KR102216845B1

KR102216845B1 - 아밀로이드 베타 응집 억제용 다기능성 탄소 도트 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102216845B1
Application number: KR1020190099490A
Authority: KR
Inventors: 박찬범; 정유정; 이병일
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2019-08-14
Filing date: 2019-08-14
Publication date: 2021-02-19

Abstract

본 발명은 아밀로이드 베타 응집 억제용 다기능성 탄소 도트 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 자세하게는 금속이온과 킬레이트를 형성하는 질소 함유 방향족 고리가 탄소 구조체의 표면에 존재하는 탄소 도트, 상기 탄소 도트를 포함하는 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 상기 탄소 도트 또는 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 신경퇴행성 질환의 치료방법에 관한 것이다. 상기 탄소 도트 또는 약학 조성물은 효과적으로 아밀로이드 베타의 응집을 억제하고, 응집체를 분해하며 아밀로이드 베타 응집체의 세포독성을 완화한다. 이러한 아밀로이드 베타 응집 억제를 통해 아밀로이드 응집체 형성 및 집적이 관련된 신경퇴행성 질환의 예방 및 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

아밀로이드 베타 응집 억제용 다기능성 탄소 도트 및 이의 용도{Multifunctional Carbon Dots for Inhibiting Amyloid beta aggregation and use thereof}

본 발명은 아밀로이드 베타 응집 억제용 다기능성 탄소 도트 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 자세하게는 금속이온과 킬레이트를 형성하는 질소 함유 방향족 고리가 탄소 구조체의 표면에 존재하는 탄소 도트, 상기 탄소 도트를 포함하는 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 상기 탄소 도트 또는 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 신경퇴행성 질환의 치료방법에 관한 것이다.

신경퇴행성 질환(neurodegenerative disease)은 중추신경계의 뇌와 척수 세포가 퇴화 또는 소실 등의 이유로 인하여 표현적인 기능장애로 나타나는 질환을 의미한다. 중추 신경계의 신경세포 뉴런은 운동을 조절하고 감각정보를 처리하며 기억, 의사결정 등의 다양한 기능을 수행하는 데 신경퇴행성 질환은 이러한 뉴런과 수초의 이상으로 기능 이상 및 장애가 발생되는 질병이다. 미국 국립 보건원의 National Institute of Neuro-logical Disorders and Stroke에 의하면 600 종류 이상의 신경퇴행성 질환이 있는 것으로 알려져 있다.

신경퇴행성 질환은 표현형으로 나타나는 증상을 기준으로 하여 크게 운동에 관계되는 문제로 인한 운동실조(ataxia)와 같은 질병과 기억 및 인지에 관련된 문제로 발생하는 치매(dementia)와 같은 질병으로 구별된다. 신경퇴행성 질환은 또한 세포 자체의 내재성 원인으로 세포가 사멸하는 세포자율성 질환과 세포 외부인자의 작용으로 세포가 사멸하는 비 세포자율성 질환으로 나누기도 한다. 그러나 이들은 상호 배타적(mutually exclusive)인 개념만은 아니고 어떤 점에서는 양자가 서로 연관되는 관계를 가지기도 한다. 알려진 신경퇴행성 질환은 알츠하이머병(Alzheimer's Disease), 파킨슨병(Parkinsons's Disease), 루게릭병(amyotrophic lateral sclerosis), 헌팅턴병(Huntington's Disease), 전측두엽 치매(Fronto-Temporal Dementia), 및 피질-기저핵 퇴행증(Cortico Basal Degeneration) 등이 있다.

알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD)은 가장 흔한 형태(전체 치매질환의 60~80%)의 치매성 질환으로 1906년 독일의 정신과 의사인 알로이스 알츠하이머(Alois Alzheimer)에 의해 알려졌다. 세계적으로 알츠하이머병은 65세 이상의 10명 중 1명꼴로 발병하여 점진적인 기억상실 및 인지기능 장애를 일으킨다. 인간을 대상으로 처치 가능한 알츠하이머병의 근본적인 치료방법은 거의 전무한 수준이며 임상 수준에서는 증상을 완화시키고 진행을 지연시키는 방안이 사용되고 있다.

알츠하이머병에 가장 흔하게 사용되는 약물로서 콜린에스테라아제 억제제 및 NMDA 수용체 길항제가 있으며, 병의 진행 단계에 따라 Donepezil(Aricept), Rivastigmine(Exelon), Galantamine(Razadyne), Memantine(Namenda) 등이 사용되고 있다. 그러나 이들은 원인에 대한 치료가 아닌 신경세포의 신호전달을 지원하는 역할을 수행하여 기억 및 인지 장애를 일시적으로 완화시키는 역할을 수행하기 때문에 치매의 완치를 위한 치료제나 치료방법 등이 요구된다(https://www.alz.org/asian/treatment/treatments.asp?nL=KO&dL=KO, Alzheimer's Association).

알츠하이머병은 주로 39~42개의 아미노산 잔기를 갖는 아밀로이드 베타 펩타이드(Aβ peptides)의 섬유상 응집체로 구성된 세포외 신경자극 플라크를 뇌에 형성하는 것을 주요한 특징으로 한다. 형성된 플라크가 신경세포 밖에 축적되어 뇌세포에 회복 불가능한 손상을 일으킴으로써, 시냅스 기능장애 및 신경세포의 사멸을 유발한다. 과생성된 아밀로이드 베타 단량체는 올리고머 및 불용성을 갖는 β-sheet가 풍부한 응집체로 자가조립하는 특징을 가지고 있다. 아밀로이드 베타는 알츠하이머병의 증상이 발현되기 오래전부터 응집되기 시작하는 것으로 알려져 있었기 때문에 아밀로이드 베타 응집체를 제거함으로써 병리학적으로 알츠하이머병을 치료하려는 시도가 계속되어 왔다. 그러나 자가조립된 아밀로이드 베타 펩타이드는 β-strand가 수소결합 및 사이드 체인의 상호작용으로 결합되는 교차 베타 시트 구조(cross-β-sheet)를 가지고 있어 화학적 또는 생물학적 분해에 대해 높은 저항성을 보이기 때문에, 알츠하이머병의 치료를 목적으로 아밀로이드 베타 응집체를 분해하는데 많은 어려움이 있어 치료방법 개발에 어려움을 겪고 있는 실정이다(T. P. J. Knowles, M. Vendruscolo, C. M. Dobson, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2014, 15, 384 및 B. Choi, T. Kim, E. S. Ahn, S. W. Lee, K. Eom, Nanoscale Res. Lett. 2017, 12, 228.).

많은 연구에서, 아밀로이드 응집체가 높은 수준의 금속이온(구리, 아연, 철 등)을 함유하고 있는 것으로 알려져 있으며, 이는 금속이온이 아밀로이드 베타의 응집 및 세포독성에 연관이 있음을 나타낸다(C. C. Curtain, et al., J. Biol. Chem., 2001, 276, 20466?20473, C. D. Syme, et al., J. Biol. Chem., 2004, 279, 18169?18177 및 M. A. Lovell, et al., J. Neurol. Sci., 1998, 158, 47?52.). 금속이온은 아밀로이드 베타의 히스티딘(Histidine)과 같은 홀 쌍 함유 잔기(lone pair-containing residues)에 결합하여 아밀로이드 베타-금속 복합체를 형성하고, 신경생리학적 조건(neurophysiological condition) 아래에서 아밀로이드 베타 응집 동역학을 조절한다(A. S. Pithadia and M. H. Lim, Curr. Opin. Chem. Biol., 2012, 16, 67?73., K. P. Kepp, Coord. Chem. Rev., 2017, 351, 127?159.).

특히, 구리(II)는 다른 금속이온보다 높은 아밀로이드 베타 결합 상수(Aβ-Cu(II) = 10?11?10?7 M [Kd], Aβ-Zn(II) = 10?9?10?6 M [Kd])를 가지기 때문에 아밀로이드-베타 복합체 형성 및 세포독성 메커니즘의 연구에 있어 주목 받는 물질이다. 이러한 특성 때문에, 아밀로이드 베타-구리(II) 복합체는 주된 독성 아밀로이드 베타종인 아밀로이드 베타 올리고머를 생성하고 안정화 시킨다(I. Benilova, E. Karran and B. De Strooper, Nat. Neurosci., 2012, 15, 349.).

또한, 산화 스트레스는 히스티딘뿐만 아니라 아밀로이드 베타의 잔기인 Met의 구리(II)를 포함하는 희소-쌍(lone-pair)을 함유한 황(S)의 단일 전자 공여(single-electron donation)에 의해 촉발된다. 이렇게 생성된 구리(I) 및 아밀로이드 베타 잔기의 양이온 라디칼은 산화 스트레스의 생성을 개시한다. 이러한, 산화-환원 활성 구리(II)(redox-active Cu(II))는 펜톤-타입 반응(Fenton-type reaction)의 산화 스트레스를 촉진하여, 아밀로이드 베타 매개성 세포독성을 증가시킨다(D. A. Butterfield, A. M. Swomley and R. Sultana, Antioxid. Redox Signaling, 2013, 19, 823?835. 및 B. I. Lee, Y. J. Chung and C. B. Park, Biomaterials, 2019, 190?191, 121?132.)

이에, 구리(II)매개 아밀로이드 베타 응집 및 세포독성을 억제하기 위한 많은 연구가 있었다(L. Zhu, et al., J. Phys. Chem. B, 2014, 118, 9298?9305., Q. Zhang, et al., Biomacromolecules, 2016, 17, 661?668., J. Meng, H. Zhang, X. Dong, F. Liu and Y. Sun, J. Inorg. Biochem., 2018, 181, 56?64.). 예를 들어, 아밀로이드 베타-구리(II) 착물에서 구리(II)를 제거하기 위해, 클리오퀴놀(clioquinol, CQ), 에틸렌디아민 테트라 아세트산(EDTA) 또는 펩티드 모방 화합물과 같은 금속 킬레이터(chelator)를 사용했다(Z. Huan, et al., J. Mol. Recognit., 2018, 31, e2697., K. Rajasekhar, C. Madhu and T. Govindaraju, ACS Chem. Neurosci., 2016, 7, 1300?1310.) 그러나, 이러한 킬레이터들은 세포독성 및 생체 부적합적 성질을 가지기 때문에, 치료제로서 적용하는데 한계가 있다.

또한, 몇몇 연구들은 구리(II) 매개성 아밀로이드 베타 응집의 완전한 억제를 위해서는, 구리(II) 킬레이팅 능력뿐아니라 아밀로이드-베타의 자기 응집 억제 등의 부가적 기능의 필요성을 강조하고 있다(Q. Zhang, X. Hu, W. Wang and Z. Yuan, Biomacromolecules, 2016, 17, 661?668.).

한편 탄소 도트(Carbon dot)는 탄소 양자점(CQD) C-dot 등으로 불리우며 크기가 10nm 이하인 탄소기반의 나노 물질이다. 탄소 도트는 2004년 전기영동을 통해 단일 막 탄소 나노 튜브를 정제하는 과정에서 처음 발견 되었다. 탄소 도트는 자연에 풍부한 탄소를 기반으로 생성하며 가격 또한 저렴하여 경쟁력 있는 새로운 나노 물질로 각광 받았다. 탄소 도트의 내인성 탄소 도메인(intrinsic carbon domain) 및 외부표면 매트릭스 그룹(extrinsic surface matrix group)에서 유래하는 탄소 도트의 전기적 밴드는 흥분된 전자의 방출 영역을 제공하여 OPCD가 형광체 역할을 할 수 있게 한다. 이 외에도 탄소 도트는 크기가 매우 작고, 구조적으로 안정적이며, 광전기적 특성 등을 가지기 때문에 다양한 분야에 걸쳐 그 용도가 연구되고 있다.

의료 분야에 있어서도, 탄소 도트를 이용하기 위한 시도가 계속 되어 왔다. 바이오 이미징, 바이오 센서 및 약학 전달 시스템의 운반자로서의 탄소 도트의 이용에 관한 보고가 계속 되어오고 있다(Youfu Wang and Aiguo Hu, Carbon quantum dots: synthesis, properties and applications, J. Mater. Chem. C, 2014, 2, 6921). 그러나 탄소 도트 자체의 치료 효과에 대한 보고는 거의 전무하며, 대부분의 탄소 도트는 UV의 조사에 의한 광촉매 활성을 가져 생체 치료를 위해 광촉매성을 이용하는 데 한계가 있다.

이러한 기술적 배경하에서, 본 발명자들은 구리 매개성 아밀로이드 베타 펩타이드의 응집의 강력한 조절제 및 세포독성 완화제로서, 생체에 적합한 아밀로이드 베타 응집 억제용 탄소 도트 및 이를 포함하는 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 금속이온 킬레이팅 능력, 아밀로이드 베타 자기조립 억제능, 광촉매성 및 생체 적합성을 가지는 다기능성 탄소 도트인 OPCD(pOPD derived Carbon Dots)를 합성하였으며, 상기 탄소 도트의 아밀로이드 베타 응집체 및 구리 복합체의 형성 억제능, 가시광선(청색광)의 조사 시에 아밀로이드 베타의 응집 억제능 및 아밀로이드 베타-구리(II) 복합체의 세포독성 감소능력을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.

본 발명의 목적은 아밀로이드 베타 응집 억제용 다기능성 탄소 도트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 다기능성 탄소 도트를 포함하는 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 금속이온과 킬레이트를 형성하는 질소 함유 방향족 고리가 탄소구조체의 표면에 존재하는 아밀로이드 베타 응집 억제용 다기능성 탄소 도트(Carbon dot)를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 아밀로이드 베타 응집 억제용 다기능성 탄소 도트(Carbon dot)를 포함하는 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 아밀로이드 베타 응집 억제용 다기능성 탄소 도트 또는 이를 포함하는 약학 조성물은, 금속이온의 킬레이팅을 통한 아밀로이드 베타-구리 복합체의 형성 및 아밀로이드 자가 조립 억제를 통해 아밀로이드 베타의 응집을 억제하고, 금속이온, 특히 아밀로이드 베타의 응집과 관련된 구리이온과의 반응을 통해 흡광성이 증가하여, 광 조사 시에 더 높은 활성 산소종의 생성을 야기하고, 상기 활성 산소종이 아밀로이드 베타를 산화시킴으로써, 효과적으로 응집을 억제하고, 응집체를 분해하며 아밀로이드 베타 응집체의 세포독성을 현저히 완화한다. 이러한 아밀로이드 베타 응집억제 및 응집체 분해를 통해 아밀로이드 응집체 형성 및 집적이 관련된 신경퇴행성 질환의 예방 및 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

도 1은 구리(II) 매개 아밀로이드 베타 응집체에 대한 다기능성 카본 도트인 OPCD의 작용을 나타낸 개략도이다.
도 2a는 OPCD의 제조과정을 나타내는 개략도이다.
도 2b는 OPCD의 HRTEM 이미지이다. 화살표가 가리키는 점이 OPCD이며, 스케일 막대는 100nm이다.
도 2c는 OPCD의 UV-vis 흡수 스펙트럼을 나타낸 것이다. 내부 그래프는 OPCD의 광루미네센스 자극(PLE) 및 방출 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 2d는 OPCD의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 2e는 OPCD의 C1s 및 N1s의 XPS 스캔 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 3a는 OPCD의 XPS 분석 스캔 스펙트럼을 나타낸 것이다. C1s는 284.8eV, N1s는 399eV, O1s 는 532.2eV에 피크를 나타낸다.
도 3b는 OPCD의 디콘볼루티드 O1s XPS 스캔 스펙트럼을 나타낸 것이다. C=O는 531.6eV, C-OH/C-O-C는 533eV에서 피크를 나타낸다.
도 4a는 Aβ-구리(II) 복합체에서 구리(II) 농도 증가에 따른 OPCD(50μg/mL)의 UV-vis 티트레이션(titration) 곡선을 나타낸 것이다. 측정은 37℃에서 30분간의 공동 배양 이후에 수행되었다.
도 4b는 순수한 Aβ 또는 Aβ-구리(II) 복합체와 다양한 농도(0, 20, 50 및 100 μg/mL)의 OPCD를 공동 배양한 경우에 oxTMB의 흡수 변화를 나타낸 것이다. 측정은 5분 간격으로 수행되었다.
도 4c는 다양한 농도의 OPCD(0, 20, 50 및 100 μg/mL)와 함께 배양한 무 금속 Aβ 펩타이드의 ThT 형광 강도를 비교한 것이다(λex= 440nm). 통계 분석은 one-way 분석에 의해 수행되었다(ANOVA, n = 3, *** p <0.001).
도 4d는 다양한 농도의 OPCD(0, 20, 50 및 100 μg/mL)와 함께 배양한 무 금속 Aβ 펩타이드의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 것이다. 모든 샘플은 37℃에서 24시간동안 배양되었다.
도 5는 구리(II) 40μM 및 다양한 농도의 EDTA(0, 10, 20, 30 및 40 μM)의 존재 아래에서 OPCD의 흡수 변화를 나타낸 것이다. EDTA의 첨가후, 420nm에서의 OPCD의 흡수량 증가는 EDTA 투여량 의존적으로 억제되었다. 흡수값의 변화는 30분의 배양후에 측정되었다.
도 6은 OPCD(100μg/mL)와 Aβ 펩타이드(40μM)의 제타전위를 OPCD 존재/부존재 아래에서 측정한 결과를 나타낸 것이다(n=3).
도 7a는 OPCD(100μg/mL)의 존재/부존재 아래에서 구리(II) 매개 응집체(Aβ-구리(II) 응집체)의 HRTEM 이미지이다.
도 7b는 OPCD(100μg/mL) 존재(빨강)/부존재(검정) 아래에서 Aβ-구리(II) 응집체의 DLS 크기 본포 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7c는 다양한 농도의 OPCD(0, 20, 50 및 100 μg/mL)를 함유한 Aβ-구리(II) 샘플의 CD 분광 분석 결과를 나타낸 것이다. Aβ-구리(II) 복합체를 제조하기 위해, 40 μM의 Aβ42 단량체를 동일한 몰량의 구리(II)와 공동배양 하였다. 모든 측정은 37℃에서 24시간 배양한 후에 수행되었다.
도 8은 메탈-프리 Aβ 응집체의 HRTEM 이미지이다. Aβ42 단량체(40μM)를 TEM 관찰전에 37℃에서 24시간 배양하였다. 스케일바는 200nm이다.
도 9a는 OPCD의 시간 의존적 구리(II) 복합체 형성에 의해 유도된 550nm에서의 OPCD의 PL 강도 향상을 나타낸 그래프이다(λex= 420nm).
도 9b는 OPCD 흡수 스펙트럼과 청색 LED 방출 스펙트럼의 오버랩을 나타낸 것이다.
도 9c는 청색 LED 광 조사 지속시에 OPCD의 광 안정성을 테스트한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 각 조건(OPCD 또는 구리(II)의 존재/부존재 및 광 조사(L)/비조사(D))에서의 Rh123의 PL값의 정규화된(normalized) 시간 프로파일을 나타낸 것이다. 활성산소(ROS, 예를 들어, 일중항 산소(singlet oxygen))의 존재 아래, ROS 검출기 DHR123 은 Rh123으로 전환되고, 525nm에서 방출이 나타난다(λex= 485nm). 측정은 10분 간격으로 수행되었다.
도 11a는 OPCD와 함께 37℃에서 24시간동안 배양된 Aβ-구리(II) 응집체의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다. 배양 초기 1시간 동안만 광을 조사하였다.
도 11b는 OPCD 존재/부존재 및 광 1시간 조사/비조사 조건에서 AFM 이미지를 나타낸 것이다. 스케일 막대는 1μm이다.
도 11c는 OPCD 존재/부존재 및 광 1시간 조사/비조사 조건에서 CD 스펙트럼을 나타낸 것이다. 모든 샘플에서 OPCD의 농도는 50μg/mL이었으며, 광 조사에는 청색 LED가 사용되었다.
도 12a는 광 비조사 조건에서 OPCD 존재(50μg/mL)/부존재 하에 배양된 Aβ-구리(II) 복합체의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 12b는 다양한 광 조사 시간(15, 30 및 60분)에서 OPCD(50μg/mL)에 의해 처리된 각 Aβ-구리(II) 샘플의 상대적 MALDI-TOF 피크 강도를 나타낸 것이다. 모든 Aβ-구리(II) 샘플은 37℃에서 24시간동안 배양 되었다.
도 13a는 0 내지 100μg/mL 범위의 다양한 OPCD 농도에서의 세포 생존능 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 13b는 1시간동안의 광 조사/비조사 조건에서 OPCD의 Aβ-구리(II) 세포독성에 대한 완화 효과를 나타낸 것이다. Aβ와 구리(II)는 동일한 몰비(각 40μM)를 사용하여 Aβ-구리(II) 복합체를 제조하였다. 통계 분석은 일원 분산분석을 통해 수행되었다 (ANOVA, n = 3, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, n.s.: 유의하지 않음).

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

많은 연구에서 알려진 바와 같이, 구리(II)와 같은 금속이온이 아밀로이드 베타 응집체의 안정성 및 복합체 형성에 중요한 역할을 하고, 아밀로이드 베타 펩타이드의 세포독성을 현저히 증가시키는 것과 관련하여, 본 출원의 발명자들은 아밀로이드 베타 펩타이드간의 응집 억제를 통한 질병 예방에 그치지 않고 금속이온 매개성 아밀로이드 베타의 응집 억제 및 응집체 분해를 통한 신경 퇴행성 질병의 예방 및 치료용 약학 조성물을 개발하고자 노력하였다.

본 출원의 발명자들은 다기능성 탄소 도트인 OPCD를 제작 하였으며, 상기 OPCD의 구조 중에서, 질소를 함유하는 방향족 고리를 가지는 표면이 구리(II)를 킬레이팅하고 아밀로이드 베타와의 다양한 상호작용을 통해 자기조립을 방해하여 아밀로이드 베타의 응집을 억제한다는 것을 확인했다. 더욱이, 금속이온, 특히 아밀로이드 베타의 응집과 관련된 구리이온과의 반응을 통해 흡광성이 증가하여, 가시광선 영역의 광 조사 시에 보다 효과적으로 활성 산소종을 생성하고, 생성된 활성 산소종이 아밀로이드 베타 펩타이드를 산화시킴으로써, 응집을 억제하고 응집체를 분해하여 세포독성을 완화시키고 생존률을 현저히 증가시킨다는 것을 확인하였다.

이에 근거하여, 본 발명은 광 조사 없이도 아밀로이드 베타-구리(II) 복합체의 형성을 억제할 수 있으며, 광 조사 시에는 활성 산소종의 생성을 통해 구리(II) 매개성 아밀로이드 베타의 응집을 억제하고 구리와 반응하여 흡광성이 증가되는 특성에 따라, 아밀로이드 베타-구리 복합체 밀집 지역에서 활성 산소종을 더욱 활발히 생성함으로써, 아밀로이드 베타의 집적이 관련된 신경퇴행성 질환을 예방하고 치료할 수 있는 데에 그 특징이 있다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 금속이온과 킬레이트(chelate)를 형성하는 질소 함유 방향족 고리가 탄소 구조체의 표면에 존재하는 탄소 도트(Carbon dot)에 관한 것이다.

본 발명의 용어 “킬레이트(chelate)”는 한 개의 리간드가 금속이온과 두 자리 이상에서 배위결합을 하여 생긴 착이온을 뜻한다.

본 발명의 용어 “탄소 구조체”는 탄소 도트에서 탄소의 동소체가 밀집되어 형성된 2차원 또는 3차원 중심부를 의미한다. 본 발명에서, 탄소 구조체는 구형 또는 디스크 중첩형 일 수 있으며, 그래핀(graphene)등으로 구성될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 “탄소 도트(carbon dot)”는 중심부의 탄소 구조체와 다양한 특성의 표면 패시베이션(surface passivation)을 갖는 형광성 나노 입자를 의미한다. 탄소 도트는 순수한 탄소 및 질소를 포함하는 관능기로 이루어 질 수 있으며, 일반적으로 탄소 도트는 카본 나노도트(carbon nanodots 또는 carbon quantum dots, CND 또는 CQD), 그래핀 퀀텀도트(graphene quantum dots, GQD) 및 폴리머 도트(polymer dots, PD) 등으로 구분된다. 탄소 도트는 다이아몬드형 나노구조인 나노 다이아몬드와 흑연(graphite)형 나노구조인 그래핀, 나노튜브, 풀러렌과 구별되는 완전히 새로운 종류의 물질이다. 기존의 대부분의 양자점이 유독한 중금속 재료를 이용할 뿐만 아니라 공기 중 의 산소와 수분에 취약하여 이용에 많은 제약이 따른다. 이에 반해, 탄소 점은 생체적합성과 안정성을 가지고 있어 기존 양자점의 단점을 보완할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 탄소 도트는 금속이온과 킬레이트(chelate)를 형성하는 질소 함유 방향족 고리가 탄소 구조체의 표면에 존재하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에서, 벤젠을 2개의 아민기로 ortho- 치환한 o-페닐렌다이아민을 중합 및 열수처리(탄화)하여 OPCD를 제작하였으며, 또 다른 실시예에서, 제작한 OPCD의 물리화학적 특성을 분석하였다. FDA-IR (Fourier Transform Infrared) 및 XPS (X-ray Photoelectron Spectroscopy)를 통해 분석한 결과 OPCD는 질소를 함유하는 폴리 방향족 관능기를 포함하고 있는 것으로 나타났으며 구체적으로, 페나자인 골격 또는 페나자인 유사 골격을 가지고 있는 것으로 나타났다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 금속이온과 킬레이트(chelate)를 형성하는 질소 함유 방향족 고리가 탄소 구조체의 표면에 존재하는 탄소 도트는 페나자인(phenazine) 또는 페나자인 유사 골격을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 용어 “페나자인(phenazine)”은 아래의 그림 1과 같다.

그림 1. 페나자인 골격(phenazine backbone)

본 발명의 용어 “페나자인 유사 골격”은 상기 그림 1의 페나자인 골격에서 N이 고리 구조를 형성하지 않고, 고립되어 아민기(amine) 또는 이민기(imine)를 형성한 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 금속이온과 킬레이트(chelate)를 형성하는 질소 함유 방향족 고리가 탄소 구조체의 표면에 존재하는 탄소 도트는 아민기 또는 이민기로 치환된 방향족 고리를 중합 및 탄화하여 형성되는 것으로 할 수 있으며, 바람직하게는 상기 아민기 또는 이민기로 치환된 방향족 고리는 o-페닐렌다이아민(ortho-phenylenediamine, OPD), p-페닐렌다이아민(para-phenylenediamine), m-페닐렌다이아민(meta-phenylenediamine), 2,3-디아미노페나자인(2,3-diaminophenazine) 및 2,3-디아미노나프탈렌(2,3-diaminonaphthalene)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 o-페닐렌다이아민(ortho-phenylenediamine, OPD)을 중합 및 탄화하여 형성되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 용어, “탄화”는 유기 물질을 탄소 물질로 전환하는 것을 의미하며 탄소화라고도 한다. 구체적으로 상기 탄화는 통상의 기술자에 의해 탄소 도트를 형성한다고 이해되는 방법이라면, 모두 이에 포함되며, ‘Bottom up’또는‘Top-down’방법을 포함할 수 있다(Youfu Wang and Aiguo Hu, J.Mater. Chem. C, 2014. 2, 6921.). 구체적으로는 전기화학적 탄화(Electrochemical carbonization), 마이크로웨이브 조사(Microwave irradiation), 레이저 어블레이션(Laser ablation) 및 열수(hydrothermal) 또는 용매열(solvothermal) 처리 등을 이용하여 탄화할 수 있으며, 바람직하게는 열수처리를 이용하여 탄화하는 것일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 황산암모늄(APS)을 처리하여 o-페닐렌다이아민을 중합하고, 중합된 폴리-o-페닐렌다이아민을 열수 처리하여 탄화하여 형성되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 상기 탄화는 중합된 폴리-o-페닐렌다이아민을 오토클레이브에 밀봉한 뒤 전기로에서 140 내지 250℃에서 2 내지 6 시간 열수 처리하는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 200℃에서 2시간 열수처리 하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 중합은 동일한 아민기 또는 이민기로 치환된 방향족 고리를 중합하는 것일 수 있으며, 아민기 또는 이민기를 가진 방향족 화합물이라면 서로 다른 것(hetero)을 중합할 수 있다. 예를 들어, 상기 아민기 또는 이민기를 가진 방향족 화합물은 o-페닐렌다이아민, p-페닐렌다이아민, m-페닐렌다이아민, 2,3-디아미노페나자인(2,3-diaminophenazine) 및 2,3-디아미노나프탈렌(2,3-diaminonaphthalene) 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 “아밀로이드 베타”는 아밀로이드 전구체 단백질(amyloid precursor protein, APP)로부터 이를 분해하는 단백질 분해효소인 베타-시크리타아제, 및 감마-시크리타아제에 의한 대사에 의해 비정상적으로 분리(abnormal cleavage)된 산물로서, 알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD)에서 중요한 병원성 물질(pathogenetic material)로 생각되고 있다. “아밀로이드 베타”는 “베타 아밀로이드”, “아밀로이드 베타 펩타이드”, “Aβ” 등의 용어와 호환적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 용어 “응집 억제”는 아밀로이드 베타의 금속 매개성 또는 금속 비매개성 응집(예, 자가조립)을 포함하는 모든 종류의 아밀로이드 베타 응집을 억제 또는 저해 하는 것을 의미하며, 응집을 통해 이미 형성된‘응집체(또는 복합체)의 분해’또한 ‘응집 억제’ 작용에 포함되어 이해될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 제작한 OPCD의 표면이 구리(II)와 같은 양이온성 금속이온에 대해 높은 친화력을 갖는 친핵성 아민기 및 이민기를 갖는 것을 확인 했으며, UV-vis 적정법을 이용하여, OPCD가 구리(II)를 킬레이팅할수 있음을 확인하였다.

본 발명의 다른 실시예에서, 이러한 OPCD의 구리(II) 킬레이팅 능력으로 인해 아밀로이드 베타-구리(II) 복합체의 과산화효소 유사활성을 감소시키고, 아밀로이드 베타-구리(II) 복합체 유래의 산화 스트레스를 방해함을 확인하였다.

따라서, 본 발명에 있어서, 상기 금속이온은 구리(II)인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 구리(II)가 없을 때에도 OPCD에 의해 아밀로이드 베타의 자기 조립을 억제할 수 있음을 확인하였다. 제타 전위 결과 OPCD의 표면에 양성자화 된 아민기 또는 이민기에 기인한 양전하가 관찰되었으며, 아밀로이드 베타와 동시에 반응 하였을 때, 아밀로이드 베타의 전위가 양의 값으로 이동하였다. 이는 OPCD와 아밀로이드 베타 펩타이드 사이의 정전기적 상호작용을 의미한다.

따라서 본 발명에 있어서, 상기 금속이온과 킬레이트(chelate)를 형성하는 질소 함유 방향족 고리가 탄소 구조체의 표면에 존재하는 탄소 도트는 베타 펩타이드와 수소 결합, 소수성 상호작용 및 정전기적 상호작용으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 상호작용을 통해 아밀로이드 베타 펩타이드의 응집을 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 용어 “정전기적 상호작용”은 각 분자가 가지는 전기적 특성으로 인해 생기는 분자간의 전기적 인력 또는 척력 등의 상호작용을 의미한다.

바람직하게는, 상기 금속이온과 킬레이트(chelate)를 형성하는 질소 함유 방향족 고리가 탄소 구조체의 표면에 존재하는 탄소 도트는 방향족 관능기가 아밀로이드 베타 펩타이드의 베타-sheet에 소수성 상호작용을 통해 인터칼레이션(intercalation) 하여 집적(stacking)을 억제 할수 있으며, 양전하를 띄는 아민기 및 이민기는 음전하를 갖는 아밀로이드 베타의 잔기와 정전기적 상호작용을 통해 구조적으로 응집을 억제하는 것을 특징으로 할 수 있고, 더욱 바람직하게는 상기 정전기적 상호작용은 수소결합일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서, 제작한 OPCD가 350nm 내지 500nm 사이의 청색광을 잘 흡수한다는 것을 확인 하였으며, 청생광 조사 아래에서 구리(II)의 농도 및 광 조사 시간에 따른 ROS 생성능을 확인하였다.

또한, 본 발명의 다른 실시예에서, MALDI ? TOF 질량 분광 분석을 통해, 생성된 ROS에 의해 아밀로이드 베타의 잔기가 산화되는 것을 확인 하였으며, AFM을 통한 형태학적 관찰에서도 아밀로이드 베타-구리(II) 응집이 억제되는 것을 확인 하였다. 특히, 아밀로이드 베타의 잔기 중 구리(II)와 상호 작용하는 His13 및 His14의 산화는 His-구리(II) 결합을 절단하여 아밀로이드 베타-구리(II) 복합체의 형성을 방해하고, Met35의 산화는 아밀로이드 베타 펩타이드의 소수성 특성을 약화시켜 β-시트를 불안정하게 만드는 것으로 판단된다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, OPCD의 무독성을 확인 하여 생체 적합성 제제로서의 적용가능성을 확인했으며, OPCD 처리시에 아밀로이드 베타-구리(II) 조건하의 세포 생존률이 50%(OPCD 미처리)에서 96%로 현저히 증가하는 것을 확인 하였다.

따라서, 본 발명에 있어서, 상기 금속이온과 킬레이트(chelate)를 형성하는 질소 함유 방향족 고리가 탄소 구조체의 표면에 존재하는 탄소 도트는 광 조사시에 금속이온과 반응하여 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)을 생성하여 아밀로이드 베타의 응집 억제 또는 응집체를 분해하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 350nm 내지 500nm의 광을 조사하여 활성 산소종을 생성하는 것을 특징으로 할 수 있다. 더욱 바람직하게는 380 내지 480nm의 광을 조사하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에 있어서, 아밀로이드 베타의 응집억제 이외에도 응집체 분해 효과를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, 광의 조사 시간 또는 아밀로이드 베타 내 금속 이온, 바람직하게는 구리 이온의 양에 따라 활성 산소종의 생성 및 아밀로이드 베타의 산화가 조절되는 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는, 광 조사시간이 증가할수록 활성 산소종의 생성, 아밀로이드 베타의 산화 및 아밀로이드 베타의 응집 저해 효과가 증가되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 광 조사 시에 활성 산소종의 생성을 통해 구리(II) 매개성 아밀로이드 베타의 응집을 억제하고 구리와 반응하여 흡광성이 증가되는 특성에 따라, 구리 이온의 농도 증가에 따라 활성 산소종을 더욱 활발히 생성함을 확인하였다.

따라서, 본 발명에 있어서, 아밀로이드 베타의 구리 농도에 비례하여 흡광도 및 광 조사에 따른 활성 산소종의 생산이 증가되는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 금속이온과 반응은 구리(II)와 반응하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 용어 “활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)”은 산소원자를 포함한 화학적으로 반응성 있는 분자로서, 일반적인 산소(안정한 상태)보다 활성이 크고 불안정하며 높은 에너지를 갖고 있는 산소를 말한다. 분자들은 산소 이온 또는 과산화수소를 포함하고 있으며, 짝지어지지 않은 전자 때문에 반응성이 매우 높다. 활성 산소종은 다른 물질의 산화를 효과적으로 유도한다. 활성 산소종은 산소의 정상적인 대사 작용에 의해서 자연스럽게 생성되기도 하나 물의 산화-환원을 통해 생성할 수도 있다. 본 발명에서 “활성 산소종”은 “활성 산소” 또는 “활성 라디칼” 등과 호환적으로 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 활성 산소종은 아밀로이드 베타의 잔기를 산화하여 아밀로이드 베타의 응집을 억제 또는 응집체를 분해하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 산화되는 아밀로이드 베타의 잔기는 티로신(Tyrosine), 히스티딘(Histidine), 및 메티오닌(Methionine)일 수 있고, 예를 들어 서열번호 1의 Met 35, His13 및 His14일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

아밀로이드 베타 펩타이드는 섬유상 응집체로 구성된 세포외 신경자극 플라크를 뇌에 형성하는 것을 주요한 특징으로 한다. 형성된 플라크가 신경세포 밖에 축적되어 뇌세포에 회복 불가능한 손상을 일으킴으로써, 시냅스 기능장애 및 신경세포의 사멸을 유발한다. 아밀로이드 베타는 증상이 발현되기 오래전부터 응집되기 시작하는 것으로 알려져 있었기 때문에 아밀로이드 베타 응집체를 제거함으로써 병리학적으로 신경퇴행성 질환을 치료하려는 시도가 계속되어 왔다. 또한 많은 연구에서, 금속이온이 아밀로이드 베타의 응집 및 세포독성에 연관이 있음이 알려져 있다(C. C. Curtain, et al., J. Biol. Chem., 2001, 276, 20466?20473, C. D. Syme, et al., J. Biol. Chem., 2004, 279, 18169?18177 및 M. A. Lovell, et al., J. Neurol. Sci., 1998, 158, 47?52.).

이와 같이, 아밀로이드 베타의 응집체 형성이 신경퇴행성 질환에 직접적인 영향을 미치는 것은 자명한 사실이며, 이러한 응집체의 형성을 억제하고 생성된 응집체를 분해함으로써, 신경퇴행성 질환의 예방, 증상의 완화 및 치료가 가능 하다.

따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 금속이온과 킬레이트(chelate)를 형성하는 질소 함유 방향족 고리가 탄소 구조체의 표면에 존재하는 탄소 도트(Carbon dot)를 포함하는 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서 상기 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물의 탄소 도트는 금속이온과 킬레이트(chelate)를 형성하는 질소 함유 방향족 고리가 탄소 구조체의 표면에 존재하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물의 탄소 도트는 금속이온과 킬레이트(chelate)를 형성하는 질소 함유 방향족 고리가 탄소 구조체의 표면에 존재하는 탄소 도트는 페나자인(phenazine) 또는 페나자인 유사 골격을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 바람직하게는 열수처리를 이용하여 탄화하는 것일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 황산암모늄(APS)을 처리하여 o-페닐렌다이아민을 중합하고, 중합된 폴리-o-페닐렌다이아민을 열수 처리하여 탄화하여 형성되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 상기 탄화는 중합된 폴리-o-페닐렌다이아민을 오토클레이브에 밀봉한 뒤 전기로에서 140 내지 250℃에서 2 내지 6 시간 열수 처리하는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 200℃에서 2시간 열수처리 하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

따라서 본 발명에 있어서, 상기 금속이온과 킬레이트(chelate)를 형성하는 질소 함유 방향족 고리가 탄소 구조체의 표면에 존재하는 탄소 도트를 포함하는 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 베타 펩타이드와 수소 결합, 소수성 상호작용 및 정전기적 상호작용으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 상호작용을 통해 아밀로이드 베타 펩타이드의 응집을 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다.

바람직하게는, 상기 금속이온과 킬레이트(chelate)를 형성하는 질소 함유 방향족 고리가 탄소 구조체의 표면에 존재하는 탄소 도트를 포함하는 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 방향족 관능기가 아밀로이드 베타 펩타이드의 베타-sheet에 소수성 상호작용을 통해 인터칼레이션(intercalation) 하여 집적(stacking)을 억제 할수 있으며, 양전하를 띄는 아민기 및 이민기는 음전하를 갖는 아밀로이드 베타의 잔기와 정전기적 상호작용을 통해 구조적으로 응집을 억제하는 것을 특징으로 할 수 있고, 더욱 바람직하게는 상기 정전기적 상호작용은 수소결합일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

따라서, 본 발명에 있어서, 상기 금속이온과 킬레이트(chelate)를 형성하는 질소 함유 방향족 고리가 탄소 구조체의 표면에 존재하는 탄소 도트를 포함하는 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 광 조사시에 금속이온과 반응하여 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)을 생성하여 아밀로이드 베타의 응집 억제 또는 응집체를 분해하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 350nm 내지 500nm의 광을 조사하여 활성 산소종을 생성하는 것을 특징으로 할 수 있다. 더욱 바람직하게는 380 내지 480nm의 광을 조사하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌졸중 및 헌팅턴병으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 용어 “신경퇴행성 질환(neurodegenerative disease)”이란 중추신경계의 뇌와 척수 세포가 퇴화 또는 소실 등의 이유로 인해 표현적인 기능장애로 나타나는 질환을 의미한다. 바람직하게는 본 발명에서의 상기 퇴행성 뇌신경질환은 아밀로이드 베타-유도 산화 스트레스에 의한 뇌신경 세포 손상이 유발되는 질환을 말하며, 아밀로이드 베타의 응집 및 집적 등을 주된 원인으로 하는 모든 신경퇴행성 질환을 포함할 수 있다. 구체적으로는 알츠하이머병, 뇌졸중, 파킨슨병(Parkinson's disease), 또는 헌팅턴병일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 용어, "예방"이란, 본 발명에 따른 탄소도트를 포함하는 약학적 조성물을 신경퇴행성 질환 의심 개체에 투여하여 퇴행성 뇌질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.

본 발명의 용어, "치료"란, 본 발명의 상기 조성물을 퇴행성 뇌질환 발병 개체에 투여하여 상기 질환의 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "개체"란, 신경퇴행성 질환이 발병되었거나 발병할 가능성이 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미할 수 있다. 상기 동물은 인간뿐만 아니라 이와 유사한 증상의 치료를 필요로 하는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 아밀로이드 베타 응집 억제용 탄소 도트 또는 신경 퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 아밀로이드 베타의 응집 억제 또는 응집체 분해방법에 관한 것이다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 아밀로이드 베타 응집 억제용 탄소 도트 또는 신경 퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 신경퇴행성 질환의 치료방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 신경 퇴행성 질환의 치료방법은 광을 조사하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 광 조사 시간 또는 금속이온 농도의 증가에 비례하여 활성 산소종의 생성이 증가하여 아밀로이드 베타의 산화 정도가 증가하고 응집체 분해 및 응집 억제 효과가 증가하는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명에 있어서, 광의 조사 시간 또는 금속이온 농도 조절을 통해 활성 산소종의 생성 및 아밀로이드 베타의 산화를 조절하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 포함된 금속이온과 킬레이트(chelate)를 형성하는 질소 함유 방향족 고리가 탄소 구조체의 표면에 존재하는 탄소도트를 통하여, 상술한 아밀로이드 베타의 산화, 응집 억제, 응집체 분해 및 독성 감소 효과를 나타내며, 이를 통해 신경퇴행성 질환, 바람직하게는, 아밀로이드 베타의 응집 및 집적 등을 주된 원인으로 하는 신경퇴행성에 대한 예방 또는 치료효과를 나타낸다.

본 발명의 약학적 조성물은 단일제제로도 사용할 수 있고, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료 효과를 가진다고 알려진 약물을 추가로 포함하여 복합제제로 제조하여 사용할 수 있으며, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "약제학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않으면서, 주입되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미할 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다. 상기 담체는 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다. 또한, 필요한 경우 항산화제, 완충액 및/또는 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여 사용할 수 있으며, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제 등으로 제제화하여 사용할 수 있다.

상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 적합한 제형으로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 당의정, 경질 또는 연질의 캡슐제, 용액제, 현탁제 또는 유화액제, 주사제, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 불활성인 유기 또는 무기 담체를 이용하여 적합한 제형으로 제조할 수 있다. 즉, 제형이 정제, 코팅된 정제, 당의정 및 경질 캡슐제인 경우 락토스, 수크로스, 전분 또는 그 유도체, 탈크, 칼슘 카보네이트, 젤라틴, 스테아르산 또는 그 염을 포함할 수 있다. 또한, 제형이 연질 캡슐제인 경우에는 식물성 오일, 왁스, 지방, 반고체 및 액체의 폴리올을 포함할 수 있다. 또한, 제형이 용액 또는 시럽 형태인 경우, 물, 폴리올, 글리세롤, 및 식물성 오일 등을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 상기의 담체 외에도 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 용해제, 감미제, 착색제, 삼투압 조절제, 산화방지제 등을 더 포함할 수 있다.

발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 특히, 나노 LED와 같은 광원과 함께 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 방식은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방식에 따를 수 있다. 투여의 방식은, 예를 들면, 피하, 정맥, 근육 또는 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.

본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 폴리 o-페닐렌다이아민 유래 탄소 도트(pOPD-derived Carbon Dots, OPCD)의 제작 및 특성 분석

실시예 1-1: OPCD의 제작

탈 이온수(Deionized Water, DW)에 o-페닐렌다이아민을 300mg/mL의 농도로 용해시킨 뒤 황산 암모늄(ammonium persulfate)을 최종농도 5mM이 되도록 첨가하였다. 그 뒤 스틸 오토클레이브(steel autoclave)에 밀봉한 뒤 전기로(muffle furnace, Thermo Fisher Scientific Co., USA)에 넣고 200℃에서 2시간동안 열수 처리(hydrothermal treatment)하였다. 열수처리한 용액을 냉각시킨 후, 10000rpm에서 15분간 원심 분리하여 큰 입자를 제거하고 상등액을 Biotech CE 투석 튜빙(500-1000 Da MWCO)으로 옮겼다. 투석 2일 후 용액을 200μm 필터 막을 통해 여과한 후, 동결 건조하여 OPCD 분말을 제조하였다(도 2a).

실시예 1-2: OPCD의 물리화학적 특성 분석

제작된 OPCD를 Tecnai G2-F30(FEI Company, USA)을 300kV에서 사용하여 투과 전자 현미경(TEM) 관찰을 수행하였다. V-650 분광광도계(spectrophotometer, Jasco Inc., Japan) 및 RF-5301PC 분광형광광도계(RF-5301PC spectrofluorophotometer, Shimadzu Inc., Japan)를 사용하여 UV-vis 흡수 및 광 발광 스펙트럼을 기록하였다. OPCD의 표면 관능기 및 화학 조성은 Nicolet iS50 푸리에 변환 적외선분광광도계(FT-IR, Thermo Fisher Scientific, USA)와 시그마 프로브 X선 광전자 분광계(XPS, Thermo VG Scientific Inc., UK)를 사용하여 분석되었다.

투과 전자 현미경(TEM) 관찰 결과, OPCD는 약 7.3nm 직경의 구형 입자로 관측 되었다(도 2b). UV-vis 및 PL 분광기를 사용하여 OPCD의 광학적 특성을 조사한 결과 OPCD의 UV-Vis 스펙트럼은 200-270 및 420nm 에서 다량의 흡수 밴드를 나타냈으며, 이는 방향족 sp2에서 컨쥬게이티드 탄소 도메인 및 N- 그룹의 π → π * 및 n → π * 전이를 의미한다(도 2c).

PL 방출 또한 550nm에서 가장 강하게 나타나고 420nm 근처에서 들뜨는(excitation) 것으로 나타났으며, 이는 n → π * 전이에서 기인 한 방출을 나타내는 것이다.

OPCD의 FT-IR 스펙트럼은 약 2750-3500 cm^-1에서 밴드(N-H 및 C-H 신축 진동)를 보였고 1100 및 1620cm^-1에서 피크(각각 C-O 및 C=O 신축 진동)를 보였다. 상기 결과는 OPCD가 가진 질소 및 산소 함유 관능기(functional group)를 나타내는 것이다. 1400 cm^-1에서 나타나는 강한 피크가 C-C/C-N 페나자인 고리를 의미하며, 760 및 610 cm^-1에서의 피크는 OPCD 표면에 존재하는 폴리 방향족 구조의 존재를 뒷받침하는 페나자인 고리의 C-H "평면을 벗어난(out of plane)" 진동과 관련이 있다(도 2d).

XPS 분석은 284.8, 399 및 532.2 eV에서 각각 C1s, N1s 및 O1s에서 기인하는 세 개의 피크를 나타낸다(도 3). XPS 결과에서 C1s 스펙트럼은 C-C(284eV) 및 C-N(286eV)의 존재를 증명하고 N1s 스펙트럼은 -NH₂, C-NH-C 및 C-N=C 구조를 나타내는 400, 401, 398 eV에서 밴드를 나타낸다(도 2e). 상기 결과는 OPD에서 유래한 페나자인(phenazine) 골격이 OPCD의 표면에 존재하는 것을 증명한다. O1s 스펙트럼은 C=O(531.6 eV) 및 C-OH/C-O-C(533.0 eV)의 두 밴드를 나타내며, 이는 산소 함유 관능기의 형성을 나타내고 OPCD가 높은 극성 및 수용성을 가지는 것을 의미한다(도 3b).

실시예 2: 아밀로이드 베타-구리(II) 복합체에 대한 OPCD의 구리(II) 킬레이팅 능력 확인

실시예 2-1: 아밀로이드 베타 단량체 및 아밀로이드 베타-구리(II) 복합체 제조

인간 유래의 아밀로이드 베타(Aβ₄₂) 1mg을 실온에서 밤새 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올(HFIP)에 용해시켰다. 그 뒤, 상기 용액을 1.5mL 단백질 Lobin 튜브에 16 분액으로 나누고 Aβ_42-가 동결건조(lyophilized) 될 때까지 진공 데시케이터(Vacuum desiccator)에 넣어두었다. 추가적인 사용을 위해, 건조된

Aβ_42-필름을 -20℃에서 보관했다.

아밀로이드 베타 단량체 샘플은 신선한 Aβ₄₂를 CH₃CN(300 μM), Na₂CO₃(300 μM) 및 NaOH(250 mM)가 포함된 혼합물 30μL에 용해하고 30분간 소니케이션 한 뒤, 최종농도가 40μM이 되도록 NaCl(8.5 mM), Na₂CO₃(14 μM), NaOH(850 μM) 및 CH₃CN(6% v/v)을 포함하는 인산염 완충액(8.5mM, pH7.4)에 희석하여 제조하였다. 아밀로이드 베타-구리(II) 복합체는 다양한 농도의 CuCl-₂를 Aβ₄₂단량체 용액에 즉시 첨가하여 제조하였다.

실시예 2-2: UV-vis 적정법을 이용한 OPCD 킬레이팅 능력 확인

50μg/mL의 OPCD 용액을 순수한 아밀로이드 베타(40μM) 또는 다양한 구리(II) 농도에서 제조된 Aβ₄₂-구리(II) 복합체(Aβ₄₂:Cu(II) = 40:10, 40:20, 40:30, 40:40, 40:50 및 40:60 μM)에 첨가한 후 37℃에서 30분간 공동배양 하였다. 상기 혼합물의 흡광도 변화를 V-650 분광광도계(Jasco Inc., Japan)를 사용하여 분석하였다.

대조군으로서, EDTA의 존재 아래 OPCD의 흡수율 변화를 관측하기 위해, 10, 20, 30 및 40μM의 EDTA를 배양 전에 첨가하고 37℃에서 30분간 공동배양한 뒤 동일한 방법으로 OPCD의 흡수율을 측정하였다.

분석 결과, 420nm에서 OPCD의 흡수는 Aβ-구리(II) 복합체에서 구리(II)의 농도가 증가함에 따라 증가하였고, 이는 OPCD가 구리(II)를 킬레이팅 하였음을 의미한다(도 4a). OPD 유래의 방향족 아민기 및 이민기는 구리(II)와 배위 결합을 하는 경우, 흡수가 강화되는 것으로 알려져 있다. 이러한 결과를 뒷받침 하여, 경쟁적 킬레이터(chelator)인 EDTA를 첨가하면 OPCD의 흡수 증가 정도가 점차적으로 감소하였다(도 5). 상기 결과는 OPCD가 구리를 킬레이팅함으로써, OPCD의 흡수 증진이 발생함을 나타낸다.

실시예 2-3: Aβ-구리(II) 복합체의 조성 분석 및 OPCD의 Aβ 유도성 산화 스트레스 억제능력 확인

동일한 몰비(각 40μM)의 구리(II)와 Aβ를 배양하여 복합체를 만들고, 유도결합 플라즈마-질량 분광법(ICP-MS)을 사용하여 분석한 결과 Aβ-구리(II) 복합체에 결합된 구리(II)의 양은 32.6 ± 3.4 μM이었다.

구리(II)가 결합된 Aβ는 과산화수소에 퍼옥시다아제(peroxidase) 유사 활성을 나타내며, 하이드록실 라디칼(OH^*)을 생성한다. 이러한 하이드록실 라디칼이 신경세포에 산화적 손상을 유도한다.

이를 확인하기 위해, OPCD 존재/부존재 하에 배양된 Aβ 및 Aβ-구리(II) 샘플 각 100μL를 H-₂O₂(10mM) 및 TMB(500μM)를 함유하는 아세트산 나트륨 버퍼(sodium acetate buffer, 900μL, 0.1M, pH4.5)와 혼합하였다. 각 용액들의 652nm에서의 흡수증가가 V-650 분광 광도계(Jasco Inc., Japan)의 고정 파장 모드를 이용하여 4분 간격으로 측정되었다.

Aβ-구리(II) 복합체는 652nm에서 흡수가 현저히 증가하여 퍼옥시다아제 유사 활성을 가지는 것으로 나타났으며, 순수한 Aβ에 비해 산화 스트레스를 높게 유발할 것으로 나타났다. 대조적으로 OPCD의 농도가 증가할수록 652nm에서 Aβ-구리(II) 복합체의 흡수가 감소하는 것으로 나타났다(그림 4b). 상기 결과는, OPCD가 구리(II)를 킬레이팅하여 Aβ-구리(II) 복합체로부터의 구리(II)를 고갈시켜 Aβ-구리(II) 복합체가 유도하는 산화스트레스를 방해하는 것을 의미한다.

실시예 3: OPCD의 금속-무의존성 Aβ 자기조립 억제효과 확인

실시예 3-1: ThT 분석을 이용한 OPCD의 금속-무의존성 Aβ 자기조립 억제효과 확인

Aβ 펩타이드는 구리(II)의 고갈 이후에도 응집될 가능성이 높기 때문에 Aβ 자기조립을 조절하는 보조기능이 있는 것이 바람직하다. 따라서, 제작한 OPCD의 금속-무의존성 Aβ 자기조립 억제효과를 확인하기 위해 티오플라빈 T(ThT) 분석법을 시행하였다.

각각의 Aβ 샘플을 OPCD 존재/부존재 아래에서 배양하고 ThT 용액(20μM)을 최종농도 4%(v/v)가 되도록 첨가하였다. 상기 혼합 용액의 형광성(fluorescence)은 RF-5301PC 분광 형광 광도계(Shimadzu Inc., Japan)를 이용하여 440nm의 자극 파장 아래 측정 되었고 485nm에서의 방출 값을 측정하여 추가분석 하였다.

Aβ 응집체는 강한 ThT 형광을 나타내지만, OPCD가 존재하는 경우 Aβ의 ThT 형광강도는 감소한다(도 4c). 상기 결과는 무 금속 조건에서 OPCD가 Aβ의 응집체 형성을 억제하는 것을 나타낸다.

실시예 3-2: FT-IR을 통한 Aβ ₄₂ 의 화학적 구조 분석

푸리에 변환 적외선 분광법(FT-IR)을 통해 OPCD 존재/부존재 하에서 Aβ₄₂의 화학적 구조를 분석하였다. FT-IR 분광계 (Thermo Fisher Scientific., USA)의 감쇄 전반사 모드를 이용하여 분석하였다. 각 Aβ샘플(2μL)을 분광계의 다이아몬드 표면에 떨어뜨린 후 수 분간 건조하였다. 그 후 FT-IR 스펙트럼을 400-4000cm^-1의 범위에서 측정하였다.

FT-IR 스펙트럼에서, Aβ종의 β-sheet 함량 감소에서 OPCD의 응집억제 활성을 뒷받침한다(도 4d). Aβ응집체는 분자간 β-sheet 구조를 나타내는 1630cm^-1에서 현저한 아마이드 I 밴드를 나타내지만, 이러한 밴드는 OPCD를 첨가함에 따라 점차적으로 감소 하였다. 발표된 문헌들을 토대로 이를 분석할 때, OPCD 표면의 다양한 질소 또는 산소 함유 관능기가 아밀로이드 베타 백본과의 수소 결합에 참여하여 Aβ의 피브릴레이션(fibrillation)을 억제하고, 방향족 그룹이 소수성 상호작용을 통해 Aβ 펩타이드의 β-sheet 스태킹(stacking) 부위에 쉽게 인터칼레이션(intercalation)되어 응집을 억제하는 것으로 예상된다.

실시예 3-3: 제타전위 분석

제타 전위 분석을 위해 샘플(100μg/mL의 OPCD 또는 300μL 솔루션에 희석된 40μM Aβ 펩타이드)를 1mL로 희석하였으며, DTS1070 일회용 세포로 옮겼다. 측정은 총 3회 수행되었다.

제타 전위(zeta potential) 측정 결과 OPCD는 표면의 양성자화된 아민기에서 기인하는 양전하(~17.4mV)를 나타냈으며 OPCD가 음전하를 띄는 아밀로이드 베타 펩타이드(~-50mV)와 동시에 배양되었을 때 전위가 ~-37.6mV만큼 양의 방향으로 이동했다(도 6). 이러한 전위 값의 변화는 양전하성 OPCD와 음전하성 아밀로이드 베타의 정전기적 상호작용을 나타내며 이를 통해 아밀로이드 베타의 자기조립을 억제하는 것을 뒷받침한다.

실시예 4: OPCD의 구리(II) 매개 Aβ 응집에 대한 이중효과 확인

실시예 4-1: TEM 및 동적 광산란(DLS) 분석

구리(II) 킬레이팅 및 Aβ 자기조립을 억제하는 두가지 능력은 구리(II) 매개 Aβ응집에 대해 강력한 시너지 효과를 일으킨다. 이러한 효과를 확인하기 위해 TEM 및 동적 광산란(DLS) 분석을 사용하여 구리(II) 매개성 아밀로이드 베타 응집체의 형태 및 크기 변화를 관찰하였다.

DLS 분석을 위한 측정은 Zetasizer NanoZS (Malvern Instruments, UK)를 사용하여 실온에서 수행하였다. DLS 측정을 위해 각 Aβ샘플(100μL)을 1mL로 희석하고 DLS 일회용 큐벳에 넣었다.

TEM 관찰을 위해 우라닐 아세테이트(UA)용액 1%(w/v)를 사용하여 Aβ 샘플을 음성 염색 하였다. 각 Aβ 샘플 5μL를 폼바/탄소 300 매시 구리 그리드(fombar/carbon 300 mesh copper grid)위에 수분 동안 떨어뜨렸다. 남은 용액은 여과지를 이용하여 제거하였다. 그 후 5μL의 UA 용액을 그리드에 떨어뜨린 다음 즉시 제거하였다. UA 용액 5μL을 다시한번 떨어트린 뒤 1분 뒤에 제거하였다. 관측은 Tecnai G2- F30 (FEI Company, USA)를 사용하여 300kV에서 수행되었다. ex situ 원자력 현미경(AFM) 분석을 위해 NHCR 실리콘 캔틸레버(Nanosensors Inc., Switzerland)가 장착된 나노스코프 V 멀티모드 AFM 장비(Veeco Instruments Inc., USA)를 사용했다. 각 Aβ 샘플 10μL를 떨어뜨려 운모(mica)에 10분간 흡착시킨뒤 상기 운모를 탈이온수(DW)로 수 회 헹구고 건조하여 측정하였다.

동일한 몰비의 구리(II)가 존재하는 경우, 얽힌 섬유 네트워크 구조를 가지는 구리(II)-free Aβ 응집체의 형태와 상당한 차이가 있는 대형 비정질 Aβ 응집체의 형성을 촉진했다(도 7a 및 도 8). 대조적으로, OPCD와 Aβ-구리(II) 복합체의 동시 배양은 현저히 적고 짧은 응집체가 형성되는 것으로 관측 되었다. 이러한 결과는 OPCD가 구리(II) 매개 Aβ의 응집을 효과적으로 차단한다는 것을 나타낸다. TEM 결과에 따르면 OPCD는 성숙한 Aβ 매개성 Aβ 응집체의 유체역학 반경을 ca. 374nm 에서 116nm까지 감소시켰다(도 7b).

실시예 4-2: 원이색(Circular dichroism, CD) 분석

J-815 원이색 분광기(Jasco Inc., Japan)를 사용하여 Aβ샘플의 원-자외선 CD 스펙트럼을 얻었다. 측정은 N2 blowing 조건 아래에서 20℃에서 0.5mm 패스랭스 큐벳(pathlength cuvette)을 사용하여 수행되었으며 190-260nm 범위에서 3번 스캔되어 스펙트럼을 얻었다.

Aβ-구리(II) 복합체 2차 구조의 구조적 전이에 대한 OPCD의 효과를 확인하기 위해 CD 분석을 이용하였다. 성숙한 Aβ-구리(II) 복합체는 195nm 에서 양의 극대값과 216nm에서 음의 극대값을 가지는 전형적인 β-sheet CD 프로파일을 보여주어 β-sheet 적층 2차 구조를 포함하는 것으로 나타났다(도 7c). 이러한 결과는 구조화되지 않은 단량체에서 β-sheet가 풍부한 구조로의 전이를 의미한다. 대조적으로 OPCD를 처리한 경우 용량 의존적으로 각 최대값 피크에서 현저한 감소를 일으키는 것이 관측되었다. 이러한 결과는 OPCD가 Aβ의 2차 구조의 구조적 변형을 통해 Aβ-구리(II) 복합체를 형성하는 것을 억제하는 것을 의미한다.

상기한 모든 결과를 종합할 때, OPCD의 구리(II)를 킬레이팅 능력 및 아밀로이드 베타의 분자간 β-sheet 적층을 차단 능력의 이중 기능를 통해 Aβ-Cu (II) 복합체의 형성을 억제함을 시사한다.

실시예 5: OPCD의 광 촉매성에 의한 구리(II) 매개 Aβ 응집에 대한 증폭된 억제효과 확인

실시예 5-1: 광 조사시 OPCD의 활성 산소종(ROS) 생성능 확인

ROS 생성 분석을 위해 DHR 분석을 수행하였다. 구체적으로, 디메틸 술폭사이드(DMSO)에 용해된 디하이드로로다민123(Dihydrorhodamine 123, DHR123) 스톡 1mM을 구리(II) 함유 OPCD 용액(100μg/mL)과 혼합하여 10μM으로 희석하였다. 광 조사 아래에서, 용액의 형광을 RF-5301PC 분광 형광광도계(Shimadzu Inc., Japan)를 사용하여 485nm의 자극(excitation) 파장 아래에서 10분 간격으로 측정하였다. 모든 데이터는 3회 측정되었으며 525nm에서 PL값은 추후 분석을 위해 사용하였다.

시간 의존적인 킬레이트 복합체 형성 프로세스를 통해 구리(II) 농도의 증가에 따른 PL 강도의 증가를 확인하였다(도 9a). 이러한 결과는 구리(II)에 의한 OPCD의 질소 함유 관능기의 변화에서 유래하며, 결과적으로 구리(II)와 OPCD의 아민기 및 이민기의 결합구조는 n → π * 전이를 촉진한다. OPCD의 광 촉매 활성을 극대화 하기 위해, 방출 스펙트럼 범위가 OPCD의 광 흡수 범위와 겹치는 청색 LED를 사용하여 광 흥분된 OPCD가 ROS를 생성하고 Aβ-Cu (II) 복합체의 형성을 억제할 수 있는지 조사하였다. PL을 측정한 결과에 따르면, OPCD는 광을 조사하는 경우에 PL강도에 변화를 거의 나타내지 않았다(도 9c). 이는 빛이 지속적으로 조사되는 환경에서도 OPCD의 흡광성 및 발광성이 감소되지 않고 안정적으로 유지되는 것을 나타낸다.

DHR 분석 결과, OPCD는 광 조사시에 Rh123의 축적을 유도하고, 구리(II)의 농도가 높을수록 Rh123을 신속하게 생산하였다(도 10). 이러한 결과는 광 조사시에 OPCD가 ROS를 생성하고, 구리(II)의 양에 비례하여 OPCD의 광 촉매성 ROS 생산에 영향을 준다는 것을 나타낸다.

실시예 5-2: 광 조사시 OPCD에서 Aβ의 구조적 변화 분석

MALDI - TOF 질량 분광 분석을 사용하여 광 조사시 OPCD에 의해 생성된 ROS의 Aβ-Cu (II) 복합체에 대한 효과를 조사 하였다. 구체적으로, Aβ₄₂ 단량체 용액(40μM)과 구리(II) 용액(40μM)을 혼합하여 Aβ-구리(II) 복합체를 제조하였다. OPCD(50μg/mL) 존재/부존재 및 광 조사/비조사의 4가지 조건 아래에서 15, 30 및 60 분으로 광 조사 시간을 달리하여 37℃에서 24시간 배양했다. MALDI-TOF 분석을 위해 2μL의 각 시료를 1:1의 비율로 알파-시아노-하이드록시신나믹산(HCCA) 매트릭스(matrix)와 혼합한 뒤 플레이트에 스포팅하였다. 스펙트럼은 Bruker autoflex III (Bruker Daltonics, Germany)를 이용하여 기록되었으며, 하기의 식 1을 통해 Aβ 샘플의 상대적 피크 강도를 비교하였다.

식 1.

{Σ(Aβ₄₂ + n[O])}/[(Aβ₄₂) + {Σ(Aβ₄₂ + n[O])}]

상기 식에서 각 소괄호 안의 값은 피크의 강도를 의미함.

일반적인 Aβ-Cu (II) 복합체의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼은 4514.3 m/z에서 강한 피크를 보인다. 이는 전장 Aβ₄₂ 펩타이드의 전형적인 질량을 나타낸다. 광 조사와 함께 OPCD 및 Aβ-Cu (II) 복합체를 1시간동안 공동 배양한 후, +14 Da 의 피크의 이동을 확인하였고, 23시간의 배양 이후에는 +16 Da의 피크의 연속적인 이동을 확인하였다(도 11a). 광 비조사(암) 조건에서는 추가적인 피크가 거의 관측 되지 않았다(도 12a). 이러한 질량 피크의 변형은 히스티딘(His), 메티오닌(Met) 및 티로신(Tyr)과 같은 Aβ의 잔기에 산소를 부가(n[O], n=1,2 또는 3)하여 야기된 것을 확인하였다. 특히 +14 Da 변형은 디하이드로-2-이미다졸론 유도체를 생성하는 His13 및 His14의 산화를 의미한다. His13 및 His14가 구리(II)와의 결합에 관여하는 주요 잔기임을 고려할 때, 이러한 산화가 아밀로이드 베타의 구리(II) 친화성을 낮추고 복합체를 형성하지 못하도록 하는 것으로 예상된다. Met35 와 같은 잔기의 산화는 β-sheet를 불안정하게 하며, 광산화된 Met의 황은 구리(II)에 불활성이 되어 구리(II) 촉매 펜톤형 반응(Cu(II)-catalyzed Fenton-type reaction)을 유도하지 못하게 한다.

도 12에서 볼 수 있듯이, OPCD 처리된 Aβ-Cu (II) 복합체에서 광 조사시간이 길어질수록 Aβ의 산소 함량을 증가시켰다. 이러한 결과는 광 조사 시간을 조절함으로써, Aβ의 산화수준을 조절할 수 있음을 시사한다.

추가적으로, 1 시간 동안의 짧은 광 조사는 Aβ-구리(II) 복합체의 응집에 대한 OPCD의 억제 효능을 현저하게 증가시켰다. 도 11b의 AFM 이미지에서 보여지는 바와 같이 1 시간 동안의 광 조사 조건에서 OPCD가 Aβ-구리(II) 복합체의 응집을 완전히 차단 함을 보여준다. 대조적으로, 일부 비정질 응집체 및 피브릴종은 광 비조사(암) 조건 하에서 생성되었으며, 광이 비조사된 경우에는 OPCD(50㎍/㎖)가 Aβ-구리(II) 복합체의 응집을 완벽하게 억제 할 수 없음을 나타낸다. 도 11c에 도시 된 CD 분석 결과에서 알 수 있듯이, Aβ-구리(II) 복합체의 β-시트 프로파일은 광 조사 아래서 OPCD를 처리한 경우, 두드러지게 사라졌다. 상기 결과는 OPCD가 구리(II) 매개 Aβ의 응집을 억제할 수 있음을 보여주며, 광 조사는 ROS 생성을 통해 Aβ를 산화함으로써 OPCD의 효능을 더욱 강화시킬 수 있음을 나타낸다.

실시예 6: 세포 생존력 검사(viability test)를 통한 구리(II) 매개 Aβ 응집체 유도성 세포독성에 대한 OPCD의 완화효과 확인

생존력 검사를 위해 쥐 갈색 세포종(rat pheochromocytoma)에서 유래한 PC12 세포주를 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)로부터 구매했다. 상기 세포를 10% FBS, 5% HS 및 1% AA를 함유하는 RPMI 1640 배지에서 유지시키고 37℃ 및 5% CO2 를 함유하는 가습 대기 조건에서 성장시켰다. 세포는 적어도 일주일에 2번씩 정기적으로 계대 배양 하였다. OPCD를 처리하였을 때 세포 생존력을 조사하기 위해 96-웰 마이크로 플레이트(웰당 10000세포/100μL)에 세포를 로딩하였다. 24시간동안 세포를 배양한 뒤, 각 10, 20, 50 및 100μg/mL 농도의 OPCD를 처리하고 24시간 더 배양하였다. 각 배양 조건(OPCD의 존재/부존재 및 광 조사/비조사) 아래에서 Aβ-구리(II) 복합체의 세포독성 시험은 Aβ-구리(II) 복합체 샘플의 앨리??(aliquot)을 100μL 배양 배지에 1% 최종 부피가 되도록 첨가함으로써 수행되었다. 배양 24시간후 배양 배지를 완전히 제거하고 10% MTT 용액(5mg/mL(PBS))을 함유하는 새로운 배지로 교체했다. 각 플레이트를 추가로 3시간동안 배양하였다. 각 웰에 생성된 자주색 포르마잔(formazan)은 100μL DMSO에 의해 가용화(solubilized)되었다. Victor 3 마이크로 플레이트 판독기(PerkinElmer Inc., USA)를 사용하여 595nm에서 흡광도를 측정하였다.

OPCD 만 첨가한 경우에 10 내지 100μg/mL의 광범위한 농도에서 90% 이상의 세포 생존력을 나타내어 OPCD가 생체-무독성임을 나타내었다(도 13a). 또한 OPCD 없이 Aβ-구리(II) 복합체만 첨가한 경우에 구리(II)에 의해 매개된 Aβ 응집체가 세포를 손상시켜 50% 미만으로 생존력을 떨어뜨렸다(도 13b). Aβ-구리(II) 복합체를 OPCD와 동시 반응 시켰을 때 세포의 생존률은 유의하게 증가하여, 50 및 100μg/mL 농도의 OPCD를 처리한경우에 각각 64.9% 및 88%의 생존율을 나타냈으며, 광 조사를 한시간 동안 한 경우, Aβ-구리(II) 복합체의 세포독성을 현저히 완화하여, 생존률을 96%로 향상 시켰다. 이러한 결과는 OPCD의 다양한 기능성이 Aβ-Cu (II) 복합체의 세포독성을 현저히 감소시키고, Aβ의 집적이 관여하는 다양한 신경퇴행성 질환의 치료에 이용될 수 있음을 시사한다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Multifunctional Carbon Dots for Inhibiting Amyloid beta aggregation and use thereof <130> P19-B146 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amyloid Beta 42 <400> 1 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40

Claims

금속이온과 킬레이트(chelate)를 형성하는 질소 함유 방향족 고리가 탄소 구조체의 표면에 존재하는 아밀로이드 베타 응집 억제용 탄소 도트(Carbon dot).
제1항에 있어서, 페나자인(phenazine) 또는 페나자인 유사 골격을 포함하는 것을 특징으로 하는 아밀로이드 베타 응집 억제용 탄소 도트(Carbon dot).
제1항에 있어서, 상기 탄소 도트는 아민기 또는 이민기로 치환된 방향족 고리를 중합(polymerization) 및 탄화(carbonization)하여 형성되는 것을 특징으로 하는 아밀로이드 베타 응집 억제용 탄소 도트(Carbon dot).
제3항에 있어서, 상기 아민기 또는 이민기로 치환된 방향족 고리는 o-페닐렌다이아민(ortho-phenylenediamine, OPD), p-페닐렌다이아민(para-phenylenediamine), m-페닐렌다이아민(meta-phenylenediamine), 2,3-디아미노페나자인(2,3-diaminophenazine) 및 2,3-디아미노나프탈렌(2,3-diaminonaphthalene)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 아밀로이드 베타 응집 억제용 탄소 도트(Carbon dot).
제1항에 있어서, 상기 금속이온은 구리이온인 것을 특징으로 하는 아밀로이드 베타 응집 억제용 탄소 도트(Carbon dot).
제1항에 있어서, 상기 질소 함유 방향족 고리는 아밀로이드 베타 펩타이드와 수소 결합, 소수성 상호작용 및 정전기적 상호작용으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 상호작용을 통해 아밀로이드 베타 펩타이드의 응집을 억제하는 것을 특징으로 하는 아밀로이드 베타 응집 억제용 탄소 도트(Carbon dot).
제1항에 있어서, 상기 탄소 도트는 광 조사 시에 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)을 생성하여 아밀로이드 베타의 응집 억제 또는 응집체를 분해하는 것을 특징으로 하는 아밀로이드 베타 응집 억제용 탄소 도트(Carbon dot).
제7항에 있어서, 350nm 내지 500nm 파장의 광을 조사하는 것을 특징으로 하는 아밀로이드 베타 응집 억제용 탄소 도트(Carbon dot).
제7항에 있어서, 아밀로이드 베타의 구리 농도에 비례하여 흡광도 및 광 조사에 따른 활성 산소종의 생산이 증가되는 것을 특징으로 하는 아밀로이드 베타 응집 억제용 탄소 도트(Carbon dot).
금속이온과 킬레이트(chelate)를 형성하는 질소 함유 방향족 고리가 탄소 구조체의 표면에 존재하는 아밀로이드 베타 응집 억제용 탄소 도트를 포함하는 신경퇴행성 질환(neurodegenerative disease) 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제10항에 있어서, 상기 아밀로이드 베타 응집 억제용 탄소 도트는 페나자인(phenazine) 또는 페나자인 유사 골격을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제10항에 있어서, 상기 아밀로이드 베타 응집 억제용 탄소 도트는 아민기 또는 이민기로 치환된 방향족 고리를 중합(polymerization) 및 탄화(carbonization)하여 형성되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제12항에 있어서, 상기 아민기 또는 이민기로 치환된 방향족 고리는 o-페닐렌다이아민(ortho-phenylenediamine, OPD), p-페닐렌다이아민(para-phenylenediamine), m-페닐렌다이아민(meta-phenylenediamine), 2,3-디아미노페나자인(2,3-diaminophenazine) 및 2,3-디아미노나프탈렌(2,3-diaminonaphthalene)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제10항에 있어서, 상기 금속이온은 구리이온인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제10항에 있어서, 상기 아밀로이드 베타 응집 억제용 탄소 도트의 질소 함유 방향족 고리는 아밀로이드 베타 펩타이드와 수소 결합, 소수성 상호작용 및 정전기적 상호작용으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 상호작용을 통해 아밀로이드 베타 펩타이드의 응집을 억제하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제10항에 있어서, 상기 아밀로이드 베타 응집 억제용 탄소 도트는 광 조사시에 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)을 생성하여 아밀로이드 베타의 응집 억제 또는 응집체를 분해하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제16항에 있어서, 350nm 내지 500nm 파장의 광을 조사하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제16항에 있어서, 상기 탄소 도트는 아밀로이드 베타의 구리의 농도에 비례하여 흡광도 및 광 조사에 따른 활성 산소종의 생산이 증가되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제10항에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌졸중 및 헌팅턴병으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.