KR102448128B1

KR102448128B1 - 미스폴딩된 단백질의 검출

Info

Publication number: KR102448128B1
Application number: KR1020177009707A
Authority: KR
Inventors: 클라우디오 소토 자라; 모하마드 샤나와즈; 러셀 엠. 리보비츠; 베네딕트 케이. 볼라트
Original assignee: 보드 오브 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템; 암프리온, 인코퍼레이티드; 클라우디오 소토 자라; 모하마드 샤나와즈; 러셀 엠. 리보비츠; 베네딕트 케이. 볼라트
Priority date: 2014-09-11
Filing date: 2015-09-11
Publication date: 2022-09-27
Also published as: WO2016040907A1; SG11201701953RA; KR20170103741A; JP7104943B2; JP6980953B2; EP3191599C0; MX2017003269A; IL251052B; AU2015314783B2; CN107208125A; SG10202008464UA; EP4292654A3; CA2960830A1; EP3191599B1; JP2017530373A; HRP20231232T1; US20160077112A1; ES2953855T3; PL3191599T3; EP3191599A1

Abstract

샘플로부터, 예를 들어 알츠하이머병, 파킨슨병 등을 가지는 환자로부터 미스폴딩된 단백질을 증폭시키고 검출하기 위한 방법 및 키트가 제공된다. 예를 들어, 샘플에서의 가용성 미스폴딩된 단백질의 존재를 결정하는 방법은 샘플을 단량체성 폴딩된 단백질과 접촉시켜 항온처리 혼합물을 형성하는 단계; 미스폴딩된 단백질의 증폭된 부분을 형성하기에 효과적인 항온처리 사이클을 2회 이상 수행하는 단계; 단량체성 폴딩된 단백질의 적어도 일부의 미스폴딩 및/또는 응집을 발생시키기에 효과적인 항온처리 혼합물을 항온처리하는 단계; 존재하는 임의의 단백질 응집체의 적어도 일부를 파괴시키기에 효과적인 항온처리 혼합물을 물리적으로 파괴시키는 단계; 및 가용성 미스폴딩된 단백질의 적어도 일부를 검출함으로써 샘플에서의 가용성 미스폴딩된 단백질의 존재를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 단량체성 폴딩된 단백질 및 가용성 미스폴딩된 단백질은 프리온 단백질(PrP) 및 이의 동형단백질을 배제할 수 있다.

Description

미스폴딩된 단백질의 검출{DETECTION OF MISFOLDED PROTEINS}

관련 출원에 대한 상호 참조

본원은 2014년 9월 11일에 출원된 미국 가특허 출원 제62/049,306호(이의 전문은 본 명세서에 참고문헌으로 포함됨)로부터의 우선권을 주장한다.

단백질 미스폴딩 장애(protein misfolding disorder; PMD)는 알츠하이머병, 파킨슨병, 2형 당뇨병, 헌팅턴병, 근위축성 측삭 경화증, 전신 아밀로이드증, 프리온 질환 등을 포함한다. 상이한 단백질의 미스폴딩된 응집체가 형성되고 축적될 수 있다. 미스폴딩된 응집체는 다른 효과 중에서 세포내 기능이상 및 조직 손상을 유도할 수 있다.

예를 들어, 알츠하이머병(Alzheimer's disease; AD) 및 파킨슨병(Parkinson's disease; PD)은 효과적인 치료 또는 정확한 전임상 진단이 없는 퇴행성 뇌 장애이다. AD에서, 예를 들어 현재까지 증거는 아밀로이드-베타 단백질(Aβ)의 미스폴딩, 응집 및 뇌 침착이 AD 병리학에 대한 촉발 인자일 수 있다는 것을 제안한다. Aβ 반이 원래 질환의 특징인 것으로 생각되지만, 현재의 조사는 가용성 Aβ 올리고머가 AD에서 신경퇴행을 발생시키는 중요한 시냅스 독성 종일 수 있다는 것을 제안한다. 뇌가 낮은 재생 능력을 가지므로, PMD의 조기 진단이 비가역적인 신경병리학적 변화가 발생하기 전에 중재를 허용하는 데 중요하다. 여러 라인의 증거가 임상 증상 및 실질적인 뇌 손상의 발생 전에 미스폴딩 및 올리고머화의 과정이 수년 또는 수십년에 시작할 수 있다는 것을 나타낸다. 널리 인정되는 조기의 민감하고 객관적인 실험실 진단의 부족은 PMD를 겪는 환자의 관리를 위한 중요한 문제로 남아 있다.

본원은 예를 들어 관련 질환의 진단을 위한 단백질 미스폴딩의 검출이 도전적인 시도일 수 있다는 것을 인식한다.

일 실시형태에서, 샘플에서의 가용성 미스폴딩된 단백질의 존재를 결정하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 샘플을 단량체성 폴딩된 단백질(monomeric, folded protein)과 접촉시켜 항온처리 혼합물을 형성하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 미스폴딩된 단백질의 증폭된 부분을 형성하기에 효과적인 항온처리 사이클을 2회 이상 수행하는 단계를 포함할 수 있다. 각각의 항온처리 사이클은 가용성 미스폴딩된 단백질의 존재 하에 단량체성 폴딩된 단백질의 적어도 일부의 미스폴딩 및/또는 응집을 발생시키기에 효과적인 항온처리 혼합물을 항온처리하는 단계를 포함할 수 있다. 각각의 항온처리 사이클은, 예를 들어 가용성 미스폴딩된 단백질을 방출시키도록, 존재하는 임의의 단백질 응집체의 적어도 일부를 파괴시키기에 효과적인 항온처리 혼합물을 물리적으로 파괴하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 가용성 미스폴딩된 단백질의 적어도 일부를 검출함으로써 샘플에서의 가용성 미스폴딩된 단백질의 존재를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 가용성 미스폴딩된 단백질은 가용성 미스폴딩된 단량체 및 가용성 미스폴딩된 응집체 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 미스폴딩된 단백질의 증폭된 부분은 가용성 미스폴딩된 단량체의 증폭된 부분, 가용성 미스폴딩된 응집체 및 불용성 미스폴딩된 응집체의 증폭된 부분 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 단량체성 폴딩된 단백질 및 가용성 미스폴딩된 단백질은 프리온 단백질(prion protein; PrP) 및 이의 동형단백질을 배제할 수 있다.

또 다른 실시형태에서, 샘플에서의 가용성 미스폴딩된 단백질의 존재를 결정하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 샘플을 티오플라빈 T 및 몰 초과의 단량체성 폴딩된 단백질과 접촉시켜 항온처리 혼합물을 형성하는 단계를 포함할 수 있다. 몰 초과는 샘플에서 가용성 미스폴딩된 단백질에 포함된 단백질 단량체의 양보다 많을 수 있다. 상기 방법은 미스폴딩된 단백질의 증폭된 부분을 형성하기에 효과적인 항온처리 사이클을 2회 이상 수행하는 단계를 포함할 수 있다. 각각의 항온처리 사이클은 미스폴딩된 단백질의 증폭된 부분을 형성하도록 가용성 미스폴딩된 단백질의 존재 하에 단량체성 폴딩된 단백질의 적어도 일부의 미스폴딩 및/또는 응집을 발생시키기에 효과적인 항온처리 혼합물을 항온처리하는 단계를 포함할 수 있다. 각각의 항온처리 사이클은, 예를 들어 가용성 미스폴딩된 단백질을 방출시키도록, 존재하는 임의의 단백질 응집체의 적어도 일부를 파괴시키기에 효과적인 항온처리 혼합물을 진탕시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 가용성 미스폴딩된 단백질에 상응하는 티오플라빈 T의 형광을 검출함으로써 샘플에서의 가용성 미스폴딩된 단백질의 존재를 결정하는 단계를 또한 포함할 수 있다. 가용성 미스폴딩된 단백질은 가용성 미스폴딩된 단량체 및 가용성 미스폴딩된 응집체 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 미스폴딩된 단백질의 증폭된 부분은 가용성 미스폴딩된 단량체의 증폭된 부분, 가용성 미스폴딩된 응집체 및 불용성 미스폴딩된 응집체의 증폭된 부분 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 단량체성 폴딩된 단백질 및 가용성 미스폴딩된 단백질은 프리온 단백질(PrP) 및 이의 동형단백질을 배제할 수 있다.

일 실시형태에서, 가용성 미스폴딩된 단백질의 존재를 결정하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 샘플로부터 가용성 미스폴딩된 단백질을 포획하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 포획된 가용성 미스폴딩된 단백질을 몰 초과의 단량체성 폴딩된 단백질과 접촉시켜 항온처리 혼합물을 형성하는 단계를 포함할 수 있다. 몰 초과는 포획된 가용성 미스폴딩된 단백질에 포함된 단백질 단량체의 양보다 많을 수 있다. 상기 방법은 미스폴딩된 단백질의 증폭된 부분을 형성하기에 효과적인 항온처리 사이클을 2회 이상 수행하는 단계를 포함할 수 있다. 각각의 항온처리 사이클은 미스폴딩된 단백질의 증폭된 부분을 형성하도록 포획된 가용성 미스폴딩된 단백질의 존재 하에 단량체성 폴딩된 단백질의 적어도 일부의 미스폴딩 및/또는 응집을 발생시키기에 효과적인 항온처리 혼합물을 항온처리하는 단계를 포함할 수 있다. 각각의 항온처리 사이클은, 예를 들어 가용성 미스폴딩된 단백질을 방출시키도록, 존재하는 임의의 단백질 응집체의 적어도 일부를 파괴시키기에 효과적인 항온처리 혼합물을 물리적으로 파괴하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 가용성 미스폴딩된 단백질의 적어도 일부를 검출함으로써 샘플에서 가용성 미스폴딩된 단백질의 존재를 결정하는 단계를 또한 포함할 수 있다. 가용성 미스폴딩된 단백질은 가용성 미스폴딩된 단량체 및 가용성 미스폴딩된 응집체 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 포획된 가용성 미스폴딩된 단백질은 포획된 가용성 미스폴딩된 단량체 및 포획된 가용성 미스폴딩된 응집체 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 미스폴딩된 단백질의 증폭된 부분은 가용성 미스폴딩된 단량체의 증폭된 부분, 가용성 미스폴딩된 응집체 및 불용성 미스폴딩된 응집체의 증폭된 부분 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 단량체성 폴딩된 단백질 및 가용성 미스폴딩된 단백질은 프리온 단백질(PrP) 및 이의 동형단백질을 배제할 수 있다.

또 다른 실시형태에서, 샘플에서의 가용성 미스폴딩된 단백질의 존재를 결정하기 위한 키트가 제공된다. 키트는 공지된 양의 단량체성 폴딩된 단백질 및 공지된 양의 가용성 미스폴딩된 단백질의 표시자 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 키트는 설명서를 포함할 수 있다. 설명서는 항온처리 혼합물을 형성하도록 샘플을 공지된 양의 단량체성 폴딩된 단백질 및 공지된 양의 가용성 미스폴딩된 단백질의 표시자 중 하나 이상과 접촉하도록 사용자에게 지시할 수 있다. 설명서는 미스폴딩된 단백질의 증폭된 부분을 형성하기에 효과적인 항온처리 사이클을 2회 이상 수행하도록 사용자에게 지시할 수 있다. 각각의 항온처리 사이클은 미스폴딩된 단백질의 증폭된 부분을 형성하도록 가용성 미스폴딩된 단백질의 존재 하에 단량체성 폴딩된 단백질의 적어도 일부의 미스폴딩 및/또는 응집을 발생시키기에 효과적인 항온처리 혼합물을 항온처리하는 단계를 포함할 수 있다. 각각의 항온처리 사이클은, 예를 들어 가용성 미스폴딩된 단백질을 방출시키도록, 존재하는 임의의 단백질 응집체의 적어도 일부를 파괴시키기에 효과적인 항온처리 혼합물을 물리적으로 파괴하는 단계를 포함할 수 있다. 설명서는 가용성 미스폴딩된 단백질을 검출함으로써 샘플에서의 가용성 미스폴딩된 단백질의 존재를 결정하도록 사용자에게 지시할 수 있다. 가용성 미스폴딩된 단백질은 가용성 미스폴딩된 단량체 및 가용성 미스폴딩된 응집체 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 미스폴딩된 단백질의 증폭된 부분은 가용성 미스폴딩된 단량체의 증폭된 부분, 가용성 미스폴딩된 응집체 및 불용성 미스폴딩된 응집체의 증폭된 부분 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 단량체성 폴딩된 단백질 및 가용성 미스폴딩된 단백질은 프리온 단백질(PrP) 및 이의 동형단백질을 배제할 수 있다.

샘플에서의 가용성 미스폴딩된 단백질의 존재를 결정하기 위해 본 명세서에 개시된 방법 및 키트는 샘플에서의 가용성 미스폴딩된 단백질의 부재를 결정하기 위해 효과적일 수 있다.

명세서에 포함되고 이의 일부를 구성하는 첨부한 도면은 예시적인 방법 및 방법을 예시하고, 예시적인 실시형태를 예시하도록 오직 사용된다.
도 1a는 항온처리의 0시간, 5시간, 10시간 및 24시간에 취한 전자 현미경사진을 보여준다.
도 1b는 가용성 올리고머 Aβ 단백질 응집체의 웨스턴 블롯이다.
도 2a는 실시예 1의 합성 가용성 올리고머 Aβ 단백질의 다양한 농도에 의해 시딩된 시간의 함수로서 ThT 형광에 의해 측정된 비증폭된 아밀로이드 형성을 보여주는 그래프이다.
도 2b는 실시예 1의 합성 가용성 올리고머 Aβ 단백질의 다양한 농도에 의해 시딩된 시간의 함수로서 ThT 형광에 의해 측정된 증폭된 사이클 가속 아밀로이드 형성을 보여주는 그래프이다.
도 3a는 AD, NND 및 NAND 군으로부터의 5개의 각각의 샘플로부터 CSF에 의해 시딩된 Aβ 응집의 평균 동역학을 보여주는, ThT 형광 표지의 함수로서 측정된, 시간에 따른 아밀로이드 형성의 그래프이다.
도 3b는 AD, NND 및 NAND 군으로부터의 샘플의 존재 하에 Aβ 응집에 대한 h 단위의 유도기 시간의 그래프이다.
도 3c는 AD, NND 및 NAND 환자로부터의 CSF 샘플의 존재 하에 180 Aβ-PMCA 사이클 후, 즉 항온처리의 90h 후(P90) 얻어진 아밀로이드 형성의 정도를 보여주는 그래프이다.
도 4a는 AD 대 NAND에 대한 도 3b에 도시된 유도기 값을 이용한 상이한 컷오프 점에 대한 위양성율(특이성)의 함수로서의 진양성율(민감도)의 도면이다.
도 4b는 AD 대 NND에 대한 도 3b에 도시된 유도기 값을 이용한 상이한 컷오프 점에 대한 위양성율(특이성)의 함수로서의 진양성율(민감도)의 도면이다.
도 4c는 AD 대 모든 대조군 샘플에 대한 도 3b에 도시된 유도기 값을 이용한 상이한 컷오프 점에 대한 위양성율(특이성)의 함수로서의 진양성율(민감도)의 도면이다.
도 4d는 도 3b에 도시된 유도기 값을 이용한 상이한 컷오프 점에 대한 위양성율(특이성)의 함수로서의 진양성율(민감도)의 도면이고, 도 4a-도 4c의 상이한 세트의 군 비교를 위한 가장 신뢰할만한 컷오프 점을 예측한다.
도 5, 표 1은 유도기 수를 이용하여 계산된, Aβ-PMCA 시험의 민감도, 특이성 및 예측 값의 예측을 보여준다.
도 6은 AD 및 대조군 환자로부터의 CSF 샘플의 존재 하에 300 Aβ-PMCA 사이클 후, 즉 항온처리의 150h 후(P90) 얻어진 샘플에 대한 h 단위의 유도기 시간의 그래프이다.
도 7a는 인간 CSF로 스파이킹된 합성으로 제조된 Aβ 올리고머를 사용한 면역고갈의 결과를 보여주는 웨스턴 블롯이다.
도 7b는 대조군 및 면역고갈된 CSF 샘플에 의해 시딩된 Aβ 응집의 동역학을 보여주는 그래프이다.
도 7c는, 오직 A11 구조형태학적 항체에 의해 고갈된, 대조군 및 면역고갈된 CSF 샘플에 의해 시딩된 Aβ 응집의 동역학을 보여주는 그래프이다.
도 8a는 복잡한 생물학적 샘플로부터 포획 Aβ 올리고머에 이용된 ELISA 고상 방법의 도식적 표시이다.
도 8b는 복잡한 생물학적 샘플로부터 포획 Aβ 올리고머에 이용된 자기 비드 고상 방법의 도식적 표시이다.
도 9, 표 2는 Aβ 올리고머를 포획하는 특이적 항체의 능력을 보여준다.
도 10은 인간 혈장에서 스파이킹된 상이한 분량의 합성 올리고머의 존재 하에 Aβ 응집의 가속을 보여주는 시간에 따른 아밀로이드 형성의 그래프이다.
도 11은 AD 환자 및 대조군으로부터 혈장 샘플의 존재 하에 Aβ-PMCA 검정에서 50% 응집에 도달하는 시간을 보여주는 그래프이다.
도 12는 프로테아제 분해 후 웨스턴 블롯에 의해 모니터링된 명확한 분량의 합성 Aβ 올리고머의 존재 하에 항온처리/음파처리의 사이클에 의한 Aβ 응집의 증폭의 결과를 보여주는 웨스턴 블롯이다.
도 13a는 PD-PMCA에 의한 αS 시드의 검출을 보여주는 시간에 따른 티오플라빈 T 형광의 그래프이다.
도 13b는 αS 시드의 표시된 양의 함수로서 작도된 50% 응집에 도달하는 시간의 그래프이다.
도 14는 알츠하이머병(AD) 또는 비신경퇴행성 질환(NND)을 가지는 대조군에 대한 PD-PMCA에 의한 인간 PD 환자로부터의 CSF 샘플에서의 αS 시드의 검출을 보여준다.
도 15, 표 3은 αS 올리고머를 포획하는 상이한 순서 또는 구조형태학적 항체의 능력을 입증한다.
도 16a는 αS 올리고머를 포획하는 데에 이용된 ELISA 고상 방법의 도식적 표시이다.
도 16b는 αS 올리고머를 포획하는 데에 이용된 자기 비드 고상 방법의 도식적 표시이다.
도 17a는 N-19 αS 항체를 사용한 인간 혈액 혈장으로부터의 αS 올리고머의 면역침강/응집의 결과를 보여주는 그래프이다.
도 17b는 211 αS 항체를 사용한 인간 혈액 혈장으로부터의 αS 올리고머의 면역침강/응집의 결과를 보여주는 그래프이다.
도 17c는 C-20 αS 항체를 사용한 인간 혈액 혈장으로부터의 αS 올리고머의 면역침강/응집의 결과를 보여주는 그래프이다.
도 18a는 CSF 샘플에서의 αS 시드의 검출에 대한 대조군 샘플에서의 결과를 보여주는 그래프이다.
도 18b는 CSF 샘플에서의 αS 시드의 검출에 대한 PD 환자에서의 결과를 보여주는 그래프이다.
도 18c는 CSF 샘플에서의 αS 시드의 검출에 대한 다계통 위축증(MSA)을 가지는 환자에서의 결과를 보여주는 그래프이다.

단백질 미스폴딩 장애(PMD)의 진단을 위한 것을 포함하는 샘플에서의 미스폴딩된 단백질의 검출을 위한 방법 및 키트가 제공된다. 상이한 단백질의 미스폴딩된 응집체가 형성되고 축적될 수 있다. 미스폴딩된 응집체는 다른 효과 중에서 세포내 기능이상 및 조직 손상을 유도할 수 있다. 예를 들어, PMD는 아밀로이드증, 예컨대 알츠하이머병(AD) 또는 전신 아밀로이드증; 시누클레인병증, 예컨대 파킨슨병(PD), 루이소체 치매; 다계통 위축증; 및 시누클레인 관련 신경축삭 퇴행위축; 2형 당뇨병; 삼자암호반복병(triplet repeat disorder), 예컨대 헌팅턴병(HD); 근위축성 측삭 경화증(ALS); 등을 포함할 수 있다. 상이한 단백질의 미스폴딩된 응집체가 형성되고 축적될 수 있다. 미스폴딩된 응집체는 다른 효과 중에서 세포내 기능이상 및 조직 손상을 유도할 수 있다.

몇몇 실시형태에서, PMD는 감염성 프리온 질환, 예를 들어 전염성 해면양 뇌증 질환(transmissible spongiform encephalopathy; TSE)을 배제할 수 있다. 이러한 전염성 해면양 뇌증(TSE)은 인간 및 동물에게 영향을 미치는 감염성 신경퇴행성 질환의 군이다. 예를 들어, 인간 TSE 질환은 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeldt-Jakob) 질환 및 이의 변종(CJD, vCJD), 쿠루병, 게르스트만-슈트라우슬러-쉐이커 질환(Gerstmann-Straussler-Scheiker; GSS) 및 치명적 가족성 불면증(fatal familial insomnia; FFI)을 포함할 수 있다. 동물 TSE 질환은 양 및 염소(스크래피); 소(소 해면양 뇌증, BSE); 엘크(elk), 흰꼬리 사슴, 노새 사슴 및 붉은 사슴(만성 소모성 질환, CWD); 밍크(전염성 밍크 뇌증, TME); 고양이(고양이 해면양 뇌증, FSE); 니얄라 및 그레이터 쿠두(해외 유제류 뇌증, EUE); 등을 포함할 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같은, "단량체 단백질" 및 "가용성 미스폴딩된 단백질"은 프리온 단백질(PrP) 및 이의 동형단백질을 배제한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, "프리온"은 TSE를 발생시키는 것으로 알려진 미스폴딩된 단백질이다. 프리온 단백질(PrP)은 여러 동형단백질: 정상, 일반 또는 세포 동형단백질(PrP^c); 프로테아제 내성 동형단백질(PrP^res); 감염성 또는 "스크래피" 동형단백질(PrP^Sc); 등과 연관될 수 있다.

단백질 미스폴딩 순환 증폭(Protein Misfolding Cyclic Amplification; PMCA)인 방법은 시험관내 미스폴딩 및 응집 과정의 인공 가속 및 증폭을 통해 미스폴딩된 응집체의 초민감 검출을 제공할 수 있다. PMCA의 기본적인 개념은 이전에 개시되어 있다(소토(Soto) 등의 WO 제2002/04954호; 에스트라다(Estrada) 등의 미국 특허 출원 공보 제20080118938호(이의 각각은 본 명세서에 전문이 참고문헌으로 포함됨). 그러나, 본 문헌의 출원일 전에, 특허 공보는 PMD의 진단을 위한 것을 포함하여 샘플에서 프리온 이외에 가용성 미스폴딩된 단백질의 증폭 및 검출을 위한 PCMA가 가능하게 하지 않았다. 본 문헌은, PMD 환자에서 발견될 수 있는, 가용성 미스폴딩된 단백질의 검출에 대한 PMCA 기술이 가능하게 하는 구체적인 예 및 상세내용을 개시한다.

다양한 실시형태에서, 샘플에서의 가용성 미스폴딩된 단백질의 존재를 결정하는 방법이 제공된다. 본 명세서에 기재된 바대로, 샘플에서의 가용성 미스폴딩된 단백질의 존재를 결정하기 위한 방법 및 키트는 샘플에서의 가용성 미스폴딩된 단백질의 부재를 결정하는 데 효과적일 수 있다. 본 명세서에 기재된 가용성 미스폴딩된 단백질은 예를 들어 PMD와 연관된 다양한 신경 병리학을 야기하거나 발생시키는 병원성 단백질일 수 있다. 상기 방법은 샘플을 단량체성 폴딩된 단백질과 접촉시켜 항온처리 혼합물을 형성하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 미스폴딩된 단백질의 증폭된 부분을 형성하기에 효과적인 항온처리 사이클을 2회 이상 수행하는 단계를 포함할 수 있다. 각각의 항온처리 사이클은, 예를 들어 미스폴딩된 단백질의 증폭된 부분을 형성하도록, 가용성 미스폴딩된 단백질의 존재 하에 단량체성 폴딩된 단백질의 적어도 일부의 미스폴딩 및/또는 응집을 발생시키기에 효과적인 항온처리 혼합물을 항온처리하는 단계를 포함할 수 있다. 각각의 항온처리 사이클은, 예를 들어 가용성 미스폴딩된 단백질을 방출시키도록, 존재하는 임의의 단백질 응집체의 적어도 일부를 파괴시키기에 효과적인 항온처리 혼합물을 물리적으로 파괴하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 가용성 미스폴딩된 단백질의 적어도 일부를 검출함으로써 샘플에서 가용성 미스폴딩된 단백질의 존재를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 가용성 미스폴딩된 단백질은 가용성 미스폴딩된 단량체 및 가용성 미스폴딩된 응집체 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 미스폴딩된 단백질의 증폭된 부분은 가용성 미스폴딩된 단량체의 증폭된 부분, 가용성 미스폴딩된 응집체 및 불용성 미스폴딩된 응집체의 증폭된 부분 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 단량체성 폴딩된 단백질 및 가용성 미스폴딩된 단백질은 프리온 단백질(PrP) 및 이의 동형단백질을 배제할 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같은, "Aβ" 또는 "베타 아밀로이드"는 아밀로이드 전구체 단백질(amyloid precursor protein; APP)의 순차적인 절단을 통해 형성된 펩타이드를 의미한다. 다양한 Aβ 동형단백질은 38-43개의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. Aβ 단백질은 APP가 임의의 조합으로 β-세크레타제 및/또는 γ-세크레타제에 의해 처리될 때 형성될 수 있다. Aβ는 AD를 겪거나 이를 가지는 것으로 의심되는 개체의 뇌에서 아밀로이드 반의 구성성분일 수 있다. 다양한 Aβ 동형단백질은 A베타40 및 A베타42를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 다양한 Aβ 펩타이드는 AD와 연관된 뉴런 손상과 연관될 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같은, "αS" 또는 "알파-시누클레인"은 전장, 140개의 아미노산 α-시누클레인 단백질, 예를 들어 "αS-140"을 의미한다. 다른 동형단백질 또는 단편은 예를 들어 엑손 3의 소실로 인해 41-54 잔기가 부족한 알파-시누클레인-126인 "αS-126"; 및 예를 들어 엑손 5의 소실로 인해 103-130 잔기가 부족한 알파-시누클레인-112인 "αS-112"를 포함할 수 있다. αS는 PD를 겪거나 PD를 가지는 것으로 의심되는 개체의 뇌에 존재할 수 있다. 다양한 αS 동형단백질은 αS-140, αS-126 및 αS-112를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 다양한 αS 펩타이드는 PD와 연관된 뉴런 손상과 연관될 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같은, "tau"는 인간에서 단일 유전자, 예를 들어 MAPT(microtubule-associated protein tau; 미세소관 연관 단백질 tau)로부터의 대안적인 스플라이싱의 생성물인 단백질을 의미한다. tau 단백질은 임의의 tau의 동형단백질의 전장 및 절두 형태를 포함한다. 다양한 동형단백질은, tau 유전자의 엑손 2, 3 및 10에서 대안적인 스플라이싱에 상응하는, 인간 뇌 조직에 존재하는 것으로 공지된 6개의 tau 동형단백질을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 3개의 동형단백질은 3개의 결합 도메인을 가지고, 다른 3개는 4개의 결합 도메인을 가진다. 미스폴딩된 tau는 AD를 겪거나 AD 또는 다른 타우병증을 가지는 것으로 의심되는 개체의 뇌에 존재할 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같은, "미스폴딩된 단백질"은, 생물학적 시스템 내에 이의 통상적인, 비병원성 정상 기능에 관여할 때 존재하므로, 단백질의 구조 입체배좌의 전부 또는 일부를 더 이상 함유하지 않는 단백질이다. 미스폴딩된 단백질은 응집체일 수 있다. 미스폴딩된 단백질은 단백질 응집체에서 위치할 수 있다. 미스폴딩된 단백질은 비기능적 단백질일 수 있다. 미스폴딩된 단백질은 단백질의 병원성 형태이성질체일 수 있다. 단량체성 폴딩된 단백질 조성물은, 미스폴딩, 올리고머화 및 시드와 연관된 응집에 대한 촉매 활성 없이, 네이티브의 비병원성 확인으로 제공될 수 있다. 단량체성 폴딩된 단백질 조성물은 시드 비함유 형태로 제공될 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같은, "단량체성 폴딩된 단백질"은 단일 단백질 분자를 의미한다. "응집된 가용성 미스폴딩된 단백질"은 용액 중에 있는 단량체의 미스폴딩된 단백질의 응집을 의미한다. 가용성 미스폴딩된 단백질의 예는, 미스폴딩된 단백질이 가용성으로 있는 한, 임의의 수의 단백질 단량체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 가용성 미스폴딩된 단백질은 단량체 단백질의 2개 내지 약 50개의 단위의 단량체 또는 응집체를 포함할 수 있다.

단량체의 및/또는 가용성 미스폴딩된 단백질은 불용성 응집체 및/또는 더 고차의 올리고머를 형성하기 위해 응집할 수 있다. 예를 들어, Aβ 단백질의 응집은 원섬유, 섬유 및 결국 AD 대상체에서 발견될 수 있는 아밀로이드 반을 생성시킬 수 있다. "시드" 또는 "핵"은 가용성 미스폴딩된 단백질 또는 짧은 단편의 섬유, 특히 추가의 미스폴딩, 올리고머화 및 응집에 대한 촉매 활성을 가지는 가용성 미스폴딩된 단백질을 의미한다. 이러한 핵형성 의존적 응집은 느린 유도기를 특징으로 할 수 있고, 여기서 응집체 핵이 형성될 수 있고, 이것은 이후 추가의 응집체 및 더 큰 중합체의 빠른 형성을 촉매할 수 있다. 유도기는 미리 형성된 핵 또는 시드의 첨가에 의해 최소화되거나 제거될 수 있다. 단량체 단백질 조성물은, 미스폴딩 및 시드와 연관된 응집에 대한 촉매 활성 없이, 제공될 수 있다. 단량체 단백질 조성물은 시드 비함유 형태로 제공될 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같은, "가용성" 종은 생리학적 조건 하에 생물학적 유체 중의 용액을 형성할 수 있지만, "불용성" 종은 생리학적 조건 하에 이러한 생물학적 유체 중의 침전물, 섬유, 침착물, 매듭, 또는 다른 용해되지 않은 형태로 존재할 수 있다. 이러한 생물학적 유체는 예를 들어 유체, 또는 양수; 담즙; 혈액; 뇌척수액; 귀지; 피부; 삼출액; 대변; 위액; 림프; 젖; 점액, 예를 들어 코 분비물; 점막, 예를 들어 코 점막; 복막액; 혈장; 흉수; 고름; 타액; 피지; 정액; 땀; 활액; 눈물; 뇨; 등 중 하나 이상으로부터 표현된 유체를 포함할 수 있다. 불용성 종은 예를 들어 Aβ, αS, tau 등의 섬유를 포함할 수 있다. 생리학적 조건 하에 상기 언급된 생물학적 유체 중에서가 아니라 비생물학적 유체 중에 용해되는 종은 불용성이라 생각될 수 있다. 예를 들어, Aβ, αS, tau 등의 섬유는 물 중의 예를 들어 계면활성제, 예컨대 황산 도데실 나트륨(SDS)의 용액 중에 용해될 수 있지만, 생리학적 조건 하에 언급된 생물학적 유체 중 하나 이상 중에 여전히 불용성일 수 있다.

몇몇 실시형태에서, 샘플은 생리학적 조건 하에 침전물, 섬유, 침착물, 매듭, 반, 또는 기재된 생물학적 유체 중 하나 이상 중에 불용성일 수 있는 다른 형태로서 Aβ, αS 또는 tau와 같은 미스폴딩된 단백질의 불용성 종을 배제할 수 있다.

예를 들어, 샘플은 섬유 형태의 αS 및 tau를 배제할 수 있다. 샘플은 불용성 형태의 미스폴딩된 Aβ, αS 및/또는 tau 단백질을 배제할 수 있고, 예를 들어 샘플은 예를 들어 섬유 형태의 침전물, 섬유, 침착물, 매듭, 반, 또는 다른 불용성 형태로서 미스폴딩된 Aβ, αS 및/또는 tau 단백질을 배제할 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법은, 예를 들어 섬유 형태의 침전물, 섬유, 침착물, 매듭, 반, 또는 다른 불용성 형태로서 미스폴딩된 Aβ 및 tau 단백질을 예를 들어 샘플로부터 배제함으로써, 불용성 형태의 미스폴딩된 Aβ 및 tau 단백질을 배제함으로써, 샘플을 제조하는 단계를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 키트는 예를 들어 섬유 형태의 침전물, 섬유, 침착물, 매듭, 반, 또는 다른 불용성 형태로서 미스폴딩된 Aβ, αS 및/또는 tau 단백질을 샘플로부터 배제함으로써 샘플을 제조하도록 사용자에게 지시하는 설명서를 포함할 수 있다. 샘플로부터 기재된 미스폴딩된 단백질의 이러한 불용성 형태의 배제는 실질적이거나 완전할 수 있다.

본 명세서에 사용된 바대로, 가용성 미스폴딩된 단백질의 응집체는 가용성 미스폴딩된 단백질을 포함하는 단백질의 비공유 회합을 의미한다. 가용성 미스폴딩된 단백질의 응집체는 "탈응집" 또는 파괴되어서 가용성 미스폴딩된 단백질을 파괴시키거나 방출할 수 있다. 가용성 미스폴딩된 단백질 시드의 수집의 촉매 활성은 적어도 부분적으로 혼합물에서의 시드의 수에 따라 스케일링될 수 있다. 따라서, 가용성 미스폴딩된 단백질 시드를 방출시키는 혼합물에서의 가용성 미스폴딩된 단백질의 응집체의 파괴는 단량체 단백질의 올리고머화에 대한 촉매 활성을 증가시킬 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같은, "미스폴딩된 단백질"은, 생물학적 시스템 내에 이의 통상적인 정상 기능에 관여할 때 존재하므로, 단백질의 구조 입체배좌의 전부 또는 일부를 더 이상 함유하지 않는 단백질이다. 미스폴딩된 단백질은 응집체일 수 있다. 미스폴딩된 단백질은 단백질 응집체에서 위치할 수 있다. 미스폴딩된 단백질은 비기능적 단백질일 수 있다. 미스폴딩된 단백질은 병리학적 동형단백질일 수 있다.

다양한 실시형태에서, 가용성 미스폴딩된 단백질의 존재를 결정하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 샘플을 티오플라빈 T 및 몰 초과의 단량체성 폴딩된 단백질과 접촉시켜 항온처리 혼합물을 형성하는 단계를 포함할 수 있다. 몰 초과는 샘플에서 가용성 미스폴딩된 단백질에 포함된 단백질 단량체의 양보다 많을 수 있다. 상기 방법은 미스폴딩된 단백질의 증폭된 부분을 형성하기에 효과적인 항온처리 사이클을 2회 이상 수행하는 단계를 포함할 수 있다. 각각의 항온처리 사이클은 미스폴딩된 단백질의 증폭된 부분을 형성하도록 가용성 미스폴딩된 단백질의 존재 하에 단량체성 폴딩된 단백질의 적어도 일부의 미스폴딩 및/또는 응집을 발생시키기에 효과적인 항온처리 혼합물을 항온처리하는 단계를 포함할 수 있다. 각각의 항온처리 사이클은, 예를 들어 가용성 미스폴딩된 단백질을 방출시키도록, 존재하는 임의의 단백질 응집체의 적어도 일부를 파괴시키기에 효과적인 항온처리 혼합물을 진탕시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 가용성 미스폴딩된 단백질에 상응하는 티오플라빈 T의 형광을 검출함으로써 샘플에서의 가용성 미스폴딩된 단백질의 존재를 결정하는 단계를 또한 포함할 수 있다. 가용성 미스폴딩된 단백질은 가용성 미스폴딩된 단량체 및 가용성 미스폴딩된 응집체 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 포획된 가용성 미스폴딩된 단백질은 포획된 가용성 미스폴딩된 단량체 및 포획된 가용성 미스폴딩된 응집체 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 미스폴딩된 단백질의 증폭된 부분은 가용성 미스폴딩된 단량체의 증폭된 부분, 가용성 미스폴딩된 응집체 및 불용성 미스폴딩된 응집체의 증폭된 부분 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 단량체성 폴딩된 단백질 및 가용성 미스폴딩된 단백질은 프리온 단백질(PrP) 및 이의 동형단백질을 배제할 수 있다.

다양한 실시형태에서, 가용성 미스폴딩된 단백질의 존재를 결정하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 샘플로부터 가용성 미스폴딩된 단백질을 포획하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 포획된 가용성 미스폴딩된 단백질을 몰 초과의 단량체성 폴딩된 단백질과 접촉시켜 항온처리 혼합물을 형성하는 단계를 포함할 수 있다. 몰 초과는 포획된 가용성 미스폴딩된 단백질에 포함된 단백질 단량체의 양보다 많을 수 있다. 상기 방법은 미스폴딩된 단백질의 증폭된 부분을 형성하기에 효과적인 항온처리 사이클을 2회 이상 수행하는 단계를 포함할 수 있다. 각각의 항온처리 사이클은 미스폴딩된 단백질의 증폭된 부분을 형성하도록 포획된 가용성 미스폴딩된 단백질의 존재 하에 단량체성 폴딩된 단백질의 적어도 일부의 미스폴딩 및/또는 응집을 발생시키기에 효과적인 항온처리 혼합물을 항온처리하는 단계를 포함할 수 있다. 각각의 항온처리 사이클은, 예를 들어 가용성 미스폴딩된 단백질을 방출시키도록, 존재하는 임의의 단백질 응집체의 적어도 일부를 파괴시키기에 효과적인 항온처리 혼합물을 물리적으로 파괴하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 가용성 미스폴딩된 단백질의 적어도 일부를 검출함으로써 샘플에서 가용성 미스폴딩된 단백질의 존재를 결정하는 단계를 또한 포함할 수 있다. 가용성 미스폴딩된 단백질은 가용성 미스폴딩된 단량체 및 가용성 미스폴딩된 응집체 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 포획된 가용성 미스폴딩된 단백질은 포획된 가용성 미스폴딩된 단량체 및 포획된 가용성 미스폴딩된 응집체 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 미스폴딩된 단백질의 증폭된 부분은 가용성 미스폴딩된 단량체의 증폭된 부분, 가용성 미스폴딩된 응집체 및 불용성 미스폴딩된 응집체의 증폭된 부분 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 단량체성 폴딩된 단백질 및 가용성 미스폴딩된 단백질은 프리온 단백질(PrP) 및 이의 동형단백질을 배제할 수 있다.

본 명세서에 사용된 바대로, 가용성 미스폴딩된 단백질의 언급은 샘플, 항온처리 혼합물 등에 분포된 가용성 미스폴딩된 단백질의 임의의 형태를 포함할 수 있다. 예를 들어, 가용성 미스폴딩된 단백질의 언급은 PMD를 겪는 대상체로부터의 샘플에서의 가용성 미스폴딩된 단백질, 예를 들어 가용성 미스폴딩된 단백질을 포함할 수 있다. 가용성 미스폴딩된 단백질의 언급은 예를 들어 항온처리 혼합물에서의 예를 들어 미스폴딩된 단백질의 증폭된 부분을 포함할 수 있다. 가용성 미스폴딩된 단백질의 언급은 포획된 가용성 미스폴딩된 단백질, 예를 들어 가용성 미스폴딩된 단백질 특이적 항체를 사용하여 샘플로부터 포획된 가용성 미스폴딩된 단백질을 포함할 수 있다.

몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 가용성 미스폴딩된 단백질의 표시자를 항온처리 혼합물과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 가용성 미스폴딩된 단백질의 표시자는 가용성 미스폴딩된 단백질의 존재 시의 표시 상태 및 가용성 미스폴딩된 단백질의 부재 시의 비표시 단계를 특징으로 할 수 있다. 샘플에서의 가용성 미스폴딩된 단백질의 존재를 결정하는 단계는 가용성 미스폴딩된 단백질의 표시자의 표시 상태를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 표시자의 표시 상태 및 표시자의 비표시 상태는 형광의 차이를 특징으로 할 수 있다. 샘플에서의 가용성 미스폴딩된 단백질의 존재를 결정하는 단계는 형광의 차이를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.

몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 몰 초과의 가용성 미스폴딩된 단백질의 표시자를 항온처리 혼합물과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 몰 초과는 항온처리 혼합물에서 단량체성 폴딩된 단백질 및 가용성 미스폴딩된 단백질에 포함된 단백질 단량체의 전체 몰 양보다 많을 수 있다.

다양한 실시형태에서, 가용성 미스폴딩된 단백질의 표시자는 티오플라빈 T, 공고 레드(Congo Red), m-I-스틸벤, 크리사민(Chrysamine) G, PIB, BF-227, X-34, TZDM, FDDNP, MeO-X-04, IMPY, NIAD-4, 발광성 공액 폴리티오펜, 형광 단백질, 예컨대 녹색 형광 단백질 및 황색 형광 단백질과의 융합체, 이들의 유도체 등 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

몇몇 실시형태에서, 샘플에서의 가용성 미스폴딩된 단백질의 존재를 결정하는 단계는 샘플에서의 가용성 미스폴딩된 단백질의 양을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 샘플에서의 가용성 미스폴딩된 단백질의 양은 대조군 샘플과 비교하여 결정될 수 있다. 샘플에서의 가용성 미스폴딩된 단백질의 양은 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 100% 중 하나 이상의 민감도로 검출될 수 있다. 샘플에서의 검출된 가용성 미스폴딩된 단백질의 양은 약 100nmol, 10nmol, 1nmol, 100pmol, 10pmol, 1pmol, 100fmol, 10fmol, 3fmol, 1fmol, 100attomol, 10attomol 및 1attomol 중 하나 이상보다 적을 수 있다. 샘플에서의 가용성 미스폴딩된 단백질의 양은 샘플에 의해 포함된 단량체성 폴딩된 단백질에 대한 몰 비로 검출될 수 있다. 몰 비는 약 1:100, 1:10,000, 1:100,000, 및 1:1,000,000 중 하나 이상보다 적을 수 있다.

다양한 실시형태에서, 샘플에서의 가용성 미스폴딩된 단백질은 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 100% 중 하나 이상의 특이성으로 검출될 수 있다.

몇몇 실시형태에서, 항온처리 혼합물은 단량체성 폴딩된 단백질을 약 1nM 내지 약 2mM; 약 10nM 내지 약 200μM; 약 100nM 내지 약 20μM; 또는 약 1μM 내지 약 10μM; 및 약 2μM 중 하나 이상의 농도, 또는 농도 범위로 포함할 수 있다.

몇몇 실시형태에서, 항온처리 혼합물은 완충제 조성물을 포함할 수 있다. 완충제 조성물은 본 명세서에 기재된 바대로 항온처리 혼합물의 pH, 예를 들어 pH 5 내지 pH 9를 준비하거나 유지시키기에 효과적일 수 있다. 완충제 조성물은 트리스(Tris)-HCL, PBS, MES, PIPES, MOPS, BES, TES 및 HEPES 등 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 완충제 농도는 약 1μm 내지 약 1M의 전체 농도일 수 있다. 예를 들어, 완충제는 0.1M의 농도의 트리스-HCl일 수 있다.

다양한 실시형태에서, 항온처리 혼합물은 염 조성물을 포함할 수 있다. 염 조성물은 항온처리 혼합물의 이온 농도를 증가시키기에 효과적일 수 있다. 염 조성물은 NaCl, KCl 등 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 항온처리 혼합물은 염 조성물을 약 1μm 내지 약 500 mM의 전체 농도로 포함할 수 있다.

몇몇 실시형태에서, 항온처리 혼합물은 약 5 내지 약 9; 약 6 내지 약 8.5; 약 7 내지 약 8; 및 약 7.4 중 하나 이상의 pH 값 또는 pH 범위에서 준비되거나 유지되는 것을 특징으로 할 수 있다.

몇몇 실시형태에서, 항온처리 혼합물은 약 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 35, 36, 37, 40, 45, 50, 55 및 60 중 하나 이상의 ℃의 온도, 예를 들어 약 22℃, 또는 이전의 값의 임의의 2개 사이의 온도 범위, 예를 들어 약 4℃ 내지 약 60℃; 약 4℃ 내지 약 35℃; 약 8℃ 내지 약 50℃; 약 12℃ 내지 약 40℃; 약 18℃ 내지 약 30℃; 약 18℃ 내지 약 26℃; 등 중 하나 이상에서 항온처리될 수 있다.

몇몇 실시형태에서, 가용성 미스폴딩된 단백질을 검출하는 단계는 웨스턴 블롯 검정, 도트 블롯 검정, 효소 연결 면역흡착 검정(ELISA), 티오플라빈 T 결합 검정, 공고 레드 결합 검정, 침강 검정, 전자 현미경검사법, 원자력 현미경검사법, 표면 플라스몬 공명 및 분광학 중 하나 이상을 포함할 수 있다. ELISA는 2측 샌드위치 ELISA를 포함할 수 있다. 분광학은 준광 산란 분광학, 다중스펙트럼 자외선 분광학, 공초점 이중 색상 형광 상관 분광학, 푸리에 변환 적외선 분광학, 분광학적 검출을 동반한 모세관 전기영동, 전자 스핀 공명 분광학, 핵 자기 공명 분광학, 형광 공명 에너지 전이(FRET) 분광학 등 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

다양한 실시형태에서, 가용성 미스폴딩된 단백질을 검출하는 단계는 항온처리 혼합물을 프로테아제와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 가용성 미스폴딩된 단백질은 웨스턴 블롯 검정, 도트 블롯 검정 및 ELISA 중 하나 이상에서 항-미스폴딩된 단백질 항체를 사용하여 검출될 수 있다.

몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 표지된 형태의 단량체성 폴딩된 단백질을 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 표지된 형태의 단량체성 폴딩된 단백질은 공유로 혼입된 방사성 아미노산, 공유로 혼입된, 동위원소 표지된 아미노산 및 공유로 혼입된 형광단 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 가용성 미스폴딩된 단백질을 검출하는 단계는 미스폴딩된 단백질의 증폭된 부분으로 혼입된 바와 같은 표지된 형태의 단량체성 폴딩된 단백질을 검출하는 단계를 포함한다.

몇몇 실시형태에서, 샘플은 대상체로부터 취해질 수 있다. 상기 방법은 샘플에서의 가용성 미스폴딩된 단백질의 존재에 따라 대상체에서의 PMD의 존재를 결정하거나 진단하는 단계를 포함할 수 있다. 샘플에서의 가용성 미스폴딩된 단백질의 존재는 대조군 대상체로부터 취해진 대조군 샘플과 비교하여 결정될 수 있다.

몇몇 실시형태에서, PMD는 아밀로이드증; 시누클레인병증; 삼자암호반복병; 또는 근위축성 측삭 경화증 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. PMD는 아밀로이드증, 예를 들어 알츠하이머병 또는 전신 아밀로이드증 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. PMD는 시누클레인병증, 예를 들어 파킨슨병, 루이소체 치매; 다계통 위축증; 또는 시누클레인 관련 신경축삭 퇴행위축 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. PMD는 헌팅턴병을 포함할 수 있다.

다양한 실시형태에서, 검출하는 단계는 샘플에서의 가용성 미스폴딩된 단백질의 양을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 샘플에서의 가용성 미스폴딩된 단백질의 양을 미리 결정된 한계치 양과 비교함으로써 대상체에서의 PMD의 존재를 결정하거나 진단하는 단계를 포함할 수 있다.

몇몇 실시형태에서, 샘플은 인지 시험에 따라 치매의 임상 징후를 나타내지 않은 대상체로부터 취해질 수 있다. 상기 방법은 샘플에서의 가용성 미스폴딩된 단백질의 존재에 따라 대상체에서의 PMD의 존재를 결정하거나 진단하는 단계를 포함할 수 있다.

몇몇 실시형태에서, 샘플은 아밀로이드 베타 조영제 영상화에 따라 피질 반 또는 매듭을 나타내지 않은 대상체로부터 취해질 수 있다. 상기 방법은 샘플에서의 가용성 미스폴딩된 단백질의 존재에 따라 대상체에서의 PMD의 존재를 결정하거나 진단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

다양한 실시형태에서, 샘플은 인지 시험에 따라 치매의 임상 징후를 나타낸 대상체로부터 취해질 수 있다. 상기 방법은 샘플에서의 가용성 미스폴딩된 단백질의 존재에 따라 대상체에서의 치매의 임상 징후에 대한 기여 인자로서 PMD의 존재를 결정하거나 진단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

몇몇 실시형태에서, 샘플은 양수; 담즙; 혈액; 뇌척수액; 귀지; 피부; 삼출액; 대변; 위액; 림프; 젖; 점액, 예를 들어 코 분비물; 점막, 예를 들어 코 점막; 복막액; 혈장; 흉수; 고름; 타액; 피지; 정액; 땀; 활액; 눈물; 뇨; 등 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 대상체로부터 샘플을 취하는 단계를 포함할 수 있다. 대상체는 인간, 마우스, 랫트, 개, 고양이, 소, 말, 사슴, 엘크, 양, 염소, 돼지 또는 비인간 영장류 중 하나일 수 있다. 비인간 동물은 야생 또는 가축일 수 있다. 대상체는 PMD의 위험에 있음, PMD를 가짐, PMD에 대한 치료 중임, 미스폴딩 단백질의 조절이상, 미스폴딩, 응집 또는 소인과 연관된 질환을 가질 위험에 있음, 미스폴딩 단백질의 조절이상, 미스폴딩, 응집 또는 소인과 연관된 질환을 가짐, 미스폴딩 단백질의 조절이상, 미스폴딩, 응집 또는 소인과 연관된 질환에 대해 치료 중임 등 중 하나 이상일 수 있다.

다양한 실시형태에서, 상기 방법은 샘플에서의 가용성 미스폴딩된 단백질의 양을, 샘플과 비교하여 다른 시간에 대상체로부터 취해진 비교 샘플에서의 가용성 미스폴딩된 단백질의 양과 비교함으로써, 대상체에서의 PMD의 진행 또는 항상성을 결정하거나 진단하는 단계를 포함할 수 있다. 다양한 실시형태에서, 샘플은 PMD에 대한 치료 중인 환자로부터 취해질 수 있다. PMCA 검정은 환자가 치료에 의해 치료될 수 있다는 것을 결정하기 위해 이용될 수 있다.

예를 들어, 다양한 기전을 통해 Aβ 항상성을 표적화하는 여러 신규한 치료제가 현재 개발 중에 있다. Aβ 올리고머에 대한 PMCA 검정은 환자가 PMD 질환 변형 치료제에 의해 치료될 수 있는지를 결정하기 위해 이용될 수 있다. PMCA 방법에 의해 검출된 바와 같은, Aβ 올리고머의 수치의 변화, 예를 들어 감소 또는 증가를 나타낸 환자는 Aβ 조절 치료제에 대한 "반응자"로 분류될 수 있고, Aβ 올리고머의 수치를 감소시키는 치료제에 의해 치료될 수 있다. 비정상 Aβ 항상성이 부족한 환자는 "비반응자"로 분류될 수 있고 치료되지 않을 수 있다. Aβ 항상성을 조절하는 것을 목표하는 치료제로부터 이익을 얻을 수 있는 환자가 따라서 확인될 수 있다.

또한, 예를 들어 다양한 기전을 통해 αS 항상성을 표적화하는 여러 신규한 치료제가 현재 개발 중에 있다. αS 항상성을 표적화하는 치료학적 접근법은 능동 면역화, 예컨대 PD01A+ 또는 PD03A+, 또는 수동 면역화, 예컨대 PRX002를 포함할 수 있다. αS 올리고머에 대한 PMCA 검정은 환자가 αS 조절 치료제에 의해 치료될 수 있는지를 결정하기 위해 이용될 수 있다. PMCA 방법에 의해 검출된 바와 같은, αS 올리고머의 수치의 변화, 예를 들어 증가 또는 감소를 나타낸 환자는 αS 조절 치료제에 대한 "반응자"로 분류될 수 있고, αS 올리고머의 수치를 감소시키는 치료제에 의해 치료될 수 있다. 비정상 αS 항상성이 부족한 환자는 "비반응자"로 분류될 수 있고 치료되지 않을 수 있다. αS 항상성을 조절하는 것을 목표하는 치료제로부터 이익을 얻을 수 있는 환자가 따라서 확인될 수 있다.

추가로, 예를 들어 가용성 미스폴딩된 단백질의 양은 PMCA를 사용하여 환자로부터의 샘플에서 측정될 수 있다. 상승한 가용성 미스폴딩된 단백질 측정을 가지는 환자는 가용성 미스폴딩된 단백질 항상성을 조절하는 치료제에 의해 치료될 수 있다. 정상 가용성 미스폴딩된 단백질 측정을 가지는 환자는 치료되지 않을 수 있다. 가용성 미스폴딩된 단백질 항상성을 조절하는 것을 목표하는 치료제에 대한 환자의 반응이 뒤따를 수 있다. 예를 들어, 가용성 미스폴딩된 단백질 수치는 치료학적 중재의 시작 시 환자 샘플에서 측정될 수 있다. 의미 있는 임상 시간 기간 동안 환자의 치료 후, 또 다른 환자 샘플이 얻어질 수 있고, 가용성 미스폴딩된 단백질 수치가 측정될 수 있다. 치료학적 중재 후 가용성 미스폴딩된 단백질 수치의 변화를 나타낸 환자는 치료에 반응하는 것으로 생각될 수 있다. 변하지 않은 가용성 미스폴딩된 단백질 수치를 나타낸 환자는 비반응성으로 생각될 수 있다. 상기 방법은 PMCA 반응을 방해할 수 있는 성분을 함유하는 환자 샘플에서의 가용성 미스폴딩된 단백질 응집체의 검출을 포함할 수 있다.

몇몇 실시형태에서, 대상체는 PMD 조절 치료에 의해 치료될 수 있다. 상기 방법은 샘플에서의 가용성 미스폴딩된 단백질의 양을 비교 샘플에서의 가용성 미스폴딩된 단백질의 양과 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 샘플 및 비교 샘플은 가용성 미스폴딩된 단백질 조절 치료 하에 일정 기간에 걸쳐 다른 시간에 대상체로부터 취해질 수 있다. 상기 방법은 일정 기간에 걸쳐 가용성 미스폴딩된 단백질의 변화에 따라 가용성 미스폴딩된 단백질 조절 치료에 반응성, 또는 일정 기간에 걸쳐 가용성 미스폴딩된 단백질의 항상성에 따라 가용성 미스폴딩된 단백질 조절 치료에 비반응성 중 하나인 대상체를 결정하거나 진단하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 가용성 미스폴딩된 단백질 조절 치료에 반응성인 것으로 결정된 대상체를 가용성 미스폴딩된 단백질 조절 치료에 의해 치료하는 단계를 포함할 수 있다. AD의 경우, 예를 들어 PMD 조절 치료제는 BACE1(베타-세크레타제 1)의 저해제; γ-세크레타제의 저해제; 및 Aβ 항상성의 조절제, 예를 들어 Aβ 항상성의 면역치료 조절제 중 하나 이상의 투여를 포함할 수 있다. Aβ 조절 치료제는 E2609; MK-8931; LY2886721; AZD3293; 세마가세스타트(semagacestat)(LY-450139); 아바가세스타트(avagacestat)(BMS-708163); 솔라네주맙(solanezumab); 크레네주맙(crenezumab); 바피네주맙(bapineuzumab); BIIB037; CAD106; 예를 들어, Barghorn 등에 의해 기재된 문헌["Globular amyloid β-peptide_1-42 oligomer - a homogenous and stable neuropathological protein in Alzheimer's disease" J. Neurochem., 2005, 95, 834-847](이의 전체 교시내용은 본 명세서에 참고문헌으로 포함됨)에 기재된 바와 같은, Aβ 글로불로머(globulomer)에 대해 길러진 8F5 또는 5598 또는 다른 항체; ACC-001; V950; 아피트로프(Affitrope) AD02; 등 중 하나 이상의 투여를 포함할 수 있다.

PD의 경우, 예를 들어 PMD 조절 치료제는 능동 면역화, 예컨대 PD01A+ 또는 PD03A+, 수동 면역화, 예컨대 PRX002 등을 포함할 수 있다. PMD 조절 치료제는 GDNF(신경교 세포주 유래 신경영양 인자), 이노신, 칼슘 채널 차단제, 구체적으로 Cav1.3 채널 차단제, 예컨대 이스라디핀, 니코틴 및 니코틴-수용체 작동제, GM-CSF, 글루타티온, PPAR-감마 작동제, 예컨대 피오글리타존 및 도파민 수용체 작동제, 예컨대 D2/D3 도파민 수용체 작동제 및 LRRK2(류신 농후 반복 키나제 2) 저해제에 의한 치료를 또한 포함할 수 있다.

몇몇 실시형태에서, 미스폴딩된 단백질의 양은 PMCA를 사용하여 환자로부터의 샘플에서 측정될 수 있다. 상승한 미스폴딩된 단백질 측정을 가지는 환자는 PMD에 대해 질환 변형 치료제에 의해 치료될 수 있다. 정상 미스폴딩된 단백질 측정을 가지는 환자는 치료되지 않을 수 있다. 질환 변형 치료제에 대한 환자의 반응이 뒤따를 수 있다. 예를 들어, 미스폴딩된 단백질 수치는 치료학적 중재의 시작 시 환자 샘플에서 측정될 수 있다. 의미 있는 임상 시간 기간 동안 환자의 치료 후, 또 다른 환자 샘플이 얻어질 수 있고, 미스폴딩된 단백질 수치가 측정될 수 있다. 치료학적 중재 후 미스폴딩된 단백질 수치의 변화를 나타낸 환자는 치료에 반응하는 것으로 생각될 수 있다. 변하지 않은 미스폴딩된 단백질 수치를 나타낸 환자는 비반응성으로 생각될 수 있다. 상기 방법은 PMCA 반응을 방해할 수 있는 성분을 함유하는 환자 샘플에서의 미스폴딩된 단백질 응집체의 검출을 포함할 수 있다.

몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 샘플 및 항온처리 혼합물 중 하나 이상에서 가용성 미스폴딩된 단백질을 선택적으로 농축시키는 단계를 포함할 수 있다. 가용성 미스폴딩된 단백질을 선택적으로 농축시키는 단계는 항온처리 혼합물을 형성하기 전에 샘플을 전처리하는 단계를 포함할 수 있다. 가용성 미스폴딩된 단백질을 선택적으로 농축시키는 단계는 항온처리 혼합물을 항온처리하기 전에 항온처리 혼합물을 전처리하는 단계를 포함할 수 있다. 가용성 미스폴딩된 단백질을 선택적으로 농축시키는 단계는 하나 이상의 특이적 항체를 가용성 미스폴딩된 단백질과 접촉시켜 포획된 가용성 미스폴딩된 단백질을 형성하는 단계를 포함할 수 있다.

예를 들어, AD의 경우, 하나 이상의 가용성 미스폴딩된 단백질 특이적 항체는 6E10, 4G8, 82E1, A11, X-40/42, 16ADV; 등 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 이러한 항체는 하기와 같이 얻어질 수 있다: 6E10 및 4G8(Covance(뉴저지주 프린스턴)); 82E1(IBL America(미네소타주 미니아폴리스)); A11(Invitrogen(캘리포니아주 칼스바드)); X-40/42(MyBioSource, Inc.(캘리포니아주 샌 디에고)); 및 16ADV (Acumen Pharmaceuticals(캘리포니아주 리버모어)).

추가로, PD의 경우, 예를 들어 하나 이상의 가용성 미스폴딩된 단백질 특이적 항체는 α/β-시누클레인 N-19; α-시누클레인 C-20-R; α-시누클레인 211; α-시누클레인 Syn 204; α-시누클레인 2B2D1; α-시누클레인 LB 509; α-시누클레인 SPM451; α-시누클레인 3G282; α-시누클레인 3H2897; α/β-시누클레인 Syn 202; α/β-시누클레인 3B6; α/β/γ-시누클레인 FL-140; 등 중 하나 이상을 포함하는 PD 특이적 항체를 포함할 수 있다. 몇몇 예에서, 하나 이상의 가용성 미스폴딩된 단백질 특이적 항체는 α/β-시누클레인 N-19; α-시누클레인 C-20-R; α-시누클레인 211; α-시누클레인 Syn 204; 등 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 이러한 항체는 하기와 같이 얻어질 수 있다: α/β-시누클레인 N-19(카탈로그 SC-7012호, Santa Cruz Biotech(텍사스주 달라스)); α-시누클레인 C-20-R(SC-7011-R); α-시누클레인 211(SC-12767); α-시누클레인 Syn 204(SC-32280); α-시누클레인 2B2D1(SC-53955); α-시누클레인 LB 509(SC-58480); α-시누클레인 SPM451(SC-52979); α-시누클레인 3G282(SC-69978); α-시누클레인 3H2897(SC-69977); α/β-시누클레인 Syn202 (SC-32281); α/β-시누클레인 3B6(SC-69699); 또는 α/β/γ-시누클레인 FL-140 (SC-10717).

추가로, 하나 이상의 가용성 미스폴딩된 단백질 특이적 항체는 가용성 미스폴딩된 단백질의 아미노산 서열에 특이적인 항체 또는 가용성 미스폴딩된 단백질의 입체배좌에 특이적인 항체 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 하나 이상의 가용성 미스폴딩된 단백질 특이적 항체는 고상에 커플링될 수 있다. 고상은 자기 비드 및 다중웰 플레이트 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

예를 들어, ELISA 플레이트는 환자 샘플로부터의 가용성 미스폴딩된 단백질을 포획하기 위해 사용된 항체에 의해 코팅될 수 있다. 항체 코팅된 ELISA 플레이트는 환자 샘플과 항온처리될 수 있고, 비결합 물질은 세척될 수 있고, PMCA 반응이 수행될 수 있다. 항체는 또한 비드에 커플링될 수 있다. 비드는 환자 샘플과 항온처리되고, 환자 샘플의 나머지로부터 가용성 미스폴딩된 단백질-항체 복합체를 분리하도록 사용될 수 있다.

다양한 실시형태에서, 샘플을 단량체성 폴딩된 단백질과 접촉시켜 항온처리 혼합물을 형성하는 단계는 몰 초과의 단량체성 폴딩된 단백질을 포획된 가용성 미스폴딩된 단백질을 포함하는 샘플과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 몰 초과의 단량체성 폴딩된 단백질은 상기 포획된 가용성 미스폴딩된 단백질에 포함된 단백질 단량체의 전체 몰 양보다 많을 수 있다. 항온처리 혼합물을 항온처리하는 단계는 미스폴딩된 단백질의 증폭된 부분을 형성하기 위해 포획된 가용성 미스폴딩된 단백질의 존재 하에 단량체성 폴딩된 단백질의 적어도 일부의 미스폴딩 및/또는 응집을 발생시키기에 효과적일 수 있다.

몇몇 실시형태에서, 단백질 응집체는 단량체 단백질, 가용성 미스폴딩된 단백질 및 가용성 미스폴딩된 단백질의 포획된 형태 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

몇몇 실시형태에서, 항온처리 혼합물을 물리적으로 파괴하는 단계는 음파처리, 교반, 진탕, 동결/해동, 레이저 조사, 오토클레이브 항온처리, 고압, 균질화 등 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 교반은 순환 교반을 포함할 수 있다. 순환 교반은 약 50분당 회전수(rotation per minute; RPM) 내지 10,000RPM에서 수행될 수 있다. 순환 교반은 약 200RPM 내지 약 2000RPM에서 수행될 수 있다. 순환 교반은 약 500RPM에서 수행될 수 있다.

다양한 실시형태에서, 항온처리 혼합물을 물리적으로 파괴하는 단계는 약 5초 내지 약 10분, 약 30초 내지 약 1분, 약 45초 내지 약 1분 동안, 약 1분 등 동안 각각의 항온처리 사이클에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 항온처리 혼합물을 물리적으로 파괴하는 단계는 약 5초 내지 약 10분, 약 30초 내지 약 1분, 약 45초 내지 약 1분 동안의 하나 이상 동안, 약 1분 등 동안 진탕시킴으로써 각각의 항온처리 사이클에서 수행될 수 있다. 항온처리 혼합물을 항온처리하는 단계는 약 5분 내지 약 5시간, 약 10분 내지 약 2시간, 약 15분 내지 약 1시간, 약 25분 내지 약 45분 등의 시간 동안 각각의 항온처리 사이클에서 독립적으로 수행될 수 있다. 각각의 항온처리 사이클은 약 5분 내지 약 5시간의 항온처리 및 약 5초 내지 약 10분의 물리적 파괴; 약 10분 내지 약 2시간의 항온처리 및 약 30초 내지 약 1분의 물리적 파괴; 약 15분 내지 약 1시간의 항온처리 및 약 45초 내지 약 1분의 물리적 파괴; 약 25분 내지 약 45분의 항온처리 및 약 45초 내지 약 1분의 물리적 파괴; 및 약 1분의 항온처리 및 약 1분의 물리적 파괴 중 하나 이상에 대해 항온처리 혼합물을 항온처리하고 물리적으로 파괴하는 단계를 독립적으로 포함할 수 있다.

항온처리 사이클을 수행하는 단계는 약 2회 내지 약 1000회, 약 5회 내지 약 500회, 약 50회 내지 약 500회, 약 150회 내지 약 250회 등으로 반복될 수 있다. 항온처리 혼합물을 항온처리하는 단계는, 각각의 항온처리 사이클에서, 약 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50℃, 또는 선행하는 값들 중 임의의 2값 사이, 예를 들어 약 15℃ 내지 약 50℃ 사이의 범위의 온도에서 독립적으로 수행될 수 있다.

몇몇 실시형태에서, 샘플을 단량체성 폴딩된 단백질과 접촉시켜 항온처리 혼합물을 형성하는 단계는 생리학적 조건 하에 수행될 수 있다. 샘플을 단량체성 폴딩된 단백질과 접촉시켜 항온처리 혼합물을 형성하는 단계는 몰 초과의 단량체 단백질과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 몰 초과는 샘플에서 가용성 미스폴딩된 단백질에 포함된 단백질 단량체의 전체 몰 양보다 많을 수 있다. 단량체성 폴딩된 단백질 및/또는 가용성 미스폴딩된 단백질은, 예를 들어 단량체성 폴딩된 단백질 및/또는 가용성 미스폴딩된 단백질의 단백질분해 전달에 의해 형성된, 하나 이상의 펩타이드를 포함할 수 있다. 예를 들어, AD의 경우, 단량체성 폴딩된 단백질 및/또는 가용성 미스폴딩된 단백질은 아밀로이드 전구체 단백질의 β- 또는 γ-세크레타제 절단을 통해 형성된 하나 이상의 펩타이드를 포함할 수 있다. 예를 들어, AD의 경우, 단량체성 폴딩된 단백질 및/또는 가용성 미스폴딩된 단백질은 A베타40 및 A베타42 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 추가로, 예를 들어 PD의 경우, 단량체성 폴딩된 단백질 및/또는 가용성 미스폴딩된 단백질은 αS-140의 단백질분해 절단을 통해 형성된 하나 이상의 펩타이드를 포함할 수 있다. 단량체의 αS 단백질 및/또는 가용성 올리고머의 αS 단백질은 αS-140, αS-126, αS-112 등 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, "αS-140"은 전장, 140개의 아미노산 α-시누클레인 단백질을 의미한다. 다른 동형단백질은 예를 들어 엑손 3의 소실로 인해 41-54 잔기가 부족한 알파-시누클레인-126인 "αS-126"; 및 예를 들어 엑손 5의 소실로 인해 103-130 잔기가 부족한 알파-시누클레인-112인 "αS-112"를 포함할 수 있다.

다양한 실시형태에서, 단량체성 폴딩된 단백질은 비재조합 생물학적 샘플로부터의 화학 합성, 재조합 제조 및 추출 중 하나에 의해 제조될 수 있다. 가용성 미스폴딩된 단백질은 실질적으로 가용성 미스폴딩된 응집체일 수 있다. 미스폴딩된 단백질의 증폭된 부분은 실질적으로 가용성 미스폴딩된 응집체 및 불용성 미스폴딩된 응집체의 증폭된 부분 중 하나 이상이다.

다양한 실시형태에서, 샘플에서의 가용성 미스폴딩된 단백질의 존재를 결정하기 위한 키트가 제공된다. 키트는 공지된 양의 단량체성 폴딩된 단백질 및 공지된 양의 가용성 미스폴딩된 단백질의 표시자 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 키트는 설명서를 포함할 수 있다. 설명서는 본 명세서에 기재된 임의의 방법을 수행하도록 사용자에게 지시할 수 있다. 예를 들어, 설명서는 항온처리 혼합물을 형성하도록 샘플을 공지된 양의 단량체성 폴딩된 단백질 및 공지된 양의 가용성 미스폴딩된 단백질의 표시자 중 하나 이상과 접촉하도록 사용자에게 지시할 수 있다. 설명서는 미스폴딩된 단백질의 증폭된 부분을 형성하기에 효과적인 항온처리 사이클을 2회 이상 수행하도록 사용자에게 지시할 수 있다. 각각의 항온처리 사이클은 미스폴딩된 단백질의 증폭된 부분을 형성하도록 가용성 미스폴딩된 단백질의 존재 하에 단량체성 폴딩된 단백질의 적어도 일부의 미스폴딩 및/또는 응집을 발생시키기에 효과적인 항온처리 혼합물을 항온처리하는 단계를 포함할 수 있다. 각각의 항온처리 사이클은, 예를 들어 가용성 미스폴딩된 단백질을 방출시키도록, 존재하는 임의의 단백질 응집체의 적어도 일부를 파괴시키기에 효과적인 항온처리 혼합물을 물리적으로 파괴하는 단계를 포함할 수 있다. 설명서는 가용성 미스폴딩된 단백질을 검출함으로써 샘플에서의 가용성 미스폴딩된 단백질의 존재를 결정하도록 사용자에게 지시할 수 있다. 가용성 미스폴딩된 단백질은 가용성 미스폴딩된 단백질 및 미스폴딩된 단백질의 증폭된 부분을 포함할 수 있다.

다양한 실시형태에서, 키트는 공지된 양의 단량체성 폴딩된 단백질 및 공지된 앙의 가용성 미스폴딩된 단백질의 표시자를 포함할 수 있다. 키트는, 개별 플레이트 또는 장치 중 하나 이상, 조합 장치 등으로서 포함된, 다중벽 미세적정 플레이트; 미세유체 플레이트; 진탕 장치; 항온처리 장치; 및 형광 측정 장치 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 진탕 마이크로플레이트 판독기(예를 들어, FLUOstar OPTIMA, BMG LABTECH Inc.(노스캐롤라이나주 캐리))는 항온처리 및 진탕의 사이클을 수행하고, 실험의 과정 동안 ThT 형광 방출을 자동으로 측정하기 위해 사용될 수 있다.

키트의 몇몇 실시형태에서, 가용성 미스폴딩된 단백질의 표시자는 표시 상태 및 비표시 상태는 형광의 차이를 특징으로 할 수 있다. 설명서는 형광 분광학에 의해 샘플에서의 가용성 미스폴딩된 단백질의 존재를 결정하도록 사용자에게 지시할 수 있다.

키트의 몇몇 실시형태에서, 가용성 미스폴딩된 단백질의 표시자는 티오플라빈 T, 공고 레드, m-I-스틸벤, 크리사민 G, PIB, BF-227, X-34, TZDM, FDDNP, MeO-X-04, IMPY, NIAD-4, 발광성 공액 폴리티오펜, 형광 단백질, 예컨대 녹색 형광 단백질 및 황색 형광 단백질과의 융합체, 이들의 유도체 등 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 단량체성 폴딩된 단백질은 공유로 혼입된 방사성 아미노산, 공유로 혼입된, 동위원소 표지된 아미노산, 공유로 혼입된 형광단 등 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

키트의 다양한 실시형태에서, 설명서는 본 명세서에 기재된 임의의 방법을 수행하도록 사용자에게 지시할 수 있다. 예를 들어, 설명서는 샘플에서의 가용성 미스폴딩된 단백질의 양을 결정하도록 사용자에 대한 지시를 포함할 수 있다. 설명서는 웨스턴 블롯 검정, 도트 블롯 검정, 효소 연결 면역흡착 검정(ELISA), 티오플라빈 T 결합 검정, 공고 레드 결합 검정, 침강 검정, 전자 현미경검사법, 원자력 현미경검사법, 표면 플라스몬 공명, 분광학 등 중 하나 이상을 수행함으로써 가용성 미스폴딩된 단백질을 검출하도록 사용자에게 지시할 수 있다. 설명서는 항온처리 혼합물을 프로테아제와 접촉시키는 것; 및 웨스턴 블롯 검정, 도트 블롯 검정 및 ELISA 중 하나 이상에서 항-미스폴딩된 단백질 항체를 사용하여 가용성 미스폴딩된 단백질을 검출하는 것에 의해 가용성 미스폴딩된 단백질을 검출하도록 사용자에게 지시할 수 있다.

키트의 몇몇 실시형태에서, 설명서는 대상체로부터 샘플을 취하도록 사용자에게 지시할 수 있다. 설명서는 샘플에서의 가용성 미스폴딩된 단백질의 존재에 따라 대상체에서의 PMD의 존재를 결정하도록 사용자에게 지시하는 것을 포함할 수 있다. 샘플에서의 가용성 미스폴딩된 단백질의 존재는 대조군 대상체로부터 취해진 대조군 샘플과 비교하여 결정될 수 있다. 설명서는 샘플에서의 가용성 미스폴딩된 단백질의 양을 미리 결정된 한계치 양과 비교함으로써 대상체에서의 PMD의 존재를 결정하도록 사용자에게 지시할 수 있다. 설명서는 양수; 담즙; 혈액; 뇌척수액; 귀지; 피부; 삼출액; 대변; 위액; 림프; 젖; 점액, 예를 들어 코 분비물; 점막, 예를 들어 코 점막; 복막액; 혈장; 흉수; 고름; 타액; 피지; 정액; 땀; 활액; 눈물; 뇨; 등 중 하나 이상을 포함하는 샘플을 얻도록 사용자에게 지시할 수 있다. 설명서는, 샘플에서의 상기 가용성 미스폴딩된 단백질의 양을, 샘플과 비교하여 다른 시간에 대상체로부터 취해진 비교 샘플에서의 가용성 미스폴딩된 단백질의 양과 비교함으로써, 대상체에서의 PMD의 진행 또는 항상성을 결정하도록 사용자에게 지시할 수 있다.

설명서는 샘플 및 항온처리 혼합물 중 하나 이상에서 가용성 미스폴딩된 단백질을 선택적으로 농축시키도록 사용자에게 지시할 수 있다. 예를 들어, 키트는 가용성 미스폴딩된 단백질을 선택적으로 농축시키거나 포획하도록 구성된 하나 이상의 가용성 미스폴딩된 단백질 특이적 항체를 포함할 수 있다. 하나 이상의 가용성 미스폴딩된 단백질 특이적 항체는 가용성 미스폴딩된 단백질의 아미노산 서열에 특이적인 항체 및 가용성 미스폴딩된 단백질의 입체배좌에 특이적인 항체 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 설명서는 포획된 가용성 미스폴딩된 단백질을 형성하도록 하나 이상의 가용성 미스폴딩된 단백질 특이적 항체를 가용성 미스폴딩된 단백질과 접촉시킴으로써 가용성 미스폴딩된 단백질을 선택적으로 농축시키도록 사용자에게 지시할 수 있다. 하나 이상의 가용성 미스폴딩된 단백질 특이적 항체는 고상에 커플링되어 제공될 수 있다. 고상은 자기 비드 및 다중웰 플레이트 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

키트의 다양한 실시형태에서, 항온처리 혼합물을 물리적으로 파괴하기 위한 설명서는 음파처리, 교반, 진탕, 동결/해동, 레이저 조사, 오토클레이브 항온처리, 고압, 균질화 등 중 하나 이상을 이용하도록 사용자에게 지시할 수 있다. 설명서는 본 명세서에 기재된 임의의 RPM 범위, 예를 들어 약 50RPM 내지 10,000RPM에 따라 순환 교반을 수행하도록 사용자에게 지시할 수 있다. 설명서는 본 명세서에 기재된 임의의 시간 범위, 예를 들어 약 5초 내지 약 10분에 따라 각각의 항온처리 사이클에서 물리적 파괴를 수행하도록 사용자에게 지시할 수 있다. 설명서는 본 명세서에 기재된 임의의 시간 범위에 따라, 예를 들어 약 5분 내지 약 5시간의 시간 동안 각각의 항온처리 사이클에서 항온처리 혼합물을 항온처리하도록 사용자에게 지시할 수 있다. 항온처리 사이클을 수행하기 위한 설명서는 본 명세서에 기재된 임의의 반복 수, 예를 들어 약 2회 내지 약 1000회 동안 항온처리 사이클을 수행하도록 사용자에게 지시할 수 있다. 항온처리 사이클을 수행하기 위한 설명서는 약 15℃ 내지 약 50℃의 온도에서 항온처리하도록 사용자에 대한 지시를 포함할 수 있다.

키트의 다양한 실시형태에서, 단량체성 폴딩된 단백질은 비재조합 생물학적 샘플로부터의 화학 합성, 재조합 제조 및 추출 중 하나에 의해 제조될 수 있다. 가용성 미스폴딩된 단백질은 실질적으로 가용성 미스폴딩된 응집체일 수 있다. 미스폴딩된 단백질의 증폭된 부분은 실질적으로 가용성 미스폴딩된 응집체 및 불용성 미스폴딩된 응집체의 증폭된 부분 중 하나 이상이다.

실시예

실시예 1: 합성 Aβ 올리고머의 제조

Aβ1-42를 예일대학교(Yale University)의 W. Keck 시설에서 고상 N-tert-뷰틸옥시카보닐 화학을 이용하여 합성하고 역상 HPLC에 의해 정제하였다. 최종 생성물을 동결건조시키고 아미노산 분석 및 질량 분광법에 의해 규명하였다. 응집된 미스폴딩된 Aβ 단백질이 없는 스톡 용액을 제조하기 위해, 응집체를 높은 pH 용해시키고 30kDa 컷오프 필터를 통해 여과시켜 남은 응집체를 제거하였다. 상이한 유형의 응집체를 제조하기 위해, 시드 비함유 Aβ1-42(10μM)의 용액을 교반에 의해 0.1M 트리스-HCl(pH 7.4) 중에 25℃에서 상이한 시간 동안 항온처리하였다. 이 제제는 항온처리 시간에 따라 Aβ 단량체, 및 명확한 비율의 섬유, 원섬유 및 가용성 미스폴딩된 Aβ 단백질의 혼합물을 함유하였다. 응집의 정도를 ThT 형광 방출, 음성 염색 후 전자 현미경검사법, A11 구조형태학적 항체에 의한 도트 블롯 연구 및 4G8 항-Aβ 항체를 사용한 겔 전기영동 후 웨스턴 블롯에 의해 규명하였다.

상이한 크기의 Aβ 올리고머의 혼합물을 섬유 형성의 과정 동안 생성하였다. 구체적으로, 가용성 미스폴딩된 Aβ 단백질을 교반하면서 25℃에서 단량체 합성 Aβ1-42(10μM)의 항온처리에 의해 제조하였다. 항온처리의 5시간 후, 외관이 구형인 가용성 미스폴딩된 Aβ 단백질의 풍부도가 음성 염색 후 전자 현미경검사법에 의해 관찰되었고, 오직 적은 양의 원섬유 및 섬유가 관찰되었다. 10시간에 대부분 원섬유가 있고, 24시간에 다량의 긴 섬유가 관찰되었다. 도 1a는 항온처리의 0시간, 5시간, 10시간 및 24시간에 취한 전자 현미경사진을 보여준다.

가용성 미스폴딩된 Aβ 단백질 응집체를 케이드(Kayed) 등의 문헌["Common structure of soluble amyloid oligomers implies common mechanism of pathogenesis," Science 2003, 300, 486-489]의 방법에 따라 A11 항-올리고머 특이적 항체를 사용하여 양성 시험하였다. 10시간 및 24시간에서의 추가의 항온처리 후, 원섬유상 및 섬유상 구조가 관찰되었다. 응집체의 크기를 한정된 기공 크기의 필터를 통한 여과 및 SDS-PAGE 분리 후 웨스턴 블로팅에 의해 결정하였다. 5시간 후 항온처리에 의해 형성된 가용성 미스폴딩된 Aβ 단백질은 30kDa 컷오프의 필터에 보유되고, 1000kDa 컷오프 필터를 통해 통과하였다. 도 1b는 가용성 미스폴딩된 Aβ 단백질 응집체의 웨스턴 블롯이다. 이 가용성 미스폴딩된 Aβ 단백질의 전기영동 분리는 대부분의 물질이 17kDa에서의 약간의 밴드로 -170kDa SDS-저항 응집체로서 이동한다는 것을 보여준다.

실시예 2: Aβ- PMCA는 합성 Aβ 올리고머를 검출한다

실시예 2A. 상이한 분량의 합성 가용성 미스폴딩된 Aβ 단백질(대조군(Aβ 올리고머 무); 또는 합성 가용성 미스폴딩된 Aβ 단백질에서의 3, 80, 300 및 8400펨토몰)과 함께 또는 이것 없이 티오플라빈 T의 존재 하에 시드 비함유 Aβ1-42의 용액을 항온처리함으로써 Aβ 응집의 시딩을 연구하였다. Aβ-PMCA 일반 절차: 0.1M 트리스-HCl(pH 7.4) 중의 2μM 응집체 비함유 Aβ1-42의 용액(200㎕의 전체 용적)을 불투명 96웰 플레이트에 위치시키고, 단독으로 또는 합성 Aβ 응집체(실시예 1에 기재된 바대로 5시간에 걸쳐 항온처리에 의해 제조됨) 또는 40㎕의 CSF 분취량의 존재 하에 항온처리하였다. 샘플을 5μM 티오플라빈 T(ThT)의 존재 하에 항온처리하고 22℃의 일정한 온도에서 에펜도르프(Eppendorf) 열혼합기를 사용하여 순환 교반(500rpm에서 1분, 이어서 진탕 없이 29분)으로 처리하였다. 다양한 시점에서, 플레이트 분광형광계를 사용하여 435㎚에서 여기 후 485㎚에서 플레이트에서 ThT 형광을 측정하였다. 도 2a는, 표시된 펨토몰 농도의 합성 가용성 미스폴딩된 Aβ 단백질 시드를 사용하여, 티오플라빈 T 형광에 의해 측정된 바와 같은 시간에 대한 (순환 증폭이 없는) 아밀로이드 형성의 그래프이다. 재현 가능성 및 유도기의 정도를 제어하도록 펩타이드 농도, 온도 및 완충제의 pH를 실험 중에 모니터링하였다. 이 조건 하에, 실험이 수행되는 시간(125시간) 동안 자발적인 Aβ 응집이 검출되지 않았다. 실시예 1의 0.3 내지 8.4fmol의 합성 가용성 미스폴딩된 Aβ 단백질의 존재 하에 단량체의 Aβ1-42 단백질의 응집을 관찰하였다.

실시예 2B: 항온처리 및 물리적 파괴의 단계를 조합한 증폭 사이클을 이용하였다. 순환 교반(500rpm에서의 1분 교반, 이어서 진탕 없이 29분 교반)에 의해 도 2a에서와 동일한 샘플을 항온처리하였다. 플레이트 분광형광계(여기: 435; 방출: 485㎚)를 사용하여 아밀로이드 섬유에 결합하는 티오플라빈 T(ThT)에 의해 시간에 따라 응집을 측정하였다. 그래프는 3회 반복의 평균 및 표준 오차를 보여준다. 170kDa의 평균 분자량을 가정하여 Aβ 올리고머의 농도를 예측하였다. 도 2b는 실 시예 1의 합성 가용성 미스폴딩된 Aβ 단백질의 다양한 농도에 대한 시간의 함수로서 ThT 형광에 의해 측정된 증폭된 사이클 가속 아밀로이드 형성을 보여주는 그래프이다. 이 조건 하에, 8400, 300, 80 및 3fmol의 합성 가용성 미스폴딩된 Aβ 단백질에 의해 유도된 단량체의 Aβ1-42 단백질의 응집은 합성 가용성 미스폴딩된 Aβ 단백질의 부재 하에 관찰된 것보다 명확히 빠르고 이것으로부터 더 용이하게 구별되었다. 이 결과는 검출 한계가 이 조건 하에 소정의 샘플에서 3fmol 이하의 가용성 미스폴딩된 Aβ 단백질이라는 것을 표시한다.

실시예 3: Aβ- PMCA는 AD 환자의 뇌척수액에서 미스폴딩된 Aβ 를 검출한다

50명의 AD 환자, 비퇴행성 신경학적 질환(NND)에 의해 이환된 39명의 인지에서 정상인 개체 및 치매의 다른 형태를 포함하는 비-AD 신경퇴행성 질환(NAND)에 의해 이환된 37명의 환자로부터 분취량의 CSF를 얻었다. DSM-IV 및 NINCDS-ADRA 가이드라인(McKhann et al., 1984)에 의해 정의되고, 통상적인 의학 검사, 신경학적 평가, 신경심리학적 평가, 자기 공명 영상화 및 Aβ1-42, 전체 Tau 및 포스포-Tau의 CSF 수치의 측정을 포함하는 다양한 시험을 이용하여 결정된 바와 같은, 개연성 있는 AD의 진단을 가지는 50명의 환자로부터 시험 CSF 샘플을 얻었다. 샘플 수집 시에 AD 환자의 평균 연령은 71.0±8.1세(범위 49-84)이었다. 12개의 사례의 정상압수두증, 말초 신경병증을 가지는 7명의 환자, 다양한 형태의 뇌 종양을 가지는 7명, ICTUS를 가지는 2명, 심각한 두통을 가지는 1명, 뇌염을 가지는 3명, 고혈압을 가지는 1명 및 확실하지 않은 진단을 가지는 6명을 포함하는, 비퇴행성 신경학적 질환(NND)에 의해 이환된 39명의 환자로부터 대조군 CSF 샘플을 얻었다. 이 환자 군으로부터 CSF 샘플이 취해진 평균 연령은 64.6±14.7세(범위 31-83)였다. 10사례의 전두측두엽 치매(5명의 행동 및 5명의 언어 변형), 파킨슨병을 가지는 6명의 환자(치매와 연관된 4명 및 운동 뉴런 질환을 가지는 1명을 포함), 진행성 핵상 마비를 가지는 6명, 척수소뇌성 실조증을 가지는 6명(치매와 연관된 1명), 근위축성 측삭 경화증을 가지는 4명, 헌팅턴병을 가지는 2명, MELAS를 가지는 1명, 루이소체 치매를 가지는 1명 및 맥관 치매를 가지는 1명을 포함하는, 비-AD 신경퇴행성 질환(NAND)에 의해 이환된 37명의 환자로부터 대조군 CSF 샘플을 또한 취했다. 이 군에 대한 샘플 수집에서의 평균 연령은 63.8±11.1세(범위 41-80)였다. 하룻밤 공복 후 무상침에 의해 L4/L5 또는 L3/L4 간극에서의 요추 천자 후 폴리프로필렌 관에서 CSF 샘플을 수집하였다. 샘플을 4℃에서 3분 동안 3,000 g에서 원심분리하고, 분취하고 분석까지 -80℃에서 저장하였다. CSF 세포 계수, 포도당 및 단백질 농도를 결정하였다. 비율 비탁법에 의해 알부민을 측정하였다. 혈액 뇌 장벽의 통합성 및 척수강내 IgG 생성을 평가하기 위해, 알부민 몫(CSF 알부민/혈청 알부민) X 10³ 및 IgG 지수(CSF 알부민/혈청 알부민)/(CSF IgG/혈청 IgG)를 계산하였다. 연구를 헬싱키 선언(Helsinki Declaration)의 조항에 따라 수행하고, 윤리 위원회(Ethics Committee)에 의해 승인받았다.

실험, 및 분석의 초기 부분을 맹검으로 수행하였다. 도 3a는 AD, NND 및 NAND 군으로부터의 5개의 각각의 샘플의 Aβ 응집의 평균 동역학을 보여주는, ThT 형광 표지의 함수로서 측정된, 시간에 따른 아밀로이드 형성의 그래프이다.

결과는 AD 환자로부터의 CSF가 대조군 CSF와 비교하여 Aβ 응집을 유의미하게 가속시킨다는 것을 나타낸다(P<0.001). 인간 CSF 샘플의 존재 하의 Aβ 응집 동역학의 차이의 유의성을 일방향 ANOVA, 이어서 사후 터키 다중 비교에 의해 분석하였다. 유의성의 수준을 P<0.05로 설정하였다. 다른 2개의 군으로부터의 샘플과 AD 사이의 차이는 P<0.001로 유의미하게 높았다(^***).

도 3b는 AD, NND 및 NAND 군으로부터의 샘플에 대한 h 단위의 유도기 시간의 그래프이다. Aβ 응집에 대한 개별 샘플의 영향을 결정하기 위해, 대조군 완충제 샘플의 공제 후 40 임의 단위보다 큰 ThT 형광에 대한 시간으로 정의된, 유도기를 예측하였다. 이 값은 이것이 대조군 완충제 샘플의 판독의 약 5배에 상응한다는 것을 고려하여 선택되었다.

도 3c는 180 Aβ-PMCA 사이클 후, 즉 항온처리의 90h 후(P90) 얻어진 아밀로이드 형성의 정도를 보여주는 그래프이다. 실험 군 사이에 유도기 및 P90의 비교는 비퇴행성 신경학적 질환 또는 비-AD 신경퇴행성 질환을 가지는 개체로부터의 대조군 샘플과 AD 사이의 유의미한 차이를 나타낸다. 추가로, 응집 매개변수와 AD 환자의 연령 사이에 상관관계가 검출되지 않았고, 이것은 마커의 수준이 환자 연령이 아니라 환자 CSF에서의 응집된 Aβ 단백질에 상응한다는 것을 나타낸다.

도 5, 표 1은 유도기 수를 이용하여 계산된, Aβ-PMCA 시험의 민감도, 특이성 및 예측 값의 예측을 보여준다.

재현 가능성을 연구하기 위해, 도 3a-도 3c에 도시된 것과 유사한 실험을 Aβ-PMCA에 대한 기질과 상이한 샘플, 시약 및 Aβ 펩타이드의 새로운 배취(batch)에 의해 독립적으로 수행하였다. 300 Aβ-PMCA 사이클 후, 즉 항온처리의 150h 후(P150) 얻어진 아밀로이드 형성의 정도를 각각의 환자에서 측정하였다. 대조군은 다른 신경퇴행성 질환 및 신경학적 이외로 아픈 환자에 의해 이환된 사람 둘 다를 포함한다. 각각의 샘플에 대한 데이터는 2회 반복 관의 평균을 나타낸다. 스튜던트 t 시험에 의해 통계 차이를 분석하였다. 도 6은 300 Aβ-PMCA 사이클 후, 즉 항온처리의 150h 후(P90) 얻어진 샘플에 대한 h 단위의 유도기 시간의 그래프이다.

연구의 과정 동안, 제4 위치로부터 생긴 CSF 샘플의 전체 세트는 많은 농도의 합성 올리고머에 의한 스파이킹 후에도 전혀 응집하지 않았다. 샘플 수집 동안 시약 오염이 검정을 방해하는 것으로 예상된다.

유도기, A50 및 P90을 포함하는 다양한 상이한 동역학 매개변수의 예측에 의해 상이한 샘플 사이의 응집 동역학의 차이를 평가하였다. 유도기는 완충제 단독의 배경 값의 5배보다 높은 ThT 형광에 도달하는 데 필요한 시간으로 정의된다. A50은 최대 응집의 50%에 도달하는 시간에 상응한다. P90은 90시간에 (ThT 형광으로 측정된) 응집의 정도에 상응한다. 민감도, 특이성 및 예측 값은 이 데이터를 이용하여 결정되고, 컷오프 한계치는 MedCalc 소프트웨어(MedCalc 소프트웨어(벨기에 오스땅드))를 사용하여 수용자 작용 특징(Receiver Operating Characteristics; ROC) 곡선 분석에 의해 결정된다.

실시예 4: CSF에서의 AD의 Aβ- PMCA 검출에 대한 미스폴딩된 Aβ 의 한계치 값의 결정

도 5, 표 1의 지원에서, 민감도, 특이성 및 예측 값은 유도기 데이터를 이용하여 결정되고, 컷오프 한계치는 MedCalc 소프트웨어(버전 12.2.1.0, MedCalc(벨기에))를 사용하여 수용자 작용 특징(ROC) 곡선 분석에 의해 결정된다. 도 5, 표 1에 도시된 바대로, 비퇴행성 신경학적 질환을 가지는 연령 일치 개체로 이루어진 대조군에 대해 90.0%의 민감도 및 84.2%의 특이성이 예측되었다. 반대로, 다른 형태의 치매를 포함하는 다른 신경퇴행성 질환으로부터의 AD의 임상적으로 더 관련된 구별에 대해, 100%의 민감도 및 94.6%의 특이성이 예측되었다. 다른 형태의 신경퇴행성 질환으로부터 AD를 구별하는 Aβ-PMCA의 이 능력은 임상적으로 유의미하다. 모든 대조군 개체를 고려한 전체 민감도 및 특이성은 각각 90% 및 92%이었다.

대조군으로부터 AD 환자를 구별하는 Aβ-PMCA 시험의 성능을 평가하기 위해, 상이한 컷오프 점에 대해 위양성율(특이성)의 함수로서 진양성율(민감도)을 작도하였다. 이 분석의 경우, AD 대 NAND(도 4a), AD 대 NND(도 4b) 및 AD 대 모든 대조군 샘플(도 4c)에 대한 유도기 값을 이용하였다. 곡선 하 면적으로 예측된, 시험의 성능은 각각 NAND, NND를 가지는 AD 및 모든 대조군의 비교에 대해 0.996±0.0033, 0.95±0.020 및 0.97±0.011이었다. 통계 분석을 MedCalc ROC 곡선 분석 소프트웨어(버전 12.2.1.0)를 사용하여 수행하고, 결과는 시험이 P<0.0001로 대조군으로부터 AD를 구별할 수 있다는 것을 보여준다. 상이한 세트의 군 비교를 위한 가장 신뢰할 만한 컷오프 점을 예측하기 위해, 각각의 컷오프 값에 대해 민감도(청색 선) 및 특이성(적색 선)을 작도하였다(도 4d). 그래프는 AD 대 모든 대조군 샘플(NAND 및 NND 군을 포함)에 대한 곡선 및 95%의 신뢰 간격을 보여준다. 이 컷오프 값은 도 5, 표 1에서 민감도, 특이성 및 예측 값을 예측하기 위해 사용되었다.

실시예 5: Aβ-올리고머 면역고갈은 인간 뇌척수액에서 Aβ 시드를 제거하고, AD CSF에서의 가용성 미스폴딩된 Aβ 단백질을 검출한다는 것을 확인시켜준다

Aβ-PMCA가 CSF에 존재하는 가용성 미스폴딩된 Aβ 단백질에 연관된 시딩 활성을 검출한다는 것을 확인하도록 면역고갈 실험을 수행하였다. 가용성 미스폴딩된 Aβ 단백질의 효율적인 면역고갈에 대한 방법론은 합성으로 제조된 가용성 미스폴딩된 Aβ 단백질에 의해 처음에 최적화되었다. Aβ의 순서를 특이적으로 인식하는 항체(4G8) 및 구조형태학적(A11) 항체의 혼합물과 접합된 다이나비드(dynabead)와의 항온처리에 의해 면역고갈을 수행하였다. 도 7a는 인간 CSF로 스파이킹된 합성으로 제조된 Aβ 올리고머를 사용한 면역고갈의 결과를 보여주는 웨스턴 블롯이다. 가용성 미스폴딩된 Aβ 단백질은 이 면역고갈에 의해 효율적으로 제거되었다.

도 7a 및 도 7b는, AD CSF에서의 시딩 활성이 가용성 미스폴딩된 Aβ 단백질 면역고갈에 의해 제거된다는 것을 보여주는, 티오플라빈 T 형광에 의해 측정된 바와 같은 시간에 대한 아밀로이드 형성의 그래프이다. 4G8 및 A11 항체에 의한 면역고갈 전에 또는 후에 AD CSF의 샘플을 사용하여 Aβ-PMCA 검정에서의 Aβ 응집을 시딩하였다. 면역고갈은 3개의 AD CSF에 적용되었다. 도 7b는 대조군 및 면역고갈된 CSF 샘플의 동역학을 보여주는 그래프이다. 도 7b는, 면역고갈된 AD CSF의 경우, Aβ-PMCA 반응에서의 Aβ 응집의 동역학이 대조군 CSF 샘플에서 관찰되는 것과 필적하고, 둘 다 면역고갈 전에 AD CSF 에 의해 관찰된 응집과 유의미하게 다르다는 것을 보여준다. 도 7c는, 오직 A11 구조형태학적 항체에 의해 고갈된, 대조군 및 면역고갈된 CSF 샘플 및 Aβ-PMCA 검정에 의해 모니터링된 응집의 동역학을 보여주는 그래프이다. 도 7c는 미스폴딩된 Aβ를 특이적으로 인식하는 A11 구조형태학적 항체를 사용하여 면역고갈된 AD CSF를 사용하여 얻어진 유사한 결과를 보여준다. 이 결과는 Aβ-PMCA가 AD CSF에서 가용성 미스폴딩된 β 단백질을 검출한다는 것을 확인시켜준다.

실시예 6: 고상 면역 포획

도 8a 및 도 8b는 복잡한 샘플, 예컨대 혈액 혈장으로부터 가용성 미스폴딩된 Aβ 단백질을 포획하기 위해 사용된 2개의 고상 방법의 도식적 표시이다. 전략 1은 ELISA 플레이트에서 고상에 결합한 특이적 항체에 의해 예비 코팅된 ELISA 플레이트를 사용하였다. 플레이트를 세척 후, 동일한 플레이트에서 Aβ-PMCA 반응을 수행하였다. 전략 2는 특이적 항체에 의해 코팅된 고상으로서 자기 비드를 사용하였다. 이 접근법은 샘플의 농도를 제공하였다.

실시예 7: 면역 포획의 특이성

도 9는 Aβ 올리고머를 포획하는 특이적 항체의 능력을 보여주는 표 2를 보여준다. 상부 패널은 이 연구에 사용된 다양한 순서 항체의 Aβ 단백질에서의 에피토프 인식 부위의 도시적 표시를 보여준다. 도 9에서의 표 2는 Aβ 올리고머를 포획하는 상이한 순서 또는 구조형태학적 항체의 효율을 입증한다. 건강한 인간 혈액 혈장에서 합성 Aβ 올리고머를 스파이킹하고 Aβ-PMCA에 의해 검출함으로써 올리고머를 포획하는 능력을 측정하였다. 기호는 상이한 항체를 사용한 검출 한계가 <12fmol(+++); 10-100fmol(++); >1pmol(+) 및 시약의 포획 없는 것보다 유의미하게 높지 않음(-)이라는 것을 나타낸다.

실시예 8: 인간 혈장에서 스파이킹된 Aβ 올리고머의 검출

도 10은, 인간 혈장에서 스파이킹된 가용성 미스폴딩된 Aβ 단백질의 검출을 보여주는, 티오플라빈 T 형광에 의해 측정된 바와 같은 시간에 대한 아밀로이드 형성의 그래프이다. 단백질 G에 의해 예비 코팅된 ELISA 플레이트를 항-구조형태학적 항체(Acumen사제의 16AD)에 의해 코팅하였다. 이후, 플레이트를 그대로의(대조군) 또는 상이한 농도의 합성 가용성 미스폴딩된 Aβ 단백질에 의해 스파이킹된 인간 혈액 혈장(100㎕)과 항온처리하였다. 항온처리 후, 플레이트를 Aβ40 단량체(2μM) 및 ThT(5μM)의 존재 하에 Aβ-PMCA(29분 항온처리 및 30초 진탕)로 처리하였다. 티오플라빈 형광에 의해 아밀로이드 형성을 측정하였다. 도 10은 유사하게 작업된 3개의 상이한 항체에 의해 수행된 여러 실험을 대표한다.

실시예 9: 대조군에 대한 AD 환자 샘플로부터의 가용성 미스폴딩된 Aβ의 포획

도 11은 AD 환자 및 대조군으로부터의 혈장 샘플에서 Aβ-PMCA 검정에서 50% 응집에 도달하는 시간을 보여주는 그래프이다. AD, 비-AD 신경퇴행성 질환(NAD), 및 건강한 대조군에 의해 이환된 환자로부터의 혈액 혈장 샘플을 항-Aβ 항체(82E1) 코팅된 비드와 항온처리하였다. Aβ-PMCA를 실시예 2에 기재된 바대로 수행하였다. 각각의 군에서의 개별 환자에서 50% 응집에 도달하는 데 필요한 시간을 기록하였다. 일방향 ANOVA, 이어서 터키 사후 시험에 의해 차이를 분석하였다. 이 데이터의 ROC 분석은 대조군으로부터 AD 환자를 정확하게 확인하기 위한 82%의 민감도 및 100%의 특이성을 보여준다.

실시예 10: 음파처리 및 진탕은 다양한 검출 방법에 의해 효과적이다

도 12는 단편 응집체에 대한 수단으로서 진탕 대신에 음파처리를 사용함으로써 Aβ 응집의 증폭의 결과를 보여주는 웨스턴 블롯이다. 명확한 분량의 합성 Aβ 올리고머의 존재 하에 실험을 수행하였다. 10㎍/㎖의 시드 비함유 단량체의 Aβ1-42의 샘플을 단독으로(레인 1) 또는 300(레인 2), 30(레인 3) 및 3(레인 4)fmol의 미스폴딩된 Aβ와 항온처리하였다. 샘플을 증폭 없이(비증폭된) 냉동시키거나 96 PMCA 사이클(증폭된)로 처리하고, 각각은 30분 항온처리, 이어서 20초 음파처리를 포함하였다. 프로테이나제 K(PK)에 의한 샘플의 처리 후 항-Aβ 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 응집된 Aβ를 검출하였다. 본 발명자들의 실험에서, 티오플라빈 T 형광을 이용한 검출이 음파처리에 적합하지 않지만, 물리적 파괴 방법으로서 진탕에 의해 매우 훌륭히 일한다는 것이 관찰되었다. 도 12는 Aβ 응집체에 대한 상이한 검출 방법, 이 경우에 웨스턴 블로팅을 이용하여 음파처리, 및 진탕이 일한다는 것을 보여준다.

실시예 11: PMCA 기질로서의 단량체의 Aβ의 생성

크기 배제 크로마토그래피에 의해 시드 비함유 단량체의 Aβ를 얻었다.

간단히 말하면, pH 7.5에서 10mM 인산나트륨에 의해 0.5㎖/분으로 용리된 Superdex 75 칼럼을 사용하여 다이메틸 설폭사이드에서 제조된 1㎎/㎖의 펩타이드 용액의 분취량을 분별화하였다. 220㎚의 UV 흡광도에 의해 피크가 검출될 것이다. Aβ의 단량체/이합체를 함유하는 4-10kDa 분자량에 상응하는 피크를 수집하고, 농도를 아미노산 분석에 의해 결정하였다. -80℃에서 샘플을 동결건조로 저장하였다.

실시예 12: Aβ의 제조 및 정제

pET28 GroES-Ub-Aβ42 플라스미드를 함유하는 이. 콜라이 세포를 37℃에서 루리아 브로쓰(Luria broth; LB) 중에 성장시키고, 0.4mM IPTG에 의해 발현을 유도하였다. 4시간 후, 세포를 수확하고, 용해 완충제(20mM 트리스-Cl, pH 8.0, 10mM NaCl, 0.1mM PMSF, 0.1mM EDTA 및 1mM β-머캅토에탄올) 중에 용해시키고, 30분 동안 18,000rpm에서 원심분리하였다. 봉입체를 6M 유레아를 함유하는 현탁 완충제(50mM 트리스-Cl, pH 8.0, 150mM NaCl 및 1mM DTT) 중에 재현탁시켰다. 30분 동안 18,000rpm에서 불용성 단백질을 원심분리에 의해 제거하였다. GroES-Ub-Aβ42 융합 단백질을 함유하는 상청액이 수집될 것이다. 융합 단백질로부터 Aβ42를 절단하기 위해, 융합 단백질을 재현탁 완충제에 의해 2회 희석하고, 2시간 동안 37℃에서 재조합 탈유비퀴틴화 효소(Usp2cc) 1:100 효소 대 기질 몰 비에 의해 처리하였다. 이후, 샘플을 C18 칼럼(25㎜ x 250㎜, Grace Vydac(미국))에 로딩하였다. Aβ42를 35분에 걸쳐 완충제 2의 20-40% 선형 구배를 이용하여 유속 10㎖/분에서 용매 시스템 완충제 1(30mM 아세트산암모늄, pH 10, 2% 아세토나이트릴) 및 완충제 2(70% 아세토나이트릴)에 의해 정제하였다. 정제된 Aβ42를 동결건조시키고 사용까지 -80℃에서 저장하였다.

실시예 13: PD- PMCA에 의한 αS 시드의 검출

실시예 13A: 상이한 분량의 합성 가용성 올리고머 αS 단백질: 대조군(αS 올리고머 무); 또는 1ng/㎖, 10ng/㎖, 100ng/㎖ 및 1㎍/㎖의 합성 가용성 올리고머 αS 단백질 시드와 함께 또는 이것 없이 티오플라빈 T의 존재 하에 시드 비함유 αS의 용액을 항온처리함으로써 αS 응집의 시딩을 연구하였다. αS-PMCA 일반 절차: PBS(pH 7.4) 중의 100㎍/㎖의 αS 시드 비함유 αS의 용액(200㎕의 전체 용적)을 불투명 96웰 플레이트에 위치시키고, 단독으로 또는 표시된 농도의 합성 αS 응집체 또는 40㎕의 CSF 분취량의 존재 하에 항온처리하였다. 샘플을 5μM 티오플라빈 T(ThT)의 존재 하에 항온처리하고 22℃의 일정한 온도에서 에펜도르프 열혼합기를 사용하여 순환 교반(500rpm에서 1분, 이어서 진탕 없이 29분)으로 처리하였다. 다양한 시점에서, 플레이트 분광형광계를 사용하여 435㎚에서 여기 후 485㎚에서 플레이트에서 ThT 형광을 측정하였다. 도 13a는, 표시된 농도의 합성 가용성 올리고머 αS 단백질 시드를 사용하여 PD-PMCA에 의해 시딩된 αS의 검출을 보여주는, 시간의 함수로서의 티오플라빈 T 형광의 그래프이다. 재현 가능성 및 유도기의 정도를 제어하도록 펩타이드 농도, 온도 및 완충제의 pH를 실험 중에 모니터링하였다. 합성 가용성 올리고머 αS 단백질 시드의 1ng/㎖, 10ng/㎖, 100ng/㎖ 및 1㎍/㎖의 αS의 존재 하에 단량체의 αS 단백질의 응집이 관찰되었다.

실시예 13B: 실시예 1A에서의 샘플을 사용하여 첨가된 αS 시드의 양의 함수로서의 50% 응집에 도달하는 시간을 결정하였다. 도 13b는 첨가된 αS 시드의 양의 함수로서 작도된 50% 응집에 도달하는 시간을 보여주는 그래프이다.

실시예 14: αS - PMCA는 PD 환자의 뇌척수액에서의 올리고머 αS를 검출한다

PD-PMCA에 의해 대조군 및 PD 환자로부터의 인간 CSF 샘플에서의 시딩 활성의 검출을 수행하였다. PBS(pH 7.4) 중의 정제된 시드 비함유 알파-시누클레인(100㎍/㎖)을 확인된 PD, AD 또는 비신경퇴행성 신경학적 질환(NND)을 가지는 인간 환자로부터의 CSF의 존재 하에 500rpm에서의 진탕에 의해 37℃에서 응집되게 하였다. 플레이트 분광형광계를 사용하여 435㎚에서의 여기 후 485㎚에서의 티오플라빈 형광에 의해 응집의 정도를 모니터링하였다.

PD 환자, 비퇴행성 신경학적 질환(NND)에 의해 이환된 인지에서 정상인 개체 및 알츠하이머병(AD)에 의해 이환된 환자로부터 CSF의 분취량을 얻었다. DSM-IV에 의해 정의되고, 통상적인 의학 검사, 신경학적 평가, 신경심리학적 평가 및 자기 공명 영상화를 포함하는 다양한 시험을 이용하여 결정된 바와 같은, 개연성 있는 PD의 진단을 가지는 환자로부터 시험 CSF 샘플을 얻었다. 하룻밤 공복 후 무상침에 의해 L4/L5 또는 L3/L4 간극에서의 요추 천자 후 폴리프로필렌 관에서 CSF 샘플을 수집하였다. 샘플을 4℃에서 3분 동안 3,000 g에서 원심분리하고, 분취하고 분석까지 -80℃에서 저장하였다. CSF 세포 계수, 포도당 및 단백질 농도를 결정하였다. 비율 비탁법에 의해 알부민을 측정하였다. 혈액 뇌 장벽의 통합성 및 척수강내 IgG 생성을 평가하기 위해, 알부민 몫(CSF 알부민/혈청 알부민) X 10³ 및 IgG 지수(CSF 알부민/혈청 알부민)/(CSF IgG/혈청 IgG)를 계산하였다. 연구를 헬싱키 선언의 조항에 따라 수행하고, 윤리 위원회Committee)에 의해 승인받았다.

실험, 및 분석의 초기 부분을 맹검으로 수행하였다. 도 14는, PD, AD 및 NND 군으로부터의 대표적인 샘플의 αS 응집의 평균 동역학을 보여주는, ThT 형광 라벨링의 함수로서 측정된, 시간에 대한 αS 올리고머화의 그래프이다.

결과는 PD 환자로부터의 CSF가 대조군 CSF와 비교하여 αS 응집을 유의미하게 가속시킨다는 것을 나타낸다(P<0.001). 인간 CSF 샘플의 존재 하의 αS 응집 동역학의 차이의 유의성을 일방향 ANOVA, 이어서 사후 터키 다중 비교에 의해 분석하였다. 유의성의 수준을 P<0.05로 설정하였다. 다른 2개의 군으로부터의 샘플과 PD 사이의 차이는 P<0.001로 유의미하게 높았다(^***).

실시예 15: 면역 포획의 특이성

도 15는 αS 올리고머를 포획하는 상이한 순서 또는 구조형태학적 항체의 능력을 입증하는 표 3을 보여준다. 건강한 인간 혈액 혈장에서 합성 αS 올리고머를 스파이킹하고 αS-PMCA에 의해 검출함으로써 올리고머를 포획하는 능력을 측정하였다. 제1 칼럼은 시험된 다양한 항체 및 상응하는 상업용 공급원을 보여준다. 제2 칼럼은 이 연구에 사용된 다양한 순서 항체의 αS 단백질에서의 에피토프 인식 부위를 기재한다. 제3 칼럼은 αS 올리고머를 포획하는 특이적 항체의 관찰된 능력을 표시한다. 기호는 상이한 항체를 사용한 검출 한계가 <12fmol(+++); 10-100fmol(++); >1pmol(+) 및 시약의 포획 없는 것보다 유의미하게 높지 않음(-)이라는 것을 나타낸다. 알파/베타-시누클레인 항체 N-19(N 말단 에피토프) 및 알파-시누클레인 항체 C-20-R(C 말단 에피토프)는 초고의 결과를 보여주고; 알파-시누클레인 항체 211(에피토프: 아미노산 121-125)은 매우 우수한 결과를 보여주고; 알파-시누클레인 항체 204(에피토프: 단편 1-130)는 우수한 결과를 보여주고; 16 ADV 마우스 IgG1(구조형태학적 에피토프)는 결과를 보여주지 않았다.

실시예 16: 고상 면역 포획

도 16a 및 도 16b는 복잡한 샘플, 예컨대 혈액 혈장으로부터 가용성 미스폴딩된 αS 단백질을 포획하기 위해 사용된 2개의 고상 방법의 도식적 표시이다. 전략 1은 ELISA 플레이트에서 고상에 결합한 특이적 항체에 의해 예비 코팅된 ELISA 플레이트를 사용하였다. 플레이트를 세척 후, 동일한 플레이트에서 αS-PMCA 반응을 수행하였다. 전략 2는 특이적 항체에 의해 코팅된 고상으로서 자기 비드를 사용하였다. 이 접근법은 샘플의 농도를 제공하였다.

실시예 17: 인간 혈액 혈장에서 스파이킹된 α- 시누클레인 올리고머의 검출을 위한 αS-PMCA

항-α-시누클레인 항체 코팅된 비드(다이나비드) 및 검출에 대해 티오플라빈-T와 함께 시딩 기질로서 α-시누클레인 단량체를 사용한 시딩 응집 검정에 의해 인간 혈액 혈장으로부터의 α-시누클레인 올리고머의 면역침강을 수행하였다. 항-α-시누클레인 코팅된 비드(1x10⁷개의 비드)를 α-시누클레인 시드와 함께(+ 0.2㎍의 시드) 및 α-시누클레인 시드 없이(- 시드) 인간 혈액 혈장(500㎕)과 항온처리하였다. 면역침강 후, 비드를 20㎕의 반응 완충제(1X PBS) 중에 재현탁시키고, 10㎕의 비드를 96웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. α-시누클레인 단량체(20㎍/㎖) 및 티오플라빈-T(5μM)를 첨가함으로써 응집 검정을 수행하였다. 435㎚의 여기 및 485㎚의 방출을 이용하여 형광광도계에 의해 형광의 증가를 모니터링하였다. 도 17a는 시드와 함께 및 이것 없이 혈액 혈장 중에 N-19 항체에 의한 면역침강/응집 결과를 예시한다. 도 17b는 시드와 함께 및 이것 없이 혈액 혈장 중에 211 항체에 의한 면역침강/응집 결과를 예시한다. 도 17c는 시드와 함께 및 이것 없이 혈액 혈장 중에 C-20 항체에 의한 면역침강/응집 결과를 예시한다.

실시예 18: αS - PMCA는 높은 민감도 및 특이성으로 PD 및 다계통 위축증에 의해 이환된 환자의 뇌척수액에서의 올리고머 αS를 검출한다.

PD 및 관련 α-시누클레인병증, 예컨대 다계통 위축증(MSA)의 생화학 진단을 위한 αS-PMCA의 효율을 연구하기 위해, 이 질환에 의해 이환된 많은 환자 및 다른 질환에 의해 이환된 대조군으로부터의 CSF에서 시험을 수행하였다. 도 18a, 도 18b 및 도 18c는 αS-PMCA를 사용하여 각각 대조군 및 PD 및 MSA에 의해 이환된 환자로부터의 인간 CSF 샘플에서의 시딩 활성의 검출을 보여준다. 완충제 MES(pH 6.0)의 정제된 시드 비함유 알파-시누클레인(100㎍/㎖)을 인간 환자 및 대조군으로부터의 CSF의 존재 하에 500rpm에서의 진탕에 의해 37℃에서 응집되게 하였다. 플레이트 분광형광계를 사용하여 435㎚에서의 여기 후 485㎚에서의 티오플라빈 형광에 의해 응집의 정도를 모니터링하였다.

DSM-IV에 의해 정의되고, 통상적인 의학 검사, 신경학적 평가, 신경심리학적 평가 및 자기 공명 영상화를 포함하는 다양한 시험을 이용하여 결정된 바와 같은, 개연성 있는 PD및 MSA의 진단을 가지는 환자로부터 시험 CSF 샘플을 얻었다. 하룻밤 공복 후 무상침에 의해 L4/L5 또는 L3/L4 간극에서의 요추 천자 후 폴리프로필렌 관에서 CSF 샘플을 수집하였다. 샘플을 4℃에서 3분 동안 3,000 g에서 원심분리하고, 분취하고 분석까지 -80℃에서 저장하였다. CSF 세포 계수, 포도당 및 단백질 농도를 결정하였다. 비율 비탁법에 의해 알부민을 측정하였다. 연구를 헬싱키 선언의 조항에 따라 수행하고, 윤리 위원회에 의해 승인받았다.

실험, 및 분석의 초기 부분을 맹검으로 수행하였다. 도 18a, 도 18b 및 도 18c는, 대조군 및 PD 및 MSA 군으로부터의 2개의 대표적인 샘플에 대한 각각 αS 응집의 평균 동역학을 보여주는, ThT 형광 표지의 함수로서 측정된, 시간에 대한 αS 응집의 그래프이다.

결과는 PD 환자로부터의 CSF가 대조군 CSF와 비교하여 αS 응집을 유의미하게 가속시킨다는 것을 나타낸다(P<0.001). 일방향 ANOVA, 이어서 사후 터키 다중 비교에 의해 인간 CSF 샘플의 존재 하의 αS 응집 동역학의 차이의 유의성을 분석하였다. 유의성의 수준을 P<0.05로 설정하였다. 다른 2개의 군으로부터의 샘플과 PD 사이의 차이는 P<0.001로 유의미하게 높았다(^***).

29명의 PD 또는 MSA 샘플 및 41명의 대조군의 전체 세트의 결과는 29개 중 26개의 PD 또는 MSA 샘플이 양성이지만, 41개 중 3개의 대조군 샘플이 양성이라는 것이고, 이것은 90%의 민감도 및 93% 특이성에 상응한다.

용어 "포함한다" 또는 "포함하는"이 명세서 또는 청구항에 사용된 정도로, 청구항에서 전환 단어로서 사용될 때 이 용어가 해석되는 바대로 용어 "포함하는"과 유사한 방식으로 포함되도록 의도된다. 더욱이, 용어 "또는"(예를 들어, A 또는 B)이 사용되는 정도로, "A 또는 B 또는 둘 다"를 의미하도록 의도된다. 본 출원인이 "둘 다가 아닌 오직 A 또는 B"를 나타내도록 의도할 때, 용어 "둘 다가 아닌 오직 A 또는 B"가 사용될 것이다. 따라서, 본 명세서에서 용어 "또는"의 사용은 포함적이고 배타적 사용이 아니다. 문헌[Bryan A. Garner, A Dictionary of Modern Legal Usage 624 (2d. Ed. 1995)]을 참조한다. 또한, 용어 "에서" 또는 "로"가 명세서 또는 청구항에 사용된 정도로, 추가적으로 "위에" 또는 "위로"를 의미하도록 의도된다. 용어 "선택적으로"가 명세서 또는 청구항에 사용된 정도로, 장치의 사용자가 장치의 사용시 필요하거나 원하는 바대로 부품의 특징 또는 기능을 활성화하거나 탈활성화할 수 있는, 부품의 상태를 의미하도록 의도된다. 용어 "작동적으로 연결된"이 명세서 또는 청구항에 사용된 정도로, 확인된 부품이 지정된 기능을 수행하는 방식으로 연결된다는 것을 의미하도록 의도된다. 용어 "실질적으로"가 명세서 또는 청구항에 사용된 정도로, 확인된 부품이 해당 산업에서 허용되는 바대로 오류의 정도로 표시된 관계 또는 품질을 가진다는 것을 의미하도록 의도된다.

명세서 및 청구항에 사용된 바대로, 단수 형태 "일", "하나" 및 "이"는 단수가 명확히 기재되지 않은 한 복수를 포함한다. 예를 들어, "화합물"의 언급은 2종 이상의 화합물의 혼합물, 및 단일 화합물을 포함할 수 있다.

본 명세서에 사용된 바대로, 수와 함께 사용되는 용어 "약"은 수의 ±10%를 포함하도록 의도된다. 즉, "약 10"은 9 내지 11을 의미할 수 있다.

본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "임의적인" 및 "임의로"는 후속하여 기재된 상황이 일어나거나 일어나지 않을 수 있어서, 설명이 상황이 일어나는 경우 및 상황이 일어나지 않는 경우를 포함한다는 것을 의미한다.

또한, 본 개시내용의 특징 또는 양태가 마쿠쉬(Markush) 군의 면에서 기재된 경우, 당해 분야의 당업자는 본 개시내용이 임의의 개별 구성원 또는 마쿠쉬 군의 구성원의 하위군의 면에서 이에 의해 또한 기재된다는 것을 인식할 것이다. 당해 분야의 당업자에 의해 이해되는 것처럼, 임의의 및 모든 목적을 위해, 예컨대 서면 설명을 제공한다는 면에서, 본 명세서에 개시된 모든 범위는 또한 임의의 및 모든 가능한 하위범위 및 이의 하위범위의 조합을 포함한다. 임의의 기재된 범위는, 적어도 동일한 1/2, 1/3, 1/4, 1/5, 1/10 등으로 쪼개지는, 동일한 범위를 충분히 기재하고 가능하게 하는 것으로 용이하게 인식될 수 있다. 비제한적인 예로서, 본 명세서에 기재된 각각의 범위는 하부 1/3, 중간 1/3 및 상부 1/3 등으로 용이하게 쪼개질 수 있다. 당해 분야의 당업자에 의해 또한 이해되는 것처럼, "까지", "적어도", "초과", "미만"과 같은 모든 언어는 언급된 수를 포함하고, 후속하여 하기 기재된 바대로 하위범위로 쪼개질 수 있는 범위를 언급한다. 마지막으로, 당해 분야의 당업자에 의해 이해되는 것처럼, 범위는 각각의 개별 구성원을 포함한다. 예를 들어, 1-3개의 세포를 가지는 군은 1개, 2개 또는 3개의 세포를 가지는 군을 의미한다. 유사하게, 1-5개의 세포를 가지는 군은 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 세포를 가지는 군을 의미하고, 기타 등등이다. 다양한 양태 및 실시형태가 본 명세서에 개시되어 있지만, 다른 양태 및 실시형태 당해 분야의 당업자에게 명확할 것이다.

상기 기재된 바대로, 본원이 이의 실시형태의 설명에 의해 예시되어 있고, 실시형태가 상당한 상세내용으로 기재되어 있지만, 첨부된 청구항의 범위를 그러한 상세내용으로 한정하거나 어떠한 방식으로든 제한하는 것이 출원인의 의도가 아니다. 추가적인 이익 및 변형이 본원의 이익을 가지는 당해 분야의 당업자에게 용이하게 나타날 수 있다. 따라서, 출원은, 이의 더 광의의 양태에서, 구체적인 상세내용, 도시된 예시적인 예, 또는 언급된 임의의 장치로 제한되지 않는다. 일반적인 본 발명의 개념의 정신 또는 범위로부터 벗어나지 않으면서 이러한 상세내용, 예 및 장치로부터 일탈이 이루어질 수 있다.

본 명세서에 개시된 다양한 양태 및 실시형태는 예시 목적을 위한 것이고, 제한으로 의도되지 않고, 진정한 범위 및 사상은 하기 청구항에 의해 표시되어 있다.

Claims

생물학적 유체에서 α-시누클레인(α-S) 응집체의 존재를 검출하는 시험관내 방법으로서,
(A) 프리-인큐베이션 혼합물을 제공하는 단계로서, 상기 프리-인큐베이션 혼합물은
(1) 100nM 내지 20μM의 농도 범위의 단량체성 α-S 단백질;
(2) pH 6 내지 7 범위를 갖는 완충제 조성물;
(3) 총 농도 450 mM 내지 550 mM의 염 조성물; 및
(4) 티오플라빈 T(ThT)을 포함하는, 상기 단계;
(B) 상기 생물학적 유체와 프리-인큐베이션 혼합물을 배합하여 인큐베이션 혼합물을 형성하는 단계;
(C) 상기 인큐베이션 혼합물을 간헐적 교반 주기로 인큐베이션하여 인큐베이션된 혼합물을 형성하는 단계;
(D) 상기 인큐베이션된 혼합물을 ThT를 여기시키는 빛의 파장으로 일루미네이션하는 단계; 및
(E) 인큐베이션 동안 형광 수준을 결정하는 단계로서, 여기서 형광 수준의 증가는 상기 생물학적 유체 내 α-S 응집체의 존재를 나타내는, 상기 단계;를 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 생물학적 유체는 인간 CSF를 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 완충제 조성물은 pH 6.5를 갖는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 완충제 조성물은 피페라진-N,N'-비스(2-에탄설폰산(PIPES)을 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 완충제 조성물은 100mM PIPES를 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 염은 NaCl을 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 염은 500mM의 농도의 NaCl을 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 생물학적 유체는 양수; 담즙; 피; 혈장; 뇌척수액; 귀지; 피부; 삼출물; 대변; 위액; 림프; 우유; 점액; 점막; 복막액; 혈장; 흉막액; 고름; 타액; 피지; 정액; 땀; 활액; 눈물; 및 소변의 하나 이상을 포함하는, 방법.
제8항에 있어서, 상기 형광 수준의 증가는 지연 단계 동안 임의의 시점에서 인큐베이션된 혼합물의 형광 수준과 비교하여 최대 형광에서 인큐베이션된 혼합물의 형광 표준 편차의 2배 이상의, 최대 형광에서 인큐베이션된 혼합물의 형광 수준의 증가인 방법.
제1항에 있어서, 상기 교반(agitating)은 진탕하는 것을 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 단량체성 α-S 단백질은 재조합 C-말단 His Tag 단량체성 α-S 단백질을 포함하는, 방법.
제11항에 있어서, 상기 단량체성 α-S 단백질은 프리-인큐베이션 혼합물에서 19.6μM의 농도로 존재하는, 방법.
인간 CSF에서 α-S 응집체의 존재를 검출하는, 시험관내 방법으로서,
(A) 프리-인큐베이션 혼합물을 제공하는 단계로서, 상기 프리-인큐베이션 혼합물은,
(1) 100nM 내지 20μM의 농도 범위의 단량체성 α-S 단백질;
(2) PIPES를 포함하며 pH 6.5를 갖는 완충제 조성물;
(3) 500 mM 농도의 NaCl; 및
(4) ThT를 포함하는, 상기 단계;
(B) 상기 인간 CSF와 프리-인큐베이션 혼합물을 배합하여 인큐베이션 혼합물을 형성하는 단계;
(C) 상기 인큐베이션 혼합물을 간헐적 교반 주기로 인큐베이션하여 인큐베이션된 혼합물을 형성하는 단계;
(D) 상기 인큐베이션된 혼합물을 ThT를 여기시키는 빛의 파장으로 일루미네이션하는 단계; 및
(E) 인큐베이션 동안 형광 수준을 결정하는 단계로서, 여기서 형광 수준의 증가는 상기 인간 CSF 내 α-S 응집체의 존재를 나타내는, 상기 단계;를 포함하는, 방법.
제13항에 있어서, 상기 단량체성 α-S 단백질은 재조합 C-말단 His Tag 단량체성 α-S 단백질을 포함하는, 방법.
제14항에 있어서, 상기 단량체성 α-S 단백질은 19.6μM의 농도로 존재하는, 방법.
생물학적 유체에서 α-S 응집체의 존재를 검출하는 시험관내 방법으로서,
(A) 프리-인큐베이션 혼합물을 제공하는 단계로서, 상기 프리-인큐베이션 혼합물은,
(1) 1uM 내지 100μM의 농도 범위의 단량체성 α-S 단백질;
(2) pH 6 내지 7 범위를 갖는 완충제 조성물;
(3) 총 농도 450 mM 내지 550 mM의 염 조성물; 및
(4) 형광단을 포함하는 표시자를 포함하는, 상기 단계;
(B) 상기 생물학적 유체와 프리-인큐베이션 혼합물을 배합하여 인큐베이션 혼합물을 형성하는 단계;
(C) 상기 인큐베이션 혼합물을 간헐적 교반 주기로 인큐베이션하여 인큐베이션된 혼합물을 형성하는 단계;
(D) 상기 인큐베이션된 혼합물을 상기 형광단을 여기시키는 빛의 파장으로 일루미네이션하는 단계; 및
(E) 인큐베이션 동안 형광 수준을 결정하는 단계로서, 여기서 형광 수준의 증가는 상기 생물학적 유체 내 α-S 응집체의 존재를 나타내는, 상기 단계;를 포함하는, 방법.
제16항에 있어서, 상기 생물학적 유체는 인간 CSF를 포함하는, 방법.
제16항에 있어서, 상기 완충제 조성물은 pH 6.5를 갖는, 방법.
제16항에 있어서, 상기 완충제 조성물은 PIPES를 포함하는, 방법.
제16항에 있어서, 상기 완충제 조성물은 100mM PIPES를 포함하는, 방법.
제16항에 있어서, 상기 염은 NaCl을 포함하는, 방법.
제16항에 있어서, 상기 염은 500mM 농도의 NaCl을 포함하는, 방법.
제16항에 있어서, 상기 생물학적 유체는 양수; 담즙; 피; 혈장; 뇌척수액; 귀지; 피부; 삼출물; 대변; 위액; 림프; 우유; 점액; 점막; 복막액; 혈장; 흉막액; 고름; 타액; 피지; 정액; 땀; 활액; 눈물; 및 소변의 하나 이상을 포함하는, 방법.
제16항에 있어서, 상기 형광 수준의 증가는 지연 단계 동안 임의의 시점에서 인큐베이션된 혼합물의 형광 수준과 비교하여 최대 형광에서 상기 인큐베이션된 혼합물의 형광 표준 편차의 2배 이상의, 최대 형광에서 인큐베이션된 혼합물의 형광 수준의 증가인 방법.
제16항에 있어서, 상기 표시자는 ThT를 포함하는, 방법.
제16항에 있어서, 상기 교반은 진탕하는 것을 포함하는, 방법.
제16항에 있어서, 상기 단량체성 α-S 단백질은 재조합 C-말단 His Tag 단량체성 α-S 단백질을 포함하는, 방법.
제27항에 있어서, 상기 단량체성 α-S 단백질은 65.4μM의 농도로 존재하는, 방법.
인간 CSF에서 α-S 응집체의 존재를 검출하는 시험관내 방법으로서,
(A) 프리-인큐베이션 혼합물을 제공하는 단계로서, 상기 프리-인큐베이션 혼합물은,
(1) 1uM 내지 100μM의 농도 범위의 단량체성 α-S 단백질;
(2) PIPES를 포함하고 pH 6.5를 갖는 완충제 조성물;
(3) 500mM의 농도의 NaCl; 및
(4) 형광단을 포함하는 표시자를 포함하는, 상기 단계;
(B) 상기 인간 CSF와 프리-인큐베이션 혼합물을 배합하여 인큐베이션 혼합물을 형성하는 단계;
(C) 상기 인큐베이션 혼합물을 간헐적 교반 주기로 인큐베이션하여 인큐베이션된 혼합물을 형성하는 단계;
(D) 상기 인큐베이션된 혼합물을 형광단을 여기시키는 빛의 파장으로 일루미네이션하는 단계; 및
(E) 인큐베이션 동안 형광 수준을 결정하는 단계로서, 여기서 형광 수준의 증가는 상기 인간 CSF 내 α-syn 응집체의 존재를 나타내는, 상기 단계;를 포함하는 방법.
제29항에 있어서, 상기 단량체성 α-S 단백질은 재조합 C-말단 His Tag 단량체성 α-S 단백질을 포함하는, 방법.
제30항에 있어서, 상기 단량체성 α-S 단백질은 65.4μM의 농도로 존재하는, 방법.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제