JP4454230B2 - β−セクレターゼ基質及びその使用 - Google Patents

Description

本発明は包括的にはアルツハイマー病に関連する神経学的及び生理学的機能不全の分野に関する。より具体的には、本発明はβ−セクレターゼに対する基質として作用するペプチドの同定に関する。本発明はまたβ−セクレターゼ活性の阻害方法、アルツハイマー病の潜在的治療法のスクリーニング方法及びアルツハイマー病の治療方法に関する。β−セクレターゼ活性を調節する化合物の同定方法も提供される。

今日の医療においてアルツハイマー病（ＡＤ）のように科学者及び一般人の興味をかきたてる主題は少ない。ＡＤはヒトにおいて晩年の精神不全の最も一般的な形として現れている。ＡＤは高齢者の一般的な痴呆性脳障害である。この疾患の主たる特徴として、進行性の記憶障害、言語及び視覚空間識別力の喪失及び挙動欠陥が挙げられる。上記した認識機能の変化は大脳皮質、海馬、前脳部基底核及び脳の他の領域のニューロンが変性した結果である。死後のアルツハイマー病脳の神経病理学的分析は常に、細胞外空間及び脳微小血管壁に変性したニューロン及び神経突起プラークの神経原線維錯綜が多数存在することを示している。神経原線維錯綜は高リン酸化タウタンパク質を含む対のヘリカルフィラメントの複数の束から構成されている（Ｌｅｅ及びＴｒｏｊａｎｏｗｓｋｉ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，２：６５３−６５６（１９９２））。神経突起プラークはアミロイドコアを包囲するタンパク質材料の沈着物から構成されている（Ｓｅｌｋｏｅ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１７：４８９−５１７（１９９４））。

ＡＤの患者数は米国だけでも４００万人以上、世界中では多分１７００〜２５００万人と推定されている。更に、患者数は集団の年令が高くなるにつれて増えると予想される。ＡＤの病理は過去２０年間広く研究されてきたが、細胞外アミロイドのタンパク質配列が決定された約１５年前になって初めてこの複雑な変性疾患を理解する上での最初の分子的手掛りが得られた。

生化学、細胞生物学、分子遺伝学、神経科学及び構造生物学を含めた各種生物学的分野の研究者たちはＡＤのメカニズムを解明しようと努力してきた。ＡＤへの研究アプローチの多様性及びこの問題への科学的興味の強さとにより、ＡＤが主要なヒトの病気における合理的な治療標的の同定に対する生化学の適用が成功した最初の例となる可能性がますます高まっている。ＡＤの病因の解明における最近の進歩は多くがこの複雑な疾患の遺伝的に多様な形態を統一化する病理的特徴としての４０−４２残基アミロイド−タンパク質（Ａβ）の見かけの役割に向けられてきた。

ＡＤは、早期に発症しかつ遺伝性である家族性ＡＤ（ＦＡＤ）、及び同定可能な原因を持たない“非家族性”、或いは散発性ＡＤ（ＳＡＤ）、の２つに分類される。ＦＡＤはまれ（全ＡＤの１０％未満）ではあるが、その臨床病理学的特徴、すなわちアミロイドプラーク、神経原線維錯綜、シナプス及びニューロンの損失及び神経伝達物質欠乏、においては、より一般的なＳＡＤと見かけ上、区別することができない。

ＡＤの定義的な神経病理学的特徴は、患者の脳におけるアミロイドプラークとして知られる不溶性のタンパク質様沈着物の蓄積である。このアミロイドプラーク沈着物の存在がアミロイド仮説の根底を成す必須の所見である。

アミロイド−βペプチド（Ａβ）の沈着がアミロイドプラークの発生及びＡＤの病因において重要な役割を果たすことを示唆する証拠もある。例えば、Ａβタンパク質の誘導元（由来元）であるβ−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）をコードする遺伝子が変異している人は必ずアルツハイマー病を発症する（Ｇｏａｔｅら，Ｎａｔｕｒｅ，３５３：８４４−８４６（１９９１）；Ｍｕｌｌａｎら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．，１：３４５−３４７（１９９２）；Ｍｕｒｒｅｌｌら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：９７−９９（１９９１）；Ｖａｎ Ｂｒｏｅｃｋｈｏｖｅｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．，３５：８−１９（１９９５））。同様に、死体解剖からアルツハイマー病患者の殆どすべての脳でアミロイドプラークが見られ、かつアミロイドプラークの沈着度が痴呆度と相関していることが判明している（Ｃｕｍｍｉｎｇｓ及びＣｏｔｍａｎ，Ｌａｎｃｅｔ，３２６：１５２４−１５８７（１９９５））。

ＡＰＰの高い発現及び／または異常プロセッシングがＡＤの主要な形態学的特徴の１つであるアミロイドプラーク及び脳血管アミロイド沈着物の形成に関連していることは少なくとも２つの典拠により確認された。その第１は、改変ＡＰＰ遺伝子を発現するトランスジェニックマウスが神経突起プラーク（老人斑）及び年令依存的記憶欠損を呈することである（Ｇａｍｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３７３：５２３−５２５（１９９５）；Ｍａｓｌｉａｈら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１６：５７９５−５８１１（１９９６）；Ｈｓｉａｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４：９９−１０３（１９９６））。

証拠の第２の部分は若いうちにアミロイドプラーク及びアルツハイマー病の他の症状を呈するダウン症候群を患っている患者の研究からもたらされている（Ｍａｎｎ及びＥｓｉｒｉ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，８９：１６７−１７９（１９８９））。ＡＰＰ遺伝子が染色体２１上に存在しているので、ダウン症候群におけるこの染色体のエキストラコピーから生ずる高い遺伝子量がアミロイドプラークの早期発現の原因であるとの仮説が出された（Ｋａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ，３２５：７３３−７３６（１９８７）；Ｔａｎｚｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５：８８０−８８４（１９８７））。家族性アルツハイマー病の症例から導かれた証拠と併せて現在のデータは、Ａβ産生を増加させる遺伝子改変によりアルツハイマー病が生じ得ることを示唆する。従って、Ａβ沈着はアルツハイマー病の早期に必ず見られる現象であるので、Ａβの産生を抑える治療がこの病気の治療において有用であると考えられる。ＡＰＰ代謝を調節するプロセスの中で、ＡＰＰのアミロイド形成的または非アミロイド形成的断片へのタンパク質分解的開裂は特に興味深い。

ＡＤの病因にＡβが関わることの最強の証拠は、Ａβペプチドが培養物中のニューロンに対して有毒であること、並びに脳においてＡβを過剰産生するトランスジェニックマウスがＡβのアミロイドプラークへの多くの沈着及び高いニューロン毒性を示すという所見からもたらされる（Ｙａｎｋｎｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４５：４１７−４２０（１９８９）；Ｆｒａｕｔｓｃｈｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：８３６２−８３６６（１９９１）；Ｋｏｗａｌｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：７２４７−７２５１（１９９１））。この毒性は、該ペプチドをアミロイドフィブリル形成を高める手順である加齢（数時間〜数日インキュベート）したとき高められる。また、不溶性のフィブリル形態のＡβをサルの脳に注射すると、ヒトのアルツハイマー病に非常によく似た病状（ニューロン破壊、タウリン酸化、小膠細胞増殖）を生ずる（Ｇｅｕｌａ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，４：８２７−８３１（１９９８））。アミロイドプラークがアルツハイマー病における中心的役割を有することの証拠については、Ｓｅｌｋｏｅ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，５３：４３８−４４７（１９９４）を参照されたい。

多数の証拠からＡβの細胞外蓄積及び沈着がＡＤの病因の主たる現象であることが示唆されたが、最近の研究からＡβまたはアミロイド含有Ｃ末端断片の高い細胞内蓄積もＡＤの病態生理において役割を果たし得ることも提案されている。例えば、家族性ＡＤの原因である変異を含有するＡＰＰの過剰発現によりニューロン培養物中のＣ１００及びＨＥＫ ２９３細胞中のＡβ４２の細胞内蓄積が高められる。Ａβ４２は形成されたアミロイドプラークにおいて短い形態のＡβよりもより有効であると考えられている４２アミノ酸長の形態のＡβである。更に、細胞内及び細胞外Ａβが海馬ニューロンの散在細胞プールにおいて形成されること及びＡＰＰの２つのタイプ（“スウェーデン”及び“ロンドン”）の家族性ＡＤ突然変異に関連する共通の特徴はＡβ_４２の高い細胞内蓄積であることを示唆する証拠もある。よって、これらの研究とＡＤ病理における細胞外Ａβ蓄積を暗示している以前の報告に基づいて、改変ＡＰＰ異化作用が病気の進行に関与し得るとみられる。

ＡＰＰは各種のタンパク分解プロセッシングを受ける遍在性膜貫通（タイプ１）糖タンパク質である（Ｓｅｌｋｏｅ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，８：４４７−４５３（１９９８））。ＡＰＰは実際単一遺伝子から選択的スプライシングにより産生されるペプチドファミリーである。ＡＰＰの主要形態はＡＰＰ_６９５、ＡＰＰ_７５１及びＡＰＰ_７７０であり、ここで下付き数字は各スプライスバリアント中のアミノ酸の数を指す（Ｐｏｎｔｅら，Ｎａｔｕｒｅ，３３１：５２５−５２７（１９８８）；Ｔａｎｚｉら，Ｎａｔｕｒｅ，３３１：５２８−５３０（１９８８）；Ｋｉｔａｇｕｃｈｉら，Ｎａｔｕｒｅ，３３１：５３０−５３２（１９８８））。ＡＰＰは多くの細胞において発現し、構成的に異化される。

ＡＰＰは短い半減期を有し、すべての細胞において２つの経路により迅速に代謝される。優性な異化経路では、Ａβ配列内のＡＰＰがα−セクレターゼにより開裂されて、可溶性細胞外ドメイン（ｓＡＰＰα）の構成的分泌及び非アミロイド形成的細胞内断片（約９ｋＤ）の出現を生ずるようである。この後者の断片は構成的カルボキシ末端断片（ｃＣＴＦα）と称される。ｃＣＴＦαはｐ３断片を生ずるγ−セクレターゼによる開裂のための好適な基質である。この経路は種の間で広く保存され、多くの細胞型に存在していると思われる（Ｗｅｉｄｅｍａｎｎら，Ｃｅｌｌ，５７：１１５−１２６（１９８９）；Ｏｌｔｅｒｓｄｏｒｆら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：４４９２−４４９７（１９９０）；Ｅｓｃｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８：１１２２−１１２４（１９９０））。この経路では、ＡＰＰのプロセッシングはＡβ領域の残基Ｌｙｓ_１６とＬｅｕ_１７間の部位でのタンパク質分解開裂を含むが、ＡＰＰは依然としてトランスゴルジ分泌コンパートメント中にある（Ｋａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ，３２５：７７３−７７９（１９８７））。この開裂はＡＰＰのＡβ部分内で起こるので、Ａβの形成を阻止する。ｓＡＰＰαは神経栄養性及び神経防御性活性を有する（Ｋｕｅｎｔｚｅｌら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２９５：３６７−３７８（１９９３））。

上記したα−セクレターゼを含むこの非アミロイド形成性経路とは対照的に、ＡＰＰをβ−セクレターゼによりタンパク質分解プロセッシングするとＡβのＮ末端は露出し、可変Ｃ末端でのγ−セクレターゼ分解後にＡβを遊離する。このＡβ産生経路はＭｅｔ_６７１−Ａｓｐ_６７２結合（７７０アミノ酸イソフォームに従ってナンバリングした）のβ−セクレターゼによる開裂を含む。γ−セクレターゼ活性が単一ペプチド結合でよりもむしろＡＰＰアミノ酸の短伸長の範囲で生じるので、前記Ｃ末端は実際には単一部位よりもむしろ開裂部位の異種コレクションである。アミロイド形成性経路では、ＡＰＰはβ−セクレターゼにより開裂されてｓＡＰＰβ及びＣＴＦβを遊離し、ＣＴＦβはその後γ−セクレターゼにより開裂されて有害なＡβペプチドを遊離する。

このＡβ産生経路において重要なことはγ−セクレターゼ開裂の位置である。γ−セクレターゼ切断が残基７１１−７１２であると短いＡβ（Ａβ４０）が生ずる。残基７１３の後で切断されると長いＡβ（Ａβ４２）が生ずる。よって、γ−セクレターゼプロセスは長さが４０または４２アミノ酸のＡβペプチド（それぞれＡβ_４０及びＡβ_４２）の産生にとって主要である。ＡＰＰ及びそのプロセッシングを検討している総説としては、Ｓｅｌｋｏｅ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８：４４７−４５３（１９９８）；Ｓｅｌｋｏｅ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１０：３７３−４０３（１９９４）を参照されたい。また、Ｅｓｃｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８：１１２２（１９９４）を参照されたい。

アミロイドプラークの主成分であるＡβは、βプリーツシート凝集物を形成し得る３９〜４３アミノ酸ペプチドである。これらの凝集性フィブリルはその後アルツハイマー病患者の脳柔組織または脳血管に蓄積する（Ｇｌｅｎｎｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１２０：８８５−８９０（１９８４）；Ｍａｓｔｅｒｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ；．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：４２４５−４２４９（１９８５））。

可溶性β−アミロイドペプチドは健康な細胞により培地において（Ｈａａｓｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３５９：３２２−３２５（１９９２））、ヒト及び動物ＣＳＦにおいて（Ｓｅｕｂｅｒｔら，Ｎａｔｕｒｅ，３５９：３２５−３７７（１９９２））産生されるという報告もある。

ＡＰＰの開裂は、タンパク質分解により産生されるポリペプチドまたはペプチド断片の検出を含めた多数の便利な方法により検出され得る。前記断片は抗体結合によるような便利な手段を用いて検出され得る。タンパク質分解開裂を検出するための別の便利な方法では基質の開裂により色素原、例えば着色または蛍光産物を放出するような色素原性β―セクレターゼ基質の使用である。

いろいろなグループがβ−セクレターゼであると考えられるタンパク質をコードするｃＤＮＡをクローン化し、配列決定している（Ｖａｓｓａｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６：７３５−７４１（１９９９）；Ｈｕｓｓａｉｎら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１４：４１９−４２７（１９９９）；Ｙａｎら，Ｎａｔｕｒｅ，４０２：５３３−５３７（１９９９）；Ｓｉｎｈａら，Ｎａｔｕｒｅ，４０２：５３７−５４０（１９９９）；Ｌｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９７：１４５６−１４６０（２０００））。β−セクレターゼはこれらのグループにより様々な名前、例えばＢＡＣＥ、Ａｓｐ２、メマプシン２で呼ばれている。

アルツハイマー病の症状を予防または緩解するための手段としてアミロイドプラークの発生の阻止の可能性について多くの興味が向けられている。このための有望な戦略は、一緒になってＡβの産生に関与する２つの酵素であるβ−及びγ−セクレターゼの少なくとも１つの酵素の活性を阻害することである。この戦略は、Ａβの沈着の結果としてのアミロイドプラークの形成がアルツハイマー病の原因であるならば、２つのセクレターゼの１つまたは両方の活性の阻害が、炎症またはアポトーシスのような後半の事象が起こる前の早い段階で病気のプロセスに介入するので魅力的である。こうした早い段階の介入は特に有効であると期待される（例えば、Ｃｉｔｒｏｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｔｏｄａｙ，６：３９２−３９７（２０００）参照）。

従って、β−アミロイドプラーク形成または毒性を妨害し得る薬物はアルツハイマー病の進行を遅らせるかまたは停止させ得ると考えられる。現在のところ、β−アミロイドプラークの形成を阻止または予防する能力について候補薬物をスクリーニングするために好適なインビトロ系または方法は数少ない。前記スクリーニング方法が数少ないのは、少なくとも部分的に、アミロイド前駆体タンパク質をβ−アミロイドペプチドに変換させ、最終的にアミロイドプラークに変換させる病原メカニズムが十分理解されていないためである。

ＡＤのような病気の治療としてＡＰＰ異化作用を調節することの予想される利点にてらして、ＡＰＰ含有細胞の生存能力を実質的に変化させずに前記細胞におけるＡＰＰ異化作用を調節するための組成物及び方法が望まれ、それが本発明の目的である。

上記した理由から、ＡＰＰからのＡβの産生を抑制または予防する能力について試験化合物をスクリーニングする方法及び系を提供することが望まれる。特に、そのような方法及び系が前記変換に関わる代謝経路に基づいていて、試験化合物が変換につながる代謝経路を中断または干渉し得るようなものが望ましい。特に、好適な候補薬物を同定すべく試験化合物を初期スクリーニングするのに特に適するように最初の方法は動物モデルよりもインビトロ系で使用されるべきである。

本発明は、β―セクレターゼ、特にヒトβ−セクレターゼに対する好適な基質である８量体ペプチドを提供する。前記基質を用いるβ−セクレターゼ活性を測定するためのインビトロアッセイも開示している。前記ペプチド基質は少なくとも１つのβ−セクレターゼ開裂部位を含むとして特徴づけられる。

１つの実施態様では、本発明のペプチド基質は免疫原として提示されているとき、本発明ペプチドのアミノ酸配列と実質的に相同なアミノ酸配列を有する天然ＡＰＰの領域に特異的に結合する抗体の産生を誘発する。別の実施態様では、前記抗体は本発明のペプチド基質に特異的に結合するが、天然ＡＰＰには特異的に結合しない。

本発明の別の態様では、基質のβ−セクレターゼによる開裂により生ずる表１及び／または表２にリストしたペプチドの１つのアミノ末端断片またはカルボキシ末端断片（或いは開裂産物）に対して特異的な抗体が提供される。前記抗体はポリクローナルでもモノクローナルでもよい。

別の態様では、本発明は表１及び／または表２にリストした８量体ペプチドの合成β−セクレターゼ開裂部位を認識する抗体を提供する。特に、天然ＡＰＰのβ−セクレターゼ開裂部位を認識しない抗体が提供される。

本発明の一つの態様は、本発明のβ−セクレターゼ基質をコードするヌクレオチド塩基配列を含む核酸に関する。好ましくは、前記核酸は発現ベクター中に含まれる。

本発明の別の態様は、本発明のβ−セクレターゼ基質をコードする核酸またはその断片を含む組み換え細胞に関する。

本発明の別の態様は、β−セクレターゼ活性のアッセイ方法に関する。β−セクレターゼ活性は可溶化形態または膜結合形態のβ−セクレターゼ産生細胞から得ることができる。前記方法は、β−セクレターゼ基質開裂により生ずる開裂産物を測定することにより実施され得る。測定は定量的または定性的に実施され得る。

よって、本発明の１態様は、（ａ）β−セクレターゼ基質、試験化合物、及びβ−セクレターゼ活性を含む調製物をβ−セクレターゼ活性を生じ得る反応条件下で混合するステップ及び（ｂ）β−セクレターゼ活性を測定するステップを含む、β−セクレターゼ活性に影響を及ぼす化合物の能力を測定する方法に関する。

前記方法の１例では、β−セクレターゼ及び初期量存在する本発明のペプチド基質を含む反応系を使用する。前記反応系はβ−セクレターゼによりペプチド基質を開裂産物に開裂させる条件下で維持する。β−セクレターゼ開裂反応はβ−セクレターゼ開裂産物の少なくとも１つの量を検出することによりモニターする。なお、前記開裂産物の量は反応が進行するにつれて経時的に増加する。前記方法はβ−セクレターゼ活性の阻害能力について試験化合物をスクリーニングするために特に有用である。試験化合物を反応系に導入し、β−セクレターゼ活性を阻害する試験化合物の能力を産生した開裂産物の量を減少させる能力に基づいて調べる。通常、反応系中のβ−セクレターゼ媒介開裂を試験化合物の非存在下で観察しかつ測定するコントロールと比較する。

本発明の方法により、本発明のペプチド基質のβ−セクレターゼによるタンパク質分解開裂を抑制する試験物質を同定することができる。前記方法は、β−セクレターゼが試験化合物の非存在下ではペプチド基質をアミノ末端断片及びカルボキシ末端断片に開裂すると予想されるような条件下で、β−セクレターゼ開裂部位を含む本発明ペプチドを試験化合物の存在下でβ−セクレターゼに接触させることを含む。こうして、前記開裂を抑制する試験化合物はβ−セクレターゼ阻害活性を有するとして同定される。通常、アミノ末端断片及び／またはカルボキシ末端断片の生成はアミノ末端断片のカルボキシ端部またはカルボキシ末端断片のアミノ端部に対して特異的な抗体を用いて検出される。アミノ末端及び／またはカルボキシ末端断片を検出するための別の方法には液体クロマトグラフィー／質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）が含まれる。

本発明は更に細胞におけるβ−アミロイド基質の開裂を抑制する方法を含む。前記方法は、β−セクレターゼ活性を少なくとも部分的に阻害するのに有効な量の化合物を細胞に投与することを含む。通常、前記化合物は上記したスクリーニングにより選択される。前記化合物はインビボで天然または組換えβ―セクレターゼのＡＰＰへの結合を抑制するときにも使用される。

本発明は更に、哺乳動物宿主におけるβ−アミロイド前駆体タンパク質の開裂の抑制方法を提供する。前記方法は、宿主細胞、通常宿主の脳細胞においてβ−セクレターゼ活性を阻害するのに有効な量の化合物を前記宿主に対して投与することを含む。前記化合物は通常本明細書に記載されているスクリーニングアッセイにより選択され得る。前記方法はアルツハイマー病、ダウン症候群等のようなＡβペプチド沈着に関連する状態を治療するのに有用である。

本発明の別の態様では、本明細書に記載されている方法により同定されたＡβ産生抑制剤はトランスジェニック動物モデルにおいて研究され得る。前記動物を試験化合物と接触させ、ＡＰＰの開裂産物の産生に（通常、減少させることにより）影響を及ぼす化合物はＡβ関連状態の治療のための薬物としてさらなる試験をするための候補物質であると見做される。

本発明のペプチド基質のβ−セクレターゼ開裂から生ずるアミノ末端断片を検出、モニターするための方法及び組成物を提供する。アミノ末端開裂産物と称される生じた断片のβＡＴＦ−ＰＳ（ペプチド基質のアミノ末端断片）は生物学的サンプル中で検出され得、動物モデルにおいて本発明の基質のプロセッシングをモニタリングするために有用である。特に、本発明は本発明のペプチド基質のインビボプロセッシングのモニタリングを提供し、このモニタリングではβＡＴＦ−ＰＳの存在が基質を発現させるように形質転換された動物由来の検体で検出され、Ｋａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ，３２５：７３３−７３６（１９８７）のナンバリングに基づいて６９５アミノ酸イソフォーム中のアミノ酸Ｎｏ．５９６と５９７の間で基質から開裂された。

本発明のペプチド基質をコードする遺伝子を発現する細胞がペプチド基質のアミノ−及びカルボキシ−末端断片である開裂産物の特に多産な産生者であることが見出された。すなわち、前記細胞は本発明の基質を内因性ＡＰＰ、野生型ヒトＡＰＰまたはスウェーデン変異ＡＰＰの開裂よりも高頻度で開裂し得る。更に、本発明の基質を細胞内プロセッシングするとＡＰＰ遺伝子の他のヒト突然変異により産生されるのより多くのβＡＴＦ−ＰＳがより多く産生される。よって、本発明のペプチド基質を発現するトランスジェニックマウスのようなトランスジェニック動物系は、本発明の基質の細胞内プロセッシングをモニターするため及びＡＰＰプロセッシングの明らかな病原形態のβ−セクレターゼ活性の結果としてのＡＰＰの開裂を抑制または調節する能力について試験化合物をスクリーニングするためのモデルとして特に適している。

本発明の他の特徴及び作用効果は複数の実施例を含めた本明細書の記載から明白である。提示されている実施例は本発明を実施するのに有用な各種成分及び方法を例示する。これらの実施例は本発明を限定するものではない。本明細書の記載に基づいて、当業者は本発明を実施するために有用な他の成分及び方法を同定、使用することができる。

請求の範囲及び明細書中、単数形の“ａ”、“ａｎ”及び“ｔｈｅ”は文脈が他を指示しない限り複数の意味を含む。例えば単数の宿主細胞への言及は複数の宿主細胞を含み、抗体への言及は１つ以上の抗体及び当業者に公知のその均等物を指す。

本発明はβ−セクレターゼ基質及び前記基質を用いるβ−セクレターゼ活性を検出するためのアッセイに関する。β−セクレターゼ基質はβ−セクレターゼ活性により開裂され得る。

β−セクレターゼ活性のアッセイは、例えばβ−セクレターゼ活性を調節し得る化合物をスクリーニングするため及びβ−セクレターゼ活性に影響を及ぼす特定化合物の能力を試験するために使用され得る。β−セクレターゼ活性を調節し得る化合物の例にはβ−セクレターゼ阻害剤が含まれる。阻害剤はいろいろな目的で、例えばアルツハイマー病の治療またはβ−セクレターゼの生物学的重要性のキャラクタリゼーションの際に使用され得る。

本発明では、それぞれが合成β−セクレターゼ開裂部位を含む合成８量体ペプチドが多数提供される。表２には、β−セクレターゼ、特にヒトβ−セクレターゼに対する基質である８量体ペプチド基質が２５６個リストされている。ペプチド基質配列をコードするポリヌクレオチド、及びインビボまたはインビトロで天然または組換えのβ−セクレターゼのタンパク質分解活性を阻害する化合物を同定するためのアッセイにおいて前記ペプチド基質配列を使用する方法も本発明の範囲内である。

特記しない限り、本発明で使用されているすべての技術的／科学的用語は本発明が属する業界の当業者が通常理解していると同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または同等の方法及び材料が本発明を実施または試験する際に使用され得るが、好ましい方法、デバイス及び材料をここに記載する。

本明細書に掲げた刊行物はすべて、本発明と関連して使用され得、前記刊行物に報告されている方法、ベクター等を記載乃至開示する目的で援用により本明細書に含まれるとする。刊行物はいずれも本発明の新規性を否定するものとして解釈されない。

以下の説明において、組換えＤＮＡ技術の分野で使用されている多数の用語が広く用いられている。用語の範囲を含めて本明細書及び請求の範囲をより明確に矛盾なく理解するために、用語は以下のように定義する。

ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質の修飾語として本明細書及び請求の範囲中で使用されている「単離」及び／または「精製」は、そう指定されたＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質がヒトの手でそのような形で作成され、よって天然のインビボ細胞環境から分離されることを意味する。このヒト介在の結果として、本発明の組換えＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質は、天然に存在するＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質とは違って、本明細書に記載されているように有用である。合成的手段、例えば本明細書に記載されている固相化学により作成され、存在する主要なペプチド種であるペプチドは「単離」または「精製」ペプチドである。

同様に、本明細書中、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質の修飾語としての「組換え体」は、そう指定されたＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質がヒトの努力により、例えばクローニング、組換え発現等により作成されたことを意味する。よって、本明細書中、組換えタンパク質は例えばヒトの努力により当該宿主に添加されたＤＮＡを発現する組換え宿主により産生されたタンパク質を指す。

本明細書中、「挿入」または「付加」は天然に存在する分子と比較してそれぞれ１つ以上のアミノ酸またはヌクレオチド残基の付加が生ずるようなアミノ酸またはヌクレオチド配列の変化を指す。

本明細書中、「置換」は１つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドのそれぞれ別のアミノ酸またはヌクレオチドによる置き換えを指す。

「疾患」は（１）本発明のペプチド、（２）本発明のペプチドの各々に対して特異的な抗体または（３）β−セクレターゼのタンパク質分解活性を阻害する化合物、を用いる治療によって恩恵を受ける任意の状態である。この中には、哺乳動物を問題の疾患にかかりやすくさせる病理的状態を含めた急性及び慢性の障害または疾患が含まれる。疾患にはアルツハイマー病が含まれる。

本明細書中で使用される「アンタゴニスト」または「阻害剤」は少なくとも１つのβ−セクレターゼ生物活性を下方調整する（例えば、抑制または阻害する）物質を指す。β−セクレターゼ阻害剤はβ−セクレターゼとその結合パートナー、例えば天然または変異ＡＰＰまたは本発明ペプチドとの相互作用を抑制または低下させる化合物または分子であり得る。β−セクレターゼがその基質を開裂させる速度を低下させる化合物はβ−セクレターゼ阻害剤である。

本明細書中で使用される「調節」は、例えば、ヒトβ−セクレターゼのタンパク質分解活性及び／または薬理学的活性のような、生物学的または機能的活性、を阻害する能力を指す。

「実質的に類似」は参照配列に対して少なくとも約８０％の配列類似性を指す。種々の実施態様において、配列類似性は少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または１００％である。配列類似性は当業界で公知の方法、例えば援用により本明細書に含まれるとするＡｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７）に記載されている方法により測定され得る。

本明細書中、「直接投与」はヒトβ−セクレターセのタンパク質分解活性を阻害する本発明ペプチドまたはその機能的誘導体に対して特異的な抗体の直接投与を指す。阻害効果を達成する化合物も含まれる。

「β−ＣＴＦドメイン」はγ−セクレターゼにより開裂され得且つβ−セクレターゼによるＡＰＰの開裂後産生されるＡＰＰのＣ末端断片（アミノ酸５９７−６９５）に近似しているポリペプチド、またはその機能的誘導体である。

本明細書中、「β−アミロイドペプチド（Ａβ）」は任意のβ−アミロイドペプチドを指す。前記ペプチドは通常約４ｋＤである。数種の異なるアミノ末端及び異種カルボキシ末端配列がアルツハイマー病組織及び培養細胞由来のＡβのキャラクタリゼーションに基づいて発見された（Ｇｌｅｎｎｅｒ及びＷｏｎｇ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１２０：８８５−８９０（１９８４）；Ｊｏａｃｈｉｍら，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，４７４：１００−１１１（１９８８）；Ｐｒｅｌｌｉら，Ｊ．Ｎｅｕｔｏｃｈｅｍ．，５１：６４８−６５１（１９８８）；Ｍｏｒｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：１７０８２−１７８０６（１９９２）；Ｓｅｕｂｅｒｔら，Ｎａｔｕｒｅ，３５９：３２５−３２７（１９９２）；Ｎａｓｌｕｎｄら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：８３７８−８３８２（１９９４）；Ｒｏｈｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：１０８３６−１０８４０（１９９３）；Ｂｕｓｃｉｇｌｉｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２０９２−２０９６（１９９３）；Ｈａａｓｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３５９：３２２−３２５（１９９２））。カルボキシ末端に関して、Ａβは、Ｎｏ．１が配列番号２５７のＡβ配列のアスパルテートとしてＮｏ．３９、４０、４１、４２、４３または４４を末端とすることが判明している。ＡβはＡＰＰのＡβ領域のアミノ末端及びカルボキシ末端の両方での開裂を含めたＡＰＰのプロセッシングにより産生される。

本明細書中、「β−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）」はヒトの染色体２１の長い腕上に局在化している同一名前の遺伝子によりコードされ且つカルボキシサード内にＡβ領域を含むタンパク質を指す。ＡＰＰは多くの哺乳動物組織の広範囲の細胞において発現されるグリコシル化単一膜貫通タンパク質である。ヒトに存在するとして現在公知のＡＰＰの特定イソタイプの例はＫａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ，３２５：７３３−７３６（１９８７）に記載されている６９５アミノ酸ポリペプチド、Ｐｏｎｔｅら，Ｎａｔｕｒｅ，３３１：５２５−５２７（１９８８）及びＴａｎｚｉら，Ｎａｔｕｒｅ，３３１：５２８−５３０（１９８８）に記載されている７５１アミノ酸ポリペプチド、並びにＫｉｔａｇｕｃｈｉら，Ｎａｔｕｒｅ，３３１：５３０−５３２（１９８８）に記載されているＡＰＰの７７０アミノ酸イソタイプである。ＡＰＰの多数の特定変異体も位置及び表現型が異なり得る点突然変異を有すると記載されている。そのような突然変異の総説はＨａｒｄｙ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．，１：２３３−２３４（１９９２）に記載されている。特に興味深い突然変異は、６９５フォームのＮｏ．５９５及び５９６の正常Ｌｙｓ−Ｍｅｔ残基がＡｓｎ−Ｌｅｕで置換されていて、“スウェーデン”変異と称されている。この変異はＡＰＰの正常β−セクレターゼ開裂部位のすぐ上流に位置し、６９５フォームの残基５９６と５９７の間で起こる。配列番号２５７はβ−セクレターゼ開裂部位の領域でのスウェーデン変異体のアミノ酸配列を示す。

本明細書中、「ヒトβ−セクレターゼ」及び「β−セクレターゼ」は天然β−セクレターゼに伴う特性と同じ特性、すなわちＡＰＰを開裂し、アルツハイマー病患者で見られるアミロイドプラークの主成分であるＡβペプチドのアミノ末端を生じ得る能力を発揮するタンパク質／酵素を指す。

本明細書において、「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」はアミノ酸残基のポリマーを指すべく同義的に使用される。この用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学的アナログであるアミノ酸ポリマー及び天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用される。

「組換えタンパク質」は組換えＤＮＡ分子由来のタンパク質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の発現により産生されるタンパク質を指す。

「その機能的誘導体」はβ−セクレターゼにより開裂され得るほどに本発明ペプチドのアミノ酸配列に対して十分な配列類似性を有する。機能的誘導体を作成し得る本発明のペプチド基質に対する修飾の例には付加、欠失及び置換が含まれる。特定修飾の影響は、β−セクレターゼによりβ−セクレターゼ基質を開裂させる本明細書に記載の反応条件を用いて測定され得る。活性を実質的に低下させない修飾が好ましい。

活性を実質的に低下させない基質の置換は、まず天然に存在するアミノ酸Ｒ基の違いを考慮して設計され得る。Ｒ基は物理的サイズ、電荷及び疎水性のようなアミノ酸の各種特性に影響を及ぼす。アミノ酸は以下のように各種グループに分類され得る：中性／疎水性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン及びメチオニン）；中性／極性（グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン及びグルタミン）；塩基性（リジン、アルギニン及びヒスチジン）；及び酸性（アスパラギン酸及びグルタミン酸）。

通常、各種アミノ酸を置換する際、同様の特性を有するアミノ酸を交換することが好ましい。特定グループ内の別のアミノ酸の置換、例えばロイシンをバリン、リジンをアルギニン、グルタミンをアスパラギンで置換してもペプチド機能は変化しないであろう。

異なるアミノ酸グループ間を変化させてもよい。好ましくは、そのような変化はペプチド中の置換しようとするアミノ酸の位置を考慮してなされる。例えば、ポリペプチド内部の非極性アミノ酸はグルタミン酸よりもアルギニンでより自由に置換され得る。なぜならば、アルギニンがより長い脂肪族側鎖を有しているからである（Ａｕｓｕｂｅｌ，「分子生物学における現在の命題（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８，別冊３３，補遺１Ｃ）。

２つの配列が比較窓の範囲で最大の対応性についてアライン（整列）させたときこれらの配列が同一ならば、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列は参照配列に対して「同一」である。比較窓をアラインさせるためのヌクレオチド及びアミノ酸配列の最適アラインメントは、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２（１９８１）の局部相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４−２４４８（１９８８）の類似性方法の検索により、前記アルゴリズムのコンビューター化実装（ウィスコンシン州マジソンに所在のＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐのウィスコンシン・ジェネティックス・ソフトウェア・パッケージ・リリース（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｔｅｒ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ）７．０中のＧＡＰ，ＢＥＳＦＩＴ，ＦＡＳＴＡおよびＴＡＦＡＳＴＡ）により、または視検により、実施され得る。

β−セクレターゼ基質に関して「本質的に構成される」は、β−セクレターゼ基質が開裂させられる能力を参照配列と比較して実質的に低下させることなくＮ末端及び／またはＣ末端付加たは欠失により参照配列が修飾され得ることを指す。欠失の例はＮ末端メチオニンの除去である。

β−セクレターゼ基質が開裂させられる能力の実質的低下は、適当な緩衝液及び適当な試薬とインキュベートした対照基質を用いて観察される活性と比較して１／１０以下の低下である。

本明細書中、「試験化合物」は物質、分子、化合物、分子または化合物の混合物、またはインビボまたはインビトロでβ−セクレターゼ活性を阻害し得ると疑われる任意の他の組成物であり得る。試験化合物は生物学的ポリマーのような巨大分子であり得、この中にはタンパク質、ポリサッカライド、核酸等が含まれる。通常、試験化合物は約２ｋＤ以下、より一般的には１．５ｋＤ以下、多くの場合１ｋＤ以下、より一般的には１００〜１，０００Ｄ、更により一般的には２００〜７５０Ｄの範囲の分子量を有する小分子である。前記試験化合物は各種基準に基づいて予め選択され得る。例えば、好適な試験化合物は公知のタンパク質分解阻害活性を有するものとして選択され得る。或いは、試験化合物はランダムに選択され、本発明のスクリーニング方法により試験され得る。インビトロで本発明のペプチド基質のβ−セクレターゼ開裂を抑制し得る試験化合物は、細胞及び／または動物におけるＡβ産生を低下させる能力を更にスクリーニングするための候補物質として見做される。

「抗体」はアナライト（抗原）に特異的に結合し、認識する免疫グロブリン遺伝子またはその断片により実質的にコードされるポリペプチドを指す。認識される免疫グロブリン遺伝子にはκ、λ、α、γ、δ、ε及びμ定常領域遺伝子並びに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。抗体は、例えば無傷の免疫グロブリンとして、または各種ペプチダーゼで消化させることにより産生される多数の十分に特徴づけられている断片として存在する。これらには、例えばＦａｂ’及びＦ（ａｂ）’_２断片が含まれる。「抗体」には全抗体の修飾により産生される抗体断片または組換えＤＮＡ方法を用いて新規合成される抗体断片も含まれ、更に慣用の方法により作成した「ヒト化」抗体も含まれる。

「イムノアッセイ」はアナライトに特異的に結合する抗体を用いるアッセイである。イムノアッセイは、アナライトを単離、標的及び／または定量するために特定抗体の特定の結合特性を用いて特徴づけられる。

抗体がタンパク質及び他の生物物質の異種集団の存在下でタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの存在を決定する結合反応において機能するとき、前記抗体は前記したタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに対して「特異的に結合する」またはこれらと「特異的に免疫反応する」。よって、指定のイムノアッセイ条件下で、特定の抗体は特定のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに優先的に結合するが、サンプル中に存在する他のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに対しては殆ど結合しない。前記条件下でのタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドへの特異的結合には、特定のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに対する特異性について選択した抗体が必要である。特定のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドと特異的に免疫反応する抗体を選択するために各種イムノアッセイフォーマットを使用することができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイがタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドと特異的に免疫反応するモノクローナル抗体を選択するために日常的に使用されている。特異的免疫反応性を測定するために使用され得るイムノアッセイフォーマット及び条件の説明についてはＨａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，「抗体 実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」，ニューヨークに所在のＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９８８年）発行を参照されたい。

本発明ペプチドに対する抗体（その結合断片及び単鎖組換え体バージョンを含む）は、動物を例えば上記した担体タンパク質とペプチドのコンジュゲートを用いて免疫化することにより産生される。本発明ペプチドに対する抗体は天然または変異ＡＰＰに結合し得ると理解されたい。しかしながら、本発明ペプチドに対して作成され、天然または変異ＡＰＰに結合しないが本発明ペプチドに結合する抗体が特に興味深い。

本発明のペプチド基質は通常の方法を用いてポリクローナル及び／またはモノクローナル抗体を作成するために使用され得る。場合により担体分子に結合させた本発明ペプチドは、以下に詳記するように小さい脊椎動物に注入され、モノクローナル抗体は公知の方法により作成される。こうして作成した抗体は生物学的及び他のサンプル中の本発明ペプチドを検出するための慣用のイムノアッセイを実施するために有用であろう。本発明の抗体は少なくとも１０^６Ｍ^−１という高アフィニティーで本発明ペプチドに結合する。同様に、本発明ペプチドをβ−セクレターゼにより開裂した結果生ずる開裂産物もこれに特異的な抗体を作成するための免疫原として使用され得る。

組換え体の本発明ペプチドまたはその合成バージョンは抗体を産生し得る動物に注入され得る。モノクローナル抗体もポリクローナル抗体もその後ペプチドの存在及び量を測定するためにイムノアッセイで使用するために作成され得る。

ポリクローナル抗体の作成方法は当業者に公知である。簡単に説明すると、免疫原をアジュバンドと混合し、その混合物を用いて動物を免疫化する。免疫原としては本発明ペプチド、適当な担体（例えば、ＧＳＴ、キーホールリンペットヘモシアニン等）に結合させた本発明ペプチド、または組換えワクシニアウイルスのような免疫化ベクターに取り込んだ（例えば、米国特許第４，７２２，８４８号明細書参照）本発明ペプチドが好ましい。免疫原調製物に対する動物の免疫応答は採血し、当該ペプチドに対する反応性の力価を測定することによりモニターされる。免疫原に対して高い力価の抗体が得られたら、血液を動物から採取し、抗血清を得る。所望により、ペプチドに対して反応する抗体を富化するために抗血清を分画する。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ．「免疫学における現在の命題（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」，ニューヨークに所在のＷｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎ（１９９１年）発行；Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，「抗体：実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」，ニューヨークに所在のＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８８年）発行を参照されたい。

モノクローナル抗体は所望抗体を分泌する細胞から作成され得る。マウス、げっ歯動物、霊長類、ヒト等のような特殊な哺乳動物宿主からモノクローナル抗体を作成することが望ましいこともある。モノクローナル抗体を作成するための方法は、例えばＳｔｉｔｅｓら編，「基本的及び臨床的免疫学（Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」，第４版，カリフォルニア州ロスアルトスに所在のＬａｎｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ発行及びここに引用されている参考文献；上掲したＨａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ；Ｇｏｄｉｎｇ，「モノクローナル抗体：原理及び実地（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」，第２版，ニューヨーク州ニューヨークに所在のＡｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８６年）発行；及びＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７（１９７５）に記載されている。この方法は動物に免疫原を注射することで進行する。次いで、動物を殺し、その脾臓から細胞を採取し、この細胞をミエローマ細胞と融合させる。その結果、インビトロで再生し得るハイブリッド細胞、即ち「ハイブリドーマ」が生ずる。次いで、ハイブリドーマの集団をスクリーニングにかけて、それぞれが免疫原に対する１つの抗体種を分泌するクローンを単離する。このようにして、得られた抗体種は、免疫原物質上の認識される特定部位に応じて作成される免疫動物由来の不死化しクローン化した単一Ｂ細胞の産物である。

別の不死化方法には、エプスタイン・バーウイルス、発ガン遺伝子またはレトロウイルスを用いる形質転換、或いは当業界で公知の他の方法が含まれる。１回不死化細胞から生ずるコロニーを抗原に対して所望の特異性及びアフィニティーを有する抗体の産生についてスクリーニングし、前記細胞から産生されるモノクローナル抗体の収率は脊椎動物（好ましくは、哺乳動物）宿主の腹膜腔への注射を含めた各種方法により高められる。本発明の抗体は場合により修飾して使用され、その中にはヒト化マウス抗体のようなキメラ抗体が含まれる。

他の好適な方法にはファージまたは類似ベクター中の組換え抗体のライブラリーの選択が含まれる。Ｈｕｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−１２８１（１９８９）；及びＷａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ，３４１：５４４−５４６（１９８９）参照。

多くの場合、ペプチド及び抗体は検出可能なシグナルを与える物質を共有結合的または非共有結合的に結合させることにより標識され得る。多種多様の標識及びコンジュゲーション方法が公知であり、科学文献及び特許文献に広く記載されている。好適な標識には放射性核種、酵素、基質、コファクター、阻害剤、蛍光部分、化学発光部分、磁気粒子等が含まれる。前記標識の使用を教示している特許には、米国特許第３，８１７，８３７号明細書、同第３，８５０，７５２号明細書、同第３，９３９，３５０号明細書、同第３，９９６，３４５号明細書、同第４，２７７，４３７号明細書、同第４，２７２，１４９号明細書及び同第４，３６６，２４１号明細書が含まれる。また、組換え免疫グロブリンも作成され得る。Ｃａｂｉｌｌｙの米国特許第４，８１６，５６７号明細書及びＱｕｅｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１００２９−１００３３（１９８６）を参照されたい。

「標識」は分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段または化学的手段により検出可能な組成物である。例えば、有用な標識には^３２Ｐ、蛍光染料、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて通常使用されているようなもの）、ビオチン、ジオキシゲニン、或いは抗血清またはモノクローナル抗体が利用可能なハプテン及びタンパク質が含まれる。標識はしばしば測定可能なシグナル、例えば放射能、蛍光または酵素活性を発生し、これを用いて結合標識の量を定量することができる。

標識は直接または（立体障害を減らすために）様々な長さを有するスペーサー腕を介して結合され得る。本発明の目的では広範囲の標識試薬を使用することができる。例えば、１つ以上の標識ヌクレオシド、トリホスフェート、プライマー、リンカーまたはプローブを使用することができる。免疫蛍光分析法は、援用により本明細書に含まれるとするＭａｒｃｈａｌｏｎｉｓら編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．（１９８２年）発行，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｓ ａ Ｔｏｏｌ中ｐ．１８９−２３１のＤｅＬｕｃａの「免疫蛍光分析（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ）」に説明されている。

標識は、標識分子に特異的に結合し得る「タグ」とも称される。例えば、タグとしてビオチンを使用することができ、このとき該タグに結合させるためにアビジニル化またはストレプトアビジニル化ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を使用し、その後色素原物質（例えば、テトラメチルベンザミン）を用いてＨＲＰの存在を検出することができる。同様に、タグはエピトープまたは抗原（例えば、ジゴキシゲニン）であり得、該タグに結合させるために酵素的、蛍光的または放射線標識した抗体が使用され得る。

本発明の抗体は本発明ペプチドを単離する際にアフィニティークロマトグラフィーにも使用される。固体支持体、例えばアガロース、セファデックス等のような粒子に結合させた抗体を用いてカラムを作成する。このカラム中に本発明ペプチドまたは天然ＡＰＰを含有すると疑われるサンプルを流し、洗浄し、高濃度の低刺激変性剤で処理すると、本発明ペプチドまたは前記ＡＰＰタンパク質は遊離される。

前記抗体は哺乳動物ＡＰＰのような特定発現産物の発現ライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。前記産物をβ−セクレターゼに結合させることが好ましい。通常、前記方法において抗体を抗体結合により抗原の存在を容易に検出できる部分で標識する。

或いは、組換え手段により非ヒト抗体のＣＤＲ領域をヒト定常領域に結合することによりヒト化免疫グロブリンを作成する。前記したヒト化免疫グロブリンは実質的にヒト免疫グロブリン（受容体免疫グロブリンと称される）由来の可変領域フレームワーク残基及び実質的にマウス免疫グロブリン（供与体免疫グロブリンと称される）由来の相補性決定領域を有する。存在する場合、定常領域は実質的にヒト免疫グロブリンにも由来する。ヒト可変領域は通常、ＣＤＲの由来元であるマウス可変領域ドメインと高い配列同一性を示すフレームワーク配列を有するヒト抗体から選択される。重鎖及び軽鎖可変領域フレームワーク残基は同一または異なるヒト抗体配列から誘導され得る。ヒト抗体配列は天然に存在するヒト抗体の配列でも各種ヒト抗体のコンセンサス配列でもよい。国際特許出願公開第ＷＯ９２／２２６５３号パンフレット参照。ヒト可変領域フレームワーク残基由来のあるアミノ酸はＣＤＲコンフォメーションへの潜在的影響及び／または抗原への結合に基づいて置換のために選択される。前記した潜在的影響はモデリング、特定位置でのアミノ酸の特性の試験または特定アミノ酸の置換または突然変異の影響の実験による観察により調査される。

置換のための他の候補物質は、その位置でヒト免疫グロブリンでは一般的でない受容体ヒトフレームワークアミノ酸である。これらのアミノ酸は抗体の同等位置またはより一般的なヒト免疫グロブリンの同等位置のアミノ酸で置換され得る。

或いは、ヒトモノクローナル抗体またはその結合断片をコードするＤＮＡ配列を単離する別の方法はＨｕｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−１２８１（１９８９）に概説されている一般的プロトコルに従ってヒトＢ細胞からのＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、その後所望特異性を有する抗体（または、結合断片）をコードする配列をクローン化、増幅させることを含む。Ｈｕｓｅに記載されているプロトコルはファージディスプレイ法と組み合わせることにより効率的となる。例えば、国際特許出願公開第ＷＯ９１／１７２７１号パンフレット及び同第ＷＯ９２／０１０４７号パンフレット参照。ファージディスプレイ法は、既にβ−セクレターゼタンパク質受容体またはそのリガンドに対するアフィニティーを有することが判明している抗体のＣＤＲ領域に変異を誘発するためにも使用され得る。高い結合アフィニティーを有する抗体を選択する。

本発明の態様は、β−セクレターゼとその天然基質との相互作用を減らすまたはなくす化合物の同定方法を提供する。本発明ペプチドは競合的結合アッセイにおいて使用され得る。前記アッセイはいずれの化合物がヒトβ−セクレターゼの基質への結合を抑制し得るかを調べるために多数の化合物を迅速にスクリーニングできる。その後に、化合物がヒトβ−セクレターゼ開裂活性の阻害剤として作用するかどうかを調べるために、結合することが分かっている化合物を用いてより詳細なアッセイを実施し得る。

当業者が理解しているように、β−セクレターゼのタンパク質分解活性を調節する化合物を同定するためのアッセイ方法は通常対照との比較を必要とする。１つのタイプの対照は、化合物に接触させた試験細胞または試験培養物と実質的に同様に処理したが、化合物とは接触させなかった細胞または培養物である。

また、対照系は本発明のペプチド基質をヒトβ−セクレターゼにより効果的に開裂されないように改質したペプチド基質を含み得る。

別のタイプの対照細胞または培養物は、本発明ペプチドを発現させない以外はトランスフェクト細胞と同一である細胞または培養物であり得る。従って、トランスフェクト細胞の化合物に対する応答を同一条件下で同一化合物に対する対照細胞または培養物の応答（または、応答なし）と比較する。

「治療」は、治療及び予防的乃至防御的手段を指す。治療を要するものには既に病気にかかっている者、病気にかかりやすい者及び病気を予防したい者が含まれる。

「スクリーニング」は複数の物質（例えば、試験化合物）をある性質の存在または不在について調べることを意味する。スクリーニングはβ−セクレターゼの阻害レベルまたはβ−セクレターゼとその基質間の相互作用レベルを含めた各種性質を測定または検出することを含み得る。

「治療有効量」は、患者の病気または状態の１つ以上の症状をある程度緩解する（例えば、アミロイドプラークの形成または更なる沈着を予防する）、または病気または状態に関連するかまたはこの原因である１つ以上の生理学的または生化学的パラメーターを部分的または完全に正常に戻す医薬組成物の量を意味する。

本発明の別の実施態様は、患者において天然ＡＰＰの開裂を抑制し得、よって前記患者における多量のアミロイドプラーク沈着を予防し得る治療用化合物の有効量を患者に投与することを含むアルツハイマー病の治療方法を提供する。

本発明では、本発明ペプチドのいずれか１つをコードするヌクレオチドの配列を含む核酸分子を提供する。本発明ペプチドの１つ以上をコードするＤＮＡ配列は、核酸を当業者に公知の各種タンパク質発現系に取り込んだとき本発明ペプチドを組換え産生するために使用され得る。

「核酸」は、１本鎖または２本鎖形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指し、特記しない限り天然に存在するヌクレオチドと同様に機能し得る天然ヌクレオチドの公知のアナログも包含する。核酸分子がＤＮＡ配列を有すると言われるとき、該核酸分子は“Ｔ”を“Ｕ”で置換した対応のＲＮＡ配列を有するＲＮＡ分子をも含む。

「組換え宿主細胞」は、外来ソースから導入したＤＮＡを有する細胞を指す。よって、例えば組換え宿主細胞は天然（非組換え）形の細胞中には見られない遺伝子を発現し得るか、または細胞中に通常存在するが別の方法で、例えば別の発現調節配列に連結して細胞に導入した遺伝子を発現し得る。

クローン化ＤＮＡの好適な発現ベクターへの取り込み、プラスミドベクターまたはそれぞれが１つ以上の異なる遺伝子をコードするプラスミドベクターの組合せ、または線状ＤＮＡを用いる真核細胞のトランスフェクション及びトランスフェクトした細胞の選択は当業界で公知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）発行参照）。本発明の核酸構築物を含む発現ベクターを宿主細胞に導入（形質導入）して形質導入した組換え細胞（すなわち、組換え異種核酸を含む細胞）を産生するための好適な手段は当業界で公知である（例えば、いずれも援用により本明細書に含まれるとするＦｒｉｅｄｍａｎｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１２７５−１２８１（１９８９）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０：９２６−９３２（１９９３）参照）。

よって、本発明の実施態様は本発明ペプチドを組換え発現する形質転換宿主細胞を提供する。

本明細書中、細胞が通常は産生しないかまたは細胞が通常低レベルでしか産生しないタンパク質を産生するように細胞が遺伝子操作により作成されたとき、細胞は「所望ペプチドを発現するように改変されている」と言われる。当業者はゲノム、ｃＤＮＡまたは合成配列を真核または原核細胞に導入し、発現する方法を容易に採用することができる。

本発明により、表１及び表２にリストされている単離、精製及び／または実質的に純粋なペプチド基質（本発明ペプチド）が提供される。本発明ペプチドの機能的に同等な誘導体も本発明の一部として含まれる。前記誘導体はアミノ酸配列中に若干の置換を有するが、にもかかわらず該誘導体の誘導元である未変性の本発明ペプチドと同じく有効であるものである。よって、機能的に同等なペプチドはβ−セクレターゼに対する基質として作用する能力を有する。

「本発明ペプチド」、「本発明のペプチド基質」、「ペプチド基質配列」または「ペプチド基質」は、配列番号１〜２５６、２５８〜２６３及び２６４からなる群から選択される配列を有する少なくとも８アミノ酸の隣接配列断片及び合成β−セクレターゼ開裂部位を含む非天然ペプチドを指すために同義的に使用される。その断片およびホモログも本発明に包含されると解される。

本発明のペプチド基質は、β−セクレターゼ開裂のための好適な基質であり且つスウェーデン変異ＡＰＰ（配列番号２５７）の対応領域から誘導されるペプチドよりも実質的に速い速度で加水分解されるアミノ酸の配列を含むとして特徴づけられる。幾つかの基質はスウェーデン変異ＡＰＰよりも３３倍速く開裂される。１つの基質ＥＶＮＦＥＶＥＦ（配列番号２６２）はスウェーデン変異ＡＰＰよりも６０倍速く開裂される。
活性な本発明のペプチド基質アナログ／断片には、アミノ酸が置換、付加または欠失されている点で表１または表２のものとは異なるアミノ酸配列を有するペプチドアナログ（例えば、活性断片）が含まれる。活性断片は生じたアナログの活性を実験で調べることにより同定され得る。

置換を有する活性アナログは選択アミノ酸置換をペプチドに導入することにより作成され得る。活性を維持または強化した置換は本発明の範囲内であるが、通常置換は本明細書に規定されるように「保存的」である。置換の数は実施者の裁量であるが、生じたペプチドのアミノ酸配列は活性ペプチドの定義に適合しなければならない。保存的アミノ酸置換は類似側鎖を有する残基の潜在的互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸のグループはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンであり、脂肪族ヒドロキシ側鎖を有するアミノ酸のグループにはセリン及びトレオニンが含まれ、酸性側鎖を有するアミノ酸のグループにはアスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、塩基性側鎖を有するアミノ酸のグループにはリジン、アルギニン及びヒスチジンが含まれ、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸のグループにはシステイン及びメチオニンが含まれる。好ましい保存的アミノ酸置換グループはバリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンである。

本発明ペプチド、その生物学的活性断片及び機能的同等物は化学合成により作成され得る。例えば、合成ペプチドはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．モデル４３０Ａまたは４３１Ａ自動ペプチド合成装置（カリフォルニア州フォスターシティー）を用い、製造業者が提供する化学材料を使用して製造され得る。

本発明ペプチドは、該ペプチドが別のタンパク質の全部または一部に結合している融合ポリペプチドの形態をも採り得る。融合物は、異種タンパク質（例えば、リポーターポリペプチド、結合ポリペプチド等）を用いて作成され得る。融合ポリペプチドは組換えにより、または当業界で公知の合成方法により形成され得る。

本発明ペプチドは公知の方法（例えば、リン酸化、スルホン化、ビオチニル化または他の部分の付加）により化学的に修飾されたアミノ酸残基をも有し得る。幾つかの実施態様では、修飾は試薬、精製標的、アフィニテイーリガンド標的等を標識するために有用である。

本明細書中、ヒトβ−セクレターゼの基質活性はβ−セクレターゼに特徴的な活性を指す。前記活性は通常１つ以上のインビトロ方法を用いて測定することができ、多くの場合セクレターゼ酵素のインビボ活性に対応している。前記活性は当業者に公知の方法、例えば開裂産物（例えば、本発明のペプチド基質のＮまたはＣ末端断片）の遊離を測定するアッセイにより測定することができる。

ヒトβ−セクレターゼにより開裂される利用可能な本発明のペプチド基質のリストについては表２を参照されたい。本明細書に記載されている配列に基づいて、別の基質も公知の方法により同定、設計することができる。

本発明は更に、表２に例示されているようなペプチド基質のβ−セクレターゼ媒介開裂を検出するためのアッセイを提供する。前記方法は（ｉ）β−セクレターゼ成分及び（ｉｉ）基質成分、好ましくは本発明ペプチドを含む反応系を利用し、β−セクレターゼは基質を経時的に開裂して開裂産物を生成する。よって、β−セクレターゼ活性は開裂産物の量の増加として経時的に観察、モニターされ得る。反応系中の開裂産物の量は免疫学的方法、クロマトグラフィー、電気泳動等を含めた各種方法を用いて測定され得る。

β−セクレターゼ開裂の検出方法は、ＡＰＰのβ−セクレターゼ媒介開裂を抑制する能力を調べるために試験化合物をスクリーニングするために特に有用である。その場合、本発明ペプチドを用いて本明細書に記載の方法により試験化合物をまず同定する。本発明ペプチドのβ−セクレターゼ媒介開裂を抑制できる試験化合物を、ＡＰＰのβ−セクレターゼ媒介開裂を抑制する能力について更に試験する。基質成分がＡＰＰである反応系に試験化合物を添加し、開裂産物の生成に対する試験化合物の影響を観察する。ＡＰＰからの開裂産物の生成を抑制する化合物は多くのＡβ生成を伴う症状（例えば、アルツハイマー病）を治療するための治療薬として有用であると見做される。

反応系は通常β−セクレターゼを含み、このβ−セクレターゼは細胞ソースから入手した精製もしくは部分精製天然β−セクレターゼである。細胞ソースは、β−セクレターゼをコードする発現ベクターをトランスフェクトしたためにβ−セクレターゼを発現する組換え宿主細胞であり得る。或いは、β−セクレターゼはβ−セクレターゼを元々（すなわち、非組換えにより）発現する細胞ソースから入手可能である。非組換え体ソースは天然β−セクレターゼの発現レベルが十分に高い細胞株であり得る。本発明のペプチド基質は、表２に例示するペプチドの１つを含み得る。ペプチド基質は組換え体であっても合成により誘導されたものでもよい。反応系は、β−セクレターゼ開裂産物の産生または基質の消失を経時的に観察できる各種の固相検出系を使用してもよい。前記方法は、β−セクレターゼ媒介開裂を抑制する試験化合物の能力を測定するのに特に有用である。

前記アッセイは、試験化合物の存在下で少なくとも１つの部分精製β−セクレターゼを少なくとも１つの本発明のペプチド基質と混合することにより実施され得る。β−セクレターゼによる本発明のペプチド基質のアミノ末端断片及びカルボキシ末端断片への開裂を抑制する物質の非存在下で前記開裂が生ずる条件を維持する。試験化合物の存在下でのペプチド基質の開裂を試験化合物の非存在下での開裂と比較し、開裂活性の有意な阻害（通常少なくとも約２５％の阻害、より一般的には少なくとも約５０％の阻害、好ましくは少なくとも約７５％の阻害、多くの場合少なくとも９０％またはそれ以上の阻害）を示す化合物はβ−セクレターゼ阻害剤と見做される。その後、細胞及び動物モデルにおいてＡβの産生を抑制するかを調べるためにβ−セクレターゼ阻害剤をインビトロ及び／またはインビボで更に試験してもよい。また、こうして生じた開裂産物は精製され、「アミノ末端」及び「カルボキシ末端」断片の各々に対して特異的な抗体を与えるための免疫原として使用され得る。これらの断片はまた他のアッセイにおいて前記断片を同定するためにも使用され得る。

β−セクレターゼ及び本発明のペプチド基質のスクリーニングアッセイは通常開裂により産生されるアミノ末端またはカルボキシ末端断片を固相上に捕捉するサンドイッチアッセイを用いて実施される。次いで、捕捉した断片はβ−セクレターゼ開裂により露出した断片の端部に対して特異的な抗体を用いて検出され得る。抗体の例は、β−セクレターゼ活性の結果として生じる開裂産物に対する抗体である。抗体の開裂産物に対する結合は直接（共有結合的）または中間連結物質（例えば、ビオチン及びアビジン）を介して間接的に抗体に結合する慣用の標識系、例えばホースラディシュペルオキシダーゼまたは他の検出可能な標識を用いて検出され得る。

上記のように選択した化合物は、インビトロアッセイにおいて天然または組換えＡＰＰのβ−セクレターゼによる開裂を抑制するためにも使用され得る。インビトロ系により選択される化合物は下記するように使用され得る。

医薬組成物及び治療方法
本発明は更に、細胞におけるＡＰＰのＡＰＰ開裂産物へのβ−セクレターゼ媒介開裂の抑制方法を提供し、その方法は本明細書に記載されている方法により選択した化合物を細胞に添加することを含む。Ａβを産生するＡＰＰ開裂を抑制するために前記化合物を細胞培養物に添加してもよい。病原性Ａβの産生及びアルツハイマー病や他のＡβ関連状態に関連するアミロイドβ−プラークの沈着を生ずるβ−セクレターゼ媒介ＡＰＰ開裂を抑制するために前記化合物を患者に投与してもよい。

本発明は更に、本明細書に記載されている方法により選択した化合物と共に医薬的に許容され得る担体を含む医薬組成物を提供する。前記医薬組成物は、本発明の方法により同定した化合物の少なくとも１つを治療または予防有効量含んでいなければならない。医薬的に許容され得る担体は、化合物を所期宿主にデリバリーするのに適した相容性で非毒性の物質であり得る。滅菌水、アルコール、脂肪、ワックス及び不活性固体を担体として使用し得る。医薬的に許容され得るアジュバント、緩衝剤、分散剤等も医薬組成物中に配合し得る。活性物質を含む医薬組成物の製造は医学文献及び科学文献に詳しく記載されている。例えば、援用により本明細書に含まれるとするＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，ペンシルバニア州イーストンに所在のＭａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８２年）発行を参照されたい。

多くの場合、医薬組成物を脳に対して直接または間接的に導入することが望ましいか必要であろう。直接導入技術には、通常血液−脳関門をバイパスするために宿主の脳室系にドラッグデリバリーカテーテルを配置することを含む。間接技術が通常好ましいが、この技術は親水性薬物を脂溶性薬物に変換することにより薬物潜在化を与えるように組成物を処方することを含む。潜在化は通常薬物をより脂溶性とし、血液−脳関門を越えて輸送されるように薬物上に存在するヒドロキシ、カルボキシ及び第１級アミン基をブロックすることにより達成される。或いは、親水性薬物のデリバリーは血液−脳関門を一時的に開放し得る高張性溶液を動脈内に注入することにより高められ得る。

医薬用担体中の化合物の濃度は広範囲で変更可能であり、すなわち医薬組成物の約０．１重量％未満〜約２０重量％以上である。筋肉注射用の典型的な医薬組成物は、例えば１〜４ｍｌの滅菌緩衝水及び１μｇ〜１ｍｇの本発明の方法により同定された化合物を含むように構成される。静注用の典型的な組成物は、１００〜５００ｍｌの滅菌リンガー液及び約１〜１００ｍｇの化合物を含むように構成され得る。

本発明の医薬組成物はＡβの沈着に関連する病気、例えばアルツハイマー病、ダウン症候群及び進行した脳の老化を予防及び／または治療するために投与され得る。治療用途では、医薬組成物をすでに病気に罹っている治療を要する患者に投与される。医薬組成物はＡβプラークの更なる沈着を抑制するのに十分な量投与する。これを達成するために十分な量が「治療有効量」である。治療有効量は病気の程度、宿主の大きさ等に依存するが、通常宿主の体重１ｋｇあたり約１μｇ〜１００ｍｇの化合物であり、１０μｇ〜１ｍｇ／ｋｇの用量がより一般的に使用される。

予防用途のために、本発明の医薬組成物はＡβ関連疾患にまだ罹っていないがその病気に罹りやすい宿主に対して投与される。前記宿主は医学文献（例えば、Ｇｏａｔｅ，Ｎａｔｕｒｅ，３４９：７０４−７０６（１９９１））に記載されているように遺伝子スクリーニング及び臨床分析により同定され得る。前記医薬組成物は症状的に初期の段階でＡβプラークの沈着を抑制または予防し得、好ましくはβ−アミロイド疾患の初期段階をも予防する。前記の予防治療のために必要な化合物の量（予防有効量と称される）は通常治療について上記した量と同じである。

β−セクレターゼ基質
本発明のβ−セクレターゼ基質はそこに特定アミノ酸置換を含めたスウェーデン突然変異からの対応配列に類似している。本発明ペプチドに対応するスウェーデン突然変異の配列を配列番号２５７に示す。スウェーデン突然変異は、ＡＰＰの野生型６９５イソフォーム中に存在するＬＹＳ_５９５−ＭＥＴ_５９６をＡＳＮ_５９５−ＬＥＵ_５９６で二重置換することにより生ずる。

本発明ペプチドは、β−セクレターゼ開裂部位を含むだけでなく、配列番号２５７のスウェーデン変異体配列よりも速く加水分解されるとして特徴づけられる。本発明ペプチドはそれ自体でβ−セクレターゼ開裂部位を含む基質を与え、誘導体ペプチドを作成するための出発点としても使用し得る。本発明ペプチドの顕著な特徴は、本明細書に記載されているデーターから分かるように本発明ペプチドの幾つかは配列番号２５７のスウェーデン変異ＡＰＰよりも少なくとも３３倍速く加水分解されることである。

本明細書の開示に基づいて、β−セクレターゼ基質は一般的な生化学合成及び組換え核酸方法を用いて作成され得る。ペプチドの化学的合成方法は当業界で公知である（例えば、Ｖｉｎｃｅｎｔ，「ペプチド及びタンパク質ドラッグデリバリー（Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」，ニューヨーク州ニューヨークに所在のＤｅｋｋｅｒ（１９９０年）発行参照）。

ペプチドの組換え合成方法も当業界で公知である。その方法ではペプチド合成のために核酸鋳型を使用する。特定のアミノ酸配列から遺伝コードの公知の縮重を用いて、多種多様のコード化核酸配列を得ることができる。遺伝コードの縮重は、殆どすべてのアミノ酸がヌクレオチドトリプレット、すなわちコドンのいろいろな組合せによりコードされるために生ずる。特定コドンの特定アミノ酸への翻訳は当業界で公知である（例えば、Ｌｅｗｉｎ，ＧＥＮＥＳ ＩＶ，ｐ．１１９，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９０年）発行参照）。

アミノ酸は以下のようにコドンによりコードされる：
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン：コドン ＧＣＡ，ＧＣＣ，ＧＣＧ，ＧＣＵ；
Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン：コドン ＵＧＣ，ＵＧＵ；
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸：コドン ＧＡＣ，ＧＡＵ；
Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸：コドン ＧＡＡ，ＧＡＧ；
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン：コドン ＵＵＣ，ＵＵＵ；
Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン：コドン ＧＧＡ，ＧＧＣ，ＧＧＧ，ＧＧＵ；
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン：コドン ＣＡＣ，ＣＡＵ；
Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン：コドン ＡＵＡ，ＡＵＣ，ＡＵＵ；
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン：コドン ＡＡＡ，ＡＡＧ；
Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン：コドン ＵＵＡ，ＵＵＧ，ＣＵＡ，ＣＵＣ，ＣＵＧ，ＣＵＵ；
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン：コドン ＡＵＧ；
Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン：コドン ＡＡＣ，ＡＡＵ；
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン：コドン ＣＣＡ，ＣＣＣ，ＣＣＧ，ＣＣＵ；
Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン：コドン ＣＡＡ，ＣＡＧ；
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン：コドン ＡＧＡ，ＡＧＧ，ＣＧＡ，ＣＧＣ，ＣＧＧ，ＣＧＵ；
Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン：コドン ＡＧＣ，ＡＧＵ，ＵＣＡ，ＵＣＣ，ＵＣＧ，ＵＣＵ；
Ｔ＝Ｔｈｒ＝トレオニン：コドン ＡＣＡ，ＡＣＣ，ＡＣＧ，ＡＣＵ；
Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン：コドン ＧＵＡ，ＧＵＣ，ＧＵＧ，ＧＵＵ；
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン：コドン ＵＣＧ；及び
Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン：コドン ＵＡＣ，ＵＡＵ。

ペプチドの組換え合成は発現ベクターを用いて宿主細胞において実施される。発現ベクターは所望ペプチドをコードする組換え核酸と適正な転写及びプロセッシングのための調節要素を含む。存在し得る調節要素には、組換え核酸に元々関連するもの及び組換え核酸に元々関連しない外因性調節要素が含まれる。外因性プロモーターのような外因性調節要素は特定宿主において組換え核酸を発現するために有用であり得る。

通常、発現ベクター中に存在する調節要素には転写プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター及び任意に存在するオペレーターが含まれる。好ましい要素は真核細胞でプロセッシングするポリアデニル化信号である。他の好ましい要素には、宿主細胞での自己複製のための複製起源、選択マーカー、限定数の有用な制限酵素部位及び高コピー数のポテンシャルが含まれる。発現ベクターの例はクローニングベクター、改変クローニングベクター、特別に設計されたプラスミド及びウイルスである。

ペプチドをコードする核酸は、発現ベクターを使用せずに例えば合成ｍＴＮＡまたは天然ｍＲＮＡを用いて細胞において発現され得る。更に、ｍＲＮＡは各種無細胞系（例えば、麦芽抽出物及び網状赤血球抽出物）及び細胞含有系（例えば、カエル卵母細胞）において翻訳され得る。細胞含有系へのｍＲＮＡの導入は、例えばマイクロインジェクションを用いて達成され得る。

発現のために適当な環境に核酸を導入するため、核酸を発現してタンパク質を産生するため及び発現タンパク質を単離するための方法は当業界で公知である。前記方法の例は文献に記載されており、例えばＡｕｓｕｂｅｌ，「分子生物学における現在の命題（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ（１９８７−１９９８年）発行及びＳａｍｂｒｏｏｋら，「分子クローニング，実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）発行に記載されている。

下記実施例は本発明の特徴及び作用効果を更に説明するために提示する。実施例はまた本発明を実施するために有用な方法をも例示する。これらの実施例は本発明を限定するものではない。

本発明のβ−セクレターゼペプチド基質の合成
本発明者らは、β−セクレターゼによる開裂の天然部位でのアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のコア構造に基づく合成コンビナトリアルペプチドライブラリーを利用してアルツハイマー病に関連する酵素であるβ−セクレターゼの好ましい基質アミノ酸配列を確立した。８つの合成ペプチドライブラリーの組を、各ライブラリーがアミノ酸組の各成分を含むように変更させたＡＰＰポリペプチド鎖に沿って１つのアミノ酸位置を含むように作成した。

前記ライブラリーは、図１（ここで、ＸはＭｅｔ及びＣｙｓを除くすべてのアミノ酸の組である）に示すようにβ−セクレターゼの公知の開裂部位を含むＡＰＰの８残基コア構造をもとに作成した。いずれの場合も、ライブラリーは８残基位置のうち７つはスウェーデン変異ＡＰＰ中の対応残基と同一であり、Ｘで示される第８残基は配列ライブラリーが生ずるようにアミノ酸の組によって異なるアミノ酸配列により表される。よって、ＡＰＰアミノ酸配列に沿った各位置に変更部位を置くことにより８つのライブラリーを作成した。前記ライブラリー及び各ペプチド基質は市販されているかまたはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（ＡＢ）の標準ペプチド合成二重カップリングプロトコル及びＡＢペプチド合成装置（カリフォルニア州フォスターシティーに所在）モデル４３０Ａを用いて合成した。ペプチド配列のライブラリーを作成するために、Ｂｏｃ保護アミノ酸の組の等モル混合物（１当量）をスウェーデン変異ＡＰＰの各位置に通常存在する残基の代わりに使用した。その結果、８つのライブラリーは、図１に示すＰ４からＰ４’のＡＰＰペプチド鎖に沿った各ポイントでアミノ酸混合物取り込みの部位を挿入することにより作成した。ペプチドライブラリー合成及びキャラクタリゼーションの方法の一般的レポートは他にも記載されている。援用により本明細書に含まれるとするＨ．Ｇ．Ｒａｍｊｉｔ，Ｇ．Ｈ．Ｋｒｕｐｐａ，Ｊ．Ｐ．Ｓｐｉｅｒ，Ｃ．Ｗ．Ｒｏｓｓ，ＩＩＩ，Ｖ．Ｍ．Ｇａｒｓｋｙ，「陽イオンエレトクロスプレーによる１９成分ドデカペプチドライブラリーの同定のためのモノアイソトープ及び炭素１３同重体の重要性 フーリエ変換イオンサイクロン共鳴質量分析法（Ｔｈｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｍｏｎｏｉｓｏｔｏｐｉｃ ａｎｄ ｃａｒｂｏｎ−１３ ｉｓｏｂａｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ １９−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｄｏｄｅｃａｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｂｒａｒｙ ｂｙ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｆｏｕｒｉｅｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍ ｉｏｎ ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）」，Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，１４：１３６８−１３７６（２０００）を参照されたい。

β−セクレターゼ活性の測定
合成及び精製後、８つのペプチドライブラリーの各々を酵素β−セクレターゼと一緒にインキュベートし、各ペプチドライブラリー成分の相対開裂速度を液体クロマトグラフィー／質量分析法を用いて追跡し、完全長ペプチド基質の消失及びペプチド開裂断片の形成の両方を分析した。酵素β−セクレターゼをｐＨ４．５で５〜５０ｎＭの濃度で各ペプチドライブラリー及び／または合成ペプチド基質の混合物と一緒にインキュベートした。

すべてのインキュベーションに関して、沈降を避けるために各ペプチド基質の濃度を１μＭに維持した。沈降は数種のより不溶性の基質でより高い基質濃度で認められる。基質及び酵素の混合物を温度管理式オートサンプラーを備えたＡｇｉｌｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１００シリーズ液体クロマトグラフィーにおいてインキュベートした。β−セクレターゼ酵素アッセイの温度は常に３７℃の一定温度で維持した。各反応混合物の１００μｌアリコートをＣ１８逆相ＬＣカラム（１×５０ｍｍ）（カリフォルニア州トーランスに所在のＭｅｔａｃｈｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）に注入し、２時間毎に反応の進行を追跡した。注入後、基質ライブラリー成分の各々の分解能を最大とするためにカラムに対して高度に最適化した溶媒勾配を与えた。最適性能は、２０％ 溶媒Ｂ（Ｂ＝アセトニトリル＋０．０５％ トリフルオロ酢酸、Ａ＝Ｈ_２Ｏ中０．０５％ ＴＦＡ）から始め、４０分間で４０％ 溶媒Ｂまで漸増させる勾配で得られた。ＬＣ／ＭＳラン後、各ペプチドの質量計算値を取り囲む０．５Ｄａマス窓を抽出することにより各ペプチド基質ライブラリー成分の選択イオン−クロマトグラムによりデータを処理した。

各反応時間でデータを抽出することにより、各基質の相対消失を追跡することができた。例えば、図２は、酵素β−セクレターゼで処理したときにＰ１’ペプチドライブラリーからのすべてのペプチドライブラリー成分について測定した開裂速度の違いを示している。幾つかのペプチドライブラリー成分は反応することが観察され、対応ピーク面積は経時的に減少したのに対して、β−セクレターゼによるプロセッシングを受けなかった成分のピーク面積はほぼ一定のままであった。ほぼ直ぐに消失したことが判明している成分は変異部位で好ましい残基であると見做された。簡潔のために、β−セクレターゼにより最も迅速に加水分解されたＰ１’ライブラリー成分（Ｐ１’＝Ｇｌｕ及びＰ１’＝Ａｌａ）、１つの中間体配列（Ｐ１’＝Ａｓｐ，スウェーデン変異ＡＰＰ中に通常存在する残基）、及びβ−セクレターゼにより開裂されなかった２つのペプチド（Ｐ１’＝Ｇｌｙ及びＰ１’＝Ｐｒｏ）のみを図２に示す。前記データから、任意Ｐ１’のＧｌｕまたはＡｌａが酵素β−セクレターゼに対する優れた基質であろうと予想された。

Ｐ１’＝ＧｌｕまたはＡｌａについての同様の相対的採択（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）のは、開裂産物の形成の分析から、すなわち図３に示すＰ１’ペプチドライブラリー由来のＣ末端断片を表すペプチド開裂産物を検出することにより推定された。この場合、好ましい残基により、Ｐ１’＝Ａｌａ及びＰ１’＝Ｇｌｕで表される産物がより迅速且つ匹敵する速度で形成されることから分かるように加水分解産物がより迅速に形成される。また、Ｐ１’＝Ａｌａ産物は、ＧｌｕまたはＡｌａよりもβ−セクレターゼ加水分解に対して余り誘導的でない残基と一致する形成を示す。よって、Ｐ１’基質部位の好ましい残基は、Ｐ１’ペプチドライブラリー分析に基づいてＧｌｕまたはＡｌａであると予想された。

Ｐ４からＰ４’の８つのペプチドライブラリーの各々を用いて同様の詳細分析を実施し、すべてのペプチドライブラリー研究の結果をまとめたグラフを図４に示す。この図では、調べた各アミノ酸についての相対的採択をＰ４からＰ４’のペプチド鎖に沿った各位置のバーの高さで表している。

上表１に示すように、ＡＰＰのスウェーデン変異体配列に沿った各位置で通常見られる残基がこの方法により最も好ましい残基または第２の最も好ましい残基と同定されることはまれであった。このデータにより、β−セクレターゼにより好ましい、すなわちＡＰＰのスウェーデン変異体配列よりも非常により迅速にプロセッシングされる基質配列を作成するように残基を集めることができる。これらの所見は、Ｐ１、Ｐ１’及びＰ２’での残基に対する好ましいアミノ酸を含む特定アミノ配列を設計及び合成することにより証明された。

この新しい基質配列はスウェーデン変異ＡＰＰ配列よりも少なくとも３０倍速くβ−セクレターゼにより加水分解されることが分かった。例えば、図５は、ペプチドライブラリー研究から誘導された配列情報を用いて得たそれぞれの純粋ペプチドで得られた結果を示している。ライブラリー結果を統合すると優れた基質が生ずるかを調べるために５つのペプチド配列をβ−セクレターゼの存在下で同時にインキュベートした。この研究は、ペプチドライブラリー研究から好ましいことが判明している残基を挿入すると通常のスウェーデン変異ＡＰＰ配列よりも速く加水分解される基質が生ずるかを確認するために実施した。ペプチドライブラリー実験と同様にして５つの各ペプチド配列をβ−セクレターゼと一緒にインキュベートした。

この実験で使用したペプチド配列は次の通りであった：

ここで、Ｃｈｇ及びＣｈａはそれぞれシクロヘキシルグリシン及びシクロヘキシルアラニン残基である。Ｐ１にとって好ましいと判明しているＦの芳香族環上の変更によりβ−セクレターゼ媒介加水分解の速度が更に速くなるかを調べるために非天然Ｃｈｇ及びＣｈａを含めた。図５に示すように、Ｐ１’のアスパランギン酸のＡｌａへの単一点変異により、対応のスウェーデン変異体配列よりも１０倍速くβ−セクレターゼにより加水分解される基質が生じた。更に、Ｐ１’でのＡｌａ置換と共にＰ１に予想フェニルアラニン残基を挿入すると、β−セクレターゼの加水分解速度がほぼ２倍に上昇した。これにより、スウェーデン変異体配列よりおおよそ１７倍速く加水分解される基質が生じた。挿入された別の置換には、任意Ｐ１−Ｐ１’−Ｐ２’に配列ＦＡＶを有する基質に対するＰ２’のバリン残基が含まれる。このＦＡＶ含有ペプチドは、スウェーデン変異体配列よりおおよそ３０倍β−セクレターゼにより加水分解されることが認められた。この結果により、単一点ライブラリー研究結果の組合せにより好ましい配列を確立することを含む方法が裏付けられる。現在のデータにより追加残基を更にうまく挿入することができる。表２は、８量体配列の各位置の２つの最も好ましい残基を選択することにより良好なβ−セクレターゼ基質であると予想される２５６配列を開示している。

追加アッセイ
β−セクレターゼペプチド基質は開裂産物の産生を調べるアッセイにおいて使用可能である。β−セクレターゼ基質の開裂は、本発明ペプチド基質のＮ−またはＣ−末端開裂産物の形成を検出することにより調べることができる。前記産物のいずれかの存在は抗体と放射性、電気化学発光または蛍光標識を用いるような方法を用いて測定され得る。所要または所望により、別の産物を濃厚にする精製ステップを使用してもよい。精製ステップの例には抗体、分離ゲル及びカラムの使用が含まれる。

開裂産物の検出
本発明のペプチド基質の開裂産物は、開裂ペプチドを捕捉するための抗体及び開裂ペプチドの存在を検出するための抗体を用いるサンドイッチアッセイを用いて検出され得る。検出は、電気化学発光（ＥＣＬ）（Ｙａｎｇら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２：１９３−１９４（１９９４）；Ｋｈｏｒｋｏｖａら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，８２：１５９−１６６（１９９８））及びＯｒｉｇｉｎ １．５アナライザー（メリーランド州ゲーザーズバーグに所在のＩｇｅｎ Ｉｎｃ．）を用いてなし得る。

阻害実験
β−セクレターゼ活性が細胞中の真性ＡＰＰプロセッシング酵素により触媒され、単に偽タンパク質分解活性によるものではないことを立証するために阻害実験を実施し得る。この実験により、公知のβ−セクレターゼ阻害剤を用いるインビトロアッセイにおいて基質のβ−セクレターゼ切断可能結合での開裂に対する表２の各種ペプチド基質の影響を調べることができる。

β−セクレターゼ活性に対するβ−セクレターゼ阻害剤の影響は、例えば本発明のペプチド基質を安定的に発現するチャイニーズハムスター卵巣線維芽細胞（ＣＨＯ細胞）を用いて測定され得る。本発明のペプチドを発現するＣＨＯ細胞を適当な増殖条件下適当な培地において増殖させる。その条件とは、例えば９０％ ＤＭＥＭ、１０％ ウシ胎仔血清、２ｍＭ グルタミン、１００μｇ／ｍｌ ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン及び０．２ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８である。前記細胞を２×１０^４細胞／ウェルの濃度で９６ウェル皿に接種する。開裂産物の形成は、ＣＨＯ細胞をトランスフェクトするために使用される参照ペプチド基質の開裂産物の少なくとも１つに特異的な放射標識抗体を用いて検出され得る。

本発明ペプチドを発現するＣＨＯ細胞を公知のβ−セクレターゼ阻害剤で処理すると、開裂産物の細胞からの分泌を用量依存的に阻止すると予想され、前記産物の抑制のＩＣ_５０値は文献で報告されている値と同等である。

また、β−セクレターゼ阻害剤は、最後に開裂関連産物の生成をもたらす表１に示す本発明のペプチド基質配列の「溶解化β−セクレターゼ」媒介プロセッシングを抑制すると予想される。

スウェーデン変異体よりも６０倍速く加水分解される好ましい基質
図６はスウェーデン変異体（配列番号２５７）及び４つの本発明ペプチドについて観察された加水分解速度を示す。１つの本発明のペプチド、特にＥＶＮＦＥＮＥＦ（配列番号２６２）はβ−セクレターゼに対する特に好ましい基質であることが判明し、その加水分解速度は配列番号２５７の加水分解速度よりも６０倍速かった。表３は、これらの結果をＥＶＮＬＡＡＥＦ（配列番号２５８）についての結果と併せて示す。

他の実施態様も本発明の範囲である。幾つかの実施態様について例示、説明してきたが、本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく各種改変を加えることができる。

スウェーデン変異ＡＰＰから誘導されるペプチドライブラリーを示す。アミノ酸を１文字コードで表す。配列番号２５７（上段）はＡＰＰの６９５イソフォームのナンバリングに基づくアミノ酸５９３〜５６０に相当するスウェーデン変異ＡＰＰを示す。 Ｐ１ライブラリーからの各種ペプチド基質のβ−セクレターゼによる開裂速度の違いを示すデータである。 Ｐ１’ペプチドライブラリーからの本発明のペプチド基質をβ−セクレターゼにより開裂した後に形成される開裂産物（Ｃ−末端断片）の分析に基づく特定アミノ酸に対するβ−セクレターゼの相対的採択を示す。 β−セクレターゼによる基質の加水分解速度に基づくペプチド基質配列に対して最も好ましい残基を示すグラフである。データは、β−セクレターゼによる基質配列の加水分解速度を上昇させる８量体配列の特定位置の好ましい配列を示す。 アミノ酸Ｐｈｅ及びＡｌａに対する採択に基づいて位置Ｐ１及びＰ１’のアミノ酸を置換すると合成８量体ペプチド基質の加水分解速度が増加することを示す。スウェーデン変異体配列６９５に相当する８量体ペプチド配列中のＡｓｐ５９７をＡｌａで置換すると、スウェーデン変異体配列に比して１０倍速い加水分解速度が観察された。更に８量体ペプチド配列のＬｅｕ５９６の代わりにＰｈｅを挿入すると、スウェーデン変異体配列で観察されたよりも１７倍速いβ−セクレターゼによる加水分解が観察された。 スウェーデン変異体（ＥＶＮＬＤＡＥＦ；配列番号２５７）の加水分解速度と本発明ペプチドＥＶＮＦＡＡＥＦ（配列番号２５９）、ＥＶＮＦＥＡＥＦ（配列番号２６０）、ＥＶＮＦＡＶＥＦ（配列番号２６１）及びＥＶＮＦＥＶＥＦ（配列番号２６２）の加水分解速度の比較を示す。

配列表

Claims (17)

1. 配列番号２６２で表されるアミノ酸配列からなる８量体ペプチド。
2. 請求の範囲第１項に記載のペプチドに対して特異的な抗体。
3. 請求の範囲第１項に記載のペプチドのアミノ末端断片を特異的に認識する抗体であって、該アミノ末端断片はβ−セクレターゼによるペプチドの開裂から生ずるものである抗体。
4. 請求の範囲第１項に記載のペプチドの開裂産物を特異的に認識する抗体であって、該開裂産物はβ−セクレターゼによるペプチドの開裂から生ずるＣ末端断片である抗体。
5. 請求の範囲第１項に記載のペプチドの合成β−セクレターゼ開裂部位に特異的な抗体であって、前記部位が６９５イソフォームに従ってナンバリングしたスウェーデン変異ＡＰＰのＬｅｕ_５９６及びＡｓｐ_５９７に対応することを特徴する前記抗体。
6. 抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求の範囲第２項〜第５項のいずれかに記載の抗体。
7. 抗体がヒト化抗体であることを特徴とする請求の範囲第２項〜第６項のいずれかに記載の抗体。
8. 請求の範囲第１項に記載のペプチドのβ−セクレターゼによる開裂を生体外において測定するステップを含むことを特徴とするβ−セクレターゼ活性のアッセイ方法。
9. 測定が開裂により生ずるβ−セクレターゼペプチド関連産物のアミノ末端に結合する抗体の使用を含むことを特徴とする請求の範囲第８項に記載の方法。
10. β−セクレターゼ活性を阻害する１つ以上の化合物の存在下で実施することを特徴とする請求の範囲第８項又は第９項に記載の方法。
11. 試験化合物のβ−セクレターゼ活性に影響を与える活性の生体外における測定方法であって、
    ａ）請求の範囲第１項に記載のペプチド、試験化合物及びβ−セクレターゼ活性を有する調製物を混合するステップ、及び
    ｂ）β−セクレターゼ活性を測定するステップ
    を含むことを特徴とする前記方法。
12. ステップｂ）がペプチド基質に対するβ−セクレターゼの作用により生ずる開裂産物の量を測定することを含む請求の範囲第１１項に記載の方法。
13. ペプチド基質のヒトβ−セクレターゼ開裂の生体外における検出方法であって、
    ヒトβ−セクレターゼ及びβ−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のβ−セクレターゼ開裂部位を含む請求の範囲第１項に記載のペプチドからなる基質を用意すること、及び
    該ペプチド基質のカルボキシ末端断片のアミノ末端及びアミノ末端断片のカルボキシ末端の少なくとも１つを前記末端に対して特異的な抗体と結合することにより、コントロールに対する基質のβ−セクレターゼ開裂の結果として生ずる少なくとも１つのβ−セクレターゼ開裂産物の量を検出することを特徴とする前記方法。
14. 請求の範囲第１項に記載のペプチドのインビボプロセッシングのモニター方法であって、前記ペプチドを発現するように形質転換した非ヒト動物由来のサンプル中の前記ペプチドの存在を特異的に検出することを含み、前記アミノ末端断片はペプチドのβ−開裂部位で開裂されていることを特徴とする前記方法。
15. 請求の範囲第４項に記載の抗体とサンプルを反応させることによりペプチドの存在を検出することを特徴とする請求の範囲第１４項に記載の方法。
16. 請求の範囲第３項に記載の抗体とサンプルを反応させることによりペプチドの存在を検出することを特徴とする請求の範囲第１４項に記載の方法。
17. β−セクレターゼを作用させたとき請求の範囲第１項に記載のペプチドの開裂により生ずることを特徴とするペプチド開裂産物。

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