JPH11506023A - 新規ディスインテグリンメタロプロテアーゼおよび使用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ディスインテグリン蛋白質に結合することのできる化合物を同定する方法およびサンプル中のディスインテグリン蛋白質に結合することのできる化合物の量および親和性を決定する方法を提供する。本発明はこれらの目的に有用な、ディスインテグリン蛋白質に対する組換え発現ベクターを含む宿主細胞およびディスインテグリン蛋白質をコードする組換え発現ベクターならびにヒトディスインテグリンメタロプロテアーゼ蛋白質、フラグメントまたはその変異体も提供する。本発明はin vivoまたはin vitroでの変形性関節炎および他のメタロプロテアーゼに基づく疾病のスクリーニング方法、キットの製造および使用も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 新規ディスインテグリンメタロプロテアーゼおよび使用法発明の分野 本発明は、新規蛋白質、そのフラグメントおよび変異体に関するものであり、 ならびにメタロプロテアーゼの上方制御により特徴づけられる変形性関節炎およ び他の疾患を含む疾患の検出および試験薬におけるそれの使用に関するものであ る。発明の背景 多くの酵素は、構造蛋白質の分解に影響しており、メタロプロテアーゼと構造 的に関連がある。これらには、ヒト皮膚線維芽コラゲナーゼ、ヒト皮膚線維芽ゼ ラチナーゼ、ヒト痰コラゲナーゼおよびゼラチナーゼ、ならびにヒトストロメラ イシンを含む。これらはアンギオテンシン変換酵素およびエンケファリナーゼと 同様に、亜鉛含有メタロプロテアーゼ酵素である。コラゲナーゼ、ストロメライ シンおよび関連酵素は、多くの疾病の総体症状の仲介において重要であり、これ らの疾病には関節リウマチ（Ｍullins,Ｄ.Ｅ.らの、Ｂiochim Ｂiophys Ａcta(1 983)、第695巻、117〜214頁）、変形性関節炎（Ｈenderson,Ｂ.らの、未来の薬 Ｄrugs of the Ｆuture(1990)、第15巻、495〜508頁）、腫瘍細胞の転移（同 書、Ｂroadhurst,Ｍ.Ｊ.らの、ヨーロッパ特許出願第276,436号、（1987年公開 ）、Ｒeich,Ｒらの、48 Ｃancer Ｒes 3307〜3312頁(1988)）、および種々の潰 瘍状態を含む。アルカリ火傷によるかまたは緑膿菌、アカントアメーバ、単純ヘ ルペスおよびワクシニアウイルス感染によって、角膜において潰瘍状態を生じる ことがある。 メタロプロテアーゼの望ましくない働きにより特徴づけられる他の状態には、 歯周炎、表皮水疱症および強膜炎を含む。多くの疾病状態にメタロプロテアーゼ が関与していることを考慮して、これらの酵素の阻害剤を調製する試みがなされ てきた。そのような阻害剤の多くが文献に開示されている。本発明は、好ましく は本プロテアーゼに特異的であり、本プロテアーゼにより仲介もしくは調節され る疾病を治療する際に活性が増大する新規阻害剤の提供を試みる。 メタロプロテアーゼの阻害剤は、少なくとも部分的には構造蛋白質の分解によ り引き起こされる疾病の治療の際に有用である。種々の阻害剤が調製されてきた が、そのような疾病の治療用薬をデザインするためにメタロプロテアーゼ阻害剤 スクリーンに絶え間ないニーズがある。 メタロプロテアーゼは、広範な機能を有する蛋白質の大きな分類である。ディ スインテグリンは亜鉛メタロプロテアーゼであり、蛇毒に豊富にふくまれる。代 替的クローン化戦略を用いることもできる。哺乳類ディスインテグリンは、約１ ８の既知サブグループを有する蛋白質の系統群である。それらは細胞接着崩壊剤 （cell adhesion disrupters）として作用し、生殖において（例えば、精子によ る卵との融合を含む受精において、および精子の成熟において）活性があること も知られている。 これらのプロテアーゼおよび他の多くのものは、分子生物学および生化学にお いて明らかにされていない。その結果、遺伝子配列の保存機関であるＧenbankが 、ディスインテグリンのフラグメントをコードするとされるものを含む数種のメ タロプロテアーゼの配列を提供している。例えば、1994年２月25日付けＧenbank 受託番号Ｚ48444は、ラットディスインテグリンメタロプロテアーゼ遺伝子とさ れるラット遺伝子の２４０７塩基を開示しており、1995年３月２日付けＧenbank 受託番号Ｚ48579は、ヒトディスインテグリンメタロプロテアーゼ遺伝子とされ る遺伝子の部分配列の１８２４塩基を開示しており、1994年10月25日付けＧenba nk受託番号Ｚ21961は、ウシ亜鉛メタロプロテアーゼ遺伝子とされる遺伝子の部 分配列の２３９７塩基を開示している。 特定の疾病の状態にメタロプロテアーゼを結びつけること、および検知そして 究極的には治療、制御またはそのような疾病の治療法をデザインする道具として これらのメタロプロテアーゼを用いることは好都合であろう。 発明の目的 ディスインテグリン蛋白質に結合することができる化合物を同定する方法を提 供することが本発明の目的である。 ディスインテグリン蛋白質に対する組換え発現ベクターを含む宿主細胞および ディスインテグリン蛋白質をコードする組換え発現ベクターを提供することも本 発明の目的である。 癌、関節症（強直性脊椎炎、関節リウマチ、通風性関節炎（通風）、炎症性関 節炎、ライム病および変形性関節炎を含む）のようなメタロプロテアーゼ仲介疾 病用のスクリーニング方法を提供することも本発明の目的である。 スクリーンにおいて、蛋白質の単離において、または蛋白質の標的部分として 有用な、蛋白質に対する抗体を提供することも本発明の目的である。 発明の概要 本発明は、ディスインテグリン蛋白質に結合することのできる化合物を同定す る方法およびサンプル中のディスインテグリン蛋白質に結合することのできる化 合物の量および親和性を決定する方法を提供する。 本発明はこれらの目的に有用な、ディスインテグリン蛋白質に対する組換え発 現ベクターを含む宿主細胞およびディスインテグリン蛋白質をコードする組換え 発現ベクターならびにヒトディスインテグリンメタロプロテアーゼ蛋白質、その フラグメントまたは変異体も提供する。 本発明はin vivoまたはin vitroでの変形性関節炎および癌のような他のメタ ロプロテアーゼに基づく疾病のスクリーニング方法、キットの製造および使用法 も提供する。 発明の詳細な説明 ここで用いるように、「蛋白質」、「プロテアーゼ」および「メタロプロテア ーゼ」という用語は、ディスインテグリンを指す。好ましくはこれは後述のヒト ディスインテグリンである。 「抗体」という用語は、ディスインテグリンまたはそれのフラグメントに対す る抗体を指す。これらは、単クローン性でも多クローン性でもよく、数種の供給 源のいかなるもの由来でも良い。本発明は、蛋白質またはペプチド技術における いずれかの方法により作製されたこれらの抗体のフラグメントも企図している。 「疾病スクリーン」という用語は、疾病または疾病の状態のスクリーンを指す 。疾病状態とは、疾病の生理学的または細胞または生化学的徴候である。好まし くはこのスクリーンは、ＥＬＩＳＡのような標準的技術を用いて、動物の生体組 織または体液または細胞培養液に用いられる。上記のように標識抗体を全身的に 与えることなどにより、生体全体における疾病の「地図化（mapping）」も考慮 する。これは、検知方法に左右されないが、好ましい該検出法には、蛍光、Ｘ線 （ＣＴスキャンを含む）、ＮＭＲ（ＭＲＩを含む）等を含む。 「化合物スクリーン」という用語は、化合物の発見、それらのプロテアーゼへ の親和性、またはスクリーンに基づく化合物のデザインまたは選択に関連する方 法およびスクリーンに関するものである。別の実施形態においては、当業者によ り了解されるような、ドラッグデザイン、好ましくは「合理的なドラッグデザイ ン」用の３次元構造の使用を考慮する。プロテアーゼが「本質的に純粋な形態」 であることが望ましいことがあるが、「本質的に純粋な形態」とは、実験または 特性決定に有効である程度に他の不純物を含まぬ蛋白質を指す。このスクリーニ ング法の使用は、プロテアーゼに結合し、かつ好ましくはプロテアーゼを阻害す る新規構造を、化学者によるかあるいは天然により作られたかにかかわらず、熟 達せる当業者が見つけるのに役立つ。これらの「阻害剤」は、プロテアーゼ活性 の制御または調節において有用であろうし、従ってそれらが機能する生物学的カ スケードを調節するのに用いることができる。このアプローチにより新しい薬学 的に有用な化合物を得ることができる。 「ディスインテグリン」という用語は、ディスインテグリン、それのフラグメ ント、それの変異体またはその機能をなおも保持している相同体を指す。この用 語は、アグラカナーゼ、および組織再構築に関与しまたはその調節を司る他のプ ロテアーゼを企図している。これは異なる種からのディスインテグリン、および 組換え法、in vitro法、または標準的ペプチド合成により調製されたディスイン テグリンも企図している。好ましくは蛋白質は、ヒトディスインテグリンまたは それの変異体である。蛋白質の変異体を定義する目的のため、好適な「ネイティ ブ」蛋白質がＧenＢank受託番号Ｚ48579に記載されており、引用により本明細書 に導入され、下記の順序で言及される。配列番号：１は、そのＤＮＡフラグメン ト配列 およびその転写物を表しており、配列番号：２は遺伝子のコード部分およびその 転写物を表している。相同ディスインテグリンには当該技術により理解される少 なくとも９０％の相同性を有する全蛋白質、またはそのフラグメントが含まれる 。例えば、ラット蛋白質は、ＤＮＡまたはｃＤＮＡ配列に由来するペプチド配列 に基づき、配列番号：１または配列番号：２と９５％相同であり、（同様の由来 の）ウシ蛋白質は９７〜９８％相同であり、共に相同体であるとみなされる。こ のように、他の生物からクローン化された相同ｃＤＮＡは、相同蛋白質を生じさ せる。 同様に、蛋白質はアミノ酸配列のみに基づき相同体とみなすことができる。ア ミノ酸配列決定には実際面で種々の制約があるので、例えば、蛋白質の最初の５ ０個のアミノ酸を比較することによって、ある蛋白質が他の蛋白質と相同である と決定してもよいであろう。したがって、相同蛋白質の９０％の相同性とは、相 同蛋白質の最初の５０個のアミノ酸鎖において５個のアミノ酸が異なっていても よいことである。 熟達せる当業者は、遺伝暗号の縮重により異なるＤＮＡ配列が同じ転写物を提 供し、これにより同じペプチドを提供することを理解するであろう。ある場合に は、同じペプチドをコードするが、ネイティブＤＮＡとは異なるＤＮＡ配列を調 製するには、・・・・ 配列決定または合成が容易であること、・・・・ ペプチドの発現が多いこと、および・・・・ ある種の異種宿主がある種のコドンを他よりも好むこと を考慮に入れる。 これらの実際的な考察は周知であり、本発明の使用者にとって有益となりうる 具体例を提供する。このように、ネイティブＤＮＡのみが本発明において予見さ れる唯一の具体例ではないことを明らかに企図している。 さらに、蛋白質のフラグメントはスクリーニング、ドラッグデザイン等におい て用いることができること、および本発明を使用する目的に全ペプチドが必ずし も必要でないことは、熟達せる当業者にとって明らかである。したがって、熟達 せる当業者にはペプチドの開示およびその使用は有用なペプチドフラグメントを 意図するものであると理解されることを明らかに企図している。 蛋白質の発現、精製収率、安定性、溶解性、等の実際的な考慮は、フラグメン トを使用するかどうか、そしてどのフラグメントを使用すべきか選択する際に、 熟達せる当業者によって考慮される。その結果、当該技術における慣用的操作を 用いて、当業者はこの開示のもと、蛋白質のフラグメントを用いても同様に本発 明を実施することができる。 蛋白質またはプロテアーゼ自身は、蛋白質への低分子の結合活性を決定するの に用いることができる。酵素標的物を用いるドラッグスクリーニングは、当該技 術で用いられ、自動化された高処理量技術を用いて使用することができる。 ディスインテグリン活性の阻害度は、変形性関節炎、および他の関節軟骨の変 性を伴う疾病の治療における効力の予測変数となり得る。遺伝子療法 理論にしばられないが、メタロプロテアーゼは、変形性関節炎の間、組織中で 上方制御されていると考えられる。我々は驚くべきことに、ヒトディスインテグ リンがヒト軟骨細胞において変形性関節炎状態の間、上方制御されることを発見 した。シグナル導入（signal transduction）メカニズムの阻害が変形性関節炎 、および軟骨の変性を伴う他の疾病における事象のカスケードを崩壊させるのに 有効である。熟達せる当業者は、もし上方制御が関節炎発症の原因ならば、この 遺伝子の作用を妨害することが変形性関節炎の治療において有用であろうことを 認識するであろう。 これは、遺伝子（すなわち、アンチセンス）療法を含んだ、数種のいずれかの 方法により行う。ディスインテグリンの阻害剤 本発明のプロテアーゼは、プロテアーゼの阻害剤を発見するのに用いることが できる。このため、本発明のプロテアーゼはスクリーニングの道具として、ある いは合理的なドラッグデザイン用として有用である。理論にしばられないが、プ ロテアーゼは細胞の再構築を調節するようであり、事実、細胞外マトリックスの 再構築を高め、それにより組織の崩壊を増大させるらしい。したがって、ディス インテグリンの阻害は、これらのプロセスにより特徴づけられる疾病の処置のた めの治療上のルートを提供する。 スクリーニングにおいて、医薬化合物を阻害の質および量の両方を決定するの に用いることができる。結果として、該スクリーニングは、これらの疾病を治療 するのに有用な活性体（actives）（好ましくは低分子活性体）の選択のための 情報を提供する。 治療法において、マトリックスのメタロプロテアーゼを阻害するのに用いられ るような、低分子量の、合成メタロプロテアーゼ阻害剤を結合することによる、 ディスインテグリンメタロプロテアーゼ活性の阻害は、細胞外マトリックスの再 構築を阻害するのに用いることができるであろう。蛋白質に対する抗体 特に望ましくない部位（例えば、器官またはある種の細胞）で活性なメタロプ ロテアーゼは、メタロプロテアーゼ阻害剤を抗体またはそれのフラグメントに結 合させることにより標的とすることができる。結合方法は、当該技術において既 知である。 本発明の抗体は、固体支持体に結合させることもできる。これらの結合体は、 所望のメタロプロテアーゼ、好ましくはディスインテグリンの精製用の親和性試 薬として用いることができる。 もう１つの態様としては、本発明の抗体を標識に直接結合させる。抗体がメタ ロプロテアーゼに結合するので、標識はin vivo でまたはin vitro 細胞培地で の比較的高レベルのメタロプロテアーゼを検出するのに用いることができる。 加えて、メタロプロテアーゼ阻害化合物を抗体に結合させることができる。典 型的結合方法は、当該技術において既知である。これらの抗体は、それゆえ治療 の際および阻害剤の用量をモニターする際の両方において有効である。 例えば、意図する標的組織用のマーカーと特異的に反応する標的リガンドを用 いることができる。本発明化合物を標的リガンドに連結する方法は周知であり、 後述の担体に連結する方法と同様である。結合体は、上述のように配合および投 与される。抗体の調製および使用 抗体は、数種の方法により作ることができる。例えば、蛋白質を適切な（例え ば、哺乳類の）対象（マウス、ウサギ、等を含む）に注射してもよい。好ましい プロトコールには、スケジュールに従った、アジュバンドの存在下での、免疫原 の反復的注射が含まれ、これにより血清中の抗体の生産を増幅させる。免疫血清 の力価は当該技術において今や標準的なイムノアッセイ法を用いて容易に測定で きる。 得られた抗血清は、直接用いることができるが、単クローン性抗体は、免疫動 物の末梢血リンパ球または脾臓の収集および抗体産生細胞の不死化、続く標準的 イムノアッセイ技術を用いる適切な抗体産生体の同定により得ることができる。 多クローン性または単クローン性調製品は、本発明の化合物を用いるモニタリ ング療法または予防措置において有用である。血液、血清、尿、または唾液など に由来する適切なサンプルは、本発明の抗体調製品を用いる標準的イムノアッセ イ技術を用いて、治療プロトコールの間、種々の時期に、蛋白質の存在の検査を することができる。 これらの抗体は、標準的結合方法を用いて、シンチグラフィー標識（例えば、 テクネチウム99またはＩ-131）のような標識と組み合わせることもできる。標識 化合物を対象（患者）に投与し、１つ以上のメタロプロテアーゼの過剰量が存在 する部位をin vivo で決定する。したがって、蛋白質に対する標識抗体は、疾病 を示唆するそのような増大した発現をスクリーニングする道具として働く。 メタロプロテアーゼに選択的に結合する抗体の能力は、in situでこれらの酵 素の分布を地図にするのに利用される。この技術は組織学的方法に用いられ、標 識抗体は競合的イムノアッセイに用いることができる。 抗体を、既知の方法を用いて他の化合物または物質に有利に結合させる。例え ば、カルボキシル官能性を有する物質では、カルボキシル残基をアルデヒドに還 元し、担体に側鎖のアミノ基との反応により結合させ、必要に応じて引き続き、 形成されたイミノ結合を還元する。カルボキシル残基をジシクロヘキシルカルボ ジイミドまたは他のカルボジイミド脱水剤のような縮合剤を用いて側鎖アミノ基 と反応させることもできる。リンカー化合物を、連結するのに用いることができ 、ホモ二官能性リンカー（homobifunctional linker）およびヘテロ二官能性リ ンカー（heterobifunctional linker）のどちらもＰierce Ｃhemical Ｃompany 社（Ｒockford、III）から入手可能である。 これらの抗体は、適切なクロマトグラフィー材料に結合しているときに、蛋白 質を単離するのに有用である。アフィニティークロマトグラフィーを用いる分離 方法は、当該技術において公知であり、熟達せる当業者の活動範囲内のものであ る。疾病マーカー 理論にしばられないが、遺伝子、そして好ましくはこの遺伝子の発現は、組織 分布が限定されており、かつその発現は潜在的な変形性関節炎仲介物により上方 制御されている。例えば、関節軟骨における、この遺伝子（およびしたがってそ の蛋白質）の発現の増強により、変形性関節炎の発生（最初期の、無症候段階を 含む）、および進行をモニターするマーカーを提供できる。したがって、増大し た、蛋白質に対する抗体は、疾病を示唆するそのような増大した発現をスクリー ニングする道具として働く。 さらに、疾病のスクリーンとして用いる場合、抗体は発色団（chromophore） または発蛍光団（fluorophore）を含有する物質に結合するか、または発色団ま たは発蛍光団をある条件において生産する酵素に結合する。これらの結合材料お よび方法は、当該技術において公知である。この方法で用いられる場合、イムノ アッセイによる蛋白質の検出は、熟達せる当業者にとって簡明である。メタロプ ロテアーゼの分布またはこれらのプロテアーゼの増加レベルを較正および検出す るために、例えば体液をこの方法でスクリーンすることができる。 このように用いる場合、本発明はメタロプロテアーゼ仲介疾病、例えば変形性 関節炎または他の関節軟骨変性疾病用の有用な診断および／または臨床上のマー カーとなる。疾病が検出されれば、症状の発症または衰弱の前に治療することが できる。 さらに、該抗体は、上述のように検出または治療のために標的の患部組織に用 いることができる。 実施例 下記の実施例は本発明の好ましい態様を説明するものであり、本発明の使用法 を簡単に記載するものであるが、これに制限されるものではない。これらの実施 例は、熟達せる当業者にとってのガイダンスとして提供されるものであり、いか なる場合にも本発明を制限するものではない。この開示およびこれらの実施例を 理解することにより、熟達せる当業者は請求された本発明を実行および使用する ことができる。 これらの実施例においては標準的出発物質を用いた。これらの物質の多くは既 知であり、商業的に入手可能である。例えば、大腸菌ＣＪ236およびＪＭ101は既 知菌株であり、pＵＢ110は既知のプラスミドであり、そしてＫunkel法突然変異 誘発もまた当該技術において公知である。 種々の宿主における発現システムによって、ならびに種々の方法によって、変 異株をつくることができ、これらの方法は分子生物学、生化学またはバイオテク ノロジーに関連する他の技術に熟達せる当業者の実践の範囲内である。 実施例１ ＲＮＡを非刺激、およびインターロイキン−１で刺激された正常ヒト関節軟骨 細胞の培地から単離した。ＲＮＡはｃＤＮＡに逆転写された。ｃＤＮＡを一連の ランダムプライマーを用いる変形ディファレンシャルディスプレー法にかけた。 刺激および非刺激軟骨細胞の両方から発生したＰＣＲサンプルは、ポリアクリ ルアミドゲル上の隣接レーンにおいて電気泳動した。示差発現したバンドを、ゲ ルから切除し、クローン化し、そして配列決定した。遺伝子の示差発現（differ ential expression）はＲＮアーゼ保護（protection）および核の移動により実 験に基いて確認された。 実施例２ 蛋白質をコードする新規の部分的ヒトｃＤＮＡをインターロイキン−１刺激ヒ ト関節（大腿骨頭）軟骨細胞の初代培養から既知の方法を用いてクローン化する 。 同じ配列を発見し、遺伝子はヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして 全長クローン（full length clones）を得ることにより完成される。 実施例３ 実施例２のクローンＤＮＡを既知の方法を用いてpＵＢ110に組み込んだ。この プラスミドは大腸菌を形質転換するのに用いられ、新しい変異株を作成するため の部位特異的突然変異誘発用の鋳型を提供する。Ｋunkel法突然変異誘発により ＧＬＮ／ＡＬＡを変換する。 実施例４ ［¹²⁵Ｉ］ディスインテグリン抗体をＩＯＤＯＢＥＡＤＳ（Ｐierce社(Ｒockfo rd、ＩＬ)の無孔性ポリスチレンビーズ上に固定化されたクロラミン-Ｔ）を用い て調製する。凍結乾燥抗体（２μｇ）を１０ｍＭ酢酸５０μｌに溶解し、４５０ μｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（Ｓigma社（Ｓt.Ｌouis,ＭＯ））に氷上で 添加した。チューブに５μｌ中５００μキュリーの¹²⁵Ｉ（Ａmersham社（Ａrlin gton Ｈeights,ＩＬ））（2200Ｃi／mmol）および１つのＩＯＤＯＢＥＡＤを添 加した。反応物を氷上で１０分間インキュベートし、時々振盪した。次いで反応 物をＩＯＤＯＢＥＡＤから除去することにより反応を終了させる。未反応の¹²⁵ Ｉを除去するために混合物をＰＤ-10ゲル濾過カラムにかける。 実施例５ 蛍光発生ペプチド（Ｂachem社（Ｇuelph Ｍills,Ｋing of Ｐrussia,Ｐa）） をディスインテグリンと混合し、蛍光の変化を２分後に、コントロールとして評 価する。次いで蛍光発生ペプチドを評価する化合物の存在下、別の実験としてデ ィスインテグリンと混合し、２分後に評価する。データを標準的方法論を用いて 評価し、評価化合物の相対結合度を得る。 実施例６ 患者の左膝から滑液０．５ｍｌを採取し、ＥＬＩＳＡによりディスインテグリ ンの上昇レベルを試験する。結果は正常よりも高いディスインテグリンレベルを 示した。患者にディスインテグリン阻害剤の予防的用量を処方し、診療所を去る 前に左膝にこれを注射する。 実施例７ 細胞外マトリックスの再構築の阻害は、ディスインテグリンメタロプロテアー ゼ活性の阻害を通して探求する。マトリックスメタロプロテアーゼを阻害するの に用いられるような、低分子量の合成メタロプロテアーゼ阻害剤を用いて、組織 の完全性およびプロテオグリカンをモニターする。 マウス由来関節軟骨のサンプルを低分子量のディスインテグリン阻害剤１マイ クロモル溶液中で成長させる。実験は阻害剤なしで成長させた同様の培地を対照 とし、これと比較する。 ７日後の培地のアッセイは、阻害培地では組織の崩壊が少なく、培養の漿液（ serum）中に存在するプロテオグリカンも少ないことを示す。この結果は阻害さ れたアグレカナーゼ活性と一致する。アグレカナーゼの阻害は組織崩壊を阻害し 、そしてプロテオグリカンの放出を減少させる。 実施例８ 蛋白質分解過程の阻害は、ディスインテグリンメタロプロテアーゼドメインの 膜結合型からの放出を起こし、膜結合型ディスインテグリン分子の「第２のメッ センジャー」シグナル形成（signaling）を阻害する。そのような第２のメッセ ンジャーシグナル形成は、細胞の表現型の変化、遺伝子発現の変化、有糸分裂活 性の変化等を引き起こす。 ディスインテグリンを含むことが知られている細胞をセリンプロテアーゼで処 理する。細胞から放出された蛋白質は標準的方法により測定される。特に、メタ ロプロテアーゼ活性を文献記載の方法によりモニターする。放出されたメタロプ ロテアーゼの量は細胞処理に用いられたセリンプロテアーゼの量に相関する。sr cチロシンキナーゼ活性における対照に対する増加の測定は、ディスインテグリ ンメタロプロテアーゼの開裂および放出に引き続きホスホチロシンに特異的な単 クローン性抗体を用いて、細胞内蛋白質のウエスタン法分析により行う。対照は セリンプロテアーゼで処理しなかった細胞である。 細胞（または細胞培養）におけるsrcチロシンキナーゼ活性を文献記載の方法 により測定する。ディスインテグリンのメタロプロテアーゼドメインの放出も文 献記載の方法により、モニターする。メタロプロテアーゼドメインの放出と細胞 内srcチロシンキナーゼ活性の増加との間には直接的相関が存在する。この結果 はsrcチロシンキナーゼカスケードの刺激によりディスインテグリン仲介細胞シ グナル形成が刺激されることと一致する。 実施例９ 細胞間接着分子、または細胞外マトリックス成分の阻害は、実施例８に記載し たように、そのような相互作用に関連する細胞形状の変化を含む、表現型の変化 の阻害を引き起こす。 インテグリン結合を配列ＲＧＤを含むペプチドで、実施例８のプロトコールを 用いて測定する。インテグリン結合を顕微鏡による細胞の視覚的形状変化を用い て競合的分析法により測定する。ペプチドは実施例８のように細胞の変化を阻害 する。 この結果はディスインテグリンとの競合またはディスインテグリンとの相互作 用の遮断と一致する。ＲＧＤペプチドは軟骨細胞における細胞変化を阻害する。 マトリックス合成の増加およびマトリックスメタロプロテアーゼ活性の促進によ って特徴づけられる、変形性関節炎の表現型は起こらない。他の容易に分析可能 な細胞変化はこの結果をモニターするのに用いることができ、これには遺伝子発 現、有糸分裂活性の変化等を含む。 実施例１０ 低分子量メタロプロテアーゼ阻害剤を実施例７の方法に従って、組織培地を処 理するのに用いる。細胞膜からのＴＮＦ-αの放出は、文献記載の方法により測 定される。実施例７の阻害剤は細胞膜から分泌されるＴＮＦ-αの量も減少させ る。 このことは、ディスインテグリンメタロプロテアーゼ活性の阻害はディスイン テグリン関連炎症カスケードおよびセクレターゼ活性の阻害を引き起こすという 理論と一致する。細胞膜等からのサイトキニンまたはＩＬ-1の放出をモニターし ても同じ結果をもたらすことが考えられる。 本明細に記載された全ての文献は引用により本明細書に導入される。 本発明の特定の具体例を記載してきたが、本発明の精神および範囲から逸脱す ることなく本発明の種々の変更および変形例が可能であることは熟達せる当業者 にとって明白であろう。以下の請求の範囲の各請求項において、本発明の範囲内 にあるそのような全ての変形例を網羅することを意図するものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｎ 9/50 Ｃ１２Ｎ 9/50 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/566 33/566 Ａ６１Ｋ 37/64 ＡＢＧ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/50 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 ティンダル，マイケル，ハワード アメリカ合衆国 45215 オハイオ州 ワ イオミング コディーパス 620 (72)発明者 ハッキ，タリク アメリカ合衆国 44106―4946 オハイオ 州 クリーブランド アデルバート ロー ド 2109 バイオメド レジデンス ビル ディング

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．関節炎の発達の間に異なって発現されるヒトディスインテグリンをコードす るＤＮＡフラグメントであって、スクリーンディスインテグリン拮抗作用、ドラ ッグデザインおよびスクリーニングに用いることが可能であることを特徴とする ＤＮＡフラグメント。 ２．ドラッグスクリーニング剤として有用な、分子量および溶解性を有すること を特徴とする請求項１に記載のヒトディスインテグリン。 ３．本質的に純粋な形態であることを特徴とする請求項１に記載のヒトディスイ ンテグリン。 ４．請求項１に記載のディスインテグリンを用いることを特徴とするヒトディス インテグリンに結合可能な化合物のスクリーニング方法。 ５．請求項１に記載のディスインテグリンを含むことを特徴とするヒトディスイ ンテグリンに結合可能な化合物用のスクリーニングキット。 ６．請求項１に記載のヒトディスインテグリンに対する抗体、またはそのフラグ メント。 ７．請求項６に記載の抗体を投与し、そしてその効果を観察することを特徴とす るメタロプロテアーゼ仲介疾病のスクリーニング方法。 ８．請求項７に記載の抗体を投与し、そしてその効果を観察することを特徴とす る変形性関節炎のスクリーニング方法。 ９．血液、滑液または他の体液をスクリーニングすることを特徴とする請求項７ に記載の変形性関節炎のスクリーニング方法。 １０．請求項６に記載のヒトディスインテグリンに対する抗体、またはそれのフ ラグメントを含むことを特徴とする変形性関節炎用のスクリーニングキット。 １１．変形性関節炎の治療における相対力価を決定するのに有用であることを特 徴とする請求項４に記載のスクリーニング方法。 １２．請求項１に記載のディスインテグリンをコードするＤＮＡ（配列番号：２ ）。 １３．請求項１２に記載のＤＮＡを含むことを特徴とする発現ベクターまたはプ ラスミド。 １４．請求項１２に記載のＤＮＡを含むことを特徴とする細胞。 １５．請求項１３に記載の発現ベクターまたはプラスミドを含むことを特徴とす る細胞。 １６．ＤＮＡが細胞にとって外来性であることを特徴とする請求項１４に記載の 細胞。 １７．請求項２に記載のヒトディスインテグリンの阻害剤。 １８．ディスインテグリン活性に関連する疾病状態を治療することを特徴とする 方法。 １９．ディスインテグリンがアグロカナーゼであることを特徴とする請求項２に 記載のディスインテグリン。 ２０．疾病は関節症であることを特徴とする請求項１８に記載の疾病状態を治療 する方法。 ２１．疾病は変形性関節炎であることを特徴とする請求項２０に記載の方法。 ２２．ディスインテグリンが組織の再構築または崩壊を調節することを特徴とす る請求項２に記載のディスインテグリン。