JP2022000629A - ミスフォールディングタンパク質の検出 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2014年9月11日出願の米国特許仮出願第62/049,306号の優先権を主張するものであり、その出願の内容全体は、参照により本明細書に組み入れられる。
タンパク質ミスフォールディング病(PMD)としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、2型糖尿病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、全身性アミロイドーシス、プリオン病などが挙げられる。異なるタンパク質のミスフォールディング凝集物が、形成および蓄積される場合がある。ミスフォールディング凝集物は、数ある影響の中で、細胞機能不全および組織損傷を誘発し得る。
一実施形態において、試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在を判定する方法が、提供される。該方法は、試料をモノマーフォールディングタンパク質と接触させて、インキュベーション混合物を形成させることを含み得る。該方法は、ミスフォールディングタンパク質の増幅部分を形成させるのに効果的になるように2回以上のインキュベーションサイクルを実施することを含み得る。各インキュベーションサイクルは、可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在下で、モノマーフォールディングタンパク質の少なくとも一部のミスフォールディングおよび/または凝集を誘発するのに効果的になるようにインキュベーション混合物をインキュベートすることを含み得る。各インキュベーションサイクルは、例えば可溶性ミスフォールディングタンパク質を放出するために、存在する任意のタンパク質凝集物の少なくとも一部を分解するのに効果的になるようにインキュベーション混合物を物理的に破壊することを含み得る。該方法は、可溶性ミスフォールディングタンパク質の少なくとも一部を検出することによって、試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在を判定することを含み得る。可溶性ミスフォールディングタンパク質は、可溶性ミスフォールディングモノマーおよび可溶性ミスフォールディング凝集物のうちの1つまたは複数を含み得る。ミスフォールディングタンパク質の増幅部分は、可溶性ミスフォールディングモノマーの増幅部分、可溶性ミスフォールディング凝集物の増幅部分、および不溶性ミスフォールディング凝集物のうちの1つまたは複数を含み得る。モノマーフォールディングタンパク質および可溶性ミスフォールディングタンパク質には、プリオンタンパク質(PrP)およびそのアイソフォームが除外され得る。
タンパク質ミスフォールディング病(PMD)の診断のためなど、試料中のミスフォールディングタンパク質の検出のための方法およびキットが提供される。異なるタンパク質のミスフォールディング凝集物が、形成および蓄積される場合がある。ミスフォールディング凝集物は、数ある影響の中で、細胞機能不全および組織損傷を誘発し得る。例えばPMDとしては、アルツハイマー病(AD)または全身性アミロイドーシスなどのアミロイドーシス;パーキンソン病(PD)、レビー小体型認知症などのシヌクレイン病;多系統萎縮症;シヌクレイン関連神経軸索ジストロフィー;2型糖尿病;ハンチントン病(HD)などのトリプレットリピート病;筋萎縮性側索硬化症(ALS)などを挙げることができる。異なるタンパク質のミスフォールディング凝集物が、形成および蓄積される場合がある。ミスフォールディング凝集物は、数ある影響の中で、細胞機能不全および組織損傷を誘発し得る。
実施例1:合成Aβオリゴマーの調製
Aβ1−42を、Yale大学W.Keck Facilityにて固相N−tert−ブチルオキシカルボニルの化学作用を利用して合成し、逆相HPLCによって精製した。最終生成物を凍結乾燥し、アミノ酸分析および質量分析によって特徴づけた。凝集されたミスフォールディングAβタンパク質を含まない原液を調製するために、凝集物を高pHに溶解し、30kDaカットオフフィルターでろ過して、残留する凝集物を除去した。異なるタイプの凝集物を調製するために、シード不含のAβ1−42の溶液(10μM)を、0.1M Tris−HCl(pH7.4)中、25℃で異なる時間、撹拌しながらインキュベートした。この調製物は、インキュベーション時間に応じて異なる割合で、Aβモノマー、そしてフィブリル、プロトフィブリルおよび可溶性ミスフォールディングAβタンパク質の混合物を含有した。凝集の度合いを、ThT蛍光発光、ネガティブ染色後の電子顕微鏡、A11コンフォメーション抗体を用いたドットブロット試験および4G8抗Aβ抗体を用いたゲル電気泳動後のウェスタンブロットによって特徴づけた。
実施例2A.Aβ凝集のシーディングを、異なる量の合成可溶性ミスフォールディングAβタンパク質(対照(Aβオリゴマー不含);または合成可溶性ミスフォールディングAβタンパク質3、80、300、および8400フェムトモル)を含み、または含まずに、チオフラビンTの存在下でシード不含Aβ1−42の溶液をインキュベーションすることによって試験した。Aβ−PMCAの一般的手順:0.1M Tris−HCl(pH7.4)中の2μM凝集物不含Aβ1−42の溶液(総量200μL)を、不透明96ウェルプレートに入れ、単独で、または合成Aβ凝集物(実施例1に記載された通り5時間インキュベートすることにより調製)もしくはCSFアリコット40μLの存在下でインキュベートした。試料を5μMチオフラビンT(ThT)の存在下でインキュベートし、22℃の一定温度でEppendorfサーモミキサーを利用して周期的攪拌に供した(500rpmで1分間、その後、振とうせずに29分間)。様々な時点で、ThT蛍光をプレート内で、プレート分光蛍光計を用いて435nmで励起した後、485nmで測定した。図2Aは、示されたフェムトモル濃度の合成可溶性ミスフォールディングAβタンパク質シードを用いた、チオフラビンTの蛍光による測定でのアミロイド形成(循環増幅を含まない)対時間のグラフである。緩衝液のペプチド濃度、温度およびpHをモニタリングして、誘導期の度合いおよび実験間の再現性を制御した。これらの条件下では、自然なAβ凝集物は、実験が実施された時間(125時間)では検出されなかった。モノマーAβ1−42タンパク質の凝集が、0.3〜8.4fmolの実施例1の合成可溶性ミスフォールディングAβタンパク質の存在下で観察された。
CSFのアリコットを、AD患者50名、非変性神経疾患(NND)に罹患した認知的に正常な個体39名、および他の形態の認知症をはじめとする非AD神経変性疾患(NAND)に罹患した個体37名から得た。テストCSF試料を、DSM−IVおよびNINCDS−ADRA指針(McKhann et al., 1984)による定義と、様々なテスト、例えば日常的医学検査、神経学的評価、神経心理学的評定、磁気共鳴画像、ならびにAβ1−42、総タウおよびホスホタウのCSFレベルの測定などを利用した測定と、によりおそらくADであると診断された患者50名から得た。試料採取時のAD患者の平均年齢は、71.0±8.1歳(範囲49〜84歳)であった。対照CSF試料を、正常圧水頭症の症例12名、末梢神経傷害の患者7名、種々の形態の脳腫瘍の患者7名、ICTUS患者2名、重度頭痛の患者1名、脳炎患者3名、高血圧患者1名、および潰瘍診断の6名からなる非変性神経疾患(NND)に罹患した患者39名から得た。CSF試料がこの患者群から採取された時の平均年齢は、64.6±14.7歳(範囲31〜83歳)であった。対照CSF試料はまた、前頭側頭型認知症10名(行動障害型5名および言語障害型5名)、パーキンソン病の患者6名(認知症関連4名および運動ニューロン疾患1名)、進行性核上性麻痺患者6名、脊髄小脳失調6名(認知症関連1名)、筋萎縮性側索硬化症4名、ハンチントン病2名、MELAS1名、レビー小体型認知症1名、および血管型認知症1名からなる非AD神経変性疾患(NAND)に罹患した個体37名から採取した。この群の試料採取時の平均年齢は、63.8±11.1歳(範囲41〜80歳)であった。CSF試料は、一夜絶食後に非外傷性針によるL4/L5間またはL3/L4間の腰部穿刺によってポリプロピレン試験管に採取した。試料を4℃および3,000gで3分間遠心分離し、分取して、分析まで−80℃で貯蔵した。CSF細胞カウント、グルコースおよびタンパク質濃度を測定した。アルブミンを、レートネフェロメトリーによって測定した。血液脳関門の統合性および髄腔内IgG産生を評価するために、アルブミン比率(CSFアルブミン/血清アルブミン)×103およびIgG指数(CSFアルブミン/血清アルブミン)(CSF IgG/血清IgG)を計算した。この試験は、Helsinki Declarationの条項にしたがって実施され、Ethics Committeeにより認可された。
図5、表1の裏づけとして、感度、特異度および予測値を、誘導期データを用いて測定し、カットオフ閾値は、MedCalcソフトウェア(バーション12.2.1.0、MedCalc、ベルギー所在)を用いた受信者動作特性(ROC)曲線解析によって測定した。図5、表1に示される通り、90.0%感度および84.2%特異度が、非変性神経疾患を有する年齢が一致した個体からなる対照群について推定された。反対に、他の形態の認知症をはじめとする他の神経変性疾患からのADの臨床的により関連した識別では、100%感度および94.6%特異度が推定された。ADを他の形態の神経変性疾患と区別するためのAβ−PMCAのこの能力は、臨床的に有意である。全ての対照個体を考慮した全体的感度および特異度は、それぞれ90%および92%であった。
免疫枯渇実験を実施して、Aβ−PMCAがCSF中に存在する可溶性ミスフォールディングAβタンパク質に関連するシーディング活性を検出することを確認した。可溶性ミスフォールディングAβタンパク質の効率的免疫枯渇の方法論を最初に、合成的に調製された可溶性ミスフォールディングAβタンパク質を用いることによって最適化した。免疫枯渇は、Aβの配列を特異的に認識する抗体(4G8)とコンフォメーション抗体(A11)との混合物でコンジュゲートされたDynabeadsと共にインキュベートすることによって実施した。図7Aは、ヒトCSFに添加された合成的に調製されたAβオリゴマーを用いた免疫枯渇の結果を示すウェスタンブロットである。可溶性ミスフォールディングAβタンパク質は、この免疫枯渇によって効率的に除去された。
図8Aおよび8Bは、血漿などの複合試料から可溶性ミスフォールディングAβタンパク質を捕捉するために用いられる2つの固相法の略図である。方策1は、ELISAプレート上の固相に結合された特異的抗体でプレコーティングされたELISAプレートを用いた。プレートを洗浄した後、Aβ−PMCA反応を、同じプレートで実施した。方策2は、特異的抗体でコーティングされた固相として磁気ビーズを用いた。このアプローチは、試料の濃度を提供した。
図9は、Aβオリゴマーを捕捉する特異的抗体の能力を実証する表2を示す。上のパネルは、この試験で用いられた種々の配列の抗体のAβタンパク質上のエピトープ認識部位の略図を示す。図9の表2は、Aβオリゴマーを捕捉するための異なる配列およびコンフォメーション抗体の効率を実証している。オリゴマーを捕捉する能力を、健常なヒト血漿における合成Aβオリゴマーの添加およびAβ−PMCAでの検出によって測定した。記号は、異なる抗体を用いた検出限界が<12fmol(+++);10〜100fmol(++);>1pmol(+)、および捕捉試薬なし(−)よりも有意に高くない、を示している。
図10は、ヒト血漿に添加された可溶性ミスフォールディングAβタンパク質の検出を示すチオフラビンT蛍光によって測定されたアミロイド形成対時間のグラフである。プロテインGでプレコーティングされたELISAプレートを、抗コンフォメーション抗体(Acumenの16ADV)でコーティングした。それゆえ、プレートを、そのままのヒト血漿(対照)(100μl)または異なる濃度の合成可溶性ミスフォールディングAβタンパク質を添加されたヒト血漿(100μl)と共にインキュベートした。インキュベーション後に、プレートを、Aβ40モノマー(2μM)およびThT(5μM)の存在下でAβ−PMCAに供した(29分間インキュベーションおよび30秒間振とう)。アミロイド形成を、チオフラビン蛍光によって測定した。図10は、同様に働く3種の異なる抗体で実施された複数の実験の代表例である。
図11は、AD患者および対照からの血漿試料中のAβ−PMCAアッセイにおいて50%凝集に達するまでの時間を示すグラフである。ADに罹患した患者、非AD神経変性疾患(NAD)に罹患した患者および健常対照の血漿試料を、抗Aβ抗体(82E1)コーティングビーズと共にインキュベートした。Aβ−PMCAを、実施例2に記載された通り実施した。50%凝集に達するのに必要となる時間を、各群の個々の患者で記録した。差は、一元配置分散分析と、それに続くテューキー多重比較事後検定によって解析した。このデータのROC解析は、対照からAD患者を正しく同定することに関して82%の感度および100%の特異度を示した。
図12は、凝集を断片化する手段として振とうの代わりに音波処理を利用することによるAβ凝集の増幅の結果を示すウェスタンブロットである。実験は、異なる量の合成Aβオリゴマーの存在下で実施した。10μg/mlシード不含モノマーAβ1−42の試料を、単独(レーン1)で、または300(レーン2)fmol、30(レーン3)fmolおよび3(レーン4)fmolのミスフォールディングAβと共にインキュベートした。試料は、増幅せずに凍結するか(非増幅)、または96PMCAサイクルに供し(増幅)、それぞれには30分間のインキュベーションと、その後の20秒間の音波処理が含まれた。凝集Aβを、プロテアーゼK(PK)での試料の処置後の抗Aβ抗体を用いたウェスタンブロットによって検出した。本発明者らの実験では、チオフラビンT蛍光を用いた検出が音波処理と適合性がなく、物理的破壊法としての振とうによって非常にうまくいくことが観察された。図12は、Aβ凝集物のための異なる検出法、この場合、ウェスタンブロットを用いると、音波処理が振とうと同様にうまく働くことを示している。
シード不含モノマーAβを、サイズ排除クロマトグラフィーによって得た。手短に述べると、ジメチルスルホキシド中で調製された1mg/mLペプチド溶液のアリコットを、pH7.5の10mMリン酸ナトリウムで0.5mL/分で溶出されるSuperdex75カラムを用いて分画した。ピークは、220nmのUV吸収によって検出される。Aβのモノマー/ダイマーを含む4〜10kDa分子量に対応するピークを回収して、アミノ酸分析によって濃度を測定した。試料を貯蔵して、−80℃で凍結乾燥した。
pET28 GroES−Ub−Aβ42プラスミドを含む大腸菌細胞を、37℃のルリアブロス(LB)培地で増殖させて、発現を0.4mM IPTGで誘導した。4時間後に、細胞を採取して、溶解緩衝液(20mM Tris−Cl(pH8.0)、10mM NaCl、0.1mM PMSF、0.1mM EDTAおよび1mM β−メルカプトエタノール)に溶解し、18,000rpmで30分間遠心分離した。封入小体を、6M尿素を含有する再懸濁緩衝液(50mM Tris−Cl(pH8.0)、150mM NaCl、および1mM DTT)に再懸濁させた。不溶性タンパク質を、18,000rpmでの30分間の遠心分離によって除去した。GroES−Ub−Aβ42融合タンパク質を含む上清が回収される。融合タンパク質からAβ42を切除するために、融合タンパク質を再懸濁緩衝液で2倍希釈し、1:100の酵素対基質モル比の組換え脱ユビキチン化酵素(Usp2cc)により37℃で2時間処理した。その後、試料をC18カラム(25mm×250mm、米国のGrace Vydac)にロードした。Aβ42を、溶媒系緩衝液1(30mM酢酸アンモニウム(pH10)、2%アセトニトリル)および緩衝液2(70%アセトニトリル)で、緩衝液2の20〜40%直線勾配を利用して、流速10ml/分で35分間にわたり精製した。精製されたAβ42を凍結乾燥して、使用まで−80℃で貯蔵した。
実施例13A:αS凝集物のシーディングを、異なる量の合成可溶性オリゴマーαSタンパク質:対照(αSオリゴマー不含);または1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、および1μg/mL合成可溶性オリゴマーαSタンパク質シードを含み、または含まずに、チオフラビンTの存在下でシード不含αSの溶液をインキュベーションすることによって試験した。αS−PMCAの一般的手順:PBS(pH7.4)中の100μg/mLαSシード不含αSの溶液(総量200μL)を、不透明96ウェルプレートに入れ、単独で、または示された濃度の合成αS凝集物もしくはCSFアリコット40μLの存在下でインキュベートした。試料を5μMチオフラビンT(ThT)の存在下でインキュベートし、22℃の一定温度でEppendorfサーモミキサーを利用して周期的攪拌に供した(500rpmで1分間、その後、振とうせずに29分間)。様々な時点で、ThT蛍光をプレート内で、プレート分光蛍光計を用いて435nmで励起した後、485nmで測定した。図13Aは、示された濃度の合成可溶性オリゴマーαSタンパク質シードを用いた、PD−PMCAによるαSシードの検出を示す、時間の関数としてのチオフラビンT蛍光のグラフである。緩衝液のペプチド濃度、温度およびpHをモニタリングして、誘導期の度合いおよび実験間の再現性を制御した。モノマーαSタンパク質の凝集が、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mLおよび1μg/mL合成可溶性オリゴマーαSタンパク質シードのαSの存在下で観察された。
対照およびPD患者から得られたヒトCSF試料中のシーディング活性の検出を、PD−PMCAによって実施した。PBS(pH7.4)中の精製されたシード不含アルファ−シヌクレイン(100μg/mL)を、確認されたPD、ADまたは非神経変性神経病(NND)を有するヒト患者から得られたCSFの存在下、500rpmで振とうしながら37℃で凝集させた。凝集の度合いを、プレート分光蛍光計を用いて435nmで励起した後、485nmのチオフラビン蛍光によってモニタリングした。
図15は、αSオリゴマーを捕捉する異なる配列またはコンフォメーション抗体の能力を実証する表3を示す。オリゴマーを捕捉する能力は、健常ヒト血漿に合成αSオリゴマーを添加し、αS−PMCAで検出することによって測定される。最初の欄は、テストされた様々な抗体および対応する商業的供給元を示す。二番目の欄は、この試験で用いられた種々の配列の抗体のαSタンパク質上のエピトープ認識部位の列挙である。三番目の欄は、αSオリゴマーを捕捉するための特異的抗体の観察された能力を示す。記号は、異なる抗体を用いた検出限界が<12fmol(+++);10〜100fmol(++);>1pmol(+)、および捕捉試薬なし(−)よりも有意に高くない、を示している。アルファ/ベータ−シヌクレイン抗体N−19(N−末端エピトープ)およびアルファ−シヌクレイン抗体C−20−R(C末端エピトープ)は最良の結果を示し、アルファ−シヌクレイン抗体211(エピトープ:アミノ酸121〜125)は、非常に良好な結果を示し、アルファ−シヌクレイン抗体204(エピトープ:断片1〜130)は、良好な結果を示し、16ADVマウスIgG1(コンフォメーションエピトープ)は、結果を示さなかった。
図16Aおよび16Bは、血漿などの複合試料から可溶性ミスフォールディングαSタンパク質を捕捉するために用いられる2つの固相法の略図である。方策1は、ELISAプレート上の固相に結合された特異的抗体でプレコーティングされたELISAプレートを用いた。プレートを洗浄した後、αS−PMCA反応を、同じプレートで実施した。方策2は、特異的抗体でコーティングされた固相として磁気ビーズを用いた。このアプローチは、試料の濃度を提供した。
ヒト血漿からのα−シヌクレインオリゴマーの免疫沈降を、抗α−シヌクレイン抗体でコーティングされたビーズ(Dynabeads)、および検出のためにチオフラビン−Tと共にシーディング基質としてα−シヌクレインモノマーを用いるシーディング凝集アッセイによって実施した。抗α−シヌクレイン抗体でコーティングされたビーズ(1×107個)を、α−シヌクレインシード(+0.2μgシード)を含み、またはα−シヌクレインシードを含まずに(−シード)、ヒト血漿(500μL)と共にインキュベートした。免疫沈降後に、ビーズを反応緩衝液20μLに再懸濁させて(1×PBS)、ビーズ10μLを96ウェルプレートの各ウェルに添加した。凝集アッセイを、α−シヌクレインモノマー(200μg/mL)およびチオフラビン−T(5μM)を添加することにより実施した。蛍光の増加を、435nmでの励起および485nmでの発光を利用した蛍光光度計によってモニタリングした。図17Aは、シードを含む、または含まない、血漿中のN−19抗体による免疫沈降/凝集結果を示す。図17Bは、シードを含む、または含まない、血漿中の211抗体による免疫沈降/凝集結果を示す。図17Cは、シードを含む、または含まない、血漿中のC−20抗体による免疫沈降/凝集結果を示す。
PDおよび関連のα−シヌクレイン病、例えば多系統萎縮症(MSA)の生化学的診断のためのαS−PMCAの効率を試験するために、テストを、これらの疾患に罹患した多くの患者および他の疾患に罹患した対照からのCSFで実施した。図18A、18B、および18Cは、αS−PMCAを用いた、それぞれ対照、ならびにPDおよびMSAに罹患した患者のヒトCSF試料中のシーディング活性の検出を示している。緩衝液MES(pH6.0)中の精製されたシード不含アルファ−シヌクレイン(100μg/mL)を、ヒト患者および対照からのCSFの存在下、500rpmで振とうしながら37℃で凝集させた。凝集の度合いを、プレート分光蛍光計を用いて435nmで励起した後、485nmのチオフラビン蛍光によってモニタリングした。
Claims (18)
- ヒトの生体試料中のα−シヌクレイン(α−syn)凝集物の存在を検出するための方法であって、
(A)ヒトの生体試料を準備するステップと;
(B)プレインキュベーション混合物を準備するステップであって、前記プレインキュベーション混合物が、
(1)モノマーα−synタンパク質、
(2)約6〜約7.4のpHを有する緩衝組成物、
(3)1μM〜500mMの総濃度の塩組成物、および
(4)チオフラビンT(ThT)
を含む、ステップと;
(C)前記ヒトの生体試料と前記プレインキュベーション混合物を混ぜ合わせてインキュベーション混合物を形成させるステップと;
(D)前記インキュベーション混合物を断続的な攪拌サイクルでインキュベートして、インキュベートされた混合物を形成させるステップと;
(E)前記インキュベートされた混合物を、前記ThTを励起する波長の光で照射するステップと;
(F)インキュベーション中の蛍光のレベルを決定するステップであって、前記蛍光のレベルの増加が、前記ヒトの生体試料中のα−syn凝集物の存在を示す、ステップと;
を含む方法。 - 前記緩衝組成物が、ピペラジン−N,N’−ビス(2−エタンスルホン酸)(PIPES)を含む、請求項1に記載の方法。
- インキュベート前の前記インキュベーション混合物における前記モノマーα−synタンパク質の総濃度が1μM〜200μMである、請求項1に記載の方法。
- インキュベート前の前記インキュベーション混合物における前記モノマーα−synタンパク質の総濃度が約6.54μM〜約65.4μMである、請求項1に記載の方法。
- 前記モノマーα−synタンパク質が、化学合成、組換え生成、または非組換え生体試料からの抽出、のうちの1つによって生成される、請求項1に記載の方法。
- 前記モノマーα−synタンパク質が、全長の140アミノ酸のα−synタンパク質またはその誘導体である、請求項1に記載の方法。
- 前記インキュベートが22℃〜42℃の温度で行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記蛍光のレベルの増加が、攪拌サイクル前のインキュベーション混合物の蛍光のレベルと比較して、最大蛍光での前記インキュベートされた混合物の蛍光の標準偏差の少なくとも2倍の最大蛍光での前記インキュベートされた混合物の蛍光レベルの増加である、請求項1に記載の方法。
- 前記塩組成物が、NaClおよびKClのうちの1つまたは複数を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ヒトの生体試料が、羊水;胆汁;血液;脳脊髄液;耳垢;皮膚;滲出液;糞便;胃液;リンパ;乳;粘液;粘膜;腹水;血漿;胸水;膿;唾液;皮脂;精液;汗;滑液;涙液;および尿のうちの1種または複数を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ヒトの生体試料が脳脊髄液を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ヒトの生体試料が血液および/または血漿を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ヒトの生体試料が皮膚を含む、請求項1に記載の方法。
- α−シヌクレイン(α−syn)凝集物を調製するための方法であって、
(A)ミスフォールディングα−synタンパク質を含むヒト脳脊髄液(CSF)試料を準備するステップと;
(B)プレインキュベーション混合物を準備するステップであって、前記プレインキュベーション混合物が、
(1)モノマーα−synタンパク質、
(2)約6〜約7.4のpHを有する緩衝組成物、および
(3)約500mMの総濃度のNaCl
を含む、ステップと;
(C)前記ヒトCSF試料と前記プレインキュベーション混合物を混ぜ合わせてインキュベーション混合物を形成させるステップと;
(D)前記インキュベーション混合物を断続的な攪拌サイクルでインキュベートすることにより前記ミスフォールディングα−synタンパク質で前記モノマーα−synタンパク質の凝集を誘導して、α−syn凝集物を含むインキュベートされた混合物を形成させるステップと;
を含む方法。 - 前記プレインキュベーション混合物がチオフラビンT(ThT)をさらに含む、請求項14に記載の方法であって、
(A)前記インキュベートされた混合物を、前記ThTを励起する波長の光で照射するステップと;
(B)インキュベーション中の蛍光のレベルを決定するステップであって、前記蛍光のレベルの増加が、前記ヒトCSF試料中のα−syn凝集物の存在を示す、ステップと;
をさらに含む、方法。 - 前記インキュベートされた混合物を、前記ThTを励起する波長の光で照射するステップが、約435nmで照射することを含み、前記決定するステップが、約485nmでThTの蛍光をモニタリングすることを含む、請求項15に記載の方法。
- 前記蛍光のレベルの増加が、攪拌サイクル前のインキュベーション混合物の蛍光のレベルと比較して、最大蛍光での前記インキュベートされた混合物の蛍光の標準偏差の少なくとも2倍の最大蛍光での前記インキュベートされた混合物の蛍光レベルの増加である、請求項15に記載の方法。
- 請求項14に記載の方法によって調製された、α−シヌクレイン(α−syn)凝集物。
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