JP2017007990A - アミロイド凝集性評価用汎用性量子ドットナノプローブ - Google Patents

Abstract

【課題】 本発明の課題は、アミロードーシスの原因物質であるアミロイド形成性タンパク質やペプチドのアミロイド線維に対して広い相互作用スペクトラムを持つ量子ドットナノプローブ（ユニバーサルプローブ）を提供することである。
【解決手段】 本発明は、３〜１０個のアミノ酸からなるアミロイド形成性ペプチドのＮ末端またはＣ末端にシステインを介して量子ドットが結合してなる、量子ドットナノプローブ、並びに、該量子ドットナノプローブを用いて、試料中のアミロイド凝集の有無を判別する方法などに関する。
【選択図】 図１０

Description

本発明は、タンパク質やペプチドのアミロイド凝集性を評価するための汎用性量子ドットナノプローブおよび該量子ドットナノプローブを用いたアミロイド形成阻害剤の評価方法に関する。

超高齢社会化が進む中で、アルツハイマー病や透析アミロイドーシスなどアミロイド線維の沈着によって引き起こされる疾病が社会問題化している。アミロイド線維は、変性したタンパク質分子が規則的に会合することによって形成される超分子複合体であり、様々な疾患の発症に深く関わっている。アミロイド線維が全身諸臓器の細胞内外に沈着することによって機能障害を引き起こす一連の疾患は、アミロイドーシスとよばれ、現在までにアルツハイマー病（アミロイドβタンパク質）、透析アミロイドーシス（β２ミクログロブリン）、遺伝性アミロイド性脳出血症（シスタチン）、異常プリオンタンパク質の伝播により発症するプリオン病など多くの疾病が報告されている。

アミロイドーシスやアミロイド形成性タンパク質などに関する研究は、この十数年間に著しい進展が見られている（例えば、非特許文献１）。例えば、比較的短い合成ペプチドを設計し、その自己凝集性について研究され（例えば、非特許文献２）、アミロイド凝集性などの解明が進められているが、アミロイド線維の生成機序、毒性及びその制御については未だ不明の部分が多く残されたままであるのが現状である。これまでアミロイド凝集を検出するため、抗体を用いること（特許文献１および２）などが検討されてきたが、標識の寿命が短く、長時間の観察には適さないという問題があった。

アミロイド線維の評価法として代表されるＴｈＴアッセイは、形成されたβシート構造に特異的に結合するチオフラビンＴ（ＴｈＴ）を用いたアミロイド形成性評価法であり、現在のアミロイド研究において広く用いられている手法である。また、透過型電子顕微鏡によってアミロイド線維の形成を観察する手法も広く用いられている。しかし、ＴｈＴアッセイでは、多量のサンプルを用いるためにスクリーニング手法としては用いることが出来ず、更に透過型電子顕微鏡観察では定量性を持たない点から、新規のアミロイド形成性評価法が求められてきた。

近年開発された蛍光を発するナノマテリアルである量子ドット（Ｑｄｏｔ（登録商標））は、抽出用溶媒の影響を受けないこと、固定化や染色等が不要で大量のサンプルを同時に処理することが可能であること、数μＬの微量でも試験が可能である。かかる量子ドットを用い、徳楽らはアミロイドβタンパク質溶液中に、量子ドットを付加したアミロイドβペプチドを低濃度で添加することにより、アミロイドβ線維を量子ドットによって蛍光標識する手法を確立した（非特許文献３および４）。しかし、この量子ドットを用いた評価法は現在までアミロイドβタンパク質のみで行われており、他のアミロイド形成性タンパク質でも可能かどうかは検討されていない。

特開２０１１−１２２９２８号公報 特開２０１４−２２３０７５号公報

Nakamura. S, Owaki. T, Maeda. Y, Katayama. S and Nakamura. K, Amyloidogenic proteins and peptides. in Mine. Y, Li-Chan. E and Jiang. B,(Eds.) "Bioactive Proteins and Peptides as Functional Foods and Nutraceuticals", Blackwell Publishing Ltd. and Institute of Food Technologists, Chapter 7 (pp.87-99), 2010 Lakshmanan. A, Cheong. DW, Accardo. A, Di Fabrizio. E, Riekel. C, Hauser. CAE: Aliphatic peptides show similar self-assembly to amyloid core sequences, challenging the importance of aromatic interactions in amyloidosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 110, 519-524, 2013 Tokuraku. K, Marquardt. M, Ikezu T: Real-time imaging and quantification of amyloid-beta peptide aggregates by novel quantum-dot nanoprobes. PLoS ONE, 4, e8492, 2009 Ishigaki. Y, Tanaka. H, Akama. H, Ogara. T, Uwai. K, Tokuraku. K: A Microliter-Scale High-throughput Screening System with Quantum-Dot Nanoprobes for Amyloid-beta Aggregation Inhibitors. PLoS ONE, 8, e72992, 2013

本発明者らは、上記の状況に鑑み、研究を重ねる中で、非特許文献３および４に記載された量子ドットナノプローブを用いたアミロイドーシスの検出について検討を進めたところ、かかる量子ドットナノプローブを用いた場合、アミロイドβタンパク質由来のアミロイドーシスは特異的に検出できる一方、他のタンパク質由来のアミロイドーシスについては検出できないという新たな問題を認識するに至った。このことは、多様なアミロイド形成性タンパク質のアミロイド凝集という現象においては、ある程度の非特異性を有することによりその利用性を格段に改善できるとの新たな発見に基づくものである。

したがって本発明の課題は、アミロイド線維に対して広い相互作用スペクトラムを持つ量子ドットナノプローブ（ユニバーサルプローブ）を提供することにある。

かかる問題を解決すべく、さらに研究を進めたところ、本発明者らは、比較的短いアミノ酸長からなるアミロイド線維に結合することが予測されるペプチド（アミロイド形成性ペプチド（amyloidogenic peptide））を用いて量子ドットナノプローブを作製したところ、かかる量子ドットナノプローブは、複数の種類のアミロイド形成性タンパク質の凝集に対する検出に用いることができることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、以下に関する。
［１］３〜１０個のアミノ酸からなるアミロイド形成性ペプチドのＮ末端またはＣ末端にシステインを介して量子ドットが結合してなる、量子ドットナノプローブ。
［２］量子ドットが、ＣＬＩＶＡＧＤ（配列番号５８）、ＣＫＬＶＦＦＡＥ（配列番号５９）、ＣＬＶＦＦＡ（配列番号６０）またはＣＧＮＮＱＱＮＹ（配列番号６１）のＮ末端にあるシステインに結合してなる、前記［１］に記載の量子ドットナノプローブ。
［３］複数の生体由来のアミロイド形成性タンパク質のアミロイド形成を検出するための、前記［１］または［２］に記載の量子ドットナノプローブ。
［４］複数の生体由来のアミロイド形成性タンパク質が、アミロイドβタンパク質、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アポリポプロテインＡ−ＩＩ、β２ミクログロブリン、インスリン、リゾチーム、シスタチンＣおよびステフィンＡからなる群から選択される２つ以上である、前記［３］に記載の量子ドットナノプローブ。
［５］複数の生体由来のアミロイド形成性タンパク質が、アミロイドβおよびアポリポタンパク質Ａ−ＩＩである、前記［４］に記載の量子ドットナノプローブ。
［６］前記［１］〜［５］のいずれか一項に記載の量子ドットナノプローブを用いて、試料中のアミロイド凝集の有無を判別する方法。

本発明の量子ドットナノプローブは、少数のアミノ酸からなるアミロイド形成性ペプチドに量子ドットとの結合のためのシステインを付加しても、種々のタンパク質由来のアミロイド凝集に対して有効に検出プローブとして機能し、汎用性のあるプローブ（ユニバーサルプローブ）として用いることができる。これは、従来において用いられていた抗体や特異性の高いプローブでは、多様なアミロイド凝集を検出するためには、アミロイド凝集の種類に応じて何種類もの抗体やプローブを用意する必要があったのに対し、１種類のプローブで、多様なアミロイド凝集の検出が一挙に検出することが可能となる。また本発明の量子ドットナノプローブは、ペプチド鎖が短いことから合成に時間やコストがかからない。すなわち、本発明の量子ドットナノプローブは、標識の寿命が長く、高感度で、迅速かつ安価にアミロイド凝集の検出ができる。
さらに、アミロイドーシスに起因する種々の疾患の診断や、種々のアミロイド形成性タンパク質やペプチドを標的としたアミロイド凝集阻害物質のスクリーニングや分子設計（抗アミロイドーシス剤の創薬）を可能にする。特に、アミロイド形成性ペプチド部分のアミノ酸長が比較的短いことから、工業的に生産する場合でも安価に製造できる。

図１は、ＴｈＴの蛍光強度を指標とし、ＡｐｏＡ−ＩＩ由来ペプチドのアミロイド凝集性を評価した結果を示す棒グラフである。黒は、各ペプチド溶液の２４時間インキュベーション後のＴｈＴ蛍光強度を示し、白は、各ペプチド溶液の４８時間インキュベーション後のＴｈＴ蛍光強度を示す。 図２は、透過型電子顕微鏡を用いたＡｐｏＡ−ＩＩ由来ペプチドのアミロイド凝集性の結果を示す写真図である。Ａ：コントロール溶液、Ｂ：ＡｐｏＡ−ＩＩ Ｃ末端ペプチド（２００μＭ）２４時間インキュベーション、Ｃ：ＡｐｏＡ−ＩＩ Ｎ末端ペプチド（２００μＭ）２４時間インキュベーション、Ｄ：ＡｐｏＡ−ＩＩ Ｃ末端ペプチド（２００μＭ）＋ＡｐｏＡ−ＩＩ Ｎ末端ペプチド（２００μＭ）２４時間インキュベーション。 図３は、Ｑｄｏｔ−Ａβプローブを用いたＡβの凝集性評価の結果を示す図である。上図は、アミロイド形成反応溶液の経時的変化を示し、下図は、各画像のＳＤ値より得られたアミロイド線維形成曲線を示す。 図４は、Ｑｄｏｔ−ＡｐｏＡ−ＩＩ（Ｃ）プローブを用いたＡｐｏＡ−ＩＩの凝集性評価の結果を示す図である。上図は、アミロイド形成反応溶液の経時的変化を示し、下図は、各画像のＳＤ値より得られたアミロイド線維形成曲線を示す。 図５は、Ｑｄｏｔ−ＬＤ６プローブを用いたＡβの凝集性評価の結果を示す図である。上図は、アミロイド形成反応溶液の経時的変化を示し、下図は、各画像のＳＤ値より得られたアミロイド線維形成曲線を示す。 図６は、Ｑｄｏｔ−ＬＤ６プローブを用いたＡｐｏＡ−ＩＩの凝集性評価の結果を示す図である。上図は、アミロイド形成反応溶液の経時的変化を示し、下図は、各画像のＳＤ値より得られたアミロイド線維形成曲線を示す。 図７は、Ｑｄｏｔ−ＬＤ６プローブを用いた種々のアミロイド形成性タンパク質凝集体の蛍光観察の結果を示す図である。Ａ：リゾチーム溶液（１．３６ｍＭ）を２４時間インキュベーションした後に観察した凝集体の蛍光画像、Ｂ：インスリン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）を３時間インキュベーションした後に観察した凝集体の蛍光画像、Ｃ：ステフィンＡ（２００μＭ）を２４時間インキュベーションした後に観察した凝集体の蛍光画像。 図８Ａは、Ｑｄｏｔ−ＡβとＱｄｏｔ−ＬＤ６をプローブとして用いた場合のＡβの凝集阻害効果の比較結果を示す図であり、ＡβとＱｄｏｔ−Ａβの混合溶液に対して各凝集阻害化合物を添加し、２４時間インキュベーション後に蛍光顕微鏡により観察した画像を示す。 図８Ｂは、Ｑｄｏｔ−ＡβとＱｄｏｔ−ＬＤ６をプローブとして用いた場合のＡβの凝集阻害効果の比較結果を示す図であり、図８Ａと同条件で、Ｑｄｏｔ−ＬＤ６を用いた場合の観察画像を示す。 図８Ｃは、Ｑｄｏｔ−ＡβとＱｄｏｔ−ＬＤ６をプローブとして用いた場合のＡβの凝集阻害効果の比較結果を示す図であり、各溶液の観察画像からＳＤ値を算出し比較した結果を示す棒グラフである。黒は、Ｑｄｏｔ−Ａβを用いた場合のＳＤ値であり、白は、Ｑｄｏｔ−ＬＤ６を用いた場合のＳＤ値である。 図９Ａは、Ｑｄｏｔ−ＡｐｏＡ−ＩＩとＱｄｏｔ−ＬＤ６をプローブとして用いた場合のＡｐｏＡ−ＩＩの凝集阻害効果の比較結果を示す図であり、ＡｐｏＡ−ＩＩとＱｄｏｔ−ＡｐｏＡ−ＩＩ（Ｃ）の混合溶液に対して各凝集阻害化合物を添加し、２４時間インキュベーション後に蛍光顕微鏡により観察した画像を示す。 図９Ｂは、Ｑｄｏｔ−ＡｐｏＡ−ＩＩとＱｄｏｔ−ＬＤ６をプローブとして用いた場合のＡｐｏＡ−ＩＩの凝集阻害効果の比較結果を示す図であり、図９Ｂと同条件で、Ｑｄｏｔ−ＬＤ６を用いた場合の観察画像を示す。 図９Ｃは、Ｑｄｏｔ−ＡｐｏＡ−ＩＩとＱｄｏｔ−ＬＤ６をプローブとして用いた場合のＡｐｏＡ−ＩＩの凝集阻害効果の比較結果を示す図であり、各溶液の観察画像からＳＤ値を算出し比較した結果を示す棒グラフである。黒は、Ｑｄｏｔ−Ａβを用いた場合のＳＤ値であり、白は、Ｑｄｏｔ−ＬＤ６を用いた場合のＳＤ値である。 図１０は、４種類のＱｄｏｔペプチドをプローブとして用いた場合のＡβの凝集性評価の結果を示す図である。

本発明の量子ドットナノプローブは、アミロイド形成性ペプチドのＮ末端またはＣ末端にシステインを介して量子ドットが結合してなる。ここでアミロイド形成性ペプチドは、３〜１０個、好ましくは４〜８個のアミノ酸からなり、例えば、下記表１に記載のアミロイド形成性ペプチドが選択される。

本発明の量子ドットナノプローブは、好ましくは、量子ドットが、ＣＬＩＶＡＧＤ（配列番号５８）、ＣＫＬＶＦＦＡＥ（配列番号５９）、ＣＬＶＦＦＡ（配列番号６０）またはＣＧＮＮＱＱＮＹ（配列番号６１）のＮ末端にあるシステインに結合してなる構造を有する。

本発明の量子ドットナノプローブは、複数の生体由来のアミロイド形成性タンパク質のアミロイド形成を検出するために用いることができる。
ここで生体由来のアミロイド形成性タンパク質は、特に限定されないが、例えば、下記表２に記載のアミロイド形成性タンパク質や、ステフィンＡ、αシヌクレインなどが挙げられる。本発明の量子ドットナノプローブを用い、表２に記載のアミロイド形成性タンパク質を検出することによって、該アミロイド形成性タンパク質に関連する疾患の診断を行うことも可能である。

本発明の一態様において、複数の生体由来のアミロイド形成性タンパク質は、アミロイドβタンパク質、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ、β２ミクログロブリン、インスリン、リゾチーム、シスタチンＣおよびステフィンＡからなる群から選択される２つ以上である。特に、アミロイドβおよびアポリポタンパク質Ａ−ＩＩであることが好ましい。

本発明はまた、前記の量子ドットナノプローブを用いて、試料中のアミロイド凝集の有無を判別する方法に関する。
アミロイド凝集は、タンパク質が線維化し、沈着することをいい、アミロイドーシスの原因となる。アミロイドーシスとは、アミロイド形成により生じる重篤な疾患群の総称である。アミロイドーシスは局在性によって全身性アミロイドーシスと限局性アミロイドーシスの２つ大きく分類されており、アミロイドタンパク質が血中に存在する場合は全身性アミロイドーシス、特定の臓器に限局して沈着を認める場合は限局性アミロイドーシスと呼ばれる。

アミロイドーシスは蓄積する臓器によっても分類することが可能であり、代表的な脳アミロイドーシスにはアルツハイマー病やアイスランド型遺伝性アミロイド性脳出血（シスタチンＣの遺伝子変異）などがある。また、クロイツフェルト・ヤコブ病やプリオン病（異常プリオンタンパク質）もまた脳内へのアミロイド線維への蓄積、沈着が原因とされている。

したがって本発明の量子ドットナノプローブは、汎用性のあるユニバーサルプローブとして用いることができるので、アルツハイマー病、アイスランド型遺伝性アミロイド性脳出血、クロイツフェルト・ヤコブ病、プリオン病などのアミロイド形成により生じる重篤な疾患の判別に用いることができる。

さらに本発明の量子ドットナノプローブは、抗アミロイド物質のスクリーニング、抗アミロイド物質の分子デザイン、生体内における標的タンパク質／ペプチドの動態観察などに用いることができる。

以下、本発明について、さらに詳細に実施例を用いて説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

＜用いた材料＞
ＡｐｏＡ−ＩＩのＮ−末端ペプチド（ＡｐｏＡ−ＩＩ（Ｎ）：ＤＭＱＳＬＦＴＱＹＦＱ（配列番号５２））および、Ｃ−末端ペプチド（ＡｐｏＡ−ＩＩ（Ｃ）：ＱＬＴＰＬＶＲＳＡＧＴＳＬＶＮＦＦＳ（配列番号５３））（（９５％≦、Biologica（Nagoya，Japan））は、６ｍＭになるようＤＭＳＯで溶解したものを用いた。
Ａβ_1-42（ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ（配列番号５４））は株式会社ペプチド研究所（Osaka, Japan）より購入し、１ｍＭとなるようＤＭＳＯで溶解したものを実験に供した。Ｃｙｓ−ＡｐｏＡ−ＩＩ（Ｃ，Ｎペプチド）、Ｃｙｓ−ＬＤ６はＭＢＬに合成委託した物を用いた。また、Ｃｙｓ−ＡβはANASPECから入手した。それぞれのシステイン残基導入ペプチドは、１ｍＭになるようＤＭＳＯ溶解し、使用するまで−８０℃で保存した。コロジオン膜は日清ＥＭ株式会社（Tokyo, Japan）より購入し、ＰＴＡ試薬は和光純薬工業株式会社（Osaka, Japan）より入手した。チオフラビンＴ（ＴｈＴ）はWako Pure Chemical Industries Ltd（Osaka，Japan）より購入した。

試験例１：ＴｈＴアッセイによるＡｐｏＡ−ＩＩのアミロイド凝集性評価
ＡｐｏＡ−ＩＩのＣ末端ペプチド（ＡｐｏＡ−ＩＩ（Ｃ））および、ＡｐｏＡ−ＩＩのＮ末端ペプチド（ＡｐｏＡ−ＩＩ（Ｎ））は、１００％ＤＭＳＯで６ｍＭに溶解した溶液を用いた。このＡｐｏＡ−ＩＩペプチド溶液を終濃度各２００μＭ、ＤＭＳＯを終濃度２０％となるように添加した。バッファーは、ｐＨ２．６にあらかじめ調製したクエン酸バッファーを終濃度５０ｍＭ加え、milliQで全量２０μＬに調製した。調製したアミロイド線維形成反応溶液を、２４時間、３７℃でインキュベーションし、０、２、６、１２、２４ｈでそれぞれ回収した。回収したアミロイド形成反応溶液８μＬと、チオフラビンＴ溶液１．６ｍＬを混合した。チオフラビンＴ溶液は、５μＭチオフラビンＴ、５０ｍＭ NaOH-Glycine buffer（ｐＨ８．５）となるよう調製した溶液を用いた。混合溶液を、励起波長４４６ｎｍおよび蛍光波長４９０ｎｍの条件において蛍光分光光度計ＦＰ−６２００（JASCO，Tokyo，Japan）を用いて測定した。

＜結果＞
ＡｐｏＡ−ＩＩ Ｃ末端ペプチド単独、ＡｐｏＡ−ＩＩ Ｎ末端ペプチド単独もしくはＡｐｏＡ−ＩＩ Ｃ末端ペプチドとＡｐｏＡ−ＩＩ Ｎ末端ペプチドとを混合した場合の３通りの条件で線維形成がどのように行われるか観察した。
まず、Ｃ末端ペプチド単独の場合、わずかに線維形成が見られた。一方、Ｎ末端ペプチド単独の場合、線維形成は引き起こされなかった。これらと比較し、ＡｐｏＡ−ＩＩ Ｃ末端ペプチドとＮ末端ペプチドを混合し、インキュベーションした結果、線維伸長が非常に速い速度で引き起こされ、最終の２４ｈでは非常に多くの線維体が観察された（図１）。

試験例２：透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によるＡｐｏＡ−ＩＩのアミロイド凝集性評価
ＡｐｏＡ−ＩＩのアミロイド線維形成条件は、上述したＴｈＴアッセイで用いた方法と同様であり、２４ｈインキュベーション後の溶液を用いた。反応溶液５μＬを、４００メッシュコロジオン膜の銅グリッド上にスポットし、すぐに濾紙でふき取り乾燥させた。次に、１％ＰＴＡ溶液をコロジオン膜上に滴下し、余分な水分を濾紙でふき取って乾燥させることで観察用サンプルとした。観察は、加速電圧８０ｋＶでＪＥＭ−１４００顕微鏡（JEOL，Tokyo，Japan）を用いて行った。

＜結果＞
ＡｐｏＡ−ＩＩ線維の観察を行った結果、上述のＴｈＴアッセイの結果と相同性の高い結果が得られた。すなわち、蛍光強度の上昇がほとんど見られなかったＣ末端ペプチド、Ｎ末端ペプチド単独の場合では線維形成は引き起こされなかった。これに対し、Ｃ末端ペプチドとＮ末端ペプチドを混合してインキュベーションした場合、線維形成が引き起こされ、多くの線維体を観察することに成功した（図２）。

試験例３：量子ドット（Ｑｄｏｔ）ナノプローブの調製
アミロイド形成性ペプチドそれぞれにＣｙｓ残基を導入したペプチドを用いて、表３に記載の量子ドットナノプローブを調製した。

まず、１２．５μＬのＱｄｏｔ−ＰＥＧ−ＮＨ２（８μＭ）を１．５ｍＬチューブに入れ、４℃、１分間、１０，０００ｇ条件下で遠心分離した。遠心分離後、上澄みをNANOSEPへ移した。Ｑｄｏｔ溶液にＰＢＳ ４５０μＬを加え、混合した後に４℃、７分間、１０，０００ｇ条件下で遠心分離した。この工程をもう一度行い、NANOSEPに残ったＱｄｏｔ溶液をＰＢＳで洗浄しながら全量を９μＬにした。９μＬのＱｄｏｔ溶液に、架橋剤となる１０ｍＭのsulfo-EMCSを１μＬ添加し、よく混合して１時間常温で反応させた。反応後、未反応のＮ−ヒドロキシスクシンイミド基を不活性化させるために１００ｍＭのＫ−グルタミン酸溶液を１μＬ加え、よく混合して１０分間常温で反応させ、Ｑｄｏｔ−ＰＥＧ−ＣＬを調製した。これを脱塩カラムに染み込ませ、さらに３μＬのＰＢＳＥを加えた後に４℃、２分間、１，０００ｇ条件下で遠心分離した。脱塩処理後のＱｄｏｔ溶液に、ＤＭＳＯ中の１ｍＭアミロイド形成性ペプチド溶液をそれぞれ加え、よく混合して１時間常温で反応させ、Ｑｄｏｔ−ＰＥＧ−ＣＬ−ｐｅｐｔｉｄｅを調製した。

未反応のマレイミド基を不活性化させるため、１００ｍＭの２−メルカプトエタノールを１μＬ加えて混合し、１０分間常温で反応させた。Ｑｄｏｔ溶液をNANOSEPへ移し、milliQを４５０μＬ加えて４℃、７分間、１０，０００ｇ条件下で遠心分離し、milliQで洗いを含め７μＬにした後、脱塩カラムに染み込ませてスタッカーとして３μＬのmilliQを加えた後に４℃、２分間、１，０００ｇ条件下で遠心分離し、Ｑｄｏｔ−ｐｅｐｔｉｄｅとした。調製したＱｄｏｔ−ｐｅｐｔｉｄｅは、それぞれnanodrop 2000（Thermo Fisher Scientific,Yokohama,Japan）を用いて励起波長２８０ｎｍ、蛍光波長３５０ｎｍで測定し、濃度を算出した。

試験例４：量子ドットナノプローブ法によるアミロイド凝集性評価
調製した量子ドットナノプローブ溶液をアミロイド形成性タンパク質溶液と混合しインキュベーションすることで、量子ドットによりアミロイド線維を蛍光標識した。線維形成反応溶液の挿入されたwellの底面から蛍光顕微鏡で画像を撮影することで、タンパク質凝集体形成の経時的変化を観察した。さらに、撮影した凝集体の画像を解析し数値化することで、アミロイド凝集性について評価した。解析には、画像解析ツールであるimageJを用い、well画像中の１００×１００pixel領域のＳＤ値をランダムに１０か所測定し、平均値を算出し比較することで定量化を行った。

試験例５：Ｑｄｏｔ−Ａβプローブを用いたＡβのアミロイド凝集性評価
Ａβペプチドは、１００％ＤＭＳＯで１ｍＭに溶解した溶液を用いた。このＡβペプチド溶液を終濃度３０μＭとなるよう添加した。バッファーは、ｐＨ７．４にあらかじめ調製した１０×ＰＢＳを終濃度１×ＰＢＳとなるよう加えた。濃度を測定したＱｄｏｔ−Ａβを、終濃度が各３０ｎＭとなるように加えた後、milliQで全量２０μＬに調製した。調製したアミロイド線維形成反応溶液４℃で２分間、１０，０００ｇで遠心分離し、沈殿を吸い取らないように上清のみを１５３６ wellプレートの１ wellにつき５μＬアプライした。次に、well上をプレートシールにより密閉し、３７℃でインキュベーションした。蛍光顕微鏡観察は０、２、６、１２、２４ｈそれぞれで行い、蛍光画像の撮影を行った。撮影画像からＳＤ値を算出し、アミロイド凝集性評価を行った。

＜結果＞
Ｑｄｏｔ−ＡβとＡβの混合溶液をインキュベーションし、蛍光顕微鏡により経時的変化を観察した。その結果、インキュベーション前には見られなかったタンパク質凝集体を観察することに成功した。観察画像より、インキュベーション開始から２時間〜６時間の間に最も線維形成が促進されていることが示された。また、ＳＤ値を測定し、線維形成曲線を作製したところ、典型的なアミロイド形成曲線が得られた（図３）。

試験例６：Ｑｄｏｔ−ＡｐｏＡ−ＩＩプローブを用いたＡｐｏＡ−ＩＩペプチドのアミロイド凝集性評価
Ｑｄｏｔ−ＡｐｏＡ−ＩＩ（Ｃ，Ｎ）を用い、ＡｐｏＡ−ＩＩのアミロイド線維形成を標識することが可能か調べた。また、Ｑｄｏｔを用いたアミロイド線維観察法が、徳楽らにより報告のあるアミロイドβでの成功例に限らず、他のアミロイド形成性タンパク質であるＡｐｏＡ−ＩＩに応用可能かを検討した。

ＡｐｏＡ−ＩＩのＣ末端、Ｎ末端ペプチドは、１００％ＤＭＳＯで６ｍＭに溶解した溶液を用いた。このＡｐｏＡ−ＩＩペプチド溶液を終濃度各５００μＭおよびＤＭＳＯを終濃度２０％となるよう添加した。バッファーは、ｐＨ２．６にあらかじめ調製したクエン酸バッファーを終濃度５０ｍＭ加えた。濃度を測定したＱｄｏｔ−ＡｐｏＡ−ＩＩ（Ｃ，Ｎ）を、終濃度が各５０ｎＭとなるように加えた後、milliQで全量２０μＬに調製した。調製したアミロイド線維形成反応溶液４℃、２分間、１０，０００ｇ条件下で遠心分離し、上清のみを１５３６ wellプレートの１ wellにつき５μＬアプライした。サンプルをアプライしたwell上を、セロテープ（登録商標）、プレートシールで密閉し、インキュベーターを用いて３７℃でインキュベーションした。蛍光顕微鏡観察は０、２、６、１２、２４ｈそれぞれで行い、撮影を行った。また、撮影画像からＳＤ値を算出し、アミロイド凝集性評価を行った。

＜結果＞
Ｑｄｏｔ−ＡｐｏＡ−ＩＩを用いることにより、ＡｐｏＡ−ＩＩアミロイド線維の形成により引き起こされる溶液の変化を経時的に観察した。その結果、インキュベーション時間の経過に伴うＡｐｏＡ−ＩＩ線維の増加を確認することに成功した。また、ＳＤ値の測定によるアミロイド線維形成性評価法がＡｐｏＡ−ＩＩにおいても有効であることが示された（図４）。今回の実験では、Ｑｄｏｔ−ＡｐｏＡ−ＩＩ（Ｃ）とＱｄｏｔ−ＡｐｏＡ−ＩＩ（Ｎ）を用いているが、Ｑｄｏｔ−ＡｐｏＡ−ＩＩ（Ｃ）をプローブとして用いた場合においてより線維体の標識が効率的に行われた。

試験例７：Ｑｄｏｔ−ＬＤ６プローブを用いた種々のアミロイド形成性タンパク質の凝集性評価
Ｑｄｏｔ−ＬＤ６により、種々のアミロイド形成性タンパク質の凝集性評価を行うことが出来るか検討した。本実験では、Ａβ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、インスリン、リゾチーム、ステフィンＡの５種のタンパク質をアミロイド形成性タンパク質として供試した。

Ａβの凝集性評価実験は、上記と同様の手法により、Ｑｄｏｔ−ＡβのかわりにＱｄｏｔ−ＬＤ６を用いることで行った。また、ＡｐｏＡ−ＩＩの凝集性評価実験は、上記と同様の手法により、Ｑｄｏｔ−ＡｐｏＡ−ＩＩのかわりにＱｄｏｔ−ＬＤ６を用いることで行った。インスリンの凝集性評価においては、まずインスリン粉末を４０ｍＭ ＨＣｌで溶解し、２０ｍｇ／ｍＬインスリン溶液を調製した。このインスリン溶液を終濃度２ｍｇ／ｍＬ添加した。リゾチームにおいては、milliQ ２１０μＬで溶解し、５ｍＭリゾチーム溶液とし、終濃度１．３６ｍＭとなるよう添加した。さらに、ステフィンＡの凝集性評価においては、粉末をmilliQで溶解し１ｍＭ溶液を調製し、終濃度２００μＭとなるよう添加した。バッファーは、Ａβにおいては、ｐＨ７．４にあらかじめ調製した１０×ＰＢＳを、終濃度１×ＰＢＳとなるように加えた。ＡｐｏＡ−ＩＩ、インスリン、リゾチーム、ステフィンＡにおいては、ｐＨ２．６にあらかじめ調製したクエン酸バッファーを終濃度５０ｍＭ加えた。濃度を測定したＱｄｏｔ−ＬＤ６を、終濃度が各５０ｎＭとなるようそれぞれ加えた後、milliQで全量２０μＬに調製した。調製したアミロイド線維形成反応溶液４℃で２分間、１０，０００ｇで遠心分離し、沈殿を吸い取らないように上清のみを１５３６ wellプレートの１ wellにつき５μＬアプライした。サンプルをアプライしたｗｅｌｌ上を、セロテープ（登録商標）、プレートシールで密閉し、インキュベーターを用いて３７℃でインキュベーションした。蛍光顕微鏡観察により凝集体を観察し、撮影画像からＳＤ値を算出し、アミロイド凝集性評価を行った。

＜結果＞
Ｑｄｏｔ−ＬＤ６により、Ａβ線維形成を経時的に観察することに成功した。また、ＳＤ値を測定し定量化を行ったところ、Ｑｄｏｔ−Ａβを用いた場合とほぼ同様の値を示した（図５）。同様に、ＡｐｏＡ−ＩＩの凝集性評価をＱｄｏｔ−ＬＤ６により行い、ＳＤ値による比較を行ったところ、Ｑｄｏｔ−ＡｐｏＡ−ＩＩにより標識した場合とほぼ同様の値を示した（図６）。更に、リゾチーム、インスリン、ステフィンＡに対してＱｄｏｔ−ＬＤ６を添加しインキュベーションを行ったところ、インキュベーション前には観察されなかったアミロイド凝集体の観察が可能であることが示された（図７）。

試験例８：Ｑｄｏｔ−ＬＤ６プローブを用いたタンパク質凝集阻害剤の活性評価
アミロイド形成阻害剤として知られているロスマリン酸（ＲＡ）、カフェ酸（ＣＡ）およびクルクミン（Ｃｕｒ）を用い、それぞれの量子ドットナノプローブを用いた場合のアミロイド線維形成阻害効果の評価に用いることが可能か検討した。

（１）Ｑｄｏｔ−ＬＤ６プローブを用いたＡβ線維形成阻害剤の活性評価
Ａβペプチドは、１００％ＤＭＳＯで１ｍＭに溶解した溶液を用いた。このＡβペプチド溶液を終濃度３０μＭとなるよう添加した。バッファーは、ｐＨ７．４にあらかじめ調製した１０×ＰＢＳを終濃度１×ＰＢＳとなるよう加えた。濃度を測定したＱｄｏｔ−ＬＤ６を、終濃度が各３０ｎＭとなるように加えた。更に、供試サンプル三種を０．１、１、１０、１００μＭそれぞれ添加し、よく混合した後にmilliQで全量２０μＬに調製した。調製したアミロイド線維形成反応溶液４℃で２分間、１０，０００ｇで遠心分離し、沈殿を吸い取らないように上清のみを１５３６ wellプレートの１ wellにつき５μＬアプライした。サンプルをアプライしたwell上を、セロテープ（登録商標）、プレートシールで密閉し、インキュベーターを用いて３７℃でインキュベーションした。蛍光顕微鏡観察は０、２、６、１２、２４ｈに行い、撮影を行った。また、撮影画像からＳＤ値を算出し、アミロイド凝集性評価を行った。

（２）Ｑｄｏｔ−ＬＤ６プローブを用いたＡｐｏＡ−ＩＩ線維形成阻害剤の活性評価
ＡｐｏＡ−ＩＩのＣ末端、Ｎ末端ペプチドは、１００％ＤＭＳＯで６ｍＭに溶解した溶液を用いた。このＡｐｏＡ−ＩＩペプチド溶液を終濃度各５００μＭ、ＤＭＳＯを終濃度２０％となるよう添加した。バッファーは、ｐＨ２．６にあらかじめ調製したクエン酸バッファーを終濃度５０ｍＭ加えた。濃度を測定したＱｄｏｔ−ＬＤ６を、終濃度が各５０ｎＭとなるように加えた。更に、供試サンプル三種を０．１、１、１０、１００μＭそれぞれ添加し、よく混合した後にmilliQで全量２０μＬに調製した。調製したアミロイド線維形成反応溶液４℃で２分間、１０，０００ｇで遠心分離し、沈殿を吸い取らないように上清のみを１５３６ wellプレートの１ wellにつき５μＬアプライした。サンプルをアプライしたwell上を、セロテープ（登録商標）、プレートシールで密閉し、インキュベーターを用いて３７℃でインキュベーションした。蛍光顕微鏡観察は０、２、６、１２、２４ｈに行い、撮影を行った。また、撮影画像からＳＤ値を算出し、アミロイド凝集性評価を行った。

＜結果＞
Ａβに対して凝集阻害剤を添加した場合の線維形成阻害度を、Ｑｄｏｔ−Ａβを用いた場合とＱｄｏｔ−ＬＤ６を用いた場合で比較し、ＳＤ値により評価した。その結果、凝集阻害剤として添加した各化合物、各添加濃度いずれにおいても、Ｑｄｏｔ−Ａβを用いた場合とＱｄｏｔ−ＬＤ６を用いた場合で差異は生じなかった（図８Ａ〜Ｃ）。同様に、ＡｐｏＡ−ＩＩに対してもＱｄｏｔ−ＡｐｏＡ−ＩＩを用いた場合とＱｄｏｔ−ＬＤ６を用いた場合で比較したところ、差異は生じなかった（図９Ａ〜Ｃ）。

試験例９：各種Ｑｄｏｔプローブを用いたＡβのアミロイド凝集性評価
表２に記載のＱｄｏｔ−ＫＥ７、Ｑｄｏｔ−ＬＡ５、およびＱｄｏｔ−ＧＹ７の３種類のＱｄｏｔプローブを新たに調整し、Ａβのアミロイド凝集体の蛍光観察を行い、Ｑｄｏｔ−ＬＤ６の場合と比較した。
Ａβペプチドは、１００％ＤＭＳＯで１ｍＭに溶解した溶液を用いた。このＡβペプチド溶液を終濃度３０μＭとなるよう添加した。バッファーは、ｐＨ７．４にあらかじめ調製した１０×ＰＢＳを終濃度１×ＰＢＳとなるよう加えた。濃度を測定した各種Ｑｄｏｔプローブを、終濃度が各３０ｎＭとなるように加えた後、milliQで全量２０μＬに調製した。調製したアミロイド線維形成反応溶液４℃で２分間、１０，０００ｇで遠心分離し、沈殿を吸い取らないように上清のみを１５３６ wellプレートの１ wellにつき５μＬアプライした。次に、well上をプレートシールにより密閉し、３７℃でインキュベーションした。蛍光顕微鏡観察は０、２、６、１２、２４ｈそれぞれで行い、蛍光画像の撮影を行った。

＜結果＞
下記表４および図１０に示すとおり、Ｑｄｏｔ−ＬＤ６と比較して、Ｑｄｏｔ−ＬＡ５およびＱｄｏｔ−ＧＹ７はほぼ同様の線維標識能を示し、Ｑｄｏｔ−ＬＤ６と同様に実用性が認められた。
Ｑｄｏｔ−ＫＥ７は、Ｑｄｏｔ−ＬＡ５と比較して若干蛍光が弱化していた。Ｑｄｏｔ−ＫＥ７とＱｄｏｔ−ＬＡ５とは、システインを除くアミロイド形成性ペプチド部分において、配列の末端にＫ、Ｅが付加しているかいないかの２残基の違いしかなく（表３）、配列のわずかな相違によって、線維標識能に変化が見られた。

＜考察＞
ＴｈＴアッセイによりＡｐｏＡ−ＩＩのアミロイド凝集性を評価した。ＡｐｏＡ−ＩＩのＣ末端ペプチドとＮ末端ペプチドをそれぞれ単体でインキュベーションし、ＴｈＴアッセイに供したところ、蛍光強度の上昇は見られなかった。チオフラビンＴは、βシート構造に特異的に結合し、蛍光を発する物質であることから、Ｃ末端ペプチド・Ｎ末端ペプチド単独では線維形成が引き起こされないことが示唆された。対して、Ｃ末端ペプチド・Ｎ末端ペプチドを混合してインキュベーションした場合には、線維形成に伴う大幅な蛍光強度の上昇が見られた。この結果から、ＡｐｏＡ−ＩＩの線維形成は、Ｃ末端とＮ末端のアミロイド形成性領域が互いに相互作用し、βシート構造を形成しながら凝集することで引き起こされると考えられる。

これらの結果を踏まえて、量子ドットを用いたＡｐｏＡ−ＩＩの凝集性評価を行った結果、Ｑｄｏｔ−ＡｐｏＡ−ＩＩをプローブとして用いることで、ＡｐｏＡ−ＩＩのアミロイド凝集を経時的に観察することが可能であった。また、プローブとして用いるＡｐｏＡ−ＩＩペプチドは、Ｎ末端ペプチドを用いた場合と比較してＣ末端ペプチドを用いた場合の方が効率的に線維を標識した。この結果から、ＡｐｏＡ−ＩＩのＣ末端線維は、線維形成反応のシード形成期における核形成に必要であり、ＡｐｏＡ−ＩＩのアミロイド凝集において重要な役割を持つことが推測される。これらの結果から、Ａβの線維標識にＱｄｏｔ−Ａβを用いる方法やＡｐｏＡ−ＩＩの線維標識にＱｄｏｔ−ＡｐｏＡ−ＩＩを用いる方法など、同種のペプチド間でのペプチド−量子ドットナノプローブの共凝集による線維標識が可能であることがわかった。

応用研究として、Ｑｄｏｔ−ＬＤ６によって種々のアミロイド形成性タンパク質の線維形成を評価できるかどうか試みた。その結果、本実験で供した５種類のアミロイド形成性ペプチドに対して、いずれにおいても線維形成を標識できることが示された。これらのことから、ＬＤ６ペプチドは、アミロイド形成性タンパク質がコンフォメーション変化を引き起こしてβシート構造を形成する際に、同時にβシート構造を形成して共凝集することが可能であると考えられる。つまり、Ｑｄｏｔ−ＬＤ６は、あらゆるタンパク質のアミロイド線維形成過程のみにおいて特異的に結合するユニバーサルなアミロイドプローブとして運用することが出来ると考えられる。

Ｑｄｏｔ−ＬＤ６を用いることによって種々のアミロイド形成性タンパク質の凝集性を評価できることが本実験により明らかとなった。しかし、この方法は異種タンパク質間の共凝集を利用したタンパク質凝集性評価法であるため、様々な化合物に対する反応性が従来法と異なる可能性があった。そこで、Ａβに対して凝集阻害剤を添加した場合の線維形成阻害度を、Ｑｄｏｔ−Ａβを用いた場合とＱｄｏｔ−ＬＤ６を用いた場合で比較した。またＡｐｏＡ−ＩＩでも同様に、Ｑｄｏｔ−ＡｐｏＡ−ＩＩを用いた場合とＱｄｏｔ−ＬＤ６を用いた場合で比較した。その結果、凝集阻害剤として添加した各化合物、各添加濃度いずれにおいても、Ｑｄｏｔ−Ａβを用いた場合とＱｄｏｔ−ＬＤ６を用いた場合で差異は生じなかった。このことから、Ｑｄｏｔ−ＬＤ６を他のタンパク質と共凝集させることで線維の蛍光標識を行った場合でも、純粋なＡβ、ＡｐｏＡ−ＩＩ線維とほぼ同様の凝集性を示すことが明らかとなった。さらに、Ａβ−ＬＤ６、ＡｐｏＡ−ＩＩ−ＬＤ６の共凝集は凝集阻害化合物に対して影響を与えないと考えられる。これにより、様々なアミロイド形成性タンパク質の凝集性評価をＱｄｏｔ−ＬＤ６のみによって行うことが可能であると言える。更には、様々な凝集阻害候補化合物のスクリーニングに利用することが可能であることも示された。

本発明の量子ドットナノプローブは、汎用性のあるユニバーサルプローブとして用いることができるので、アミロイドーシスに起因する種々の疾患の診断や、種々のアミロイド形成性タンパク質やペプチドを標的としたアミロイド凝集阻害物質の分子設計（抗アミロイドーシス剤の創薬）に向けた研究を可能にする。

Claims (6)

1. ３〜１０個のアミノ酸からなるアミロイド形成性ペプチドのＮ末端またはＣ末端にシステインを介して量子ドットが結合してなる、量子ドットナノプローブ。
2. 量子ドットが、ＣＬＩＶＡＧＤ（配列番号５８）、ＣＫＬＶＦＦＡＥ（配列番号５９）、ＣＬＶＦＦＡ（配列番号６０）またはＣＧＮＮＱＱＮＹ（配列番号６１）のＮ末端にあるシステインに結合してなる、請求項１に記載の量子ドットナノプローブ。
3. 複数の生体由来のアミロイド形成性タンパク質のアミロイド形成を検出するための、請求項１または２に記載の量子ドットナノプローブ。
4. 複数の生体由来のアミロイド形成性タンパク質が、アミロイドβタンパク質、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ、β２ミクログロブリン、インスリン、リゾチーム、シスタチンＣおよびステフィンＡからなる群から選択される２つ以上である、請求項３に記載の量子ドットナノプローブ。
5. 複数の生体由来のアミロイド形成性タンパク質が、アミロイドβおよびアポリポタンパク質Ａ−ＩＩである、請求項４に記載の量子ドットナノプローブ。
6. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の量子ドットナノプローブを用いて、試料中のアミロイド凝集の有無を判別する方法。