JP2003512043A - Ａｓｐ２の阻害剤のスクリーニング方法 - Google Patents
Ａｓｐ２の阻害剤のスクリーニング方法Info
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Abstract
(57)【要約】
Ａｓｐ２が介在するポリペプチドまたは蛋白基質の切断を阻害する化合物を同定するために化合物をスクリーニングする方法であって、Ａｓｐ２および基質を含む反応系を提供し；試験化合物不在下での切断の程度と比較した試験化合物の存在下での基質の切断の程度を測定することを特徴とする方法、およびそれにより同定される化合物、ならびにＡｓｐ２制御のＡＰＰ切断の阻害剤である化合物およびＡＤを含むβアミロイド蛋白に関連する疾患の治療または予防を包含する治療におけるそれらの使用。
Description
【０００１】
（技術分野）
本発明は治療において有用である可能性のある化合物を同定するのに用いられ
るアッセイに関する。本発明はまた治療にてポリペプチドを切断するモジュレー
ターの使用に関する。
るアッセイに関する。本発明はまた治療にてポリペプチドを切断するモジュレー
ターの使用に関する。
【０００２】
（従来技術）
βアミロイド（Ａβ）蛋白関連疾患は、Ａβ蛋白の不溶性沈殿物が脳内に沈殿
することにより特徴付けられる、一群の異種の障害である（Roberts G W、Leigh
P N およびWeinberger D. Neuropsychiatric Disorders．Gower Medical Press
．London １９９３）。実質的な数のＡβ蛋白が沈殿した結果、認識力が低下し
、痴呆が向上する臨床的症候群が出現する。かかる沈殿物は多くの痴呆性症候群
に存在することが知られており、これらの症候群としてアルツハイマー病、皮質
レビ小体病、パーキンソン病およびダウン症候群の患者におけるアルツハイマー
型疾患が挙げられる。加えて、Ａβ沈殿物は血管疾患および脳血管疾患の患者の
脳にも存在し（Adams J H およびDuchen L W （編）Greenfields Neuropatholog
y 第５版、Edward Arnold、London １９９２）、これらの後者の症状は上記した
疾患に罹患しやすくするか、またはその原因となりうる。
することにより特徴付けられる、一群の異種の障害である（Roberts G W、Leigh
P N およびWeinberger D. Neuropsychiatric Disorders．Gower Medical Press
．London １９９３）。実質的な数のＡβ蛋白が沈殿した結果、認識力が低下し
、痴呆が向上する臨床的症候群が出現する。かかる沈殿物は多くの痴呆性症候群
に存在することが知られており、これらの症候群としてアルツハイマー病、皮質
レビ小体病、パーキンソン病およびダウン症候群の患者におけるアルツハイマー
型疾患が挙げられる。加えて、Ａβ沈殿物は血管疾患および脳血管疾患の患者の
脳にも存在し（Adams J H およびDuchen L W （編）Greenfields Neuropatholog
y 第５版、Edward Arnold、London １９９２）、これらの後者の症状は上記した
疾患に罹患しやすくするか、またはその原因となりうる。
【０００３】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、臨床的には痴呆により、神経病理学的には多数
の老人斑および神経原線維タングルの存在により特徴付けられる中枢神経系の進
行性消耗性疾患である。ＡＤは、典型的には、老人の後期発症性疾患である。し
かしながら、この疾患の早期発症形態が年齢に依存した浸透率で常染色体性優性
遺伝子として遺伝する家系がわずかながら報告されている。該疾患を発症する年
齢は６０歳より下であることが最も一般的である。遺伝子は早期および後期発症
ＡＤの両方に関与している。 脳における３９−４３残基のアミロイド−β蛋白の生成および沈殿（Ａβ、Gl
enner,G.G.＆Wong,C.W. Biochem.Biophys.Res.Commun. １２０、８８５−８９０
（１９８４））はＡＤの不変的神経病理学的特徴である。Ａβは、まずβ−セク
レターゼ、ついでγ−セクレターゼの連続的作用により、１型インテグラル膜か
ら糖蛋白であるアミロイド先駆体蛋白（ＡＰＰ）が切断されることで産生される
（Selkoe,D.J. Annu.Rev.Cell.Biol. １０、３７３−４０３（１９９４））。
の老人斑および神経原線維タングルの存在により特徴付けられる中枢神経系の進
行性消耗性疾患である。ＡＤは、典型的には、老人の後期発症性疾患である。し
かしながら、この疾患の早期発症形態が年齢に依存した浸透率で常染色体性優性
遺伝子として遺伝する家系がわずかながら報告されている。該疾患を発症する年
齢は６０歳より下であることが最も一般的である。遺伝子は早期および後期発症
ＡＤの両方に関与している。 脳における３９−４３残基のアミロイド−β蛋白の生成および沈殿（Ａβ、Gl
enner,G.G.＆Wong,C.W. Biochem.Biophys.Res.Commun. １２０、８８５−８９０
（１９８４））はＡＤの不変的神経病理学的特徴である。Ａβは、まずβ−セク
レターゼ、ついでγ−セクレターゼの連続的作用により、１型インテグラル膜か
ら糖蛋白であるアミロイド先駆体蛋白（ＡＰＰ）が切断されることで産生される
（Selkoe,D.J. Annu.Rev.Cell.Biol. １０、３７３−４０３（１９９４））。
【０００４】
ＡＰＰはα−またはβ−セクレターゼにより細胞中で切断することができ、そ
の結果、該蛋白の可溶性Ｎ−末端フラグメント（ｓＡＰＰαおよびｓＡＰＰβ）
が遊離する。得られた膜アンカーのＣ−末端フラグメント（ＣＴＦαおよびＣＴ
Ｆβ）がγ−セクレターゼの基質であり；ＣＴＦαを切断すると３ｋＤａのペプ
チドｐ３が生じ、ＣＴＦβの切断でＡβペプチドが生じる。β−セクレターゼの
切断事象は、粗面小胞体およびトランス−ゴルジ網を含む、数種の細胞内オルガ
ネラ内で生じることが明らかにされている（Hartmann.ら、Nature Medicine. ３
、１０１６−１０２０（１９９７）；Cook,D.G.ら、Nature Medicine. ３、１０
２１−１０２３（１９９７）；Wild-Bode,C.ら、J.Biol.Chem. ２７２、１６０
８５−１６０８８（１９９７））。Ａβはその分泌前に細胞内で遅い速度で生成
され、時間と共に培養細胞に蓄積するＡβの神経内プールが報告されている（Sk
ovronsky,D.M.、Doms,R.W.＆Lee,V.M.-Y.、J.Biol.Chem. １４１、１０３１−１
０３９（１９９８））。
の結果、該蛋白の可溶性Ｎ−末端フラグメント（ｓＡＰＰαおよびｓＡＰＰβ）
が遊離する。得られた膜アンカーのＣ−末端フラグメント（ＣＴＦαおよびＣＴ
Ｆβ）がγ−セクレターゼの基質であり；ＣＴＦαを切断すると３ｋＤａのペプ
チドｐ３が生じ、ＣＴＦβの切断でＡβペプチドが生じる。β−セクレターゼの
切断事象は、粗面小胞体およびトランス−ゴルジ網を含む、数種の細胞内オルガ
ネラ内で生じることが明らかにされている（Hartmann.ら、Nature Medicine. ３
、１０１６−１０２０（１９９７）；Cook,D.G.ら、Nature Medicine. ３、１０
２１−１０２３（１９９７）；Wild-Bode,C.ら、J.Biol.Chem. ２７２、１６０
８５−１６０８８（１９９７））。Ａβはその分泌前に細胞内で遅い速度で生成
され、時間と共に培養細胞に蓄積するＡβの神経内プールが報告されている（Sk
ovronsky,D.M.、Doms,R.W.＆Lee,V.M.-Y.、J.Biol.Chem. １４１、１０３１−１
０３９（１９９８））。
【０００５】
ＡＰＰの工程に関与するセクレターゼは同定されていないが、阻害剤の研究に
より、α−セクレターゼはメタロプロテイナーゼであることが示唆されている（
Parvathy,S.、Hussain,I.、Karran,E.H.、Turner,A.J.＆Hooper,N.M.、Biochemi
stry ３７、１６８０−１６８５（１９９８））。β−セクレターゼの多くの候
補体が提案されており、例えば、プロテアソーム（Ishiura,S.、Tsukahara,T.、
Tabira,T.＆Sugita,H.、FEBS Lett. ２５７、３８８−３９２（１９８９）)、メ
タロプロテイナーゼチメット（McDermott,J.R.、Biggins,J.A.＆Gibson,A.M.、B
iochem.Biophys.Res.Commun. １８５、７４６−７５２（１９９２））、数種の
チモトリプシン様セリンプロテイナーゼ（Nelson,R.B.、Siman,R.、Iqbal,M.A.
＆Potter,H.、J. Neurochem ６１、５６７−５７７（１９９３）；Sahasrabudhe
,S.R.ら、J.Biol.Chem. ２６８、１６６９９−１６７０５（１９９３）；Savage
,M.J.ら、Neuroscience ６０、６０７−６１９（１９９４））、メタロプロテイ
ナーゼＭＰ７８（Thompson,A.、Grueninger-Leitch,F.、Huber,G.＆Malherde P.
、Brain Res. ４８、２０６−２１４（１９９７））およびＭＰ１００（Huber,G
.ら、J.Neurochem. ７２、１２１５−１２２３（１９９９））ならびにカテプシ
ンＤ（Ladror,U.S.、Snyder,S.W.、Wang,G.T.、Holzman,T.F.＆Krafft,G.A.、J.
Biol.Chem. ２６９、１８４２２−１８４２８（１９９４））などが斟酌されて
いる。最近では、プレセニリン−１がγ−セクレターゼに対する独特なジアスパ
ルチル共同因子であるか、またはγ−セクレターゼその物であると報告されてい
る（Wolfe,M.S.ら、Nature. ３９８、５１３−５１７（１９９９））。ＷＯ９６
／４００８５は、ヒト脳組織およびヒト２９３細胞から単離した、ゲル排除クロ
マトグラフィーで測定した場合に２６０ｋＤａないし３００ｋＤａの範囲にある
見かけ分子量の、β−セクレターゼ候補体を提案している。
より、α−セクレターゼはメタロプロテイナーゼであることが示唆されている（
Parvathy,S.、Hussain,I.、Karran,E.H.、Turner,A.J.＆Hooper,N.M.、Biochemi
stry ３７、１６８０−１６８５（１９９８））。β−セクレターゼの多くの候
補体が提案されており、例えば、プロテアソーム（Ishiura,S.、Tsukahara,T.、
Tabira,T.＆Sugita,H.、FEBS Lett. ２５７、３８８−３９２（１９８９）)、メ
タロプロテイナーゼチメット（McDermott,J.R.、Biggins,J.A.＆Gibson,A.M.、B
iochem.Biophys.Res.Commun. １８５、７４６−７５２（１９９２））、数種の
チモトリプシン様セリンプロテイナーゼ（Nelson,R.B.、Siman,R.、Iqbal,M.A.
＆Potter,H.、J. Neurochem ６１、５６７−５７７（１９９３）；Sahasrabudhe
,S.R.ら、J.Biol.Chem. ２６８、１６６９９−１６７０５（１９９３）；Savage
,M.J.ら、Neuroscience ６０、６０７−６１９（１９９４））、メタロプロテイ
ナーゼＭＰ７８（Thompson,A.、Grueninger-Leitch,F.、Huber,G.＆Malherde P.
、Brain Res. ４８、２０６−２１４（１９９７））およびＭＰ１００（Huber,G
.ら、J.Neurochem. ７２、１２１５−１２２３（１９９９））ならびにカテプシ
ンＤ（Ladror,U.S.、Snyder,S.W.、Wang,G.T.、Holzman,T.F.＆Krafft,G.A.、J.
Biol.Chem. ２６９、１８４２２−１８４２８（１９９４））などが斟酌されて
いる。最近では、プレセニリン−１がγ−セクレターゼに対する独特なジアスパ
ルチル共同因子であるか、またはγ−セクレターゼその物であると報告されてい
る（Wolfe,M.S.ら、Nature. ３９８、５１３−５１７（１９９９））。ＷＯ９６
／４００８５は、ヒト脳組織およびヒト２９３細胞から単離した、ゲル排除クロ
マトグラフィーで測定した場合に２６０ｋＤａないし３００ｋＤａの範囲にある
見かけ分子量の、β−セクレターゼ候補体を提案している。
【０００６】
Ａｓｐ２（エンドクレプシン２としても知られている）は、脳および膵臓にお
いて高レベルでの発現を示す、貫膜アスパルチルプロテイナーゼである（ＥＰ０
８５５４４４）。その後、１３０位の残基は、ＥＰ０８５５４４４（Hussain,I.
ら、Molec.Cell.Neuosci, １４、４１９−４２７（１９９９））に記載されるよ
うにグルタミン酸ではなく、バリンであることがわかった。細胞中に一時的にト
ランスフェクトさせた後に、ゲル電気泳動により測定した場合、プロテイナーゼ
の分子量は６０−６５ｋＤａである。成熟形態のＡｓｐ２は残基Ｇｌｕ４６から
始まる（Sinha.S.ら、Nature ４０２、５３７−５４０（１９９９））。スプラ
イス変異体もまた見つかった（ＷＯ００／１７３６９）。 Gloshらは、J.Amer.Chem.Soc.（２０００）１２２、３５２２−３５２３にお
いて、ＯＭ９９−２（Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ＊Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌ
ｕ−Ｐｈｅ、ここで＊はヒドロキシエチレン遷移状態のアイソスターを示す）を
含む、メマプシン２（Ａｓｐ２）の阻害剤を開示する。
いて高レベルでの発現を示す、貫膜アスパルチルプロテイナーゼである（ＥＰ０
８５５４４４）。その後、１３０位の残基は、ＥＰ０８５５４４４（Hussain,I.
ら、Molec.Cell.Neuosci, １４、４１９−４２７（１９９９））に記載されるよ
うにグルタミン酸ではなく、バリンであることがわかった。細胞中に一時的にト
ランスフェクトさせた後に、ゲル電気泳動により測定した場合、プロテイナーゼ
の分子量は６０−６５ｋＤａである。成熟形態のＡｓｐ２は残基Ｇｌｕ４６から
始まる（Sinha.S.ら、Nature ４０２、５３７−５４０（１９９９））。スプラ
イス変異体もまた見つかった（ＷＯ００／１７３６９）。 Gloshらは、J.Amer.Chem.Soc.（２０００）１２２、３５２２−３５２３にお
いて、ＯＭ９９−２（Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ＊Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌ
ｕ−Ｐｈｅ、ここで＊はヒドロキシエチレン遷移状態のアイソスターを示す）を
含む、メマプシン２（Ａｓｐ２）の阻害剤を開示する。
【０００７】
本発明はＡｓｐ２がＡＰＰのβ−セクレターゼ切断経路にて機能しうるという
知見に基づくものである。プロテイナーゼは、それがＡＤの脳を含む、脳に存在
し、Ａβを産生することが知られている細胞系にて見出されており、７５１アミ
ノ酸のＡＰＰのイソ型を安定して発現する細胞のゴルジ／小胞体にてＡＰＰと共
に局在化している点で、β−セクレターゼの予想される多くの特徴を有する。加
えて、Ａｓｐ２は触媒性ドメインを有するＩ型インテグラル膜蛋白であり、膜オ
ルガネラのルーメンに存することもわかった。Ａｓｐ２のＡＰＰ発現細胞へのト
ランスフェクションは細胞におけるβ−セクレターゼ活性の増加をもたらし、そ
の結果、ｓＡＰＰβが培地に分泌され、Ｃ−末端フラグメント由来のβ−セクレ
ターゼが蓄積される。提案されているＡｓｐ２の触媒性アスパルチル残基が成熟
すると、ＡＰＰのβ−セクレターゼ切断の特徴であるこれらフラグメントの産生
がなくなる。これらの知見はＡｓｐ２の蛋白分解活性を阻害することが、アルツ
ハイマー病を含む、βアミロイド蛋白−関連疾患の治療に関する療法において有
用である可能性があることを示唆する。
知見に基づくものである。プロテイナーゼは、それがＡＤの脳を含む、脳に存在
し、Ａβを産生することが知られている細胞系にて見出されており、７５１アミ
ノ酸のＡＰＰのイソ型を安定して発現する細胞のゴルジ／小胞体にてＡＰＰと共
に局在化している点で、β−セクレターゼの予想される多くの特徴を有する。加
えて、Ａｓｐ２は触媒性ドメインを有するＩ型インテグラル膜蛋白であり、膜オ
ルガネラのルーメンに存することもわかった。Ａｓｐ２のＡＰＰ発現細胞へのト
ランスフェクションは細胞におけるβ−セクレターゼ活性の増加をもたらし、そ
の結果、ｓＡＰＰβが培地に分泌され、Ｃ−末端フラグメント由来のβ−セクレ
ターゼが蓄積される。提案されているＡｓｐ２の触媒性アスパルチル残基が成熟
すると、ＡＰＰのβ−セクレターゼ切断の特徴であるこれらフラグメントの産生
がなくなる。これらの知見はＡｓｐ２の蛋白分解活性を阻害することが、アルツ
ハイマー病を含む、βアミロイド蛋白−関連疾患の治療に関する療法において有
用である可能性があることを示唆する。
【０００８】
したがって、本発明は、ポリペプチドまたは蛋白基質のＡｓｐ２介在切断を阻
害する化合物を同定するために化合物をスクリーニングする方法であって、Ａｓ
ｐ２および基質を含む反応系を準備し、試験化合物の存在下での基質の切断の程
度を試験化合物の不存在下での切断の程度と比較して測定することを含む、方法
を提供する。本発明はまたそれにより同定された化合物ならびにＡＤを含めβア
ミロイド蛋白関連の疾患の治療または予防を含む療法におけるその使用に関する
。 基質はＡｓｐ２酵素により加水分解されうる蛋白またはペプチドである。これ
は非特異的蛋白基質であってもよく、例えば、カゼイン、ヘモグロビン、インス
リンＢ−鎖、チトクロムＣなどである。それはまた、全長の組換え体または末端
切断したアミロイド先駆体蛋白である。基質はまたペプチドであってもよく、よ
り大きな蛋白の合成フラグメントであることも多い。例えば、ＡＰＰのβ−セク
レターゼ切断部位に広がるペプチドは都合のよい基質として供することができ、
野生型β‐部位配列（Ｐ６からＰ５’まで、Berger,A.＆Schecter,I. Philos.Tr
ans.R.Soc.Lond.［Biol.]２５７、２４９−２６４（１９７０）） Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg（配列番号１） またはスウェーデン変異体配列（Ｐ６からＰ５’まで） Ile-Ser-Glu-Val-Asn-Leu-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg（配列番号２） または野生型またはスウェーデン変異体配列のより小さなもしくはより大きなペ
プチド、およびこれらの配列を基礎とする他の変異体を含む、このペプチドを用
いることができるかもしれない。
害する化合物を同定するために化合物をスクリーニングする方法であって、Ａｓ
ｐ２および基質を含む反応系を準備し、試験化合物の存在下での基質の切断の程
度を試験化合物の不存在下での切断の程度と比較して測定することを含む、方法
を提供する。本発明はまたそれにより同定された化合物ならびにＡＤを含めβア
ミロイド蛋白関連の疾患の治療または予防を含む療法におけるその使用に関する
。 基質はＡｓｐ２酵素により加水分解されうる蛋白またはペプチドである。これ
は非特異的蛋白基質であってもよく、例えば、カゼイン、ヘモグロビン、インス
リンＢ−鎖、チトクロムＣなどである。それはまた、全長の組換え体または末端
切断したアミロイド先駆体蛋白である。基質はまたペプチドであってもよく、よ
り大きな蛋白の合成フラグメントであることも多い。例えば、ＡＰＰのβ−セク
レターゼ切断部位に広がるペプチドは都合のよい基質として供することができ、
野生型β‐部位配列（Ｐ６からＰ５’まで、Berger,A.＆Schecter,I. Philos.Tr
ans.R.Soc.Lond.［Biol.]２５７、２４９−２６４（１９７０）） Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg（配列番号１） またはスウェーデン変異体配列（Ｐ６からＰ５’まで） Ile-Ser-Glu-Val-Asn-Leu-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg（配列番号２） または野生型またはスウェーデン変異体配列のより小さなもしくはより大きなペ
プチド、およびこれらの配列を基礎とする他の変異体を含む、このペプチドを用
いることができるかもしれない。
【０００９】
Ａｓｐ２基質配列をコードするように修飾された大きな蛋白もまたスクリーニ
ングのための有用な基質として供することができる。例えば、マルトース結合蛋
白（ＭＢＰ）をそのＣ−末端で野生型またはスウェーデン変異体のβ−部位配列
をコードするように修飾し、 マルトース結合蛋白−Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg （野生型β−部位）（配列番号３） マルトース結合蛋白−Ile-Ser-Glu-Val-Asn-Leu-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg （スウェーデン変異体β−部位）（配列番号４） を産生することができる。
ングのための有用な基質として供することができる。例えば、マルトース結合蛋
白（ＭＢＰ）をそのＣ−末端で野生型またはスウェーデン変異体のβ−部位配列
をコードするように修飾し、 マルトース結合蛋白−Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg （野生型β−部位）（配列番号３） マルトース結合蛋白−Ile-Ser-Glu-Val-Asn-Leu-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg （スウェーデン変異体β−部位）（配列番号４） を産生することができる。
【００１０】
これらをさらにＣ−末端Ｑ−タグ（Leu-Ser-Leu-Ser-Gln-Ser-Lys-Val-Leu-Pr
o-Gly-Pro（配列番号５）をコードするように修飾し、 マルトース結合蛋白−Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-Le
u-Ser-Leu-Ser-Gln-Ser-Lys-Val-Leu-Pro-Gly-Pro（野生型β−部位）（配列番
号６） マルトース結合蛋白−Ile-Ser-Glu-Val-Asn-Leu-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-Le
u-Ser-Leu-Ser-Gln-Ser-Lys-Val-Leu-Pro-Gly-Pro（スウェーデン変異体β−部
位）（配列番号７） を産生することができる。
o-Gly-Pro（配列番号５）をコードするように修飾し、 マルトース結合蛋白−Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-Le
u-Ser-Leu-Ser-Gln-Ser-Lys-Val-Leu-Pro-Gly-Pro（野生型β−部位）（配列番
号６） マルトース結合蛋白−Ile-Ser-Glu-Val-Asn-Leu-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-Le
u-Ser-Leu-Ser-Gln-Ser-Lys-Val-Leu-Pro-Gly-Pro（スウェーデン変異体β−部
位）（配列番号７） を産生することができる。
【００１１】
これらの蛋白をＱ−タグを介して蛍光標識し、種々の蛍光フォーマットでの使
用に適する基質を形成することができる。 該アッセイは、ＷＯ９６／４０８８５に記載されるような、従来のアッセイフ
ォーマットを用いる無細胞または細胞を基礎とする反応系にて行うことができる
。 本発明において使用されるＡｓｐ２酵素として、スプライス変異体を含むイソ
形態が挙げられる。 細胞を基礎とするアッセイは、Ａｓｐ２および基質をコードするＤＮＡを含有
する発現ベクターでの同時トランスフェクションを含むであろう。 切断産物の存在は、基質フラグメントに拮抗して産生されるポリクローナルま
たはモノクローナル抗体を用いることによって宿主細胞の蛋白含量を検定するこ
とにより検出することができる。いずれか適当な配置の免疫アッセイ、例えば、
ウェスタンブロットアッセイまたはＥＬＩＳＡを利用してもよい。
用に適する基質を形成することができる。 該アッセイは、ＷＯ９６／４０８８５に記載されるような、従来のアッセイフ
ォーマットを用いる無細胞または細胞を基礎とする反応系にて行うことができる
。 本発明において使用されるＡｓｐ２酵素として、スプライス変異体を含むイソ
形態が挙げられる。 細胞を基礎とするアッセイは、Ａｓｐ２および基質をコードするＤＮＡを含有
する発現ベクターでの同時トランスフェクションを含むであろう。 切断産物の存在は、基質フラグメントに拮抗して産生されるポリクローナルま
たはモノクローナル抗体を用いることによって宿主細胞の蛋白含量を検定するこ
とにより検出することができる。いずれか適当な配置の免疫アッセイ、例えば、
ウェスタンブロットアッセイまたはＥＬＩＳＡを利用してもよい。
【００１２】
無細胞アッセイは、適当な反応緩衝液中に、所望によりＦｃ融合部としてであ
ってもよい精製された組換えＡｓｐ２および基質を含むであろう。該酵素は優勢
的に成熟形態であることが好ましい。 該酵素は蛋白Ａアフィニティークロマトグラフィーを用いる精製を容易にする
ためにＦｃ融合部として存在してもよい。このＦｃ融合部はヒトＩｇＧから誘導
されるのが適当である。
ってもよい精製された組換えＡｓｐ２および基質を含むであろう。該酵素は優勢
的に成熟形態であることが好ましい。 該酵素は蛋白Ａアフィニティークロマトグラフィーを用いる精製を容易にする
ためにＦｃ融合部として存在してもよい。このＦｃ融合部はヒトＩｇＧから誘導
されるのが適当である。
【００１３】
無細胞アッセイにおいて、その切断産物は上記したようにイムノアッセイによ
り検出することができる。また、ペプチド基質は、切断部位をはさんで広がる、
一対のマーカー基を含有していてもよい。切断によりマーカーを分離し、これら
のマーカーの同時局在化を反映する技法を用いて検出することができる。検出は
２つのマーカーの間にある視覚的相互作用によるものであってもよく、あるいは
より一般的には、基質での同時局在化によるシグナル発生であってもよい。視覚
的相互作用を基礎とする技法は、Forster理論により説明されるように、蛍光エ
ネルギー移動（ＦＱ）および冷光エネルギー移動（SelvinおよびHearst、Proc.N
at.Acad.Sci.USA、１９９４、９１、１００２４）を包含する。並進または旋回
拡散の変化を基礎とするアッセイは、蛍光相関的分光法（ＦＣＳ）（Eigenおよ
びRigler、Proc.Nat.Acad.Sci.USA、１９９４、９１、５７４０）および蛍光偏
光法（ＦＣＳ）（fluorescence polarisation）（Levineら、Anal Biochem.、１
９９７、２４７、８３）を包含する。放射活性を基礎とするアッセイはシンチレ
ーション近接アッセイおよびニトロセルロース濾過技法を包含する。表面吸収技
法は、吸収、蛍光、化学ルミネセンスまたは時間分解蛍光（ＴＲＦ）検出のいず
れかを用いる免疫アッセイを包含する（Wallac OY、フィンランド）。
り検出することができる。また、ペプチド基質は、切断部位をはさんで広がる、
一対のマーカー基を含有していてもよい。切断によりマーカーを分離し、これら
のマーカーの同時局在化を反映する技法を用いて検出することができる。検出は
２つのマーカーの間にある視覚的相互作用によるものであってもよく、あるいは
より一般的には、基質での同時局在化によるシグナル発生であってもよい。視覚
的相互作用を基礎とする技法は、Forster理論により説明されるように、蛍光エ
ネルギー移動（ＦＱ）および冷光エネルギー移動（SelvinおよびHearst、Proc.N
at.Acad.Sci.USA、１９９４、９１、１００２４）を包含する。並進または旋回
拡散の変化を基礎とするアッセイは、蛍光相関的分光法（ＦＣＳ）（Eigenおよ
びRigler、Proc.Nat.Acad.Sci.USA、１９９４、９１、５７４０）および蛍光偏
光法（ＦＣＳ）（fluorescence polarisation）（Levineら、Anal Biochem.、１
９９７、２４７、８３）を包含する。放射活性を基礎とするアッセイはシンチレ
ーション近接アッセイおよびニトロセルロース濾過技法を包含する。表面吸収技
法は、吸収、蛍光、化学ルミネセンスまたは時間分解蛍光（ＴＲＦ）検出のいず
れかを用いる免疫アッセイを包含する（Wallac OY、フィンランド）。
【００１４】
このように、基質の切断は、直接的または間接的に、シグナル、例えば放射活
性、冷光または蛍光シグナルの調節をもたらす。 あるマーカー基はシグナルジェネレーターを有し、あるいは別個のレポーター
システムとの結合能を有する。レポーターシステムそれ自体がシグナルジェネレ
ーターを有していてもよく、あるいはさらなるシグナルジェネレーターに結合し
てもよい。他のマーカー基がモジュレーターとして機能し、あるいは結合した複
合体それ自体が分子との結合能を有し、その結果、モジュレーターとして機能す
る。 シグナルジェネレーター基として、例えば、放射活性、冷光（三重項状態発光
）および蛍光（一重項状態発光）標識が挙げられる。
性、冷光または蛍光シグナルの調節をもたらす。 あるマーカー基はシグナルジェネレーターを有し、あるいは別個のレポーター
システムとの結合能を有する。レポーターシステムそれ自体がシグナルジェネレ
ーターを有していてもよく、あるいはさらなるシグナルジェネレーターに結合し
てもよい。他のマーカー基がモジュレーターとして機能し、あるいは結合した複
合体それ自体が分子との結合能を有し、その結果、モジュレーターとして機能す
る。 シグナルジェネレーター基として、例えば、放射活性、冷光（三重項状態発光
）および蛍光（一重項状態発光）標識が挙げられる。
【００１５】
別個のレポーターシステムとの結合能を有するマーカー基として、例えば、抗
体、酵素および受容体についてのリガンドが挙げられる。抗体、酵素または受容
体のレポーター系はその自体を標識するか、免疫アッセイにて関連付けることが
できる。かかるリガンドの適当な例は、抗−ジニトロフェノール抗体で捕獲され
、つづいて適当な免疫アッセイで検出することのできるジニトロフェノールであ
る。 モジュレーター基として、例えば、標識および部分が基質と共有結合するかま
たは非共有結合した場合に、蛍光または冷光標識の光学特性あるいは全体として
の基質の光学特性を調節する部分が挙げられる。基質を蛋白分解性切断に付した
後、標識の、または全体としての分子の光学特性を蛋白分解活性を分光学的にモ
ニター観察できるように調節する。
体、酵素および受容体についてのリガンドが挙げられる。抗体、酵素または受容
体のレポーター系はその自体を標識するか、免疫アッセイにて関連付けることが
できる。かかるリガンドの適当な例は、抗−ジニトロフェノール抗体で捕獲され
、つづいて適当な免疫アッセイで検出することのできるジニトロフェノールであ
る。 モジュレーター基として、例えば、標識および部分が基質と共有結合するかま
たは非共有結合した場合に、蛍光または冷光標識の光学特性あるいは全体として
の基質の光学特性を調節する部分が挙げられる。基質を蛋白分解性切断に付した
後、標識の、または全体としての分子の光学特性を蛋白分解活性を分光学的にモ
ニター観察できるように調節する。
【００１６】
モジュレーターとして機能することのできる、あるいは分子と結合し、モジュ
レーター複合体を形成することのできる基として、例えば、ストレプトアビジン
またはアビジンとの結合能を有するビオチンリガンドなどの蛋白用のリガンド、
または溶液のまたは固定されていない抗体用のハプテンが挙げられる。ビオチン
リガンドは、適当なリンカー基、例えばアミノヘキサノイルで誘導されていても
よいビオチンを包含する。 シグナルジェネレーター基および蛍光シグナルジェネレーターの光学特性を調
節する他のモジュレーター基として、フルオロホール（吸収および蛍光スペクト
ルの範囲を示す分子ファミリー）、例えばクマリン、キサンテン（ローダミン、
ロードールおよびフルオレセインを含む）、フルオレスカミン誘導体、ナフタレ
ン、ピレン、キノリン、レソルフィン、ジフルオロボラジアザインダセン、アク
リジン、ピリジルオキサドール、イソインドール、ダンシル、ダブチル、ダブシ
ル、ベンゾフラニル、フタルイミド、ナフタールイミドおよびフタール性ヒドラ
ジド（ルミノールおよびイソルミノールを含む）が挙げられる。
レーター複合体を形成することのできる基として、例えば、ストレプトアビジン
またはアビジンとの結合能を有するビオチンリガンドなどの蛋白用のリガンド、
または溶液のまたは固定されていない抗体用のハプテンが挙げられる。ビオチン
リガンドは、適当なリンカー基、例えばアミノヘキサノイルで誘導されていても
よいビオチンを包含する。 シグナルジェネレーター基および蛍光シグナルジェネレーターの光学特性を調
節する他のモジュレーター基として、フルオロホール（吸収および蛍光スペクト
ルの範囲を示す分子ファミリー）、例えばクマリン、キサンテン（ローダミン、
ロードールおよびフルオレセインを含む）、フルオレスカミン誘導体、ナフタレ
ン、ピレン、キノリン、レソルフィン、ジフルオロボラジアザインダセン、アク
リジン、ピリジルオキサドール、イソインドール、ダンシル、ダブチル、ダブシ
ル、ベンゾフラニル、フタルイミド、ナフタールイミドおよびフタール性ヒドラ
ジド（ルミノールおよびイソルミノールを含む）が挙げられる。
【００１７】
適当な標識／モジュレーター対として、例えば、従来の蛍光エネルギー移動ま
たはクエンチされた蛍光（ＦＱ）の供与／受容体システム、例えばローダミン／
ローダミン、特にローダミングリーン／テトラメチルローダミン、フルオレセイ
ン／クマリン、５−ジメチルアミノ−１−ナフタレンスルホニル（ＤＡＮＳＹＬ
）／４−(４’−ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）または
５−(２−アミノエチル)アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）／Ｄ
ＡＢＣＹＬが挙げられ、それにより受容体の吸収スペクトルが供与体の発光スペ
クトルと重なり、Forster（１９４８）理論に従って、ペプチドが切断されると
エネルギー移動の変化が観察される。 ＦＱを用いて検出する場合、対となるマーカー基は、組み合わせＥＤＡＮＳ／
ＤＡＢＣＹＬおよびフルオレセイン／ロダミンを有するアミノ酸より選択される
ことが好ましい。この対は５−（および／または６−）カルボキシフルオレセイ
ンと５−（および／または６−）テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）とであ
ることが最も好ましい。
たはクエンチされた蛍光（ＦＱ）の供与／受容体システム、例えばローダミン／
ローダミン、特にローダミングリーン／テトラメチルローダミン、フルオレセイ
ン／クマリン、５−ジメチルアミノ−１−ナフタレンスルホニル（ＤＡＮＳＹＬ
）／４−(４’−ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）または
５−(２−アミノエチル)アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）／Ｄ
ＡＢＣＹＬが挙げられ、それにより受容体の吸収スペクトルが供与体の発光スペ
クトルと重なり、Forster（１９４８）理論に従って、ペプチドが切断されると
エネルギー移動の変化が観察される。 ＦＱを用いて検出する場合、対となるマーカー基は、組み合わせＥＤＡＮＳ／
ＤＡＢＣＹＬおよびフルオレセイン／ロダミンを有するアミノ酸より選択される
ことが好ましい。この対は５−（および／または６−）カルボキシフルオレセイ
ンと５−（および／または６−）テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）とであ
ることが最も好ましい。
【００１８】
別の標識の例として、（例えば、具体的には均一系時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）
技法またはランタニドキレート励起（ＬＡＮＣＥ）技法により示される）ランタ
ニド共鳴エネルギーを蛍光またはクロモホール受容体に移すための発光用供与体
としてのランタニドイオン（典型的には、テルビウムおよびユーロピウム）が挙
げられる。スピン−カップリングしたランタニド供与体のクエンチもまた、酸化
窒素ラジカル受容体、典型的にはピペリジニルオキシまたはピロリジニルオキシ
ラジカルを用いて行うこともできる（M.V.Rogers（１９９７）DDT ２（４）１５
６を参照のこと）。
技法またはランタニドキレート励起（ＬＡＮＣＥ）技法により示される）ランタ
ニド共鳴エネルギーを蛍光またはクロモホール受容体に移すための発光用供与体
としてのランタニドイオン（典型的には、テルビウムおよびユーロピウム）が挙
げられる。スピン−カップリングしたランタニド供与体のクエンチもまた、酸化
窒素ラジカル受容体、典型的にはピペリジニルオキシまたはピロリジニルオキシ
ラジカルを用いて行うこともできる（M.V.Rogers（１９９７）DDT ２（４）１５
６を参照のこと）。
【００１９】
モジュレーター基が、基質を蛋白分解性切断に付した後の、全体としての基質
の光学特性を調節する部分である場合、適当な標識／モジュレーター対として、
例えば蛍光標識と、蛋白用リガンド、例えストレプトアビジンまたはアビジンと
の結合能を有するビオチンが挙げられる。切断によってもたらされるペプチドの
旋回拡散の変化は、蛍光偏光（ＦＰ）における変化を観察することによりモニタ
ーすることができる。また、蛍光相関的分光法（ＦＣＳ）を用いて旋回拡散の変
化をモニターすることもできる。 かくして、ＦＰまたはＦＣＳを用いて検出する場合、マーカー基は、上記した
ように、フルオロホールを有し、蛋白リガンド、例えばビオチン誘導体、または
ハプテン、例えばジフルオロボラジアザインダセン、ダンシル、ジニトロフェノ
ール、フルオロセイン、ドーダミンおよびナフタルイミドを有するアミノ酸が組
み合わされたアミノ酸から選択される。マーカー基対は、好ましくは、フルオロ
ホール／ビオチンリガンドを組み合わせたものである。該対はアミノヘキサネー
ト結合ビオチン（ビオチン−Ｘ）を組み合わせた５−（および／または６）−カ
ルボキシフルオレセインであることがより好ましい。
の光学特性を調節する部分である場合、適当な標識／モジュレーター対として、
例えば蛍光標識と、蛋白用リガンド、例えストレプトアビジンまたはアビジンと
の結合能を有するビオチンが挙げられる。切断によってもたらされるペプチドの
旋回拡散の変化は、蛍光偏光（ＦＰ）における変化を観察することによりモニタ
ーすることができる。また、蛍光相関的分光法（ＦＣＳ）を用いて旋回拡散の変
化をモニターすることもできる。 かくして、ＦＰまたはＦＣＳを用いて検出する場合、マーカー基は、上記した
ように、フルオロホールを有し、蛋白リガンド、例えばビオチン誘導体、または
ハプテン、例えばジフルオロボラジアザインダセン、ダンシル、ジニトロフェノ
ール、フルオロセイン、ドーダミンおよびナフタルイミドを有するアミノ酸が組
み合わされたアミノ酸から選択される。マーカー基対は、好ましくは、フルオロ
ホール／ビオチンリガンドを組み合わせたものである。該対はアミノヘキサネー
ト結合ビオチン（ビオチン−Ｘ）を組み合わせた５−（および／または６）−カ
ルボキシフルオレセインであることがより好ましい。
【００２０】
好ましい態様において、マーカー基対は蛍光−クエンチ（ＦＱ）、蛍光−偏光
（ＦＰ）または蛍光相関的分光学（ＦＣＳ）アッセイを提供する。 マーカー基は、蛍光と、リジン、オルニチン、システイン、ホモシステイン、
セリン、ホモセリンおよびチロシンなどの容易に化学修飾することのできる側鎖
を有するアミノ酸の蛋白リガンド誘導体であることが好ましい。
（ＦＰ）または蛍光相関的分光学（ＦＣＳ）アッセイを提供する。 マーカー基は、蛍光と、リジン、オルニチン、システイン、ホモシステイン、
セリン、ホモセリンおよびチロシンなどの容易に化学修飾することのできる側鎖
を有するアミノ酸の蛋白リガンド誘導体であることが好ましい。
【００２１】
好ましい態様において、マーカー基は、式：
【化２】
［式中、Ｒ１は、連結部分を介して直接または間接的に、リジンに結合する適当
なマーカー基より選択される］ で示される修飾リジン基であるか、またはその修飾リジン基を含み、マーカー基
対が一緒になって上記したマーカー基対を形成する。
なマーカー基より選択される］ で示される修飾リジン基であるか、またはその修飾リジン基を含み、マーカー基
対が一緒になって上記したマーカー基対を形成する。
【００２２】
基質はペプチド合成のいずれか適当な慣用的方法により調製することができる
。これは、例えば、固相合成におけるＦｍｏｃ−およびＢｏｃ−版を基礎とし、
鎖をアセンブリーするために順序かつフラグメントの変数またはその組み合わせ
を含む方法を包含する。さらに、また順序またはフラグメントの変数またはその
組み合わせを利用する、溶液方法によってペプチドを化学合成する多様な方法も
包含する。酵素カップリングなどを基礎とする方法等の別の合成方法も考えるこ
とができる。ペプチドを合成するのに、可能な多くの変数、例えば、異なる保護
基、樹脂およびリンカー、カップリング試薬、溶媒、脱遮断剤などで開始する変
数があることは当業者であれば理解するであろう。かかる方法の例示を、例えば
、「Solid Phase Synthesis by J M Stewart and J D Young」、サンフランシス
コ、フリーマン、１９６９；「The Chemical Synthesis of Peptides」、J Jone
s、Clarendon Press、オックスフォード、１９９１；「Principles of Peptide
Synthesis」、M Bodanszky、Springer-Verlag、NY、NY、１９８４；「Solid Pha
se Peptide Synthesis」、E AthertonおよびR C Sheppard、IRL Press、Oxford
University Press、オックスフォード、１９８９を含む、教科書に見ることがで
きる。より近代的な方法が、「Innovations and Perspectives in Solid Phase
Synthesis」、R Epton編を含む、最近のシンポジウムの、ならびにヨーロピアン
・アンド・アメリカン・ペプチド・ソサイエティーにより計画され、表題「ペプ
チド」の下に公開されたシンポジウムの、一連の周知のプロシーディング（Proc
eedings）に記載されている。
。これは、例えば、固相合成におけるＦｍｏｃ−およびＢｏｃ−版を基礎とし、
鎖をアセンブリーするために順序かつフラグメントの変数またはその組み合わせ
を含む方法を包含する。さらに、また順序またはフラグメントの変数またはその
組み合わせを利用する、溶液方法によってペプチドを化学合成する多様な方法も
包含する。酵素カップリングなどを基礎とする方法等の別の合成方法も考えるこ
とができる。ペプチドを合成するのに、可能な多くの変数、例えば、異なる保護
基、樹脂およびリンカー、カップリング試薬、溶媒、脱遮断剤などで開始する変
数があることは当業者であれば理解するであろう。かかる方法の例示を、例えば
、「Solid Phase Synthesis by J M Stewart and J D Young」、サンフランシス
コ、フリーマン、１９６９；「The Chemical Synthesis of Peptides」、J Jone
s、Clarendon Press、オックスフォード、１９９１；「Principles of Peptide
Synthesis」、M Bodanszky、Springer-Verlag、NY、NY、１９８４；「Solid Pha
se Peptide Synthesis」、E AthertonおよびR C Sheppard、IRL Press、Oxford
University Press、オックスフォード、１９８９を含む、教科書に見ることがで
きる。より近代的な方法が、「Innovations and Perspectives in Solid Phase
Synthesis」、R Epton編を含む、最近のシンポジウムの、ならびにヨーロピアン
・アンド・アメリカン・ペプチド・ソサイエティーにより計画され、表題「ペプ
チド」の下に公開されたシンポジウムの、一連の周知のプロシーディング（Proc
eedings）に記載されている。
【００２３】
マーカー基の導入は、慣用的方法、例えば塩基性条件下、マーカー基の活性化
エステル（例えば、スクシンイミジル）、混合無水物（例えば、エトキシカルボ
ニル）、酸塩化物、マレイミド、イソシアニドまたはイソチオシアニド誘導体を
、単一のリジン、オルニチン、セリンまたはホモセリン残基がその側鎖に保護さ
れていない第一アミンまたはヒドロキシルを有する、その基礎となる基質（樹脂
結合した、または溶液中の）に添加することによりなされる。別法として、単一
のシステインまたはホモシステイン残基が保護されていないままである、基礎と
なる基質（樹脂結合した、または溶液中の）を、塩基性条件下、マーカー／受容
体基の主たるハロゲン化アルキルまたはマレイミド誘導体と反応させる。 一般に、試験化合物の不存在下での切断速度は、所定の時点での切断の程度と
して認識されるであろう。該アッセイは特定の時点での切断の阻害についての、
または切断速度についての試験である。
エステル（例えば、スクシンイミジル）、混合無水物（例えば、エトキシカルボ
ニル）、酸塩化物、マレイミド、イソシアニドまたはイソチオシアニド誘導体を
、単一のリジン、オルニチン、セリンまたはホモセリン残基がその側鎖に保護さ
れていない第一アミンまたはヒドロキシルを有する、その基礎となる基質（樹脂
結合した、または溶液中の）に添加することによりなされる。別法として、単一
のシステインまたはホモシステイン残基が保護されていないままである、基礎と
なる基質（樹脂結合した、または溶液中の）を、塩基性条件下、マーカー／受容
体基の主たるハロゲン化アルキルまたはマレイミド誘導体と反応させる。 一般に、試験化合物の不存在下での切断速度は、所定の時点での切断の程度と
して認識されるであろう。該アッセイは特定の時点での切断の阻害についての、
または切断速度についての試験である。
【００２４】
基質切断は、溶液中で、または固体支持体を利用して行うことができる。
基質添加する前に試験化合物をプロテアーゼと一緒にプレインキュベートして
もよく、また別法として基質を直接添加してもよい。プロテアーゼおよび基質の
最終濃度を、アッセイを行うのに適当な処理速度が得られるように計算する。例
えば、メタノールまたはトリフルオロ酢酸を添加することで反応を停止させ、慣
用的システムを用いて生成物を分析してもよい。 例えば、ＵＶ検出を行いながら、逆相ＨＰＬＣを使用することができる（例え
ば、Kuo,Dら、Biochemistry、８３４７（１９９４）およびAllsopら、Bioorgani
c and Med.Chem.Lett.、４４３（１９９５）を参照のこと）。試験化合物の活性
は所定の濃度での酵素活性の減少割合％として表すことができる。ＨＰＬＣアッ
セイにおいては、これは対照と比較した生成物のピーク面積の減少として計算さ
れる。基質がマーカー対を含有する場合、別法としてメタノールまたは外因結合
蛋白を用いて該反応を停止させ、利用するマーカー基の選択に適するいずれか慣
用的なシステムを用いて生成物を分析してもよい。
もよく、また別法として基質を直接添加してもよい。プロテアーゼおよび基質の
最終濃度を、アッセイを行うのに適当な処理速度が得られるように計算する。例
えば、メタノールまたはトリフルオロ酢酸を添加することで反応を停止させ、慣
用的システムを用いて生成物を分析してもよい。 例えば、ＵＶ検出を行いながら、逆相ＨＰＬＣを使用することができる（例え
ば、Kuo,Dら、Biochemistry、８３４７（１９９４）およびAllsopら、Bioorgani
c and Med.Chem.Lett.、４４３（１９９５）を参照のこと）。試験化合物の活性
は所定の濃度での酵素活性の減少割合％として表すことができる。ＨＰＬＣアッ
セイにおいては、これは対照と比較した生成物のピーク面積の減少として計算さ
れる。基質がマーカー対を含有する場合、別法としてメタノールまたは外因結合
蛋白を用いて該反応を停止させ、利用するマーカー基の選択に適するいずれか慣
用的なシステムを用いて生成物を分析してもよい。
【００２５】
放射活性法はビオチン／放射性標識対の使用を包含する。基質を従来の濾過（
例えば、ニトロセルロース）法によりストレプトアビジン被覆のフラッシュプレ
ートまたはストレプトアビジン被覆のシンチレーション近接アッセイビーズ上に
捕獲させる。シンチレーション計数により、放射性標識を検出してもよい。 抗体を基礎とするペプチド検出法は、リガンド／リガンド対、例えばビオチン
／ジニトロフェノール標識の使用を包含する。例えば、ストレプトアビジン被覆
のプレート上に一のリガンドを介して捕獲した後、固定した基質の検出を他のリ
ガンド、例えば抗ＤＮＰ抗体に対する抗体を用いて行い、つづいて酵素結合イム
ノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、解離強化時間分解蛍光法（ＤＥＬＦＩＡ法
、Wallac OY）、イムノソルベントルミネッセンス化学ルミネッセンス法または
蛍光検出法などの免疫アッセイに付す。
例えば、ニトロセルロース）法によりストレプトアビジン被覆のフラッシュプレ
ートまたはストレプトアビジン被覆のシンチレーション近接アッセイビーズ上に
捕獲させる。シンチレーション計数により、放射性標識を検出してもよい。 抗体を基礎とするペプチド検出法は、リガンド／リガンド対、例えばビオチン
／ジニトロフェノール標識の使用を包含する。例えば、ストレプトアビジン被覆
のプレート上に一のリガンドを介して捕獲した後、固定した基質の検出を他のリ
ガンド、例えば抗ＤＮＰ抗体に対する抗体を用いて行い、つづいて酵素結合イム
ノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、解離強化時間分解蛍光法（ＤＥＬＦＩＡ法
、Wallac OY）、イムノソルベントルミネッセンス化学ルミネッセンス法または
蛍光検出法などの免疫アッセイに付す。
【００２６】
エネルギー移動の変化を測定する光学方法は、フルオリメーターを用いて蛍光
全体の強度を肉眼で測定してもよく、あるいは例えば、Evotec Biosystems GmbH
により開発されたアルゴリズムを用いる蛍光相関的分光学（ＦＣＳ）を介して個
々の蛍光分子からの光子放出のシグナルを処理することにより行うことができる
。同様のアルゴリズムを、ＦＣＳを用いて分子光度および粒子数の両者の変化を
介して、および／または間接的に標識されたペプチド基質を用いて蛋白分解速度
を決定するのに用いることもできる。 モジュレーター基が、基質を蛋白分解的に切断した後の、全体としての基質の
光学特性を調節する部分である場合、例えば、二元的なビオチニル化に付し、蛍
光標識したペプチドが切断された結果としての蛍光偏光（ＦＰ）の変化を、例え
ばストレプトアビジンまたはアビジンを添加することなく、あるいは最も好まし
くは添加して、プロテアーゼ活性をモニター観察するのに用いることができる。
ストレプトアビジンまたはアビジンを添加し、または添加することなく、蛋白分
解の結果として、この蛍光的に標識されたペプチド基質の拡散時間の変化もまた
、並進的ＦＣＳによりモニターすることができる。蛍光偏光は、例えば、蛍光偏
光プレートリーダーで測定することができる。
全体の強度を肉眼で測定してもよく、あるいは例えば、Evotec Biosystems GmbH
により開発されたアルゴリズムを用いる蛍光相関的分光学（ＦＣＳ）を介して個
々の蛍光分子からの光子放出のシグナルを処理することにより行うことができる
。同様のアルゴリズムを、ＦＣＳを用いて分子光度および粒子数の両者の変化を
介して、および／または間接的に標識されたペプチド基質を用いて蛋白分解速度
を決定するのに用いることもできる。 モジュレーター基が、基質を蛋白分解的に切断した後の、全体としての基質の
光学特性を調節する部分である場合、例えば、二元的なビオチニル化に付し、蛍
光標識したペプチドが切断された結果としての蛍光偏光（ＦＰ）の変化を、例え
ばストレプトアビジンまたはアビジンを添加することなく、あるいは最も好まし
くは添加して、プロテアーゼ活性をモニター観察するのに用いることができる。
ストレプトアビジンまたはアビジンを添加し、または添加することなく、蛋白分
解の結果として、この蛍光的に標識されたペプチド基質の拡散時間の変化もまた
、並進的ＦＣＳによりモニターすることができる。蛍光偏光は、例えば、蛍光偏
光プレートリーダーで測定することができる。
【００２７】
本発明の方法により同定可能な阻害剤は、競合結合アッセイにて用いるための
試薬を創製するのに標識することのできる活性部位リガンドである。 したがって、本発明は、 ポリペプチドまたは蛋白基質のＡｓｐ２介在切断を阻害する化合物をスクリーニ
ングし、かかる化合物を同定する方法であって、Ａｓｐ２および標識された活性
部位のリガンドを含む反応系を準備し、試験化合物の存在下での標識リガンドの
結合の程度を試験化合物の不存在下での標識リガンドの結合の程度と比較し、結
合アフィニティーを測定することを含む、方法を提供する。 本発明はまた、上記方法により同定される化合物および、ＡＤを含め、βアミ
ロイド蛋白−関連疾患の治療または予防を含む治療における使用に関する。 リガンドについてのアッセイ方法は一般的であり、切断アッセイについて上記
した並進または旋回拡散を基礎とする方法を包含する。好ましい態様において、
スクリーニング方法は蛍光偏光（ＦＰ）を基礎とする。好ましい標識は上記した
フルオロホールであり、好ましくはローダミングリーンである。
試薬を創製するのに標識することのできる活性部位リガンドである。 したがって、本発明は、 ポリペプチドまたは蛋白基質のＡｓｐ２介在切断を阻害する化合物をスクリーニ
ングし、かかる化合物を同定する方法であって、Ａｓｐ２および標識された活性
部位のリガンドを含む反応系を準備し、試験化合物の存在下での標識リガンドの
結合の程度を試験化合物の不存在下での標識リガンドの結合の程度と比較し、結
合アフィニティーを測定することを含む、方法を提供する。 本発明はまた、上記方法により同定される化合物および、ＡＤを含め、βアミ
ロイド蛋白−関連疾患の治療または予防を含む治療における使用に関する。 リガンドについてのアッセイ方法は一般的であり、切断アッセイについて上記
した並進または旋回拡散を基礎とする方法を包含する。好ましい態様において、
スクリーニング方法は蛍光偏光（ＦＰ）を基礎とする。好ましい標識は上記した
フルオロホールであり、好ましくはローダミングリーンである。
【００２８】
該アッセイは、切断アッセイについて上記したような従来のアッセイフォーマ
ットを用いる、無細胞または細胞を基礎とする反応系にて行うことができる。 宿主細胞は、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであってもよ
い、ベクターを用いて遺伝的操作（形質導入、形質転換またはトランスフェクト
）されている。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ファージなどの形
態であってもよい。遺伝的操作を施した宿主細胞を、プロモーターを活性化する
ために、形質転換体を選択するために、またはその遺伝子を増幅するために適当
に修飾した従来の栄養培地に培養することができる。温度、ｐＨなどの培養条件
は、発現のために選択される宿主細胞と同じく、今まで使用されている条件であ
り、当業者に明らかであろう。
ットを用いる、無細胞または細胞を基礎とする反応系にて行うことができる。 宿主細胞は、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであってもよ
い、ベクターを用いて遺伝的操作（形質導入、形質転換またはトランスフェクト
）されている。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ファージなどの形
態であってもよい。遺伝的操作を施した宿主細胞を、プロモーターを活性化する
ために、形質転換体を選択するために、またはその遺伝子を増幅するために適当
に修飾した従来の栄養培地に培養することができる。温度、ｐＨなどの培養条件
は、発現のために選択される宿主細胞と同じく、今まで使用されている条件であ
り、当業者に明らかであろう。
【００２９】
適当な発現ベクターは染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えばＳＶ４
０の誘導体；細菌性プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラ
スミド；プラスミドとファージＤＮＡ、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイ
ルス、および偽狂犬病ウイルスなどウイルスＤＮＡの組み合わせから誘導された
ベクターを包含する。しかしながら、宿主において複製可能であり、かつ生存可
能である限り、いずれの他のベクターも用いることができる。 適当なＤＮＡ配列を種々の方法によりベクター中に挿入することができる。一
般に、当該分野にて公知の方法により、ＤＮＡ配列を適当なエンドヌクレアーゼ
部位に挿入する。かかる操作および別の操作は当業者の範囲内にあると考えられ
る。 発現ベクターにおけるＤＮＡ配列を、ｍＲＮＡ合成を指向するように、適当な
発現対照配列（プロモーター）に機能的に結合させる。かかるプロモーターの代
表例として、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、イー・コリ・ｌａｃまたはｔ
ｒｐ、ファージラムダＰＬプロモーターおよび原核生物または真核生物細胞ある
いはウイルスの遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーターに
言及することができる。発現ベクターはまた、翻訳を開始するためのリボソーム
結合部位および転写ターミネーターを含有する。該ベクターはまた、発現を増幅
するための適当な配列を含んでいてもよい。
０の誘導体；細菌性プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラ
スミド；プラスミドとファージＤＮＡ、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイ
ルス、および偽狂犬病ウイルスなどウイルスＤＮＡの組み合わせから誘導された
ベクターを包含する。しかしながら、宿主において複製可能であり、かつ生存可
能である限り、いずれの他のベクターも用いることができる。 適当なＤＮＡ配列を種々の方法によりベクター中に挿入することができる。一
般に、当該分野にて公知の方法により、ＤＮＡ配列を適当なエンドヌクレアーゼ
部位に挿入する。かかる操作および別の操作は当業者の範囲内にあると考えられ
る。 発現ベクターにおけるＤＮＡ配列を、ｍＲＮＡ合成を指向するように、適当な
発現対照配列（プロモーター）に機能的に結合させる。かかるプロモーターの代
表例として、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、イー・コリ・ｌａｃまたはｔ
ｒｐ、ファージラムダＰＬプロモーターおよび原核生物または真核生物細胞ある
いはウイルスの遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーターに
言及することができる。発現ベクターはまた、翻訳を開始するためのリボソーム
結合部位および転写ターミネーターを含有する。該ベクターはまた、発現を増幅
するための適当な配列を含んでいてもよい。
【００３０】
加えて、発現ベクターは１またはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含有
し、真核生物細胞を培養するためにジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシ
ン耐性、あるいはイー・コリにおけるテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性
などの形質転換された宿主細胞を選択するための表現型特性を提供する。 遺伝子は、プロモーター、リボソーム結合部位（細菌発現の場合）、所望によ
りオペレーター（以下、包括的に「制御」因子という）の制御下に置くことがで
き、そうすれば、所望の蛋白をコードするＤＮＡ配列はこの発現構造を含有する
ベクターにより形質転換される宿主細胞中のＲＮＡに転写される。そのコード化
配列はシグナルペプチドまたはリーダー配列を含んでいてもいなくてもよい。本
発明の蛋白配列は、例えば、イー・コリｔａｃプロモーターまたは蛋白Ａ遺伝子
（ｓｐａ）プロモーターおよびシグナル配列を用いて発現することができる。リ
ーダー配列は翻訳後プロセッシングにて細菌性宿主により除去することができる
。プロモーター領域はＣＡＴ（クロラムフェニコール・トランスフェラーゼ）ベ
クターまたは他のベクターを選択可能なマーカーと一緒に用いて所望の遺伝子よ
り選択することができる。２つの適当なベクターがＰＫＫ２３２−８およびＰＣ
Ｍ７である。個々に命名された細菌性プロモーターは、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ
３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰＲ、ＰＬおよびｔｒｐを包含する。真核生物プロモ
ーターは、ＣＭＶ即時型、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、
レトロウイルス由来のＬＴＲおよびマウスメタロチオネイン−Ｉを包含する。適
当なベクターおよびプロモーターの選択は十二分に当業者の範囲内にある。
し、真核生物細胞を培養するためにジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシ
ン耐性、あるいはイー・コリにおけるテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性
などの形質転換された宿主細胞を選択するための表現型特性を提供する。 遺伝子は、プロモーター、リボソーム結合部位（細菌発現の場合）、所望によ
りオペレーター（以下、包括的に「制御」因子という）の制御下に置くことがで
き、そうすれば、所望の蛋白をコードするＤＮＡ配列はこの発現構造を含有する
ベクターにより形質転換される宿主細胞中のＲＮＡに転写される。そのコード化
配列はシグナルペプチドまたはリーダー配列を含んでいてもいなくてもよい。本
発明の蛋白配列は、例えば、イー・コリｔａｃプロモーターまたは蛋白Ａ遺伝子
（ｓｐａ）プロモーターおよびシグナル配列を用いて発現することができる。リ
ーダー配列は翻訳後プロセッシングにて細菌性宿主により除去することができる
。プロモーター領域はＣＡＴ（クロラムフェニコール・トランスフェラーゼ）ベ
クターまたは他のベクターを選択可能なマーカーと一緒に用いて所望の遺伝子よ
り選択することができる。２つの適当なベクターがＰＫＫ２３２−８およびＰＣ
Ｍ７である。個々に命名された細菌性プロモーターは、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ
３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰＲ、ＰＬおよびｔｒｐを包含する。真核生物プロモ
ーターは、ＣＭＶ即時型、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、
レトロウイルス由来のＬＴＲおよびマウスメタロチオネイン−Ｉを包含する。適
当なベクターおよびプロモーターの選択は十二分に当業者の範囲内にある。
【００３１】
調節配列に加えて、宿主細胞の増殖に関連して蛋白配列の発現を制御すること
を可能とする制御配列を添加することが望ましい。制御配列は当業者に公知であ
り、例えば、制御化合物の存在を含む、化学的または物理的刺激に応答してスイ
ッチがオンまたはオフとなる遺伝子の発現を引き起こすものが挙げられる。制御
因子の他の型はまたベクター、例えばエンハンサー配列に存在してもよい。
を可能とする制御配列を添加することが望ましい。制御配列は当業者に公知であ
り、例えば、制御化合物の存在を含む、化学的または物理的刺激に応答してスイ
ッチがオンまたはオフとなる遺伝子の発現を引き起こすものが挙げられる。制御
因子の他の型はまたベクター、例えばエンハンサー配列に存在してもよい。
【００３２】
発現ベクターは、特定のコード化配列が適当な制御配列を有するベクター中に
あるように、調節配列に関してコード化配列の位置および配向がそのコード化配
列が調節配列の「調節」下で転写されるように、構築される（すなわち、調節配
列でＤＮＡ分子に結合するＲＮＡポリメラーゼがコード化配列を転写する）。そ
のコード化配列の修飾はこの目的を達成するために行うことが望ましい。例えば
、ある場合には、適当な配向で調節配列に結合するように、すなわち読取枠を維
持するように、その配列を修飾する必要がある。調節配列および他の制御配列を
上記したクローニングベクターなどのベクターに挿入する前にコード化配列にラ
イゲートしてもよい。また、そのコード化配列を既に調節配列および適当な制限
部位を含有する発現ベクター中に直接的にクローンすることもできる。また、こ
のコード化配列の修飾を行い、選択された宿主細胞が発現を亢進するのに適する
ようにコドン使用頻度を改変することもできる。
あるように、調節配列に関してコード化配列の位置および配向がそのコード化配
列が調節配列の「調節」下で転写されるように、構築される（すなわち、調節配
列でＤＮＡ分子に結合するＲＮＡポリメラーゼがコード化配列を転写する）。そ
のコード化配列の修飾はこの目的を達成するために行うことが望ましい。例えば
、ある場合には、適当な配向で調節配列に結合するように、すなわち読取枠を維
持するように、その配列を修飾する必要がある。調節配列および他の制御配列を
上記したクローニングベクターなどのベクターに挿入する前にコード化配列にラ
イゲートしてもよい。また、そのコード化配列を既に調節配列および適当な制限
部位を含有する発現ベクター中に直接的にクローンすることもできる。また、こ
のコード化配列の修飾を行い、選択された宿主細胞が発現を亢進するのに適する
ようにコドン使用頻度を改変することもできる。
【００３３】
一般に、組換え発現ベクターは、宿主細胞の複写の起源および形質転換を可能
とする選択可能なマーカー、例えば、イー・コリのアンピシリン耐性遺伝子およ
びエス・セレビシアエＴＲＰ１遺伝子、および下流の構造配列の転写を指令する
ための高度に発現した遺伝子から由来のプロモーターを含んでいるであろう。異
種構造配列を適当な時期に翻訳開始および停止配列と、好ましくは翻訳蛋白の周
辺腔または細胞外培地への分泌指令能を有するリーダー配列と組み合わせる。異
種配列は、所望の特性、例えば、発現された組換え産物の安定性または精製の単
純化を付与するＮ−末端同定ペプチドを含む、融合蛋白をコードすることができ
ることが望ましい。 上記した適当なＤＮＡ配列ならびに適当なプロモーターまたは調節配列を含有
するベクターを利用して適当な宿主を形質転換し、その宿主が蛋白を発現させる
ことできる。
とする選択可能なマーカー、例えば、イー・コリのアンピシリン耐性遺伝子およ
びエス・セレビシアエＴＲＰ１遺伝子、および下流の構造配列の転写を指令する
ための高度に発現した遺伝子から由来のプロモーターを含んでいるであろう。異
種構造配列を適当な時期に翻訳開始および停止配列と、好ましくは翻訳蛋白の周
辺腔または細胞外培地への分泌指令能を有するリーダー配列と組み合わせる。異
種配列は、所望の特性、例えば、発現された組換え産物の安定性または精製の単
純化を付与するＮ−末端同定ペプチドを含む、融合蛋白をコードすることができ
ることが望ましい。 上記した適当なＤＮＡ配列ならびに適当なプロモーターまたは調節配列を含有
するベクターを利用して適当な宿主を形質転換し、その宿主が蛋白を発現させる
ことできる。
【００３４】
クローニング用の組換えＤＮＡベクターおよびそれにより形質転換することの
できる宿主細胞として、例えば、バクテリオファージλ（イー・コリ）、ｐＢＲ
３２２（イー・コリ）、ｐＡＣＹＣ１７７（イー・コリ）、ｐＫＴ２３０（グラ
ム陰性菌）、ｐＭＥ２９０（イー・コリ以外のグラム陰性菌）、ｐＬＡＦＲ１（
グラム陰性菌）、ｐＭＥ２９０（イー・コリ以外のグラム陰性菌）、ｐＨＶ１４
（イー・コリおよびバシラス・サチリス）、ｐＢＤ９（バシラス）、ｐＩＪ６１
（ストレプトマイセス）、ｐＵＣ６（ストレプトマイセス）、ＹＩｐ５（サッカ
ロマイセス）、バキュロウイルス昆虫細胞系、ＹＣｐ１９（サッカロマイセス）
が挙げられる。通常、「DNA Cloning」：Vol.I＆II、Gloverら編、IRL Press Ox
ford（１９８５）（１９８７）および；T.Maniatisら、「Molecular Cloning」
Cold Spring Harbor Laboratory（１９８２）を参照のこと。
できる宿主細胞として、例えば、バクテリオファージλ（イー・コリ）、ｐＢＲ
３２２（イー・コリ）、ｐＡＣＹＣ１７７（イー・コリ）、ｐＫＴ２３０（グラ
ム陰性菌）、ｐＭＥ２９０（イー・コリ以外のグラム陰性菌）、ｐＬＡＦＲ１（
グラム陰性菌）、ｐＭＥ２９０（イー・コリ以外のグラム陰性菌）、ｐＨＶ１４
（イー・コリおよびバシラス・サチリス）、ｐＢＤ９（バシラス）、ｐＩＪ６１
（ストレプトマイセス）、ｐＵＣ６（ストレプトマイセス）、ＹＩｐ５（サッカ
ロマイセス）、バキュロウイルス昆虫細胞系、ＹＣｐ１９（サッカロマイセス）
が挙げられる。通常、「DNA Cloning」：Vol.I＆II、Gloverら編、IRL Press Ox
ford（１９８５）（１９８７）および；T.Maniatisら、「Molecular Cloning」
Cold Spring Harbor Laboratory（１９８２）を参照のこと。
【００３５】
ある場合には、ポリペプチドを宿主生物から分泌させ、その後に分泌性シグナ
ルを切断する配列を付加することが望ましい。 酵母発現ベクターはまた当該分野にて知られている。例えば、米国特許第４４
４６２３５号；第４４４３５３９号を参照のこと；欧州特許出願番号１０３４０
９；１００５６１；９６４９１も参照のこと。ＳＶ４０後期プロモーターを用い
て哺乳動物細胞にて発現を駆動させるｐＳＶ２ｎｅｏ（Southern,PJおよびBerg,
PJ、Mol.Appl.Genet.１：３２７−３４１（１９８２）に記載）またはＣＭＶプ
ロモーターを用いて発現を駆動させるｐＣＤＮＡ１から由来のベクター、ｐＣＤ
ＮＡ１ｎｅｏ（Nelson,Jら、Mol.Cell Biol.７：４１２５−２９（１９８７）な
どである。これら後者の２つのベクターを哺乳動物細胞における一時的または安
定した（Ｇ４１８耐性を利用）発現のために利用することができる。昆虫細胞発
現系、例えば、ドロソフィラもまた有用である。例えば、ＰＣＴ出願のＷＯ９０
／０６３５８およびＷＯ９２／０６２１２ならびにＥＰ２９０２６１−Ｂ１を参
照のこと。
ルを切断する配列を付加することが望ましい。 酵母発現ベクターはまた当該分野にて知られている。例えば、米国特許第４４
４６２３５号；第４４４３５３９号を参照のこと；欧州特許出願番号１０３４０
９；１００５６１；９６４９１も参照のこと。ＳＶ４０後期プロモーターを用い
て哺乳動物細胞にて発現を駆動させるｐＳＶ２ｎｅｏ（Southern,PJおよびBerg,
PJ、Mol.Appl.Genet.１：３２７−３４１（１９８２）に記載）またはＣＭＶプ
ロモーターを用いて発現を駆動させるｐＣＤＮＡ１から由来のベクター、ｐＣＤ
ＮＡ１ｎｅｏ（Nelson,Jら、Mol.Cell Biol.７：４１２５−２９（１９８７）な
どである。これら後者の２つのベクターを哺乳動物細胞における一時的または安
定した（Ｇ４１８耐性を利用）発現のために利用することができる。昆虫細胞発
現系、例えば、ドロソフィラもまた有用である。例えば、ＰＣＴ出願のＷＯ９０
／０６３５８およびＷＯ９２／０６２１２ならびにＥＰ２９０２６１−Ｂ１を参
照のこと。
【００３６】
高等真核生物によるＤＮＡの転写はエンハンサー配列をベクターに挿入するこ
とで向上する。エンハンサーは、プロモーターに作用してその転写を向上させる
、通常、約１０ないし３００ｂｐの、ＤＮＡのシス作用座因子である。例えば、
ｂｐ１００ないし２７０の複製起源の後期側上のＳＶ４０エンハンサー、サイト
メガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起源の後期側上のポリオー
マエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。 上記のベクターを含有する宿主細胞は、哺乳動物細胞のような高等真核生物細
胞または酵母細胞のような下等真核生物細胞とすることができ、または宿主細胞
は細菌細胞のような原核生物細胞とすることができる。適当な宿主の代表例とし
て、原核生物、例えば、イー・コリ、ストレプトミセス、サルモネラ・チフィム
リウム（Salmonella typhimurium）のような細菌細胞、および真核生物、例えば
、酵母、ドロソフィラおよびスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugipe
rda）などの昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳまたはボウズ（Bowes）黒色腫などの哺乳
動物細胞、植物細胞等のような真菌細胞が挙げられる。適当な宿主の選択は、本
明細書の教示から当業者の範囲内にあると考えられる。
とで向上する。エンハンサーは、プロモーターに作用してその転写を向上させる
、通常、約１０ないし３００ｂｐの、ＤＮＡのシス作用座因子である。例えば、
ｂｐ１００ないし２７０の複製起源の後期側上のＳＶ４０エンハンサー、サイト
メガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起源の後期側上のポリオー
マエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。 上記のベクターを含有する宿主細胞は、哺乳動物細胞のような高等真核生物細
胞または酵母細胞のような下等真核生物細胞とすることができ、または宿主細胞
は細菌細胞のような原核生物細胞とすることができる。適当な宿主の代表例とし
て、原核生物、例えば、イー・コリ、ストレプトミセス、サルモネラ・チフィム
リウム（Salmonella typhimurium）のような細菌細胞、および真核生物、例えば
、酵母、ドロソフィラおよびスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugipe
rda）などの昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳまたはボウズ（Bowes）黒色腫などの哺乳
動物細胞、植物細胞等のような真菌細胞が挙げられる。適当な宿主の選択は、本
明細書の教示から当業者の範囲内にあると考えられる。
【００３７】
構築物の宿主細胞中への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、Ｄ
ＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクションまたはエレクトロポレーショ
ンによって行うことができる（Davis,L.、Dibner,M.、Battey,I.、Basic Method
s in Molecular Biology（１９８６））。 適当な宿主系統を形質転換し、宿主系統を適当な細胞密度まで増殖させた後、
選択されたプロモーターを適当な方法（例えば、温度シフトまたは化学的誘導）
によって誘導し、細胞をさらなる期間培養する。 細胞は、典型的には、遠心分離によって収穫され、物理的または化学的方法に
よって崩壊され、得られた粗抽出物をさらなる精製用に保持する。
ＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクションまたはエレクトロポレーショ
ンによって行うことができる（Davis,L.、Dibner,M.、Battey,I.、Basic Method
s in Molecular Biology（１９８６））。 適当な宿主系統を形質転換し、宿主系統を適当な細胞密度まで増殖させた後、
選択されたプロモーターを適当な方法（例えば、温度シフトまたは化学的誘導）
によって誘導し、細胞をさらなる期間培養する。 細胞は、典型的には、遠心分離によって収穫され、物理的または化学的方法に
よって崩壊され、得られた粗抽出物をさらなる精製用に保持する。
【００３８】
蛋白の発現に用いられた微生物細胞は、冷凍−解凍循環、超音波処理、機械的
崩壊または細胞溶解剤の使用を包含する当業者によく知られたいずれかの慣用的
な方法によって崩壊させることができる。 種々の哺乳動物細胞培養系はまた、組換え蛋白を発現するために用いることが
できる。哺乳動物発現系の例は、Gluzman、Cell、２３：１７５（１９８１）に
よって記載されたサル腎臓繊維芽細胞のＣＯＳ−７系統、および適合性ベクター
の発現能を有する他の細胞系統、例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬお
よびＢＨＫ細胞系統を包含する。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適当なプ
ロモーターおよびエンハンサー、また、いずれかの必要なリボソーム結合部位、
ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終止配列
、および５’フランキング非転写配列を含むであろう。ＳＶ４０スプライスおよ
びポリアデニル化部位由来のＤＮＡ配列を所望の非転写遺伝子を提供するために
用いてもよい。
崩壊または細胞溶解剤の使用を包含する当業者によく知られたいずれかの慣用的
な方法によって崩壊させることができる。 種々の哺乳動物細胞培養系はまた、組換え蛋白を発現するために用いることが
できる。哺乳動物発現系の例は、Gluzman、Cell、２３：１７５（１９８１）に
よって記載されたサル腎臓繊維芽細胞のＣＯＳ−７系統、および適合性ベクター
の発現能を有する他の細胞系統、例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬお
よびＢＨＫ細胞系統を包含する。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適当なプ
ロモーターおよびエンハンサー、また、いずれかの必要なリボソーム結合部位、
ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終止配列
、および５’フランキング非転写配列を含むであろう。ＳＶ４０スプライスおよ
びポリアデニル化部位由来のＤＮＡ配列を所望の非転写遺伝子を提供するために
用いてもよい。
【００３９】
ヒト以外のトランスジェニック動物を宿主として使用してもよい。
本発明のアッセイが無細胞である場合、発現されたポリペプチドの回収方法は
選択された発現系および宿主に依存する。発現系がポリペプチドを増殖培地中に
分泌する場合、ポリペプチドを培地から直接精製することができる。ポリペプチ
ドが分泌されない場合、それは細胞ライゼートから単離されるか、または細胞膜
フラクションから回収される。ポリペプチドが細胞表面に局在する場合、全細胞
または単離した膜を所望の遺伝子産物のアッセイ可能な供給源として使用するこ
とができる。イー・コリのような細菌宿主中に発現されたポリペプチドは、封入
体からの単離およびリフォールディングを必要とするかもしれない。適当な増殖
条件および回収方法の選択は、当該分野の範囲内である。
選択された発現系および宿主に依存する。発現系がポリペプチドを増殖培地中に
分泌する場合、ポリペプチドを培地から直接精製することができる。ポリペプチ
ドが分泌されない場合、それは細胞ライゼートから単離されるか、または細胞膜
フラクションから回収される。ポリペプチドが細胞表面に局在する場合、全細胞
または単離した膜を所望の遺伝子産物のアッセイ可能な供給源として使用するこ
とができる。イー・コリのような細菌宿主中に発現されたポリペプチドは、封入
体からの単離およびリフォールディングを必要とするかもしれない。適当な増殖
条件および回収方法の選択は、当該分野の範囲内である。
【００４０】
該ポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈澱、酸抽出、アニオ
ンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィ
ー、疎水相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒ
ドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを
包含する、方法によって組換え細胞培養物から回収および精製できる。必要なら
ば、蛋白リフォールディング工程を成熟蛋白の配置を完成する際に用いることが
できる。最終的に、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最終精製工程
に用いることができる。 組換え生産手法において使用される宿主に応じて、ポリペプチドをグリコシル
化してもよく、または非グリコシル化してもよい。ポリペプチドはまた、最初の
メチオニンアミノ酸残基を包含してもよい。
ンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィ
ー、疎水相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒ
ドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを
包含する、方法によって組換え細胞培養物から回収および精製できる。必要なら
ば、蛋白リフォールディング工程を成熟蛋白の配置を完成する際に用いることが
できる。最終的に、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最終精製工程
に用いることができる。 組換え生産手法において使用される宿主に応じて、ポリペプチドをグリコシル
化してもよく、または非グリコシル化してもよい。ポリペプチドはまた、最初の
メチオニンアミノ酸残基を包含してもよい。
【００４１】
「組換え」ポリペプチドなる語は、組換えＤＮＡ技術によって生産された、す
なわち、所望のポリペプチドをコードしている外来性ＤＮＡ構築物によって形質
転換された細胞から生産されたポリペプチドをいう。「合成」ポリペプチドなる
語は、化学合成によって調製されたものをいう。 「レプリコン」なる語は、インビボにおけるＤＮＡ複製の自律性単位として機
能する、すなわち、それ自体の調節下で複製能を有するいずれかの遺伝子（例え
ば、プラスミド、染色体、ウイルス）をいう。 「ベクター」なる語は、プラスミド、ファージまたはコスミドなどのレプリコ
ンであって、それに別のＤＮＡセグメントが結合して結合したセグメントの複製
を引き起こし得るものをいう。
なわち、所望のポリペプチドをコードしている外来性ＤＮＡ構築物によって形質
転換された細胞から生産されたポリペプチドをいう。「合成」ポリペプチドなる
語は、化学合成によって調製されたものをいう。 「レプリコン」なる語は、インビボにおけるＤＮＡ複製の自律性単位として機
能する、すなわち、それ自体の調節下で複製能を有するいずれかの遺伝子（例え
ば、プラスミド、染色体、ウイルス）をいう。 「ベクター」なる語は、プラスミド、ファージまたはコスミドなどのレプリコ
ンであって、それに別のＤＮＡセグメントが結合して結合したセグメントの複製
を引き起こし得るものをいう。
【００４２】
「二本鎖ＤＮＡ分子」なる語は、弛緩型およびスーパーコイルの両方の二本鎖
ヘリックスにおけるデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミンま
たはシトシン塩基）の重合形態をいう。この用語は、分子の一次および二次構造
のみに言及し、いずれか特定の三次形態に限定するものではない。よって、該用
語は、特に、直線状ＤＮＡ分子（例えば制限フラグメント）、ウイルス、プラス
ミド、および染色体において見出される二本鎖ＤＮＡを包含する。特定の二本鎖
ＤＮＡ分子の構造を議論する場合、配列は本明細書においてＤＮＡのセンス鎖に
沿った５’から３’への方向の配列のみを与える通常の慣例にしたがって記載さ
れる。
ヘリックスにおけるデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミンま
たはシトシン塩基）の重合形態をいう。この用語は、分子の一次および二次構造
のみに言及し、いずれか特定の三次形態に限定するものではない。よって、該用
語は、特に、直線状ＤＮＡ分子（例えば制限フラグメント）、ウイルス、プラス
ミド、および染色体において見出される二本鎖ＤＮＡを包含する。特定の二本鎖
ＤＮＡ分子の構造を議論する場合、配列は本明細書においてＤＮＡのセンス鎖に
沿った５’から３’への方向の配列のみを与える通常の慣例にしたがって記載さ
れる。
【００４３】
特定の蛋白のＤＮＡ「コーディング配列」または特定の蛋白を「コードするヌ
クレオチド配列」なる語は、適当な制御配列の調節下に置かれたときにポリペプ
チドに転写および翻訳されるＤＮＡ配列である。 「プロモーター配列」なる語は、細胞中でＲＮＡポリメラーゼとの結合能を有
し、下流の（３’方向）コーディング配列の転写を開始できるＤＮＡ調節領域を
いう。プロモーター配列内には、転写開始部位（慣用的にヌクレアーゼＳ１での
マッピングによって定義される）ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合の原因とな
る蛋白結合ドメイン（コンセンサス配列）が見られる。真核生物プロモーターは
、いつもというわけではないが、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボック
スを含有することが多い。
クレオチド配列」なる語は、適当な制御配列の調節下に置かれたときにポリペプ
チドに転写および翻訳されるＤＮＡ配列である。 「プロモーター配列」なる語は、細胞中でＲＮＡポリメラーゼとの結合能を有
し、下流の（３’方向）コーディング配列の転写を開始できるＤＮＡ調節領域を
いう。プロモーター配列内には、転写開始部位（慣用的にヌクレアーゼＳ１での
マッピングによって定義される）ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合の原因とな
る蛋白結合ドメイン（コンセンサス配列）が見られる。真核生物プロモーターは
、いつもというわけではないが、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボック
スを含有することが多い。
【００４４】
ＤＮＡ「調節配列」なる語は、包括的には、宿主細胞におけるコーディング配
列の発現（すなわち、転写および翻訳）を提供する、プロモーター配列、リボソ
ーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、転写終止配列、上流調節ドメイン、エ
ンハンサーなどをいう。 調節配列は、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列と結合し、コーディング
配列をｍＲＮＡに転写し、次いで、それがコーディング配列によってコードされ
るポリペプチドに翻訳されるとき、細胞中においてコーディング配列の「発現を
指示」する。
列の発現（すなわち、転写および翻訳）を提供する、プロモーター配列、リボソ
ーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、転写終止配列、上流調節ドメイン、エ
ンハンサーなどをいう。 調節配列は、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列と結合し、コーディング
配列をｍＲＮＡに転写し、次いで、それがコーディング配列によってコードされ
るポリペプチドに翻訳されるとき、細胞中においてコーディング配列の「発現を
指示」する。
【００４５】
「宿主細胞」なる語は、外来性ＤＮＡ配列によって形質転換またはトランスフ
ェクトされた、または形質転換またはトランスフェクトされることのできる細胞
をいう。 外来性ＤＮＡが細胞膜内に導入されたとき、細胞はその外来性ＤＮＡによって
「形質転換」されている。外来性ＤＮＡは、細胞のゲノムを構成している染色体
ＤＮＡ中に組み込まれていても（共有結合）いなくてもよい。原核生物および酵
母において、例えば、外来性ＤＮＡはプラスミドのようなエピソームエレメント
上に維持されうる。真核生物細胞に関して、安定に形質転換またはトランスフェ
クトされた細胞は、外来性ＤＮＡが染色体中に組み込まれ、その結果、染色体複
製を介して娘細胞によって受け継がれるものである。該安定性は、真核生物細胞
の外来性ＤＮＡを含有する娘細胞の集団よりなる細胞系統またはクローンを確立
する能力によって示される。 「クローン」なる語は、有糸分裂によって単一細胞または共通の祖先から誘導
される細胞の集団をいう。「細胞系統」なる語は、多世代にわたってインビトロ
にて安定して増殖することのできる一次細胞のクローンをいう。
ェクトされた、または形質転換またはトランスフェクトされることのできる細胞
をいう。 外来性ＤＮＡが細胞膜内に導入されたとき、細胞はその外来性ＤＮＡによって
「形質転換」されている。外来性ＤＮＡは、細胞のゲノムを構成している染色体
ＤＮＡ中に組み込まれていても（共有結合）いなくてもよい。原核生物および酵
母において、例えば、外来性ＤＮＡはプラスミドのようなエピソームエレメント
上に維持されうる。真核生物細胞に関して、安定に形質転換またはトランスフェ
クトされた細胞は、外来性ＤＮＡが染色体中に組み込まれ、その結果、染色体複
製を介して娘細胞によって受け継がれるものである。該安定性は、真核生物細胞
の外来性ＤＮＡを含有する娘細胞の集団よりなる細胞系統またはクローンを確立
する能力によって示される。 「クローン」なる語は、有糸分裂によって単一細胞または共通の祖先から誘導
される細胞の集団をいう。「細胞系統」なる語は、多世代にわたってインビトロ
にて安定して増殖することのできる一次細胞のクローンをいう。
【００４６】
本発明はまた、Ａｓｐ２調節のＡＰＰ切断の阻害剤である化合物、およびアル
ツハイマー病を包含するβアミロイド蛋白関連疾患の治療におけるその使用に関
する。 本発明はさらに、Ａｓｐ２調節のＡＰＰ切断を阻害するための、特に、アルツ
ハイマー病を包含するβアミロイド蛋白関連疾患の治療のための医薬の調製にお
ける本発明の化合物の使用を提供する。 本発明はさらに、Ａｓｐ２調節のＡＰＰ切断を阻害する方法、特に、アルツハ
イマー病を包含するβアミロイド蛋白関連疾患の治療または予防方法であって、
有効量の本発明の化合物を患者に投与することを特徴とする方法を提供する。
ツハイマー病を包含するβアミロイド蛋白関連疾患の治療におけるその使用に関
する。 本発明はさらに、Ａｓｐ２調節のＡＰＰ切断を阻害するための、特に、アルツ
ハイマー病を包含するβアミロイド蛋白関連疾患の治療のための医薬の調製にお
ける本発明の化合物の使用を提供する。 本発明はさらに、Ａｓｐ２調節のＡＰＰ切断を阻害する方法、特に、アルツハ
イマー病を包含するβアミロイド蛋白関連疾患の治療または予防方法であって、
有効量の本発明の化合物を患者に投与することを特徴とする方法を提供する。
【００４７】
療法において使用する場合、本発明の化合物は標準的な製薬習慣にしたがって
処方される。 したがって、本発明は、本発明の化合物および医薬上許容される担体を含んで
なる医薬組成物を提供する。 経口投与される場合に活性な化合物を液体、例えば、シロップ、懸濁液または
エマルジョン、錠剤、カプセルおよびロゼンジとして処方できる。 液体処方は、一般に、化合物または医薬上許容される塩の、懸濁化剤、保存料
、フレーバー剤または着色料を含む適当な液体担体、例えば、エタノール、グリ
セリン、非水性溶媒、例えば、ポリエチレングリコール、油、または水中懸濁液
または溶液を含むであろう。
処方される。 したがって、本発明は、本発明の化合物および医薬上許容される担体を含んで
なる医薬組成物を提供する。 経口投与される場合に活性な化合物を液体、例えば、シロップ、懸濁液または
エマルジョン、錠剤、カプセルおよびロゼンジとして処方できる。 液体処方は、一般に、化合物または医薬上許容される塩の、懸濁化剤、保存料
、フレーバー剤または着色料を含む適当な液体担体、例えば、エタノール、グリ
セリン、非水性溶媒、例えば、ポリエチレングリコール、油、または水中懸濁液
または溶液を含むであろう。
【００４８】
錠剤形態の組成物は、固形処方の調製に慣例的に使用されるいずれかの適当な
医薬担体を用いて調製できる。かかる担体の例は、ステアリン酸マグネシウム、
デンプン、ラクトース、シュークロースおよびセルロースを包含する。 カプセル形態の組成物は、慣例的なカプセル化手法を用いて調製できる。例え
ば、活性材料を含有するペレットを標準的な担体を用いて調製し、次いで、ハー
ドゼラチンカプセル中に充填でき、別法では、分散液または懸濁液をいずれかの
適当な医薬担体、例えば、水性ガム、セルロース、珪酸塩または油を用いて調製
し、次いで、分散液または懸濁液をソフトゼラチンカプセル中に充填することが
できる。
医薬担体を用いて調製できる。かかる担体の例は、ステアリン酸マグネシウム、
デンプン、ラクトース、シュークロースおよびセルロースを包含する。 カプセル形態の組成物は、慣例的なカプセル化手法を用いて調製できる。例え
ば、活性材料を含有するペレットを標準的な担体を用いて調製し、次いで、ハー
ドゼラチンカプセル中に充填でき、別法では、分散液または懸濁液をいずれかの
適当な医薬担体、例えば、水性ガム、セルロース、珪酸塩または油を用いて調製
し、次いで、分散液または懸濁液をソフトゼラチンカプセル中に充填することが
できる。
【００４９】
典型的な非経口組成物は、化合物または医薬上許容される塩の、滅菌水性担体
または非経口で許容される油、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルピ
ロリドン、レシチン、落花生油または胡麻油中溶液または懸濁液を含む。別法と
して、溶液を凍結乾燥し、次いで、投与直前に適当な溶媒を用いて復元できる。 典型的な坐剤処方は、式（Ｉ）の化合物またはこの方法で投与される場合に活
性なその医薬上許容される塩を結合剤および／または滑沢剤、例えば、ポリマー
グリコール、ゼラチンまたはカカオ脂または他の低融点植物もしくは合成ワック
スまたは脂肪を含んでなる。
または非経口で許容される油、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルピ
ロリドン、レシチン、落花生油または胡麻油中溶液または懸濁液を含む。別法と
して、溶液を凍結乾燥し、次いで、投与直前に適当な溶媒を用いて復元できる。 典型的な坐剤処方は、式（Ｉ）の化合物またはこの方法で投与される場合に活
性なその医薬上許容される塩を結合剤および／または滑沢剤、例えば、ポリマー
グリコール、ゼラチンまたはカカオ脂または他の低融点植物もしくは合成ワック
スまたは脂肪を含んでなる。
【００５０】
好ましくは、組成物は錠剤またはカプセルのような単位投与形態で存在する。
経口投与用の各投与単位は、好ましくは、１〜２５０ｍｇの本発明の阻害剤を
含有する（非経口投与の場合、好ましくは０．１〜２５ｍｇを含有する）。 成人患者の１日の投与計画は、例えば、式（Ｉ）の化合物または遊離の塩とし
て計算されるその医薬上許容される塩が１ｍｇ〜５００ｍｇ、好ましくは１ｍｇ
〜２５０ｍｇである経口投与量、あるいは０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは
０．１ｍｇ〜２５ｍｇである静脈内、皮下、または筋内投与量であってもよく、
化合物は１日に１〜４回投与される。適当には、化合物は連続的な治療の期間投
与される。 本発明は、さらに、下記の実施例に関して記載されるが、本発明がかかる実施
例に限定されないということは理解されるべきである。全ての部または量は、特
記しないかぎり、重量によるものである。
含有する（非経口投与の場合、好ましくは０．１〜２５ｍｇを含有する）。 成人患者の１日の投与計画は、例えば、式（Ｉ）の化合物または遊離の塩とし
て計算されるその医薬上許容される塩が１ｍｇ〜５００ｍｇ、好ましくは１ｍｇ
〜２５０ｍｇである経口投与量、あるいは０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは
０．１ｍｇ〜２５ｍｇである静脈内、皮下、または筋内投与量であってもよく、
化合物は１日に１〜４回投与される。適当には、化合物は連続的な治療の期間投
与される。 本発明は、さらに、下記の実施例に関して記載されるが、本発明がかかる実施
例に限定されないということは理解されるべきである。全ての部または量は、特
記しないかぎり、重量によるものである。
【００５１】
方法
哺乳動物細胞におけるＡｓｐ２の一過性発現
Ａｓｐ２をコードするＤＮＡを哺乳動物細胞における一過性発現用の発現ベク
ター中にクローンさせた。Ａｓｐ２遺伝子をプライマー： ５' TATTATCTACTCGAGCCACCATGGCCCAAGCCCTGCC ３'（配列番号８） および ５' GTTAATATAAAGCTTCAGCAGGGAGATGTCATCAGC ３'（配列番号９） を用いて増幅し、ｐＣＲ２．１（Invitrogen）中にクローンさせた。次いで、Ａ
ｓｐ２遺伝子をＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐｃＤＮＡ３．１ａＭｙ
ｃＨｉｓ（Invitrogen）にライゲートした。 ヒトＡＰＰイソ型６９５を過剰発現するＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽細胞（ＳＨ
−ＳＹ５Ｙ ＡＰＰ６９５）を、１０％ＣＯ２／９０％空気の加湿雰囲気中、３
７℃において、１０％胎仔ウシ血清（ｖ／ｖ）、ペニシリン（５０単位／ｍｌ）
、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、２ｍＭグルタミンおよび２６０μｇ
／ｍｌヒグロマイシンＢを補足したダルベッコ修飾必須培地：Ｆ１２中で培養し
た。野生型およびＡＰＰスウェーデン型変異（Haass, C.ら、Nature. Med. 1: 1
291-1296 (1995)）、Ｌｙｓ５９５→ＡｓｎおよびＭｅｔ５９６→Ｌｅｕ（ＡＰ
Ｐ６９５ナンバリング）を有するＣＯＳ−７ ＡＰＰ７５１細胞を３００μｇ／
ｍｌヒグロマイシンＢを有する上記の培地中で培養した。一過性トランスフェク
ションのために、細胞を７５ｃｍ２組織培養フラスコ中において約６０％集密度
で播種し、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ＰＬＵＳ試薬（Life Technologies）を
用いて製造者による記載とおりにトランスフェクトした。トランスフェクション
の２４時間後、培地をＯｐｔｉＭＥＭ−１（１０ｍｌ）に変えた。２４時間後に
培地を収集し、簡単に遠心分離して（５００ｘｇ、１０分間）いずれの細胞も除
去し、次いで、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ１０コンセントレーター（Amicon）を用い
て濃縮した。酵素不含細胞解離バッファー（Life Technologies）を用いてフラ
スコから細胞を解離させることによって採取し、プロテアーゼ阻害剤のカクテル
（Boehirnger Mannheim）を含有する５０ｍＭ トリス／ＨＣｌ ｐＨ７．４、１
％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中、４℃で３０分間インキュベーションすることによ
って溶解させた。遠心分離後（３０００ｘｇ、５分間）、上清を吸引し、アッセ
イまで−２０℃で保管した。
ター中にクローンさせた。Ａｓｐ２遺伝子をプライマー： ５' TATTATCTACTCGAGCCACCATGGCCCAAGCCCTGCC ３'（配列番号８） および ５' GTTAATATAAAGCTTCAGCAGGGAGATGTCATCAGC ３'（配列番号９） を用いて増幅し、ｐＣＲ２．１（Invitrogen）中にクローンさせた。次いで、Ａ
ｓｐ２遺伝子をＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐｃＤＮＡ３．１ａＭｙ
ｃＨｉｓ（Invitrogen）にライゲートした。 ヒトＡＰＰイソ型６９５を過剰発現するＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽細胞（ＳＨ
−ＳＹ５Ｙ ＡＰＰ６９５）を、１０％ＣＯ２／９０％空気の加湿雰囲気中、３
７℃において、１０％胎仔ウシ血清（ｖ／ｖ）、ペニシリン（５０単位／ｍｌ）
、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、２ｍＭグルタミンおよび２６０μｇ
／ｍｌヒグロマイシンＢを補足したダルベッコ修飾必須培地：Ｆ１２中で培養し
た。野生型およびＡＰＰスウェーデン型変異（Haass, C.ら、Nature. Med. 1: 1
291-1296 (1995)）、Ｌｙｓ５９５→ＡｓｎおよびＭｅｔ５９６→Ｌｅｕ（ＡＰ
Ｐ６９５ナンバリング）を有するＣＯＳ−７ ＡＰＰ７５１細胞を３００μｇ／
ｍｌヒグロマイシンＢを有する上記の培地中で培養した。一過性トランスフェク
ションのために、細胞を７５ｃｍ２組織培養フラスコ中において約６０％集密度
で播種し、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ＰＬＵＳ試薬（Life Technologies）を
用いて製造者による記載とおりにトランスフェクトした。トランスフェクション
の２４時間後、培地をＯｐｔｉＭＥＭ−１（１０ｍｌ）に変えた。２４時間後に
培地を収集し、簡単に遠心分離して（５００ｘｇ、１０分間）いずれの細胞も除
去し、次いで、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ１０コンセントレーター（Amicon）を用い
て濃縮した。酵素不含細胞解離バッファー（Life Technologies）を用いてフラ
スコから細胞を解離させることによって採取し、プロテアーゼ阻害剤のカクテル
（Boehirnger Mannheim）を含有する５０ｍＭ トリス／ＨＣｌ ｐＨ７．４、１
％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中、４℃で３０分間インキュベーションすることによ
って溶解させた。遠心分離後（３０００ｘｇ、５分間）、上清を吸引し、アッセ
イまで−２０℃で保管した。
【００５２】
Ａｓｐ２の細胞下局在化
Ｍｙｃエピトープタグを有するＡｓｐ２をコードするｃＤＮＡをＣＯＳ−７Ａ
ＰＰ−７５１細胞中にトランスフェクトした。細胞を固定し、Spector,D.L.、Go
ldman,R.D.＆Leinwald,L.A.によってLaboratory Manual、３、１０５．３、Cold
Spring Harbor Lab Press、Cold Spring Harbor、New York（１９９８）に記載
されるように、間接的免疫蛍光法用に処理した。ＡＰＰを抗Ｃ−末端抗体Ａｂ５
４を用いて可視化させた。対照となる抗体は、Sigmaからのモノクローナル抗−
ゴルジ５８Ｋ蛋白、Transduction Labsからのモノクローナル初期エンドソーム
抗原１（ＥＥＡ１）、Stressgenからのモノクローナル抗ＫＤＥＬ、SantaCruz B
iotechnologyからのモノクローナル抗Ｍｙｃであった。Molecular Probesからの
抗マウス抗体で標識したAlexa４８８または抗ウサギ抗体で標識したAlexa５６８
を用いて検出した。Leica共焦点顕微鏡を用いて顕微鏡検査を行った。
ＰＰ−７５１細胞中にトランスフェクトした。細胞を固定し、Spector,D.L.、Go
ldman,R.D.＆Leinwald,L.A.によってLaboratory Manual、３、１０５．３、Cold
Spring Harbor Lab Press、Cold Spring Harbor、New York（１９９８）に記載
されるように、間接的免疫蛍光法用に処理した。ＡＰＰを抗Ｃ−末端抗体Ａｂ５
４を用いて可視化させた。対照となる抗体は、Sigmaからのモノクローナル抗−
ゴルジ５８Ｋ蛋白、Transduction Labsからのモノクローナル初期エンドソーム
抗原１（ＥＥＡ１）、Stressgenからのモノクローナル抗ＫＤＥＬ、SantaCruz B
iotechnologyからのモノクローナル抗Ｍｙｃであった。Molecular Probesからの
抗マウス抗体で標識したAlexa４８８または抗ウサギ抗体で標識したAlexa５６８
を用いて検出した。Leica共焦点顕微鏡を用いて顕微鏡検査を行った。
【００５３】
免疫組織化学
Ａｓｐ２免疫組織化学：２人のアルツハイマー病患者（女性、６２歳および８
９歳）および２人の高齢の対照（女性、８０歳および８６歳）から由来のパラホ
ルムアルデヒドで固定化した海馬ならびに前頭部および側頭部皮質の１０μｍの
セクションを再水和し、４℃にて一夜インキュベートすることによってＡｓｐ２
に対する抗体で標識した。その後の処理は、ビオチン−アビジン系（ビオチニル
化したヤギ抗ウサギ抗体を用いる）およびクロモゲン、ジアミノベンジジン（Ve
ctor Laboratories）を用いた。
９歳）および２人の高齢の対照（女性、８０歳および８６歳）から由来のパラホ
ルムアルデヒドで固定化した海馬ならびに前頭部および側頭部皮質の１０μｍの
セクションを再水和し、４℃にて一夜インキュベートすることによってＡｓｐ２
に対する抗体で標識した。その後の処理は、ビオチン−アビジン系（ビオチニル
化したヤギ抗ウサギ抗体を用いる）およびクロモゲン、ジアミノベンジジン（Ve
ctor Laboratories）を用いた。
【００５４】
変異誘発
Stratagene QuickChenge変異誘発装置を用いてＡｓｐ２活性部位の変異体を構
築した。２つのオリゴヌクレオチドを消化して各ＡｓｐをＡｓｎに導入した。 Ｄ９３Ｎ１： ５' CTCAACATCCTGGTGAATACAGGCAGCAGTAAC ３'（配列番号１０） Ｄ９３Ｎ２： ５' GTTACTGCTGCCTGTATTCACCAGGATGTTGAG ３'（配列番号１１） Ｄ２８９Ｎ１： ５' GACAAGAGCATTGTGAACAGTGGCACCACCAAC ３'（配列番号１２） Ｄ２８９Ｎ２： ５' GTTGGTGGTGCCACTGTTCACAATGCTCTTGTC ３'（配列番号１３） （上記した位置Ｄ９３およびＤ２８９は成熟蛋白の位置Ｄ４８およびＤ２４４に
対応する） 変異を、QuickChengeプロトコルに従って、ｐｃＤＮＡ３．１ａＡｓｐ２構築物
中に導入した。変異体を配列決定し、所望の活性部位変異の存在およびＰＣＲ変
異の不存在を確認した。
築した。２つのオリゴヌクレオチドを消化して各ＡｓｐをＡｓｎに導入した。 Ｄ９３Ｎ１： ５' CTCAACATCCTGGTGAATACAGGCAGCAGTAAC ３'（配列番号１０） Ｄ９３Ｎ２： ５' GTTACTGCTGCCTGTATTCACCAGGATGTTGAG ３'（配列番号１１） Ｄ２８９Ｎ１： ５' GACAAGAGCATTGTGAACAGTGGCACCACCAAC ３'（配列番号１２） Ｄ２８９Ｎ２： ５' GTTGGTGGTGCCACTGTTCACAATGCTCTTGTC ３'（配列番号１３） （上記した位置Ｄ９３およびＤ２８９は成熟蛋白の位置Ｄ４８およびＤ２４４に
対応する） 変異を、QuickChengeプロトコルに従って、ｐｃＤＮＡ３．１ａＡｓｐ２構築物
中に導入した。変異体を配列決定し、所望の活性部位変異の存在およびＰＣＲ変
異の不存在を確認した。
【００５５】
ＳＤＳ ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティング
細胞ライゼート（２０μｇ）または培地（２０倍濃縮した培地の１５μｌ）試
料を等量のＬａｍｅｌｌｉ試料バッファー（０．５Ｍトリス／ＨＣｌ、ｐＨ６．
８、１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．１％ブロモフェノールブルー、２０％（ｖ／
ｖ）グリセロールおよび５％β−メルカプトエタノール）と混合し、プレキャス
トを用いて１０％トリスグリシンＳＤＳポリアクリルアミドゲル（Novex）上で
電気泳動に付した。電気泳動後、ウェットブロット（wet blot）装置（Novex）
を用いて、ゲルをＰＶＤＦ上に１００Ｖにて６０分間エレクトロブロットした。
転移バッファーは３５ｍＭトリスＨＣｌ、１９３ｍＭグリシンおよび２０％メタ
ノール（ｖ／ｖ）を含んだ。転移後、膜を５％Ｍａｒｖｅｌ、リン酸緩衝化セイ
ライン（ＰＢＳ）、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０中、室温で３時間遮断した。次い
で、膜を一次抗体と一緒に２％ウシ血清アルブミン、ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅ
ｎ−２０中、４℃で一夜インキュベートした。抗−Ｈｉｓ６抗体（Boehringer M
annheim）は１：１０００倍希釈で用い、ＡＰＰのＣ末端（アミノ酸配列６７６
−６９５）に対して生じた抗体、Ａｂ５４（Allsop,D.ら、Alzheimer's Disease
: Biology, Diagnostics and Therapeutics、Iqbal,K.、Winblad,B.、Nishimura
,T.、Takeda,M.＆Wisneski,H.M.、717-727、John Wiley、New York (1997)）は
１：２５０００倍希釈で用い、ＡＰＰのＡβドメインのアミノ酸１−１６に対し
て生じた抗体ＷＯ２（Ida N.ら、J.Biol.Chem. 271: 22908-22914 (1996)）は１
：３０００倍希釈で用い、β−セクレターゼによる切断後に生じた可溶性ＡＰＰ
のネオエピトープ領域に対して生じた抗体１Ａ９（Le Brocque,D.ら、Biochem.
37: 14558-14565 (1998)）は１：３０００倍希釈で用いた。結合した抗体を強化
化学ルミネセンス（ＥＣＬ）検出法（Amesham）と共に、ペルオキシダーゼ結合
型二次抗体（sigma）を用い、抗体１Ａ９および抗体ＷＯ２でプローブした膜の
場合、付加的なペルオキシダーゼ抗−ペルオキシダーゼ抗体を用いて検出した。
料を等量のＬａｍｅｌｌｉ試料バッファー（０．５Ｍトリス／ＨＣｌ、ｐＨ６．
８、１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．１％ブロモフェノールブルー、２０％（ｖ／
ｖ）グリセロールおよび５％β−メルカプトエタノール）と混合し、プレキャス
トを用いて１０％トリスグリシンＳＤＳポリアクリルアミドゲル（Novex）上で
電気泳動に付した。電気泳動後、ウェットブロット（wet blot）装置（Novex）
を用いて、ゲルをＰＶＤＦ上に１００Ｖにて６０分間エレクトロブロットした。
転移バッファーは３５ｍＭトリスＨＣｌ、１９３ｍＭグリシンおよび２０％メタ
ノール（ｖ／ｖ）を含んだ。転移後、膜を５％Ｍａｒｖｅｌ、リン酸緩衝化セイ
ライン（ＰＢＳ）、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０中、室温で３時間遮断した。次い
で、膜を一次抗体と一緒に２％ウシ血清アルブミン、ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅ
ｎ−２０中、４℃で一夜インキュベートした。抗−Ｈｉｓ６抗体（Boehringer M
annheim）は１：１０００倍希釈で用い、ＡＰＰのＣ末端（アミノ酸配列６７６
−６９５）に対して生じた抗体、Ａｂ５４（Allsop,D.ら、Alzheimer's Disease
: Biology, Diagnostics and Therapeutics、Iqbal,K.、Winblad,B.、Nishimura
,T.、Takeda,M.＆Wisneski,H.M.、717-727、John Wiley、New York (1997)）は
１：２５０００倍希釈で用い、ＡＰＰのＡβドメインのアミノ酸１−１６に対し
て生じた抗体ＷＯ２（Ida N.ら、J.Biol.Chem. 271: 22908-22914 (1996)）は１
：３０００倍希釈で用い、β−セクレターゼによる切断後に生じた可溶性ＡＰＰ
のネオエピトープ領域に対して生じた抗体１Ａ９（Le Brocque,D.ら、Biochem.
37: 14558-14565 (1998)）は１：３０００倍希釈で用いた。結合した抗体を強化
化学ルミネセンス（ＥＣＬ）検出法（Amesham）と共に、ペルオキシダーゼ結合
型二次抗体（sigma）を用い、抗体１Ａ９および抗体ＷＯ２でプローブした膜の
場合、付加的なペルオキシダーゼ抗−ペルオキシダーゼ抗体を用いて検出した。
【００５６】
ＡＰＰ Ｃ末端フラグメントの場合、細胞ライゼート（２０μｇ）を等量のＬ
ａｍｅｌｌｉ試料バッファー（０．５Ｍトリス／ＨＣｌ、ｐＨ６．８、１０％（
ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．１％ブロモフェノールブルー、２０％（ｖ／ｖ）グリセロ
ールおよび５％β−メルカプトエタノール）と混合し、プレキャストを用いて１
０−２０％トリストリシンＳＤＳポリアクリルアミドゲル（Nevex）上で電気泳
動した。電気泳動後、ゲルを０．４５μｍニトロセルロース上に０．３８Ａで３
５分間、ウェットブロット装置（Novex）を用いてエレクトロブロットした。転
移バッファーは、３５ｍＭトリスＨＣｌ、１９３ｍＭグリシン、０．０１％ＳＤ
Ｓおよび２０％メタノール（ｖ／ｖ）からなった。転移後、ブロットを沸騰ＰＢ
Ｓ中で１０分間、電子レンジにかけた。転移後、Ａｂ５４で検出する場合、膜を
５％ミルク粉末、リン酸緩衝化セイライン（ＰＢＳ）、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２
０中、室温で１時間遮断した。次いで、膜を２％ウシ血清アルブミン、ＰＢＳ、
０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０中においてＡｂ５４（１：２５０００の希釈率で使用
される）と一緒に４℃で一夜インキュベートした。ＷＯ２の場合、膜を１０％ミ
ルク粉末、ＰＢＳ中、室温で１時間遮断した。次いで、膜をＰＢＳ中１μｇ／ｍ
ｌのＷＯ２と一緒に４℃で一夜インキュベートした。強化化学ルミネセンス（Ｅ
ＣＬ）検出法（Amersham）と共にペルオキシダーゼ結合型二次抗体（Sigma）を
用いて、結合した抗体を検出した。
ａｍｅｌｌｉ試料バッファー（０．５Ｍトリス／ＨＣｌ、ｐＨ６．８、１０％（
ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．１％ブロモフェノールブルー、２０％（ｖ／ｖ）グリセロ
ールおよび５％β−メルカプトエタノール）と混合し、プレキャストを用いて１
０−２０％トリストリシンＳＤＳポリアクリルアミドゲル（Nevex）上で電気泳
動した。電気泳動後、ゲルを０．４５μｍニトロセルロース上に０．３８Ａで３
５分間、ウェットブロット装置（Novex）を用いてエレクトロブロットした。転
移バッファーは、３５ｍＭトリスＨＣｌ、１９３ｍＭグリシン、０．０１％ＳＤ
Ｓおよび２０％メタノール（ｖ／ｖ）からなった。転移後、ブロットを沸騰ＰＢ
Ｓ中で１０分間、電子レンジにかけた。転移後、Ａｂ５４で検出する場合、膜を
５％ミルク粉末、リン酸緩衝化セイライン（ＰＢＳ）、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２
０中、室温で１時間遮断した。次いで、膜を２％ウシ血清アルブミン、ＰＢＳ、
０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０中においてＡｂ５４（１：２５０００の希釈率で使用
される）と一緒に４℃で一夜インキュベートした。ＷＯ２の場合、膜を１０％ミ
ルク粉末、ＰＢＳ中、室温で１時間遮断した。次いで、膜をＰＢＳ中１μｇ／ｍ
ｌのＷＯ２と一緒に４℃で一夜インキュベートした。強化化学ルミネセンス（Ｅ
ＣＬ）検出法（Amersham）と共にペルオキシダーゼ結合型二次抗体（Sigma）を
用いて、結合した抗体を検出した。
【００５７】
結果
ヒトにおけるＡｓｐ２免疫反応性の証明
ＡＤおよび対照海馬を、Ａｓｐ２由来のペプチド配列に対して生じた蛋白Ａ精
製ポリクローナル抗血清を用いてＡｓｐ１に対して免疫染色した。明らかな神経
細胞の染色はあるが、星状細胞、小グリア細胞または希突起グリア細胞に関連し
た染色はなかった。いくつかの神経細胞は、他よりも強く標識されたようであっ
たが、それらは全て、神経細胞形質および樹状突起の細胞質だけに局在する免疫
反応性を有する類似の染色パターンを示した。樹状突起の染色はめったに１０−
１５μｍを超えて広がらず、軸策の標識化は観察されなかった。陽性細胞体その
ものの内で、染色は不均一であり、わずかな粒状を示した。神経細胞内染色もま
た、高齢の対照から由来の前頭部および側頭部皮質において、および脳において
明らかであった。
製ポリクローナル抗血清を用いてＡｓｐ１に対して免疫染色した。明らかな神経
細胞の染色はあるが、星状細胞、小グリア細胞または希突起グリア細胞に関連し
た染色はなかった。いくつかの神経細胞は、他よりも強く標識されたようであっ
たが、それらは全て、神経細胞形質および樹状突起の細胞質だけに局在する免疫
反応性を有する類似の染色パターンを示した。樹状突起の染色はめったに１０−
１５μｍを超えて広がらず、軸策の標識化は観察されなかった。陽性細胞体その
ものの内で、染色は不均一であり、わずかな粒状を示した。神経細胞内染色もま
た、高齢の対照から由来の前頭部および側頭部皮質において、および脳において
明らかであった。
【００５８】
Ａｓｐ２は、ＡＰＰの６９５イソ型を安定して発現するトランスフェクトされ
ていないＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ ＡＰＰ−６９５）に、およびＡ
ＰＰの７５１７５１イソ型を発現するＣＯＳ−７細胞（ＣＯＳ−７ ＡＰＰ−７
５１）にて存在することがわかった。Ａｓｐ２のレベルは、Ａｓｐ２遺伝子を有
するベクターｐｃＤＮＡ３．１での一過性トランスフェクションで増加した。そ
の蛋白での一過性トランスフェクションに付すと、Ａｓｐ２は６５ｋＤａでの主
要なバンドとして存在した。ＥＣＬブロットを長期間にわたって照射すると、６
０ｋＤａでのバンドが弱くなるのは明らかであった。脱糖鎖形成実験により、こ
れら２つのバンドがその同じ蛋白とは別に糖鎖形成された形態であることがわか
った。
ていないＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ ＡＰＰ−６９５）に、およびＡ
ＰＰの７５１７５１イソ型を発現するＣＯＳ−７細胞（ＣＯＳ−７ ＡＰＰ−７
５１）にて存在することがわかった。Ａｓｐ２のレベルは、Ａｓｐ２遺伝子を有
するベクターｐｃＤＮＡ３．１での一過性トランスフェクションで増加した。そ
の蛋白での一過性トランスフェクションに付すと、Ａｓｐ２は６５ｋＤａでの主
要なバンドとして存在した。ＥＣＬブロットを長期間にわたって照射すると、６
０ｋＤａでのバンドが弱くなるのは明らかであった。脱糖鎖形成実験により、こ
れら２つのバンドがその同じ蛋白とは別に糖鎖形成された形態であることがわか
った。
【００５９】
Ａｓｐ２およびＡＰＰの細胞下局在化
Ｍｙｃエピトープでタグ化したＡｓｐ２を有するベクターｐｃＤＮＡ３．１を
ＣＯＳ−７ ＡＰＰ−７５１細胞中にトランスフェクトした。いくつかの報告（K
uentzel,S.L.、Ali,S.M.、Altman,R.A.、Greenberg,B.D.＆Raub,T.J.、J.Bioche
m. ２９５、３６７−３７８（１９９３）；Walter,J.ら、Mol.Med. ２、６７３
−６９１（１９９６））と矛盾することなく、特有の核近位染色および細胞全体
にわたるさらに全体的な網状染色により明らかにされるように、ＡＰＰがゴルジ
／小胞体の領域に局在化したのは明らかであった。ＣＯＳ−７ ＡＰＰ−７５１
細胞中のＭｙｃタグ化Ａｓｐ２およびＡＰＰを同時に検出することで明らかにさ
れるように、Ａｓｐ２は本質的に同じ細胞下分布を示し、ＡＰＰとの明らかな共
同局在化を示した。共同局在化が絶対的ではなく；ＡＰＰがＡｓｐ２よりも細胞
周辺に向かってより簡単に検出されることは興味のあることである。このことは
これら２つの蛋白が処理され、細胞内を移動する際に、それら蛋白が分離する可
能性のあることを示唆する。これら蛋白の分布は、初期エンドソームおよび小胞
体を特定するマーカーの分布とは全く異なる。
ＣＯＳ−７ ＡＰＰ−７５１細胞中にトランスフェクトした。いくつかの報告（K
uentzel,S.L.、Ali,S.M.、Altman,R.A.、Greenberg,B.D.＆Raub,T.J.、J.Bioche
m. ２９５、３６７−３７８（１９９３）；Walter,J.ら、Mol.Med. ２、６７３
−６９１（１９９６））と矛盾することなく、特有の核近位染色および細胞全体
にわたるさらに全体的な網状染色により明らかにされるように、ＡＰＰがゴルジ
／小胞体の領域に局在化したのは明らかであった。ＣＯＳ−７ ＡＰＰ−７５１
細胞中のＭｙｃタグ化Ａｓｐ２およびＡＰＰを同時に検出することで明らかにさ
れるように、Ａｓｐ２は本質的に同じ細胞下分布を示し、ＡＰＰとの明らかな共
同局在化を示した。共同局在化が絶対的ではなく；ＡＰＰがＡｓｐ２よりも細胞
周辺に向かってより簡単に検出されることは興味のあることである。このことは
これら２つの蛋白が処理され、細胞内を移動する際に、それら蛋白が分離する可
能性のあることを示唆する。これら蛋白の分布は、初期エンドソームおよび小胞
体を特定するマーカーの分布とは全く異なる。
【００６０】
ｓＡＰＰβ分泌に対するＡｓｐ２の発現およびＡｓｐ２活性部位変異体の効果
活性部位変異体およびＡｓｐ２の両方がＳＨ−ＳＹ５Ｙ ＡＰＰ−６９５細胞
において同様なレベルまで発現された。空ベクターｐｃＤＮＡ３．１ＭｙｃＨｉ
ｓトランスフェクト対照細胞と比べて、ｓＡＰＰβ（１１０ｋＤａ）の増加がＡ
ｓｐ２トランスフェクト細胞から由来の培地中で観察された。Ａｓｐ−Ａｓｎ変
異体Ｄ９３ＮまたはＤ２８９Ｎのいずれかでトランスフェクトした細胞から分泌
されたｓＡＰＰβは何の増加も示さなかった。ｓＡＰＰβで見られたのとは対照
的に、Ａｓｐ２は可溶性ＡＰＰαの分泌または細胞中における全長ＡＰＰに対し
て効果がなかった。
において同様なレベルまで発現された。空ベクターｐｃＤＮＡ３．１ＭｙｃＨｉ
ｓトランスフェクト対照細胞と比べて、ｓＡＰＰβ（１１０ｋＤａ）の増加がＡ
ｓｐ２トランスフェクト細胞から由来の培地中で観察された。Ａｓｐ−Ａｓｎ変
異体Ｄ９３ＮまたはＤ２８９Ｎのいずれかでトランスフェクトした細胞から分泌
されたｓＡＰＰβは何の増加も示さなかった。ｓＡＰＰβで見られたのとは対照
的に、Ａｓｐ２は可溶性ＡＰＰαの分泌または細胞中における全長ＡＰＰに対し
て効果がなかった。
【００６１】
ＡＰＰ Ｃ末端フラグメントに対するＡｓｐ２の発現およびＡｓｐ２活性部位変
異体の効果 ＡＰＰのＣ末端フラグメントがスウェーデン変異の有るまたは無いＡＰＰ−７
５１を安定して発現するＣＯＳ−７細胞中で検出された。ＡＰＰのＣ末端領域に
対して生じたＡｂ５４によって、１２ｋＤａおよび１０ｋＤａのバンドが検出さ
れた。１２ｋＤａフラグメントはヒトＡβの５−９残基に特異的な抗体ＷＯ２と
免疫反応したので、β−セクレターゼの作用によって生産されたＣ末端フラグメ
ント（ＣＴＦβ）である。１０ｋＤａフラグメントバンドはこの抗体と免疫反応
せず、したがってこのことおよびその分子量に基づいて、該フラグメントバンド
はα−セクレターゼの作用によって生産されたＣ末端フラグメント、ＣＴＦαで
ある。γ−セクレターゼの作用によって生産されたＣ末端フラグメントは検出さ
れなかった。これは、該フラグメントが低レベルであるため、または細胞におけ
るその迅速なクリアランスのためであるかもしれない。 Ａｓｐ２でのトランスフェクションは、Ａｂ５４およびＷＯ２抗体によって検
出した場合、ＣＯＳ−７ＡＰＰ−７５１細胞中における１２ｋＤａ ＣＴＦの蓄
積をもたらした。Ａｓｐ２との一過性トランスフェクションはまた、スウェーデ
ン変異を含むＡＰＰ−７５１を発現するＣＯＳ−７にてこの１２ｋＤａβ−セク
レターゼ誘導のＣＴＦの蓄積の原因となる。 Ｄ９３ＮおよびＤ２８９Ｎ活性部位変異体ではＣＴＦβの増加はなく、エンド
クレプシン−２の発現が触媒的アスパラギン酸残基が存在する必要のある機能的
プロテイナーゼをコードすることを確認した。
異体の効果 ＡＰＰのＣ末端フラグメントがスウェーデン変異の有るまたは無いＡＰＰ−７
５１を安定して発現するＣＯＳ−７細胞中で検出された。ＡＰＰのＣ末端領域に
対して生じたＡｂ５４によって、１２ｋＤａおよび１０ｋＤａのバンドが検出さ
れた。１２ｋＤａフラグメントはヒトＡβの５−９残基に特異的な抗体ＷＯ２と
免疫反応したので、β−セクレターゼの作用によって生産されたＣ末端フラグメ
ント（ＣＴＦβ）である。１０ｋＤａフラグメントバンドはこの抗体と免疫反応
せず、したがってこのことおよびその分子量に基づいて、該フラグメントバンド
はα−セクレターゼの作用によって生産されたＣ末端フラグメント、ＣＴＦαで
ある。γ−セクレターゼの作用によって生産されたＣ末端フラグメントは検出さ
れなかった。これは、該フラグメントが低レベルであるため、または細胞におけ
るその迅速なクリアランスのためであるかもしれない。 Ａｓｐ２でのトランスフェクションは、Ａｂ５４およびＷＯ２抗体によって検
出した場合、ＣＯＳ−７ＡＰＰ−７５１細胞中における１２ｋＤａ ＣＴＦの蓄
積をもたらした。Ａｓｐ２との一過性トランスフェクションはまた、スウェーデ
ン変異を含むＡＰＰ−７５１を発現するＣＯＳ−７にてこの１２ｋＤａβ−セク
レターゼ誘導のＣＴＦの蓄積の原因となる。 Ｄ９３ＮおよびＤ２８９Ｎ活性部位変異体ではＣＴＦβの増加はなく、エンド
クレプシン−２の発現が触媒的アスパラギン酸残基が存在する必要のある機能的
プロテイナーゼをコードすることを確認した。
【００６２】
Ａｓｐ２−Ｆｃ融合蛋白（Ａｓｐ２（１−４６０）−Ｆｃ）の調製
Ａｓｐ２、アミノ酸１〜４６０（ＥＰ８５５４４４；ただしＧｌｕ->Ｖａｌ）
をコードするｃＤＮＡフラグメントをサブクローン化して、ヒト免疫グロブリン
、ＩｇＧ１の９９−３３０残基との融合蛋白を創製し、哺乳動物発現ベクターｐ
ＣＤＮ（Aiyarら）中にクローン化した。Ｎｏｔ１での消化によってプラスミド
を線状にし（１５μｇＤＮＡ、３７℃、一夜）、滅菌的に沈殿させ、５０μｌ１
ｘＴＥバッファー（１０ｍＭトリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中に再懸
濁した。Hensleyらの技術を用いて、ＤＮＡをBio−Rad Gene Pulser（Bio-Rad L
aboratories）を用いてチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ Ｅ１Ａ）細胞系統
（維持培地中の懸濁液中での生育に順応させたＤＧ−４４（Urlaubら）から由来
）中にエレクトロポレートした。選択するまでの２４時間、細胞を９６ウェル培
養プレート中に維持培地中５ｘ１０５細胞／プレートにて播種した。細胞はヌク
レオシドを含有しない維持培地（選択培地）中で選択した。個々のコロニー由来
の条件付培地を、Ｏｒｉｇｅｎアナライザー（IGEN）上で電気化学ルミネセンス
検出法を用いてアッセイした（この技術はYangが１９９４年に報告されている）
。高発現コロニーを３０リットルの選択培地を含有する２５０ｍｌ振盪フラスコ
中に秤量し、精製のための条件培地を得た。
をコードするｃＤＮＡフラグメントをサブクローン化して、ヒト免疫グロブリン
、ＩｇＧ１の９９−３３０残基との融合蛋白を創製し、哺乳動物発現ベクターｐ
ＣＤＮ（Aiyarら）中にクローン化した。Ｎｏｔ１での消化によってプラスミド
を線状にし（１５μｇＤＮＡ、３７℃、一夜）、滅菌的に沈殿させ、５０μｌ１
ｘＴＥバッファー（１０ｍＭトリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中に再懸
濁した。Hensleyらの技術を用いて、ＤＮＡをBio−Rad Gene Pulser（Bio-Rad L
aboratories）を用いてチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ Ｅ１Ａ）細胞系統
（維持培地中の懸濁液中での生育に順応させたＤＧ−４４（Urlaubら）から由来
）中にエレクトロポレートした。選択するまでの２４時間、細胞を９６ウェル培
養プレート中に維持培地中５ｘ１０５細胞／プレートにて播種した。細胞はヌク
レオシドを含有しない維持培地（選択培地）中で選択した。個々のコロニー由来
の条件付培地を、Ｏｒｉｇｅｎアナライザー（IGEN）上で電気化学ルミネセンス
検出法を用いてアッセイした（この技術はYangが１９９４年に報告されている）
。高発現コロニーを３０リットルの選択培地を含有する２５０ｍｌ振盪フラスコ
中に秤量し、精製のための条件培地を得た。
【００６３】
Aiyar,N.、Baker,E.、Wu,H-L,E.、Nambi,P.、Edwards,R.M.、Trill,J.J.、Ellis
,C.、Bergsma,D.、 Human AT1 receptor is a single copy gene：characterization in a stable c
ell line. Molecular and Cellular Biochemistry １３１：７５−８６、１９９
４； Urlaub,G.、Kas,E.、Carothers,A.M.およびChasin,L.A.（１９８３）Cell ３３
、４０５−４１２； Hensley,P.、McDevitt,P.J.、Brooks,I.、Trill,J.J.、Feild,J.A.、McNulty,D.
E.、Connor,J.R.、Griswold,D.E.、Kumar,V.、Kopple,K.D.、Carr,S.A.、Dalton
,B.J.、Johanson,K. The soluble form of E-selectin is an asymmetric monom
er：Expression, purification and characterization of the recombinant pro
tein. J.Biol.Chem ２６９：２３９４９−２３９５８（１９９４）； Yang,H.、Leland,J.K.、Yost,D.、Massey,R.J. Electrochemiluminescence：A n
ew diagnostic and research tool. Biotechnology, １２：１９３−１９４（１
９９４）
,C.、Bergsma,D.、 Human AT1 receptor is a single copy gene：characterization in a stable c
ell line. Molecular and Cellular Biochemistry １３１：７５−８６、１９９
４； Urlaub,G.、Kas,E.、Carothers,A.M.およびChasin,L.A.（１９８３）Cell ３３
、４０５−４１２； Hensley,P.、McDevitt,P.J.、Brooks,I.、Trill,J.J.、Feild,J.A.、McNulty,D.
E.、Connor,J.R.、Griswold,D.E.、Kumar,V.、Kopple,K.D.、Carr,S.A.、Dalton
,B.J.、Johanson,K. The soluble form of E-selectin is an asymmetric monom
er：Expression, purification and characterization of the recombinant pro
tein. J.Biol.Chem ２６９：２３９４９−２３９５８（１９９４）； Yang,H.、Leland,J.K.、Yost,D.、Massey,R.J. Electrochemiluminescence：A n
ew diagnostic and research tool. Biotechnology, １２：１９３−１９４（１
９９４）
【００６４】
Ａｓｐ２−Ｆｃ精製
上記に従って調製したＡｓｐ２−ＦｃをＣＨＯ Ｅｌａ培地から蛋白Ａアフィ
ニティークロマトグラフィー（BioProcessing LtdのＰｒｏＳｅｐＡ樹脂）によ
って捕獲した。その融合蛋白を０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ３．０）でカラ
ムより溶出させ、１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いて中和し、０．２５
Ｍ ＮａＣｌを含有する２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）に対して透析した。
Ｎ−末端配列決定およびＤＴＴと共にまたは無しでのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は蛋
白がＡｓｐ２／Ｆｃ−Ｆｃのジスルフィド結合ヘテロダイマーであることを示し
た。Ｎ末端配列決定は、シグナル配列の全てを処理し、プロフォーム（Ｔｈｒ２
２より開始）が３７．５％および成熟形態（Ｇｌｕ４６より開始）が６２．５％
からなることが分った。
ニティークロマトグラフィー（BioProcessing LtdのＰｒｏＳｅｐＡ樹脂）によ
って捕獲した。その融合蛋白を０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ３．０）でカラ
ムより溶出させ、１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いて中和し、０．２５
Ｍ ＮａＣｌを含有する２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）に対して透析した。
Ｎ−末端配列決定およびＤＴＴと共にまたは無しでのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は蛋
白がＡｓｐ２／Ｆｃ−Ｆｃのジスルフィド結合ヘテロダイマーであることを示し
た。Ｎ末端配列決定は、シグナル配列の全てを処理し、プロフォーム（Ｔｈｒ２
２より開始）が３７．５％および成熟形態（Ｇｌｕ４６より開始）が６２．５％
からなることが分った。
【００６５】
Ａｓｐ２に関する蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）切断アッセイ
スウェーデン変異体ＡＰＰベータ部位配列の配列に基づくペプチド（Ｘ）をＦ
ＲＥＴアッセイにおける使用のために二重標識した。
ＲＥＴアッセイにおける使用のために二重標識した。
【００６６】
【化３】
【００６７】
該ペプチドは、Ｎ末端にローダミングリーン基を、Ｃ末端にテトラメチルロー
ダミン基を有する、スウェーデン変異体ベータ−切断部位をスパンニングする１
１残基（Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ＊Ａｓｐ−Ａｌａ−
Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ）を包含する。これは、Ａｓｐ２による介在するペプチ
ド配列の切断を２つの蛍光基間のエネルギー移動によってモニターすることを可
能にする。
ダミン基を有する、スウェーデン変異体ベータ−切断部位をスパンニングする１
１残基（Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ＊Ａｓｐ−Ａｌａ−
Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ）を包含する。これは、Ａｓｐ２による介在するペプチ
ド配列の切断を２つの蛍光基間のエネルギー移動によってモニターすることを可
能にする。
【００６８】
実際、アッセイは下記のように行われた。
蛍光ペプチド基質（０．５μＭ）を５０ｍＭ酢酸ナトリウム、２０ｍＭ塩化ナ
トリウム、５％グリセロール、０．１％ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロ
ピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパン−スルホネート）、ｐＨ３．８）を
含有するバッファー中において、上記のように調製されたＡｓｐ２−Ｆｃ酵素と
一緒にインキュベートした。アッセイは、酵素（２５ｎＭ最終濃度）の添加によ
って開始され、切断は４８５ｎｍ励起、５３８ｎｍ発光を用いる蛍光プレートリ
ーダーにおいてモニターされた。ペプチドのＣ末端ＴＡＭＲＡ基は効果的な消光
剤として作用したので、ローダミングリーン強度の増加が切断において観察され
た。
トリウム、５％グリセロール、０．１％ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロ
ピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパン−スルホネート）、ｐＨ３．８）を
含有するバッファー中において、上記のように調製されたＡｓｐ２−Ｆｃ酵素と
一緒にインキュベートした。アッセイは、酵素（２５ｎＭ最終濃度）の添加によ
って開始され、切断は４８５ｎｍ励起、５３８ｎｍ発光を用いる蛍光プレートリ
ーダーにおいてモニターされた。ペプチドのＣ末端ＴＡＭＲＡ基は効果的な消光
剤として作用したので、ローダミングリーン強度の増加が切断において観察され
た。
【００６９】
該アッセイは、目的化合物のＩＣ５０およびＫｉ値を決定するために使用され
た。
た。
【化４】
（Ｉ）
【００７０】
【化５】
（ＩＩ）
を含む、多くのヒドロキシエチレン化合物が該アッセイにおける阻害剤であるこ
とがわかった。（Ｉ）および（ＩＩ）について、各々、７．７ｎＭおよび７．３
ｎＭのＫｉ値が測定された。
とがわかった。（Ｉ）および（ＩＩ）について、各々、７．７ｎＭおよび７．３
ｎＭのＫｉ値が測定された。
【００７１】
Ａｓｐ２蛍光偏光アッセイ
Ａｓｐ２活性部位で作用する化合物を同定するためにさらに競合アッセイを設
計した。５−，６−ローダミングリーンをヒドロキシエチレン阻害剤（Ｉ）の遊
離Ｎ末端アミンに付加することによって該化合物を修飾し、標識したリガンド（
ＩＩＩ）を創製した。
計した。５−，６−ローダミングリーンをヒドロキシエチレン阻害剤（Ｉ）の遊
離Ｎ末端アミンに付加することによって該化合物を修飾し、標識したリガンド（
ＩＩＩ）を創製した。
【００７２】
【化６】
（ＩＩＩ）
【００７３】
得られた化合物を下記のように実験的に試験して、上記のように調製されたＡ
ｓｐ２−Ｆｃ酵素でＫｄを決定した。 酵素およびリガンド（ＩＩＩ）を変える３次元分析を行った。リガンド濃度範
囲は１、３、１０、３０および１００ｎＭであった。酵素濃度範囲は、１００ｎ
Ｍから下に連続２倍希釈（１１回希釈＋酵素なしの対照）であった。適当な濃度
のリガンドを５％ＤＭＳＯ中で調製した。酵素溶液を２倍の（ｘ２）アッセイバ
ッファー（ここに、ｘ１＝５０ｍＭ酢酸ナトリウム、２０ｍＭ塩化ナトリウム、
５％グリセロール、０．１％ＣＨＡＰＳ、ｐＨ４．０）中において調製した。５
μｌの酵素溶液（種々の濃度）を５μｌのリガンド（種々の濃度）と低容量３８
４ミクロタイタープレート中で混合した。試料を１５分間平衡化した後、蛍光偏
光をＬＪＬ Ａｃｑｕｅｓｔプレートリーダーにおいて読取った。 異方性値をプロットし、密着結合相互作用のＫｄを得た。１．２２ｎＭのＫｄ
が相互作用について得られた。
ｓｐ２−Ｆｃ酵素でＫｄを決定した。 酵素およびリガンド（ＩＩＩ）を変える３次元分析を行った。リガンド濃度範
囲は１、３、１０、３０および１００ｎＭであった。酵素濃度範囲は、１００ｎ
Ｍから下に連続２倍希釈（１１回希釈＋酵素なしの対照）であった。適当な濃度
のリガンドを５％ＤＭＳＯ中で調製した。酵素溶液を２倍の（ｘ２）アッセイバ
ッファー（ここに、ｘ１＝５０ｍＭ酢酸ナトリウム、２０ｍＭ塩化ナトリウム、
５％グリセロール、０．１％ＣＨＡＰＳ、ｐＨ４．０）中において調製した。５
μｌの酵素溶液（種々の濃度）を５μｌのリガンド（種々の濃度）と低容量３８
４ミクロタイタープレート中で混合した。試料を１５分間平衡化した後、蛍光偏
光をＬＪＬ Ａｃｑｕｅｓｔプレートリーダーにおいて読取った。 異方性値をプロットし、密着結合相互作用のＫｄを得た。１．２２ｎＭのＫｄ
が相互作用について得られた。
【００７４】
化合物（ＩＶ）を同じアッセイで試験して化合物（ＩＩＩ）に対する競合性を
明らかにした。
明らかにした。
【化７】
（ＩＶ）
【００７５】
酵素（固定濃度２５ｎＭ）、リガンド（ＩＩＩ）（固定濃度２．５ｎＭ）およ
び試験化合物（１０μＭから下に２倍の連続希釈）を最終アッセイ容量１０μｌ
においてｘ１アッセイバッファー（５０ｍＭ ５０ｍＭ酢酸ナトリウム、２０ｍ
Ｍ塩化ナトリウム、５％グリセロール、０．１％ＣＨＡＰＳ、ｐＨ３．８）中で
混合し、３時間平衡化した。次いで蛍光偏光を読取った。実験は二重反復試験で
行った。 蛍光リガンド（ＩＩＩ）の完全な置換が、アッセイ中、試験化合物の最高濃度
で観察された。６７．５ｎＭの平均Ｋｉが得られた。
び試験化合物（１０μＭから下に２倍の連続希釈）を最終アッセイ容量１０μｌ
においてｘ１アッセイバッファー（５０ｍＭ ５０ｍＭ酢酸ナトリウム、２０ｍ
Ｍ塩化ナトリウム、５％グリセロール、０．１％ＣＨＡＰＳ、ｐＨ３．８）中で
混合し、３時間平衡化した。次いで蛍光偏光を読取った。実験は二重反復試験で
行った。 蛍光リガンド（ＩＩＩ）の完全な置換が、アッセイ中、試験化合物の最高濃度
で観察された。６７．５ｎＭの平均Ｋｉが得られた。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ
33/50 33/50 Ｚ
33/53 33/53 Ｄ
33/533 33/533
33/566 33/566
33/58 33/58 Ｚ
// Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
ＺＮＡ Ａ
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，
ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ
Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ
，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，
ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，
ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ
Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ
，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，
ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ
Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ
，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，
ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ
Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ
，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，
ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(71)出願人 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイ
ション
ＳＭＩＴＨＫＬＩＮＥ ＢＥＥＣＨＡＭ
ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
アメリカ合衆国ペンシルベニア州19406−
0939、キング・オブ・プルシア、スウェー
ドランド・ロード709番
(72)発明者 ゲイリー・クリスティー
イギリス、シーエム19・５エイダブリュ
ー、エセックス、ハーロウ、サード・アベ
ニュー、ニュー・フロンティアーズ・サイ
エンス・パーク・サウス、スミスクライ
ン・ビーチャム・ファーマシューティカル
ズ
(72)発明者 イシュルット・フセイン
イギリス、シーエム19・５エイダブリュ
ー、エセックス、ハーロウ、サード・アベ
ニュー、ニュー・フロンティアーズ・サイ
エンス・パーク・サウス、スミスクライ
ン・ビーチャム・ファーマシューティカル
ズ
(72)発明者 デイビッド・ジェイ・パウエル
イギリス、シーエム19・５エイダブリュ
ー、エセックス、ハーロウ、サード・アベ
ニュー、ニュー・フロンティアーズ・サイ
エンス・パーク・サウス、スミスクライ
ン・ビーチャム・ファーマシューティカル
ズ
Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA20 DA36 FA15 FB01
FB03 FB07 FB12
4B024 AA11 BA14 CA04 CA07 DA02
GA11
4B063 QA18 QQ20 QR16 QR48 QR57
QS36 QX02
4C084 AA16 ZA02 ZA15 ZA16
Claims (19)
- 【請求項１】 Ａｓｐ２が介在するポリペプチドまたは蛋白基質の切断を阻
害する化合物を同定するために化合物をスクリーニングする方法であって、Ａｓ
ｐ２および基質を含む反応系を準備し、試験化合物の存在下での基質の切断の程
度を試験化合物の不存在下での切断の程度と比較して測定することを含む、方法
。 - 【請求項２】 基質がＡＰＰスウェーデン変異体配列（Ｐ６からＰ５’まで
）のベータ−セクレターゼ切断部位にスパンニングするペプチドである、請求項
１記載の方法。 - 【請求項３】 基質が： Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−
Ｐｈｅ−Ａｒｇであり、種々の蛍光フォーマットに使用するのに適する基質を得
るためにＱ−タグで蛍光的に標識されていてもよい、請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 Ａｓｐ２および基質をコードするＤＮＡを含有する発現ベク
ターで同時トランスフェクトされる宿主細胞を含む細胞を基礎とするアッセイで
あり、基質フラグメントに拮抗して生じるポリクローナルまたはモノクローナル
抗体を用いて宿主細胞の蛋白含量をアッセイすることによって切断産物の存在を
検出する、上記した請求項いずれかに記載の方法。 - 【請求項５】 適当な反応緩衝液中、Ｆｃ融合部としてであってもよい精製
された組換えＡｓｐ２、および基質を含む無細胞アッセイであり、基質の切断を
免疫アッセイによるか、あるいは直接的または間接的にシグナルの制御の結果に
より測定する、請求項１ないし３のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項６】 Ａｓｐ２が介在するポリペプチドまたは蛋白基質の切断を阻
害する化合物を同定するために化合物をスクリーニングする方法であって、Ａｓ
ｐ２および活性部位の標識されたリガンドを含む反応系を準備し、試験化合物の
存在下での標識リガンドの結合の程度を試験化合物の不存在下での標識リガンド
の結合の程度と比較し、結合アフィニティーを測定することを含む、方法。 - 【請求項７】 リガンドについてのアッセイ方法が並進または旋回拡散を基
礎とする、請求項６記載の方法。 - 【請求項８】 アッセイ方法が蛍光偏光法（ＦＰ）を基礎とする、請求項７
記載の方法。 - 【請求項９】 標識されたリガンドが、式（ＩＩＩ）： 【化１】 （ＩＩＩ） で示される化合物である、請求項８記載の方法。
- 【請求項１０】 請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法により同定
される化合物。 - 【請求項１１】 治療にて用いられる請求項１０記載の化合物。
- 【請求項１２】 請求項１０記載の化合物および医薬上許容される担体を含
む医薬組成物。 - 【請求項１３】 Ａｓｐ２制御のＡＰＰ切断を阻害するための医薬の製造に
おける請求項１０記載の化合物の使用。 - 【請求項１４】 βアミロイド蛋白関連疾患の治療または予防用医薬の製造
における請求項１０記載の化合物の使用。 - 【請求項１５】 有効量の請求項１０記載の化合物を患者に投与することを
含む、Ａｓｐ制御のＡＰＰ切断の阻害方法。 - 【請求項１６】 βアミロイド蛋白関連疾患の治療または予防方法であって
、有効量の請求項１０記載の化合物を患者に投与することを含む、方法。 - 【請求項１７】 Ａｓｐ２制御のＡＰＰ切断の阻害剤である、化合物。
- 【請求項１８】 βアミロイド蛋白関連疾患を治療するための医薬の製造に
おける請求項１７記載の化合物の使用。 - 【請求項１９】 βアミロイド蛋白関連疾患の治療または予防方法であって
、有効量の請求項１７記載の化合物を投与することを含む、方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9924957.5A GB9924957D0 (en) | 1999-10-21 | 1999-10-21 | Novel treatment |
| GB9924957.5 | 1999-10-21 | ||
| PCT/GB2000/004039 WO2001029563A1 (en) | 1999-10-21 | 2000-10-19 | Method of screening for inhibitors of asp2 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003512043A true JP2003512043A (ja) | 2003-04-02 |
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ID=10863153
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001532104A Withdrawn JP2003512043A (ja) | 1999-10-21 | 2000-10-19 | Ａｓｐ２の阻害剤のスクリーニング方法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP1224469B1 (ja) |
| JP (1) | JP2003512043A (ja) |
| AT (1) | ATE292801T1 (ja) |
| AU (1) | AU7934900A (ja) |
| DE (1) | DE60019321T2 (ja) |
| ES (1) | ES2240183T3 (ja) |
| GB (1) | GB9924957D0 (ja) |
| WO (1) | WO2001029563A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013158281A (ja) * | 2012-02-03 | 2013-08-19 | Shionogi & Co Ltd | 新規ｂａｃｅ１活性測定方法 |
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|---|---|---|---|---|
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| US6835565B1 (en) | 1998-09-24 | 2004-12-28 | Pharmacia & Upjohn Company | Alzheimer's disease secretase |
| US6844148B1 (en) | 1998-09-24 | 2005-01-18 | Pharmacia & Upjohn Company | Alzheimer's disease secretase, APP substrates therefor, and uses therefor |
| US6699671B1 (en) * | 1998-09-24 | 2004-03-02 | Pharmacia & Upjohn Company | Alzheimer's disease secretase, APP substrates therefor, and uses therefor |
| US7115410B1 (en) | 1999-02-10 | 2006-10-03 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | β-secretase enzyme compositions and methods |
| US7456007B1 (en) | 1998-12-31 | 2008-11-25 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | β-secretase enzyme compositions and methods |
| AU4000900A (en) | 1999-02-10 | 2000-08-29 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Beta-secretase enzyme compositions and methods |
| US7514408B1 (en) | 1999-12-02 | 2009-04-07 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | β-secretase enzyme compositions and methods |
| JP2003528071A (ja) | 2000-03-23 | 2003-09-24 | エラン ファーマスーティカルズ インコーポレイテッド | アルツハイマー病治療用組成物および方法 |
| AU2002359301B2 (en) * | 2001-10-23 | 2008-07-03 | Comentis, Inc. | Beta-secretase inhibitors and methods of use |
| TW200815349A (en) | 2006-06-22 | 2008-04-01 | Astrazeneca Ab | New compounds |
| TW201020244A (en) | 2008-11-14 | 2010-06-01 | Astrazeneca Ab | New compounds |
| EP2281824A1 (en) | 2009-08-07 | 2011-02-09 | Noscira, S.A. | Furan-imidazolone derivatives, for the treatment of cognitive, neurodegenerative or neuronal diseases or disorders |
| MX346500B (es) | 2010-11-10 | 2017-03-22 | Genentech Inc * | Metodos y composiciones para inmunoterapia para enfermedad neural. |
| JP2013542973A (ja) | 2010-11-22 | 2013-11-28 | ノスシラ、ソシエダッド、アノニマ | 神経変性疾患または神経変性状態を治療するためのビピリジンスルホンアミド誘導体 |
| WO2014198372A1 (de) * | 2013-06-12 | 2014-12-18 | Merck Patent Gmbh | Hydroxyethylenderivate zur behandlung von arthrose |
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| EP3845565A3 (en) | 2014-11-19 | 2021-09-08 | Genentech, Inc. | Antibodies against bace1 and use thereof for neural disease immunotherapy |
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| US5292652A (en) * | 1990-10-05 | 1994-03-08 | Athena Neurosciences, Inc. | Amyloidin protease and uses thereof |
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