes que têm sequências de aminoácidos mutadas por eliminação, substituição, adição e/ou inserção e mutantes que têm funcionalidades equivalentes às das sequências de aminoácidos modificadas.

Essas modificações (por exemplo, mutações) de sequências de aminoácidos podem, por exemplo, ocorrer de mutação espontânea ou modificação post-translacional mas poodem ser artificalmente induzidos pela utilização de um gene natural (por exemplo, genes específicos da presente invenção. A homologia desses mutantes em relação ao polipéptido não mutado pode ser de pelo menos de 7 0 %, preferencialmente de 80 %, mais preferencialmente 95 %, ainda mais preferencialmente 97 %. 0 polipéptido anterior e os seus mutantes e homólogos têm uma característica estrutural conservada em comum e podem ter actividades biológicas do produto de expressão do gene da presente invenção, tal como a acção de suporte da sobrevivência dos neurónios, a acção de estimulação do crescimento dos neurónios, acção de geração de nervos e acção de estimulação de nevróglia. A homologia dos polipéptidos pode ser analisada por pesquisa através de uma base de dados tal como a base de dados SWISSPLOTS utilizando um software de análise de sequências tal como FASTA [Clustal, V., Methods Mol. Biol., 25, 307-318 (1994)]. A codificação do gene para esse mutante é silenciosa ou está conservada para a substituição de aminoácidos. Assim, os resíduos de aminoácidos codificados pela sequência de nucleótidos não estão alterados.

Os resíduos de aminoácidos substituíveis de forma conservadora, isto é, os resíduos de aminoácidos substituí- 10 veis por outros resíduos de aminoácidos sem perda das actividades dos polipéptidos que tem esses resíduos de aminoácidos e os resíduos de aminoácidos correspondentes são os que se seguem. Resíduo original de Resíduo de aminoác aminoácido substituição conservadora Ala Ser Arg Lis Asn Gin, His Asp Gli Cis Ser Gin Asn Glu Asp Gli Pró His Asn ou Gin Ile Leu ou Vai Leu Ile ou Vai Lis Arg, Aln ou Gli Met Leu ou Ile Fen Met, Leu ou Tir Ser Tre Tre Ser Trp Tir Tir Trp ou Fen Vai Ile ou Leu de

Além disso, Cis pode ser substituído por um tipo diferente de resíduo de aminoácido, por exemplo, Ser, Ala ou Vai. 0 gene e o produto de expressão de acordo com a presente invenção providenciam informação e meios de grande utilidade para elucidação, explicação pormenorizada, diagnóstico, profilaxia e terapia das doenças neurodegenerativas tais como a doença de Alzheimer , isquêmia cerebral e doença de Parkinson. 0 gene da presente invenção pode também ser utilizado com vantagem para o desenvolvimento de novos fármacos capazes de induzir a expressão do gene para ser utilizado no tratamento das referidas doenças neurodegenerativas. Além disso, a detecção da expressão do gene da presente invenção e do produto de expressão resultante em indivíduos ou tecidos e a detecção da mutação (eliminação ou mutação de um ponto) do gene ou da sua expressão anormal podem ser utilizados com vantagem para a elucidação e o diagnóstico das referidas doenças neurodegenerativas. O gene da presente invenção inclui mas não se limita ao gene que comporta a sequência de nucleótidos mostrada na SEQ ID NO: 2 que codifica para uma proteína com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1, por exemplo um gene (gene LY6H) comportando a sequência de nucleótidos mostrada na SEQ ID NO: 3. Por exemplo, o gene da presente invenção pode ser um gene que codifica para uma sequência de aminoácido derivada da sequência de aminoácidos definida antes por uma dada modificação, um gene que codifica para uma sequência de aminoácidos para uma dada modificação, um gene de codificação para uma sequência de aminoácidos com um dado grau de homologia com a sequência de aminoácidos definida antes ou um gene que comporta uma sequência de nucleótidos comportando um dado grau de homologia com qualquer um dos genes anteriores.

Esse grau de homologia mencionado antes com uma sequência de aminoácidos definida ou com uma sequência de nucleótidos significa uma homologia de pelo menos não menos do que 70 %, preferencialmente não menos do que 90 %, mais preferen- 12 cialmente não menos do que 95 %, ainda mais preferencialmente não menos do que 97 %. A presente invenção engloba homólogos (genes homólogos e homólogos de proteína) comportando a mesma homologia. 0 gene da presente invenção inclui "um gene que codifica para um polipéptido que comporta uma sequência de aminoácidos (sequência de aminoácidos modificada) derivada da sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1 por eliminação, substituição ou adição de uma ou uma pluralidade de aminoácidos". A dimensão e a posição ou posições de "eliminação, substituição ou adição" não são particularmente restritas dado que o polipéptido resultante com uma sequência de aminoácidos modificada é equivalente, na função biológica, ao polipéptido (proteína de LY6H) comportando a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1. A "função biológica", mencionada antes inclui funções fisiológicas tais como a acção de suporte da sobrevivência dos neurónios, a acção de elongação dos nervos, a acção de regeneração dos nervos, a acção de activação da nevróglia e a acção mnemónica e o "equivalente" é um polipéptido que tem essa função. Por isso, a proteína que comporta essa sequência de aminoácidos modificada inclui uma proteína (equivalente) comportando um fragmento (uma fracção de resíduo consecutivo) da sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1 e comportando actividades fisiológicas semelhantes às mencionadas antes para o comprimento completo da referida sequência de aminoácidos. Além disso, o gene que codifica para um polipéptido comportando a sequência de aminoácidos mencionada antes pode ser um gene com o qual o gene da presente invenção codifica um polipéptido comportando a pré-modificação da sequência de aminoácidos que pode ser detectada. 0 termo pluralidade, tal como se utiliza em ligação com a referida 13 modificação normalmente significando não menos do que 2 mas até várias, embora o intervalo não seja restrito. O homólogo do gene LY6H (e o homólogo do produto de expressão do gene), de acordo com a presente invenção, significa qualquer série de genes relacionados (e os seus produtos de expressão) que são homólogos na sequência e reconhecidos como uma família de genes a partir das suas características estruturais, modelo de expressão dos genes comuns e semelhanças na referida função biológica. Assim, obviamente, inclui alelos dos genes da presente invenção. A modificação (mutação) de uma sequência de aminoãcidos pode ocorrer naturalmente, por exemplo por mutação espontânea e modificação post-translacional mas pode ser induzida artificalmente com base no gene original (por exemplo, o gene específico da presente invenção). A presente invenção cobre qualquer um e todos os genes modificados comportando as características anteriores sem olhar à causa ou aos meios da modificação ou da mutação.

Os meios artificaiais para a referida modificação (mutação) da sequência de aminoácidos inclui técnicas de engenharia genética tais como mutagénese específica do sítio [Methods in Enzymology, 154, 350, 367-382 (1987); ibid., 100, 468 (1983); Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984); "Zoku Seikagaku Jikken Koza (Experiments in Biochemistry, Second Series) 1": Idenshi Kenkyuho (Methods in Gene Research) II, the Biochemical Society of Japan (ed.), p 105 (1986), etc.], processos de síntese química tal como o processo de fosfotriéster e o processo de fosfoamidite [J. Am. Chem. Soc., 89, 4801 (1967); ibid., 91, 3350 (1969); Science, 150, 178 (1968); Tetrahedron Lett., 22, 1859 (1981); ibid., 24, 245 (1983)] e combinações desses processos. 14

Mais particularmente, o ADN pode ser sintetizado por um processo químico tal como o processo da fosfoamidite ou o processo de fosfotriéster e esta síntese pode ser efectuada num sintetizador automatizado de oligo-nucleótidos disponível comercialmente. O fragmento com uma estrutura helicoidal dupla pode ser obtido a partir de um fragmento sintetizado quimicamente, com uma estrutura helicoidal simples por meio da síntese de uma estrutura helicoidal complementar e anelou-as em condições apropriadas ou adicionando a estrutura helicoidal complementar utilizando uma sequência iniciadora apropriada e uma polimerase de ADN.

Um exemplo específico do gene de acordo com a presente invenção é o gene que comporta a sequência de nucleótidos mostrada na SEQ ID NO: 3. A região de codificação (a sequência mostrada na SEQ ID NO: 2) desta sequência de nucleótidos é um exemplo da combinação de codões que especificam os respectivos resíduos de aminoácidos da sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1. O gene da presente invenção não está limitado ao gene que comporta a referida sequência de nucleótidos definida mas inclui qualquer gene que comporta uma sequência de nucleótidos que se pode obter por meio da selecção de qualquer combinação arbitrária de codões pode ser feita por rotina, com referência à utilização do codão no hospedeiro a ser utilizado [Nucleic Acids Res., 9, 43 (1981)].

Além disso, o gene da presente invenção inclui um que comporta uma sequência de nucleótidos que mostra um certo nível de homologia com a sequência de nucleótidos mostrada na SEQ ID NO: 3. Infere-se a partir do referido nível de homologia que são polinucleótidos e polinucleótidos complementares com pelo menos 70 % de homologia, preferencialmene pelo menos 90 % de homologia, mais preferencialmente pelo menos 95 % de 15 homologia, com a sequência de nucleótidos mostradas na SEQ ID NO: 3. O gene que comporta esse nível de homologia pode ser caracterizado, por exemplo, como um polinucleótido que híbrida com um ADN com a sequência de nucleótidos mostrada na SEQ ID NO: 3 em condições severas. Mais particularmente, o gene que comporta uma sequência de nucleótidos que híbrida com o ADN comportando a sequência de nucleótidos mostrada na SEQ ID NO: 3 em condições de 6 x CSP a 65 °C durante a noite ou formamida-4 a 50 % x CSP a 37 °C durante a noite está incluída no conceito do gene que tem o referido nível de homologia. Aqui, CSP significa citrato salino padrão (1 x CSP = NaCl 0,15 M, citrato de sódio 0,015 M). O gene da presente invenção pode ser facilmente produzido e isolado pele tecnologia geral da engenharia genética à base da informação sobre a sequência em qualquer exemplo específico do gene da presente invenção como se descreve nesta descrição (por exemplo, Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989); Zoku Seikagaku Jikken Koza (Experiments in Biochemistry, Second Series): "Idenshi Kenkyuho (Methods in Gene Research) I, II, III, the Biochemical Society of Japan (ed.), (1986)].

Mais particularmente, isto pode ser feito por meio da preparação de uma biblioteca de ADNc a partir de uma fonte apropriada, em que o gene da presente invenção pode ser expresso, por um processo de rotina e em que se selecciona um clone desejado desta biblioteca utilizando uma sonda apropriada ou um anticorpo específico do gene da presente invenção [Proc. Natl. Acad. Sei., EUA., 7_8, 6613 (1981); Science, 222, 778 (1983)]. A fonte de ADNc, que pode ser utilizada no processo anterior inclui várias células e tecidos que expressam o gene 16 da presente invenção, assim como as células de cultura que dele derivam, particularmente tecidos do cérebro. O isolamento do ARN total dessa fonte, o isolamento e a purificação de ARNm e a aquisição e clonagem de ADNc podem também ser realizados de uma forma convencional. Além disso, as bibliotecas de ADNc estão comercialmente disponíveis e a presente invenção pode ser realizada na prática utilizando essas bibliotecas de aDNc, por exemplo as bibliotecas de ADNc disponíveis no CLONTECH Lab. Inc. 0 processo de rastreio para o gene da presente invenção a partir de uma biblioteca de ADNc não está particularmente restrito mas pode utilizar-se o processo convencional. Exemplos de processos de rastreio incluem um processo de imuno-rastreio utilizando um anticorpo específico da proteína produzida por um ADNc para seleccionar o clone de ADNc correspondente, um processo utilizando uma sonda de ligação selectiva à sequência de ADN alvo, tal como um processo de hibridação de placa e um processo de hibridação de colónias e uma combinação desses processos.

Como sonda para o processo anterior, o ADN sintetizado quimicamente, de acordo com a informação da sequência de nucleótidos no gene da presente invenção pode ser utilizado, de uma forma geral. 0 gene da presente invenção que já tenha sido obtido ou um seu fragmento pode também ser utilizado como sonda, com vantagem. 0 iniciador de um sentido e o iniciador de sentido contrário estabelecidos de acordo com a informação da sequência de nucleótidos sobre o gene da presente invenção podem ser utilizados como sondas de rastreio. A sequência de nucleótidos a ser utilizada como sonda pode ser uma sequência parcial de nucleótidos correspondendo 17 à SEQ ID NO: 2 e compreendendo pelo menos 10 nucleótidos consecutivos, preferencialmente 20 nucleótidos consecutivos, mais preferencialmente 30 nucleótidos consecutivos e o que é mais preferencial, 50 nucleótidos consecutivos. Além disso, o clone positivo que comporta a sequência de nucleótidos mostrada na SEQ ID NO: 2 como tal pode ser utilizado como a sonda.

Na obtenção do gene da presente invenção, a amplificação de ADN/ARN por RCP [Science, 230, 1350 (1985)] pode ser utilizada com vantagem. Particularmente quando é difícil de obter um ADNc de comprimento completo a partir de uma biblioteca, pode-se utilizar, com vantagem, o processo RACE [Rapid amplification of cDNA ends; Jikken Igaku (Experimental Medicine), 12 (6), 35 (1994)], especialmente o processo 5'-RACE [Μ. A. Frohman, et al., Proc. Natl. Acad. Sei., EUA., 8, 8998 (1988)] .

Os iniciadores que se utilizam nesses processos de RCP podem ser judiciosamente estabelecidos com referência à informação da sequência sobre o gene da presente invenção tal como descrito aqui e pode ser sintetizado por um processo de rotina. O isolamento e a purificação do fragmento de ADN/ARN amplificado pode ser realizado de uma forma de rotina tal como se mencionou antes, por exemplo pelo processo de electroforese em gel. A sequenciação do gene da presente invenção tal como se obteve da forma anterior ou de vários fragmentos de ADN pode ser feita de acordo com o processo do didesoxi [Proc. Natl. Acad. Sei., EUA., 74, 5463 (1977)] ou o processo de Maxam e Gilbert [Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)] ou de uma forma mais expedita utilizando um kit comercial de sequenciação . 18

Por exemplo, com o gene da presente invenção assim obtido, a expressão ou a não expressão do gene da presente invenção num indivíduo ou num dado tecido pode ser especificamente detectada utilizando uma porção ou toda a sequência de nucleótidos do gene da presente invenção. A detecção anterior pode ser feita por processos convencionais, tais como a amplificação de ARN por RCP-TR (reacção em cadeia de polimerase - transcrita reversamente; E.S. Kawasaki, et al., Amplification of RNA. Em PCR Protocol. A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. , SanDiego, 21-27 (1991)], análise de mancha de Northern [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Lab. (1989)], determinação do nível cellular por meio de RCP-TR in situ [Nucl. Acids Res., 21, 3159-3166 (1993)] ou hibridação in situ, NASBA [nucleic acid sequence-based amplification, Nature, 350, 91-92 (1991)] e técnicas convencionais semelhantes, O porcesso de detecção preferido é o da RCP-TR. O iniciador que se utiliza quando se escolhe o processo de RCP para os fins anteriores não está parcialmente restrito desde que seja característico do gene da presente invenção e capaz de amplificar selectivamente apenas o gene em particular e pode ser judiciosamente estabelecido com base na informação da sequência do gene da presente invenção. Normalmente, pode-se utilizar como iniciador um gene que tenha uma sequência parcial do gene da presente invenção, que tem um comprimento de cerca de 10-35 nucleótidos, preferencialmente com 15-30 nucleótidos de comprimento. O gene da presente invenção, inclui assim o fragmento do ADN que pode ser utilizado como um iniciador específico e/ou a sonda específica para a detecção do gene LY6H da presente invenção. 19 O fragmento de ADN mencionado antes pode ser definido como um polinucleótido que híbrida com o polinucleótido que comporta a sequência de nucleõtido mostrada na SEQ ID NO: 2 em condições severas. As condições severas mencionadas antes podem ser condições normais para iniciadores ou para sondas e, como tal, não são particularmente restritas. Por exemplo, podem-se mencionar as condições mencionadas antes de 6 x CSP, a 65 °C, durante a noite ou a condição formamida a 50 % - 4 x CSP, a 37 °C, durante a noite.

Aplicando o gene da presente invenção à tecnologia de engenharia genética padrão, o produto da expressão (polipé-ptido) do gene ou de uma proteína que o contenha pode ser facilmente produzido em grandes quantidades e com uma boa reprodutibilidade.

Por isso, a presente invenção tem por objecto um poli-péptido comportando uma sequência de aminoácidos codificada pelo gene da presente invenção (o produto da expressão da presente invenção), um vector que comporta o gene da presente invenção para a produção do polipéptido, uma célula hospedeira transfectada com o vector e um processo para a produção do polipéptido da presente invenção que compreende o crescimento da célula hospedeira. 0 polipéptido (proteína de LY6H) comportando a sequência de aminoácidos indicada como SEQ ID NO: 1 é um enquadramento específico do polipéptido da presente invenção. 0 polipéptido da presente invenção não se limita a esta proteína de LY6H mas inclui o seu homólogo. O homólogo pode ser um polipéptido que comporta uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1 por meio de eliminação, substituição ou adição de um ou mais aminoácidos e retendo a mesma função como a proteína de LY6H. Um exemplo 20 específico do homólogo é o produto de expressão de um homólogo do referido gene de LY6H (o gene equivalente de LY6H inclusive do alelo).

Além disso, o homólogo da proteína de LY6H da presente invenção inclui proteínas que comportam a mesma actividade ou a mesma função que o polipéptido que comporta a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1 conforme se pode derivar de qualquer mamífero, tal como equinos, ovelhas, gado bovino, caninos, macacos, gatos, ursos, etc. e roedores tais como ratos, murganhos e coelhos. 0 polipéptido da presente invenção pode ser produzido pela tecnologia convencional do ADN recombinante [por exemplo, Science, 224, 1431 (1984); Biochem. Biophys. Res. Comm., 130, 692 (1985); Proc. Natl. Acad. Sei., EUA., 80, 5990 (1983)] com base na informação sobre a sequência dada pela presente invenção.

Mais particularmente, a produção do referido polipéptido realiza-se pelo processo que compreende a construção de um ADN recombinante (vector de expressão) que permite a expressão do gene que codifica para a proteína desejada numa célula hospedeira, transformando a célula hospedeira com o vector, fazendo crescer o transformante resultante e recolhendo o péptido do caldo de cultura. A célula hospedeira mencionada antes pode ser qualquer uma de uma célula procariótica ou de uma célula eucariótica. Como célula procariótica, podemos mencionar Escherichia coli, Bacillus subtilits e outras bactérias comuns e podem utilizar-se, preferencialmente, células de Escherichia coli, particularmente células de Escherichia coli K12. As células hospedeiras eucarióticas incluem células da linha de células 21 de macaco COS [Cell, 23: 175 (1981)] , células de ovário de hamster chinês e as suas células deficitárias em di-hidrofolato-redutase [Proc. Natl. Acad. Sei., EUA., 77: 4216 (1980) ]. Em termos destas últimas, podem utilizar-se, com vantagem, células de fungos do género Saccharomyces, mas não são as únicas escolhas.

Quando se utilizam células procarióticas como células hospedeiras, pode-se utilizar, com vantagem, uma estrutura de plasmido de expressão preparada utilizando um vector que é replicado numa célula hospedeira particular e adiciona-se um promotor e a sequência de SD (Shine e Dalgarno) a montante do gene da presente invenção de modo a que o gene lá possa ser expresso assim como um codão de iniciação (por exemplo ATG) necessário para a iniciação da síntese da proteína. Como o vector mencionado antes, é normal utilizar-se plasmidos derivados de Escherichia coli, tais como pBR322, pBR325, pUC12, pUC13, etc. Contudo, estas não são escolhas exclusivas mas podem utilizar-se vários vectores conhecidos. Exemplos de vectores comerciais para serem utilizados nos sistemas de expressão utilizando E. coli incluem pGEX-4T (Amersham Pharmacia Biotech), pMAL-C2, pMAl-P2 (New England Biolabs), pET21, pET21/lacq (Invitrogen) e pBAD/His (Invitrogen).

Como vector de expressão para ser utilizado quando se utilizam células hospedeiras de um vertebrado, normalmente utiliza-se o vector que comporta um promotor a montante do gene da presente invenção a ser expresso, os sítios de seccionamento de ARN, o sítio de poliadenilação e uma sequência de terminação da transcrição e este vector pode ainda ter uma origem de replicação se necessário. Um exemplo específico do vector de expressão é um pSV2dhfr que comporta um promotor precoce de SV40 [Moi. Cell. Biol., 1: 854 (1981) ]. Independemente dos anteriores, podem utilizar-se 22 vários vectores conhecidos disponíveis comercialmente. Exemplos de vectores comerciais que são utilizados nos sistemas de expressão que utilizam células de animais incluem vectores para células de animais, tais como pEGFP-N, pEGFP-C (CLONTECH), pIND (Invitrogen), pcDNA3.1/His (Invitrogen), etc., e vectores para células de insectos, tais como pFastBac HT (Gibci BRL), pAcGHLT (PharMingen), pAc5/V5-His, pMT/V5-HÍs e pMT/Bip/V5-his (todos da Invitrogen). pAM82, que comporta um promotor para o gene da fosfatase ácida [Proc. Natl. Acad. Sei., EUA., 80g 1 (1983)] é um exemplo específico do vector de expressão para ser utilizado quando as células de fungos são utilizadas como células hospedeiras. Os vectores de expressão comerciais para as células de fungos incluem pPICZ (Invitrogen) e pPICZ alfa (Invitrogen). O promotor não está particularmente restrito. Quando se utiliza uma estirpe do género Escherichia como hospedeiro, pode-se utilizar, com vantagem, promotor de triptofano (trp), promotor de lpp, promotor de lac, promotor de recA, promotor de PL/PR, etc. Quando o hospedeiro é uma estirpe do género Bacillus, utiliza-se preferencialmente o promotor SP01, o promotor SP02, o promotor penP, etc. Quando se utiliza um fungo como o hospedeiro, pode-se utilizar com vantagem o promotor pH05, o promotor PGK, o promotor GAP, o promotor ADH, etc. 0 promotor preferido para ser utilizado quando as células hospedeiras são células de animais, incluem promotores derivados de SV40, promotores de retrovírus, promotor de metalotioneína, promotor de choque térmico, promotor de citomegalovírus e promotor de SRa.

Como vector de expressão para o gene da presente invenção, pode-se utilizar com vantagem o vector de expressão 23 da proteína de fusão convencional. O pGEX (Promega) para a expressão das proteínas fundidas com glutationa-S-transferase (GST) é um exemplo específico do vector. A sequência de polinucleótido em que a sequência de codificação para um polipéptido maduro ajuda na expressão e na secreção de um polipéptido a partir das células hospedeiras inclui a sequência secretória, a sequência leader e a sequência de marcador (marcador de hexa-histidina, marcador de histidina) utilizadas na purificação de um polipéptido de fusão maduro no caso de células bacterianas e o marcador de hemaglutinina (HA) no caso de células de mamíferos. O processo de introdução do ADN recombinante (vector de expressão) na célula hospedeira e o processo de transformação associado não estão particularmente restritos, mas podem ser utilizados vários processos normalizados. 0 transformante obtido pode ser posto em cultura de uma forma de rotina, pela qual a proteína objectivo codificada pelo gene para isso expressamente preparado, de acordo com a presente invenção, é expresso e produzido (acumula-do/segregado) intracelularmente, extracelularmente ou na membrana da célula. 0 meio de cultura a ser utilizado pode ser cuidadosamente seleccionado entre vários meios de rotina de acordo com o tipo de células hospedeira utilizado e realiza-se também a cultura em condições que favorecem o crescimento da célula hospedeira. A proteína recombinante resultante (proteína LY6H) de acordo com a presente invenção pode ser eventualmente isolada 24 e purificada por várias técnicas de separação tirando vantagem das suas propriedades físicas e/ou químicas, por exemplo ["Seikagaku Data Book (Biochemical Data Book) II", 1175-1259, primeira edição, Ia impressão, 23 de Junho de 1980, Tokyo Kagaku Dojin K. K. ; Biochemistry, 25 (25), 8274 (1986); Eur. J. Biochem., 163, 313 (1987), etc.].

Exemplos dessas técnias são o processo convencional de reconstituição, o tratamento com um agente de precipitação da proteína (processo de salinificação), centrifugação, processo do choque osmótico, rompimento sónico, ultrafiltração, vários tipos de cromatografia tal como a cromatografia de peneiro molecular (filtração em gel), cromatografia de adsorção, cromatografia de permuta iónica, cromatografia de afinidade e cromatografia de líquida de elevada resolução (CLER), diálise e combinações destas técnicas. A técnica particularmente preferida inclui a cromatografia de afinidade utilizando uma coluna à qual de acoplou um anticorpo específico de uma proteína da presente invenção.

Ao preparar o gene objectivo que codifica o polipéptido da presente invenção, a sequência de nucleótidos do gene Y6H conforme se mostra na SEQ ID NO: 2 pode ser utilizada com vantagem. Se desejado, este gene pode ser utilizado depois dos codões que especificam os respectivos resíduos de aminoácidos terem sido judiciosamente alterados. Além disso, quando se modifica qualquer resíduo de aminoácido ou sequência parcial da sequência de aminoácidos codificada pelo gene LY6H, por meio de substituição, eliminação ou adição, essas modificações podem ser feitas por meio de vários processos descritos antes, por exemplo por mutagénese específica do sítio. 25 O polipéptido da presente invenção pode ser produzido por um protocolo padrão para a síntese química de acordo com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1. O processo inclui o processo convencional de fase líquida e o processo de fase sólida para a síntese de péptidos.

Mais particularmente, o processo para a síntese de péptidos inclui o processo designado por elongação em fases em que os aminoácidos constituintes estão acoplados um por um à extensão da cadeia e o processo de condensação do fragmento que compreende a síntese de fragmentos consistindo cada um deles em vários dos aminoácidos anteriores e o acoplamento dos fragmentos uns aos outros. A síntese da proteína da presente invenção pode ser preparada a partir de qualquer um dos dois processos anteriores. 0 processo de condensação para ser utilizado na síntese de péptidos anteriores pode também ser um processo convencional, incluindo o processo de azida, o processo misto de anidrido de ácido, o processo de DCC, o processo do éster activo, o processo redox, o processo de ADFF (azida de difenilfosforilo), processo de DCC + aditivo (1-hidroxi-benzotriazole, N-hidroxi-succinamida, N-hidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboxamida ou similar) e processo do reagente de Woodward. O dissolvente a ser utilizado nestes processos pode também ser judiciosamente seleccionado entre os dissolventes comuns bem conhecidos na técnica para serem utilizados nessas reacções de condensação de formação de péptidos. Exemplos de dissolventes incluem dimetilformamida (DMF), dimetil-sulfó-xido (DMSO), hexafosforamida, dioxano, tetra-hidrofurano (THF), acetato de etilo, etc. e as suas misturas. 26

Na condução das reacções de síntese dos péptidos, o grupo carboxilo de qualquer aminoácido ou do péptido de um fragmento que não deve tomar parte na reacção, pode ser protegido antes, geralmente por esterificação sob a forma de um éster de alquilo inferior tal como éster de metilo, éster de etilo, éster de terc-butilo, etc. ou um éster de aralquilo tal como éster de benzilo, éster de p-metoxibenzilo, éster de p-nitrobenzilo, etc.

No que se refere a qualquer aminoácido com um grupo funcional na sua cadeia, o grupo hidroxilo de um resíduo de tirosina pode ser protegido, por exemplo, antecipadamente, com um grupo acetilo, benzilo, benziloxicarbonilo, butilo terciário ou outro grupo, embora essa protecção não seja necessariamente indispensável. Além disso, o grupo guanidino de um resíduo de arginina pode ser protegido com u mgrupo de protecção apropriado tal como um grupo nitro, tosilo, p-metoxibenzeno-sulfonilo, metileno-2-sulfonilo, benziloxicarbonilo, isoborniloxicarbonilo, adamantiloxicarboxilo ou similares.

As reacções para a eliminação desses grupos de protecção dos aminoácidos, péptidos ou a proteína do produto final da presente invenção, protegidos, podem também ser realizadas de uma forma de rotina, por exemplo, por redução catalítica ou por um processo utilizando amónia líquida/fluoreto de hidrogénio e sódio, ácido bromídrico, ácido clorídrico, ácido trofluoroacético, ácido acético, ácido fórmico, ácido metano-sulfónico ou outro reagente. 0 polipéptido da presente invenção, assim produzido, pode ser purificado conforme seja necessário, por meio das várias técnicas mencionadas antes, tal como cromatografia com resina de permuta iónica, cromatografia de partição, cromatografia 27 em gel, distribuição em contra-corrente e processos semelhantes da rotina no domínio da química dos péptidos. 0 polipéptido da presente invenção pode ser utilizado com vantagem como um imunogémio para a preparação do seu anticorpo específico. Utilizando este imunogénio, pode-se providenciar o anticorpo anti-soro (anticorpo policlonal) e o anticorpo monoclonal. A tecnologia de produção de anticorpos é bem conhecida dos especialistas na matéria e na presente invenção podem utilizar-se processos conhecidos [por exemplo, Zoku Seikagaku Jikken Koza (Experiências em Bioquímica, segunda série) "Men-eki Seikagaku Kenkyuho (Processos em Immunobioquímica)", editado pela Sociedade Bioquímica do Japão (1986)].

Por exemplo, como animal imunitário para a recolha do seu anti-soro desejado, podem seleccionar-se arbitrariamente animais vulgares tais como coelhos, cobaias, ratos, murganhos, galinhas, etc. e pode-se fazer a imunização com o referido imunogénio e a recolha de sangue pode também ser realizada por processos convencionais. A preparação de um anticorpo monoclonal pode também ser realizada por técnicas convencionais que compreendem a construção de um hibridoma entre as células do plasma (célula imunitária) de um animal imunizado com o referido imunogénio e uma célula de plasmacitoma, a selecção de clones que produzem o anticorpo desejado e a cultura dos clones. O animal imunitário selecciona-se, geralmente, em consideração com a sua compatibilidade com as células de plasmacitoma que são utilizadas para a fusão de células e normalmente o rato ou o murganho utiliza-se com vantagem. 0 processo de 28 imunização pode ser o mesmo que o utilizado para a preparação do referido anti-soro e, se desejado, a imunização pode ser feita utilizando um adjuvante convencional em combinação. A célula de plasmacitoma a utilizar na referida híbrida-ção não está particularmente restrita a uma em especial mas inclui várias células de mieloma tais como p3 (p3/x63-Ag8) [Nature, 256: 495-497 (1975)], p3-Ul [Current Topics in Microbiology and Immunology, 81.: 1-7 (1978)], NS-1 [Eur. J. Immunol., 6: 511-519 (1976)], MPC-11 [Cell, 8: 405-415 (1976)], SP2/0 [Nature, 276: 269-271 (1978)], etc., R210 [Nature, 277: 131-133 (1979)] e outras de ratos e células derivadas delas. A hibridação entre a referida célula imunitária e a referida célula de plasmacitoma pode ser efectuada por meio da tecnologia conhecida na presença de um promotor de hibridação convencional tal como polietileno-glicol (PEG) ou vírus de Sendai (HVJ) e a separação do hibridoma objectivo pode também ser feita de uma forma conhecida [Meth. in Enzymol. , 7j3: 3 (1981); Zoku Seikagaku Jikken Koza (ditto) ] . A pesquisa do clone da célula que produz o anticorpo objectivo e a preparação do anticorpo monoclonal pode também ser realizada de uma forma de rotina. Por exemplo, a pesquisa do hibridoma que produz o anticorpo pode ser feita por qualquer uma de várias técnicas que se utilizam por rotina para a detecção de anticorpos, tais como ELISA [Meth. in Enzymol., T0_: 419-439 (1980)], processo de placa, processo de manchas, processo da reacção de aglutinação, processo de Ouchterlony, radio-imuno-ensaio e similares, utilizando a proteína da presente invenção como antigénio. 29

Pode-se fazer a colheita do anticorpo da presente invenção do hibridoraa resultante fazendo a cultura do hibridoma de uma forma de rotina e recuperando o anticorpo como um sobrenadante de cultura ou administrando o hibridoma a um mamífero compatível e recuperando o anticorpo sob a forma de ascites. O primeiro processo é apropriado para a produção do anticorpo de elevada pureza, enquanto o último processo é apropriado para uma produção elevada do anticorpo. 0 anticorpo assim produzido pode ser ainda purificado por meios convencionais tais como extracção de sal, filtração em gel, cromatografia de afinidade e similares. O anticorpo assim obtido é caracterizado pela sua afinidade de ligação para a proteína LY6H da presente invenção e pode ser utilizado com vantagem para a purificação da proteína LY6H e para a determinação ou a diferenciação da proteína por técnicas imunológicas. Além disso, logo que se tenha confirmado que a expressão do gene da presente invenção decresceu no lobo temporal do cérebro de um paciente com doença de Alzheimer que é uma doença neurodegenerativa, este anticorpo pode ser utilizado para rastrear agonistas ou antagonistas da proteína LY6H. A presente invenção também tem por objecto o novo anticorpo descrito antes. 0 polipéptido da presente invenção é útil no domínio da medicina como produto farmacêutico que o contém como um ingrediente activo. Por isso, a presente invenção tem por objecto uma composição farmacêutica que compreende o polipéptido da presente invenção como um ingrediente activo. A utilidade do polipéptido da presente invenção nessa composição farmacêutica ou como essa composição farmacêutica 30 é atribuível à acção de suporte da sobrevivência dos neurónios, acção de elongação dos nervos, acção de regeneração dos nervos, acção de activação de nevróglia e acção mnemónica inerente a este polipéptido específico do cérebro. Exemplos desses processos para a confirmação destas acções incluem os processos para cada acção que se seguem. 1) Acção de suporte da sobrevivência dos neurónios O processo que se segue pode ser utilizado para a quantificação da acção de suporte da sobrevivência dos neurónios do polipéptido da presente invenção. Por exemplo, o hipocampo é isolado assépticamente isolado do cérebro de um feto de rato SD e é tratado com uma enzima e semeia-se numa placa de 96 microtibos pré-revestida com poli-L-lisina (Sigma) contendo soro de bovino fetal a 10 % - DMEM a uma concentração final de 2 x 105 células/cm2.

As células crescem durante 24 horas, período ao fim do qual se muda o meio de cultura para DMEM contendo suplemento de N2 a 1 % (Gibco). Depois, adiciona-se o ingrediente activo que é o polipéptido da presente invenção (o grupo da presente invenção). Como controlo, adiciona-se o polipéptido da presente invenção que tinha sido tratado a quente num banho de água a ferver (o grupo da proteína em ebulição) durante 5 minutos.

Prepararam-se as células (cultura) de cada grupo da forma anterior durante 72 horas. Depois, por meio da realização de um ensaio de MTT [brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-iyl)-2,5-difeniltetrazólio] utilizando o sistema de ensaio de 96 microtubos para a titulação de células da Promega, pode-se avaliar o efeito de suporte da sobrevivência dos neurónios do polipéptido da presente invenção nos neurónios do hipocampo. 31

Do mesmo modo, isolando assepticamente a parte média ventral do cérebro do conjunto do cérebro de um rato SD fetal tal como se fez antes e realizando um ensaio de MTT da mesma maneira que antes, pode-se investigar o efeito de suporte da sobrevivência dos neurónios do polipéptido da presente invenção nos neurónios da parte média do cérebro. 2) Acção dopaminérgica de suporte da sobrevivência dos neurónios

Como um processo de avaliação da acção de suporte da sobrevivência dos neurónios do polipéptido da presente invenção, podemos mencionar o processo que se segue de quantificação da actividade dopaminérgica de suporte da sobrevivência dos neurónios. Assim, preparam-se as células (cultura) de cada grupo como se preparou antes na 1) pondo-as em cultura durante 72 horas e depois fixou-se com paraformaldeído-SBF a 4 %, deixando em repouso durante 15 minutos à temperatura ambiente. Assim, utilizando Triton X 100 a 1 %/SBF, fez-se passer a cultura através de uma membrana.

Para evitar a ligação não específica do anticorpo, faz-se a incubação das células em soro de cabra a 10 % - SBF durante 1 hora e depois, utilizando um anticorpo policlonal de hidroxilase anti-tirosina (Chemicon, diluído 1000 vezes no seio de SBF), íncubou-se ainda a 4 °C durante 16 horas. Depois da eliminação do fluido do anticorpo, lavaram-se as células com SBF e, depois da adição de imunoglobulina anti-coelho de cabra acoplada a polímero de dextrano marcado com peroxidase, da Dako, incubou-se à temperatura ambiente durante 1 hora. 32 A detecção das células positivas de tirosina-hidroxilase pode ser feita por uma reacção da cor utilizando diaminobenzidina como o substrato. Desta maneira, a actividade dopaminérgica de suporte da sobrevivência dos neurónios do polipéptido da presente invenção pode ser avaliada utilizando o número de células positivas de tirosina hidroxilase como indicador. 3) Acção de elongação do nervo A determinação da acção de elongação do nervo (acção de elongação - promoção axonal) do polipéptido da presente invenção pode ser realizada utilizando células de PC12 [Número de acesso da ATCC CRL1721; Science, 229, 393-395 (1985)] como se segue. Assim, Assim, transplantaram-se as células de PC12 de uma sub-cultura em meio MEM modificado por Dalbecco (MEM-D) contendo 5 % de soro de cavalo inactivado pelo calor (56 °C, 3 0 min) e 10 % de soro bovino fetal (SBF) para colagénio num prato de Petri revestido com plástico, com 35 mm de diâmetro, numa concentração de 6xl01 cêlulas/3 mL. Dois dias depois da transplantação, substituiu-se o meio com MEM-D contendo uma concentração variável do polipéptido da presente invenção assim como factor de crescimento do nervo (FCN Wako Pure Chemical Ind.) e FCS e continuou-se a cultura para cada caso. No 3o dia, examinaram-se as alterações morfológicas das células com um microscópio de contraste de fase. Avaliando se a formação de nevrites ou a promoção de excrescências de nevrites, em comparação com o controlo, pode avaliar-se o potencial de elongação - promoção axonal do polipéptido da presente invenção. 33 1

Acção de activação da nevróglia A acção de activação da nevróglia pode ser avaliada, por exemplo, por determinação do efeito do polipéptido da presente invenção na activação da nevróglia por FGF de acordo com o processo de Kniss et al. ou o processo de Bogler et al. [Kniss, D. A., e Burry, R. W., Brain Res. , 439, 281-288 (1988); Bogler, O., et al. , . Proc. Natl. Acad. Sei., EUA., 8^7 (16), 6368-6372 (1990)]. 5) Acção de mnemónica A acção de mnemónica pode ser avaliada, por exemplo, de acordo com o protocolo de Morris [Morris. R. G. M. , J. Neurosci. Meth., 11, 47-60 (1984)].

Outro processo de avaliação compreende a administração da proteína LY6H ou de um agonista ou de um antagonista da proteína LY6H que será seleccionada por um rastreio a um modelo de animal da doença de Alzheimer tal como um gene da proteína precursor do mutante de β-amiloide ou um gene mutante de presenilina 1 de rato transgénico [por exemplo, Nature, 373, 523-527 (1995); Nature Med., 5, 560-564 (1999)] e avalia-se o grau de progressão da doença ou o grau de degeneração do nervo em comparação com um grupo de controlo não tratado.

Além disso, para ter o gene expresso no lobo temporal humano (terapia de genes), utiliza-se, por exemplo, um vector de adenovírus [Straus, E. S., Plenum Press New York, 451-496 (1984); Setoguchi, Y. , et al. , Blood, 84, 2953-2964 (1994)]. Assim, um possível processo compreende a clonagem do gene da presente invenção no vector de adenovírus, fazendo a cultura em células indiferenciadas, a administração dele directamente no lobo temporal ou intravenosamente através de um vaso sanguíneo periférico e verificando se a demência do tipo de 34

Alzheimer ou se a doença de Alzheimer tinha melhorado ou se a sua progressão tinha sido inibida. O polipéptido, como ingrediente activo da composição farmacêutica da presente invenção, inclui o seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Esse sal inclui sais não tóxicos com metais alcalinos, metais alcalino-terrosos ou amónio, tal como sais com sódio, potássio, lítio, cálcio, magnésio, bário e amónio. Estes sais podem ser preparados por processos convencionais na técnica, Além disso, o referido sal inclui sais de adição de ácido não tóxicos que podem ser preparados por meio da reacção do polipéptido da presente invenção que é o ingrediente activo, com ácidos orgânicos ou inorgânicos apropriados. Os sais de adição de ácido representativos incluem cloridrato, bromidrato, sulfato, bi-sulfato, acetato, oxalato, valerato, oleato, laurato, borato, benzoato, lactato, fosfato, p-tolueno-sulfonato (tosilato), citrato, maleato, fumarato, succinato, tartrato, sulfonato, glicolato, maleato, ascorbato, benzeno-sulfonato, naftaleno-sulfonato e similares. A composição farmacêutica da presente invenção inclui a composição que compreende uma quantidade efectiva sob o ponto de vista farmacológico do polipéptido da presente invenção e um veículo ou diluente farmacêutico, apropriado, não tóxico. 0 veículo farmacêutico que pode ser utilizado para a referida composição farmacêutica (preparação farmacêutica) inclui diluentes ou excipientes que são utilizados convencionalmente de acordo com as formas de dosagem, tal como cargas de enchimento, aumentadores de volume, ligantes, humectantes, desintegrantes, tensioactivos e lubrificantes. Podem ser judiciosamente seleccionados de acordo com a forma de dosagem da unidade da composição. 35 A composição farmacêutica da presente invenção particularmente preferida pode ser preparada utilizando vários aditivos que podem ser formulados como preparações vulgares de proteínas, tais como estabilizantes, biocidas, tampões, agentes de isotonificação, qgentes quelantes, agentes de controlo do pH e tensioactivos. O estabilizante inclui albumina de soro humano, um L-aminoácido, um açúcar e um derivado de celulose, por exemplo. Podem ser utilizados isoladamente ou em combinação com um tensioactivo ou similar quando necessário. A utilização em combinação com um tensioactivo pode levar a uma estabilização mais efectiva do ingrediente activo em particular. O L-aminoácido não está particularmente restrito mas pode, por exemplo, ser qualquer um entre glicina, cisteína e ácido glutâmico. 0 açúcar não está particularmente restrito, mas inclui mono-sacáridos tais como glicose, manose, galactose, frutose, etc.; álcoois de açúcar tais como manitol, inositol, xilitol, etc., di-sacáridos tais como sacarose, maltose, lactose, etc,; polissacáridos tais como dextrano, hidroxipropil-amido, sulfato de condroitina, ácido hialurónico, etc.; e os seus derivados. O tensioactivo não está particularmente restrito e podem ser utilizados quer tensioactivos iónicos como não iónicos. Exemplos de tensioactivos são os ésteres de alquilo de polioxietileno-glicol e sorbitano, éteres de alquilo de polioxietileno, ésteres de monoacilo de sorbitano e glicéridos de ácidos gordos. 36

Os derivados de celulose que podem ser utilizados não estão particularmente restritos incluindo qualquer um de metilcelulose, etilcelulose, hidroxietilcelulose, hidroxipro-pilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose e carboximetilcelu-lose de sódio. 0 nível de adição de qualquer um dos referidos açúcares e outros aditivos pode ser judiciosamente seleccionado com referência à quantidade que se utiliza normalmente. Geralmente, utiliza-se o açúcar numa proporção não inferior a cerca de 0,0001 mg, preferencialmente dentro do intervalo de cerca de 0,01 a cerca de 10 mg, por cada yg de ingrediente activo. O tensioactivo é utilizado geralmente numa proporção não inferior a cerca de 0,00001 mg, preferencialmente dentro do intervalo de cerca de 0,0001 a cerca de 0,01 mg, por cada yg de ingrediente activo. Pode-se utilizar albumina de soro humano, um exemplo de estabilizante, numa proporção não inferior a 0,0001 mg, preferencialmente dentro do intervalo de cerca de 0,001 a cerca de 0,1 mg, por cada yg de ingrediente activo. A quantidade do aminoácido, outro exemplo de estabilizante, pode ser seleccionada dentro do intervalo de cerca de 0,001 a cerca de 0,1 mg, por cada yg de ingrediente activo. O nível de adição do derivado de celulose não inferior a cerca de 0,00001 mg e selecciona-se, preferencialment, dentro do intervalo de cerca de 0,001 a cerca de 0,1 mg. A quantidade do ingrediente activo na composição farmacêutica da presente invenção pode ser liberalmente seleccionada num vasto intervalo mas selecciona-se geralmente no intervalo de cerca de 0,00001 a cerca de 70 % em peso, preferencialmente cerca de 0,0001 a cerca de 5 % em peso. 37 A composição farmacêutica da presente invenção pode ser ainda complementada com um tampão, um agente isotónico e um agente quelante. O tampão inclui ácido bórico, ácido fosfórico, ácido acético, ácido cítrico, ácido ε-amino-capróico, ácido glutâmico e os sais correspondentes (os seus sais de metais alcalinos ou metais alcalino-terrosos, tais como sais de sódio, sais de potássio, sais de cálcio e sais de magnésio). O agente isotónico inclui cloreto de sódio, cloreto de potássio, açúcares e glicerol. 0 agente quelanet inclui edetato de sódio e ácido cítrico. 0 nível de adição de qualquer um destes aditivos pode estar dentro do intervalo convencional. A preparação farmacêutica da presente invenção pode ser providenciada sob a forma de uma solução e numa forma liofilizada sob a qual pode ser armazenada. Essas preparações loifilizadas podem ser dissolvidas extemporaneamente, por exemplo, no seio de um tampão inclusive de água, soluções salinas ou similares numa concentrações apropriada.

No que respeita à forma de dosagem unitária da composição farmacêutica da presente invenção, podem-se seleccionar várias formas de acordo com o objectivo terapêutico. A forma representativa inclui formas de dosagem sólidas tais como comprimidos, pós, pós puros, grânulos, cápsulas, etc. e formas de dosagem líquidas tais como soluções, suspensões, emulsões, xaropes, elixires, etc. Estas formas de dosagem são geralmente classificadas por via de administração, em preparações orais, preparações parentéricas, preparações nasais, supositórios vaginais, supositórios rectais, comprimidos sub-linguais, pomadas e outras. Cada uma dessas formas de dosagem pode ser formulada e moldada ou de alguma forma preparada por processos estabelecidos em farmácia. 38

Por exemplo, podem fabricar-se comprimidos utilizando, como o referido veículo farmacêutico qualquer um de vários excipientes tais como lactose, sacarose, cloreto de sódio, glicose, ureia, amido, carbonato de cálcio, caulino, celulose cristalina, ácido silícico, fosfato de potássio, etc.; ligantes tais como água, etanol, propanol, xarope simples, solução de glicose, solução de amido, solução de gelatina, carboximetilcelulose, hidroxipropilcelulose, metilcelulose, polivinilpirrolidona, etc.; disintegradores tais como carboximetilcelulose de sódio, carboximetilcelulose de cálcio, hidroxipropilcelulose com um baixo grau de substituição, amido anidro, alginato de sódio, pó de agar, pó de laminarano, carbonato de hidrogénio e sódio, carbonato de cálcio, etc.; tensioactivos tais como ésteres de ácidos gordos de polioxietileno e sorbitano, sulfato de laurilo e sódio, estearato de monoglicerol, etc.; inibidores de disintegração tais como sacarose, astearina, manteiga de cacau, óleo hidrogenado, etc.; promotores de absorção tais como bases de amónio quaternário, sulfato de laurilo e sódio, etc.; humectantes tais como glicerol, amido, etc.; adsorventes tais como amido, lactose, caulino, bentonite, sílica coloidal, etc.; e lubrificantes tais como talco purificado, sais de ácido esteárico, pó de ácido bórico, polietileno-glicol, etc.

Quando necessário, esses comprimidos podem ser revestidos com revestimentos convencionais para providenciar comprimidos revestidos com açúcar, comprimidos revestidos com gelatina, comprimidos revestidos com produtos entéricos e comprimidos revestidos com filmes. Também se podem utilizar comprimidos em camadas duplas ou em camadas múltiplas. O veículo farmacêutico que pode ser utilizado para a produção de pílulas inclui vários excipientes tais como 39 glicose, lactose, amido, manteiga de cacau, óleo vegetal hidrogenado, caulino, talco, etc.; ligantes tais como pó de goma arábica, pó detragacanto, gelatina, etanol, etc.; e disintegrantes tais como laminarano e agar.

As cápsulas podem ser fabricadas, de uma forma geral de uma maneira convencional misturando o ingrediente activo da presente invenção com o veículo ou os veículos farmacêuticos e enchendo a composição resultante em moldes de cápsulas de gelatina dura, moldes de cápsulas de gelatina mole ou similares. A preparação líquida para administração oral inclui soluções, emulsões, suspensões, xaropes, elixires, etc., aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico formulados como se faz por rotina com diluentes inertes tais como água e estas formas de dosagem podem conter um agente de molhagem, um emulsionante, um agente de suspensão e/ou outros aditivos auxiliares. Podem ser fabricadas por processos já estabelecidos na indústria farmacêutica. A preparação líquida para administração parentérica, inclusive soluções, emulsões e suspensões esterilizadas, aquosas e não aquosas que podem ser preparadas utilizando diluentes tal como água, álcool etílico, propileno-glicol, polietileno-glicol, álcool de isostearilo etoxilado, álcool de isostearilo polioxilado, ésteres de ácidos gordos, polioxietileno e sorbitano e óleos vegetais tais como azeite. Além disso, podem formular-se ésteres orgânicos injectáveis, tais como oleato de etilo. Além disso, qualquer um dos solubilizantes, tampões, agentes de molhagem, emulsionantes, agentes de suspensão, conservantes, dispersantes convencionais, etc. pode ser adicionado. 40

As várias formas de dosagem farmacêuticas anteriores podem ser esterilizadas de uma forma de rotina. Esta esterilização pode conseguir-se por filtração através de um filtro bacteriano, formulação de um biocida, irradiação ou tratamento pelo calor. Além disso, podem ser providenciadas sob a forma de composições sólidas esterilizadas que podem ser dissolvidas extemporaneamente em água esterilizada ou num meio apropriado que se possa esterilizar.

Para o fabrico de formas de dosagem para administração rectal ou vaginal, podem utilizar-se veículos farmacêuticos tal como polietileno-glicol, manteiga de cacau, álcoois superiores, ésteres de álcoois superiores, gelatina, glicéridos semi-sintéticos, etc.

Pomadas tal como pastas, cremes e geles podem ser preparadas utilizando um diluente tal como petrolato branco, parafina, glicerol, derivados de celulose, propileno-glicol, polietileno-glicol, silicone, bentonite e óleos vegetais tais como azeite.

As composições para administração transnasal ou sublingual podem ser preparadas de uma forma de rotina utilizando um excipiente padrão bem conhecido.

Quando necessário, as preparações farmacêuticas da presente invenção podem ser complementadas com agentes corantes, conservantes, perfumes, agentes aromatizantes, adoçantes e outros fármacos. O processo para administração dessas preparações farmacêuticas não está particularmente restrito mas pode ser seleccionado de acordo com a forma de dosagem específica, a idade do paciente, o sexo e outros factores, severidade da 41 doença e outras variáveis. Por exemplo, comprimidos, pílulas, soluções, suspensões, emulsões, grânulos e cápsulas são administradas oralmente, enquanto os produtos parentéricos são administrados intravenosamente, quer isoladamente ou em mistura com glicose, aminoácidos ou outras infusões convencionais ou, quando necessário, administradas isoladamente intramuscularmente, intradermicamente, subcutaneamente ou intraperitonealmente. Os supositórios rectais são administrados no recto; os supositórios vaginais são administrados na vagina,· as preparações nasais são administradas pelas narinas, as preparações sub-linguais são administradas bucalmente e as pomadas são administradas topicamente para libertação do fármaco por via transdérmica. A dosagem para qualquer uma das preparações farmacêuticas anteriores não está particularmente restrita mas pode ser judiciosamente seleccionada de uma vasta gama de acordo com o efeito terapêutico expectável, o processo de administração, a duração do tratamento, os antecedentes do paciente tal como a idade e o sexo e outros factores. Geralmente, a dosagem normal recomendada do ingrediente activo é de cerca de 01 pg - 1 mg/dia, por kg do peso do corpo do paciente. A dose anterior pode ser administrada uma vez por dia ou em 2 ou mais doses divididas.

Além disso, tal como se aponta no exemplo de trabalho que será apresentado aqui adiante, a expressão do gene da presente invenção foi abolida ou diminuiu no lobo temporal do paciente com doença de Alzheimer. Por isso, construindo um vector de expressão arbitrária que comporta todo ou parte do gene da presente invenção e introduzindo o vector de expressão no tecido do lobo temporal para a expressão forçada do gene no tecido, as alterações neurodegenerativas, inclusive de uma atrofia excessiva dos neurónios no lobo 42 temporal, podem ser inibidas e, por isso, a progressão da doença de Alzheimer pode parar. Por isso, a presente invenção providencia ainda uma composição farmacêutica para a terapia de genes (agente terapêutico de genes) que possui essa acção inibidora da neurodegeneração. A presente invenção tem ainda por objecto ou vector de expressão anterior ou o vector para a terapia de genes, as células transfectadas com o gene da presente invenção através da introdução do referido vector e uma composição farmacêutica para a terapia dos genes que compreende qualquer um dos anteriores como o componente activo. A terapia dos genes utilizando o referido agente terapêutico de genes realiza-se por administração de pelo menos um elemento seleccionado no grupo que consiste no vector para a introdução e a expressão do gene da presente invenção e as células transfectadas com o gene da presente invenção através da introdução do referido vector nos neurónios do cérebro ou no tecido do lobo temporal de um paciente com doença degenerativa. Por esse processo, as alterações neurodegenerativas nesse tecido podem ser inibidas e os sintomas da doença de Alzheimer, da demência do tipo de Alzheimer, doença de Parkinson, isquémia cerebral, etc. podem ser aliviadas. A terapia dos genes vai agora ser descrita com mais detalhe. Na execução que se segue de uma terapia de genes, pode utilizar-se a terapia dos genes, a rotina química, as técnicas biológicas moleculares, microbiológicas, de ADN recombinante, genética e imunológica podem ser utilizadas a menos que seja especificado de outra forma. Estas técnicas estão descritas em, inter alia, Maniatis, T.., et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (Cold Spring Harbor 43

Laboratory), Cold Spring Harbor, New York (1982)), Sambrook, J. , et al. , Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd Ed. (Cold Spring harbor Laboratory), Cold Spring harbor, New York (1981)), Ausbel, F. M. , et al. , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York (1992)), Glover, D., DNA Cloning, I and II (Oxford Press (1985)), Anand, Techniques for the Analysis of Complx Genomes (Academic Press (1992), Guthrie, G. , et al., Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology (Academic Press (1991)), e Fink, et al. , Hum. Gene Ther., 3, 11-19 (1992). A terapia dos genes pode ser realizada utilizando um vector de terapia de genes comportando todo ou parte do gene da presente invenção ou as células transfectadas com o gene da presente invenção através da introdução do referido vector. Esta terapia dos genes pode ser, por exemplo, um processo para fornecer o gene LY6H ou a sua função às células em que o referido gene não foi expresso. Por meio dessa terapia, fica inibida a neurodegeneração da célula do receptor/célula alvo. O gene da presente invenção ou um fragmento do gene pode ser introduzido nas células por meio de um vector adaptado para manter o gene extra-cromossicamente. Nesses casos, pode acontecer que um gene em particular seja expresso pelas células a partir de uma posição extra-cromossómica. Além disso, quando o gene LY6H vai ser expresso pela introdução de um fragmento do gene no sítio do lobo temporal do sistema nervoso do cérebro e não se verídica expressão do gene, o fragmento particular do gene pode ser um fragmento que codifica uma parte da proteína de LY6H que é necessária para a sobrevivência ou o crescimento não tumorigénico das células. 44 0 vector de transferência dos genes pode ser qualquer um dos vários vectores conhecidos em que o gene da presente invenção temha sido sub-clonada, tal como se vai descrever aqui a seguir. A introdução do vector de transferência dos genes na célula alvo pode ser facilmente efectuada por meio da tecnologia estabelecida de introdução de ADN em várias células que já é conhecida pelos especialistas na matéria, tal como electroporação, transfecção de fosfato de cálcio (co-precipitação), transdução do vírus e outras técnicas. As células transfectadas com o gene da presente invenção podem ser utilizadas como um fármaco para distúrbios neurodegenerativos do cérebro, inclusive de um inibidor de atrofia prematura do sistema nervoso do cérebro ou como modelos para investigação terapêutica.

Tal como se mencionou antes, o gene ou o fragmento de gene da presente invenção, tal como introduzido pela terapia de genes de acordo com a presente invenção aumenta a expressão do produto do gene correspondente no nervo do cérebro ou no tecido circundante para assim inibir a atrofia do nervo do cérebro no tecido que expressa o gene. Essa terapia de genes pode ser aplicada com vantagem ao tecido neuronal do cérebro em que a expressão do gene LY6H ou a proteína de LY6H tenha sido abolida assim como ao tecido neuronal do cérebro em que o nível de expressão do referido gene tenha diminuído. A terapia de genes, de acordo com a presente invenção, realiza-se como se segue. Em primeiro lugar, faz-se um rastreio dos pacientes candidatos para a terapia de genes por meio de um registo de um tomograma em computador (TC) com a posição de digitalização fixada no lobo temporal do paciente 45 com demência do tipo de Alzheimer ou doença de Alzheimer para verificar se há atrofia do lobo temporal ou para verificar a progressão da atrofia.

Assim, para se conseguir a expressão do gene da presente invenção, o ARNm do LY6H intracelular é criado na célula alvo e a sua tradução é promovida para acelerar a expressão do gene LY6H. Com este fim, produz-se preferencialmente um oligonucleótido num sentido correspondente ao ARNm do gene e fornece-se à célula alvo. Dando à célula a actividade para promover a expressão do gene LY6H por meio da terapia de genes anteriores, pode-se inibir a alteração neurode-generativa na célula do receptor/célula alvo do cérebro.

De acordo com a terapia de genes anterior, utilizando o referido oligonucleótido num sentido, o objectivo de inibição da alteração neurodegenerativa do cérebro e o consequente alívio ou paragem da progressão de sintomas neurodegenerativos pode ser atingida com sucesso fazendo uma sub-clonagem do gene LY6H num retrovírus, adenovírus ou vector derivado de AAV e que infecta as células alvo do nervo do cérebro com o vector para causar assim a expressão do oligonucleótido num sentido.

Quando um oligonucleótido num sentido do gene da presente invenção é introduzido nos neurónios cerebrais ou tecido cerebral para aumentar a expressão da proteína de LY6H, o oligonucleótido num sentido não precisa de ter um oligonucleótido de comprimento completo do gene LY6H mas pode ser o produto de modificação que retém assim uma função praticamente idêntica à função do gene parental e promove a expressão do gene LY6H ou um fragmento do gene que compreende uma sequência parcial que retém a referida função.

Os vectores que podem ser utilizados para a introdução de um gene objectivo tanto para a recombinação do ADN como a manutenção do gene extracromossómico são já conhecidos na técnica e pode-se utilizar qualquer um dos vectores conhecidos na prática da presente invenção. Por exemplo, um vírus ou um vector de plasmido que inclui uma cópia do oligonucleótido num sentido do gene LY6H ligado ao elemento do controlo de expressão e são capazes de expressar o produto de oligonucleótido num sentido na célula alvo, podem ser utilizados como esses vectores. Qualquer um dos vectores de expressão mencionados antes podem ser utilizados normalmente mas os vectores preferidos são os que se constroem utilizando qualquer um dos vectores descritos na patente de invenção norte-americana USP 5252479 e na patente de invenção WO 93/07282 (especificamente pWP-7A, pWP-19, pWU-1, pWP-8A, pWP-21 e/ou pRSVL) ou o pRC/VCM (Invitrogen) como a fonte de vector. Ainda mais preferidos são os vários vectores de vírus que se descrevem aqui a seguir.

Como promotor para ser utilizado no vector para a terapia de genes, utilizam-se preferencialmente esses promotores, que são intrínsecos dos tecidos afectados a se tratados nas várias doenças. Exemplos dos promotores são a albumina, a a-fetoproteína, a αΐ-antitripsina, a tranferrina e a trans-tiretina para o fígado e anidrase carbónica I e antigénio carcinoembriónico para o cólon. Quando os tecidos afectados são o útero e a placenta, pode-se dar como exemplo estrogénio, aromatase, citocroma P450, enzima P450 que cliva a cadeia lateral do colesterol e 17- α-hidroxilase P450.

Para a próstata, podem dar-se como exemplos os antigénios específicos da próstata, gene de raposa gp-91 e calicreína específica da próstata. Para a mama, podem dar-se como exemplos erb-B2, erb-B3, beta -caseína, beta -lactoglobina e 47 proteína de trigo. Para o pulmão, podem dar-se como exemplos proteína C tensioactiva e uroglobulina. Para a pele, podem dar-se como exemplos Κ-14-queratína, queratina 1 ou 6 humana e leuclina. Para o cérebro, podem dar-se como exemplos proteína ácida fibrilhar glial, proteína específica do astrócito maduro, mielina, vilina pancreática da hidroxilase de tirosina, glucagon e polipéptido amilóide dos ilhéus de Langerhans. Para a tiróide, podem dar-se como exemplos a tiroglobulina e calcitonina. Para os osssos, podem dar-se como exemplos αΐ-colagéneo, osteocalcina e sialoglicoproteína do osso. Para o rim, podem dar-se como exemplos renina, fosfatase alcalina do fígado/ossos/rim e eritropoietina e para o pâncreas, podem dar-se como exemplos amilase e PAP1.

Além disso, na produção de um vector para a introdução de um oligonucleótido num sentido, o oligonucleótido num sentido a ser introduzido (um com uma sequência de comprimento completo ou de complemento parcial correspondendo à sequência do gene da presente invenção) pode ser facilmente preparada e adquirida pelas técnicas de engenharia genética padrão com base na informação de sequências de nucleótidos sobre o gene da presente invenção conforme foi descrito aqui antes. A transferência desse vector para a introdução de um oligonucleótido num sentido em células pode ser realizada por várias técnicas já conhecidas na técnica, tal como electroporação, transfecção do fosfato de cálcio (co-precipitação) , transdução do vírus e similar. As células transfectadas com o referido oligonucleótido num sentido, como tal e sob a forma isolada, tem uma acção inibidora da neurodegeneração do cérebro de tal modo que possam ser utilizadas como um fármaco ou um modelo de investigação terapêutica, também para a inibição ou a paragem da progressão das lesões neurodegenerativas. 48

Na terapia dos genes, o vector anterior para a introdução de um oligonucleótido num sentido pode ser injectado quer topicamente no lobo temporal ou na região circundante do paciente ou sistemicamente. Além disso, pode ser posto em cultura com células indiferenciadas e, depois, administrado por injecção local ou sistémica. Por meio dessa administração, o vector pode ser introduzido nas células dos nervos do cérebro do paciente. No caso de o gene transduzido não ter sido absorvido permanentemente no cromossoma de cada célula alvo, a administração pode ser repetida periodicamente . O processo da terapia de genes, de acordo com a presente invenção, inclui tanto a técnica in vivo que compreende a administração de uma estrutura para a introdução do referido oligonucleótido num sentido (um vector de transferência do oligonucleótido num sentido) directamente no corpo e a técnica ex vivo que compreende a transferência do gene para as células indiferenciadas em cultura e, depois da cultura, o transplante ou de algum modo a introdução das células no corpo do paciente. Uma terapia de genes compreendendo a introdução do referido oligonucleótido num sentido directamente na célula é também viável.

As células alvo em que o oligonucleótido num sentido, do gene da presente invenção, tem que ser introduzido, podem ser judiciosamente seleccionadas de acordo com o objecto da terapia de genes (tratamento). Por exemplo, as células alvo incluem neurónios do cérebro e tecidos dos nervos do cérebro assim como linfócitos, fibroblastos, hepatócitos e células hemopoiéticas. 49 O processo de introdução de um oligonucleótido num sentido, na terapia de genes anterior, inclui uma técnica de introdução virai e uma técnica de introdução não virai.

No que respeita à técnica de introdução virai, tendo em consideração o facto de o oligonucleótido num sentido a ser transferido ser uma substância estranha que é expressa especialmente nas células normais do cérebro, o processo que utiliza um vector de retrovírus, por exemplo, pode ser exemplificado. Outros vectores de vírus que podem ser utilizados incluem o vector de adenovírus, vector do VIH (vírus da imunodeficiência humana), vector do vírus adeno-associado (VAA), vector do vírus do herpes, vector do vírus do herpes simplex (VHS) e vector do vírus de Epstein-Barr (VEB). O processo de construção de um vector de vírus para a transferência de um oligonucleótido num sentido e o processo para a transferência de um oligonucleótido num sentido para a célula alvo ou para o tecido alvo vão agora ser especificamente descritos. O sistema do vector de retrovírus consiste num vector de vírus e uma célula auxiliar (célula de empilhamento). A célula auxiliar significa uma célula que tem expresso genes que codificam a proteína estrutural gag (proteína estrutural dentro da partícula de vírus), etc. de um retrovírus, mas que não formou partículas de vírus. Por outro lado, o vector do vírus tem o sinal de empilhamento e as RTL (repetições de terminal longo), mas falta-lhe genes estruturais, tais como gag, pol, env, etc., que são necessários para a replicação do vírus. O sinal de empilhamento é uma sequência que funciona como um marcador no conjunto de uma partícula de vírus. Os genes selectivos (neo, hyg) e o oligonucleótido num sentido 50 objecto, ligado no sítio de clonagem, são introduzidos no lugar dos genes de vírus. Para se obter um título elevado das partículas de vírus, é importante utilizar uma inserção tão curta quanto possível, providenciar um amplo sinal de empilhamento incluindo uma parte do gene gag e ter cuidado para que não saia o ATG do gene gag.

Como ADN do vector que comporta o oligonucleótido num sentido objecto é transferido para a célula auxiliar, o ARN genómico do vector é empilhado pela proteína estrutural do vírus formada pela célula auxiliar, por meio da qual as partículas do vírus são formadas e segregadas. A partícula de vírus, como vírus recombinante infecta a célula alvo e, como resultado, a sequência de ADN transcrita de forma reversa do ARN genómico do vírus é integrada no núcleo da célula de modo a que o gene num sentido inserido no vector seja expresso.

Pode utilizar-se uma técnica usando um fragmento de fibronectina contendo o domínio de adesão da célula, um sítio de ligação da heparina e um segmento de conjugação [Hanenberg, H., et al. , Exp. Hemat., 23, 747 (1995)], para melhorar a eficiência da transferência do gene objecto.

Um exemplo de vector de retrovírus que pode ser utilizado no sistema anterior de vectores de retrovírus é o retrovírus derivado do vírus da leucemia de rato [McLachlin, J. R., et al. , Proc. Natl. Acad. Res. Molec. Biol. , 3^8, 91-135 (1990)]. O processo que utiliza um vector de adenovírus é agora descrito em detalhe. O vector de adenovírus pode ser construído de acordo com os processos descritos em Berkner, K. L., Curr. Topics Microbiol. Immunol., 158, 39-66 (1992), Setoguchi, Y., et al. , Blood, 84, 2946-2953 (1994), Kanegae, H. et al. [Jikken Igaku (Experimental Medicine), 12, 28-34 51 (1994)] e Ketner, G. et al. , Proc. Natl. Acad. Sei., USA., 91, 6186-6190 (1994).

Por exemplo, para construir um vector de adenovírus não proliferativo, em primeiro lugar faz-se a excisão da região precoce EI e/ou E3 do adenovírus. Depois, utiliza-se um vector de plasmido contendo a unidade de expressão do gene estranho desejado (que consiste no oligonucleótido num sentido a ser transferido, no promotor para transcrição do referido oligonucleótido num sentido, poli A para assegurar a estabilidade do gene transcrito) e uma parte do ADN genómico e um plasmido contendo o genoma do adenovírus, para co-transfectar a célula 293, por exemplo. Como assim causa-se uma recombinação homóloga entre eles para a substituição da unidade de expressão do gene por El, obtém-se um vector de adenovírus proliferativo como o vector que comportoa o oligonucleótido num sentido alvo. Também se pode construir um vector de adenovírus com a extremidade 3' com uma proteína terminal adicionada, por meio da ligação do ADN genómico do adenovírus a um vector de cosmido. Além disso o vector YAC pode também ser utilizado para a construção de um vector de adenovírus. A seguir descreve-se, em resumo, a produção de um vector de vírus adeno-associado (VAA). O VAA foi descoberto como um vírus pequeno que contaminava os sistemas de cultura de adenovírus. Como este vírus, tem sido identificada a existência do género Parvovirus capaz de proliferação autónoma dentro das células hospedeiras sem requerer um vírus auxiliar para a replicação do vírus e o género Dependovirus que requer um vírus auxiliar. Este VAA tem uma vasta gama de hospedeiros e ê um dos vírus comuns que infectam vários tipos de células. O genoma do vírus é um AND linear de estrutura helicoidal simples que consiste em 4680 nucleótidos, com os 52 145 nucleótidos em ambas as extremidades que comportam uma sequência característica conhecida como RTI (repetição dos terminais invertidos). Esta região da RTI funciona como a origem de replicação e desempenha o papel de um iniciador. A RTI é também essencial para o empilhamento das partículas do vírus e a integração do VAA no ADN do cromossoma da célula hospedeira. No que respeita à proteína do vírus, a metade esquerda do genoma codifica para a proteína não estrutural, que é a proteína reguladora Rep que controla a replicação e a transcrição. A construção do VAA recombinante pode ser realizada por meio da utilização da propriedade do VAA para se tornar integrada no ADN no cromossoma, onde se pode preparar o vector de transferência do gene desejado. Este processo pode ser descrito em detalhe como se segue. Primeiro, constrói-se um plasmido (plasmido do vector do VAA) que retém as RTIs nas extremidades 5' e 3' de um VAA de tipo selvagem e comportando o oligonucleõtido num sentido a ser transferido, interposto entre elas. A proteína do vírus, necessária para a replicação do vírus e a formação das partícuças de vírus é fornecida a partir de um plasmido auxiliar separado. É necessário assegurar que a sequência comum de nucleótido existirá entre os dois plasmidos de modo a que o vírus de tipo selvagem não apareça na recombinação do ADN. Depois, os dois plasmidos são transferidos para a célula 293 por transfecção, por exemplo, e ainda as células são infectadas com um adenovírus como o vírus auxiliar (quando se utiliza a célula 293, este adenovírus pode ser um adenovírus não proliferativo), onde se produz o VAA recombinante não proliferativo desejado. Dado que este VAA recombinante está presente no núcleo, as células são submetidas a congelação - descongelação e recuperada e o adenovírus contaminante é inactivado pelo calor a 55 °C. Depois, se necessário, o VAA recombinante é seprarado e 53 concentrado por ultracentrifugação utilizando cloreto de césio. Desta maneira, pode-se obter o VAA recombinante desejado para a transferência de genes. A produção de um vector de VEB pode ser realizada pelo processo de Shimidzu et al. [Shimidzu, N. , SAIBO KOUGAKU (Cell Technology, 14 (3), 280-287 (1995)]. A produção do vector de VEB para a transferência do oligonucleótido num sentido de acordo com a presente invenção é descrita a seguir resumidamente. O vírus de EB (virus de Epstein-Barr) é um vírus da família dos Herpesviridae, que foi isolado pela primeira vez por Epstein e os seus colaboradores a partir de células em cultura derivada do linfoma de Burkitt [Kieff, E. e Liebowitz, D. : Virology, 2a ed. Raven Press, New York, 1990, pp. 1889-1920]. Este VEB tem actividade de transformação de células e para o utilizar como um vector para a transferência de genes, é necessário preparar um vírus deficiente nesta actividade de transformação. Isto pode ser feito como se segue.

Assim, primeiro que tudo, o genoma do VEB na vizinhança do ADN alvo em que o gene estranho desejado vai ser inserido e clonado. Depois insere-se um fragmento do ADN do gene estranho e um gene resistente a fármacos na estrutura de um vector para a preparação de um vírus recombinante Depois, o vector para a preparação de um vírus recombinante que é excisado com uma enzima de restrição apropriada é transfectado com as células de Akata positivas em relação ao VEB. Recupara-se o vírus recombinante formado por recombinação homóloga, em conjunto com o VEB de Akata de tipo selvagem, através da estimulação da produção do vírus por meio de tratamento anti-superfície da imunoglobulina. O vírus recombinante é infectado com células de Akata negativas em 54 relação ao VEB, na presença de um fármaco, seleccionam-se os clones resistentes, em que se podem obter as células de Akata infectadas exclusivamente com o vírus recombinante isentas do VEB de tipo selvagem. Depois, por indução da actividade virai nas células de Akata infectadas pelo vírus recombinante, pode-se produzir em quantidades o vector do vírus recombinante objectivo. 0 processo de introdução do gene objecto na célula alvo ou no tecido alvo na terapia dos genes da presente invenção inclui os dois processos representativos que se seguem. O primeiro processo compreende a colheita das células alvo a partir de um paciente a ser tratado, o crescimento das células e_x vivo, por exemplo sob adição de interleucina-2 (IL-2) ou similar, para transferir oligonucleótido objecto, de um sentido colhido no vector de retrovírus e a re-transplantação das células resultantes (processo ex vivo). Este processo é apropriado para a terapia de doenças genéticas causadas por genes defeituosos e cancro, por exemplo. 0 segundo processo é um processo para a transferência directa dos genes que compreende a injecção do oligonucleótido objecto, de um sentido directamente no corpo do paciente ou no sítio alvo tal como no tecido cerebral (processo directo).

Mais particularmente, o primeiro processo pode ser realizado da seguinte maneira, por exemplo. Assim, as células mononucleares, tal como as células indiferenciadas, colhidas do paciente são separadas fraccionadamente a partir de monócitos utilizando um separador de sangue e fez-se a cultura na presença de IL-2 num meio apropriado tal como o 55 meio de ΆΙΜ-V durante cerca de 72 horas, seguida da adição do vector que comporta o oligonucleótido, de um sentido a ser introduzido. Para melhorar a eficiência da transferência do oligonucleótido num sentido, pode-se fazer crescer as células na presença de protamina a 32 °C durante 1 hora, centrífuga-se a 2500 rpm e depois faz-se a cultura em atmosfera de um gás com dióxido de carbonoa 10 %, a 37 °C, durante 24 horas. Depois de se repetir este processo algumas vezes, faz-se novamente a cultura das células na presença de IL-2 em, por exemplo, meio de AIM-V durante 48 horas e depois lava-se com uma solução salina. Contam-se as células viáveis e avalia-se a eficiência da introdução do oligonucleótido num sentido, por meio de RCP in situ ou, quando o objecto é a actividade enzimática, analisa-se o grau de actividade enzimática.

Os controlos de segurança tal como a cultura de bactérias e de fungos em células de cultura, verificação quanto à presença ou à ausência de infecções do micoplasma, pesquisa de endotoxina, etc. são realizados para confirmar as condições de segurança. Depois, as células em cultura transformadas com a dose efectiva prevista do oligonucleótido num sentido voltam para o paciente por meio de injecção intravenosa a conta-gotas. Repete-se o processo anterior a intervalos de várias semanas ou de alguns meses para consumar a terapia dos genes. A dosagem do vector do vírus é judiciosamente seleccionado de acordo com a célula alvo. A dose normalmente preferida pode ser, por exemplo, de 1 x 103 cfu - 1 x 108 cfu em termos de título de vírus por de 1 x 108 células alvo.

Pode-se adoptar, numa versão alternativa do primeiro processo anterior que compreende a co-cultura das células produtoras de vírus com o vector de retrovírus comportando o 56 oligonucleótido num sentido, objecto e as células do paciente para introduzir assim o oligonucleótido num sentido nas células alvo.

Na realização do segundo processo (processo directo) para a terapia de genes, é particularmente preferível realizar uma experiência preliminar ex vivo para verificar se o oligonucleótido num sentido, objecto, pode ser então introduzido pelo processo da transferência de genes por meio de uma RCP do ADNc do gene do vector ou por RCP in situ ou verificar se o efeito terapêutico desejado, por exemplo elevação de uma actividade específica ou do crescimento ou inibição do crescimento das células alvo podem então ser conseguidos por introdução do o oligonucleótido num sentido, objecto. Além disso, quando se utiliza um vector de vírus, é obviamente de grande importância confirmar a segurança da introdução do o oligonucleótido num sentido, na terapia de genes, por meio da realização de uma pesquisa por RCP do retrovírus proliferativo e similares, determinando a actividade de trancriptase reversa ou monitorizando o gene da proteína de revestimento (env) pela técnica de RCR. A terapia de genes da presente invenção na doença de Alzheimer, demência do tipo de Alzheimer ou doença de Parkinson pode, por exemplo, ser uma terapia de doenças neurodegenerativas que compreende a colheita de células indiferenciadas ou células dos nervos do cérebro do paciente, estabelecendo uma linha de células de cultura por tratamento enzimático ou similar, introduzindo o oligonucleótido num sentido, objecto nas células alvo dos nervos do cérebro utilizando VAA ou similares, realizando um rastreio com células G418, medindo a quantidade de expressão de IL-12 ou similar in vivo, dando um tratamento de radiação e inoculando 57 as células em tecido do cérebro de pacientes ou no sítio do lobo temporal. A presente invenção tem ainda por objecto uma composição ou uma preparação farmacêutica (um agente terapêutico do gene) compreendendo um vector de transferência do oligonu-cleótido num sentido da presente invenção ou uma linha de células transformadas com o o oligonucleótido num sentido, como um ingrediente activo numa quantidade efectiva sob o ponto de vista farmacológico em combinação com um veículo ou diluente farmacêutico, apropriado, não tóxico. 0 veículo farmacêutico que pode ser utilizado na composição farmacêutica (preparação farmacêutica) da presente invenção inclui os diluentes ou excipientes, por exemplo cargas, aumentadores de volume, ligantes, humectantes, desintegrantes, tensioactivos, lubrificantes, etc., que são normalmente utilizadas consoante o modo de utilização dessa composição e podem ser utilizados selectivamente de acordo com uma forma unitária de dosagem contemplada da preparação. A forma de dosagem unitária da preparação farmacêutica da presente invenção podem ser as mesmas que foram mencionadas para a preparação de polipéptidos da presente invenção e uma preparação apropriada pode ser seleccionada judiciosamente de acordo com o objectivo terapêutico. O processo terapêutico e profiláctico da doença neurodegenerativa, de acordo com a presente invenção, é a seguir descrito em detalhe. A presente invenção tem por objecto um processo para a terapia de doenças neurodegenerativas, tais como doença de Alzheimer, demência do tipo de Alzheimer, isquémia do 58 cérebro, doença de Parkinson e doenças similares em que esteja envolvido um excesso ou uma parte do polipéptido LY6H. Quando a actividade de LY6H é excessiva, pode optar-se por várias abordagens. 0 primeiro processo compreende a administração de um composto inibidor (antagonista) numa quantidade efectiva para inibir a função do polipéptido LY6H bloqueando a sua ligação a um ligando, substrato, receptor, enzima ou similar ou a inibição de um sinal secundário em combinação com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico melhorando assim o estado anormal. Um processo alternativo compreende a administração de um polipéptido de LY6H sob uma forma solúvel capaz de se ligar a um ligando, substrato, receptor, enzima ou similar em concorrência com o LY6H endógeno. Um exemplo típico dessa substância concorrente inclui um fragmento de polipéptido de LY6H. Num outro processo, pode-se administrar um polipéptido de LY6H sob uma forma solúvel capaz de se ligar a um ligando em concorrência com o LYGH endógeno. Um exemplo típico dessas substância concorrente inclui um fragmento do polipéptido do LY6H,

Ainda num outro processo, a expressão do gene que codifica para o polipéptido de LY6H endógeno pode ser inibida por meio da aplicação de uma técnica de inibição da expressão de um gene ao produto do gene LY6H. As técnicas deste tipo conhecidas incluem a utilização de uma sequência de sentido inverso ("antisense", a que corre no sentido de 3' para 5') gerada internamente ou administrada separadamente [por exemplo, Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988), 0'Connor, J. Neurochem _56: 560 (1991)] . Como um processo alternativo, pode-se utilizar um oligonucleótido capaz de formar uma hélice tríplice com o gene [por exemplo, Lee et al., Nucleic Acids Res., 6: 3073 (1979); Cooney et al., Science, 241: 456 (1988); Dervan et al., Science, 251: 1360 (1991)]. Estes 59 oligómeros podem ser administrados tal qual ou os oligómeros relacionados podem ser expressos in vivo.

Para a terapia de sintomas anormais relacionados com uma sub-expressão de LY6H e com a sua actividade, podem utilizar-se vários processos. O primeiro processo compreende a administração de um composto capaz de activar LY6H (agonista) numa quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico em conjunto com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico a um indivíduo para melhorar assim esses sintomas anormais. Num outro processo, a produção endógena de LY6H por meio de células relacionadas num indivíduo, pode ser actuada pela terapia de genes. Por exemplo, o polinucleótido da presente invenção pode ser manipulado de modo a que seja expresso com um vector de retrovírus defeituoso conforme se mencionou aqui antes. Depois, isola-se esta estrutura de expressão do retrovírus e introduz-se nas células empilhadas transduzidas com um vector de plasmido de retrovírus que comporta o ARN que codifica o polipéptido da presente invenção de modo a que as células empilhadas formam partículas de vírus infecciosos contendo o gene objecto. Estas células produtoras são administradas ao indivíduo para manipulação in vivo das células de modo que o polipéptido pode ser expresso in vivo. Para uma visão global sobre a terapia dos genes, pode-se fazer referência a Human Molecular Genetics, T. Strachan e A. P. Read, BIOS Scientific Publishers Ltd. (1996), Capítulo 20 - Gene Therapy and Other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches, inclusive as referências específicas aqui citadas. Um processo alternativo compreende a asministração de uma dose terapêutica do polipéptido do LY6H em combinação com um veículo farmacêutico apropriado. 60

As células podem ser formuladas, por exemplo, em soluções salinas tamponadas com fosfato (a pH 7,4), solução de Ringer ou uma injecção de composição intracelular ou numa forma de dosagem tal que possam ser administradas em combinação com uma substância condutora com uma eficiência aumentada da transferência do gene, tal como a protamina. O processo de administração da preparação farmacêutica anterior não está particularmente restrito mas pode-se estabelecer um regime apropriado de acordo com a forma de dosagem particular, a idade do paciente, o sexo e outros factores, a severidade da doença e similares. A quantidade de ingrediente activo a ser incorporado na preparação farmacêutica e a dosagem não são particularmente restritas mas cada uma pode ser seleccionada de uma forma livre de uma vasta gama de acordo com o benefício terapêutico esperado, o processo de administração, a duração do tratamento, os antecedentes do paciente, inclusive a sua idade e sexo e outras variáveis.

Geralmente, a dosagem do vector de retrovírus que comporta o oligonucleótido num sentido como preparação farmacêutica, pode ser, por exemplo, de cerca de 1 x 103 pfu até 1 x 1015 pfu em termos de título de retrovírus por quilograma de peso do corpo por dia.

No caso de células que comportam o oligonucleótido num sentido para introdução, a dose pode ser seleccionada paropriadamente no intervalo de cerca de 1 x 10A célu-las/corpo até 1 x IO15 células/corpo. A preparação anterior pode ser administrada uma vez por dia ou em várias doses divididas por dia ou mesmo 61 intermitentemente a intervalos de 1 ou várias semanas. Preferencialmente, uma substância que conduz a uma eficiência aumentada da transferência de genes, tal como a protamina ou uma preparação que contenha a mesma, pode ser administrada em combinação.

Quando a terapia de genes, de acordo com a presente invenção, é aplicada à terapia de uma doença neurodegene-rativa, pode ser realizada numa combinação apropriada com outras terapias de genes (terapia conjuntiva de genes) ou em combinação com uma fármaco-terapia utilizando um inibidor de acetilcolinesterase ou uma similar e/ou uma terapia de reabilitação. A terapia de genes da presente invenção pode ser realizada com referência às linhas mestras de NIH inclusive dos seus aspectos de segurança [Recombinant DNA Advisory Committee, Human Gene Therapy, 4, 365-389 (1993)].

Além disso, de acordo com a presente invenção, para os fins da detecção da presença do gene LY6H, é possível preparar uma amostra biológica tal como sangue ou soro, eventualmente extracto de ácido nucleico e analisa-se para a detecção do gene LY6H. 0 processo de detecção do gene pode compreender a preparação de um fragmento de ADN do gene da presente invenção e o seu desenho de tal maneira que possa ser utilizado no rastreio do gene LY6H e/ou da sua amplificação. Mais especificamente, é possível construir um fragmento de ADN com as propriedades de uma sonda para a hibridação da placa, hibridação de colónias, análise de mancha de Southern, análise de mancha de Northern, etc. ou uma sonda para a preparação de um ADN de comprimento completo ou parcial do gene da presente invenção que tenha sido amplificado por uma reacção em cadeia de polimerase (RCP) que amplifica uma 62 sequência de nucleótido com uma polimerase. Com este fim, prepara-se primeiro um iniciador que tem a mesma sequência que o gene LY6H. Então, faz-se reagir este iniciador, como uma sonda para rastreio, com uma amostra biológica (amostra de ácido nucleico) para verificar a presença da sequência do gene LY6H em particular. A amostra de ácido nucleico pode ser preparado por qualquer uma de várias técnicas que facilitam a detecção da sequência alvo, tal como desnaturação, digestão da enzima de restrição, electroforese ou análise de pontos de manchas.

Como processo para o referido rastreio, é particularmente preferida a utilização de uma técnica de RCP quanto aos pontos de sensibilidade da vista e esta técnica não está particularmente restrita considerando que se utiliza um fragmento do gene da presente invenção como um iniciador. Assim, pode-se utilizar qualquer uma dessas técnicas conhecidas [Science, 230, 1350-1354 (1985)] e as versões modificadas de RCP que tenham sido desenvolvidas no passado ou que se venham a desenvolver no futuro [Sakaki, Yoshiyuki et al. (ed.), Jikken Igaku (Experimental Medicine), Suplemento 8 (9) (1990), Yodosha; Protein, Nucleic Acid, Enzyme: Special Supplement, Kyoritsu Shuppan, 3J5 (7) (1990)]. 0 fragmento de ADN para ser utilizado como iniciador é um ADN de oligonucleótido sintetizado quimicamente e esse ADN de oligonucleótido pode ser sintetizado utilizando um sintetizador automático de ADN ou similar, por exemplo o Pharmacia LKB Gene Assembles Plus (Pharmacia). O comprimento preferido do iniciador (iniciador num sentido ou iniciador no sentido contrário) a ser sintetizado pode ser, por exemplo, de cerca de 10-30 nucleótidos. A sonda para os requerentes no referido rastreio é normalmente uma sonda marcada mas pode ser uma sonda não marcada ou a detecção pode ser feita de 63 acordo com a ligação específica a um ligando marcado directamente ou indirectamente. O marcador apropriado e o processo de marcação da sonda ou do ligando pertence à técnica anterior. Assim, o marcador da técnica anterior inclui radioísótopos, biotina, grupos fluorescentes, grupos quimioluminescentes, enzimas, anticorpos, etc., que pode ser recuperado através de processos conhecidos tais como a tradução do corte, a iniciação aleatória e o tratamento com cinase. A técnica de RCP a ser utilizada para a detecção pode ser, por exemplo, por RCP-TR mas podem ser utilizadas várias modificações da técnica que são utilizadas por rotina na técnica.

Além disso, o processo do ensaio anterior pode ser realizado de forma expedita utilizando um kit de reagentes para a detecção de um gene LY6H nas amostras.

Por isso, a presente invenção providencia um kit de reagentes para a detecção de um gene LY6H compreendendo um fragmento de ADN do gene da presente invenção.

Este kit de reagentes compreende pelo menos um fragmento que híbrida com uma parte ou com toda a sequência de nucleõtidos mostrada na SEQ ID NO: 2 ou as suas sequências de nucleótidos complementares como uma componente essencial e podem eventualmente conter outros componentes tais como o agente de marcação e reagentes de RCP (por exemplo, Taq ADN polimerase, trifosfato de desoxinucleótido, iniciadores, etc. O agente de marcação pode ser um rádio-isótopo ou um modificador químico tal como uma substância fluorescente mas o fragmento de ADN como tal tem de ser conjugado com esse 64 agente de marcação. Este kit de reagentes pode ainda conter um dissolvente ou diluente de reacção apropriado, um anticorpo padrão, um tampão, uma solução de lavagem, uma solução de paragem da reacção, etc. que torna mais fácil de realizar o ensaio. A presente invenção, num outro aspecto, ainda tem por objecto um processo para o diagnóstico de doenças neurodegenerativas que compreendem a utilização do processo de ensaio anterior e um agente de diagnóstico ou um kit de reagentes de diagnóstico para ser utilizado na prática do referido processo.

Pela sequenciação directa ou indirecta dos genes de LY6h obtidos das amostras do ensaio por meio da utilização do processo anterior, é possível encontrar novos genes relacionados com o gene LY6H com uma elevada homologia com o gene LY6H de tipo selvagem.

Por isso, a presente invenção tem ainda por objecto um processo de rastreio de genes relacionados com o gene LY6H em amostras que compreendem a realização do referido ensaio e a sequenciação dos genes LY6H contidos nas amostras de ensaio. O LY6H de tipo selvagem e/ou o mutante de LY6H podem ser determinados utilizando a proteína codificada pelo gene LY6H humano da presente invenção (um polipéptido comportando a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1) , um polipéptido que comporta uma sequência de aminoácidos derivada da sequência mostrada na SEQ ID NO: 1 por meio da eliminação, substituição ou adição de 1 ou de uma pluralidade de aminoácidos, um fragmento de qualquer um deles ou de um anticorpo de uma qualquer dessas proteínas. 65

Por isso, a presente invenção tem por objecto um processo de determinação de um anticorpo anti LY6H de tipo selvagem e/ou mutante de LY6H ou um processo para a determinação do antigénio. Por este processo, o grau de deterioração do nervo do cérebro pode ser detectado a partir de uma alteração do LY6H de tipo selvagem (polipéptido). Essas alterações podem ser detectadas pela sequenciação de LY6H por uma tecnologia bem estabelecida descrita aqui antes, mais preferencialmente detectando as diferenças no polipéptido de LY6H ou a presença ou a ausência de polipéptido de LY6H pela utilizazção do referido anticorpo (anticorpo policlonal ou monoclonal). A seguir dá-se um exemplo específico da determinação do referido LY6H de tipo selvagem e/ou mutante de Ly6H. 0 anticorpo anti-LY6H pode ser utilizado para imuno-precipitar o polipéptido de LY6H a partir de uma solução contendo uma amostra biológica obtida de um corpo humano, tal como uma amostra de sangue ou de soro ou pode reagir com o polipéptido de LY6H em gel de poliacrilamida de uma mancha de Western ou imuno-mancha. O polipéptido de LY6H numa secção de parafina ou num espécimen de tecido congelado pode ser detectado por uma técnica de imuno-histoquímica utilizando o anticorpo anti-LY6H. A produção do anticorpo e a tecnologia de purificação são bem conhecidas na técnica e podem utilizar-se selectivamente técnicas apropriadas. A tecnologia relavante preferida para a detecção de LY6H de tipo selvagem ou um seu mutante inclui um ensaio imuno-absorvente ligado à enzima (ELISA), rádio-imuno-ensaio (RIA), ensaio imuno-radiométrico (IRMA) e ensaio imuno-enzimométrico (IEMA) com uma técnica de sanduíche utilizando um anticorpo monoclonal e/ou um anticorpo policlonal. 66 A presente invenção tem ainda por objecto um ligando de LY6H ou um receptor de LY6H que existe numa fracção da membrana da célula ou na superfície da célula e comportando uma afinidade de ligação para o polipéptido de LY6H. Pode-se obter o receptor de LY6H por conjugação de um polipéptido de LY6H marcado numa amostra biológica contendo uma fracção da membrana da célula, extracção, isolamento e purificação do produto de conjugação e identificação da sequência de aminoácidos do produto isolado. 0 processo para a preparação e o processo de sequenciação deste polipéptido receptor de LY6H são óbvios para um especialista na matéria.

Além disso, aplicando o receptor de LY6H ou um seu fragmento para um rastreio de vários fármacos, a presente invenção permite a selecção de vários compostos (que reagem com o receptor de LY6H, inclusive de compostos de baixo peso molecular, compostos de elevado peso molecular, proteínas, fragmentos de proteínas, antigénios, anticorpos, etc.). Preferencialmente, utiliza-se um receptor de LY6H como um todo. 0 polipéptido receptor de LY6H ou um seu fragmento para ser utilizado nesse rastreio podem ter sido imobilizados numa matriz sólida ou podem ser uma substância livre numa solução a ser transportada para a superfície da célula.

Um exemplo do rastreio de fármacos anterior é um sistema de rastreio em que as células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas transformadas de forma estável com um ADN recombinante que codifia para um polipéptido de LY6H ou um seu fragmento são utilizados, preferncialmente, num ensaio de ligação competitivo. Como uma alternativa, as referidas células hospedeiras, quer numa forma livre ou como imobilizadas, são utilizadas no ensaio de ligação padrão. Mais particularmente, o rastreio de fármacos anterior pode compreender a reacção do polipéptido receptor de LY6H ou de 67 um seu fragmento, com o polipéptido de LY6H ou um seu fragmento, na presença de um fármaco candidato, para causar a formação de um complexo e a detecção do grau de inibição da formação do complexo pelo fármaco candidato anterior.

Assim, de acordo com a presente invenção, pode-se providenciar um processo de rastreio de fármacos que compreende o contacto de um fármaco candidato com o polipéptido receptor de LY6H ou um seu fragmento e depois detectando a presença do complexo resultante ou a presença de um complexo do polipéptido receptor de LY6H ou um seu fragmento com um ligando por meio de uma técnica conhecida per se. Além disso, fazendo o ensaio da actividade do receptor de LY6H é possível avaliar se um fármaco candidato é capaz de antagonizar o receptor de LY6H e, de acordo com isto, pode-se modificar a actividade do LY6H definido antes, isto é, pode ser capaz de modular o crescimento dos neurónios ou modular a conjugação de proteína - proteína ou a actividade de formação do complexo. Nesse ensaio de ligação concorrente, marca-se o polipéptido do receptor de LY6H ou um seu fragmento. Quando o polipéptido do receptor de LY6H livre ou um seu fragmento se separa do complexo de proteína -proteína e se mede a quantidade de marcação da substância livre (não formação do complexo), o valor da medição serve como referência da ligação do factor de ensaio com o receptor de LY6H. 0 valor medido serve também como uma medida de inibição da ligação do receptor de LY6H ao polipéptido de LY6H. Analisando um péptido pequeno (pseudopéptido) do polipéptido de LY6H desta maneira, pode-se fazer o ensaio do fármaco candidato como uma substância que tem actividade que antagoniza o receptor de LY6H.

Outro protocolo para a avaliação de fármacos, de acordo com a presente invenção, é o da avaliação de um composto com 68 uma afinidade de ligação adequada para o polipéptido do receptor de LY6H. Em resumo, este processo compreende a sintetização de um grande número de compostos diferentes dos péptidos de ensaio num suporte sólido tal como uma superfície de um alfinete de plástico ou outro material, reagindo os compostos dos péptidos de ensaio com o polipéptido do receptor de LY6H e, depois da lavagem, a detecção dos produtos de ligação da reacção do polipéptido do receptor de LY6H por um processo conhecido [por exemplo, a publicação da patente de invenção PCT No. WO 84-03564].] O receptor de LY6H purificado pode ser directamente revestido na placa a ser utilizada no referido processo de fármaco-rastreio. O anticorpo pode ser capturado com um anticorpo não neutralizante contra o polipéptido e o polipéptido do receptor de LY6H ser imobilizado numa fase sólida. A presente invenção tem ainda por objecto a utilização de um ensaio concorrencial de avaliação do fármaco. Para a ligação com um polipéptido do receptor de LY6H ou um seu fragmento, faz-se com que um anticorpo de neutralização capaz de se ligar especificamente ao polipéptido do receptor de LY6H concorra com o composto candidato. Por meio dessa reacção concorrencial com o anticorpo de neutralização, pode-se detectar a presença de qualquer péptido com um ou mais determinantes antigénicos do polipéptido do receptor de LY6H.

Como outro processo para a avaliação do fármaco, o polipéptido de LY6H da presente invenção ou o produto do gene LY6H da presente invenção pode ser utilizada na avaliação dos compostos que activam (agonistas) ou inibem (antagonistas ou inibidores) a actividade do polipéptido de LY6H ou do produto do gene LY6H. 69

Utilizando o polipéptido de LY6H ou o produto do gene LY6H da presente invenção, podem identificar-se agonistas ou antagonistas das células, preparações isentas de células, bibliotecas químicas e composições de ocorrência natural. Estes agonistas ou antagonistas podem ser substratos naturais ou modificados, ligandos, enzimas ou receptores do polipéptido de LY6H da presente invenção ou as cópias estruturais ou funcionais do polipéptido da presente invenção [Coligan et al. , Current Protocols in Immunology, 1_(2),

Capítulo 5 (1991)].

Estudos de hibridação in situ revelaram a expressão do gene LY6H da presente invenção em vários tecidos do cérebro humano normal, a níveis particularmente elevados no hipocampo e no córtex entorrinal que estão normalmente severamente prejudicados em pacientes com Alzheimer e verificou-se que o seu nível de expressão estava fortemente diminuído inclusive no lobo temporal do hipocampo e no córtex entorrinal de pacientes com doença de Alzheimer. É por isso muito provável que este gene esteja associado com o início e o progresso da referida doença.

Por isso, é expectãvel que um agonista ou antagonista desta proteína de LY6H tenha aplicação como fármaco terapêutico ou profiláctico para doenças neurodegenerativas tais como doença de Alzheimer, demência do tipo de Alzheimer, isquêmia cerebral e doença de Parkinson.

Os compostos que se obtêm através do rastreio dos fármacos candidatos para as referidas doenças relacionadas com o referido gene LY6H têm as funções da proteína da presente invenção (o produto da expressão do gene da presente invenção), tal como a acção de suporte à sobrevivência dos neurónios, acção do elongação do nervo, acção de regeneração 70 do nervo, acção da activação de nevróglia, etc. nos sistemas nervoso central e outros e acção mnemónica do cérebro (formação da memória), entre outras acções fisiológicas e, por isso, podem ser utilizados como um fármaco terapêutico ou profiláctico para várias doenças neurodegenerativas tais como doença de Alzheimer, demência do tipo Alzheimer, isquémia cerebral e doença de Parkinson. Assim, as proteínas da presente invenção (inclusive dos produtos de expressão do gene, dos seus péptidos parciais e dos seus sais) são utilizáveis como reagentes para a avaliação dos compostos que promovem as funções da proteína da presente invenção. A presente invenção tem por objecto um processo de avaliação de compostos que promovem as funções da proteína da presente invenção (aqui a seguir referidas algumas vezes como um melhorador funcional da proteína da presente invenção. Mais particularmente, a presente invenção tem por objecto (a) um processo de avaliação para um melhorador funcional da proteína da presente invenção que compreende o contacto (1) da proteína da presente invenção com as células dos nervos ou de um tecido dos nervos por um lado e (2) a proteína e um composto de ensaio com as referidas células dos nervos ou de um tecido dos nervos por outro lado e a comparação dos resultados e (b) um processo de avaliação de um melhorador funcional da proteína da presente invenção que compreende a administração (1) da proteína da presente invenção a um vertebrado por um lado e (2) a proteína da presente invenção e um composto de ensaio a um vertebrado, por outro lado e a comparação dos resultados.

Mais particularmente, no processo de avaliação anterior (a) , mede-se a actividade fisiológica nos sistemas nervoso central ou outros, tal como a actividade de suporte à sobrevivência dos neurónios, actividade do elongação do 71 nervo, actividade de regeneração do nervo, actividade da activação de nevróglia, nas condições anteriores (1) e (2) e compararam-se os resultados. No processo de avaliação (b) , mede-se a actividade de mnemónica (formação da memória) no cérebro, por exemplo, nas referidas duas condições (1) e (2) e compararam-se os resultados.

As células doe nervos (neurónios e nevróglia), para serem utilizados na avaliação anterior, incluem células de neuroblastoma, células de glioma e as suas células de hibridoma (por exemplo, N18TG-2, IMR-32, GOTO (por exemplo, G0T0-P3), NB1, C6BU-1, U251, KNS42, KNS81 e células NG108-15 e PC12 com uma potência de diferenciação das células do nervo). 0 tecido do nervo que pode ser utilizado inclui a célula neuroepitelial de rato, a célula de cultura primária do hipocampo de rato, células de Prukinje de cultura de rato fetal e gânglios da raiz dorsal de rato. 0 composto de ensaio inclui péptidos, proteínas, compostos não peptídicos, compostos sintéticos, produtos de fermentação, extractos de células, extractos de plantas, extractos de tecido animal e plasma. Estes compostos podem ser compostos novos ou compostos conhecidos.

Na realização do referido processo de rastreio (a) dissolve-se ou suspende-se a proteína da presente invenção (inclusive de um seu péptido parcial ou um seu sal) no seio de um tampão de rastreio para preparar uma amostra da proteína da presente invenção. O tampão pode ser qualquer solução tampão que não interfira com o contacto entre a proteína da presente invenção e a célula ou tecido do nervo (por exemplo, tampão de fosfato, tampão de Tris-HCl, etc. a um pH de cerca de 4-10, preferencialmente um pH de cerca de 6-8) . Ά duração do contacto é normalmente de cerca de 1-10 dias, preferencialmente cerca de 7-10 dias. A temperatura de 72 contacto é normalmente de cerca de 3 7 °C. As actividades da proteína da presente invenção nos sistemas nervoso central ou em outros, tal como a actividade de suporte à sobrevivência dos neurónios, actividade de elongação do nervo, actividade de regeneração do nervo, actividade da activação de nevróglia podem ser determinadas por processos de rotina tal como a avaliação visual da elongação axonal, a medição da concentração do Ca2+ intracelular e similares.

Qualquer composto de ensaio que promova qualquer das referidas actividades fisiológicas, tal como a actividade de suporte à sobrevivência dos neurónios, actividade do elongação do nervo, actividade de regeneração do nervo, actividade da activação de nevróglia de pelo menos 20 %, preferencialmente não menos do que cerca de 3 0 %, mais preferencialmente não menos do que 50 %, ainda mais preferencialmente não menos do que 70 %, nas condições mencionadas antes (2) quando comparadas com a condição (1) pode ser seleccionado como melhorador funcional da proteína da presente invenção.

Na realização do processo de análise anterior (b) , a proteína da presente invenção, sozinha ou em combinação com o composto de ensaio, é administrado a animais de laboratório por meio de uma injecção intravenosa, subcutânea ou intramuscular ou oralmente. A dosagem da proteína da presente invenção para administração oral é geralmente de cerca de 0,1-100 mg/dia, preferencialmente cerca de 1,0 a 50 mg/dia, mais preferencialmente cerca de 1,0-20 mg/dia, por mamífero (com base num peso do corpo de 50 kg) . A dose parentérica deve-se seleccionar de acordo com o receptor e o processo de administração mas é preferível administrar cerca de 0,01-30 mg/dia, preferencialmente cerca de 0,1-20 mg/dia, mais 73 preferencialmente cerca de 0,1 a 10 mg/dia, por mamífero (peso do corpo de 50 kg) por via intravenosa.

Os animais de ensaio incluem mamíferos tais como o homem, o macaco, o chimpanzé, o murganho, o rato, o coelho, ovelhas, porcos, vacas, cavalos, gatos e cães e peixe (por exemplo, carpa, salmão, arenque, truta irisada, peixe dourado, etc.). A actividade de mnemónica (formação da memória) da proteína da presente invenção no cérebro pode ser avaliada de acordo, por exemplo, com um protocolo do ensaio de labirinto aquático (designado muitas vezes por "water maze Morris test") [Morris, R. G. M., J. Neurosci. Meth. , 11, 47-60 (1984)]. Qualquer composto de ensaio que promova o efeito de mnemónica anterior não inferior a cerca de 20 %, preferencialmente não inferior a 50 %, mais preferencialmente não inferior a 70 %, na referida condição (2) quando comparada com a condição (1) é utilizável como um melhorador funcional da proteína da presente invenção. 0 kit de avaliação é um outro enquadramento da presente invenção (inclusive do produto de expressão do gene, um seu péptido parcial e qualquer sal de qualquer um deles) como um seu componente essencial. Um kit consiste dos seguintes componentes: 1-4 é um exemplo do kit de avaliação da presente invenção.

Componente 1: solução de Hank como tempão de ensaio

Componente 2: Proteína padrão (proteína da presente invenção ou um seu sal)

Componente 3: Células dos nervos ou um tecido do nervo (uma cultura das referidas células de nervos ou um tecido do nervo 74 numa placa de 24 microtubos, 104 célula/tubo, para crescer utilizando MEME de Eagle, solução de Hanks, sob atmosfera de C02 a 5 % a 37 °C) .

Componente 4: Um microscópio invertido para observação A avaliação com o kit de avaliação anterior pode ser realizada como se segue.

[Processo]

Conta-se o número, por campo de visão, de células positivas de elongação axonal no microtubo contendo o composto de ensaio e compara-se com o número de células positivas de elongação axonal no microtubo de controlo (ensaio isento de composto) e a diferença é testada sob o ponto de vista estatístico. 0 composto ou o sal obtido pelo processo de avaliação ou com o kit de avaliação de acordo com a presente invenção é um elemento seleccionado na classe mencionada antes que consiste em péptidos, proteínas, compostos não peptídicos, compostos sintéticos, produtos de fermentação, extractos de células, extractos de plantas, extractos de tecido animal, etc. e é um composto capaz de promover a função da proteína da presente invenção. O composto que promove as funções da proteína da presente invenção como tal mostra actividades fisiológicas tais como actividade de suporte da sobrevivência neuronal, actividade de elongação dos nervos, actividade de regeneração dos nervos, actividade de activação da nevróglia, etc. e por isso promove a função da proteína da presente invenção ou similar adicionalmente ou em sinergia ou, embora não exibindo essas actividades fisiológicas por si própria, pode promover a função da proteína da presente invenção. Exemplos dos sais 75 do composto incluem sais com bases aceitáveis sob o ponto de vista fisiológico (por exemplo, metais alcalinos) ou ácidos (por exemplo, ácidos orgânicos, ácidos inorgânicos). Particularmente preferidos são os sais de adição de ácidos aceitáveis sob o ponto de vista fisiológico, tal como os sais com ácidos inorgânicos (por exemplo, ácido clorídrico, ácido fosfórico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico) ou ácidos orgânicos (por exemplo, ácido acético, ácido fórmico, ácido propiónico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido málico, ácido oxálico, ácido benzóico, ácido metano-sulfónico, ácido benzeno-sulfónico). O composto ou o sal que promove a função da proteína da presente invenção tem valor como um fármaco de baixa toxicidade, seguro, terapêutico ou profiláctico para várias doenças degenerativas tais como a doença de Alzheimer, demência do tipo Alzheimer, isquémia cerebral e doença de Parkinson. 0 processo de avaliação anterior envolve a utilização de células que expressam o polipéptido de LY6H na superfície da célula ou respondem à proteína da presente invenção. Esntre essas células estão as células derivadas de animais mamíferos, fungos, Drosophilia e E. coli. As células que expressam o polipéptido de LY6H (ou a membrana das células que tenham expresso o polipéptido) ou respondem ao polipéptido de LY6H contactam com o composto de ensaio para se observar a estimulação ou a inibição da ligação ou da resposta funcional. Depois, compara-se a actividade de LY6H das células que contactaram com o composto candidato com a de células similares mas que não tiveram esse contacto. 76 O ensaio anterior pode ser realizado por detecção da adesão das células que comportam o polipétido de LY6H utilizando um marcador directamente ou indirectamente acoplado a um composto candidato ou num sistema de ensaio utilizando uma concorrência com uma substância concorrente com o a substância. Desta maneira, a ligação do composto candidato pode ser facilmente ensaiada. Além disso, utilizando um sistema de detecção apropriado para as células que comportam o polipéptido de LY6H nesses ensaios, deve-se analisar se o composto candidato produzirá um sinal atibruível â activação do polipéptido de LY6H. 0 inibidor de activação é geralmente analisado na presença de um agonista conhecido e observa-se o efeito do composto candidato na activação devido ao agonista. 0 ensaio pode compreender um simples processo que compreende a mistura do composto candidato com uma solução contendo o polipéptido de LY6H para formar uma mistura, determinando-se a actividade de LY6H na mistura com um padrão. 0 composto de baixo peso molecular (agonista ou antagonista) que se liga à proteína de LY6H pode obter-se por meio de um rastreio com BIACORE 2000, por exemplo [Markgren, P. 0., et al., Analytical Biochemistry, 265, 340-350 (1998)].

De acordo com a presente invenção, para desenvolver um derivado de polipéptido de LY6H mais activo ou estabilizado ou um fármaco que aumenta ou bloqueia a função do polipéptido de LY6H in vivo, é possível construir um polipéptido activo sob o ponto de vista biológico ou um seu análogo estrutural para interacção, tal como um agonista de LY6H, um antagonista de LY6H, um inibidor de LY6H ou similar. 0 análogo estrutural mencionado antes podem ser obtidos, por exemplo, por determinação da estrutura tri-dimensional de um complexo do polipéptido de LY6H com outra proteína por cristalografia de 77 raios X, modelação em computador ou uma combinação dessas técnicas. A informação sobre a estrutura de um análogo estrutural pode também ser adquirida por modelação de polipéptidos com base na estrutura de proteínas homólogas.

Para se obter o referido derivado do polipéptido de LY6H mais activo ou estabilizado, pode-se utilizar uma análise por meio da pesquisa de alanina. Este processo compreende a substituição de Ala em cada resíduo de aminoácido para avaliar a influência da substituição na actividade do péptido. Assim, como cada resíduo de aminoácido de um péptido é assim analisado, determina-se a região de importância para a actividade ou a estabilidade do péptido. Por este processo, é possível desenhar um derivado de polipéptido de LY6H mais activo ou estável. É também possível isolar o anticorpo específico do alvo seleccionado por meio do ensaio funcional e a análise da estrutura do seu cristal. Como regra, por meio desta abordagem, obtém-se o núcleo do fármaco que providencia uma base para se obter o subsequente desenho do fármaco. Produzindo um antibiótico anti-ideotípico ao anticorpo funcional, activo sob o ponto de vista farmacológico, é possível identificar e isolar um péptido de um banco de péptidos gerados quimicamente ou biologicamente. Por isso, é previsível que o péptido seleccionado possa também servir como núcleo do fármaco.

Desta forma, é possível desenhar e desenvolver fármacos com uma actividade de LY6H melhorada ou estabilizada ou actuando como inibidores, agonistas, antagonistas da actividade de LY6H. ry g A avaliação desse fármaco pode ser feita por titulação do seu efeito na sobrevivência dos neurónios utilizando neurónios do hipocampo de cultura primária [Japan. J. Pharmacol, 5J3, 221-227 (1990)] ou investigando os seus efeitos nas lesões degenerativas em animais com um modelo de Alzheimer tal como o gene da proteína precursora de β-amilóide ou o gene mutante de presenilina 1 de ratos transgénico [Nature, 373, 523-527 (1995) : Nature Med., 5, 560-564 (1999)] . 0 composto assim obtido pode ser utilizado não apenas como um fármaco para a doença de Alzheimer, mas também como um fármaco terapêutico para o enfarte cerebral e outras doenças neurodegenerativas.

Além disso, de acordo com a presente invenção, produzindo ratos fortes comportando o gene LY6H (ratos transgénicos com antecedentes fortes), é possível averiguar qual o sítio ou sítios da sequência de nucleótidos do gene LY6H que têm influências nas referidas actividades múltiplas de LY6H in vivo, isto é, que funções têm os produtos de expressão do gene LY6H e o gene LY6H modificado in vivo.

Este processo é uma técnica para modificar intencionalmente a informação genética de um ser vivo, utilizando genes recombinantes homólogos e inclui um processo que células indiferenciadas embriónicas de rato (por exemplo, células ES) [Capeccchi, M. R., Science, 244, 1288-1292 (1989)]. O processo de geração do referido rato mutante é realizado agora por uma tecnologia de rotina para os especialistas na matéria e os ratos mutantes podem ser facilmente gerados aplicando um gene LY6H humano, de tipo 79 selvagem ou um gene LY6H mutante a uma versão modificada da tecnologia anterior [Noda, Testuo (ed.): Jikken Igaku (Experimental Medicine), Suplemento, 14 (20) (1996),

Yodosha]. Por isso, utilizando esta técnica, é possível desenhar e desenvolver que têm uma actividade de LY6H melhorada ou estabilizada ou inibidores, agonistas e antagonistas da actividade de LY6H.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A fig. 1 é uma representação diagramática da análise de manchas de Northern que mostra o modelo de expressão do gene LY6H em vários sítios do cérebro de um paciente com doença de Alzheimer.

MELHOR PRÁTICA DE REALIZAÇÃO DA PRESENTE INVENÇÃO

Os exemplos que se seguem destinam-se a ilustrar a presente invenção em mais detalhe.

Exemplo l (1) Clonagem e sequenciação de ADN do gene LY6H humano O ARNm extraído do cérebro humano fetal foi comprado aos CLONTECH Laboratories e utilizou-se como o material inicial. A partir deste ARNm, sintetizou-se um ADN e ligou-se a um vector lambda ZAPII (Stratagene) para construir uma biblioteca de ADNc (Otsuka GEN Research Institute, Otsuka Pharmaceutical Co.) . Utilizando o processo de excisão in vivo [in vivo excision: Short, J. M., et al., Nucleic Acids Res., 16, 7583-7600 (1988)],formaram-se colónias de genes humanos comportando Escherichia coli em meio de agar e recolheram-se aleatoriamente para registar os clones de E. coli comportando 80 o gene humano numa microplaca de 96 micro-tubos. Armazenaram-se estes clones a -80 °C.

Depois, pôs-se em cultura cada clone registado em 1,5 mL de meio LB durante a noite e extraiu-se o ADN e purificou-se utilizando um extractor automático de plasmido PI-100 (Kurabo). Decompôs-se o ARN de E. coli contaminado com ARNase e eliminou-se. Finalmente, preparou-se 30 pL de uma solução de ADN e utilizou-se uma porção de 2 pL, verificou-se a dimensão aproximada do ADN e a quantidade por meio do processo do minigel. Utilizou-se uma porção de 7 pL para uma reacção de sequenciação e armazenou-se os 21 pL remanescentes como um ADN de plasmido, a 4 °C. Por este processo, pode-se extrair um cosmido o qual pode também ser utilizado como uma sonda para HFIS (hibridação por fluorescência in situ, "FISH" na terminologia inglesa) como se descreve a seguir, por meio de uma modificação menor do programa.

Depois, realizou-se na terminação de desoxi uma reacção de Sanger et al. utilizando T3, T7 ou um iniciador de oligonucleótido sintético [Sanger, F., et al. , Proc. Natl. Acad. Sei., USA., 74, 5463-5467 (1977)] ou uma reacção de sequenciação de ciclo [Carothers, A. M., et al., Bio. Techniques, 7, 494-499 (1989)] que é a reacção da terminação de desoxi mais a RCP. Trata-se de técnicas de extensão de cadeia com uma terminação especifica com quatro tipos de bases utilizando uma pequena quantidade (cerca de 0,1-05 pg) do ADN do plasmido como matriz.

Utilizando um iniciador marcado com ITCF (isotiocianato de fluoresceína) como o iniciador da sequência, realizaram-se 25 ciclos da reacção utilizando Taq polimerase. Do fragmento de ADN marcado por fluorescência, determinou-se a sequência de cerca de 400 nucleótidos a partir da extremidade 5' do 81 ADNc com o sequenciador automático de ADN, ALF™ DNA Sequencer (Pharmacia). A região não traduzida 3' tem uma elevada heterogeneidade entre os genes e apropriada para a diferenciação de genes individuais. Por isso, a sequenciação da região da extremidade 3' foi também realizada nalguns casos. A vastíssima informação sobre a sequência de nucleótidos gerada com o sequenciador de ADN foi transmitida a um computador DEC3400 de 64 bit para realizar uma análise computorizada da homologia. Esta análise da homologia foi realizada por meio de uma pesquisa em base de dados (GenBank, EMBL) de acordo com o programa FASTA da UWGCG [Pearson, W. R. e Lipman, D. J. , Proc. Natl. Acad. Sei., USA., 8j5, 2444-2448 (1988)] .

Fujiwara et al. descrevem em detalhe acerca do processo de análise anterior para uma biblioteca de ADNc de cérebro fetal humano [Fujiwara, T., et al. , DNA Res. , 2, 107-111 (1991)] .

Os MSE (marcadores de sequência expressa: sequências do ADN parcial do fragmento de gene expresso) seleccionados aleatoriamente a partir da biblioteca de ADNc de cérebro fetal humano construída como antes, foram então sequenciados.

Verificou-se que o clone designado por GEN-425D01 na pesquisa de sequências do GenBank/EMBL de acordo com o programa FASTA era altamente homólogo do gene que codifica para a proteína da família Ly6 de rato.

Utilizando um ADN de estrutura helicoidal dupla inserido num vector (vector de pBluescript; Stratagene) como matriz e 82 um oligonucleótido sintético como iniciador, determinou-se a sequência de nucleótidos do ADNc inclusive de toda a região de codificação do clone anterior por meio do processo de terminação de cadeia de didesoxi de Sanger. A sequenciação com o sequenciador automático de ADN ABIPRISMTM377 revelou que a sequência de ADNc do clone obtido antes continha uma região de codificação do aminoácido de 420 bases e a sequência de aminoácidos assim codificada continha 140 resíduos de aminoácidos. A sequência de aminoácidos do clone de ADNc de comprimento completo era composta por 854 nucleótidos. Mostra-se a sequência completa na SEQ ID NO: 3; a sequência de nucleótidos do fragmento de leitura aberta está indicada na SEQ ID NO: 2; e a sequência de aminoácidos codificada pela referida sequência de nucleótidos está indicada na SEQ ID NO: 1. A sequência de aminoácidos da proteína humana de LY6H foi comparada com as sequências de outras proteínas da família Ly6 e comparou-se a sequência de nucleótidos conservada na região de iniciação da tradução do aminoácido [Kozak, M., J. Biol. Chem., 266, 19867-19870 (1991)] com a região 5' do gene LY6H humano. O codão de iniciação assim determinado estava localizado na posição 99-101, que é o segunde tripleto de ATG da sequência de nucleótidos indicada na SEQ ID NO: 3. Além disso, o sinal de poliadenilação (AATAAA) estava localizado na posição 832-837 da mesma sequência de nucleótidos. (2) Análise de mancha de Northern

Para definir o perfil de expressão de LY6H em tecidos, realizou-se uma análise de mancha de Northern, utilizando vários tecidos humanos. 83

Na análise de mancha de Northern, utilizaram-se as Manchas I e II (CLONTECH) do NTM (Northern de tecido múltiplo) .

Amplificou-se o fragmento do ADNc por RCP utilizando um conjunto de iniciação das sequências de promotores de T3 e T7 . 0 produto da amplificação de RCP do referido clone de ADNc do GEN-425D01 foi marcado com [32P] -dCTP (Random Primed DNA Labeling Kit, Boehringer Mannheim GmbH) para ser utilizado como sonda. A mancha contendo o produto de amplificação foi pré-hibridado (em condições de acordo com o protocolo do produto) e depois foi submetida a hibridação de acordo com o protocolo do produto.

Realizou-se a hibridação a 65 °C durante a noite no seio de uma solução composta por NaCl 1 M/Tris-HCl 50 mM (a pH 7,5)/2 x solução de Denhardt/sulfato de dextrano a 10 %/solução de SDS a 1 % (contendo 100 pg/mL de ADN de esperma de salmão desnaturado). Depois de se lavar duas vezes com 2 x SSC/SDS a 0,1% à temperature ambiente, lavou-se o produto uma vez com 0,1 x SSC/SDS a 0,1% a 65 ° C durante 40 minutos. Expôs se o filtro contra um filme de raios X (Kodak) a -70 °C durante 18 horas.

Realizou-se o ensaio anterior utilizando os seguintes tecidos humanos de adulto: cérebro, pâncreas, testículos, intestino delgado, cólon, timo, próstata, ovários, coração, placenta, pulmão, fígado, músculo do esqueleto, rim, baço, testículos e leucócito do sangue periférico. Como resultado, observaram-se transcritos de cerca de 1 kb mostrando 84 homologia com LY6H no cérebro, pâncreas, testículos, intestino delgado, cólon, timo, próstata e ovários, particularmente elevada no cérebro.

(3)_Localização do gene no cromossoma por meio de HISF utilizando clones de cosmido

Realizou-se uma HISF para a localização cromossómica utilizando 0,5 pg por cada ADN de cosmido como uma sonda de acordo com o processo conhecido [Takahashi, E. et al. , Hum. Genet., 8j5, 14-16 (1990)] . Apanharam-se os sinais de HISF por meio do filme Provia 100 (Fuji, ISO 100) ou um sistema de câmera CCD (Applied Imaging Cyto Vision).

Como resultado, verificou-se que o gene LY6H humano estava localizado no q24.3 do cromossoma 8. Assim, mapeou-se o GEN-425D01 na banda de cromossomas 8q24.3.

Os anticorpos contra as proteínas que pertencem à família LY6 têm sido utilizados na purificação das células indiferenciadas de sangue como um alvo da terapia de genes [van de Rijn, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA., 86, 4634-4638 (1989)], estudos sobre a diferenciação de células de sangue [van de Rijn. M., et al. , Proc. Natl, Acad. Sei., USA., 86, 4634-4638 (1989); Classon, B. J. e Coverdale, L. , Proc. Natl. Acad. Sei., USA., 91, 5296-5300 (1994)], activação de células imunitárias [Malek, T. R. , et al. , J. Exp. Med., 164, 709-722 (1986)], inibição da produção de células imunitárias activas [Haque, A., et al. , Immunology, 69, 558-563 (1990)] e similares e tem-se verificado que têm efeitos anti-tumor [Lu, L., et al., J. Immunol., 142, 719-725 (1989)]. O gene LY6H humano providenciado na presente exemplo permite a detecção da expressão do gene em vários tecido, a produção da proteína humana de LY6H por meio de técnicas de 85 engenharia genética e a construção de um anticorpo por meio da utilização do gene, consequentemente permitindo a referida purificação das células indiferenciadas do sangue, a investigação da diferenciação das células do sangue, a activação das células imunitárias, a inibição da activação de células imunitárias e a terapia de tumores.

Além disso, o LY6H expresso num nível elevado no cérebro permite a investigação sobre a diferenciação de células de nervos, activação dos neurónios e terapia das doenças mentais e dos neurónios. 0 rastreio de compostos com a proteína humana LY6H como alvo é também possível e os compostos assim obtidos são úteis como o anticorpo da proteína anti-humana LY6H.

Exemplo 2 (1) Análise de mancha de Northern em tecidos cerebrais de um paciente com doença de Alzheimer

Realizou-se a análise de mancha de Northern de acordo com o exemplo 1 (2).

Para investigar a expressão do gene LY6H nos tecidos do cérebro de pacientes com doença de Alzheimer, fez-se análise de mancha de Northern utilizando tecidos do cérebro de pacientes com doença de Alzheimer e tecidos do cérebro de seres humanos normais.

Realizou-se a análise de mancha de Northern utilizando a mancha II de cérebro humano normal e a mancha II de um ser humano com Alzheimer (ambos da Invitrogen) e comparou-se a expressão do gene LY6H em vários tecidos do cérebro, nomeadamente no lobo frontal, no lobo temporal, no lobo 86 parietal, no lobo occipital, na protuberância anular, no tálamo e no coro caloso, entre cérebros normais e de pessoas com doença de Alzheimer.

Os resultados mostram-se na fig. 1.

Tal como foi apontado no exemplo 1, o gene LY6H é expresso num nível elevado no cérebro. A análise anterior revelou que, embora a expressão do gene fosse confirmada em vários tecidos do cérebro humano normal, o gene foi expresso a níveis particularmente elevados no lobo temporal inclusive do hipocampo e no córtex entorrial que são conhecidos por estares severamente deteriorados em pacientes com doença de Alzheimer, enquanto se verificaram decréscimos marcados no lobo temporal inclusive do hipocampo e do córtex entorrial no paciente com doença de Alzheimer, indicando que é muito pouco provável que o gene esteja envolvido no início e na progressão desta doença.

Por isso, é expectável que a estrutura helicoidal que corre no sentido de 5' para 3' do gene LY6H, o porduto de expressão de LY6H e a proteína de LY6H tenham aplicação como fármacos terapêuticos para a doença de Alzheimer, demência do tipo de Alzheimer, isquémica cerebral e doença de Parkinson.

Além disso, também é expectável que os agonistas e os antagonistas da proteína de LY6H sejam utilizáveis como fármacos terapêuticos para a doença de Alzheimer e para outras doenças.

Exemplo 3

(1) Construção de um vector de expressão de LY6H 87 O ADNc de LY6H obtido pelo processo de excisão in vivo é clivado com Mvll e Xhol para se obter um fragmento de cerca de 800 bases. Este fragmento, contendo toda a região de codificação do gene LY6H mostrado na SEQ ID NO: 1, está ligado ao pAc5.1/V5-HisA (Invitrogen) clivado de EcoRV/Xhol para construir um vector de expressão (vector de expressão pAC/LY6H). (2) Expressão e purificação da proteína que é o ingrediente activo da presente invenção O ADN do vector de expressão de pAC/LY6H e o ADN do vector de pCoHYGRO (Invitrogen) misturam-se numa relação de 19:1 e introduziram-se em células de mosca da fruta (Schneider 2) por transfecção de fosfato de cálcio. Depois das células estarem em cultura em soro bovino fetal a 10 % em meio de expressão de DES (Invitrogen) a 23 °C, durante 48 horas, adiciona-se à cultura 300 pg/mL de higromicina (Hygromycini B, Boehringer Mannheim) e realiza-se a selecção de clones de células resistentes a fármacos durante 3 semanas. Submete-se um transformante estável a uma cultura estacionária a uma concentração de 5 x 106 células/mL utilizando 20 frascos de cultura Falcon 5000 (Becton Dickinson) contendo 20 mL de soro bovino fetal a 10 % em meio de expressão de DES (Invitrogen) e colhem-se as células da cultura. Depois de se lavar duas vezes com uma solução salina tamponada por fosfato (STF), faz-se uma suspensão das células no seio de STF contendo 2 % de albumina de soro bovino e 0,5 U/mL de fosfolipase C específica de fosfatidil-inositol (FLCFI) e fez-se a cultura a 37 °C durante 1 hora. A partir do sobrenadante da cultura, pode-se purificar a proteína objectivo por cromatografia em coluna de permuta iónica ou similar. 88 (3) Isolamento e cultura de neurónios do hipocampo

Isola-se assépticamente todo o cérebro a partir de fetos de ratos SD no dia embrionário 18 e faz-se a excisão do hipocampo. Corta-se o tecido excisado em lâminas finas com um bisturi e faz-se a incubação para o tratamento enzimático no seio de STF contendo 0,25 % de tripsina e 0,02 % de DNase I a 37 °C durante 20 minutos. Depois da reacção enzimática parar por adição de soro bovino fetal, repete-se três vezes, com uma pipeta com uma ponta de plástico, a aspiração - ejecção do produto digerido da célula para dispersar as células. Faz-se passar a dispersão das células através de um filtro que consiste em 2 folhas de papel de lentes empilhadas para eliminar o tecido não digerido e centrifuga-se a 1000 rpm durante 5 minutos. Lavam-se as células com MEMD (meio essencial mínimo de Dulbecco, "DMEM" na terminologia inglesa) (Gibco) e semeou-se numa placa de 96 micro-tubos revestida de poli-L-lisina (Sigma) contendo SBF a 10 % MEMD a uma concentração final de 2 x 105 cêlulas/cm2. (4) Tratamento com o ingrediente activo de proteína da presente invenção

As células anteriores são postas em cultura durante 24 horas e depois muda-se o meio de cultura para MEMD com um suplemente de N2 a 1 % (Gibco) , adiciona-se a proteína que é o ingrediente activo da presente invenção como se preparaou antes em (2) (o grupo da invenção).

Para comparação, a proteína que é o ingrediente activo da presente invenção é tratada a quente num banho de água a ferver durante 5 minutos e adiciona-se (o grupo da proteína fervida). 89 (5) Avaliação da sobrevivência dos neurónios do hipocampo Põe-se em cultura as células (de cultura) em cada grupo, conforme se preparou em (4), durante 72 horas. Depois, pode-se avaliar o efeito de suporte da sobrevivência dos neurónios do hipocampo por parte da proteína que é o ingrediente activo da presente invenção, por meio do ensaio com MTT [brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio]. Este ensaio de MTT pode ser realizado utilizando, por exemplo, um sistema de ensaio "Cell Titer 96" da Promega. (6) Isolamento e cultura de neurónios do cérebro médio

Isola-se assépticamente todo o cérebro a partir de fetos de ratos SD no dia embrionário 14 e faz-se a excisão da parte ventral do cérebro médio. Corta-se o tecido excisado em lâminas finas com um bisturi e faz-se a incubação para o tratamento enzimãtico no seio de solução tamponada com fosfato (STF) contendo 0,25 % de tripsina e 0,002 % de DNase I a 37 °C durante 20 minutos. Depois da reacção enzimãtica parar por adição de soro bovino fetal, repete-se três vezes, com uma pipeta com uma ponta de plástico, a aspiração -ejecção do produto digerido da célula para dispersar as células. Faz-se passar a dispersão das células através de um filtro que consiste em 2 folhas de papel de lentes empilhadas para eliminar o tecido não digerido e centrifuga-se a 1000 rpm durante 5 minutos. Lavam-se as células com MEMD (meio essencial mínimo de Dulbecco, "DMEM" na terminologia inglesa) /F12 (Gibco) e semeou-se numa placa de 96 micro-tubos revestida de poli-L-lisina (Sigma) contendo SBF a 10 % - MEMD/F12 a uma concentração final de 3 x 105 células/cm2. (7) Tratamento com a proteína que é o ingrediente activo da presente invenção 90

Faz-se uma cultura das células preparadas em (6) durante 24 horas e depois muda-se o meio de cultura para MEMD/F12 com um suplemente de N2 a 1 % (Gibco), adiciona-se a proteína que é o ingrediente activo da presente invenção como se preparaou antes em (2) (o grupo da invenção).

Para comparação, a proteína que é o ingrediente activo da presente invenção é tratada a quente num banho de água a ferver durante 5 minutos e adiciona-se (o grupo da proteína fervida). (8) Avaliação do efeito de suporte da sobrevivência dos neurónios do cérebro médio

Fez-se uma cultura das células (de cultura) em cada grupo conforme preparado em (7), durante 72 horas. Depois, o efeito de suporte da sobrevivência dos neurónios do cérebro médio da proteína que é o ingrediente activo da presente invenção foi avaliado por meio do ensaio de MTT [brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-iyl)-2,5-difeniltetrazólio]. Este ensaio de MTT pode ser realizado utilizando, por exemplo, o sistema de ensaio "CellTiter 96" da Promega. (9) Avaliação do efeito de suporte da sobrevivência dos neurónios dopaminérgicos

Fez-se uma cultura das células (de cultura) em cada grupo conforme preparado em (7), durante 72 horas e depois fixou-se deixando-as em repouso am paraf ormaldeído a 4 % - STF à temperatura ambiente, durante 15 minutos. Depois, utilizando Triton X100 a 1 %/STF, faz-se passar através de uma membrana.

Para evitar a a ligação não específica do anticorpo, faz-se a incubação das células em soro de cabra a 10 % - STF 91 durante 1 hora e depois, utilizando um anticorpo policlonal de hidroxilase anti-tirosina (Chemicon; diluído 1000 vezes com STF), incubaram-se as células a 4 °C durante 16 horas. Depois de se retirar a solução de anticorpo, lavaram-se as células com STF e, depois da adição de imunoglobulina anti-coelho de cabra, conjugada com polímero de dextrano, marcada com peroxidase (Dako), incubaram-se as células à temperatura ambiente durante 1 hora.

As células positivas de tirosina hidroxilase podem ser detectadas pela cor da reacção utilizando diaminobenzidina como o substrato. Utilizando o número de células positivas de tirosina hidroxilase como um marcador, pode-se avaliar o efeito de suporte da sobrevivência dos neurónios dopaminérgicos.

APLICABILIDADE INDUSTRIAL A presente invenção tem por obj ecto um novo gene específico do cérebro e uma proteína assim codificada e, por meio da sua utilização, tecnologias com valor para a purificação de células indiferenciadas, para a investigação sobre a diferenciação de células de sangue, para a activação de células imunitárias, para a inibição da produção de células imunitárias activas e para a terapia de tumores. A presente invenção também tem por objecto novos genes com actividades fisiológicas tais como a actividade de suporte da sobrevivência dos neurónios do cérebro, a actividade de elongação dos nervos, a actividade de regeneração dos nervos, a actividade de activação da nevróglia e a actividade de formação da memória do cérebro.

Tendo em vista a marcada diminuição do seu nível de expressão no lobo temporal do cérebro em pacientes com doença 92 de Alzheimer, considera-se que o gene da presente invenção inibe alterações neurodegenerativas do tecido, sendo assim utilizável como um fármaco para a terapia de genes. Além disso, o produto da expressão do gene da presente invenção encontra aplicação como fármaco profiláctico e terapêutico para essas doenças neurodegenerativas. 93

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Ostuka Pharmaceutical Co., ltd. <120> LY6H gene <130> P99-45 <160> 3 <170> Patentin Ver. 2.0

<210> 1 <211> 140 <212> PRT <213> cérebro embriónico humano <400> 1

Met Leu Pro Ala Ala Met Lis Gli Leu Gli Leu Ala Leu Leu Ala Vai 1 5 10 15 Leu Leu Cis Ser Ala Pro Ala His Gli Leu Trp Cis Glo Asp Cis Tre 20 25 30 Leu Tre Tre Asn Ser Ser His Cis Tre Pro Lis Gin Cis Gin Pro Ser 35 40 45 Asp Tre Vai Cis Ala Ser Vai Arg Ile Tre Asp Pro Ser Ser Ser Arg 50 55 60 Lis Asp His Ser Vai Asn Lis Met Cis Ala Ser Ser Cis Asp Fen Vai 65 70 75 80 Lis Arg His Fen Fen Ser Asp Tir Leu Met Gli Fen Ile Asn Ser Gli 85 90 95 Ile Leu Lis Vai Asp Vai Asp Cis Cis Glu Lis Asp Leu Cis Asn Gli 100 105 110 Ala Ala Gli Ala Gli His Ser Pro Trp Ala Leu Ala Gli Gli Leu Leu 115 120 125 Leu Ser Leu Gli Pro Ala Leu Leu Trp Ala Gli Pro 130 135 140 <210> 2 <211> 420 94

<212> ADN <213> cérebro embriónico humano <400> 2 atgctgcctg cagccatgaa gggcctcggc ctggcgctgc tggccgtcct gctgtgctcg 60 gcgcccgctc atggcctgtg gtgccaggac tgcaccctga ccaccaactc cagccattgc 120 accccaaaga agtgccagcc gtccgacacg gtgtgtgcca gtgtccgaat caccgatccc 180 agcagcagca ggaaggatca ctcggtgaac aagatgtgtg cctcctcctg tgacttcgtt 240 aagcgacact ttttctcaga ctatctgatg gggtttatta actctgggat cttaaaggtc 300 gacgtggact gctgcgagaa ggatttgtgc aatggggcgg caggggcgg gcacagcccc 360 tgggccctgg ccggggggct cctgctcagc ctggggcctg ccctcctctg ggctgggccc 420

<210> 3 <211> 854 <212> ADN <213> cérebro embriónico humano <220>

<221) CDS <222 > (99) . . (518) <4 00> 3 acgccgcccg agcccggagt gcggacaccc ccgggatgct tgcgccccag aggacccgcg 60 ccccaagccc ccgcgccgcc cccaggccca cccggagc atg ctg cct gca gcc atg 116 Met Leu Pro Ala Ala Met 1 5 aag ggc ctc ggc clg gcg ctg ctg gcc gtc ctg ctg tgc tcg gcg ccc 164

Lis Gli Leu Gli Leu Ala Leu Leu Ala Vai Leu Leu Cis Ser Ala Pro 10 15 20 gct cat ggc ctg tgg tgc cag gac tgc acc ctg acc acc aac tcc age 212

Ala His Gli Leu Trp Cis Gin Asp Cis Tre Leu Tre Tre Asn Ser Ser 25 30 35 cat tgc acc cca aag cag tgc cag ccg tcc gac acg gtg tgt gcc agt 260 His Cis Tre Pro Lis Gin Cis Gin Pro Ser Asp Tre Vai Cis Ala Ser 40 45 50 gtc cga ate acc gat ccc age age age agg aag gat cac tcg gtg aac 308

Vai Arg lie Tre As Pro Ser Ser Ser Arg Lis Asp His Ser Vai Asn 95 55 60 65 70 aag atg tgt gcc tcc tcc tgt gac ttc gtt aag cga cac ttt ttc tca 356

Lis Met Cis Ala Ser Ser Cis Asp Fen Vai Lis Arg His Fen Fen Ser 75 80 85 gac tat ctg atg ggg ttt att aac tct ggg ate tta aag gtc gac gtg 404 Asp Tir Leu Met Gli Fen Ile Asn Ser Gli Ile Leu Lis Vai Asp Vai 90 95 100 gac tgc tgc gag aag gat ttg tgc aat ggg gcg gea ggg gea ggg cac 452 Asp Cis Cis Glu Lis Asp Leu Cis Asn Gli Ala Ala Gli Ala Gli His 105 110 115 age ccc tgg gcc ctg gcc ggg ggg ctc ctg ctc age ctg ggg cct gcc 500 Ser Pro Trp Ala Leu Ala Gli Gli Leu Leu Leu Ser Leu Gli Pro Ala 120 125 130 ctc ctc tgg gct ggg ccc tgatgtctcc tccttcccac ggggcttctg 548 Leu Leu Trp Ala Gli Pro 135 140 agcttgctcc cctgagcctg tggctgccct ctccccagec tggcgtggct ggggctgggg 608 gcagccttgg cccagclccg tggctgtggc ctgtggctct cactcctccc ccgacglgaa 668 gcctccctgt ctctccgcca gctctgagtc ccaggcagct ggacatctcc aggaaaccag 728 gccatctggg caggaggcct ggggatgagg gtgggggggg acccccaggt cccggagggg 788 aagtgaagca acagcccagc tggaagggcg tcttctgcgg agaaataaag tcacttttga 848

Lisboa, 8 de Janeiro de 2007 96

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Gene caracterizado pelo facto de compreender uma sequência de nucleótidos que codifica para uma das seguintes proteínas (a) ou (b): (a) uma proteína que tem a sequência de aminoãcidos mostrada na SEQ ID NO: 1 (b) uma proteína que tem a sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1 por eliminação, substituição ou adição de um ou vários aminoácidos e tendo actividade de mnemónica, em que a referida sequência de aminoácidos é pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO: 1.
2. Gene de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a sequência de nucleótidos ser a que está indicada na SEQ ID NO: 2.
3. Gene caracterizado pelo facto de compreender o polinucleótido (a) ou (b) seguinte: (a) um polinucleótido contendo a sequência de nucleótidos mostrada na SEQ ID NO: 3 (b) um polinucleótido que híbrida em condições severas com um ADN comportando a sequência de nucleótidos mostrada na SEQ ID NO: 3, em que o referido polinucleótido codifica uma sequência de aminoácidos que comporta actividade de mnemónica. 1
4. Vector de expressão do gene caracterizado pelo facto de compreender o gene de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3.
5. Célula hospedeira caracterizada pelo facto de compreender o vector de expressão do gene de acordo com a reivindicação 4.
6. Proteína caracterizada pelo facto de ser codificada pelo gene de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3 .
7. Proteína de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo facto de ser um produto de expressão derivável do vector de expressão do gene de acordo com a reivindicação 4.
8. Anticorpo específico para a proteína de acordo com a reivindicação 6 ou o produto de expressão de acordo com a reivindicação 7.
9. Composição caracterizada pelo facto de compreender, como ingrediente activo, a proteína de acordo com as reivindicações 6 ou 7, em combinação com um veículo farmacêutico para a terapia e a profilaxia de doenças neurodegenerativas, em que a doença neurodegenerativa se selecciona no grupo que consiste em doença de Alzheimer, a demência do tipo de Alzheimer, isquémia do cérebro e doença de Parkinson.
10. Processo para avaliar compostos candidatos, caracterizado pelo facto compreender a utilização da proteína de acordo com as reivindicações 6 ou 7 em que os 2 referidos compostos candidatos se ligam ou influenciam a proteína ou o produto de expressão.
11. Utilização da proteína de acordo com as reivindicações 6 ou 7 para a produção de um medicamento para a terapia e a profilaxia de doenças neurodegene-rativas, em que a doença neurodegenerativa se selecciona no grupo que consiste em doença de Alzheimer, demência do tipo de Alzheimer, isquémia do cérebro e doença de Parkinson. Lisboa, 8 de Janeiro de 2007 3