JP2013158281A - 新規ｂａｃｅ１活性測定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】
本発明は、ｐＨおよび基質濃度について従来法に比べ、より生体内の環境に近い条件でアッセイ可能とすることにより、阻害剤を正確に評価可能なアッセイを提供すること、を課題とする。
【解決手段】
従来、ｐＨ４．５付近であるとされていたＢＡＣＥ１の至適ｐＨ活性が、アミロイド前駆体タンパク質を基質として用いた場合はｐＨ５．４〜６．８に変化すること、さらに感度も飛躍的に向上すること、を予想外に見出したことにより、上記課題を解決した。

【選択図】なし

Description

本発明は、ＢＡＣＥ１活性を高感度で正確に評価する新規活性測定方法に関する。

アルツハイマー病（ＡＤ）は、老人斑、神経原繊維変化、神経細胞脱落そして認知障害によって特徴付けられる進行性の神経変性疾患である。病理学的、生化学的な検討から老人斑の構成分子であるアミロイドβタンパク質（Ａβ）がＡＤの原因分子であると考えられている（非特許文献１、２）。Ａβは、その前駆タンパク質であるβＡＰＰがβ―セクレターゼ（ＢＡＣＥ１）により切断され、その後更にγ‐セクレターゼにより切断されることで産生されるペプチド断片である。したがって、ＢＡＣＥ１を阻害してＡβの産生を阻害することがＡＤ治療の有効なアプローチであると考えられており、これまでＢＡＣＥ１阻害剤について多数の報告がある。しかしながら、ＢＡＣＥ１アッセイで見出された阻害剤のなかには、生体ではＢＡＣＥ１の阻害効果を示さない場合も報告されており（非特許文献３）、ＢＡＣＥ１アッセイの問題となっている。

アミロイド前駆体タンパク質部分ペプチドを基質として用いた検討から、ＢＡＣＥ１の酵素活性の至適ｐＨはｐＨ４〜５であることが報告されている（非特許文献４）。そして、この至適ｐＨは基質としてアミロイド前駆体タンパク質を用いた場合も同様であると考えられている（特許文献１、非特許文献５、非特許文献６）。例えば、非特許文献６では中性付近のｐＨではＢＡＣＥ１はアミロイド前駆体タンパク質との結合ができず、ｐＨ４．５〜５において、ＢＡＣＥ１はアミロイド前駆体タンパク質と結合可能な活性型構造にシフトするというモデルが提唱されている。このため、ＢＡＣＥ１のアッセイは基質の種類と関係なく、主にこのｐＨ条件で行われている。
一方、生体内でのＢＡＣＥ１によるアミロイド前駆体タンパク質の切断反応は初期エンドソームで起こっており（非特許文献７）、その初期エンドソーム内のｐＨは６〜６．５である（非特許文献８）。すなわち、生体内でのＢＡＣＥ１よるアミロイド前駆体タンパク質の分解はｐＨ６〜６．５で行われている。したがって、ＢＡＣＥ１アッセイは生体内のｐＨを反映した条件で行われておらず、これまで初期エンドソーム内の条件に近いｐＨ（例えばｐＨ６．２付近）で、ＢＡＣＥ１アッセイを行ったという報告はない。
さらに、アミロイド前駆体タンパク質部分ペプチドを基質として用いたＢＡＣＥ１アッセイは感度が悪い。例えば、過剰な質濃度（５μＭ）でアッセイが行われている（引用文献６）。しかし、生理的なアミロイド前駆体タンパク質濃度はｎＭオーダー（例えば過剰発現細胞数十ｎＭ程度（非特許文献１０））と考えられているが、この程度の濃度でＢＡＣＥ１アッセイを行ったという報告はない。
このように、従来のＢＡＣＥ１のアッセイは生体内の環境を反映していないことから、生体内のｐＨでアッセイ可能で、感度が高いＢＡＣＥ１のアッセイ系を提供することが望まれていた。

特表２００９−５４１３１１公報

Ｃｈａｐｍａｎ，Ｄ．Ｐ．ら、Ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅ、２００６年、第３巻、Ａ３４ Ｂｒａａｋ，Ｈ．ら、Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １９９１年、第１巻、２１３ページ Ｇａｒｉｎｏ，Ｃ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００６年、第４９巻、４２７５ページ Ｖａｓｓａｒ，Ｒ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９年、第２８６巻、７３５ページ Ｓｃｈｏｌｅｆｉｅｌｄ，Ｚ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００３年、第１６３巻、９７ページ Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｈ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００８年、第２８巻、３６６３ページ Ｋｏｏ，Ｅ．Ｈ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９４年、第２６９巻、１７３８６ページ Ｄｅｍａｕｒｅｘ，Ｎ．ら、Ｎｅｗｓ ｉｎ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２００２年、第１７巻、１ページ Ｇｒｕｎｉｎｇｅｒ−Ｌｅｉｔｃｈ，Ｆ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｏｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００２年、第２７７巻、４６８７ページ Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｖ．ら、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ２０１２年、第３１巻、１８７ページ

本発明は、ｐＨや基質濃度について生体内環境に近い条件を有し、感度が高いＢＡＣＥ１のアッセイ系を構築することにより、阻害剤を正確に評価することが可能なアッセイ方法を提供すること、を課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、アミロイド前駆体タンパク質を基質として用いた場合、従来ｐＨ４．５付近であるとされていたＢＡＣＥ１反応の至適ｐＨが、ｐＨ５．４〜６．８に変化し、感度も飛躍的に向上することを予想外に見出した。本発明者らは、この知見に基づいて、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、
［１］（１）配列番号１、３もしくは５で表されるアミノ酸配列を含むアミロイド前駆体タンパク質、または配列番号１、３もしくは５で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸を有する配列を含み、ＢＡＣＥ１により切断される、アミロイド前駆体タンパク質変異体、
を、ｐＨ５．４〜６．８の条件下でＢＡＣＥ１と接触させる工程、および
（２）前記アミロイド前駆体タンパク質または前記アミロイド前駆体タンパク質変異体、の分解産物の量を測定する工程、
を含むＢＡＣＥ１活性測定方法。
［２］前記アミロイド前駆体タンパク質または前記アミロイド前駆体タンパク質変異体、の分解産物が、βＣＴＦまたはｓＡＰＰβである、［１］に記載のＢＡＣＥ１活性測定方法。
［３］（１）配列番号１、３もしくは５で表されるアミノ酸配列を含むアミロイド前駆体タンパク質、または配列番号１、３もしくは５で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸を有する配列を含み、ＢＡＣＥ１により切断されるアミロイド前駆体タンパク質変異体、
を、被験物質の存在下、ｐＨ５．４〜６．８の条件下でＢＡＣＥ１と接触させる工程、
（２）前記アミロイド前駆体タンパク質または前記アミロイド前駆体タンパク質変異体、の分解産物の量を測定する工程、および
（３）前記分解産物を、被験物質の非存在下でのアミロイド前駆体タンパク質またはアミロイド前駆体タンパク質変異体、の分解産物の量と比較する工程、
を含むＢＡＣＥ１阻害剤のスクリーニング方法。
［４］［３］に記載のＢＡＣＥ１阻害剤のスクリーニング方法であって、さらに
（４）被験物質の存在下でのアミロイド前駆体タンパク質またはアミロイド前駆体タンパク質変異体、の分解産物の量が、被験物質の非存在下でのアミロイド前駆体タンパク質またはアミロイド前駆体タンパク質変異体、の分解産物の量より減少している場合、被験物質をＢＡＣＥ１阻害剤として選択する工程、
を含むＢＡＣＥ１阻害剤のスクリーニング方法。
［５］前記アミロイド前駆体タンパク質または前記アミロイド前駆体タンパク質変異体、の分解産物が、βＣＴＦまたはｓＡＰＰβである、［３］または［４］に記載のＢＡＣＥ１阻害剤のスクリーニング方法。
［６］前記ｐＨ５．４〜６．８がｐＨ５．６〜６．６である、［１］または［２］記載のＢＡＣＥ１活性測定方法。
［７］前記ｐＨ５．４〜６．８がｐＨ５．９〜６．３である、［１］または［２］記載のＢＡＣＥ１活性測定方法。
［８］前記ｐＨ５．４〜６．８がｐＨ６．０〜６．２である、［１］または［２］記載のＢＡＣＥ１活性測定方法。
［９］前記ｐＨ５．４〜６．８がｐＨ５．６〜６．６である、［３］〜［５］のいずれかに記載のＢＡＣＥ１阻害剤のスクリーニング方法。
［１０］前記ｐＨ５．４〜６．８がｐＨ５．９〜６．３である、［３］〜［５］のいずれかに記載のＢＡＣＥ１阻害剤のスクリーニング方法。
［１１］前記ｐＨ５．４〜６．８がｐＨ６．０〜６．２である、［３］〜［５］のいずれかに記載のＢＡＣＥ１阻害剤のスクリーニング方法。
［１２］［１］〜［１１］のいずれかに記載の方法に用いられる、キット。
などを提供する。

本発明は、従来は提供することが困難であった、ｐＨや基質濃度について生体内環境に近い条件を有し、感度が高いＢＡＣＥ１のアッセイ系を構築することにより、阻害剤を正確に評価可能なアッセイ方法を提供する。

図１は、Ａβの産生を模式的に示す。即ち、ＢＡＣＥ１およびγ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅによりアミロイド前駆体タンパク質が連続切断を受けてＡβが産生されることを示す。 図２は、アミロイド前駆体タンパク質ペプチドを基質として用いたＢＡＣＥ１酵素活性のｐＨによる変化を示す。（ａ）は全長ＢＡＣＥ１を酵素として用いた測定結果、（ｂ）はＢＡＣＥ１細胞外領域を酵素として用いた測定結果を示す。図中、ＦＬ−ＢＡＣＥ１は全長ＢＡＣＥ１、ｒｈ−ＢＡＣＥ１は、配列番号９で示されるＢＡＣＥ１の細胞外領域、ｐｅｐｔｉｄｅはアミロイド前駆体タンパク質ペプチド（配列番号７で示されるアミロイド前駆体タンパク質ペプチドのＣ末端に、ビオチンが付加されたもの）、を示す。 図３は、アミロイド前駆体タンパク質を基質として用いたＢＡＣＥ１酵素活性のｐＨによる変化を示す。（ａ）は全長ＢＡＣＥ１を酵素として用いた測定結果、（ｂ）はＢＡＣＥ１細胞外領域を酵素として用いた測定結果を示す。図中、ＦＬ−ＢＡＣＥ１は全長ＢＡＣＥ１、ｒｈ−ＢＡＣＥ１は、配列番号９で示されるＢＡＣＥ１の細胞外領域、ＡＰＰはアミロイド前駆体タンパク質、を示す。 図４は、アミロイド前駆体タンパク質を基質として用いたＢＡＣＥ１酵素活性のｐＨによる変化を示す。 図５、（ａ）ＢＡＣＥ１阻害剤であるβ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＶの構造式、および（ｂ）アミロイド前駆体タンパク質を用いたＢＡＣＥ１アッセイ系におけるβ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＶの阻害活性曲線を示す。 図６は、基質として用いたアミロイド前駆体タンパク質あるいはアミロイド前駆体タンパク質ペプチドの濃度と、ＢＡＣＥ１によりそれぞれが分解されて生じた分解産物濃度との関係を示す。図中、黒四角（ＡＰＰ）はアミロイド前駆体タンパク質を、白丸（ｐｅｐｔｉｄｅ）はアミロイド前駆体タンパク質ペプチド（配列番号７で示されるアミロイド前駆体タンパク質ペプチドのＣ末端に、ビオチンが付加されたもの）、を示す。

本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、本発明の属する分野の当業者によって通常理解される意味で用いられる。

本明細書において、「アミロイド前駆体タンパク質」とは、Ａｍｙｌｏｉｄ Ｐｒｅｃｕｒｓｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ （ＡＰＰ）のことであり、老人班の主要構成成分であるアミロイドβペプチド（Ａβ）の前駆体をいう。アミロイド前駆体タンパク質には、ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１、およびＡＰＰ７７０の３つが知られている。本発明におけるアミロイド前駆体タンパク質は特にＡＰＰ６９５が好ましい。
また、ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１、またはＡＰＰ７７０について、それぞれシグナルペプチド部分（各配列の１〜１７位）が欠損したもの（配列番号１、３、または５）は本明細書で規定するアミロイド前駆体タンパク質に含まれる。
また、ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１、またはＡＰＰ７７０について、シグナルペプチド部分が欠損していないもの（配列番号２、４、または６）も本明細書で規定するアミロイド前駆体タンパク質に含まれる。つまりシグナルペプチドを有しないものおよびシグナルペプチドを有するものいずれも本発明書の「アミロイド前駆体タンパク質」に含まれる。
アミロイド前駆体タンパク質であればこれらに限られず、ヒト以外にもマウスおよびラットのものも利用することができる。本発明のアミロイド前駆体タンパク質はヒト、サル、イヌ、ウサギ、ラット、マウス、その他の動物の脳から抽出することができる。大腸菌や細胞（ＨＥＫ細胞、ＣＯＳ−１細胞、又はＣＨＯ細胞等）で発現させた組換え体も利用できる。合成品でもよい。
本明細書において、「アミロイド前駆体タンパク質変異体」には、配列番号１、３、または５で表される配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸を有する配列を含み、ＢＡＣＥ１により切断される、アミロイド前駆体タンパク質を含む。また配列番号２、４、または６で示される配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸を有する配列を含み、ＢＡＣＥ１により切断される、アミロイド前駆体タンパク質も「アミロイド前駆体タンパク質変異体」に含まれる。つまり、これらのシグナルペプチドを有しないものおよびシグナルペプチドを有するものも、本発明書の「アミロイド前駆体タンパク質変異体」に含まれる。
また、これらのアミロイド前駆体タンパク質変異体としては、例えばスウェーデン変異を有するものであってもよい。スウェーデン変異を有するアミロイド前駆体タンパク質変異体とは、配列番号２の５９５位のＬｙｓがＡｓｎに、そして５９６位のＭｅｔがＬｅｕにそれぞれ置換した変異体をいう。

本明細書において、「ＢＡＣＥ１」とは、アミロイド前駆体タンパク質をβ部位で切断する酵素をいう。例えばＢＡＣＥ１はＡＰＰ６９５のβ部位（配列番号２の５９６番目と５９７番目の間）を切断する。本発明におけるＢＡＣＥ１はアミロイド前駆体タンパク質をβ部位で切断する活性がある配列番号９記載の配列（より好ましくは配列番号１０記載の配列）を含んでいるタンパク質であればよく、全長でもよい。また、アミロイド前駆体タンパク質をβ部位で切断する活性があれば、配列番号９（より好ましくは配列番号１０）記載の配列において、１又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたＢＡＣＥ１改変体であってもよい。代表的なＢＡＣＥ１としては、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｂｅｔａ−ｓｉｔｅ ＡＰＰ−ｃｌｅａｖｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ １（ＧｅｎＢａｎｋ ｄａｔａｂａｓｅｓ， ＮＣＢＩ． ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ．ＮＰ＿０３６２３６）などを挙げることができるが、各種バリアントであってもよく（例えば、ｉｓｏｆｏｒｍ Ａ：ＮＰ＿０３６２３６、ｉｓｏｆｏｒｍ Ｂ：ＮＰ＿６２０４２８、ｉｓｏｆｏｒｍ Ｃ：ＮＰ＿６２０４２７、ｉｓｏｆｏｒｍ Ｄ：ＮＰ＿６２０４２９、ｉｓｏｆｏｒｍ Ｅ：ＮＰ＿００１１９３９７７、ｉｓｏｆｏｒｍ Ｆ：ＮＰ＿００１１９３９７８）、これらに限定されない。
また、ヒト以外にもマウスおよびラットのものも利用することができる。本発明におけるＢＡＣＥ１の例としては、ヒト、サル、イヌ、ウサギ、ラット、マウス、その他の動物の脳から抽出できる。大腸菌や細胞（ＣＨＯ、ＨＥＫ等）で発現させた組換え体も利用できる。合成品でもよい。

本明細書において、「ｓＡＰＰβ」とは、上記アミロイド前駆体タンパク質またはアミロイド前駆体タンパク質変異体がＢＡＣＥ１によってβ部位で切断されて生じる２つの断片のうち、Ｎ末側の断片のことをいう。
本明細書において、「βＣＴＦ」とは、上記アミロイド前駆体タンパク質またはアミロイド前駆体タンパク質変異体がＢＡＣＥ１によってβ部位で切断されて生じる２つの断片のうち、Ｃ末側の断片のことをいう。
本明細書において、「ネオエピトープ」とは、あるペプチドが切断されて新たに生じるエピトープのことをいう。例えば、本明細書で定義したアミロイド前駆体タンパク質またはアミロイド前駆体タンパク質変異体が、ＢＡＣＥ１により切断されて新たに生じたｓＡＰＰβのＣ末端、βＣＴＦのＮ末端のエピトープのことをいう。

本明細書において、切断された基質（例えば、βＣＴＦやｓＡＰＰβ）の「量」とは、対象となる物質の物理量を直接示す尺度（例えば、モル数、重量等）をいう。切断された基質の量は物理化学的手法により直接量を測定してもよいし、免疫学的手法を用いて間接的に量を測定してもよい。あるいは量が不明であっても、存在量を反映する指標（物理化学的手法または免疫学的手法以外の指標で表示されうる）で表示することによってスクリーニングを実施することができる。

本明細書において、「被験物質」とはスクリーニングの対象となりうる任意の物質をいう。 例えば、低分子化合物（コンビナトリアルケミストリーで合成されたものも含む）、有機化合物、ポリペプチド、タンパク質、糖、核酸、脂質、及び／又はこれらの複合体が挙げられる。しかしこれらに限定されるものではない。

本明細書において、「阻害」とは、酵素活性を低減、または消滅させることをいう。阻害の形式は、基質（アミロイド前駆体タンパク質またはアミロイド前駆体タンパク質変異体）との競合阻害、非競合阻害、その他の様式であってもよい。「阻害剤」とは、ＢＡＣＥ１についていうとき、酵素活性を低減または消失させる物質をいい、阻害薬、阻害物質ともいう。阻害剤は、酵素及び基質に結合して酵素阻害を示しても良く、酵素のみに結合または基質のみに結合して酵素活性を阻害してもよい。

本明細書において、「スクリーニング」とは、種々のアッセイ（評価）系を用いて被検物質を評価し、多くの被験物質群（例えば低分子などを含むライブラリー）の中から特定の性質を持つ物質（例えば、医薬品として有効な化合物）を選択することをいう。スクリーニングの際は、標的となる物質の物理化学的性質（例えば質量）を指標にしてもよく、標的となる物質に何らかの標識を付してもよく、標的被験物質に特異的な手段（例えば抗体など）を用いてもよい。スクリーニングの例としては、イムノアッセイが挙げられるが、これに限られるものではない。

本明細書において、「標識」とは、化合物や分子そのものを同定するなどのために、化合物の一部を改変して目印をつけることをいう。標識物質の標識には、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質、酵素、ビオチンが用いられるが、これらに限定されるものではない。上記放射性同位元素としては、例えば３Ｈ，１４Ｃ，３２Ｐ，３３Ｐ，３５Ｓ，１２５Ｉなどが、上記蛍光物質としては、例えばフルオレスカミン、フルオレッセインイソチオシアネートなどが、上記発光物質としては、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン、シュウ酸エステルなどが、上記酵素としては、βガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などが、それぞれ挙げられる。

本明細書において、「イムノアッセイ」とは、抗体を用いた免疫学的測定法のことをいう。また、「ＥＬＩＳＡ」とは、イムノアッセイの一形態である酵素免疫測定（定量）法のことをいう。ＥＬＩＳＡにはサンドイッチ法、競合法、直接吸着法などの方法あるが、それらに限定されない。

本明細書において、「キット」とはＢＡＣＥ１阻害剤の探索のためのキットをいう。例えば、本発明にかかるキットは、ＢＡＣＥ１酵素、アミロイド前駆体タンパク質、バッファー、および検出抗体を含む。しかし、キットの構成内容はこれに限られない。

（好ましい実施形態の説明）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はこれらに限定されないことが理解される。当業者はいかなる公知の他の方法も利用可能であり、例えば以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解される。

（ＢＡＣＥ１活性測定方法）
一つの局面において、本発明は、ＢＡＣＥ１活性測定方法を提供する。
一つの好ましい実施形態として、このスクリーニング方法は、（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むアミロイド前駆体タンパク質、または配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸を有する配列を含み、ＢＡＣＥ１により切断される、アミロイド前駆体タンパク質変異体、
を、ｐＨ５．４〜６．８の条件下でＢＡＣＥ１と接触させる工程、および（２）前記アミロイド前駆体タンパク質または前記アミロイド前駆体タンパク質変異体、の分解産物の量を測定する工程、を含む。
一般的に、ＢＡＣＥ１活性を測定する場合は、ペプチド基質を用いてｐＨ４．５付近の条件で反応を行う。これまでアミロイド前駆体タンパク質を用いてｐＨ５．４〜６．８の条件下でＢＡＣＥ１活性を測定されたという報告はない。ペプチド基質ではなくアミロイド前駆体タンパク質を用いて、このｐＨでアッセイできたことは驚くべきことである。本発明の活性測定系は基質とｐＨ条件について、従来法に比べより自然に近い条件で活性を評価できると考えられる。

一つの好ましい実施形態として、本発明のＢＡＣＥ１活性測定方法にはＡＰＰ６９５そのもの、およびシグナルペプチドが切断されたもの、いずれも本発明のＢＡＣＥ１活性測定方法に利用しうる。またＡＰＰ７５１、ＡＰＰ７７０、およびこれらのシグナルペプチドが切断されたものも、ＡＰＰ６９５と同様に本発明のＢＡＣＥ１活性測定方法に基質として利用しうる。

一つの好ましい実施形態として、本発明のＢＡＣＥ１活性測定方法において、アミロイド前駆体タンパク質またはアミロイド前駆体タンパク質変異体の分解産物が、βＣＴＦまたはｓＡＰＰβであるＢＡＣＥ１測定方法が挙げられる。この場合、βＣＴＦまたはｓＡＰＰβはイムノアッセイにて定量することができる。例えば、βＣＴＦの定量には、市販の８２Ｅ１抗体（ＩＢＬ）などをイムノアッセイに用いることもできるが、これに限られない。

一つの好ましい実施形態として、本発明のＢＡＣＥ１活性測定方法において、ｐＨが５．４〜６．８の条件下で行うことができる。また、好ましくはｐＨが５．６〜６．６、さらに好ましくはｐＨが５．９〜６．３、よりさらに好ましくはｐＨが６．０〜６．２の条件下、で本発明のＢＡＣＥ１活性測定を行いうる。

一つの局面において、本発明のＢＡＣＥ１阻害剤のスクリーニング方法を提供する。
一つの好ましい実施形態として、本発明のＢＡＣＥ１阻害剤のスクリーニング方法は、（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むアミロイド前駆体タンパク質、または
配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸を有する配列を含み、ＢＡＣＥ１により切断されるアミロイド前駆体タンパク質変異体を、被験物質の存在下、ｐＨ５．４〜６．８の条件下でＢＡＣＥ１と接触させる工程、（２）前記アミロイド前駆体タンパク質または前記アミロイド前駆体タンパク質変異体、の分解産物の量を測定する工程、および（３）前記分解産物を、被験物質の非存在下でのアミロイド前駆体タンパク質またはアミロイド前駆体タンパク質変異体、の分解産物の量と比較する工程、を含みうる。

一つの好ましい実施形態として、被験物質の存在下でのアミロイド前駆体タンパク質またはアミロイド前駆体タンパク質変異体の分解産物の量と、被験物質の非存在下でのアミロイド前駆体タンパク質またはアミロイド前駆体タンパク質変異体の分解産物の量を比較し、被験物質の存在下でのアミロイド前駆体タンパク質またはアミロイド前駆体タンパク質変異体の分解産物の量の方が減少している場合、該被験物質をＢＡＣＥ１阻害剤として選択することができる。

一つの好ましい実施形態として、本発明のＢＡＣＥ１阻害剤のスクリーニング方法において、アミロイド前駆体タンパク質またはアミロイド前駆体タンパク質変異体の分解産物が、βＣＴＦまたはｓＡＰＰβであるＢＡＣＥ１測定方法が挙げられる。この場合、βＣＴＦまたはｓＡＰＰβはイムノアッセイにて定量することができる。例えば、βＣＴＦの定量には、市販の８２Ｅ１抗体（ＩＢＬ）などをイムノアッセイに用いることもできるが、これに限られない。

一つの好ましい実施形態として、本発明のＢＡＣＥ１阻害剤のスクリーニング方法において、ｐＨが５．４〜６．８の条件下で行うことができる。また、好ましくはｐＨが５．６〜６．６、さらに好ましくはｐＨが５．９〜６．３、よりさらに好ましくはｐＨが６．０〜６．２の条件下、でＢＡＣＥ１阻害剤のスクリーニング方法を行いうる。
従来法に比べ、細胞内条件に近いことから、本発明のＢＡＣＥ１阻害剤のスクリーニング方法を用いて阻害剤を選択すれば、酵素反応系のみならず、培養細胞系、または動物やヒト中でもＢＡＣＥ１を阻害し、Ａβ産生を抑制する化合物が得られると期待できる。このような化合物はアルツハイマー病、軽度認知症（Ｍｉｌｄ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ、ＭＣＩ）などの治療薬となりうる。

本スクリーニング方法を用いて見出すことができるＢＡＣＥ１阻害剤の例としては、実施例として後述される”β−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＶ”などが挙げられるが、これに限定されない。スクリーニングの対象となる被験物質はどのような物質を用いても良いが、１つの実施形態として、被験物質とあわせて、公知のＢＡＣＥ１特異的阻害剤を阻害の陽性対照として用いることが好ましい。難溶性の被験物質を溶媒（ＤＭＳＯ等）に溶解させてスクリーニングに用いる場合は、被験物質を含まない溶媒のみを陰性対象とすることが好ましい。

ＢＡＣＥ１活性は当該分野において、公知または本明細書において説明する任意の手法によって測定することができる。例えば、ＢＡＣＥ１の活性は、特定条件下でのアミロイド前駆体タンパク質またはアミロイド前駆体タンパク質変異体が切断されて生じる断片（ｓＡＰＰβおよび／またはβＣＴＦ）の量で測定することができる。該スクリーニング方法において、該被験物質の非存在下でのｓＡＰＰβおよび／またはβＣＴＦの量より、該被験物質の存在下でのｓＡＰＰβおよび／またはβＣＴＦの量が少ない場合は、該被検物質をＢＡＣＥ１阻害剤として選択できる。

ｓＡＰＰβおよび／またはβＣＴＦの検出には、物理的手段、化学的手段を用いてもよいが、抗体による検出が好ましい。例えば、βＣＴＦのＮ末端（ネオエピトープ）を特異的に認識する抗体および／またはｓＡＰＰβのＣ末端（ネオエピトープ）を特異的に認識する抗体を用いることができる。

本発明のスクリーニング方法で、阻害剤の阻害活性は様々な指標で表すことができる。例えば、阻害活性を、被験物質の非存在下の切断断片（ｓＡＰＰβおよび／またはβＣＴＦ）の産生量と、被験物質の存在下の切断断片（ｓＡＰＰβおよび／またはβＣＴＦ）の産生量との比率（％など）で表すこともできる。例えば、被験物質の存在下の切断断片が被験物質の非存在下の切断断片の産生量に比べて８０％、好ましくは７０％、より好ましくは５０％である場合、被験物質を阻害剤として選択することができる。また基質濃度に依存しない阻害活性の指標として阻害定数（Ｋｉ）を用いて、被験物質の阻害活性を表すこともできる。

抗体を用いた、アミロイド前駆体タンパク質またはアミロイド前駆体タンパク質変異体、の分解産物の量の測定の好ましい例としては、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）が用いられる。ＥＬＩＳＡには、競合法、直接結合法、サンドイッチ法があるが、サンドイッチ法が望ましい。βＣＴＦのＮ末端を特異的に認識する抗体および／またはｓＡＰＰβのＣ末端を特異的に認識する抗体をキャプチャー抗体として使用する場合は、２次抗体は放射能またはＨＲＰを初めとする酵素等で標識されていることが望ましい。ＨＲＰとあわせて発色基質を用いることで機器により容易に測定することができる。定義にあるように、標識の種類はこれらに限定されない。１次抗体および２次抗体がモノクローナル抗体であることが好ましい。
また、抗体を用いたアミロイド前駆体タンパク質断片の検出法は競合法、直接吸着法やイムノメトリック法、ネフロメトリー法であってもよい。競合法では、まずマイクロプレート等に抗体を固相化する。被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原（Ｆ）と抗体と結合した標識抗原（Ｒ）とを分離する（Ｒ／Ｆ分離）。Ｒおよび／またはＦの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。直接吸着法では、まず抗原をマイクロプレート等に固相化する。抗原に１次抗体を反応させ、さらに１次抗体に対する標識した２次抗体を反応させる。この標識量を測定し、抗原量を定量する。イムノメトリック法では、例えば被検液中の抗原を固相化抗原と一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後、固相と液相を分離し、固相または液相の標識量を測定して、被検液中の抗原量を定量する。または被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、反応液を固相化抗原に加え、未反応の標識化抗体を固相に結合させた後、固相と液相を分離、固相または液相の標識量を測定して、被検液中の抗原量を定量する。ネフロメトリー法では、ゲル内または溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。

本発明の好ましい実施形態の一つとして、ＢＡＣＥ１阻害剤のスクリーニング方法を応用した、一度に大量のアッセイが可能なハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）が挙げられる。一つの化合物について、様々な濃度での阻害活性が測定でき、効率よくＢＡＣＥ１阻害剤を選択することが出来る。例えば、９６ウェル、３８４ウェル、１５３６ウェルプレート、またはそれ以上のウェルプレートに、マニュアル操作またはロボットを用いてＢＡＣＥ１、アミロイド前駆体タンパク質、バッファーおよび阻害剤を添加し、大量にアッセイすることができる。この条件に限られない。

本発明はまた、本発明のスクリーニング方法を実施するのに好適なスクリーニング用キ
ットを提供する。該キットは、例えば、ＢＡＣＥ１、アミロイド前駆体タンパク質、およびバッファーを構成として含む。検出用抗体を含んでも良い。
該キットは、さらに酵素活性の測定や化合物と酵素または基質との結合試験に必要な試薬類もしくは器具類（例えば、ＳＰＲ用センサーチップ、質量分析用プロテインチップ等）を含んでもよい。

以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。なお、本実施例において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、免疫学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものである。例えば、遺伝子工学的手法として、特に断らない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）に記載されている方法を用いた。本明細書において関連する部分が参考として援用される。

ペプチド基質を用いたＢＡＣＥ１酵素活性のｐＨ依存的変化の測定
従来から一般的に使用されるアミロイド前駆体タンパク質ペプチドを用いて、全長ＢＡＣＥ１や細胞外領域ＢＡＣＥ１の至適ｐＨを検討した。
・全長ＢＡＣＥ１の調製
全長ＢＡＣＥ１の調製のために、まずＢＡＣＥ１安定発現
ＨＥＫ２９３細胞を構築した。具体的には、ヒトＢＡＣＥ１（ＧｅｎＢａｎｋ ｄａｔａｂａｓｅｓ， ＮＣＢＩ． ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ．ＮＰ＿０３６２３６）発現プラスミドを標準的な方法を用いて構築し、そのプラスミドを
ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ （Ｒｏｃｈｅ）を用いてＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションした。その後、ＢＡＣＥ１発現細胞をネオマイシン薬剤耐性を指標に選抜し、安定発現細胞を得た。ＢＡＣＥ１の発現はウエスタンブロットにより確認した。ＢＡＣＥ１安定発現
ＨＥＫ２９３細胞を１５ｃｍ ｄｉｓｈで８０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｔとなるように培養後、細胞をＰＢＳに懸濁し、懸濁液から細胞を遠心分離し、−８０℃で保存した。１５ｃｍ ｄｉｓｈ１／２枚分の細胞に対し、ＰＢＳを５００μＬ添加した。ダウンスホモジナイザータイトで１０ストローク ホモジナイズした。そのホモジネートを１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有ＰＢＳで４０倍希釈した。
・細胞外領域ＢＡＣＥ１の調製
細胞外領域ＢＡＣＥ１として、市販のｒｈＢＡＣＥ１（Ｒ＆Ｄ）を用い、同様の反応を行なった。
・ペプチド基質の調製
アミロイド前駆体タンパク質ペプチドは、Ａｍｅｒｉｃａｎ ｐｅｐｔｉｄｅ社でカスタムメイドのペプチドを使用した。配列は以下の通り；ＳＥＶＮＬ／ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＫ（配列番号７）−ｂｉｏｔｉｎ。アミロイド前駆体タンパク質のＢＡＣＥ１切断部位からＮ末端側の５アミノ酸の配列、Ｃ末端側の１２アミノ酸の配列を含むペプチドを用いた。
・反応用プレートの調製
全長ＢＡＣＥ１は抗体固相プレートを用いて９６ｗｅｌｌプレート上に精製・固相し、このプレート上で酵素反応を行なった。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８溶液で、抗ＢＡＣＥ１抗体（ＭＡＢ５３０８、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を１μｇ／ｍＬになるように希釈した。その溶液を１００μＬ／ｗｅｌｌとなるようにＭａｘｉｓｏｒｐ ９６ｗｅｌｌプレートに添加し、室温２時間もしくは４℃終夜インキュベートした。その後、上清を捨て、０．５％ ＢＳＡ含有ＴＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ）を３００μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、室温２時間もしくは４℃終夜インキュベートした。上清を捨て、上記ＢＡＣＥ１含有溶液を１００μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、４℃終夜静置し、ＢＡＣＥ１を固相した。各ｗｅｌｌを３回以上ＰＢＳもしくはＰＢＳＴで洗浄した後に、酵素反応液、基質及び化合物を添加した。

・ＢＡＣＥ１酵素反応
酵素反応液組成は以下の通りである。５０ｍＭ ｃｉｔｒａｔｅ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ ４．６〜７．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００。Ｃｏｍｐｌｅｔｅ （ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ， Ｒｏｃｈｅ）、１０μＭ ＤＡＰＴ。
上記の酵素反応液９７μＬに対して、基質２μＬ、化合物１μＬを添加後、３７℃で２時間緩やかに振とうし、酵素反応を行った。上記の反応液中のｒｈＢＡＣＥ１の最終濃度１２．５ｎｇ／ｍＬ、ペプチド基質の最終濃度１μＭである。
・切断断片の定量
ペプチド基質の切断断片は、抗β切断ネオエピトープ抗体である８２Ｅ１（ＩＢＬ）を用いて定量した。８２Ｅ１を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０で１μｇ／ｍＬに希釈した。１００μＬ／ｗｅｌｌずつｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ｗｅｌｌ ｗｈｉｔｅ ｐｌａｔｅに添加し、室温２時間もしくは４℃終夜静置した。上清を捨て、 ０．５％ ＢＳＡ含有ＴＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ）を３００μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、室温２時間もしくは４℃終夜インキュベートした。上清を捨て、サンプルを各ウェルに添加した。標準物質としては、ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＫ（配列番号８）−ｂｉｏｔｉｎ （Ａｍｅｒｉｃａｎ ｐｅｐｔｉｄｅ）を用いた。サンプル及び標準物質の希釈には、１％ＢＳＡ含有ＴＢＳＴを用いた。サンプル及び標準物質を添加後、４℃で終夜静置した。その後、ＴＢＳＴ等で各ウェルを４回洗浄後、１％ＢＳＡ含有ＴＢＳＴで１００００倍希釈したＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ） １００μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し室温で１時間静置した。その後、各ｗｅｌｌをＴＢＳＴ等で４回洗浄後、ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ ｐｉｃｏ （ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を４５μＬずつ添加し化学発光をＡＲＶＯ （ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて測定した。

得られた結果を図２に示す。（ａ）全長ＢＡＣＥ１（ＦＬ−ＢＡＣＥ１）、（ｂ）細胞外領域ＢＡＣＥ１（ｒｈＢＡＣＥ１）のいずれを用いても、ｐＨ４．６の条件で最も高い酵素活性を示した。この結果は、従来の報告と一致する（非特許文献３）。

アミロイド前駆体タンパク質を基質としたときのＢＡＣＥ１酵素活性のｐＨ依存性の検討
生体内で実在する形の基質つまりアミロイド前駆体タンパク質の切断反応の至適ｐＨを、全長ＢＡＣＥ１と細胞外領域ＢＡＣＥ１を用いて比較検討した。
アミロイド前駆体タンパク質の調製のために、まずアミロイド前駆体タンパク質ｓｗｅ安定発現ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を構築した。具体的には、野生型ＡＰＰ６９５の配列（ＧｅｎＢａｎｋ ｄａｔａｂａｓｅｓ， ＮＣＢＩ． ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ．ＮＰ＿９５８８１７）にｓｗｅｄｉｓｈ変異を導入した発現プラスミドを標準的な方法を用いて構築した。そのプラスミドを
ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００ （ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ）を用いてヒト神経芽細胞ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞にトランスフェクションした。その後、ＡＰＰｓｗｅ発現細胞をハイグロマイシン薬剤耐性を指標に選抜し、安定発現細胞を得た。ＡＰＰ６９５の発現はウエスタンブロットにより確認した。
このアミロイド前駆体タンパク質ｓｗｅ安定発現ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を１０ｃｍ ｄｉｓｈで８０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｔとなるように培養後した。細胞をＰＢＳに懸濁し、懸濁液から細胞を遠心分離し、−８０℃で保存した。１０ｃｍ ｄｉｓｈ１枚分の細胞に対し、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有ＰＢＳを１００μＬ添加し、３０分間 ４℃で転倒混和後、１６０００×ｇ ４℃ １０分遠心した。その上清に対し、２０μＬ ｈｅｐａｒｉｎ ｂｅａｄｓを添加し４℃で終夜転倒混和した。ｈｅｐａｒｉｎ ｂｅａｄｓをＰＢＳで３回洗浄後、溶出液２０ｍＭ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ １．５Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．４ ２００μＬをビーズに添加し３０分間 ４℃で転倒混和した。その後、スピンカラムを用いてビーズのみを除去し、溶出液を得た。その溶出液を、脱塩カラム（Ｚｅｂａ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎ ７ｋＭＷＣＯ，ＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて脱塩し、基質溶液とした。
全長ＢＡＣＥ１，細胞外領域ＢＡＣＥ１、酵素反応液の調製法および反応条件は全て実施例１と同じである。
切断断片の定量には、ＩＢＬ社βＣＴＦ ＥＬＩＳＡを用いた。酵素反応液の一部を用い、キット添付の操作手順書に従い定量を実施した。
得られた結果を図３に示す。（ａ）全長ＢＡＣＥ１（ＦＬ−ＢＡＣＥ１）、（ｂ）細胞外領域ＢＡＣＥ１（ｒｈＢＡＣＥ１）のいずれを用いても、予想外にもｐＨ６．２の条件で最も高い酵素活性を示した。実施例１の結果と合わせて考えると、生体内における全長ＢＡＣＥ１によるアミロイド前駆体タンパク質切断反応の至適ｐＨは６．２付近であること、この反応の至適ｐＨは酵素の構造や長さの違いよりも基質のそれに大きく依存することが示された。

全長ＢＡＣＥ１によるアミロイド前駆体タンパク質切断反応のｐＨ依存性の詳細な検討
全長ＢＡＣＥ１によるアミロイド前駆体タンパク質切断反応の至適ｐＨをより詳細に解析するために、反応液のｐＨを０．２または０．３おきに変化させたときの酵素活性変化を測定した。
実施例２と同様の方法で各ｐＨの反応液を用いたときの酵素活性を定量した。その結果を図４に示す。ｐＨ６．１付近で酵素活性が最大であり、ｐＨ５．１〜６．８までの条件で酵素活性が認められた。

全長ＢＡＣＥ１によるアミロイド前駆体タンパク質切断反応に対するＢＡＣＥ１阻害剤の阻害活性
本発明で確立されたアッセイ系において、生体の環境でも阻害活性を有するＢＡＣＥ１阻害剤である−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＶ（非特許文献３、ＣＡＳ ｎｕｍｂｅｒ ７９７０３５−１１−１）の活性を検討した。
図５（ａ）に示す化合物を反応液に添加したときの、アミロイド前駆体タンパク質に対する全長ＢＡＣＥ１の酵素活性を実施例２、３と同様の方法で測定した。その結果を図５（ｂ）に示す。β−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＶの用量依存的に酵素活性が阻害されることが示された。このことから、アミロイド前駆体タンパク質と全長ＢＡＣＥ１を用いたアッセイ系を用いて化合物の阻害活性評価を行うことが可能であることが示された。

全長ＢＡＣＥ１によるアミロイド前駆体タンパク質とペプチドの切断効率比較
アミロイド前駆体タンパク質とアミロイド前駆体タンパク質ペプチドをそれぞれ基質として用いた場合（１〜１５ｎＭの濃度範囲内）の、全長ＢＡＣＥ１活性を比較した。反応時間を１時間に、ペプチド基質を用いた場合はｐＨ４．１に，アミロイド前駆体タンパク質を基質として用いた場合はｐＨ６．２で反応を行い、その他の条件は実施例２、３と同様の方法で切断効率を測定した。その結果を図６に示す。ペプチド基質切断効率と比較して、アミロイド前駆体タンパク質切断効率の方が顕著に高いことが示された。
このことから、従来法においては生体内に比べ高濃度のペプチド基質を用いる必要があるが、本発明のアミロイド前駆体タンパク質を用いたアッセイ方法は、低濃度基質で高活性を示すといえる。従って、従来法に比べ、本発明のアッセイ方法は、ｐＨのみならず基質濃度についても、より生理的条件に近い条件でアッセイできることが示された。

本発明は、ＢＡＣＥ１阻害剤を高感度で正確に評価するアッセイ方法を提供する。このような方法は、医薬品・製薬産業において有用である。たとえば、ＢＡＣＥ１が関与する疾患であるアルツハイマー病の治療薬の探索に利用できる。

配列番号１：シグナルペプチドを有しないＡＰＰ６９５のアミノ酸配列を示す。
配列番号２：ＡＰＰ６９５のアミノ酸配列を示す。
配列番号３：シグナルペプチドを有しないＡＰＰ７５１のアミノ酸配列を示す。
配列番号４：ＡＰＰ７５１のアミノ酸配列を示す。
配列番号５：シグナルペプチドを有しないＡＰＰ７７０のアミノ酸配列を示す。
配列番号６：ＡＰＰ７７０のアミノ酸配列を示す。
配列番号７：ペプチド基質のアミノ酸配列を示す
配列番号８：βＣＴＦのＮ末端部分のアミノ酸配列を示す。
配列番号９：ＢＡＣＥ１の２２−４６０位のアミノ酸配列を示す。
配列番号１０：ＢＡＣＥ１の４６−４５８位のアミノ酸配列を示す。

Claims (4)

1. （１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むアミロイド前駆体タンパク質、または
   配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸を有する配列を含み、ＢＡＣＥ１により切断される、アミロイド前駆体タンパク質変異体、
   を、ｐＨ５．４〜６．８の条件下でＢＡＣＥ１と接触させる工程、および
   （２）前記アミロイド前駆体タンパク質または前記アミロイド前駆体タンパク質変異体、の分解産物の量を測定する工程、
   を含むＢＡＣＥ１活性測定方法。
2. 前記アミロイド前駆体タンパク質または前記アミロイド前駆体タンパク質変異体、の分解産物が、βＣＴＦまたはｓＡＰＰβである、請求項１に記載のＢＡＣＥ１活性測定方法。
3. （１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むアミロイド前駆体タンパク質、または
   配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸を有する配列を含み、ＢＡＣＥ１により切断されるアミロイド前駆体タンパク質変異体、
   を、被験物質の存在下、ｐＨ５．４〜６．８の条件下でＢＡＣＥ１と接触させる工程、
   （２）前記アミロイド前駆体タンパク質または前記アミロイド前駆体タンパク質変異体、の分解産物の量を測定する工程、および
   （３）前記分解産物を、被験物質の非存在下でのアミロイド前駆体タンパク質またはアミロイド前駆体タンパク質変異体、の分解産物の量と比較する工程、
   を含むＢＡＣＥ１阻害剤のスクリーニング方法。
4. 前記アミロイド前駆体タンパク質または前記アミロイド前駆体タンパク質変異体、の分解産物が、βＣＴＦまたはｓＡＰＰβである、請求項３に記載のＢＡＣＥ１阻害剤のスクリーニング方法。

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