JP2019518196A - アミロイドベータ凝集の一次核形成阻害剤の同定方法 - Google Patents
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Abstract
Description
アミロイドベータ凝集の一次核形成阻害剤を同定する方法の最中、次の:
a)A−ベータ種を溶液、特に緩衝液の中に入れるステップ、
b)アミロイドベータ凝集を測定するステップ
を実施する。
c)A−ベータ種として、2単位のA−ベータモノマー間に配置されたリンカーを有する2単位のA−ベータモノマーを選択するステップ
を特徴とする。
a.アミロイドベータ凝集体に結合するとその蛍光特性(例えば、蛍光強度、蛍光偏光)が変化する色素分子を添加した後の蛍光分光法。一例は、アミロイドベータ凝集体への結合後に蛍光強度の明らかな上昇を示す色素チオフラビンTである。
b.アミロイドベータ凝集体に結合するとその蛍光特性(例えば、蛍光強度、蛍光偏光)が変化する色素で標識されたAベータ・フレキシダイマー(Flexidimer)分子を使用した蛍光分光法。
c.(ナノ)粒子およびタンパク質凝集体を検出するための確立された方法である動的光散乱。
a)凍結乾燥されたA−ベータ種、
b)緩衝液または溶液、
c)任意選択で、アミロイド形成または凝集を検出するための蛍光色素
を含み、ここで、A−ベータ種は、2単位のA−ベータモノマー間に配置されたリンカーを有する2単位のA−ベータモノマーからなる。
タンパク質ミスフォールディング疾患のモノマーの凝集を検査するための方法であって、
a)タンパク質ミスフォールディング疾患のモノマーを溶液または緩衝液に入れるステップ、
b)モノマーの凝集を測定するステップ
を含む方法において、
モノマーとして、タンパク質ミスフォールディング疾患の際に現れるモノマーの2単位であり、これらのモノマー単位間に配置されたリンカーを有する2単位を選択するステップ
を特徴とする方法に関する。
1.マイクロタイタープレートに、緩衝液、例えば20μMリン酸ナトリウム、pH7.4、50μMNaCl中に溶かしたAベータ・フレキシダイマーの25μM溶液を入れる。アミロイド形成を検出するための色素、例えば、チオフラビンTを添加する。阻害剤の不在下および存在下において、蛍光レーザを使用して、蛍光強度を測定する。
Claims (21)
- アミロイドベータ凝集の一次核形成阻害剤を同定するための方法であって、
a)A−ベータ種を溶液または緩衝液の中に入れるステップ、
b)アミロイドベータ凝集を測定するステップ
を含む方法において、
c)A−ベータ種として、A−ベータモノマー間に配置されたリンカーを有する2単位のA−ベータモノマーを選択するステップ
を特徴とする方法。 - アミロイド形成を検出するための蛍光色素を、溶液または緩衝液に添加し、アミロイドベータ凝集の検出として、蛍光シグナルの上昇を測定することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- アミロイドベータ凝集を光散乱によって検出することを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。
- A−ベータ種に、A−ベータ(1−42)および/もしくはA−ベータ(1−40)からなるモノマー、ならびに/または別のA−ベータモノマーを選択することを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一つに記載の方法。
- 2つの同一単位のA−ベータモノマーまたは2つの同一ではない単位のA−ベータモノマーを選択することを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一つに記載の方法。
- フレキシブルな立体配座を有するペプチドリンカーをリンカーとして選択することを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一つに記載の方法。
- リンカーとして、極性、非荷電アミノ酸、例えば、セリンおよび/またはトレオニンに富み、小さいアミノ酸、例えば、グリシンおよび/またはアラニンおよび/またはプロリンに富むペプチドリンカーを選択することを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一つに記載の方法。
- A−ベータ種間のリンカーとして、アミロイドベータ凝集の誘導期を少なくとも50%、特に80%、90%、さらには100%さえも低下させるペプチドを選択することを特徴とする、請求項1〜7のいずれか一つに記載の方法。
- リンクされるA−ベータモノマー中にあるアミノ酸数の50%±5%に相当するアミノ酸数を有するリンカーを選択することを特徴とする、請求項1〜8のいずれか一つに記載の方法。
- リンカーとして、配列(Glyx−Sery)n(x=1〜4、y=1およびn=1〜10)を有するペプチドリンカーを選択することを特徴とする、請求項1〜9のいずれか一つに記載の方法。
- リンカーとして、配列(Gly4−Ser)4を有するペプチドリンカーを選択することを特徴とする、請求項10に記載の方法。
- アミノ酸グリシンがアミノ酸アラニンおよび/またはプロリンに交換されているリンカーを選択することを特徴とする、請求項10または11に記載の方法。
- アミノ酸セリンがアミノ酸トレオニンおよび/またはアスパラギンおよび/またはグルタミンに交換されているリンカーを選択することを特徴とする、請求項10〜12のいずれか一つに記載の方法。
- 被検阻害剤を添加し、その阻害剤が、蛍光シグナルの高さを制限するか、または蛍光シグナルの時間的上昇を減速させた場合に肯定的に評価されることを特徴とする、請求項2〜13のいずれか一つに記載の方法。
- タンパク質ミスフォールディング疾患のモノマーの凝集を検査するための方法であって、
− タンパク質ミスフォールディング疾患のモノマーを溶液または緩衝液の中に入れるステップ、
− モノマーの凝集を測定するステップ
を含む方法において、
− モノマーとして、タンパク質ミスフォールディング疾患の際に現れるモノマーの2単位であって、これらのモノマー単位間に配置されたリンカーを有する2単位を選択するステップ
を特徴とする検査方法。 - グリシンおよび/またはセリンに富むことを特徴とする、請求項1〜15のいずれか一つに記載の方法を実施するためのペプチドリンカー。
- 配列番号1によるペプチドを特徴とする、請求項16に記載のペプチドリンカー。
- アミノ酸グリシンがアミノ酸アラニンおよび/またはプロリンに交換されており、アミノ酸セリンがアミノ酸トレオニンおよび/またはアスパラギンおよび/またはグルタミンに交換されていることを特徴とする、請求項16または17に記載のペプチドリンカー。
- 凝集、特に、アミロイドベータ凝集の一次核形成阻害剤を同定するための、2単位のタンパク質ミスフォールディング疾患のモノマー間、特にA−ベータモノマー間のリンカーとしての、請求項16〜18のいずれか一つに記載のペプチドリンカーの使用。
- 2つのモノマー、A−ベータ(1−42)および/またはA−ベータ(1−40)を特徴とする、請求項19に記載の、ペプチドリンカーの使用。
- 請求項1〜15に記載の方法を実施するためのキットにおいて、
a)凍結乾燥された、タンパク質ミスフォールディング疾患のモノマー、特にA−ベータ種、
b)緩衝液、
c)任意選択で、凝集、特に、アミロイドベータ凝集を検出するための蛍光色素、
を含み、
モノマー、特に、A−ベータ種が、2単位のモノマー間、特にA−ベータモノマー間に配置されたリンカーを有する2単位のモノマー、特にA−ベータモノマーからなる
ことを特徴とするキット。
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