WO2021100744A1 - アミロスフェロイド（ＡＳＰＤ）の代替物となりうるアミロイドβタンパク質（Ａβ）の架橋体、及びＡＳＰＤの分析 - Google Patents

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星美奈子
荒井由江
町田清隆
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    • G01N2800/2821—Alzheimer

Definitions

  • the present disclosure relates to the analysis of cross-linked A ⁇ protein (A ⁇ ), cross-linked A ⁇ that can be a substitute for amyloid ⁇ protein (ASPD), and ASPD.
  • a ⁇ cross-linked A ⁇ protein
  • a ⁇ cross-linked A ⁇ that can be a substitute for amyloid ⁇ protein
  • ASPD amyloid ⁇ protein
  • Amylospheroids (a mylo sp heroi d s ( ASPD)) is amyloid ⁇ protein (A [beta]) is an A [beta] aggregates of spherical about 30 gathered diameter of about 10 ⁇ 15 nm, it occurs neuronal cell death in Alzheimer's disease It is a structure that is considered to play an important role in the above.
  • ASPD was isolated as an in vitro synthesized A ⁇ aggregate (that is, synthetic ASPD) showing strong neurotoxicity (Non-Patent Document 1).
  • Specific antibodies to this synthetic ASPD were produced (Patent Documents 1 and 2), and using this antibody, ASPDs actually formed in vivo (that is, native ASPDs) were produced from the brains of human patients with Alzheimer's disease. Isolated (Non-Patent Document 1).
  • NAK ⁇ 3 the synaptic protein
  • ASPD binding reduces the function of NAK ⁇ 3, and it has been clarified that nerve cells are overexcited, resulting in death of nerve cells (Patent Document 3 and Non-Patent Document 2).
  • Nerve cell loss is the most correlated with clinical symptoms in Alzheimer's disease.
  • the amount of native ASPD in the cerebral cortex of Alzheimer's disease patients with neuronal loss increased in correlation with the severity of Alzheimer's disease, and the amount of native ASPD in the cerebellum of Alzheimer's disease patients with less neuronal loss was It became clear that only a small amount was present (Non-Patent Document 3). Therefore, amylospheroids are thought to play an important role in the irreversible stage of development of Alzheimer's disease.
  • native ASPD has also been detected in the brains of patients with dementia with Lewy bodies (Non-Patent Document 3), and ASPD is considered to play an important role in the onset of dementia with Lewy bodies.
  • Synthetic ASPD which is considered to be equivalent to native ASPD, can be produced by slowly stirring a liquid containing A ⁇ (Non-Patent Documents 1 and 4).
  • a cell-secreting ASPD-like structure considered to be equivalent to native ASPD can be secreted from, for example, CHO cells expressing a predetermined APP protein, and can be obtained from the culture supernatant of the CHO cells. (Patent Document 5).
  • amylospheroids play an important role in Alzheimer's disease and Lewy body dementias.
  • ASPD amylospheroids
  • a standard substance When analyzing (including measuring) a substance, a standard substance (standard) is usually required. Standard materials are used, for example, in calibration and the creation of calibration curves. Native ASPD, synthetic ASPD, and cell-secreting ASPD-like structures can be used as reference materials for the analysis of ASPD. On the other hand, as a standard substance for a diagnostic kit, it is desired that stable production is possible, storage stability is excellent, and production cost is low. Native ASPD, synthetic ASPD, and cell-secreting ASPD-like structure have problems as standard substances of kits for analyzing ASPD from the viewpoints of ease of manufacture, storage stability, manufacturing cost, and the like. Therefore, the present disclosure, in one aspect, provides a substance that can be a substitute for ASPD, or a substance that can be a standard substance for ASPD in the analysis of ASPD.
  • the present disclosure also provides, in another aspect, a method capable of analyzing ASPD in a biological sample, such as blood or cerebrospinal fluid.
  • the present disclosure is, in one aspect, a substance that competes with ASPD for an ASPD-specific antibody, wherein A ⁇ is crosslinked by a cross-linking agent, wherein the cross-linking agent has a spacer arm length of 4 ⁇ or more and 50 ⁇ or more.
  • the present disclosure is, in other embodiments, a cross-linked product of A ⁇ , wherein A ⁇ is a cross-linking agent having a spacer arm length of 4 ⁇ or more and 50 ⁇ or less, or an oxyethylene group of 1 or more and 13 or less as a spacer arm and / or oxy.
  • a ⁇ is a cross-linking agent having a spacer arm length of 4 ⁇ or more and 50 ⁇ or less, or an oxyethylene group of 1 or more and 13 or less as a spacer arm and / or oxy.
  • the present invention relates to a crosslinked product which is crosslinked by a crosslinking agent having a propylene group.
  • the present disclosure comprises the following steps: (1) When a biological sample that may contain ASPD is brought into contact with an antibody (first antibody) that is bound to an insoluble carrier and can bind to ASPD, and ASPD is contained. A step of binding ASPD to the first antibody; and (2) including a step of reacting the ASPD bound to the first antibody in step (1) with an anti-ASPD monoclonal antibody (second antibody).
  • the present invention relates to a method for analyzing ASPD, wherein the first antibody is a humanized anti-ASPD monoclonal antibody huASD2 or a monoclonal antibody BAN50a, and the second antibody is an anti-ASPD monoclonal antibody mASD3 or a labeled antibody thereof.
  • a substance that can be a substitute for ASPD or a substance that can be a standard substance for ASPD in the analysis of ASPD can be provided. Further, according to the present disclosure, in another aspect, it is possible to provide a method capable of analyzing ASPD in a biological sample, for example, blood or cerebrospinal fluid.
  • FIG. 1 is an example of the results of performing SDSPAGE of A ⁇ crosslinked products 1 to 3.
  • FIG. 2 is a schematic diagram illustrating an embodiment of CLEIA [anti-ASPD polyclonal antibody / mASD3] of ASPD.
  • FIG. 3 is an example of a graph showing the results of comparing the reactivity of ASPD in CLEIA with ASPD and A ⁇ crosslinked products 1 to 3.
  • FIG. 4 is an example of a graph showing the results of comparing the reactivity of commercially available A ⁇ oligomer ELISA and ASPD in CLEIA with A ⁇ crosslinked product 1, ASPD, and A ⁇ 1-16 dimer.
  • FIG. 1 is an example of the results of performing SDSPAGE of A ⁇ crosslinked products 1 to 3.
  • FIG. 2 is a schematic diagram illustrating an embodiment of CLEIA [anti-ASPD polyclonal antibody / mASD3] of ASPD.
  • FIG. 3 is an example of a graph showing the results of comparing the re
  • FIG. 5 is an example of the result of confirming the immunity of A ⁇ crosslinked body 1, and is a result showing that the serum of a rabbit immunized with A ⁇ crosslinked body 1 reacts with the immobilized synthetic ASPD. ..
  • FIG. 6 is an example of a graph of the results of plotting the measured values of ASPD by CLEIA of diluted samples of human CSF to which ASPD was added (dilution ratios 1-fold, 1/2, 1/4, and 1/8).
  • FIG. 7 is a graph of the results of plotting the measured values of ASPD by CLEIA of diluted samples of human plasma to which ASPD was added (dilution ratios 1-fold, 1/2, 1/4, 1/8, and 1/16). This is an example.
  • FIG. 8 is a schematic diagram illustrating an embodiment [huASD2 / mASD3] of CLEIA of ASPD.
  • FIG. 9 is an example of a graph of the results of measuring four independent ASPD-containing samples with CLEIA [huASD2 / mASD3] of ASPD.
  • FIG. 10 is a schematic diagram illustrating an embodiment of the ASPD CLEIA [huASD2 / biotinylated mASD3].
  • FIG. 11 is an example of a graph of the results of measuring an ASPD-containing sample with CLEIA [huASD2 / biotinylated mASD3] of ASPD.
  • FIG. 12 is an example of a graph of the results of detecting ASPD and MAP16 by the CLEIA [huASD2 / biotinylated mASD3] system and the [BAN50 / biotinylated BAN50] system of ASPD.
  • FIG. 13 is an example of the results of comparing the results of a human plasma sample (dilution ratio 1/4) and a buffer sample with various [first antibody / second antibody] combinations.
  • FIG. 14 shows an example of the results of performing ASPD CLEIA [huASD2 / biotinylated mASD3] on 10 plasma samples of patients diagnosed with Alzheimer's disease (AD) and 10 plasma samples of healthy subjects. ..
  • the present disclosure is based on the finding that, in one aspect, a crosslinked form of A ⁇ crosslinked with a predetermined crosslinker exhibits similar reactivity to ASPD to an ASPD-specific antibody.
  • the present disclosure is based on the finding that, in other embodiments, ASPD in a biological sample can be efficiently analyzed by a combination of predetermined antibodies.
  • ASPD may include native ASPD, synthetic ASPD, and cell-secreting ASPD-like structure.
  • Antibodies specific for ASPD include polyclonal anti-ASPD antibodies and monoclonal anti-ASPD antibodies disclosed in WO2006 / 016644 and WO2009 / 057664 in one or more embodiments, and in one or more embodiments.
  • Rabbit polyclonal anti-ASPD antibody rpASD1, rpASD2 and rpASD3
  • mouse monoclonal anti-ASPD antibody mASD1, mASD2 and mASD3
  • hamster monoclonal anti-ASPD antibody haASD1, haASD2, haASD3, haASD4 and haASD5
  • humanized Antibodies huASD2 and the like
  • a ⁇ is a protein consisting of a sequence corresponding to a part of amyloid precursor protein (APP), and is a protein having a peptide sequence cut out from APP by ⁇ -selectase and ⁇ -selectase in vivo.
  • APP amyloid precursor protein
  • a ⁇ is simply referred to as A ⁇ 38 (A ⁇ 1-38), A ⁇ 39 (A ⁇ 1-39), A ⁇ 40 (A ⁇ 1-40), A ⁇ 41 (A ⁇ 1-41), A ⁇ 42 (A ⁇ 1-42), A ⁇ 43 (A ⁇ 1-43). ), Or all or part of these.
  • the term A ⁇ may include human A ⁇ and non-human mammal A ⁇ .
  • Human APPs include splicing variants such as hAPP770, hAPP751 and hAPP695 in one or more embodiments.
  • hAPP770 NCBI accession number NP_000475 (VERSION NP # 000475.1 GI: 4502167)), but is not limited to this.
  • the N-terminal amino acid of human A ⁇ corresponds to the 672nd amino acid D (aspartic acid) of hAPP770.
  • the term A ⁇ may include wild-type and mutant A ⁇ .
  • the mutant A ⁇ includes, in one or more embodiments, having a sequence of peptides excised from the mutant APP.
  • Mutant APPs include mutations linked to familial Alzheimer's disease, such as Swedish mutations, Leuven mutations, Icelandic mutations, London mutations, Egyptian mutations, Australian mutations, German mutations, French mutations, Florida mutations, Iberian mutations, Examples include Australian mutations, Belgian mutations, Flesh mutations, Icelandic mutations, British mutations, Tottori mutations, Italian mutations, Arctic mutations, Osaka mutations, Iowa mutations, and Ducchi mutations.
  • Other mutations may include mutations to modified amino acids, unnatural amino acids, D-amino acids and the like.
  • modified amino acid include amino group modification, carboxyl group modification, thiol group modification, hydroxyl group modification, glycation modification, PEGification modification and the like in one or more embodiments.
  • a ⁇ crosslinked product The present disclosure relates, in one aspect, to an A ⁇ crosslinked body in which A ⁇ is crosslinked with a predetermined crosslinked body.
  • a ⁇ is as described above.
  • the cross-linking agent used for the A ⁇ cross-linked product according to the present disclosure is a cross-linking agent having a spacer arm length of 4 ⁇ or more and 50 ⁇ or less in one or more embodiments.
  • the spacer arm length refers to the molecular span (distance between binding molecules) of the cross-linking agent.
  • the spacer arm length of the crosslinked body is described in a catalog or product manual of a commercially available crosslinked body, and can be appropriately selected and obtained by those skilled in the art.
  • the spacer arm length is 4 ⁇ or more, preferably 7 ⁇ or more, preferably 10 ⁇ or more, and more preferably 13 ⁇ or more, from the viewpoint of bringing the reactivity to the ASPD-specific antibody closer to ASPD.
  • 14 ⁇ or more is more preferable, 15 ⁇ or more is more preferable, 16 ⁇ or more is further preferable, 17 ⁇ or more is further preferable, 18 ⁇ or more is further preferable, 19 ⁇ or more is further preferable, 20 ⁇ or more is further preferable, and 21 ⁇ or more is further preferable.
  • the spacer arm length is preferably 50 ⁇ or less, preferably 45 ⁇ or less, more preferably 40 ⁇ or less, further preferably 36 ⁇ or less, further preferably 33 ⁇ or less, and 30 ⁇ or less in one or more embodiments. Is even more preferable, 27 ⁇ or less is further preferable, and 24 ⁇ or less is further preferable.
  • the cross-linking agent used for the A ⁇ cross-linked product according to the present disclosure is an oxyethylene group (-CH 2 CH 2 O-, EO group) of 1 or more and 13 or less and / or an oxypropylene group as a spacer arm. It is a cross-linking agent having (-CH 2 CH 2 CH 2 O-, PO group).
  • the spacer arm refers to a skeleton or group between the reactive ends of the cross-linking agent.
  • the total number of EO groups and PO groups in the spacer arm is 1 or more, preferably 2 or more, in one or more embodiments, from the viewpoint of bringing the reactivity to the ASPD-specific antibody closer to ASPD.
  • the total number of EO groups and PO groups in the spacer arm is 13 or less, preferably 10 or less, more preferably 9 or less, still more preferably 8 or less, from the same viewpoint. , 7 or less is more preferable, and 6 or less is further preferable.
  • Examples of the cross-linking target of the cross-linking agent used in the A ⁇ cross-linked product according to the present disclosure include an amino group, a sulfhydryl group, a carboxyl group, and a non-selection group in one or more embodiments.
  • the reaction end of the cross-linking agent used for the A ⁇ cross-linked product according to the present disclosure is preferably a reaction end that cross-links between amino groups from the viewpoint of bringing the reactivity to an ASPD-specific antibody closer to ASPD. , NHS ester or imide ester.
  • the cross-linking agent used for the A ⁇ cross-linked product according to the present disclosure may or may not be cleaving. From the viewpoint of stability, it is preferable that there is no cleaving property.
  • the cross-linking agent used for the A ⁇ cross-linked product according to the present disclosure is ethylene glycol bis (succinimidyl succinate) (EGS) from the viewpoint of bringing the reactivity to an ASPD-specific antibody closer to ASPD in one or more embodiments.
  • EGS ethylene glycol bis (succinimidyl succinate)
  • the A ⁇ used in the A ⁇ crosslinked product according to the present disclosure includes A ⁇ 38, A ⁇ 39, A ⁇ 40, A ⁇ 41 or A ⁇ 42 from the viewpoint of bringing the reactivity to the antibody specific to ASPD closer to ASPD, and A ⁇ 40 or A ⁇ 42 is preferable, and A ⁇ 42 is more preferable. preferable.
  • the molecular weight of the A ⁇ crosslinked product according to the present disclosure exceeds 100 kDa or 114 kDa as the molecular weight analyzed by 10-20% SDSPAGE in one or more embodiments.
  • the A ⁇ cross-linked form according to the present disclosure is equivalent to ASPD in the cytotoxicity of ASPD, that is, the property of selectively inducing cell death in functionally mature nerve cells. It may be well, or it may be less toxic than ASPD, or it may not have cytotoxicity, or it may be more toxic than ASPD.
  • the A ⁇ crosslinked product according to the present disclosure may be less toxic than ASPD or has no cytotoxicity in one or more embodiments.
  • the A ⁇ crosslinked product according to the present disclosure is more preferably reactive with an antibody specific for ASPD because it is closer to the reactivity of ASPD than the reactivity of A ⁇ aggregates other than ASPD. Is as reactive as ASPD.
  • the A ⁇ crosslinked product according to the present disclosure is a substance that competes with ASPD for an antibody specific for ASPD in one or more embodiments.
  • the A ⁇ crosslinked product according to the present disclosure can be an alternative to ASPD in one or more embodiments in terms of reactivity to ASPD-specific antibodies.
  • the A ⁇ crosslinked product according to the present disclosure can be a reference substance for ASPD analysis or a kit thereof in one or more embodiments.
  • analysis of ASPD may include detection, measurement, quantification of ASPD, and screening utilizing them in one or more embodiments.
  • the ASPD analysis in which the A ⁇ cross-linked product according to the present disclosure is used as a standard substance includes, in one or more embodiments, an analysis using an immunoassay using an antibody specific for ASPD, and is more specific. Examples include an enzyme immunoassay method using an ASPD-specific antibody and a chemiluminescence / enzyme immunoassay method, and more specifically, an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) using an ASPD-specific antibody.
  • ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
  • the A ⁇ crosslinked product according to the present disclosure can be used to prepare a calibration curve in ASPD analysis. In one or more other embodiments, the A ⁇ crosslinked product according to the present disclosure can be used as a positive control in ASPD analysis.
  • the A ⁇ crosslinked product according to the present disclosure can be a reference substance for ASPD analysis in the diagnosis of diseases associated with the accumulation of ASPD in one or more embodiments.
  • Diseases associated with the accumulation of ASPD include, in one or more embodiments, Alzheimer's disease, Lewy body dementias, and the like.
  • the A ⁇ cross-linked product according to the present disclosure may be a standard substance for ASPD analysis or a kit thereof in companion diagnostics for therapeutic agents targeting ASPD in one or more embodiments.
  • the A ⁇ crosslinked product according to the present disclosure can be a component of a companion diagnostic agent for a therapeutic agent targeting ASPD in one or more embodiments.
  • the ASPD analysis kit contains, in one or more embodiments, reagents necessary for immunoassays using antibodies specific for ASPD.
  • the reagent include antibodies specific for ASPD in one or more embodiments.
  • the ASPD analysis kit according to this aspect is, in one or more embodiments, an ASPD analysis kit for diagnosing a disease associated with the accumulation of ASPD, an ASPD analysis kit for companion diagnostics of a therapeutic agent targeting ASPD, or an ASPD analysis kit.
  • a companion diagnostic for therapeutic agents targeting ASPD include, in one or more embodiments, pharmaceutical compositions for the prevention, amelioration, and / or treatment of diseases associated with the accumulation of ASPD.
  • the A ⁇ crosslinked product according to the present disclosure has immunogenicity in one or more embodiments and can induce the production of an antibody against the A ⁇ crosslinked product according to the present disclosure.
  • the A ⁇ crosslinked product according to the present disclosure has immunogenicity in one or more embodiments and can induce the production of an antibody against ASPD. Therefore, the A ⁇ crosslinked product according to the present disclosure can be a substitute for ASPD from the viewpoint of being able to induce an antibody against ASPD in one or more embodiments.
  • ASPD is used as an active vaccine against diseases associated with the accumulation of ASPD (eg, WO2017 / 179646). Since the A ⁇ crosslinked product according to the present disclosure can be a substitute for ASPD, the A ⁇ crosslinked product according to the present disclosure can also be used as an active vaccine and can be used for the production of a vaccine.
  • the present disclosure relates to, in one aspect, a pharmaceutical composition containing the A ⁇ crosslinked product according to the present disclosure as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition containing the A ⁇ crosslinked product according to the present disclosure as an active ingredient.
  • One or more embodiments of the pharmaceutical composition according to the present disclosure include a vaccine containing an A ⁇ crosslinked according to the present disclosure.
  • the pharmaceutical compositions and vaccines according to the present disclosure may include pharmaceutically acceptable excipients and / or adjuvants.
  • the pharmaceutical compositions and vaccines according to the present disclosure may be used in one or more embodiments for the prevention, amelioration, and / or treatment of diseases associated with the accumulation of ASPD.
  • the pharmaceutical compositions and vaccines according to the present disclosure may be used in one or more embodiments for the prevention, amelioration, and / or treatment of Alzheimer's disease and / or Lewy body dementias.
  • the pharmaceutical compositions and vaccines according to the present disclosure may, in one or more embodiments, be administered to a subject at risk of suffering from a disease associated with the accumulation of ASPD, a subject at risk of suffering from it, or a subject suffering from it.
  • the pharmaceutical composition according to the present disclosure is administered to a subject who may suffer from Alzheimer's disease and / or Lewy body dementias, a subject who may suffer from it, or a subject who suffers from it in one or more embodiments. sell.
  • Examples of the target include mammals, humans, and mammals other than humans.
  • the pharmaceutical composition and vaccine according to the present disclosure are acquired for immunity against ASPD, a disease associated with the accumulation of ASPD, or Alzheimer's disease and / or Lewy body dementias.
  • the method for administering the pharmaceutical composition and vaccine according to the present disclosure is, in one or more embodiments, intramuscular, intraperitoneal, intradermal or subcutaneous injection, or into the oral cavity, gastrointestinal tract, respiratory tract, urogenital tract. Transmucosal administration may be included.
  • Examples of the dose of the A ⁇ crosslinked product in the pharmaceutical composition and vaccine according to the present disclosure include an amount that induces an immune defense response without causing a significant side effect on the administration subject.
  • the dosage of the pharmaceutical composition and vaccine according to the present disclosure is, in one or more embodiments, 0.01 ⁇ g to 10 mg, 0.1 ⁇ g to 1000 ⁇ g, 1 ⁇ g to 100 ⁇ g, 5 ⁇ g to 50 ⁇ g of the cell-secreting ASPD-like structure. Alternatively, the amount is expected to be included in the range of 5 ⁇ g to 25 ⁇ g. Following the initial administration, one or several booster administrations may be given at sufficient intervals.
  • the disclosure is a method of preventing, ameliorating, and / or treating a disease associated with the accumulation of ASPD (eg, Alzheimer's disease and / or Lewy body dementias), the A ⁇ cross-linking according to the present disclosure.
  • ASPD eg, Alzheimer's disease and / or Lewy body dementias
  • the present invention relates to a method comprising administering to a body or a pharmaceutical composition or vaccine according to the present disclosure.
  • the present disclosure is, in other aspects, a method of obtaining immunity against ASPD itself to a subject, which comprises administering to the subject the A ⁇ crosslinked product according to the present disclosure or the pharmaceutical composition or vaccine according to the present disclosure.
  • ASPD eg, Alzheimer's disease and / or Lewy body dementias
  • the present disclosure is, in still another aspect, a method for obtaining immunity against a disease associated with the accumulation of ASPD, wherein the A ⁇ crosslinked product according to the present disclosure or the pharmaceutical composition or vaccine according to the present disclosure is administered to the subject.
  • the A ⁇ crosslinked product according to the present disclosure or the pharmaceutical composition or vaccine according to the present disclosure is administered to the subject.
  • methods including that.
  • the present disclosure also relates to a method for producing a pharmaceutical composition or vaccine, which comprises, in one aspect, combining the A ⁇ crosslinked product according to the present disclosure with an excipient and / or an adjuvant.
  • the present disclosure is, in other embodiments, a method for producing a pharmaceutical composition containing the A ⁇ crosslinked product according to the present disclosure as an active ingredient, or a vaccine having the A ⁇ crosslinked product according to the present disclosure, which is described below.
  • the present invention relates to a production method including a step of producing an A ⁇ crosslinked product according to the disclosure.
  • the A ⁇ crosslinked product according to the present disclosure can be obtained in one or more embodiments by adding a crosslinking agent to an aqueous A ⁇ solution in which A ⁇ is dissolved in an aqueous solvent to cause a crosslinking reaction.
  • a ⁇ may be prepared by peptide synthesis or may be produced by recombinant techniques.
  • the amount of the cross-linking agent to be added is 10 times or more, 20 times or more, or 30 times or more in terms of molar amount with respect to A ⁇ .
  • the amount of the cross-linking agent to be added is 200 times or less, 100 times or less, or 75 times or less in terms of moles in one or more embodiments.
  • the crosslinked product after the crosslinking reaction may be further subjected to ultrafiltration.
  • the A ⁇ crosslinked product according to the present disclosure can be obtained in the holding liquid or the recovery liquid of the filter residue.
  • the molecular weight cutoff value (MWCO) of the ultrafiltration filter may be 30 kDa, 50 kDa, or 100 kDa in one or more embodiments.
  • the A ⁇ crosslinked product according to the present disclosure can be produced in one or more embodiments by the method described in Examples.
  • [A4] The A ⁇ cross-linked product according to any one of [A1] to [A3], wherein the cross-linking agent is a cross-linking agent having a reaction end for cross-linking between amino groups.
  • [A5] The A ⁇ crosslinked product according to any one of [A1] to [A4], wherein the molecular weight analyzed by 10-20% SDSPAGE exceeds 100 kDa.
  • [A6] The A ⁇ crosslinked product according to any one of [A1] to [A5], which is a substance that competes with ASPD for an antibody specific for ASPD.
  • [A7] The A ⁇ crosslinked product according to any one of [A1] to [A6], which is a standard substance for ASPD analysis.
  • A9 The A ⁇ crosslinked product according to any one of [A1] to [A8], which is a standard substance for ASPD analysis in companion diagnostics for therapeutic agents targeting ASPD.
  • A10 The A ⁇ crosslinked product according to any one of [A1] to [A9], which is a component of a companion diagnostic agent for a therapeutic agent targeting ASPD.
  • B1] Use of the A ⁇ crosslinked product according to any one of [A1] to [A10] as a substance that competes with ASPD for an antibody specific for ASPD.
  • [B2] Use of the A ⁇ crosslinked product according to any one of [A1] to [A10] as an alternative to ASPD for an ASPD-specific antibody.
  • [B3] Use of the A ⁇ crosslinked product according to any one of [A1] to [A10] as a standard substance for ASPD analysis.
  • [B4] Use of the A ⁇ crosslinked product according to any one of [A1] to [A10] in the diagnosis of a disease associated with the accumulation of ASPD.
  • [B5] The use according to [B4], wherein the diagnosis is a companion diagnostic of a therapeutic agent targeting ASPD.
  • [B6] Use of the A ⁇ crosslinked product according to any one of [A1] to [A10] as a reference substance for ASPD analysis in the diagnosis of diseases associated with the accumulation of ASPD.
  • [B7] Use of the A ⁇ crosslinked product according to [B6], wherein the disease associated with the accumulation of ASPD is Alzheimer's disease and / or Lewy body dementias.
  • [B8] Use of the A ⁇ crosslinked product according to any one of [A1] to [A10] as a standard substance for ASPD analysis in companion diagnostics for therapeutic agents targeting ASPD.
  • [B9] Use of the A ⁇ crosslinked product according to any one of [A1] to [A10] as a component of a companion diagnostic agent for a therapeutic agent targeting ASPD.
  • a companion diagnostic agent for a therapeutic agent targeting ASPD which comprises the A ⁇ crosslinked product according to any one of [A1] to [A10] as a standard substance.
  • An ASPD analysis method comprising using the A ⁇ crosslinked product according to any one of [A1] to [A10] as a standard substance.
  • the ASPD analysis method according to [C7] which comprises immunoassaying with an antibody specific for ASPD.
  • the ASPD analysis method according to [C9] wherein the disease associated with the accumulation of ASPD is Alzheimer's disease and / or Lewy body dementias.
  • [C11] The ASPD analysis method according to any one of [C7] to [C10] for companion diagnostics of a therapeutic agent targeting ASPD.
  • a diagnostic method according to a companion diagnostic method for a therapeutic agent targeting ASPD which comprises performing the ASPD analysis method according to any one of [C7] to [C11].
  • [C13] The diagnostic method according to [C12], wherein the therapeutic agent targeting ASPD is a pharmaceutical composition for preventing, ameliorating, and / or treating a disease associated with the accumulation of ASPD.
  • the disease associated with the accumulation of ASPD is Alzheimer's disease and / or Lewy body dementias.
  • [D1] A pharmaceutical composition containing the A ⁇ crosslinked product according to any one of [A1] to [A10] as an active ingredient.
  • [D2] A vaccine containing the A ⁇ crosslinked product according to any one of [A1] to [A10].
  • [D3] Use of the A ⁇ crosslinked product according to any one of [A1] to [A10] as an active vaccine.
  • [D4] Use of the A ⁇ crosslinked product according to any one of [A1] to [A10] in vaccine production.
  • the vaccine is the vaccine for diseases associated with the accumulation of ASPD, the vaccine according to [D2], or the use according to [D3] or [D4].
  • [D6] A method for preventing, ameliorating, and / or treating a disease associated with the accumulation of ASPD, the A ⁇ crosslinked product according to any one of [A1] to [A10], and the pharmaceutical composition according to [D1]. , Or a method comprising administering to a subject the vaccine according to [D2].
  • [D7] The method according to [D6], wherein the disease associated with the accumulation of ASPD is Alzheimer's disease and / or Lewy body dementias.
  • [D8] A method for obtaining immunity against ASPD in a subject, the A ⁇ crosslinked product according to any one of [A1] to [A10], the pharmaceutical composition according to [D1], or the pharmaceutical composition according to [D2].
  • [D9] A method for obtaining immunity against a disease associated with the accumulation of ASPD, which is the A ⁇ crosslinked product according to any one of [A1] to [A10], the pharmaceutical composition according to [D1], or the pharmaceutical composition.
  • a method comprising administering to a subject the vaccine according to [D2].
  • [D10] The method according to [D9], wherein the disease associated with the accumulation of ASPD is Alzheimer's disease and / or Lewy body dementias.
  • [D11] A method for producing a pharmaceutical composition or vaccine, which comprises combining the A ⁇ crosslinked product according to any one of [A1] to [A10] with a pharmaceutically acceptable excipient.
  • the present disclosure relates to an ASPD analysis method (hereinafter, also referred to as “ASPD analysis method according to the present disclosure”) including the following steps (1) and (2).
  • ASPD ASPD analysis method
  • (1) When a biological sample that may contain ASPD is brought into contact with an antibody that can bind to ASPD (first antibody) that is bound to an insoluble carrier, and ASPD is contained. A step of binding ASPD to the first antibody.
  • (2) A step of reacting the ASPD bound to the first antibody in step (1) with an anti-ASPD monoclonal antibody (second antibody).
  • the first antibody is a humanized anti-ASPD monoclonal antibody huASD2 or a monoclonal antibody BAN50a.
  • the second antibody is the mouse monoclonal anti-ASPD antibody mASD3 or a labeled antibody thereof.
  • the ASPD analysis method according to the present disclosure is a method utilizing the principle of immunoassay, and in one or more embodiments, is an enzyme immunoassay such as ELISA and a chemiluminescent enzyme immunoassay such as CLEIA.
  • huASD2 As the first antibody to be bound to the insoluble carrier, huASD2 or BAN50a from the viewpoint of improving the detection sensitivity when blood, plasma component, cerebrospinal fluid or a diluted solution thereof is used as a sample in one or more embodiments. Is preferable.
  • huASD2 is described in WO2009 / 057664 and has a heavy chain variable region of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing and a light chain variable region of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 of the sequence listing. It is a humanized monoclonal anti-ASPD antibody.
  • SEQ ID NO: 1 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYFMSWVRQAPGKGLEWVGGIEIKSYFYATYYFGSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTTNREVGGLDNWGQGTLVTVSS
  • SEQ ID NO: 2 QSVLTQPSSLSASPGASASLTCTLRSGISVGGKNIYWYQQKPGSPPQYLLKYSSYSNKQLGPGVPSRFSGSKDASANAGILLISGLQSEDEADYYCSIHESNAYVFGGGTKLTVLGR huASD2 can be obtained, for example, by cotransfecting and expressing ASD2RHApG1D200 (Patent Organism Depositary Center Accession Number: FERM BP-11040) ASD2RLApLN100 (Patent Organism Depositary Center Accession Number: FERM BP-11041) on known animal cells.
  • huASD2 in the present disclosure refers to a heavy chain variable region of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 of the sequence listing and a light chain variable region of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 of the sequence listing.
  • An anti-ASPD antibody having the above can be substituted.
  • SEQ ID NO: 3 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYFMSWVRQAPGKGLEWVXGIEIKSYFYATYYFGSVKGRFTISRDDSKNTXYLQMNSLKTEDTAVYYCTXNREVGGLDNWGQGTLVTVSS
  • SEQ ID NO: 4 QXVLTQPXSLSASPGASASLTCTLRSGISVGGKNIYWYQQKPGSPPQXXLXYSSYSNKQLGPGVPSRFSGSKDXSANAXILLISGLQSEDEADYYCSIHESNAYVFGGGTKLTVLG (In SEQ ID NO: 3, the 49th X is G or A, the 81st X is L or V, and the 100th X is T or R.
  • the 49th X is T or R.
  • the 2nd place X is S or A
  • the 8th place X is S or A
  • the 48th place X is Y or F
  • the 49th place X is L or F.
  • the 51st place X is K or F or R
  • the 74th place X is A or T
  • the 79th place X is G or A).
  • BAN50a is a known monoclonal antibody that specifically recognizes the N-terminal region of A ⁇ described in WO94-17197 pamphlet.
  • BAN50a can be used, or it can be produced by a known method using the patented biological deposit center hybridoma BAN50 (accession number FERM BP4163).
  • the second antibody include mASD3 labeled antibodies from the viewpoint of improving the detection sensitivity in one or more embodiments. Labeling includes biotinylation in one or more embodiments.
  • Examples of the insoluble carrier in the ASPD analysis method according to the present disclosure include beads and a solid phase product such as a multi-well plate in one or more embodiments.
  • Biological samples that may contain ASPD include blood, plasma, and cerebrospinal fluid, and dilutions thereof, as one or more embodiments.
  • the ASPD analysis method according to the present disclosure may include, in one or more embodiments, a step (0) of preparing a biological sample prior to the step (1).
  • This sample preparation step (0) comprises diluting a biological sample such as blood, plasma, and cerebrospinal fluid with a suitable solvent or buffer in one or more embodiments.
  • the solvent or buffer may contain a surfactant or other chemicals as long as it does not interfere with the analysis.
  • the ASPD analysis method may further include the following step (3) in one or more embodiments.
  • the reporter is linked to the step of reacting the second antibody bound to ASPD in step (2) with the anti-mouse antibody linked to the reporter, or to the label of the second antibody bound to ASPD in step (2).
  • the step of reacting the binding partner of the above-mentioned label examples include substances that utilize chemiluminescence and bioluminescence, fluorescent proteins, and the like in one or more embodiments, and substances that utilize chemiluminescence or bioluminescence are preferable from the viewpoint of improving detection sensitivity.
  • substances that utilize chemiluminescence or bioluminescence include enzymes such as bioluminescent enzymes and variants thereof in one or more embodiments.
  • Examples of the enzyme include HRP (horseradish peroxidase), alkaline phosphatase, and the like in one or more embodiments.
  • Examples of the binding partner include streptavidin and the like when the label is biotin in one or more embodiments.
  • Luminescence measurements can be made with a luminometer or multi-plate reader in one or more embodiments.
  • the A ⁇ crosslinked product according to the present disclosure may be used as a standard substance in one or more embodiments.
  • [E1] A method for analyzing ASPD, which comprises the following steps (1) and (2).
  • Step (1) When a biological sample that may contain ASPD is brought into contact with an antibody that can bind to ASPD (first antibody) that is bound to an insoluble carrier, and ASPD is contained. The step of binding ASPD to the first antibody.
  • Step (2) A step of reacting the ASPD bound to the first antibody in step (1) with an anti-ASPD monoclonal antibody (second antibody).
  • the first antibody is a humanized anti-ASPD monoclonal antibody huASD2 or a monoclonal antibody BAN50a.
  • the second antibody is the mouse monoclonal anti-ASPD antibody mASD3 or a labeled antibody thereof.
  • [E2] The analysis method according to [E1], which is a method utilizing the principle of immunoassay.
  • [E3] The analytical method according to [E2], wherein the method utilizing the principle of immunoassay is ELISA or CLEIA.
  • [E4] The analytical method according to any one of [E1] to [E3], wherein the biological sample is blood, plasma components, cerebrospinal fluid or a diluted solution thereof.
  • [E5] The analytical method according to any one of [E1] to [E4], which comprises a step (0) of preparing a biological sample before the step (1).
  • [E6] The analytical method according to [E5], wherein the sample preparation step (0) comprises diluting a biological sample selected from the group consisting of blood, plasma, and cerebrospinal fluid into a solvent or buffer.
  • Step (3) The reporter is attached to the step of reacting the second antibody bound to ASPD in step (2) with the anti-mouse antibody linked to the reporter, or to the labeling of the second antibody bound to ASPD in step (2).
  • the step of reacting the binding partners of the linked labels [E8]
  • the analysis method according to any one of [E1] to [E7] which uses the substance described in [1] below as a standard substance for ASPD.
  • a diagnostic method for diagnosing a disease associated with the accumulation of ASPD which comprises performing the analytical method according to any one of [E1] to [E12].
  • the diagnostic method according to [E13], wherein the disease associated with the accumulation of ASPD is Alzheimer's disease and / or Lewy body dementias.
  • a diagnostic method according to a companion diagnostic method for a therapeutic agent targeting ASPD which comprises performing the analytical method according to any one of [E1] to [E12].
  • the therapeutic agent targeting ASPD is a pharmaceutical composition for preventing, ameliorating, and / or treating a disease associated with the accumulation of ASPD.
  • [E17] The diagnostic method according to [E16], wherein the disease associated with the accumulation of ASPD is Alzheimer's disease and / or Lewy body dementias.
  • An ASPD analysis kit comprising a humanized anti-ASPD monoclonal antibody huASD2 or a monoclonal antibody BAN50a (first antibody) and a mouse monoclonal anti-ASPD antibody mASD3 or a labeled antibody thereof (second antibody).
  • the ASPD analysis kit according to [F1] further comprising the A ⁇ crosslinked product according to any one of [A1] to [A10].
  • a substance that competes with ASPD for an ASPD-specific antibody in which A ⁇ is crosslinked by a cross-linking agent, and the cross-linking agent has a spacer arm length of 4 ⁇ or more and 50 ⁇ or less. Or, a substance which is a cross-linking agent having 1 or more and 13 or less EO groups and / or PO groups as a spacer arm.
  • a kit for analyzing ASPD which comprises the substance according to [1] or the crosslinked product according to [2], and an anti-ASPD antibody.
  • ASPD Standard substance in ASPD analysis.
  • the use according to [5] or [6], wherein the disease associated with the accumulation of ASPD is Alzheimer's disease and / or Lewy body dementias.
  • [8] The following steps: (1) When a biological sample that may contain ASPD is brought into contact with an antibody that can bind to ASPD (first antibody) that is bound to an insoluble carrier, and ASPD is contained. A step of binding ASPD to the first antibody; and (2) including a step of reacting the ASPD bound to the first antibody in step (1) with an anti-ASPD monoclonal antibody (second antibody).
  • the first antibody is a humanized anti-ASPD monoclonal antibody huASD2 or a monoclonal antibody BAN50a.
  • a method for analyzing ASPD, wherein the second antibody is a mouse monoclonal anti-ASPD antibody mASD3 or a labeled antibody thereof.
  • the reporter is linked to the step of reacting the second antibody bound to ASPD in step (2) with the anti-mouse antibody linked to the reporter, or to the label of the second antibody bound to ASPD in step (2).
  • the analysis method according to [8] which comprises the step of reacting the binding partner of the above-mentioned label.
  • the analytical method according to [8] or [9] wherein the substance according to [1] or the crosslinked product according to [2] is used as a standard substance for ASPD.
  • concentrations of the A ⁇ crosslinked product and ASPD are converted to A ⁇ monomers unless otherwise specified.
  • a ⁇ crosslinked product 1-3 was prepared.
  • a ⁇ crosslinked body 1 A ⁇ 42
  • the crosslinking agent is BS (PEG) 5
  • a ⁇ crosslinked body 2 A ⁇ 42
  • the crosslinking agent is BS (PEG) 9
  • a ⁇ crosslinked body 3 A ⁇ 42
  • the crosslinking agent is DFDNB
  • the cross-linking agents used are as follows.
  • BS (PEG) 5 Bis (succinimidyl) penta (ethylene glycol) (Spacer arm length: 21.7 ⁇ )
  • BS (PEG) 9 Bis (succinimidyl) nona (ethylene glycol) (Spacer arm length: 35.8 ⁇ )
  • DFDNB 1,5-difluoro-2,4-dinitorobenzene (Spacer arm length: 3.0 ⁇ )
  • a ⁇ crosslinked SDSPAGE SDSpage (10-20% Gel) was performed using the obtained A ⁇ crosslinked products 1 to 3 to confirm that they were crosslinked.
  • An example of the result is shown in FIG.
  • each of the A ⁇ crosslinked bodies 1 to 3 was polymerized, and it was recognized that the molecular weight was 100 kDa or more.
  • ASPD CLEIA reactivity of A ⁇ crosslinked products The ASPD CLEIA reactivity of the obtained A ⁇ crosslinked products 1 to 3 was confirmed.
  • the ASPD CLEIA used was the system shown in FIG. 2, which was an anti-ASPD polyclonal antibody (first antibody) immobilized on a solid phase, a mouse anti-ASPD monoclonal antibody mASD3 (second antibody) on the detection side, and an anti-mouse IgG-. It is a system that uses HRP.
  • FIG. 3 shows an example of the results of comparing the reactivity of ASPD CLEIA [anti-ASPD polyclonal antibody / mASD3] using A ⁇ crosslinked products 1 to 3 as a subject as compared with the case where ASPD was used as a subject. As shown in FIG. 3, A ⁇ crosslinked products 1 and 2 were closer to ASPD reactivity than A ⁇ crosslinked product 3. Among them, the A ⁇ crosslinked product 1 showed the same reactivity as ASPD.
  • the A ⁇ crosslinked product 1 showed the same reactivity as ASPD.
  • a ⁇ crosslinked product 1 and ASPD were significantly less reactive than A ⁇ 1-16 dimer.
  • ASPD CLEIA the reactivity of A ⁇ 1-16 dimer was significantly weaker than that of A ⁇ crosslinked product 1 and ASPD.
  • ASPD CLEIA was found to have high detection sensitivity with respect to A ⁇ crosslinked product 1 and ASPD.
  • Solid-phase synthetic ASPD shows the reactivity to the synthetic ASPD-immobilized plate of the obtained serum
  • control shows the reactivity to the F12 protein-immobilized plate of the obtained serum
  • Empty indicates the reactivity of the obtained serum to an empty plate. From the results shown in FIG. 5, it was shown that A ⁇ crosslinked product 1 is immunogenic and can induce an antibody that reacts with ASPD.
  • ASPD Cerebrospinal Fluid
  • Cleaning x 3 (4) Third-order reaction: Anti-mouse IgG-HRP (1/20000) was added at 100 ⁇ L / well, and the mixture was allowed to stand at 25 ° C. for 60 minutes.
  • HRP chemiluminescent substrate of HRP (trade name: SuperSignal pico, manufactured by ThermoFisher) at 100 ⁇ L / well, and measure the luminescence with a plate reader (trade name: infinite M200pro, manufactured by TECAN).
  • a ⁇ aggregate 1 or a cell-secreting ASPD-like structure (WO2017 / 179646) was used.
  • a 3% BSA in PBS (-) 0.05% preservative (trade
  • a known concentration of ASPD was added to human CSF (Age84 / Caucasian / M) (high concentration H: 108 pM, medium concentration M: 54 pM, low concentration L: 27.5 pM, none N: 0 pM) and quantified by diluting 4-fold.
  • An example of the results is shown in Table 1 below.
  • ASPD ASPD was measured in human plasma sample with ASPD CLEIA [anti-ASPD polyclonal antibody / mASD3]. Specifically, the flow was as follows. (1) A known concentration of ASPD is added to human plasma and diluted with a sample diluent (diluted 1 to 16 times). (2) Primary reaction: Add 100 ⁇ L / well to a multi-well plate on which a rabbit anti-ASPD polyclonal antibody is immobilized, and shake at 25 ° C. for 60 minutes. Cleaning x 3 (3) Secondary reaction: mASD3 (1 ⁇ g / ml) is added at 100 ⁇ L / well, and the mixture is shaken at 25 ° C. for 60 minutes.
  • Cleaning x 3 (4) Third-order reaction: Anti-mouse IgG-HRP (1/20000) is added at 100 ⁇ L / well and shaken at 25 ° C. for 60 minutes.
  • HRP chemiluminescent substrate of HRP (trade name: SuperSignal pico, manufactured by ThermoFisher) at 100 ⁇ L / well, and measure the luminescence with a plate reader (trade name: infinite M200pro, manufactured by TECAN).
  • a ⁇ aggregate 1 or a cell-secreting ASPD-like structure (WO2017 / 179646) was used.
  • a 3% BSA in PBS (-) 0.05% preservative (trade name: Proclin,
  • Table 2 shows an example of the results of adding a known concentration of ASPD to human plasma (Age29 / Caucasian / F), diluting it 4-fold with 3% BSA PBS (-), and quantifying it.
  • ASPD could be measured by using human plasma instead of human CSF. However, the recovery rate was about half. It is considered to be the effect of plasma components.
  • a sample in which ASPD was spiked in human plasma was diluted 2-fold, 4-fold, 8-fold, 16-fold with a sample diluent, and the dilution ratios were 1-fold, 1/2, 1/4, 1/8, and so on.
  • the result of measuring the sample which is 1/16 is shown in FIG.
  • FIG. 7 as a result of plotting the results of the diluted sample, dilution linearity was obtained. However, the slope was halved compared to the buffer. It is considered to be the effect of plasma components.
  • the effect on the recovery rate of human plasma samples could be eliminated by setting the dilution rate of the samples to 1/16.
  • ASPD CLEIA [huASD2 / mASD3] As the antibody immobilized on the solid phase, humanized anti-ASPD monoclonal antibody huASD2 was used, and ASPD was measured by ASPD CLEIA using mouse anti-ASPD monoclonal antibody mASD3 and anti-mouse IgG-HRP (FIG. 8). huASD2 is described in WO2009 / 057664. An example of the result is shown in FIG. As shown in FIG. 9, when four independent ASPD measurements were performed, almost the same emission value was obtained.
  • ASPD CLEIA [huASD2 / biotinylated mASD3]
  • a system was constructed in which the mASD3 antibody was biotinylated and HRP to which streptavidin (SA) was bound was used (FIG. 10).
  • SA streptavidin
  • the huASD2 / biotinylated mASD3 system had high properties for ASPD and hardly detected a multi-antigen peptide (MAP16, manufactured by Fujifilm Wako Co., Ltd.) in which 16 molecules of A ⁇ 1-10 were bound (FIG. 12).
  • MAP16 multi-antigen peptide
  • FIG. 12 when measured with a BAN50 / biotinylated BAN50 system (polymer amyloid ⁇ oligomer ELISA kit, manufactured by Fujifilm Wako Co., Ltd.) as a control, the system detected MAP16 with high sensitivity, but could hardly detect ASPD (SPD).
  • SPD ASPD
  • a plasma sample containing ASPD and having a dilution ratio of 1/4 was prepared and compared with a buffer sample.
  • An example of the result is shown in FIG. As shown in FIG. 13, it was confirmed that the influence of plasma components can be most effectively avoided in the case of the combination of [BAN50a / biotinylated mASD3].
  • ASPD CLEIA 10 plasma samples ( ⁇ ) of patients diagnosed with Alzheimer's disease (AD) and 10 plasma samples ( ⁇ ) of healthy subjects.
  • ASPD CLEIA was performed with the combination of.
  • ASPD was detected in 4 AD patients. The result is shown in FIG. From these results above, it was shown that ASPD in blood can be measured by ASPD CLEIA.

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Abstract

アミロスフェロイド（ＡＳＰＤ）の代替物（substitute）となりうる物質、及び、ＡＳＰＤの分析方法が提供される。　本開示は、一態様において、スペーサーアーム長が４Å以上５０Å以下である架橋剤、又は、スペーサーアームとして１以上１３以下のオキシエチレン基（－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－）及び／又はオキシプロピレン基（－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－）を有する架橋剤によってアミロイドβタンパク質（Ａβ）が架橋されている物質に関する。　本開示は、その他の態様において、該物質を標準物質として使用するＡＳＰＤの分析方法に関する。

Description

アミロスフェロイド（ＡＳＰＤ）の代替物となりうるアミロイドβタンパク質（Ａβ）の架橋体、及びＡＳＰＤの分析
　本開示は、アミロイドβタンパク質（Ａβ）の架橋体、アミロスフェロイド（ＡＳＰＤ）の代替物となりうるＡβ架橋体（cross-linked Aβ）、及びＡＳＰＤの分析に関する。
　アミロスフェロイド（amylospheroids（ＡＳＰＤ））は、アミロイドβタンパク質（Ａβ）が約３０個集まった直径約１０～１５ｎｍの球状のＡβ集合体であって、アルツハイマー病の神経細胞死が起きるうえで重要な役割を果たすと考えられる構造体である。
　ＡＳＰＤは、強い神経毒性を示すin vitroで合成されたＡβ集合体（すなわち、合成ＡＳＰＤ）として単離された（非特許文献１）。この合成ＡＳＰＤに対する特異的な抗体が作製され（特許文献１及び２）、この抗体を用い、アルツハイマー病のヒト患者の脳から、実際に、生体内で形成されたＡＳＰＤ（すなわち、ネイティブＡＳＰＤ）が単離された（非特許文献１）。
　ネイティブＡＳＰＤ及び合成ＡＳＰＤは、同様に、成熟神経細胞に対して選択的に細胞死を誘発する。この神経細胞死におけるＡＳＰＤのターゲットが、神経の生存と機能に極めて重要な役割を果たしているシナプスタンパク質「Ｎａ+，Ｋ+－ＡＴＰａｓｅポンプのα３サブユニット（以下、ＮＡＫα３）」であることが発見され、ＡＳＰＤの結合によりＮＡＫα３の機能が低下し、神経細胞が過剰に興奮することで神経細胞が死に至ることが明らかにされた（特許文献３、非特許文献２）。
　アルツハイマー病における臨床症状と最も相関するのが神経細胞の脱落である。神経細胞脱落が認められるアルツハイマー病患者の大脳皮質におけるネイティブＡＳＰＤ量は、アルツハイマー病の重症度に相関して増加し、そして、神経細胞脱落があまり認められないアルツハイマー病患者の小脳におけるネイティブＡＳＰＤ量は微量しか存在しないことが明らかとなった（非特許文献３）。したがってアミロスフェロイドは、アルツハイマー病が発症する不可逆的段階において重要な役割を果たすと考えられる。さらに、ネイティブＡＳＰＤは、レビー小体型認知症患者の脳からも検出されており（非特許文献３）、レビー小体型認知症においてもＡＳＰＤはその発症において重要な役割を果たすと考えられる。
　ネイティブＡＳＰＤと等価であると考えられる合成ＡＳＰＤは、Ａβを含む液体をゆっくり撹拌することにより製造されうる（非特許文献１、特許文献４）。
　また、ネイティブＡＳＰＤと等価であると考えられる細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体は、例えば、所定のＡＰＰタンパク質を発現するＣＨＯ細胞から分泌させることができ、該ＣＨＯ細胞の培養上清から得ることができる（特許文献５）。
ＷＯ２００６／０１６６４４ ＷＯ２００９／０５７６６４ ＷＯ２０１３／０９９８０６ ＷＯ２０１３／０９４６１４ ＷＯ２０１７／１７９６４６
Hoshi et al., Spherical aggregates of β-amyloid (amylospheroid) show high neurotoxicity and activate tau protein kinase I/glycogen synthase kinase-3β, PNAS May 27, 2003 vol. 100 no. 11 6370-6375 Ohnishi et al., Na, K-ATPase α3 is a death target of Alzheimer patient amyloid-β assembly, PNAS August 11, 2015 vol. 112 no. 32 E4465-E4474 Noguchi et al., Isolation and characterization of patient-derived, toxic, high mass amyloid beta-protein (Abeta) assembly from Alzheimer disease brains, J Biol Chem. 2009 Nov 20;284(47):32895-905
　上述のとおり、アミロスフェロイド（ＡＳＰＤ）はアルツハイマー病やレビー小体型認知症において重要な役割を果たす。ＡＳＰＤが関与する疾病の予防、診断、治療等において、対象（患者）の生体試料中のＡＳＰＤを分析する必要性が高まっている。
　また、ＡＳＰＤを標的とする治療薬が開発された際には、そのコンパニオン診断のためにＡＳＰＤの分析が必要となる。
　物質を分析（測定を含む）する場合、通常、標準物質（スタンダード）が必要である。標準物質は、例えば、キャリブレーションや検量線の作成に使用される。ネイティブＡＳＰＤ、合成ＡＳＰＤ、及び細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体は、ＡＳＰＤの分析の標準物質として使用できる。
　一方で、診断キットの標準物質としては、安定した製造が可能で、保管安定性に優れ、製造コストが低いことが望まれる。ネイティブＡＳＰＤ、合成ＡＳＰＤ、及び細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体は、ＡＳＰＤを分析するためのキットの標準物質としては、製造の容易性、保管安定性、製造コストなどの観点から問題がある。
　そこで、本開示は、一態様において、ＡＳＰＤの代替物となりうる物質、又は、ＡＳＰＤの分析においてＡＳＰＤの標準物質となりうる物質を提供する。
　また、本開示は、その他の一態様において、生体試料、例えば、血液や脳脊髄液中のＡＳＰＤを分析できる方法を提供する。
　本開示は、一態様において、ＡＳＰＤに特異的な抗体に対してＡＳＰＤと競合する物質であって、Ａβが架橋剤によって架橋された物質であり、前記架橋剤は、スペーサーアーム長が４Å以上５０Å以下である架橋剤、又は、スペーサーアームとして１以上１３以下のオキシエチレン基（－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－）及び／又はオキシプロピレン基（－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－）を有する架橋剤である物質に関する。
　本開示は、その他の態様において、Ａβの架橋体であって、Ａβが、スペーサーアーム長が４Å以上５０Å以下である架橋剤、又は、スペーサーアームとして１以上１３以下のオキシエチレン基及び／又はオキシプロピレン基を有する架橋剤によって架橋されている架橋体に関する。
　本開示は、その他の態様において、下記の工程：
（１）不溶性担体に結合している、ＡＳＰＤに結合可能な抗体（第一抗体）に、ＡＳＰＤを含有している可能性がある生体由来試料を接触させて、ＡＳＰＤが含有されている場合に第一抗体にＡＳＰＤを結合させる工程；及び
（２）工程（１）で第一抗体に結合したＡＳＰＤに、抗ＡＳＰＤモノクローナル抗体（第二抗体）を反応させる工程
を含み、
　第一抗体が、ヒト化抗ＡＳＰＤモノクローナル抗体ｈｕＡＳＤ２、又は、モノクローナル抗体ＢＡＮ５０ａであり、第二抗体が、抗ＡＳＰＤモノクローナル抗体ｍＡＳＤ３又はその標識化抗体である、ＡＳＰＤの分析方法に関する。
　本開示によれば、一態様において、ＡＳＰＤの代替物となりうる物質、又は、ＡＳＰＤの分析においてＡＳＰＤの標準物質となりうる物質を提供できる。
　また、本開示によれば、その他の一態様において、生体試料、例えば、血液や脳脊髄液中のＡＳＰＤを分析できる方法を提供できる。
図１は、Ａβ架橋体１～３のＳＤＳＰＡＧＥを行った結果の一例である。 図２は、ＡＳＰＤのＣＬＥＩＡの一実施形態［抗ＡＳＰＤポリクローナル抗体／ｍＡＳＤ３］を説明する概略図である。 図３は、ＡＳＰＤのＣＬＥＩＡにおける反応性を、ＡＳＰＤとＡβ架橋体１～３で比較した結果を示すグラフの一例である。 図４は、市販のＡβオリゴマーＥＬＩＳＡ、及び、ＡＳＰＤのＣＬＥＩＡにおける反応性を、Ａβ架橋体１、ＡＳＰＤ、及びＡβ１－１６ダイマーで比較した結果を示すグラフの一例である。 図５は、Ａβ架橋体１の免役原性を確認した結果の一例であって、Ａβ架橋体１で免疫されたウサギの血清が固相化された合成ＡＳＰＤに反応することを示す結果である。 図６は、ＡＳＰＤを添加したヒトＣＳＦの希釈サンプル（希釈率１倍、１／２、１／４、及び１／８）のＡＳＰＤのＣＬＥＩＡによる測定値をプロットした結果のグラフの一例である。 図７は、ＡＳＰＤを添加したヒト血漿の希釈サンプル（希釈率１倍、１／２、１／４、１／８、及び１／１６）のＡＳＰＤのＣＬＥＩＡによる測定値をプロットした結果のグラフの一例である。 図８は、ＡＳＰＤのＣＬＥＩＡの一実施形態［ｈｕＡＳＤ２／ｍＡＳＤ３］を説明する概略図である。 図９は、ＡＳＰＤのＣＬＥＩＡ［ｈｕＡＳＤ２／ｍＡＳＤ３］で独立した４つのＡＳＰＤ含有サンプルを測定した結果のグラフの一例である。 図１０は、ＡＳＰＤのＣＬＥＩＡの一実施形態［ｈｕＡＳＤ２／ビオチン化ｍＡＳＤ３］を説明する概略図である。 図１１は、ＡＳＰＤのＣＬＥＩＡ［ｈｕＡＳＤ２／ビオチン化ｍＡＳＤ３］でＡＳＰＤ含有サンプルを測定した結果のグラフの一例である。 図１２は、ＡＳＰＤのＣＬＥＩＡ［ｈｕＡＳＤ２／ビオチン化ｍＡＳＤ３］システムと、［ＢＡＮ５０／ビオチン化ＢＡＮ５０］システムで、ＡＳＰＤとＭＡＰ１６を検出した結果のグラフの一例である。 図１３は、さまざまな［第一抗体／第二抗体］の組み合わせで、ヒト血漿サンプル（希釈率１／４）とバッファーサンプルの結果を比較した結果の一例である。 図１４は、アルツハイマー病（ＡＤ）と診断された患者の血漿サンプル１０例と、健常者の血漿サンプル１０例に対して、ＡＳＰＤのＣＬＥＩＡ［ｈｕＡＳＤ２／ビオチン化ｍＡＳＤ３］を行った結果の一例である。
　本開示は、一態様において、所定の架橋剤で架橋したＡβの架橋体が、ＡＳＰＤに特異的な抗体に対してＡＳＰＤと同様の反応性を示すという知見に基づく。
　本開示は、その他の態様において、所定の抗体の組み合わせにより、生体試料内のＡＳＰＤを効率的に分析できるという知見に基づく。
　本開示において、単にＡＳＰＤという場合には、ネイティブＡＳＰＤ、合成ＡＳＰＤ、及び細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体を含みうる。
　ＡＳＰＤに特異的な抗体としては、一又は複数の実施形態において、ＷＯ２００６／０１６６４４及びＷＯ２００９／０５７６６４に開示されるポリクローナル抗ＡＳＰＤ抗体及びモノクローナル抗ＡＳＰＤ抗体が挙げられ、さらなる一又は複数の実施形態において、ウサギポリクローナル抗ＡＳＰＤ抗体（ｒｐＡＳＤ１、ｒｐＡＳＤ２及びｒｐＡＳＤ３）、マウスモノクローナル抗ＡＳＰＤ抗体（ｍＡＳＤ１、ｍＡＳＤ２及びｍＡＳＤ３）、ハムスターモノクローナル抗ＡＳＰＤ抗体（ｈａＡＳＤ１、ｈａＡＳＤ２、ｈａＡＳＤ３、ｈａＡＳＤ４及びｈａＡＳＤ５）、並びに、ヒト化モノクローナル抗ＡＳＰＤ抗体（ｈｕＡＳＤ２）等が挙げられる。
　［アミロイドβタンパク質］
　Ａβは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の一部に相当する配列からなるタンパク質で、生体内でβセレクターゼ及びγセレクターゼによってＡＰＰから切り出されるペプチドの配列を有するタンパク質である。
　本開示において、単にＡβというときは、Ａβ３８（Ａβ１－３８）、Ａβ３９（Ａβ１－３９）、Ａβ４０（Ａβ１－４０）、Ａβ４１（Ａβ１－４１）、Ａβ４２（Ａβ１－４２）、Ａβ４３（Ａβ１－４３）、又はこれらの全部若しくは一部を指し得る。
　本開示において、単にＡβというときは、ヒトＡβ及び非ヒト哺乳類Ａβを含みうる。
　ヒトＡＰＰとしては、一又は複数の実施形態において、ｈＡＰＰ７７０、ｈＡＰＰ７５１、及びｈＡＰＰ６９５などのスプライシングバリアントが挙げられる。ｈＡＰＰ７７０（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０００４７５（VERSION NP#000475.1 GI:4502167）が挙げられるが、これに限定されない。
　ヒトＡβのＮ末端のアミノ酸（Ａβの１番目のアミノ酸）は、ｈＡＰＰ７７０の６７２番目のアミノ酸Ｄ（アスパラギン酸）に相当する。
　本開示において、単にＡβというときは、野生型及び変異型のＡβを含みうる。
　変異型Ａβとしては、一又は複数の実施形態において、変異型ＡＰＰから切り出されるペプチドの配列を有するものが挙げられる。変異型ＡＰＰとしては、家族性アルツハイマー病に連鎖する変異が挙げられ、例えば、Ｓｗｅｄｉｓｈ変異、Ｌｅｕｖｅｎ変異、Ｉｃｅｌａｎｄｉｃ変異、Ｌｏｎｄｏｎ変異、Ｉｒａｎｉａｎ変異、Ａｕｓｔｒｉａｎ変異、Ｇｅｒｍａｎ変異、Ｆｒｅｎｃｈ変異、Ｆｌｏｒｉｄａ変異、Ｉｂｅｒｉａｎ変異、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ変異、Ｂｅｌｇｉａｎ変異、Ｆｌｅｍｉｓｈ変異、Ｉｃｅｌａｎｄｉｃ変異、Ｂｒｉｔｉｓｈ変異、Ｔｏｔｔｏｒｉ変異、Ｉｔａｌｉａｎ変異、Ａｒｃｔｉｃ変異、Ｏｓａｋａ変異、Ｉｏｗａ変異、Ｄｕｔｃｈ変異などが挙げられる。その他の変異としては、修飾アミノ酸、非天然アミノ酸、Ｄ－アミノ酸等への変異を含みうる。修飾アミノ酸としては、一又は複数の実施形態において、アミノ基修飾、カルボキシル基修飾、チオール基修飾、水酸基修飾、糖化修飾、ＰＥＧ化修飾等が挙げられる。
　［Ａβ架橋体］
　本開示は、一態様において、所定の架橋体でＡβが架橋されたＡβ架橋体に関する。Ａβについては、上述のとおりである。
　本開示に係るＡβ架橋体に用いる架橋剤は、一又は複数の実施形態において、スペーサーアーム長が４Å以上５０Å以下である架橋剤である。スペーサーアーム長とは、架橋剤の分子スパン（結合分子間の距離）をいう。架橋体のスペーサーアーム長は、市販の架橋体のカタログや製品説明書に記載されており、当業者であれば適宜選択し入手できる。
　スペーサーアーム長としては、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤに特異的な抗体に対する反応性をＡＳＰＤに近づける観点から、４Å以上であって、７Å以上が好ましく、１０Å以上が好ましく、１３Å以上がより好ましく、１４Å以上がより好ましく、１５Å以上がより好ましく、１６Å以上がさらに好ましく、１７Å以上がさらに好ましく、１８Å以上がさらに好ましく、１９Å以上がさらに好ましく、２０Å以上がさらに好ましく、２１Å以上がさらに好ましい。
　スペーサーアーム長としては、一又は複数の実施形態において、同様の観点から、５０Å以下であって、４５Å以下が好ましく、４０Å以下がより好ましく、３６Å以下がさらに好ましく、３３Å以下がさらに好ましく、３０Å以下がさらに好ましく、２７Å以下がさらに好ましく、２４Å以下がさらに好ましい。
　本開示に係るＡβ架橋体に用いる架橋剤は、一又は複数の実施形態において、スペーサーアームとして１以上１３以下のオキシエチレン基（－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－、ＥＯ基）及び／又はオキシプロピレン基（－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－、ＰＯ基）を有する架橋剤である。スペーサーアームとは、架橋剤の反応性末端間の骨格又は基をいう。
　スペーサーアームにおけるＥＯ基及びＰＯ基の合計の数としては、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤに特異的な抗体に対する反応性をＡＳＰＤに近づける観点から、１以上であって、２以上が好ましく、３以上がより好ましく、４以上がさらに好ましい。
　スペーサーアームにおけるＥＯ基及びＰＯ基の合計の数としては、一又は複数の実施形態において、同様の観点から、１３以下であって、１０以下が好ましく、９以下がより好ましく、８以下がさらに好ましく、７以下がさらに好ましく、６以下がさらに好ましい。
　本開示に係るＡβ架橋体に用いる架橋剤の架橋標的は、一又は複数の実施形態において、アミノ基、スルフヒドリル基、カルボキシル基、非選択などが挙げられる。
　本開示に係るＡβ架橋体に用いる架橋剤の反応末端は、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤに特異的な抗体に対する反応性をＡＳＰＤに近づける観点から、アミノ基間を架橋する反応末端が好ましく、ＮＨＳエステル又はイミドエステルが挙げられる。
　本開示に係るＡβ架橋体に用いる架橋剤は、開裂性があってもよく、なくてもよい。安定性の観点からは、開裂性はないことが好ましい。
　本開示に係るＡβ架橋体に用いる架橋剤は、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤに特異的な抗体に対する反応性をＡＳＰＤに近づける観点から、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）　（ＥＧＳ、スペーサーアーム長１６．１Å）、スルホＥＧＳ（スペーサーアーム長１６．１Å）、ビス（スクシンイミジル）ペンタ（エチレングリコール）　（ＢＳ（ＰＥＧ）5、スペーサーアーム長２１．７Å）、ビス（スクシンイミジル）ノナ（エチレングリコール）　（ＢＳ（ＰＥＧ）9、スペーサーアーム長３５．８Å）が好ましく、ＢＳ（ＰＥＧ）5、及びＢＳ（ＰＥＧ）9がより好ましく、ＢＳ（ＰＥＧ）5がさらに好ましい。
　本開示に係るＡβ架橋体に用いるＡβは、ＡＳＰＤに特異的な抗体に対する反応性をＡＳＰＤに近づける観点から、Ａβ３８、Ａβ３９、Ａβ４０、Ａβ４１又はＡβ４２が挙げられ、Ａβ４０又はＡβ４２が好ましく、Ａβ４２がより好ましい。
　本開示に係るＡβ架橋体の分子量は、一又は複数の実施形態において、１０－２０％ＳＤＳＰＡＧＥで分析される分子量として、１００ｋＤａを超え、又は、１１４ｋＤａを超える。
　本開示に係るＡβ架橋体は、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤの細胞毒性、すなわち、機能的に成熟した神経細胞に選択的に細胞死を誘発する特性が、ＡＳＰＤと同等であってもよく、或いは、ＡＳＰＤよりも弱毒性であってもよく、或いは、細胞毒性を有していなくてもよく、或いは、ＡＳＰＤと比べて毒性が高くてもよい。本開示に係るＡβ架橋体は、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤよりも弱毒性であってもよく、或いは、細胞毒性を有していない。
　本開示に係るＡβ架橋体は、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤに特異的な抗体に対する反応性が、ＡＳＰＤ以外のＡβ凝集体の反応性に比べて、ＡＳＰＤの反応性に近く、より好ましくは、ＡＳＰＤと同等な反応性である。
　本開示に係るＡβ架橋体は、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤに特異的な抗体に対してＡＳＰＤと競合する物質である。
　本開示に係るＡβ架橋体は、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤに特異的な抗体に対する反応性の観点から、ＡＳＰＤの代替物となりうる。
　本開示に係るＡβ架橋体は、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤ分析又はそのキットの標準物質となりうる。
　本開示において、ＡＳＰＤの分析は、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤの検出、測定、定量、及びそれらを利用するスクリーニングを含みうる。
　本開示に係るＡβ架橋体が標準物質として使用されるＡＳＰＤ分析としては、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤに特異的な抗体を使用する免疫測定法を利用した分析が挙げられ、より具体的には、ＡＳＰＤに特異的な抗体を使用する酵素免疫測定法、化学発光・酵素免疫測定法が挙げられ、より具体的には、ＡＳＰＤに特異的な抗体を使用するEnzyme-Linked Immunosorbent Assay（ＥＬＩＳＡ）やChemiluminescent Enzyme immunoassay（ＣＬＥＩＡ）などが挙げられる。
　一又は複数の実施形態において、本開示に係るＡβ架橋体は、ＡＳＰＤ分析において検量線の作成に使用されうる。その他の一又は複数の実施形態において、本開示に係るＡβ架橋体は、ＡＳＰＤ分析においてポジティブコントロールとして使用されうる。
　本開示に係るＡβ架橋体は、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病の診断におけるＡＳＰＤ分析の標準物質となりうる。ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病としては、一又は複数の実施形態において、アルツハイマー病、及びレビー小体型認知症などが挙げられる。
　本開示に係るＡβ架橋体は、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断におけるＡＳＰＤ分析又はそのキットの標準物質となりうる。本開示に係るＡβ架橋体は、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断薬の一成分となりうる。
　よって、本開示は、その他の態様において、本開示に係るＡβ架橋体を標準物質として含むＡＳＰＤ分析キットに関する。本態様に係るＡＳＰＤ分析キットは、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤに特異的な抗体を使用する免疫測定法に必要な試薬を含む。前記試薬としては、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤに特異的な抗体が挙げられる。
　本態様に係るＡＳＰＤ分析キットは、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病の診断のためのＡＳＰＤ分析キット、ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断のためのＡＳＰＤ分析キット、又は、ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断薬である。
　ＡＳＰＤを標的とした治療薬としては、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病の予防、改善、及び／又は治療のための医薬組成物が挙げられる。
　本開示に係るＡβ架橋体は、一又は複数の実施形態において、免疫原性を有し、本開示に係るＡβ架橋体に対する抗体の産生を誘導しうる。
　また、本開示に係るＡβ架橋体は、一又は複数の実施形態において、免疫原性を有し、ＡＳＰＤに対する抗体の産生を誘導しうる。
　よって、本開示に係るＡβ架橋体は、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤに対する抗体を誘導できる観点から、ＡＳＰＤの代替物となりうる。
　ＡＳＰＤを、ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病に対して能動ワクチンとして使用することはすでに開示されている（例えば、ＷＯ２０１７／１７９６４６）。
　本開示に係るＡβ架橋体はＡＳＰＤの代替物となりうることから、本開示に係るＡβ架橋体も、能動ワクチンとして使用でき、また、ワクチンの製造に使用できる。
　よって、本開示は、一態様において、本開示に係るＡβ架橋体を有効成分とする医薬組成物に関する。本開示に係る医薬組成物の一又は複数の実施形態として、本開示に係るＡβ架橋体を含むワクチンが挙げられる。本開示に係る医薬組成物及びワクチンは、薬学的に許容される腑形剤及び／又はアジュバントを含んでもよい。
　本開示に係る医薬組成物及びワクチンは、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病の予防、改善、及び／又は治療のために使用されうる。本開示に係る医薬組成物及びワクチンは、一又は複数の実施形態において、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の予防、改善、及び／又は治療のために使用されうる。
　本開示に係る医薬組成物及びワクチンは、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病を罹患するおそれのある対象、罹患したおそれのある対象、又は、罹患した対象に投与されうる。本開示に係る医薬組成物は、一又は複数の実施形態において、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症を罹患するおそれのある対象、罹患したおそれのある対象、又は、罹患した対象に投与されうる。該対象としては、哺乳類、ヒト、ヒト以外の哺乳類が挙げられる。
　本開示に係る医薬組成物及びワクチンをＡＳＰＤ、ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病、又は、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症に対する免疫を対象に獲得させる一又は複数の実施形態について説明する。本開示に係る医薬組成物及びワクチンの投与法は、一又は複数の実施形態において、筋内、腹腔内、皮内若しくは皮下への注射、又は、口道、消化管、気道、尿生殖路への経粘膜投与が含まれうる。本開示に係る医薬組成物及びワクチンにおけるＡβ架橋体の投与量としては、投与対象に著しい副作用を及ぼすことなく免疫防御応答を誘発する量が挙げられる。本開示に係る医薬組成物及びワクチンの投与量は、一又は複数の実施形態において、細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体を０．０１μｇ～１０ｍｇ、０．１μｇ～１０００μｇ、１μｇ～１００μｇ、５μｇ～５０μｇ、又は５μｇ～２５μｇの範囲で含むことになると量と見込まれる。初期投与に続いて、十分な間を置いて１回又は数回のブースター投与をしてもよい。
　したがって、本開示は一態様において、ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病（例えば、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症）の予防、改善、及び／又は治療の方法であって、本開示に係るＡβ架橋体又は本開示に係る医薬組成物若しくはワクチンを対象に投与することを含む方法に関する。
　本開示は、その他の態様において、ＡＳＰＤそれ自体に対する免疫を対象に獲得させる方法であって、本開示に係るＡβ架橋体又は本開示に係る医薬組成物若しくはワクチンを対象に投与することを含む方法に関する。
　本開示は、さらにその他の態様において、ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病に対する免疫を対象に獲得させる方法であって、本開示に係るＡβ架橋体又は本開示に係る医薬組成物若しくはワクチンを対象に投与することを含む方法に関する。
　また、本開示は、一態様において、本開示に係るＡβ架橋体と、腑形剤及び／又はアジュバントとを組合せることを含む、医薬組成物又はワクチンの製造方法に関する。
　本開示は、その他の態様において、本開示に係るＡβ架橋体を有効成分とする医薬組成物、又は、本開示に係るＡβ架橋体を有するワクチンの製造方法であって、後述する製造方法により本開示に係るＡβ架橋体を製造する工程を含む製造方法に関する。
　［Ａβ架橋体の製造方法］
　本開示に係るＡβ架橋体は、一又は複数の実施形態において、Ａβが水性溶媒に溶解したＡβ水溶液に、架橋剤を添加して架橋反応をさせることで得ることができる。
　Ａβは、ペプチド合成により調製してもよく、組み換え技術で生産してもよい。
　添加する架橋剤の量は、一又は複数の実施形態において、Ａβに対しモル換算で、１０倍以上、２０倍以上、又は３０倍以上である。添加する架橋剤の量は、一又は複数の実施形態において、モル換算で、２００倍以下、１００倍以下、又は７５倍以下である。
　架橋反応後の架橋体は、さらに、限外ろ過に供してもよい。保持液又はフィルター残渣の回収液中に本開示に係るＡβ架橋体を得ることができる。
　限外ろ過フィルターの分子量カットオフ値（ＭＷＣＯ）としては、一又は複数の実施形態において、３０ｋＤａ、５０ｋＤａ、又は１００ｋＤａが挙げられる。
　本開示に係るＡβ架橋体は、一又は複数の実施形態において、実施例の記載の方法で製造できる。
　したがって、本開示は、以下の実施形態に関しうる；
　［Ａ１］　Ａβが、スペーサーアーム長が４Å以上５０Å以下である架橋剤によって架橋されている、Ａβ架橋体。
　［Ａ２］　Ａβが、スペーサーアームとして１以上１３以下のＥＯ基及び／又はＰＯ基を有する架橋剤によって架橋されている、Ａβ架橋体。
　［Ａ３］　Ａβが、Ａβ３８、Ａβ３９、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２、又はＡβ４３である、［Ａ１］又は［Ａ２］に記載のＡβ架橋体。
　［Ａ４］　架橋剤が、アミノ基間を架橋する反応末端を有する架橋剤である、［Ａ１］から［Ａ３］のいずれかに記載のＡβ架橋体。
　［Ａ５］　１０－２０％ＳＤＳＰＡＧＥで分析される分子量が１００ｋＤａを超える、［Ａ１］から［Ａ４］のいずれかに記載のＡβ架橋体。
　［Ａ６］　ＡＳＰＤに特異的な抗体に対してＡＳＰＤと競合する物質である、［Ａ１］から［Ａ５］のいずれかに記載のＡβ架橋体。
　［Ａ７］　ＡＳＰＤ分析の標準物質である、［Ａ１］から［Ａ６］のいずれかに記載のＡβ架橋体。
　［Ａ８］　ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病の診断におけるＡＳＰＤ分析の標準物質である、［Ａ１］から［Ａ７］のいずれかに記載のＡβ架橋体。
　［Ａ９］　ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断におけるＡＳＰＤ分析の標準物質である、［Ａ１］から［Ａ８］のいずれかに記載のＡβ架橋体。
　［Ａ１０］　ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断薬の一成分である、［Ａ１］から［Ａ９］のいずれかに記載のＡβ架橋体。
　［Ｂ１］　ＡＳＰＤに特異的な抗体に対してＡＳＰＤと競合する物質としての、［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体の使用。
　［Ｂ２］　ＡＳＰＤに特異的な抗体に対するＡＳＰＤの代替物としての、［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体の使用。
　［Ｂ３］　ＡＳＰＤ分析の標準物質としての、［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体の使用。
　［Ｂ４］　ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病の診断における、［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体の使用。
　［Ｂ５］　前記診断が、ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断である［Ｂ４］に記載の使用。
　［Ｂ６］　ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病の診断におけるＡＳＰＤ分析の標準物質としての、［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体の使用。
　［Ｂ７］　ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病が、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症である、［Ｂ６］に記載のＡβ架橋体の使用。
　［Ｂ８］　ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断におけるＡＳＰＤ分析の標準物質としての、［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体の使用。
　［Ｂ９］　ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断薬の一成分としての、［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体の使用。
　［Ｃ１］　［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体を標準物質として含む、ＡＳＰＤ分析キット。
　［Ｃ２］　さらに、ＡＳＰＤに特異的な抗体を含む、［Ｃ１］に記載のＡＳＰＤ分析キット。
　［Ｃ３］ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病の診断のための、［Ｃ１］又は［Ｃ２］に記載のＡＳＰＤ分析キット。
　［Ｃ４］　ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病が、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症である、［Ｃ３］に記載のＡＳＰＤ分析キット。
　［Ｃ５］ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断のための、［Ｃ１］から［Ｃ４］のいずれかに記載のＡＳＰＤ分析キット。
　［Ｃ６］　［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体を標準物質として含む、ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断薬。
　［Ｃ７］　［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体を標準物質として使用することを含む、ＡＳＰＤ分析方法。
　［Ｃ８］　ＡＳＰＤに特異的な抗体を用いて免疫分析することを含む、［Ｃ７］に記載のＡＳＰＤ分析方法。
　［Ｃ９］　ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病の診断のための、［Ｃ７］又は［Ｃ８］に記載のＡＳＰＤ分析方法。
　［Ｃ１０］　ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病が、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症である、［Ｃ９］に記載のＡＳＰＤ分析方法。
　［Ｃ１１］　ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断のための、［Ｃ７］から［Ｃ１０］のいずれかに記載のＡＳＰＤ分析方法。
　［Ｃ１２］　ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断方法であって、[Ｃ７］から［Ｃ１１］のいずれかに記載のＡＳＰＤ分析方法を行うことを含む、診断方法。
　［Ｃ１３］　ＡＳＰＤを標的とした治療薬が、ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病の予防、改善、及び／又は治療のための医薬組成物である、［Ｃ１２］に記載の診断方法。
　［Ｃ１４］　ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病が、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症である、［Ｃ１３］に記載の診断方法。
　［Ｄ１］　［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体を有効成分とする医薬組成物。
　［Ｄ２］　［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体を含むワクチン。
　［Ｄ３］　［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体の能動ワクチンとしての使用。
　［Ｄ４］　ワクチン製造における［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体の使用。
　［Ｄ５］　ワクチンは、ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病に対するワクチンである、［Ｄ２］に記載のワクチン、又は、［Ｄ３］若しくは［Ｄ４］に記載の使用。
　［Ｄ６］　ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病の予防、改善、及び／又は治療の方法であって、［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体、［Ｄ１］に記載の医薬組成物、又は、［Ｄ２］に記載のワクチンを対象に投与することを含む、方法。
　［Ｄ７］　ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病が、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症である、［Ｄ６］に記載の方法。
　［Ｄ８］　ＡＳＰＤに対する免疫を対象に獲得させる方法であって、［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体、［Ｄ１］に記載の医薬組成物、又は、［Ｄ２］に記載のワクチンを対象に投与することを含む、方法。
　［Ｄ９］　ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病に対する免疫を対象に獲得させる方法であって、［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体、［Ｄ１］に記載の医薬組成物、又は、［Ｄ２］に記載のワクチンを対象に投与することを含む、方法。
　［Ｄ１０］　ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病が、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症である、［Ｄ９］に記載の方法。
　［Ｄ１１］　［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体と、薬学的に許容される腑形剤とを組み合わせることを含む、医薬組成物又はワクチンの製造方法。
　［ＡＳＰＤの分析方法］
　本開示は、一態様において、下記の工程（１）及び（２）を含むＡＳＰＤの分析方法（以下、「本開示に係るＡＳＰＤ分析方法」ともいう）に関する。
　（１）不溶性担体に結合している、ＡＳＰＤに結合可能な抗体（第１抗体）に、ＡＳＰＤを含有している可能性がある生体由来試料を接触させて、ＡＳＰＤが含有されている場合に第１抗体にＡＳＰＤを結合させる工程。
　（２）工程（１）で第１抗体に結合したＡＳＰＤに、抗ＡＳＰＤモノクローナル抗体（第２抗体）を反応させる工程。
　ここで、第１抗体が、ヒト化抗ＡＳＰＤモノクローナル抗体ｈｕＡＳＤ２、又は、モノクローナル抗体ＢＡＮ５０ａであり、
　第２抗体が、マウスモノクローナル抗ＡＳＰＤ抗体ｍＡＳＤ３又はその標識化抗体である。
　本開示に係るＡＳＰＤ分析方法は、免疫測定法の原理を利用する方法であって、一又は複数の実施形態において、ＥＬＩＳＡなどの酵素免疫測定法、ＣＬＥＩＡなどの化学発光酵素免疫測定法である。
　不溶性担体に結合させる第１抗体としては、一又は複数の実施形態において、血液、血漿成分、脳脊髄液又はそれらの希釈液を試料とした場合の検出感度を向上させる観点からｈｕＡＳＤ２、又は、ＢＡＮ５０ａが好ましい。
　ｈｕＡＳＤ２は、ＷＯ２００９／０５７６６４に記載されるものであり、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列の重鎖可変領域及び、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列の軽鎖可変領域を有するヒト化モノクローナル抗ＡＳＰＤ抗体である。
配列番号１：EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYFMSWVRQAPGKGLEWVGGIEIKSYFYATYYFGSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTTNREVGGLDNWGQGTLVTVSS
配列番号２：QSVLTQPSSLSASPGASASLTCTLRSGISVGGKNIYWYQQKPGSPPQYLLKYSSYSNKQLGPGVPSRFSGSKDASANAGILLISGLQSEDEADYYCSIHESNAYVFGGGTKLTVLGR
　ｈｕＡＳＤ２は、例えば、ＡＳＤ２ＲＨＡｐＧ１Ｄ２００（特許生物寄託センター受託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１０４０）ＡＳＤ２ＲＬＡｐＬＮ１００（特許生物寄託センター受託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１０４１）を公知の動物細胞にコトランスフェクトし、発現させることにより得ることができる。
　なお、一又は複数の実施形態において、本開示におけるｈｕＡＳＤ２は、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列の重鎖可変領域及び、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列の軽鎖可変領域を有する抗ＡＳＰＤ抗体で代用できる。
配列番号３：EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYFMSWVRQAPGKGLEWVXGIEIKSYFYATYYFGSVKGRFTISRDDSKNTXYLQMNSLKTEDTAVYYCTXNREVGGLDNWGQGTLVTVSS
配列番号４：QXVLTQPXSLSASPGASASLTCTLRSGISVGGKNIYWYQQKPGSPPQXXLXYSSYSNKQLGPGVPSRFSGSKDXSANAXILLISGLQSEDEADYYCSIHESNAYVFGGGTKLTVLG
（配列番号３において、第４９位のＸは、Ｇ又はＡであり、第８１のＸは、Ｌ又はＶであり、第１００位のＸは、Ｔ又はＲである。配列番号４において、第２位のＸは、Ｓ又はＡであり、第８位のＸは、Ｓ又はＡであり、第４８位のＸは、Ｙ又はＦであり、第４９位のＸは、Ｌ又はＦであり、第５１位のＸは、Ｋ又はＦ又はＲであり、第７４位のＸは、Ａ又はＴであり、第７９位のＸは、Ｇ又はＡである。）
　本開示において、ＢＡＮ５０ａは、国際公開ＷＯ９４－１７１９７号パンフレットに記載された、ＡβのＮ末端領域を特異的に認識する公知のモノクローナル抗体である。ＢＡＮ５０ａは市販のものを使用でき、あるいは、特許生物寄託センターハイブリドーマＢＡＮ５０（受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ４１６３）を用いて、公知の方法により製造することができる。
　第２抗体は、一又は複数の実施形態において、検出感度を向上させる観点から、ｍＡＳＤ３の標識化抗体が挙げられる。標識化としては、一又は複数の実施形態において、ビオチン化が挙げられる。
　本開示に係るＡＳＰＤ分析方法における不溶性担体としては、一又は複数の実施形態において、ビーズや、マルチウェルプレートなどの固相物が挙げられる。
　ＡＳＰＤを含有している可能性がある生体由来試料としては、一又は複数の実施形態として血液、血漿、及び脳脊髄液、ならびにそれらの希釈物が挙げられる。
　本開示に係るＡＳＰＤ分析方法は、一又は複数の実施形態において、工程（１）の前に生体由来試料を調製する工程（０）を含んでもよい。この試料調製工程（０）は、一又は複数の実施形態において、血液、血漿、及び脳脊髄液などの生体試料を適当な溶媒又はバッファーに希釈することを含む。また、この試料調製工程（０）は、一又は複数の実施形態において、前記溶媒又はバッファーは、分析を妨げない範囲で、界面活性剤やその他の薬剤を含んでもよい。
　本開示に係るＡＳＰＤ分析方法は、一又は複数の実施形態において、さらに下記の工程（３）を含んでいてもよい。
　（３）工程（２）でＡＳＰＤに結合した第２抗体に、レポーターが連結した抗マウス抗体を反応させる工程、又は、工程（２）でＡＳＰＤに結合した第２抗体の標識に、レポーターが連結した前記標識の結合パートナーを反応させる工程。
　レポーターとしては、一又は複数の実施形態において、化学発光や生物発光を利用する物質、蛍光タンパク質などが挙げられ、検出感度を向上させる観点からは化学発光や生物発光を利用する物質が好ましい。
　化学発光や生物発光を利用する物質としては、一又は複数の実施形態において、生物発光酵素やその改変体などの酵素が挙げられる。
　前記酵素としては、一又は複数の実施形態において、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）、及び、アルカリフォスファターゼなどが挙げられる。
　前記結合パートナーとしては、一又は複数の実施形態において、標識がビオチンである場合、ストレプトアビジン等が挙げられる。
　発光の測定は、一又は複数の実施形態において、ルミノメーターやマルチプレートリーダーで行うことができる。
　本開示に係るＡＳＰＤ分析方法は、一又は複数の実施形態において、本開示に係るＡβ架橋体を標準物質として使用してもよい。
　したがって、本開示は、以下の実施形態に関しうる；
　［Ｅ１］　下記の工程（１）及び（２）を含むＡＳＰＤの分析方法。
　工程（１）不溶性担体に結合している、ＡＳＰＤに結合可能な抗体（第１抗体）に、ＡＳＰＤを含有している可能性がある生体由来試料を接触させて、ＡＳＰＤが含有されている場合に第１抗体にＡＳＰＤを結合させる工程。
　工程（２）工程（１）で第１抗体に結合したＡＳＰＤに、抗ＡＳＰＤモノクローナル抗体（第２抗体）を反応させる工程。
　ここで、第１抗体が、ヒト化抗ＡＳＰＤモノクローナル抗体ｈｕＡＳＤ２、又は、モノクローナル抗体ＢＡＮ５０ａであり、
　第２抗体が、マウスモノクローナル抗ＡＳＰＤ抗体ｍＡＳＤ３又はその標識化抗体である。
　［Ｅ２］　免疫測定法の原理を利用する方法である、［Ｅ１］に記載の分析方法。
　［Ｅ３］　免疫測定法の原理を利用する方法が、ＥＬＩＳＡ又はＣＬＥＩＡである、［Ｅ２］に記載の分析方法。
　［Ｅ４］　生体由来試料が、血液、血漿成分、脳脊髄液又はそれらの希釈液である、［Ｅ１］から［Ｅ３］のいずれかに記載の分析方法。
　［Ｅ５］　工程（１）の前に生体由来試料を調製する工程（０）を含む、［Ｅ１］から［Ｅ４］のいずれかに記載の分析方法。
　［Ｅ６］　試料調製工程（０）は血液、血漿、及び脳脊髄液からなる群から選択される生体試料を溶媒又はバッファーに希釈することを含む、［Ｅ５］に記載の分析方法。
　［Ｅ７］　さらに、下記の工程（３）を含む、［Ｅ１］から［Ｅ６］のいずれかに記載の分析方法。
　工程（３）工程（２）でＡＳＰＤに結合した第２抗体に、レポーターが連結した抗マウス抗体を反応させる工程、又は、工程（２）でＡＳＰＤに結合した第２抗体の標識に、レポーターが連結した前記標識の結合パートナーを反応させる工程。
　［Ｅ８］　ＡＳＰＤの標準物質として後記［１］に記載の物質を使用する、［Ｅ１］から［Ｅ７］のいずれかに記載の分析方法。
　［Ｅ９］　［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体を標準物質として使用することを含む、［Ｅ１］から［Ｅ７］のいずれかに記載の分析方法。
　［Ｅ１０］　ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病の診断のための、［Ｅ１］から［Ｅ９］のいずれかに記載の分析方法。
　［Ｅ１１］　ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病が、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症である、［Ｅ１０］に記載の分析方法。
　［Ｅ１２］　ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断のための、［Ｅ１］から［Ｅ１１］のいずれかに記載の分析方法。
　［Ｅ１３］　ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病の診断方法であって、[Ｅ１］から［Ｅ１２］のいずれかに記載の分析方法を行うことを含む、診断方法。
　［Ｅ１４］　ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病が、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症である、［Ｅ１３］に記載の診断方法。
　［Ｅ１５］　ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断方法であって、[Ｅ１］から［Ｅ１２］のいずれかに記載の分析方法を行うことを含む、診断方法。
　［Ｅ１６］　ＡＳＰＤを標的とした治療薬が、ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病の予防、改善、及び／又は治療のための医薬組成物である、［Ｅ１５］に記載の診断方法。
　［Ｅ１７］　ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病が、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症である、［Ｅ１６］に記載の診断方法。
　［Ｆ１］　ヒト化抗ＡＳＰＤモノクローナル抗体ｈｕＡＳＤ２又はモノクローナル抗体ＢＡＮ５０ａ（第１抗体）と、マウスモノクローナル抗ＡＳＰＤ抗体ｍＡＳＤ３又はその標識化抗体（第２抗体）とを含む、ＡＳＰＤ分析キット。
　［Ｆ２］　さらに、［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体を含む、［Ｆ１］に記載のＡＳＰＤ分析キット。
　［Ｆ３］　［Ｅ１］から［Ｅ１２］のいずれかに記載の分析方法又は［Ｅ１３］から［Ｅ１７］のいずれかに記載の診断方法のための、[Ｆ１]又は［Ｆ２］に記載のＡＳＰＤ分析キット。
　本開示は、以下の実施形態に関しうる；
　［１］　ＡＳＰＤに特異的な抗体に対してＡＳＰＤと競合する物質であって、Ａβが架橋剤によって架橋された物質であり、前記架橋剤は、スペーサーアーム長が４Å以上５０Å以下である架橋剤、又は、スペーサーアームとして１以上１３以下のＥＯ基及び／又はＰＯ基を有する架橋剤である、物質。
　［２］　Ａβの架橋体であって、Ａβが、スペーサーアーム長が４Å以上５０Å以下である架橋剤、又は、スペーサーアームとして１以上１３以下のＥＯ基及び／又はＰＯ基を有する架橋剤によって架橋されている架橋体。
　［３］　［１］に記載の物質又は［２］に記載の架橋体と、抗ＡＳＰＤ抗体とを含む、ＡＳＰＤを分析するためのキット。
　［４］　ＡＳＰＤ分析における、［１］に記載の物質又は［２］に記載の架橋体の標準物質としての使用。
　［５］　ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病の診断における、［１］に記載の物質又は［２］に記載の架橋体の標準物質としての使用。
　［６］　前記診断が、ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断である、［５］に記載の使用。
　［７］　ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病が、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症である、［５］又は［６］に記載の使用。
　［８］　下記の工程：
（１）不溶性担体に結合している、ＡＳＰＤに結合可能な抗体（第１抗体）に、ＡＳＰＤを含有している可能性がある生体由来試料を接触させて、ＡＳＰＤが含有されている場合に第１抗体にＡＳＰＤを結合させる工程；及び
（２）工程（１）で第１抗体に結合したＡＳＰＤに、抗ＡＳＰＤモノクローナル抗体（第２抗体）を反応させる工程
を含み、
　第１抗体が、ヒト化抗ＡＳＰＤモノクローナル抗体ｈｕＡＳＤ２、又は、モノクローナル抗体ＢＡＮ５０ａであり、
　第２抗体が、マウスモノクローナル抗ＡＳＰＤ抗体ｍＡＳＤ３又はその標識化抗体である、ＡＳＰＤの分析方法。
　［９］　さらに、下記の工程：
（３）工程（２）でＡＳＰＤに結合した第２抗体に、レポーターが連結した抗マウス抗体を反応させる工程、又は、工程（２）でＡＳＰＤに結合した第２抗体の標識に、レポーターが連結した前記標識の結合パートナーを反応させる工程
を含む、［８］に記載の分析方法。
　［１０］　ＡＳＰＤの標準物質として［１］に記載の物質又は［２］に記載の架橋体を使用する、［８］又は［９］に記載の分析方法。
　以下に、実施例を用いて本発明の一又は複数の実施形態をさらに説明する。
　以下の実施例において、Ａβ架橋体及びＡＳＰＤの濃度は、特に言及がない場合、Ａβモノマー換算である。
　１．Ａβ架橋体の調製
　下記のＡβ架橋体１－３を調製した。
　　Ａβ架橋体１：Ａβ４２、架橋剤は、ＢＳ（ＰＥＧ）5
　　Ａβ架橋体２：Ａβ４２、架橋剤は、ＢＳ（ＰＥＧ）9
　　Ａβ架橋体３：Ａβ４２、架橋剤は、ＤＦＤＮＢ
　使用した架橋剤は、以下の通り。
ＢＳ（ＰＥＧ）5：Bis(succinimidyl) penta(ethylene glycol)
（スペーサーアーム長：２１．７Å）
ＢＳ（ＰＥＧ）9：Bis(succinimidyl) nona(ethylene glycol)
（スペーサーアーム長：３５．８Å）
ＤＦＤＮＢ：1,5-difluoro-2,4-dinitorobenzene
（スペーサーアーム長：３．０Å）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　Ａβ架橋体のプロトコール
Ａβ４２　０．５６ｍｇを１２０μＬ　ＤＭＳＯで溶解（１ｍＭ）
↓
１０μＬを９０μＬ　ＰＢＳ（－）に添加後２５℃、１５分静置（Ａβとして１００μＭ、０．０４６６６７ｍｇに相当）
↓
架橋試薬ＢＳ（ＰＥＧ）5，ＢＳ（ＰＥＧ）9，又はＤＦＤＮＢを５０倍モル添加後、２５℃、３０分静置
↓
Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ８．０を添加（終濃度５０ｍＭ）、２５℃、３０分静置
↓
ＭＷＣＯ５０Ｋの限外ろ過フィルターでフィルター処理して、高分子画分を得る
ＰＢＳ（－）３００μＬ洗浄ｘ３
メンブレン残渣を５０μＬのＰＢＳ（－）で回収
↓
ＢＣＡ法で濃度測定
　２．Ａβ架橋体のＳＤＳＰＡＧＥ
　得られたＡβ架橋体１～３を用いてＳＤＳＰＡＧＥ（１０－２０％Ｇｅｌ）を行い、架橋されていることを確認した。その結果の一例を図１に示す。
　図１に示す通り、Ａβ架橋体１～３は、それぞれ、高分子化しており、分子量は１００ｋＤａ以上であると認められた。
　３．Ａβ架橋体のＡＳＰＤ　ＣＬＥＩＡ反応性
　得られたＡβ架橋体１～３のＡＳＰＤ　ＣＬＥＩＡ反応性を確認した。
　使用したＡＳＰＤ　ＣＬＥＩＡは、図２に示すシステムであり、固相に固定化した抗ＡＳＰＤポリクローナル抗体（第一抗体）、検出側のマウス抗ＡＳＰＤモノクローナル抗体ｍＡＳＤ３（第二抗体）、及び抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰを使用するシステムである。ｍＡＳＤ３は、ＷＯ２００６／０１６６４４及びＷＯ２００９／０５７６６４に記載されるモノクローナル抗体であって、ハイブリドーマは特許生物寄託センターに寄託されている（寄託番号は、ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０３９４）。ＨＲＰは、ホースラディッシュペルオキシダーゼを表す。
　Ａβ架橋体１～３を被検体としたＡＳＰＤ　ＣＬＥＩＡ［抗ＡＳＰＤポリクローナル抗体／ｍＡＳＤ３］の反応性を、ＡＳＰＤを被検体とした時と比べた結果の一例を図３に示す。
　図３に示す通り、Ａβ架橋体１及び２は、Ａβ架橋体３に比べてＡＳＰＤの反応性に近かった。なかでも、Ａβ架橋体１は、ＡＳＰＤと同等の反応性を示した。
　Ａβ架橋体の反応性比較（続き）
　次に、ＡβのＮ末端を特異的に認識するモノクローナル抗体８２Ｅ１を使用する市販のＡβオリゴマー測定キットを用いてＡβ架橋体の反応性を比較した。
　被検体として、Ａβ架橋体１、ＡＳＰＤ、及びＡβ１－１６ダイマーを使用した。
　また、ＡＳＰＤ　ＣＬＥＩＡ［抗ＡＳＰＤポリクローナル抗体／ｍＡＳＤ３］におけるＡβ架橋体１、ＡＳＰＤ、及びＡβ１－１６ダイマーの反応性を比較した。
　その結果の一例を図４に示す。
　図４に示すとおり、ＡＳＰＤ　ＣＬＥＩＡと同様に、市販のＡβオリゴマー測定キットにおいても、Ａβ架橋体１は、ＡＳＰＤと同等の反応性を示した。
　８２Ｅ１を使用する市販のＡβオリゴマー測定キットでは、Ａβ架橋体１及びＡＳＰＤは、Ａβ１－１６ダイマーと比較して著しく反応性が弱かった。
　反対に、ＡＳＰＤ　ＣＬＥＩＡにおいては、Ａβ１－１６ダイマーの反応性は、Ａβ架橋体１及びＡＳＰＤと比べて著しく反応性が弱かった。
　また、ＡＳＰＤ　ＣＬＥＩＡは、Ａβ架橋体１及びＡＳＰＤに対して特性が高い検出感度を有していることが認められた。
　４．Ａβ架橋体の免疫原性
　ウサギ（ニュージーランドホワイト）に、フロイントアジュバント（ＦＣＡ、初回）、不完全フロイントアジュバント（ＦＩＡ、５回）のアジュバンドとともにＡβ架橋体１の免疫（１００μｇ／回）を６回行い、その後、全採血を行い、血清中の抗体のＡβ架橋体１及び合成ＡＳＰＤに対する反応性の評価を行った。その結果の一例を図５に示す。
　図５において、「ｐｒｅ血清」は、免疫前の血清のＡβ架橋体１固相化プレートに対する反応性を示し、「固相化Ａβ架橋体」は、得られた血清のＡβ架橋体１固相化プレートに対する反応性を示し、「固相化合成ＡＳＰＤ」は、得られた血清の合成ＡＳＰＤ固相化プレートに対する反応性を示し、「ｃｏｎｔｒｏｌ」は、得られた血清のＦ１２タンパク質固相化プレートに対する反応性を示し、「Ｅｍｐｔｙ」は、得られた血清の空プレートに対する反応性を示す。
　図５の結果から、Ａβ架橋体１は、免疫原性があり、ＡＳＰＤに反応する抗体を誘導できることが示された。
　５．脳脊髄液（ＣＳＦ）中のＡＳＰＤの測定
　ＡＳＰＤ　ＣＬＥＩＡシステム［抗ＡＳＰＤポリクローナル抗体／ｍＡＳＤ３］で、ヒトＣＳＦ検体中のＡＳＰＤの測定を行った。具体的には以下のフローで行った。
（１）ＣＳＦに既知濃度ＡＳＰＤを添加し、検体希釈液で希釈（１～１６倍希釈）。
（２）一次反応：ウサギ抗ＡＳＰＤポリクローナル抗体を固定化したマルチウェルプレートに１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃６０分静置。
　　洗浄×３
（３）二次反応：ｍＡＳＤ３（１μｇ／ｍｌ）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃６０分静置。
　　洗浄×３
（４）三次反応：抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（１／２００００）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃６０分静置。
　　洗浄×３
（５）測定：ＨＲＰの化学発光基質（商品名：SuperSignal pico、ThermoFisher社製）を１００μＬ／ウェルで添加し、プレートリーダー（商品名：infinite M200pro、TECAN社製）で発光を測定。
　測定用のスタンダードには、Ａβ凝集体１又は細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体（ＷＯ２０１７／１７９６４６）を用いた。
　検体希釈液には、３％ＢＳＡ　ｉｎ　ＰＢＳ（－）　０．０５％防腐剤（商品名：プロクリン、シグマアルドリッチ社製）を用いた。
　洗浄液には、ＰＢＳ（－）　０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０を用いた。
　ヒトＣＳＦ（Ａｇｅ８４／Ｃａｕｃａｓｉａｎ／Ｍ）に既知濃度ＡＳＰＤを添加し（高濃度Ｈ：１０８ｐＭ、中濃度Ｍ：５４ｐＭ、低濃度Ｌ：２７．５ｐＭ、なしＮ：０ｐＭ）、４倍希釈して定量した結果の一例を下記表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表１に示すように、ほぼ１００％の回収率があった。なお、ヒトＣＳＦ（Ａｇｅ６６／Ｃａｕｃａｓｉａｎ／Ｍ）及びヒトＣＳＦ（Ａｇｅ６９／Ｃａｕｃａｓｉａｎ／Ｍ）を使用した場合も同様の結果が得られた。
　次に、ヒトＣＳＦにＡＳＰＤをスパイクしたサンプルを検体希釈液で２倍、４倍、８倍に希釈し、希釈率が１倍、１／２、１／４、及び１／８であるサンプルを測定した結果を図６に示す。
　図６に示すように、希釈サンプルの結果をプロットした結果、希釈直線性が得られた。
　６．ヒト血漿中のＡＳＰＤの測定
　ＡＳＰＤ　ＣＬＥＩＡ［抗ＡＳＰＤポリクローナル抗体／ｍＡＳＤ３］で、ヒト血漿検体中のＡＳＰＤの測定を行った。具体的には以下のフローで行った。
（１）ヒト血漿に既知濃度ＡＳＰＤを添加し、検体希釈液で希釈（１～１６倍希釈）。
（２）一次反応：ウサギ抗ＡＳＰＤポリクローナル抗体を固定化したマルチウェルプレートに１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃６０分振とう。
　　洗浄×３
（３）二次反応：ｍＡＳＤ３（１μｇ／ｍｌ）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃６０分振とう。
　　洗浄×３
（４）三次反応：抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（１／２００００）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃６０分振とう。
　　洗浄×３
（５）測定：ＨＲＰの化学発光基質（商品名：SuperSignal pico、ThermoFisher社製）を１００μＬ／ウェルで添加し、プレートリーダー（商品名：infinite M200pro、TECAN社製）で発光を測定。
　測定用のスタンダードには、Ａβ凝集体１又は細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体（ＷＯ２０１７／１７９６４６）を用いた。
　検体希釈液には、３％ＢＳＡ　ｉｎ　ＰＢＳ（－）　０．０５％防腐剤（商品名：プロクリン、シグマアルドリッチ社製）を用いた。
　洗浄液には、ＰＢＳ（－）　０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０を用いた。
　ヒト血漿（Ａｇｅ２９／Ｃａｕｃａｓｉａｎ／Ｆ）に既知濃度ＡＳＰＤを添加し、３％ＢＳＡ　ＰＢＳ（－）で４倍希釈して定量した結果の一例を下記表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表２に示すように、ヒトＣＳＦに変えてヒト血漿を用いてもＡＳＰＤを測定できた。しかし、回収率が半分程度であった。血漿成分の影響であると考えられる。
　次に、ヒト血漿にＡＳＰＤをスパイクしたサンプルを検体希釈液で２倍、４倍、８倍、１６倍に希釈し、希釈率が１倍、１／２、１／４、１／８、及び１／１６であるサンプルを測定した結果を図７に示す。
　図７に示すように、希釈サンプルの結果をプロットした結果、希釈直線性が得られた。しかし、バッファーに比べて傾きが１／２になった。血漿成分の影響であると考えられる。
　なお、ヒト血漿試料における回収率への影響は、試料の希釈率を１／１６とすると解消できた。
　７．ＡＳＰＤ　ＣＬＥＩＡ［ｈｕＡＳＤ２／ｍＡＳＤ３］
　固相に固定化する抗体としてヒト化抗ＡＳＰＤモノクローナル抗体ｈｕＡＳＤ２を使用し、マウス抗ＡＳＰＤモノクローナル抗体ｍＡＳＤ３、及び抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰを使用したＡＳＰＤ　ＣＬＥＩＡでＡＳＰＤを測定した（図８）。
　ｈｕＡＳＤ２はＷＯ２００９／０５７６６４に記載されるものである。
　その結果の一例を図９に示す。図９に示すとおり、４回の独立したＡＳＰＤ測定を実施したところ、ほぼ同じ発光値が得られた。
　８．ＡＳＰＤ　ＣＬＥＩＡ［ｈｕＡＳＤ２／ビオチン化ｍＡＳＤ３］
　ＡＳＰＤの検出感度を向上させるため、ｍＡＳＤ３抗体をビオチン化し、ストレプトアビジン（ＳＡ）が結合したＨＲＰを使用するシステムを構築した（図１０）。
　ｈｕＡＳＤ２／ビオチン化ｍＡＳＤ３システムでＡＳＰＤを測定したところ、ｈｕＡＳＤ２／ｍＡＳＤ３のシステムに比べて検出感度が向上した（図１１）。
　また、ｈｕＡＳＤ２／ビオチン化ｍＡＳＤ３システムは、ＡＳＰＤに対する特性が高く、Ａβ１－１０が１６分子結合したマルチ抗原ペプチド（ＭＡＰ１６、富士フィルム和光社製）をほとんど検出しなかった（図１２）。一方、コントロールとしてＢＡＮ５０／ビオチン化ＢＡＮ５０システム（高分子アミロイドβオリゴマーＥＬＩＳＡキット、富士フィルム和光社製）で測定したところ、同システムは、ＭＡＰ１６を感度よく検出したが、ＡＳＰＤをほとんど検出できなかった（図１２）。
　９．血漿の影響を低減できる抗体の組み合わせ
　固定化する第一抗体と、検出側の第二抗体の組み合わせの中から、血漿の影響を低減できる組み合わせを見出した。
　下記の［第一抗体／第二抗体］の組み合わせでＡＳＰＤ　ＣＥＩＬＡのシステムを構築し、血漿試料中のＡＳＰＤを測定した。
　［第一抗体／第二抗体］の組み合わせとしては、［ｈｕＡＳＤ２／ビオチン化ｍＡＳＤ３］、［ｍＡＳＤ３／ビオチン化ｍＡＳＤ３］、［８２Ｅ１／ビオチン化ｍＡＳＤ３］、［ＢＡＮ５０ａ／ビオチン化ｍＡＳＤ３］、及び［６Ｅ１０／ビオチン化ｍＡＳＤ３］を採用した。サンプルとしては、ＡＳＰＤを含有する希釈率１／４の血漿サンプルを準備し、バッファーサンプルと比較した。
　その結果の一例を図１３に示す。
　図１３に示す通り、［ＢＡＮ５０ａ／ビオチン化ｍＡＳＤ３］の組み合わせの場合に、血漿成分の影響をもっとも効果的に回避できることが確認された。
　１０．ＡＤ患者の血液試料を用いた測定
　アルツハイマー病（ＡＤ）と診断された患者の血漿サンプル１０例（○）と、健常者の血漿サンプル１０例（△）に対して、［ｈｕＡＳＤ２／ビオチン化ｍＡＳＤ３］の組み合わせでＡＳＰＤ　ＣＬＥＩＡを行った。その結果、ＡＤ患者の４例についてＡＳＰＤが検出された。その結果を図１４に示す。
　以上のこれら結果から、ＡＳＰＤ　ＣＬＥＩＡによって血液中のＡＳＰＤを測定することが可能であることが示された。

Claims (11)

  1. 　アミロスフェロイド（ＡＳＰＤ）に特異的な抗体に対してＡＳＰＤと競合する物質であって、
    　アミロイドβタンパク質（Ａβ）が架橋剤によって架橋された物質であり、
    　前記架橋剤は、スペーサーアーム長が４Å以上５０Å以下である架橋剤、又は、スペーサーアームとして１以上１３以下のオキシエチレン基（－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－）及び／又はオキシプロピレン基（－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－）を有する架橋剤である、物質。
  2. 　Ａβの架橋体であって、
    　Ａβが、スペーサーアーム長が４Å以上５０Å以下である架橋剤、又は、スペーサーアームとして１以上１３以下のオキシエチレン基（－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－）及び／又はオキシプロピレン基（－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－）を有する架橋剤によって架橋されている架橋体。
  3. 　請求項１に記載の物質又は請求項２に記載の架橋体と、抗ＡＳＰＤ抗体とを含む、ＡＳＰＤを分析するためのキット。
  4. 　ＡＳＰＤ分析における、請求項１に記載の物質又は請求項２に記載の架橋体の標準物質としての使用。
  5. 　ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病の診断における、請求項１に記載の物質又は請求項２に記載の架橋体の使用。
  6. 　前記診断が、ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断である、請求項５に記載の使用。
  7. 　ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病のワクチンの有効成分としての、請求項１に記載の物質又は請求項２に記載の架橋体の使用。
  8. 　ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病が、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症である、請求項５から７のいずれかに記載の使用。
  9. 　下記の工程：
    （１）不溶性担体に結合している、ＡＳＰＤに結合可能な抗体（第一抗体）に、ＡＳＰＤを含有している可能性がある生体由来試料を接触させて、ＡＳＰＤが含有されている場合に第一抗体にＡＳＰＤを結合させる工程；及び
    （２）工程（１）で第一抗体に結合したＡＳＰＤに、抗ＡＳＰＤモノクローナル抗体（第二抗体）を反応させる工程
    を含み、
    　第一抗体が、ヒト化抗ＡＳＰＤモノクローナル抗体ｈｕＡＳＤ２、又は、モノクローナル抗体ＢＡＮ５０ａであり、
    　第二抗体が、マウスモノクローナル抗ＡＳＰＤ抗体ｍＡＳＤ３又はその標識化抗体である、ＡＳＰＤの分析方法。
  10. 　さらに、下記の工程：
    （３）工程（２）でＡＳＰＤに結合した第二抗体に、レポーターが連結した抗マウス抗体を反応させる工程、又は、工程（２）でＡＳＰＤに結合した第二抗体の標識に、レポーターが連結した前記標識の結合パートナーを反応させる工程
    を含む、請求項９に記載の分析方法。
  11. 　ＡＳＰＤの標準物質として、請求項１に記載の物質又は請求項２に記載の架橋体を使用する、請求項９又は１０に記載の分析方法。
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