CN109073656B

CN109073656B - 用于鉴别β淀粉样蛋白聚集的一次成核的抑制剂的方法

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Publication number: CN109073656B
Application number: CN201780020468.9A
Authority: CN
Inventors: W.霍耶
Original assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 2016-04-29
Filing date: 2017-04-06
Publication date: 2022-07-26
Anticipated expiration: 2037-04-06
Also published as: JP2019518196A; JP6990193B2; DK3449260T3; EP3449260B1; US20190317111A1; WO2017186203A1; CN109073656A; ES2846181T3; EP3449260A1; US11346847B2; DE102016005169B3

Abstract

本发明涉及用于鉴别β淀粉样蛋白聚集的一次成核的抑制剂的方法，其具有步骤：a)将Aβ物类预先放置在缓冲液中；b)确定β淀粉样蛋白聚集；其特征在于，c)作为Aβ物类，选择两个单元的Aβ单体，它们具有布置在所述Aβ单体之间的接头。公开了对此的接头、试剂盒以及它们的用途。

Description

用于鉴别β淀粉样蛋白聚集的一次成核的抑制剂的方法

本发明涉及用于鉴别β淀粉样蛋白聚集的一次成核的抑制剂的方法。

现有技术

由于未来几十年的人口学发展，患有与年龄有关的疾病的人数增加。在此，特别是应提及所谓的阿尔茨海默病（AD，阿尔茨海默痴呆，拉丁语：阿尔茨海默症）。

迄今为止，不存在对抗AD病因的活性物质或药物。迄今为止使用和批准的药物缓解阿尔茨海默痴呆中出现的一些症状。然而，它们无法减缓疾病的进展或导致治愈。存在某些物质，它们在动物实验中在预防方面显示出成功，但是未（未必）在治疗AD方面。

阿尔茨海默病的特征是β淀粉样肽（Abeta肽、Aβ肽、Aβ或Aβ-肽）的细胞外沉积物。通常在AD患者死后的脑中发现Aβ肽以斑块形式沉积。因此，各种形式的Aβ肽 - 例如原纤维– 导致疾病的发生和进展。此外，多年来，可自由扩散的小的Aβ寡聚物已被认为是AD发生和进展的主要原因。

作为Aβ寡聚物的基本单元的Aβ单体在人体中不断产生，并且推测本身没有毒性。甚至可能的是，单体具有积极功能。Aβ单体可以根据其浓度随机集合到一起。该浓度取决于其在体内的形成速率和分解速率。如果体内Aβ单体的浓度随着年龄的增加而提高，则单体越来越可能自发地集合到一起形成Aβ寡聚物。如此产生的Aβ寡聚物可以与朊病毒类似地增多，并最终导致阿尔茨海默病。

从现有技术物质中已知的物质以各种方式降低Aβ单体和/或寡聚物的浓度。例如已知已在动物实验中用于预防的γ分泌酶调节剂。

对于在动物实验中显示出积极结果的许多物质，这种效应无法在人体临床试验中得到证实。期望的是防止形成第一Aβ寡聚物，即防止一次成核。由此不能形成任何毒性寡聚物。

因此，需要新型化合物，例如活性物质和抑制剂，其非常特异地且以高亲和力与Aβ寡聚物结合，由此防止其增多或直接抑制其形成。

β淀粉样蛋白聚集的抑制剂原则上可以如下获得，即选择对β淀粉样肽具有结合亲和力的分子。例如，借助于免疫学方法选择抗体并借助于显示选择法选择肽，它们随后在对于聚集的潜在抑制作用方面被测试。

希望的是通过它们对于聚集反应的影响而直接鉴别抑制剂。这可以通过如从Arosio等人已知的动力学聚集测定进行（Arosio P., Vendruscolo, M., Dobson, C.M.,Knowles, T.P.J. (2015). Chemical kinetics for drug discovery to combatprotein aggregation diseases. Trends in Pharmacological Sciences. 35: 127-135）。

然而如从Habchi等人已知，通过目前的动力学聚集测定，不利的是仅通过大量时间和材料支出才可能特异性地鉴别一次成核的抑制剂（Habchi, J., Arosio, P., Perni,M., Costa, A.R., Yagi-Utsumi, M., Joshi, P., Chia, S., Cohen, S.I.A., Müller,M.B.D., Linse, S., Nollen, E.A.A., Dobson, C.M., Knowles, T.P.J.Vensdruscolo, V. (2016). An anticancer drug suppresses the primary nucleationreaction that initiates the production of the toxic Ab42 aggregates linkedwith Alzheimer’s disease. Sci. Adv. 2, e1501244: 1-13）。

为了对于各种抑制剂候选物检测对一次成核的抑制作用，必须此后特别不利地在多个Aβ浓度和抑制剂浓度下进行大量聚集测定，这通常经几个小时的时间，然后进行复杂的数学拟合程序。

在根据该现有技术获得的抑制剂候选物的情况下，特别不利地仍然不清楚抑制剂到底干扰了Aβ聚集的何种反应步骤。

因此从现有技术中已知，经常选择如下分子，其虽然抑制淀粉样蛋白形成，但对此导致潜在毒性Aβ寡聚物的形成增多。因此，只能在复杂、费时的个案研究中鉴别特异性抑制一次成核的分子。

发明目的

因此，本发明的目的是提供更简单和更快速、更成本有利的方法，该方法用于明确地鉴别β淀粉样蛋白聚集的一次成核的抑制剂。

此外，本发明的目的是提供用于进行该方法的合适化合物和提供其用途。

本发明的另一目的是提供能够用于进行该方法的试剂盒。

目的实现

该目的通过根据权利要求1的方法和根据次要权利要求的化合物和试剂盒以及它们的用途得以实现。对此的有利的实施方式从其引用的权利要求获知。

发明描述

在用于鉴别β淀粉样蛋白聚集的一次成核的抑制剂的方法的过程中，进行下列步骤：

a) 将Aβ物类预先放置在溶液，特别是缓冲液中；

b) 确定β淀粉样蛋白聚集。

该方法的特征在于，

c) 作为Aβ物类，选择两个单元的Aβ单体，它们具有布置在所述Aβ单体之间的接头。

所提及的步骤是在该方法的阴性对照的范畴中进行的步骤。

一次成核表示每个寡聚物的产生。

所述β淀粉样蛋白聚集和潜在抑制剂的影响可以以此方式通过现有技术例如在多孔板中检测。

可以例如将用于检测淀粉样蛋白形成的荧光染料添加到溶液或缓冲液中。然后例如借助于所谓的硫黄素T-试验而确定作为β淀粉样蛋白聚集证据的荧光信号的增加。

β淀粉样蛋白聚集的下列其它检测方法尤其可行：

a. 添加染料分子后的荧光光谱法，该染料分子的荧光特性（例如荧光强度、荧光偏振）在与β淀粉样蛋白聚集体结合时发生变化。一个实例是染料硫黄素T，其在与β淀粉样蛋白聚集体结合后显示出显著提高的荧光强度。

b. 使用用染料标记的Aβ柔性二聚体（Abeta-Flexidimer）分子的荧光光谱法，该染料的荧光特征（例如荧光强度、荧光偏振）在与β淀粉样蛋白聚集体结合时发生变化。

c. 动态光散射，其作为用于检测（纳米）颗粒和蛋白质聚集体的既定方法。

这些测量根据时间进行。

在b的情况下，可以特别地在Aβ物类之间选择用染料标记的肽接头。

所述接头具有多种优点。其显著地缩短β淀粉样蛋白聚集的延滞期，优选缩短至少50 %、60 %、70 %、80 %、81 %、82 %、83 %、84 %、85 %、86 %、87 %、88 %、89 %、90 %、91 %、92%、93 %、94 %、95 %、96 %、97 %、98 %、99 %或甚至100 %，相比于在相应未连接的单体聚集时的延滞期。

因此，有利地在根据本发明的方法中在将经连接的Aβ单体添加到缓冲液后立即开始β淀粉样蛋白聚集。

关于该方法，这意味着当在具有未连接的单体的现有技术方法中在约10小时温育时间后发生荧光信号的增加时，则通过根据该实施例的本发明方法的步骤c)确保了由此使延滞期在缩短80％的延滞期的情况下最迟在2小时后或在缩短90％的延滞期的情况下最迟在1小时后或在更少的时间后结束。

已经认识到，通过本发明方法的步骤c)有利地导致Aβ物类的局部浓度可以经由两个Aβ单体的连接而提高并因此加速β淀粉样蛋白聚集。

已经认识到，相比于使用溶液中的未连接的Aβ单体的测定而言，通过本发明方法的步骤c）从绝对来看也有利地在使用连接的Aβ单体时需要更少的Aβ物类材料。因此该方法更成本有利。

主要优点是明显缩短的延滞期，与现有技术不同地，在此期间不再有二次过程与一次成核重叠。因此，可以通过本发明的方法提供物质针对β淀粉样蛋白聚集时的一次成核的抑制作用的清楚证据。

在此，根据步骤a)-c)的本发明的方法是一种方法的阴性对照，其中可以测试从现有技术已知或假设的潜在一次成核抑制剂的效力，以防止β淀粉样蛋白聚集。

作为Aβ物类或单体，特别地但不排他性地考虑并可以根据测定方法选择Aβ（1-42）以及Aβ（1-40）或任意的其它Aβ物类，例如Pyro-Glu-Aβ（3-40、3-42）。该方法可用于所有已知的Aβ单体。

可以设想，以此方式不仅测试阿尔茨海默痴呆的Aβ单体及其聚集，而且还测试其它蛋白质错误折叠疾病的单体。此时，在这些疾病中出现的蛋白质的单体相互连接。

在AD的情况下，可以但不必选择两个相同单元的Aβ物类，它们与所述接头以头尾或其它方式连接。还可以将不同Aβ物类的Aβ单体相互连接，例如将A-β（1-40）与A-β（1-42）。

头尾（英语：头对尾）意味着将所述接头优选通过共价肽键布置在第一Aβ单体单元的C端和第二Aβ单体单元的N端。

有利地，可以选择具有柔性构象的肽接头（英语：固有无序的构象）作为接头。为了实现柔性构象并防止所述接头与Aβ单体单元的相互作用，该接头可以有利地富含极性不带电的氨基酸，例如丝氨酸、苏氨酸和/或天冬酰胺和/或谷氨酰胺，和此外富含小氨基酸，例如甘氨酸和/或丙氨酸和/或脯氨酸。特别地，可以选择富含甘氨酸和/或丝氨酸的接头，其也可以特别是仅由甘氨酸和丝氨酸组成。

该方法可以设置NMR波谱作为进一步的步骤，以显示所述接头不干扰聚集状态下的原纤维形态和/或所述Aβ单体在二聚体中保持它们的天然构象。

特别地，所述接头不影响溶液或缓冲液中的Aβ单元的固有无序性（英语：固有无序构象）。特别地，该接头也不改变聚集状态下的淀粉样蛋白原纤维的形态。

以此方式连接的Aβ单元的聚集方法和动力学的特征基本上在于一次成核，并且特别是在缓冲液中的约1-50μM，优选1μM、2μM、5μM、10μM、20μM至约50μM的Aβ物类浓度下，这可归因于Aβ的局部浓度的提高。在此，可以取每个中间值。

通过所述接头，肽的天然性质不受影响。特别地，在形成原纤维和/或聚集体的构象之前的固有无序性性质不受所述接头的影响。

该方法可以具有如下步骤，其中将经连接的Aβ物类的构象与未连接的单元的构象例如通过NMR测量进行比较。

经连接的单元有利地用作未连接单元的模型物质。

该方法可以具有如下步骤，其中检验经连接的Aβ物类是否与未连接的Aβ物类形成相同形式的原纤维。为此，可以例如进行原子力显微镜法。

本发明的方法适用于例如在多孔微量滴定板中的高通量筛选。

该方法特别地用于检查一次成核的动力学。为此，可以在有和没有β淀粉样蛋白聚集抑制剂的情况下进行基于微量滴定的测定。

特别地，可以选择具有序列(Gly_x-Ser_y)_n的肽接头作为接头，其中x = 1-4，y = 1且n = 1-10。

代替丝氨酸，可以选择苏氨酸和/或天冬酰胺和/或谷氨酰胺。这些氨基酸有利地获得稳定性。

代替甘氨酸，可以选择丙氨酸和/或脯氨酸。

作为经验法则，在所述接头中应存在如同在经连接的Aβ物类中的氨基酸数的约10-90％。通常，该接头应在蛋白质错误折叠疾病的情况下应包含触发聚集的单体单元的氨基酸数的约10-90％。在Aβ（1-40）的情况下，该接头则包含约4-36个氨基酸。特别地，该接头包含触发聚集的单体单元的氨基酸数的20-80％、30-70％或40-60％。

作为进一步的经验法则，在所述接头中应特别地存在如同在经连接的Aβ物类中的氨基酸数的约50％±5％。通常，该接头应在蛋白质错误折叠疾病的情况下具有触发聚集的单体单元的氨基酸数的约50％±5％。

特别地，具有序列(Gly₄-Ser)₄的肽接头已经被证明有利地作为接头，其中上述替换成其他氨基酸的条件可以适用。

所述接头有利地特别巨大地缩短阿尔茨海默痴呆的β淀粉样蛋白聚集的延滞期，特别地但不排他性地在Aβ（1-40）和/或Aβ（1-42）作为要连接的Aβ物类的情况下。

经连接的Aβ物类应位于的浓度应特别地为约>2 μM。此时，延滞期的缩短和一次成核的主导性特别明显。

通过上述方法和与此相伴的延滞期的缩短确保了β淀粉样蛋白聚集立即开始并且是可检测的。由此，可检测到潜在活性物质候选物对一次成核动力学的影响。

在Aβ物类或其它蛋白质错误折叠疾病的单体单元之间的上述本发明接头明显地减小（β淀粉样蛋白）聚集的延滞期，优选减小至少80％。

添加要测试的物质，例如抑制剂，当其相比于阴性对照的信号而言限制荧光信号的高度或减慢荧光信号随时间的增加时将其阳性评估。

作为根据SEQ ID NO: 1的肽的具有氨基酸序列ggggsggggsggggsggggs的柔性接头是示例性且特别重要的，因为其有利地具有所需的性质。该接头用于鉴别β淀粉样蛋白聚集，特别是Aβ（1-40）和/或Aβ（1-42）和/或蛋白质错误折叠疾病的其它单体的β淀粉样蛋白聚集的一次成核的活性物质和抑制剂，其中上述可替换成其它氨基酸的规则又应适用。

用于进行本发明方法的试剂盒包含：

a) Aβ物类，其是经冻干的；

b) 缓冲液或溶液；

c) 任选的用于检测淀粉样蛋白形成或聚集的荧光染料；

其中所述Aβ物类由两个单元的Aβ单体构成，所述Aβ单体具有布置在它们之间的接头。

所述试剂盒的成分在使用前溶解在缓冲液或溶液中，并可立刻使用。

所述接头有利地不影响β淀粉样蛋白聚集的折叠结构。

然后，可通过现有技术（在此为硫黄素测试）通过测量荧光信号随时间的增加而检测在多孔板中的β淀粉样蛋白聚集和潜在抑制剂的影响。

还可以提供不含荧光染料的试剂盒，例如当β淀粉样蛋白聚集以其它方式，例如通过光散射或其它方法如上所示进行检测时。

抑制Aβ聚集的物质，特别是活性物质或抑制剂是用于治疗阿尔茨海默病的相应有希望的活性物质候选物，因为通过本发明方法甚至完全不产生特别毒性的寡聚物。在这个意义上，该方法导致在时间上跳过β淀粉样蛋白聚集的二次过程。

特别地，聚集反应的最初步骤，即所谓的一次成核的抑制剂在此作为活性成分也是令人感兴趣的。此类抑制剂潜在地防止阿尔茨海默痴呆的特别毒性的Aβ寡聚物的形成。

通过本发明的方法，成功地以特别简单和经加速的方式通过相应地缩短延滞期而鉴别β淀粉样蛋白聚集的一次成核的可靠抑制剂，并因此成本有利地找到针对毒性寡聚物形成的活性物质。

在此，现有技术中已经鉴别的分子，例如肽、抗体，用于治疗癌症的活性物质，例如蓓萨罗丁当然也可以用于缩短的本发明测定中，并检验它们在防止毒性寡聚物形成时的效力。这可以用作阳性对照。

此外在本发明的范围内已经认识到，β淀粉样蛋白聚集是由多个步骤构成的复杂反应，其中下游的二次过程在现有技术常规测定的可观察的反应进程中占主导性。还已经认识到，这些下游过程在延滞期的过程中发生。

相应地，已根据本发明经开发了动力学聚集测定，其不是由二次过程而是通过缩短延滞期由一次成核主导。

代替单体Aβ，该测定或本发明的方法或KIT利用新开发的具有工作名称“Aβ柔性二聚体”的二聚体构建体，其中两个Aβ单体通过柔性肽接头相互连接。为此可以例如使用两个单元的最常见的Aβ变体，即Aβ（1-40）。其它Aβ变体，例如Aβ（1-42）或经修饰的形式，包括更短形式的二聚体及其混合物是令人感兴趣的，因此是本发明的主题。仅举例来说，单体Aβ（1-40）可以与单体A-β（1-42）连接。

选择相对大长度的接头，由此使得二聚体构建体中的Aβ单元不在形成普通淀粉样蛋白结构时被与融合邻体（Nachbarn）的相互作用阻碍，这可以通过原子力显微镜测量来证实。

与Aβ单体相比，Aβ柔性二聚体在动力学聚集测定（在此是本发明的方法）中有利地显示出改进的性质。有利地，其特征在于几乎完全消除了延滞期。此外，缓冲液中的浓度可以为1μM以上至约50μM，优选约5μM。由此有利地导致在进行该测试方法时出现明显的时间节省。此外，可以以此方式鉴别要添加的活性物质作为在同时降低的Aβ单体浓度的情况下实际上抑制一次成核且并非在稍后的时间点才干扰进一步聚集的活性物质。

这些积极效果从关于接头的现有技术，例如从Chen等人（Chen, X., Zaro, J.,Shen, W.-C. (2013). Fusion protein linkers: Property, Design andFunctionality. Adv Drug Deliv Rev 65(10): 1357-1369）或从Chichilli等人（Chichilli, V.P.R., Kumar, V., Sivaram J. (2013). Protein Science 22:153-167）是不可预期的。

以此方式鉴别了防止毒性寡聚物形成并且被考虑作为针对相应蛋白质错误折叠疾病的活性物质的抑制剂。

本发明不限于此。相反，本发明涉及普遍涉及蛋白质错误折叠疾病的单体聚集的其它方法，并且特别是：

检验蛋白质错误折叠疾病的单体聚集的方法，其具有下列步骤：

a) 将蛋白质错误折叠疾病的单体预先放置在溶液或缓冲液中；

b) 确定所述单体的聚集；

其特征在于，

作为单体，选择两个单元的出现在蛋白质错误折叠疾病中的单体，它们具有布置在所述单体单元之间的接头。

所述接头具有如已描述的特征。

应当理解，此外还可以测试Aβ单体，例如所谓的Aβ（1-42）和/或Aβ（1-40）和/或出现在阿尔茨海默痴呆中的其它单体的聚集行为。此外，可以根据所公开的方法以本发明的方式测试其它蛋白质错误折叠疾病的每种其它单体，以及要求保护对此的试剂盒和肽接头。

实施例

下面借助实施例和所附的附图更详细地解释本发明，而不由此将本发明限制于β淀粉样蛋白聚集。

图1显示了具有本发明二聚体的本发明方法的动力学。A：Aβ单体（在此为Aβ（1-40）单体）与相应的柔性二聚体之间的比较。B：根据浓度的在一次成核和二次过程之间的转变。

图2显示了Aβ（1-40）淀粉样蛋白形成与来自柔性二聚体的原纤维形成之间的模型比较。

在微量滴定板中预先放置Aβ柔性二聚体在缓冲液中，例如在20 μM磷酸钠，pH7.4，50 μM NaCl中的25 μM溶液。添加用于检测淀粉样蛋白形成的染料，例如硫黄素T。

Aβ单体柔性二聚体对延滞期缩短的影响示于图1中。

A：在x轴上绘制以小时计的时间，在y轴上绘制荧光强度作为聚集的量度。Aβ柔性二聚体的聚集在> 1 μM的初始浓度下可直接从聚集测定开始起检测到而没有延迟时间（图1A，空心菱形0.9 μM，实心菱形1.3 μM，空心三角形1.9 μM，实心三角形 2.7μM，空心圆形3.9 μM，实心圆形5.5 μM，空心正方形8 μM，实心正方形11 μM）。

这种行为与在> 2 μM的Aβ柔性二聚体浓度下的主导二次过程向主导一次成核的转变一致（图1B）。在图1B中，相对于柔性二聚体的浓度（以μM计）绘制t1/2（以小时计）的双对数图。在约3 μM的浓度以上时，一次成核是Aβ柔性二聚体的β淀粉样蛋白聚集中的主导过程。约-0.3的斜率表示二次过程主导，约-3的斜率表示一次成核主导。

图2借助于原子力显微镜法显示了柔性二聚体形成与Aβ单体（在此是对于Aβ（1-40）的情况）相同形态的原纤维。

将抑制剂候选物添加到各个孔中。将微量滴定板在37℃下在荧光读数器中温育，并在几分钟的时间段内以定期的间隔测定荧光。

通过如下方式鉴别抑制剂，即所述抑制剂停止或减缓荧光信号随时间的增加（未显示）。

其它实施例

1. 在微量滴定板中预先放置Aβ柔性二聚体在缓冲液中，例如在20 μM磷酸钠，pH7.4，50 μM NaCl中的25 μM溶液。添加用于检测淀粉样蛋白形成的染料，例如硫黄素T。通过荧光读数器测量在不存在和存在抑制剂的情况下的荧光强度。

2. 将Aβ柔性二聚体用合适的染料分子标记，该染料分子通过荧光偏振的提高而显示β淀粉样蛋白聚集。在微量滴定板中预先放置经标记的Aβ柔性二聚体在缓冲液中，例如在20 μM磷酸钠，pH7.4，50 μM NaCl中的25 μM溶液。通过荧光读数器测量在不存在和存在抑制剂的情况下的荧光偏振。

3. 在微量滴定板中预先放置Aβ柔性二聚体在缓冲液中，例如在20 μM 磷酸钠，pH7.4，50 μM NaCl中的25 μM 溶液。通过光散射检测器测量在不存在和存在抑制剂的情况下的光散射。

Claims

1.鉴别β淀粉样蛋白聚集的一次成核的抑制剂的方法，其具有下列步骤：

a) 将Aβ物类预先放置在溶液或缓冲液中；

b) 确定β淀粉样蛋白聚集；

其特征在于，

c) 作为Aβ物类，选择两个单元的Aβ单体Aβ1-40和/或Aβ1-42，它们具有布置在所述Aβ单体之间的接头，其中作为接头，选择具有序列(Gly_x-Ser_y)_n的肽接头，其中x=1-4，y=1且n=1-10；

并且其中所述接头具有连接的Aβ物类中的氨基酸数的10-90％；

并且其中作为接头，选择具有柔性构象的肽接头；

并且其中选择肽作为位于所述两个单元的Aβ单体之间的接头，所述肽相比于在相应未连接的单体聚集时的延滞期而言，将β淀粉样蛋白聚集的延滞期缩短至少50%；

d) 将用于检测淀粉样蛋白形成的荧光染料添加到溶液或缓冲液中，并测量作为β淀粉样蛋白聚集证据的荧光信号的增加；

e) 添加要测试的抑制剂，当所述抑制剂限制荧光信号的高度或减慢荧光信号的随时间的增加时将其阳性评估。

2.根据权利要求1所述的方法，

其特征在于，

在步骤d)中不添加荧光染料，并且通过光散射检测所述β淀粉样蛋白聚集。

3.根据权利要求1至2任一项所述的方法，

其特征在于，

选择两个相同或两个不同单元的Aβ单体。

4.根据权利要求1至2任一项所述的方法，

其特征在于，

作为位于所述两个单元的Aβ单体之间的接头，选择将β淀粉样蛋白聚集的延滞期缩短80 %、90 %或甚至100 %的肽。

5.根据权利要求1至2任一项的方法，

其特征在于，

作为接头，选择具有序列(Gly₄-Ser)₄的肽接头。

6.检验β淀粉样蛋白单体聚集的方法，其具有下列步骤：

- 将β淀粉样蛋白物类预先放置在溶液或缓冲液中；

- 确定所述β淀粉样蛋白单体的聚集；

- 其特征在于，

作为Aβ物类，选择两个单元的Aβ单体1-40和/或Aβ单体1-42，它们具有布置在所述Aβ单体之间的接头，其中作为接头，选择具有序列(Gly_x-Ser_y)_n的具有柔性构象的肽接头，其中x= 1-4，y = 1且n = 1-10。