ES2846181T3 - Procedimiento para la identificación de inhibidores de nucleación primaria de agregación de beta-amiloide - Google Patents

Procedimiento para la identificación de inhibidores de nucleación primaria de agregación de beta-amiloide Download PDF

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Abstract

Procedimiento para la identificación de inhibidores de nucleación primaria de agregación de beta-amiloide, con los pasos: a) se dispone una especie de A-beta en disolución, o bien tampón; b) se determina la agregación de beta-amiloide; caracterizado por que c) como especie de A-beta se seleccionan dos unidades de monómero de A-beta (1-40) y/o monómero de A-beta (1-42) con un engarce dispuesto entre los monómeros de A-beta, seleccionándose como engarce un engarce peptídico con la secuencia (Glyx-Sery)n, con x = 1-4, y = 1 y n = 1-10, y presentando el engarce 10 a 90 % del número de aminoácidos, como las especies de A-beta engarzadas, y estando dispuesto el engarce entre el entre el término C del primer monómero de A-beta y el término N del segundo monómero de A-beta, y seleccionándose como engarce un engarce peptídico con conformación flexible, y seleccionándose como engarce, que se encuentra entre las dos unidades de monómeros de A-beta, un péptido que reduce la fase lag de la agregación de beta-amiloide en al menos 50 % en comparación con la fase lag en la agregación de los monómeros no engarzados correspondientemente, d) se añade un colorante fluorescente para la identificación de la formación de amiloide a la disolución, o bien tampón, y se mide el aumento de la señal de fluorescencia como identificación de la agregación de beta-amiloide, e) se añade un inhibidor a examinar y se valora positivamente si limita la altura de la señal de fluorescencia o retarda el ascenso temporal de la señal de fluorescencia.

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento para la identificación de inhibidores de nucleación primaria de agregación de beta-amiloide La invención se refiere a un procedimiento para la identificación de inhibidores de nucleación primaria de agregación de beta-amiloide.
Estado de la técnica
Debido al desarrollo demográfico, en las próximas décadas aumentará el número de personas que sufren enfermedades ocasionadas por la edad. En este caso se debe citar en especial la denominada enfermedad de Alzheimer (AD, demencia de Alzheimer, lat. Morbus Alzheimer).
Hasta el momento no existe ningún principio activo o medicamento que actúe contra las causas de AD. Los medicamentos empleados y permitidos hasta el momento atenúan algunos de los síntomas que se presentan en la demencia de Alzheimer. No obstante, estos no pueden retrasar el avance de la enfermedad u ocasionar una curación. Existen algunas sustancias que han mostrado buenos resultados en experimentos con animales en la prevención, pero no (necesariamente) en el tratamiento de AD.
Una característica de la enfermedad de Alzheimer son depósitos extracelulares del péptido beta-amiloide (péptido Abeta-péptido A-beta, AB o péptido AB). Estos depósitos de péptido A-beta en placas se puede determinar típicamente en los cerebros de pacientes de AD post mortem. Por lo tanto, diferentes formas del péptido A-beta -como por ejemplo fibrillas- se hacen responsables de la producción y el avance de enfermedades. Adicionalmente, desde hace algunos años, los pequeños oligómeros de A-beta, libremente difundibles, se consideran el principal causante de la producción y del avance de la AD.
Los monómeros de A-beta, como componentes de los oligómeros de A-beta, se producen en el cuerpo humano de manera constante, y presumiblemente no son tóxicos de por sí. Existe incluso la posibilidad de que los monómeros posean una función positiva. Los monómeros de A-beta se pueden agregar ocasionalmente en función de su concentración. La concentración es dependiente de su tasa de formación y degradación en el cuerpo. Si con edad creciente tiene lugar un aumento de la concentración de monómeros de A-beta en el cuerpo, una agregación espontánea de monómeros para dar oligómeros de A-beta es cada vez más probable. Los oligómeros de A-beta producidos de este modo pueden propagarse análogamente a los priones, y conducir en último término a la enfermedad de Alzheimer.
Las sustancias conocidas por el estado de la técnica reducen la concentración de monómeros y/u oligómeros de A-beta de las más diversas maneras. De este modo, por ejemplo son conocidos moduladores de gammasecretasa, que se emplearon en experimentos con animales para la prevención.
En el caso de muchas sustancias que han mostrado resultados positivos en experimentos con animales, esto no se pudo confirmar en estudios clínicos en personas. Sería deseable la inhibición de la formación de los primeros oligómeros de A-beta, es decir, la supresión de la nucleación primaria. De este modo no se pudieron formar ninguno de los oligómeros tóxicos.
Por consiguiente, existe una necesidad de nuevos compuestos, como principios activos e inhibidores, que se enlacen muy específicamente y con alta afinidad a los oligómeros de A-beta, y que impidan de este modo su propagación o inhiban directamente su formación.
En principio, los inhibidores de agregación de beta-amiloide se pueden obtener seleccionándose moléculas con una afinidad de enlace para el péptido beta-amiloide. A modo de ejemplo, se seleccionan anticuerpos por medio de métodos inmunológicos y péptidos por medio de procedimientos de selección por visualización, que se someten a ensayo a continuación con respecto a un efecto inhibidor potencial sobre la agregación.
Es deseable identificar los inhibidores directamente a través de su efecto sobre la reacción de agregación. Esto es posible con ayuda de ensayos de agregación cinéticos, como es sabido por Arosio et al. (Arosio P., Vendruscolo, M., Dobson, C.M., Knowles, T.P.J. (2015). Chemical kinetics for drug discovery to combat protein aggregation diseases. Trends in Pharmacological Sciences. 35: 127-135).
Sin embargo, con los actuales ensayos de agregación cinéticos, desventajosamente, solo con gran inversión de tiempo y material es posible identificar inhibidores de nucleación primaria de manera específica, como es sabido por Habchi et al. (Habchi, J., Arosio, P., Perni, M., Costa, A.R., Yagi-Utsumi, M., Joshi, P., Chia, S., Cohen, S.I.A., Müller, M.B.D., Linse, S., Nollen, E.A.A., Dobson, C.M., Knowles, T.P.J. Vensdruscolo, V. (2016). An anticancer drug suppresses the primary nucleation reaction that initiates the production of the toxic Ab42 aggregates linked with Alzheimer's disease. Sci. Adv. 2, e1501244: 1-13).
Para identificar un efecto inhibidor sobre la nucleación primaria para un candidato a inhibidor individual se debe realizar a continuación, de modo especialmente desfavorable, un gran número de ensayos de agregación a diversas concentraciones de A-beta, así como de inhibidor, y habitualmente durante un intervalo de tiempo de varias horas, seguidos de complejos procedimientos de ajuste matemáticos.
En el caso de los candidatos a inhibidor obtenidos según este estado de la técnica, de modo especialmente desfavorable sigue sin estar claro en qué pasos de reacción de agregación A-beta intervienen los inhibidores en general.
De este modo, por el estado de la técnica es sabido que frecuentemente se seleccionan moléculas que inhiben ciertamente la formación de amiloide, pero conducen en cambio a una formación acrecentada de oligómeros de A-beta potencialmente tóxicos. Por consiguiente, moléculas que inhiben específicamente la nucleación primaria se pueden identificar solo en investigaciones de casos particulares costosas, tediosas.
Tarea de la invención
Por lo tanto, es tarea de la invención poner a disposición un procedimiento más sencillo y rápido, económico, con el que se puedan identificar claramente inhibidores de nucleación primaria de agregación de beta-amiloide. Solución de la tarea
La tarea se soluciona con el procedimiento según la reivindicación 1 y según la reivindicación secundaria. De las reivindicaciones relacionadas resultan configuraciones ventajosas a tal efecto.
Descripción de la invención
Durante el procedimiento para la identificación de inhibidores de nucleación primaria de agregación de betaamiloide se realizan los siguientes pasos:
a) se dispone una especie de A-beta en disolución, en especial tampón;
b) se determina la agregación de beta-amiloide.
El procedimiento está caracterizado por que
c) como especie de A-beta se seleccionan dos unidades de monómero de A-beta con un engarce dispuesto entre los monómeros de A-beta.
Con nucleación primaria se designa la producción de cualquier oligómero.
Por el documento US 2007/021345 A1 es conocido un procedimiento para la identificación de inhibidores de nucleación primaria de agregación de beta-amiloide, con los pasos:
a) se dispone una especie de A-beta en disolución, o bien tampón;
b) se determina la agregación de beta-amiloide; caracterizado por que
c) como especie de A-beta se selecciona monómero de A-beta.
El objeto de la presente invención se diferencia de este procedimiento conocido en que como especie de A-beta se seleccionan dos unidades de monómero de A-beta con un engarce dispuesto entre los monómeros de A-beta. Mediante el empleo de este engarce se puede disponer un procedimiento más rápido y más rentable. Las ventajas especiales del engarce empleado para el procedimiento se describen a continuación.
La agregación de beta-amiloide y la influencia de inhibidores potenciales se puede identificar de diferentes maneras a través del estado de la técnica, por ejemplo en placas multipocillos.
Por ejemplo, para la identificación de la formación de amiloide se puede añadir un colorante fluorescente a la disolución, o bien al tampón. El aumento de la señal de fluorescencia como identificación de la agregación de beta-amiloide se determina, a modo de ejemplo, por medio del denominado ensayo de tioflavina T.
En especial son posibles los siguientes procedimientos de identificación de la agregación de beta-amiloide ulteriores:
a. espectroscopía de fluorescencia tras adición de moléculas colorantes, cuyas propiedades de fluorescencia (por ejemplo intensidad de fluorescencia, polarización de fluorescencia) se modifican en el caso de enlace a agregados de beta-amiloide. Un ejemplo es el colorante tioflavina-T, que muestra una intensidad de fluorescencia claramente elevada tras enlace a agregados de beta-amiloide.
b. Espectroscopía de fluorescencia bajo empleo de moléculas de Abeta-Flexidimer, que están marcadas con un colorante cuyas propiedades de fluorescencia (por ejemplo intensidad de fluorescencia, polarización de fluorescencia) se modifican en el caso de enlace a agregados de beta-amiloide. c. Dispersión de la luz dinámica como método establecido para la identificación de (nano)partículas y agregados proteicos.
Estas mediciones se efectúan frente al tiempo.
En el caso b. se pueden seleccionar en especial engarces peptídicos entre las especies de A-beta que están marcados con colorantes.
El engarce tiene varias ventajas. Este acorta considerablemente la fase lag de agregación de beta-amiloide, preferentemente al menos en 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o incluso 100 % en comparación con la fase lag en el caso de agregación de los monómeros no engarzados correspondientemente.
Por consiguiente, en el procedimiento según la invención, la agregación de beta-amiloide comienza inmediatamente tras la adición de monómeros de A-beta engarzados al tampón.
En relación con el procedimiento, esto significa que, si en el procedimiento según al estado de la técnica con monómeros no engarzados se efectuó un aumento de la señal de fluorescencia después de aproximadamente 10 h de tiempo de incubación, con el paso c) del procedimiento según la invención conforme a este ejemplo se asegura que de este modo la fase lag ha concluido a más tardar después de 2 h en el caso de una fase lag acortada en 80 %, o bien a más tardar después de 1 h en el caso de una fase lag acortada en 90 %, o después de un poco más de tiempo.
Se identificó que, con el paso c) del procedimiento según la invención, se provoca ventajosamente que la concentración local de especie A-beta aumenta mediante el engarce de dos monómeros de A-beta, y de este modo se puede acelerar la agregación de beta-amiloide.
Se identificó que, con el paso c) del procedimiento según la invención, en términos absolutos, también se requiere ventajosamente menos material de especie de A-beta en el caso de empleo de monómeros de A-beta engarzados en comparación con un ensayo en el que se emplean monómeros de A-beta no engarzados en disolución. Por consiguiente, el procedimiento es más rentable.
La ventaja principal es la fase lag claramente acortada, en la que, al contrario que en el estado de la técnica, ningún proceso secundario se superpone ya con la nucleación primaria. Por lo tanto, con el procedimiento según la invención se puede proporcionar una identificación clara de la acción inhibidora de sustancias frente a la nucleación primaria en la agregación de beta-amiloide.
En este caso, el procedimiento según la invención conforme a los pasos a)-c) es el control negativo de un procedimiento, en el que inhibidores de nucleación primaria potenciales, ya conocidos también por el estado de la técnica o supuestos, se pueden someter a ensayo respecto a eficacia para impedir la agregación de betaamiloide.
Como especies de A-beta, o bien monómeros, en especial entran en consideración especies de A-beta (1-42), pero no exclusivamente, sino también A-beta (1-40), o cualquier otra especie de A-beta, como por ejemplo piroglu-Abeta (3-40, 3-42), y estas se pueden seleccionar correspondientemente a la carga de ensayo. El procedimiento es aplicable para todos los monómeros de A-beta conocidos.
Es concebible someter a ensayo no solo los monómeros de A-beta de la demencia de Alzheimer y su agregación de este modo, sino también los monómeros de otras enfermedades debidas al plegamiento defectuoso de proteínas. Los monómeros de proteínas que se presentan en estas enfermedades se engarzan entonces entre sí. En el caso de AD se pueden, aunque no se tienen por qué seleccionar dos especies de A-beta idénticas, que se engarzan con el engarce cabeza-a-cola o de otro modo. Por lo tanto, también se pueden engarzar entre sí monómeros de A-beta de diferentes especies de A-beta, por ejemplo A-beta (1-40) con A-beta (1-42).
Cabeza-a-cola (en inglés head-to-tail) significa que el engarce entre el término C de una primera unidad de monómero de A-beta y el término N de la segunda unidad de monómero de A-beta está dispuesto preferentemente mediante un enlace peptídico covalente.
Como engarce se puede seleccionar ventajosamente un engarce peptídico con una conformación flexible (en inglés intrinsically disordered conformation). Para posibilitar una conformación flexible y suprimir interacciones del engarce con las unidades de monómero de A-beta, el engarce puede ser ventajosamente rico en aminoácidos polares, no cargados, como por ejemplo serina, treonina y/o asparagina y/o glutamina, y además rico en aminoácidos reducidos, como por ejemplo glicina y/o alanina y/o prolina. En especial, el engarce se puede seleccionar rico en glicina y/o serina, y también puede estar constituido en especial exclusivamente por glicina y serina. Tal secuencia peptídica es conocida, a modo de ejemplo, por Sejin Lee et al: "Syntheses of biologically active and covalently bonded amyloid-B dimers (P1-118)", Alzheimers's and Dementia, tomo 10, N° 4, Suppl, 1 Julio 2014, página P344, o por el documento US 8323647 b2.
El procedimiento puede prever una espectroscopia de NMR como paso ulterior, con el fin de mostrar que el engarce no interviene en la morfología de las fibrillas en estado agregado y/o los monómeros de A-beta adquieren su conformación nativa en el dímero.
El engarce no influye en especial en el desorden intrínseco de las unidades de A-beta (en inglés intrinsically disordered conformation) en la disolución, o bien en el tampón. En especial, el engarce tampoco modifica la morfología de fibrillas amiloides en estado agregado.
El procedimiento y la cinética de agregación de unidades de A-beta engarzadas de este modo está marcado esencialmente por la nucleación primaria y en especial precisamente en concentraciones de especie de A-beta de aproximadamente 1-50 microM en el tampón, preferentemente 1 microM, 2 microM, 5 microM, 10 microM, 20 microM hasta aproximadamente 50 microM, lo que se puede atribuir al aumento de la concentración local de A­ beta. En este caso se puede suponer cualquier valor intermedio.
Por lo tanto, con el engarce no se influye sobre las propiedades naturales de los péptidos. En especial no se influye sobre la propiedad de desorden intrínseco antes del desarrollo de la conformación de fibrillas y/o agregados a través del engarce.
El procedimiento puede presentar un paso en el que la conformación de las especies A-beta engarzadas se compara con las unidades no engarzadas, a modo de ejemplo mediante mediciones por NRM.
Las unidades engarzadas sirven ventajosamente como sustancia modelo para las unidades no engarzadas. El procedimiento puede presentar un paso en el que se analiza que, o bien si las especies A-beta engarzadas desarrollan la misma forma de fibrillas que las especies A-beta no engarzadas. A tal efecto se puede realizar, por ejemplo, microscopía de fuerza atómica.
El procedimiento según la invención es apropiado para un barrido de alta resolución, por ejemplo en placas de microtitración multipocillos.
El procedimiento se realiza en especial para el control de la cinética de nucleación primaria. A tal efecto se puede realizar un ensayo basado en microtitración con y sin inhibidores de agregación de beta-amiloide.
Como engarce se puede seleccionar en especial un engarce peptídico con la secuencia (Glyx-Sery)n con x=1-4, y=1 y n=1 -10.
En lugar de serina se puede seleccionar treonina y/o asparagina y/o glutamina. Estos aminoácidos alcanzan la estabilidad ventajosamente.
En lugar de glicina se puede seleccionar alanina y/o prolina.
Como regla general, en el engarce se presentará aproximadamente 10-90 % del número de aminoácidos como en la especie de A-beta engarzada. Generalmente, en el caso de enfermedades por plegamiento defectuoso de proteínas, el engarce comprenderá aproximadamente 10-90 % del número de aminoácidos de las unidades monoméricas que desencadenan la agregación. En el caso de A-beta (1-40), el engarce comprende entonces aproximadamente 4-36 aminoácidos. El engarce comprende en especial 20-80 %, 30-70 % o 40-60 % del número de aminoácidos de las unidades monoméricas que desencadenan la agregación.
Como otra regla general, en el engarce se presentará en especial aproximadamente 50 % ± 5 % del número de aminoácidos como en la especie de A-beta engarzada. Generalmente, en el caso de enfermedades por plegamiento defectuoso de proteínas, el engarce presentará aproximadamente 50 % ± 5 % del número de aminoácidos de las unidades monoméricas que desencadenan la agregación.
Como engarce ha dado buen resultado en especial un engarce peptídico con la secuencia (Gly4-Ser)4, pudiendo considerarse las condiciones de intercambio por otros aminoácidos citadas anteriormente.
Ventajosamente, estos engarces acortan la fase lag de la agregación de beta-amiloide de la demencia de Alzheimer con especial intensidad, en especial, pero no exclusivamente en el caso de A-beta (1-40) y/o A-beta (1-42) como especies de A-beta a engarzar.
La concentración en la que se debe disponer la especie de A-beta engarzada debía ascender en especial aproximadamente a > 2 microM. Entonces están especialmente marcados el acortamiento de la fase lag y el dominio de la nucleación primaria.
Con el procedimiento citado anteriormente y el acortamiento de la fase lag que acompaña a este se asegura que la agregación de beta-amiloide comience inmediatamente y sea identificable. De este modo es identificable la influencia de candidatos a principio activo potenciales sobre la cinética de la nucleación primaria.
Los anteriormente citados engarces según la invención entre las especies de A-beta o unidades monoméricas de otras enfermedades debidas al plegamiento defectuoso de proteínas reducen claramente la fase lag de una agregación (de beta-amiloide), de modo preferente en al menos 80 %.
Una sustancia a analizar, por ejemplo un inhibidor, se adiciona y se valora positivamente si limita la altura de la señal de fluorescencia y/o retarda el ascenso temporal de la señal de fluorescencia frente a la señal del control negativo.
El engarce flexible con la secuencia de aminoácidos ggggsggggsggggsggggs como péptido según la SEQ ID NO: 1 es ejemplar y especialmente relevante, ya que presenta ventajosamente las propiedades necesarias. Este engarce se emplea en la identificación de principios activos e inhibidores de nucleación primaria de agregación de beta-amiloide, en especial de A-beta (1-40) y/o A-beta (1-42) y/u otros monómeros de enfermedades debidas al plegamiento defectuoso de proteínas, debiéndose considerar a su vez las reglas de intercambiabilidad por otros aminoácidos citados anteriormente.
Ventajosamente, el engarce no influye sobre la estructura de hoja plegada de la agregación de beta-amiloide. A través del estado de la técnica, en este caso un ensayo de tioflavina, la agregación de beta-amiloide en placas multipocillos es identificable entonces a través de medición del ascenso de las señales de fluorescencia a través del tiempo y la influencia de inhibidores potenciales.
Las sustancias, en especial los principios activos, o bien inhibidores que inhiben la agregación de A-beta, son correspondientemente candidatos a principios activos muy prometedores para la terapia de la enfermedad de Alzheimer, ya que con el procedimiento según la invención no se producen en ningún caso los oligómeros especialmente tóxicos. En este sentido, el procedimiento conduce a omitir temporalmente los procesos secundarios de agregación de beta-amiloide.
En este caso también son interesantes como principios activos especialmente los inhibidores de los primeros pasos de la reacción de agregación, la denominada nucleación primaria. Tales inhibidores impiden potencialmente la formación de los oligómeros de A-beta de la demencia de Alzheimer, especialmente tóxicos.
Con el procedimiento según la invención, de modo especialmente sencillo y acelerado se consigue identificar inhibidores fiables de la nucleación primaria de agregación de beta-amiloide mediante correspondiente acortamiento de la fase lag y, por consiguiente, hallar principios activos contra la formación de oligómeros tóxicos de manera rentable.
Naturalmente, en este caso también se aplican las moléculas identificadas ya en el estado de la técnica, como péptidos, anticuerpos, principios activos para el tratamiento de cáncer, como por ejemplo bexaroteno, en el ensayo acortado según la invención, y se analizan respecto su eficacia en la prevención de la formación de oligómeros tóxicos. Estas se pueden emplear como control positivo.
A tal efecto, en el ámbito de la invención se identificó que la agregación de beta-amiloide es una reacción compleja, constituida por varios pasos, en la que procesos posteriores secundarios dominan el ensayo común de desarrollo de reacción observado según el estado de la técnica. Además, se identificó que estos procesos posteriores se producen durante la fase lag.
Correspondientemente, según la invención se desarrolló un ensayo de agregación cinético que no se domina mediante procesos secundarios, sino mediante la nucleación primaria, mediante acortamiento de la fase lag.
En lugar de monómero de A-beta, el ensayo, o bien el procedimiento según la invención utiliza un constructo dimérico recién desarrollado con el título de trabajo ''Abeta-FlexiDimer'', en el que dos monómeros de A-beta están unidos entre sí a través de un engarce peptídico flexible. A tal efecto se pueden emplear, a modo de ejemplo, dos unidades de la variante de A-beta más frecuente, la A-beta (1-40). Son interesantes y, por lo tanto, objeto de la invención otras variantes diméricas de A-beta, como por ejemplo A-beta (1 -42), o versiones modificadas, también versiones más cortas y mezclas de estas. De manera ejemplar se puede engarzar únicamente un monómero de A-beta (1-40) con un monómero de A-beta (1-42).
El tamaño relativamente grande del engarce se seleccionó para que las unidades A-beta en el constructo dimérico no se obstaculizaran en la formación de la estructura de amiloide habitual mediante interacciones con los vecinos fusionados, lo que se puede confirmar mediante medidas de microscopía de fuerza atómica.
En comparación con el monómero de A-beta, el Abeta-FlexiDimer muestra ventajosamente un comportamiento mejorado en el ensayo de agregación cinético, en este caso el procedimiento según la invención. Este está caracterizado ventajosamente por que elimina casi completamente la fase lag. A tal efecto, la concentración se puede situar a partir de 1 microM hasta aproximadamente 50 microM, de modo preferente aproximadamente 5 microM. De este modo se provoca ventajosamente que se produzca un claro ahorro de tiempo en la realización del procedimiento de ensayo. Además, un principio activo añadido se puede identificar de este modo como un principio activo que inhibe de hecho la nucleación primaria y no interviene en la agregación ulterior hasta un momento posterior, con concentraciones de monómero de A-beta simultáneamente reducidas.
Estos efectos positivos no eran de esperar por el estado de la técnica sobre engarces, como por ejemplo por Chen et al. (Chen, X., Zaro, J., Shen, W.-C. (2013). Fusion protein linkers: Property, Design and Functionality. Adv Drug Deliv Rev 65(10): 1357-1369) o por Chichilli et al. (Chichilli, V.P.R., Kumar, V., Sivaram J. (2013). Protein Science 22:153-167).
De este modo se identifican los inhibidores que impiden la formación de oligómeros tóxicos y entran en consideración como principios activos frente a las correspondientes enfermedades debidas al plegamiento defectuoso de proteínas.
La invención no está limitada a esto. La invención se refiere más bien a otros procedimientos que se refieren a la agregación de monómeros de enfermedades debidas al plegamiento defectuoso de proteínas en general, y precisamente en especial: procedimiento para el análisis de la agregación de monómeros de beta-amiloide de enfermedades debidas al plegamiento defectuoso de proteínas, con los pasos:
a) se dispone una especie de beta amiloide en disolución, o bien tampón;
b) se determina la agregación de monómeros de beta-amiloide;
caracterizado por que
como especie de A-beta se seleccionan dos unidades de monómero de A-beta con un engarce dispuesto entre los monómeros de A-beta.
El engarce presenta las características anteriores.
Es obvio que, a tal efecto, también los monómeros de A-beta, como el citado A-beta (1-42) y/o A-beta (1-40) y/u otros monómeros que se presentan en la demencia de Alzheimer se pueden examinar respecto a su comportamiento de agregación. Además, cualquier otro monómero de otra enfermedad debida al plegamiento defectuoso de proteínas se puede examinar del modo según la invención según el procedimiento dado a conocer, y se puede reivindicar asimismo un KIT, o bien un engarce peptídico a tal efecto.
Ejemplos de realización
En lo sucesivo se explica más detalladamente la invención por medio de ejemplos de realización y las figuras adjuntas, sin que de este modo se produzca una limitación de la invención a la agregación de beta-amiloide. Muestran:
la Figura 1: cinética del procedimiento según la invención con dímero según la invención. A Agregación de Abeta-Flexi-Dimer a diferentes concentraciones. B Transición entre la nucleación primaria y los procesos secundarios en función de la concentración.

Claims (6)

  1. REIVINDICACIONES
    1 Procedimiento para la identificación de inhibidores de nucleación primaria de agregación de beta-amiloide, con los pasos:
    a) se dispone una especie de A-beta en disolución, o bien tampón;
    b) se determina la agregación de beta-amiloide; caracterizado por que
    c) como especie de A-beta se seleccionan dos unidades de monómero de A-beta (1 -40) y/o monómero de A-beta (1 -42) con un engarce dispuesto entre los monómeros de A-beta, seleccionándose como engarce un engarce peptídico con la secuencia (Glyx-Sery)n, con x = 1-4, y = 1 y n = 1-10, y presentando el engarce 10 a 90 % del número de aminoácidos, como las especies de A-beta engarzadas, y estando dispuesto el engarce entre el entre el término C del primer monómero de A-beta y el término N del segundo monómero de A-beta, y seleccionándose como engarce un engarce peptídico con conformación flexible, y seleccionándose como engarce, que se encuentra entre las dos unidades de monómeros de A-beta, un péptido que reduce la fase lag de la agregación de beta-amiloide en al menos 50 % en comparación con la fase lag en la agregación de los monómeros no engarzados correspondientemente,
    d) se añade un colorante fluorescente para la identificación de la formación de amiloide a la disolución, o bien tampón, y se mide el aumento de la señal de fluorescencia como identificación de la agregación de beta-amiloide,
    e) se añade un inhibidor a examinar y se valora positivamente si limita la altura de la señal de fluorescencia o retarda el ascenso temporal de la señal de fluorescencia.
  2. 2. - Procedimiento según la reivindicación precedente, caracterizado por que en el paso d) no se añade un colorante fluorescente y la agregación de beta-amiloide se identifica mediante dispersión de la luz.
  3. 3. - Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que se seleccionan dos unidades de monómero A-beta idénticas o no idénticas.
  4. 4. - Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que como engarce, que se encuentra entre las dos unidades de monómeros de A-beta, se selecciona un péptido, que reduce la fase lag de la agregación de beta-amiloide en 80 %, en especial 90 % o incluso 100 %.
  5. 5. - Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes caracterizado por que como engarce se selecciona un engarce peptídico con la secuencia (Gly4-Ser)4.
  6. 6. - Procedimiento para el análisis de la agregación de monómeros de beta-amiloide, con los pasos:
    - se dispone una especie de beta-amiloide en disolución, o bien tampón;
    - se determina la agregación monómeros de beta-amiloide;
    - caracterizado por que como especie de A-beta se seleccionan dos unidades de monómero de A-beta (1 -40) y/o monómero de A-beta (1-42) con un engarce dispuesto entre los monómeros de A-beta, seleccionándose como engarce un engarce peptídico con conformación flexible con la secuencia (Glyx-Sery)n, con x = 1-4, y = 1 y n = 1-10.
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