JP5295229B2 - Aβオリゴマー測定法 - Google Patents
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Description
近年、アミロイドβ(Aβ)ペプチドのオリゴマーの、神経性疾患(例、アルツハイマー病、MCI(mild cognitive impairment)、ダウン症候群)における役割が議論されており、Aβ(1−42)のオリゴマーが病原性の構造原理であり、その形成がアルツハイマー病の初期の病理的イベントであることが報告されている(Journal of Neurochemistry,2005,95,834−847)。
また、比較的高分子量のオリゴマー、特に12量体が記憶の損傷に、より大きな影響を与えることが報告されている(Vol440,Number 7082,2006,p.352−357,nature)。
したがって、Aβオリゴマーの測定方法の開発は、アルツハイマー病の初期の診断、およびAβオリゴマーの治療薬の開発等に有効であることが期待される。
Aβオリゴマーは、ウエスタンブロット法により測定することができるが、ウエスタンブロット法では多くの検体を分析することが困難なので、ELISA法によるAβオリゴマーの測定法の開発が望まれている。
また、非特許文献2には、抗体6E10を用いたサンドイッチEIAで、Aβオリゴマーを検出した例が記載されている。
また、非特許文献3には、抗体2F12または抗体6E10を用いたサンドイッチEIAで、Aβオリゴマーを検出した例が記載されている。
また、非特許文献4には、抗体2F12を用いたサンドイッチEIAで、オリゴマーを検出した例が記載されている。
また、非特許文献5には、抗体2F12を用いたサンドイッチEIAで、オリゴマーを検出した例が記載されている。
すなわち本発明は、
[1]
下記の工程:
(a)不溶性担体に結合している、配列番号:1で表されるアミノ酸配列からなる部分ペプチドを認識するモノクローナル抗体(第1抗体)に、Aβオリゴマーを含有している可能性がある試料を接触させて、第1抗体にAβオリゴマーを結合させる工程;および
(b)工程(a)で第1抗体に結合したAβオリゴマーに、標識化された、配列番号:1で表されるアミノ酸配列からなる部分ペプチドを認識するモノクローナル抗体(第2抗体)を反応させる工程
を含む、Aβオリゴマーの測定方法;
[2]
配列番号:1で表されるアミノ酸配列からなる部分ペプチドを認識するモノクローナル抗体がBAN50aである上記[1]記載の方法;
[3]
Aβオリゴマーが9量体以上である上記[1]記載の方法;
[4]
Aβオリゴマーが12量体以上である上記[1]記載の方法;
[5]標識化されたモノクローナル抗体(第2抗体)がFabフラグメント化されている上記[1]記載の方法;
[6]
Aβオリゴマーが、Aβ(1−40)、Aβ(1−42)、もしくはAβ(1−43)、もしくはそれらのN末短縮体、またはそれらの修飾体あるいはそれらの混合物のオリゴマーである上記[1]記載の方法;
[7]
(a)不溶性担体に結合している、モノクローナル抗体BAN50a(第1抗体);および
(b)標識化されたモノクローナル抗体BAN50a(第2抗体)
を含有する、Aβオリゴマーの測定キット;
[8]
Aβオリゴマーが関与する神経性疾患の診断薬である、上記[7]記載の測定キット;
[9]
上記[7]記載の測定キットを用いてAβオリゴマーを測定することを特徴とする、Aβオリゴマー形成を阻害する化合物の探索方法;
[10]
上記[7]記載の測定キットを用いてAβオリゴマーを測定することを特徴とする、A
βオリゴマーが関与する神経性疾患の診断方法;
[11]
上記[7]記載の測定キットを用いてAβオリゴマーを測定することを特徴とする、Aβオリゴマーが関与する神経性疾患の治療方法;
等を提供するものである。
本発明のAβオリゴマーの測定方法では、配列番号:1で表されるアミノ酸配列からなる部分ペプチドを認識するモノクローナル抗体を用いる。
配列番号:1は、Aβ(1−16)のアミノ酸配列である。
[配列番号:1]
Asp−Ala−Glu−Phe−Arg−His−Asp−Ser−Gly−Tyr−Glu−Val−His−His−Gln−Lys
モノクローナル抗体BAN50aは、国際公開WO94−17197号パンフレットに記載された公知の抗体であり、当該特許文献に記載の方法で製造することができる。また、モノクローナル抗体BAN50aは、特許生物寄託センター(旧通商産業省工業技術院生命工学技術研究所)に受託番号FERM BP4163で寄託されているハイブリドーマを用いて、公知の方法により製造することができる。
工程(a):不溶性担体に結合している、配列番号:1で表されるアミノ酸配列からなる部分ペプチドを認識するモノクローナル抗体(第1抗体)に、Aβオリゴマーを含有する試料を接触させて、第1抗体にAβオリゴマーを結合させる工程。
工程(b):工程(a)で第1抗体に結合したAβオリゴマーに、標識化された、配列番号:1で表されるアミノ酸配列からなる部分ペプチドを認識するモノクローナル抗体(第2抗体)を反応させる工程。
当該不溶化(固定化)においては、物理吸着を用いてもよく、また通常蛋白質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。例えば、ビオチン−(ストレプト)アビジン系が好ましく用いられる。本発明に用いられる担体としては、例えば、アガロース、デキストラン、およびセルロースなどの不溶性多糖類;ポリスチレン、ポリアクリルアミド、およびシリコンなどの合成樹脂;およびガラスが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
不溶性担体に、前記「配列番号:1で表されるアミノ酸配列からなる部分ペプチドを認識するモノクローナル抗体」を結合させたのち、所望により、市販のブロッキング剤を用いて、ブロッキング処理を行ってもよい。
当該標識化に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素(例:西洋ワサビ ペルオキシダーゼ(horse−radish peroxidase;HRP))、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば125I、131I、3H、14Cなどが挙げられる。酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えばβ−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素が挙げられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、およびフルオレッセンイソチオシアネートが挙げられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンが挙げられる。標識化されるモノクローナル抗体としては、モノクローナル抗体のIgG、Fabフラグメント、Fab’フラグメントまたはF(ab’)2フラグメント(好ましくは、FabフラグメントまたはFab’ フラグメント)を用いることができる。例えば、西洋ワサビ ペルオキシダーゼで標識する場合、モノクローナル抗体のIgGまたはFabフラグメントに西洋ワサビ ペルオキシダーゼを常法により結合させればよい。
[方法1]
Aβ1−42(例えば、ペプチド研究所から入手可能である)を1mMの濃度になるようにHFIPにて溶解し、エッペンドルフチューブに10μLとなるように分注し、エバポレータにて乾燥させる。その後、−30℃以下に冷凍保存する。凍結保存合成Aβペプチドを、DMSO(ジメチルスルフォキシド)で、10μLとなるように溶解後、更に生理的なバッファー(リン酸緩衝液;PBS、DMEM(ダルベッコ改変培地)、F12培地など)を用いて最終濃度が10μMの濃度になるように溶解し、氷冷室等で一定時間(例、一昼夜)、インキュベーションする。
[方法2]
Aβオリゴマーが関与する神経性疾患(例、アルツハイマー病、MCI、ダウン症候群)に罹患している(または、その可能性がある)対象、老齢者、またはアルツハイマー病原因遺伝子過剰発現トランスジェニックマウス等に由来する生体試料(例、脳の一部、生物の血液、脳脊髄液)を、氷冷下で、例えばプロテアーゼ阻害剤カクテルを含むTrisバッファーで抽出することにより、測定用サンプルとする。
本発明の方法は、好ましくは、9量体以上の高分子(例、約40kd〜200kd)オリゴマー(特に好ましくは12量体以上(例、12量体〜32量体)のオリゴマー)を含有する(または、その可能性がある)試料の分析に、好適に用いられる。
ついで、標識剤の種類に応じて、標識剤のシグナルを測定することにより、試料中のAβオリゴマーを測定する。
〔Aβ(1−40)〕配列番号:2
Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val
〔Aβ(1−42)〕配列番号:3
Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala
〔Aβ(1−43)〕配列番号:4
Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-Thr
〔Aβ(3−40)〕配列番号:5
Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val
〔Aβ(3−42)〕配列番号:6
Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala
〔Aβ(3−43)〕配列番号:7
Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-Thr
(a)不溶性担体に結合している、モノクローナル抗体BAN50a(第1抗体);および
(b)標識化されたモノクローナル抗体BAN50a(第2抗体)
を含有する、Aβオリゴマーの測定キット
もまた提供する。
(a)不溶性担体に結合している、モノクローナル抗体BAN50a(第1抗体);および
(b)標識化されたモノクローナル抗体BAN50a(第2抗体)
に加えて、ELISA法に必要な各種試薬や器具を備えていてもよい。
当該キットは、本発明の測定方法の実施のために使用することができ、9量体以上の高分子(約40kd〜200kd)オリゴマー(特に好ましくは、12量体以上(例、12量体〜32量体)のオリゴマー)を選択的に測定することができる。
例えば、
(1)初代神経細胞の培養液に被検化合物を添加した後、その培養上清中のAβオリゴマーの量を、本発明の測定方法または本発明の測定キットを用いて測定し、その量を低下させる活性のある化合物を選択すること、または
(2)被検化合物を投与した動物の脳内のAβオリゴマーの量を、本発明の測定方法または本発明の測定キットを用いて測定し、その量を低下させる活性のある化合物を選択することによって、Aβオリゴマー形成を阻害する化合物の探索(スクリーニング)をすることができる。
例えば、本発明の測定方法、または本発明の測定キットを用いて、Aβオリゴマーを測定することにより、Aβオリゴマーが関与する神経性疾患の診断を行なう事ができる。すなわち、本発明の測定キットは、Aβオリゴマーが関与する神経性疾患の診断薬として用いる事ができる。
具体的には、例えば、本発明の測定方法、または本発明の測定キットを用いて、対象の脳脊髄液中のAβオリゴマー量を測定することにより、Aβオリゴマーが関与する神経性疾患の罹患の有無、および病態進行度を診断することができる。
すなわち、本発明の測定方法、および本発明の測定キットは、Aβオリゴマーが関与する神経性疾患の予防または治療のための医薬の治療効果のモニター、または治験薬の評価に使用することができる。
さらに、本発明の方法、または本発明の測定キットを用いてAβオリゴマーが関与する神経性疾患に罹患した患者の脳脊髄液等の中のAβオリゴマーを測定することにより、その患者にとってより適当な治療方法を選択するオーダーメード治療も可能となる。
HRP:西洋ワサビペルオキシダーゼ(horseradish peroxidase
)
下記の実施例において、各ELISAは、以下のバッファーを用いて実施した。
[バッファー]
コーティングバッファーA
(0.1M 炭酸バッファー、pH9.6)
ブロッキングバッファーB
(25% Block Ace in PBS)
バッファー C
(pH7.0、20mM リン酸バッファー、10% Block Ace、0.2% BSA、0.05% Merthiolate(商標) Na(チメロサール)、400mM NaCl、0.076% CHAPS、2mM Na2EDTA、56℃ 30分加熱処理後、冷室保存)
BAN50aおよびHRP標識化BAN50aを用いたELISA(オリゴマーAβの定量)を、以下のステップで実施した。
(1)BAN50a抗体を10μg/ml(75μl/well)の濃度でコーティングバッファーAに溶かし、EIA96ウェルプレート(high maximum binding clear plate、Greiner社)に添加後、一昼夜、冷蔵室(約4℃)でインキュベーションした。
(2)PBS(カルシウム,マグネシウム・フリー;以下、PBS(−)と略記載する場合がある)で3回洗浄し、ブロッキングバッファーBを100μL/wellとなるように添加し、保存した。
(3)実験日に、ブロッキングバッファーBを捨て、PBS(−)で2回洗浄し、25μlのバッファーCを添加した。
(4)スタンダードモノマーAβ1−42[Aβ1−42 TFA塩(ペプチド研究所)をDMSOに1mMとなるように溶解し、さらにF12培地(GIBCO)で10μMに希釈して1mlずつ分注して冷室(約−4℃)に一昼夜静置した溶液(当該溶液中には、オリゴマーが形成されている)を、バッファーCにてスタンダードのモノマー濃度換算値として、1μM溶液になるように希釈し分注後、−80℃で保存した。使用時に、分注した1μM溶液を、サンプルバッファーで2倍希釈系列(Aβ1−42濃度換算で10〜0.0097nM)を作成しスタンダードとして用いた。]を含む溶液は、バッファーCにてAβのモノマー相当濃度として100nM濃度から2倍希釈系列で0.390625nMまで準備した。サンプルを適当な濃度で希釈して、検量線の中に入ることを確認し、プレートに100μL/wellとなるように添加した。
(5)一昼夜、サンプルを冷蔵室(約4℃)にてインキュベーションした。
(6)プレートをPBS(−)で4回洗浄した。
(7)二次抗体として、HRP標識化BAN50a(生体内試料を測定する場合(すなわち、in vivoの場合)はFab'−HRP)を5000倍希釈にバッファーDにて希釈溶解し75μL/wellとなるように添加した。これらの2次抗体は、専門業者(和光純薬)に依頼して、製造を行った。
(8)室温にて3時間以上インキュベーションした。
(9)プレートをPBS(−)で6回洗浄した。
(10)各プレートにTMB基質(Kirkegaard&Perry社)が75μl/wellとなるように添加し、室温でインキュベーションした。
(11)その後、反応した基質溶液に1Mリン酸溶液(75μl/well)を添加し、反応を停止させ、マルチラベルカウンター(PerkinElmer社)によって、OD450を測定した。
以下の方法で、被試験化合物のオリゴマー形成への影響を調べた。
(1)Aβ1−42をDMSOで溶解し、300μMとした。
(2)適当な組成の反応液を調製して、チューブに入れた。
[反応液の組成の例(Aβ1−42の最終反応溶液中のAβ1−42濃度が3μM、化合物が3μM)]
Aβ1−42 (300μM) 1μL
クルクミン溶液(300μM) 1μL
F12培地 98μL
計 100μL
(3)チューブを4℃で一昼夜インキュベーションした。
(4)反応液をバッファーC(前述)にて100倍希釈し、前述のELISAにて測定した。
(5)Vehicle群を100%として、阻害率を算定した。
実施例1のELISA系によって認識されるオリゴマーAβの分子種を同定した。Aβ1−42 TFA塩(ペプチド研究所)をDMSOに1mMとなるように溶解し、更に、10μMの濃度になるようにF−12培地に溶解し、4℃で一昼夜、インキュベーション処理した。その後、本サンプルをろ過膜(0.45μm)で前処理した後、ゲルろ過カラムに300μL注入した。ゲルろ過は、Waters社のAllianceシステムで、Biosuite 450,125の2本を組み合わせ、PBS(−)を溶出バッファーとして1mL/minの速度で、氷冷室にて溶出させた。また、分子量のキャリブレーションに、Amersham社の低分子量、高分子量の2つのマーカーセットを用いた。キャリブレーションは、エクセル(マイクロソフト社)で、Log(分子量)をY軸に、溶出時間をX軸にしてプロットすることで実施した。タンパク質の量は、OD=280nmでモニターした(図1)。また、溶出で分画したサンプル液を、Buffer Cで10倍以上希釈し、実施例1のELISA系を用いて、分析した。その結果、実施例1のELISA系では、モノマーおよび比較的低分子のオリゴマー(2mer〜6mer)は検出されず、17分から19分に溶出した高分子オリゴマー(12mer〜32mer)が高い感度で検出された(図2)。
実施例2に従って、オリゴマーAβの形成を阻害することが知られているクルクミン(Curcumin)による高分子オリゴマーAβ形成阻害を分析した。クルクミンの濃度を変えてAβ42溶液に添加後、実施例1のELISAを用いて、クルクミンのオリゴマーAβ形成への影響を検討した。その結果、オリゴマーAβのシグナルが特異的に低下した。結果を図2に示す。対照のため、モノマーを認識する、BAN50a−HRP標識化BC05aやBNT77a−HRP標識化BC05aのELISAでの同様の分析(Asami-Odaka A, Ishibashi Y, Kikuchi T, Kitada C, Suzuki N., Long amyloid beta-protein secreted from wild-type human neuroblastoma IMR-32 cells. Biochemistry. 1995 Aug 15;34(32):10272-8. )に記載の方法に準じて行った。)の結果も、あわせて、図3に示す。
BAN50a抗体を10μg/mlの濃度で0.1M炭酸バッファー(pH9.6)に溶解し、96−well ポリスチレンプレート(FLUOTRAC(商標) 600、Greiner Bio−One社)に添加(75μl/well)後に4℃で24時間インキュベートした。プレートをPBS(−)(Ca,Mg−free PBS、DULBECCO'S PBS、大日本住友製薬ラボラトリープロダクツ部)で3回洗浄し、ブロッキングバッファー(PBS(−)/0.8% BlockAce(大日本住友製薬ラボラトリープロダクツ部)/0.01% Merthiolate Na)を100μl/wellになるように添加して4℃で保存した。実験日にブロッキングバッファーを捨てて、PBS(−)で2回洗浄し、25μlのサンプルバッファー(0.02M リン酸バッファー/0.4% BlockAce/0.2% BSA/0.05% Merthiolate Na/0.4M NaCl/0.076% CHAPS/2mM Na2EDTA)を各wellに添加した。アルツハイマー病患者髄液(コントロールとしては健常者髄液)をプロテアーゼインヒビター(complete,Mini、Roche Diagnostics社)を加えた(1タブレット/5ml)2倍濃度のサンプルバッファーで2倍に希釈し、各wellに100μlずつ添加した。また、Aβ1−42 TFA塩(ペプチド研究所)をDMSOに1mMとなるように溶解し、さらにF12培地(GIBCO)で10μMに希釈して1mlずつ分注して冷室(約−4℃)に一昼夜静置したものバッファーCにて1μM溶液に希釈し分注後、−80℃で保存。使用時に、分注した1μM溶液を、サンプルバッファーで2倍希釈系列(Aβ1−42モノマー濃度換算で2.5〜0.0097nM)を作成しスタンダードとして用いた。すなわち、毎回の実験で全く同様の手順で作成したAβ1−42溶液(2倍希釈系列,100μl/well)中に存在するAβ42オリゴマーをスタンダードとして用いた。バッファーCで希釈したサンプル及びスタンダード溶液を添加したプレートを4℃で24時間保存した後に、PBS(−)で4回洗浄し、HRP標識BAN50a抗体(1000〜5000倍希釈液)を100μl/wellになるように添加して室温で3時間インキュベートした。インキュベーション後にプレートをPBS(−)で6回洗浄した後に、化学発光基質(SuperSignal ELISA Femto、PIERCE社)を100μl/wellで添加して、ルミノメーター(SpectraMax L(商品名)、Molecular Devices社)で発光強度を定量した。検量線の結果を図4に、脳脊髄液サンプル測定の結果を図5に示す。図5に示されるように、当該方法により、アルツハイマー病患者および健常者の髄液中のAβオリゴマー濃度を、有意に区別できた。
Claims (9)
- 下記の工程:
(a)不溶性担体に結合している、配列番号:1で表されるアミノ酸配列からなる部分ペプチドを認識するモノクローナル抗体(第1抗体)に、Aβオリゴマーを含有している可能性がある試料を接触させて、第1抗体にAβオリゴマーを結合させる工程;および
(b)工程(a)で第1抗体に結合したAβオリゴマーに、標識化された、配列番号:1で表されるアミノ酸配列からなる部分ペプチドを認識するモノクローナル抗体(第2抗体)を反応させる工程
を含む、Aβオリゴマーの測定方法であって、
第1抗体がBAN50aであり、且つ第2抗体が標識化されたBAN50aである方法。 - Aβオリゴマーが9量体以上である請求項1記載の方法。
- Aβオリゴマーが12量体以上である請求項1記載の方法。
- 標識化されたモノクローナル抗体(第2抗体)がFabフラグメント化されている請求項1記載の方法。
- Aβオリゴマーが、Aβ(1−40)、Aβ(1−42)、もしくはAβ(1−43)、もしくはそれらのN末短縮体、またはそれらの修飾体あるいはそれらの混合物のオリゴマーである請求項1記載の方法。
- (a)不溶性担体に結合している、モノクローナル抗体BAN50a(第1抗体);および
(b)標識化されたモノクローナル抗体BAN50a(第2抗体)
を含有する、Aβオリゴマーの測定キット。 - Aβオリゴマーが関与する神経性疾患の診断薬である、請求項6記載の測定キット。
- 請求項6記載の測定キットを用いてAβオリゴマーを測定することを特徴とする、Aβオリゴマー形成を阻害する化合物の探索方法。
- 請求項6記載の測定キットを用いてAβオリゴマーを測定することを特徴とする、Aβオリゴマーが関与する神経性疾患の罹患の有無又は病態進行度を試験する方法。
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