KR20000075711A - 신규의 디스인테그린 메탈로프로테아제의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 디스인테그린 단백질에 결합할 수 있는 화합물을 동정하고, 시료중의 디스인테그린 단백질에 결합할 수 있는 화합물의 양 및 친화도를 측정하는 방법을 제공한다. 이 방법은 또한 디스인테그린 단백질에 대한 재조합 발현 벡터 및 디스인테그린 단백질에 대해 코딩하는 재조합 발현 벡터 및 이러한 목적에 유요한, 인간 디스인테그린 메탈로프로테아제 단백질, 이의 단편 또는 돌연변이체를 함유하는 숙주세포를 제공한다. 본 발명은 또한 키트 형태로 제조 및 사용할 수 있는, 골관절염 및 기타 메탈로프로테아제에 근거한 질병에 대한 생체내 또는 실험관 스크리닝 방법을 제공한다.

Description

신규의 디스인테그린 메탈로프로테아제, 이의 돌연변이체, 단편등의 용도 {USE OF A NOVEL DISINTEGRIN METALLOPROTEASE, MUTANTS, FRAGMENTS AND THE LIKE}

많은 효소들이 구조 단백질의 분해에 영향을 미치며, 구조적으로 관련된 메탈로프로테아제이다. 이것에는 인간피부 섬유아세포 콜라게나아제, 인간 피부 섬유아세포 겔라티나아제, 인간 담 콜라게나아제 및 겔라티나아제, 및 인간 스트로멜리신이 포함된다. 참조, 예컨대, S.E. Whitham et al., Comparison of human stromelysin and collagenase by cloning and sequence analysis" Biochem J. 240:913 (1986). 참조, G.I. Goldberg et al., "Human Fibroblast Collagenase" J. Biol. Chem. 261:660 (1986). 금속 의존 (예, 아연) 은 "메탈로프로테아제" 로 알려진 이러한 구조적으로 관련된 효소의 공통적인 특징이다.

이러한 효소의 조절된 생산 및 활성은 조직 구성의 통상의 발육에서 중요한 역할을 한다. 그러나, 과량의 경우, 이러한 효소는 연결 조직의 병리학적 파괴를 유발할 수 있다. 참조,J.Saus et al., "The Complete Primary Structure of Human Matrix Metalloprotease-3" J. Biol. Chem 263:6742(1988). 이런 많은 효소는 아연함유 메탈로프로테아제 효소이고, 이는 안지오텐신전환 효소 및 엔케팔리나아제이다. 콜라게나아제, 스트로멜리신 및 관련 효소는 류마티스 관절염 (Mullins,D.E., et al., Biochim Biophys Acta (1983) 695:117-214);골관절염 (Henderson, B., et al., Drugs of the Future (1990) 15:495-508); 종양세포의 전이 (ibid, Broadhurst, M.J., et al., European Patent Application 276.436(published 1987), Reich, R., et al., 48 Cancer Res 3307-3312 (1988); 다양한 궤양 상태를 포함한 수많은 질병의 증후군을 조정하는데 있어 중요하다. 궤양 질환은 알칼리 화상의 결과 또는 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 아칸타모에바, 단순포진 및 백시니아 바이러스에 의한 감염의 결과와 같은 각막을 초래할 수 있다.

사실, 암 조직에서의 메탈로프로테아제의 측정은 메탈로프로테아제의 증가치가 전이 포텐셜과 상관관계가 있음을 시사한다. 참조, 예컨대, M.J.Duffy et al., "Assay of matrix metalloproteases types 8 and 9 by ELISA in human breast cancer" Br.J. Cancer 71:1025 (1995).

바람직하지 않은 메탈로프로테아제 활성을 특징으로 하는 다른 질환에는 치근막 질환, 표피수포증 및 공막염이 포함된다. 수많은 질병의 상태에서의 메탈로프로테아제의 관련에 비추어, 이러한 효소에 대한 억제제를 제조하고자하는 시도들이 있어왔다. 수많은 이런 억제제가 문헌에 기재되어 있다. 본 발명은 상기의 프로테아제에 의해 조절되거나 조정되는 질병을 치료하는데 있어서 강화된 활성을 갖는 새로운 억제제, 바람직하게는 상기의 프로테아제에 특이적인 억제제를 제공하고자 한다.

메탈로프로테아제의 억제제는 적어도 부분적으로는 구조 단백질의 파괴에 의해 유발되는 질병의 치료에 있어서는 유용하다. 다양한 억제제가 제조되었으나, 이러한 질병의 치료용 약제를 설계하기 위해서는 메탈로프로테아제 억제제의 선별이 지속적으로 필요하다.

수 많은 질병 상태에서의 매트릭스 메탈로프로테아제의 관여 가정하에, 이러한 효소의 억제제를 동정하고자 하는 시도가 행하여 왔다. 예컨대, TapI-2 및 1,10-펜안트롤린이 공지된 메탈로프로테아제 억제제이다. 참조, 예컨대, J.Arribas et al., "Diverse Cell Surface Protein Ectodomains Are Shed by a System Sensitive to Metalloprotease Inhibitors", J.Biol.Chem.271:11376 (1996).

메탈로프로테아제는 매우 다양한 기능을 가진 광범위한 군의 단백질이다. 디스인테그린은 뱀의 독액에 풍부한 아연 메탈로프로테아제이다. 포유류 디스인테그린은 약 18 개의 공지된 아군(subgroup) 을 가진 일족의 단백질이다. 이것은 세포유착교란제로 작용하고, 또한 생식에서도 활성적인 것으로 공지되어 있다 (예,정자에 의한 난자의 수정(이의 융합 포함), 및 정자 성숙에서).

이러한 프로테아제 및 많은 기타 프로테아제는 분자생물학 및 생화학에 알려졌 있다. 그 결과, 유전자 서열 보관소인 GenBank 는 디스인테그린의 단편을 코딩하는 것으로 전해지는 몇몇의 것을 포함하여 메탈로프로테아제의 여러 서열을 제공한다. 예컨대, GenBank 기탁번호 #Z48444 (1994.2.25) 에는 래트 디스인테그린 메탈로프로테아제로 전해지는 래트 유전자의 2407 뉴클레오티드가 개시되어 있고; GenBank 기탁번호 #Z48579 (1995.3.2) 에는 인간 디스인테그린 메탈로프로테아제 유전자로 전해지는 유전자의 부분서열의 1824 뉴클레오티드가 개시되어 있으며; GenBank 기탁번호 #Z21961 (1994.10.25) 에는 소 아연 메탈로프로테아제 유전자로 전해지는 유전자의 부분 서열의 2397 뉴클레오티드가 개시되어 있다.

이러한 대단히 다양한 메탈로프로테아제가 존재하기 때문에, i) 특정 메탈로프로테아제를 특별히 검출할 방법 및 ii) 후보 억제제를 동정하는 방법에 대한 지속적인 필요가 있다.

특정 질환 상태에서 메탈로프로테아제를 시도하고, 이러한 메탈로프로테아제를 이러한 질환의 진단 및 궁극적으로 치료, 조절 또는 이러한 질환의 치료설계의 도구로서 사용하는 것이 유리할 것이다.

본 발명의 목적

본 발명의 목적은 디스인테그린 단백질에 결합할 수 있는 화합물을 동정하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 또한 디스인테그린 단백질에 대한 재조합 발현 벡터 및 디스인테그린 단백질에 대해 코딩하는 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 또한 암, 아쓰로포씨 (arthropothies) (양키루징 스폰돌리티스 (ankylosing spondolytis), 류마티스 관절염, 통풍성 관절염(통풍), 염증성 관절염, 라임 질환 및 골관절염포함) 와 같은 메탈로프로테아제 중재 질환의 스크리닝방법을 제공하는 것이다.

본 발병의 목적은 또한 단백질의 스크린, 단리에 유용한 단백질에 대한 항체 또는 단백질에 대한 목표화 부분(targeting moiety) 으로서 항체를 제공하는 것이다.

본 발명의 요약

본 발명은 디스인테그린 단백질에 결합할 수 있는 화합물을 동정하고, 시료에서 디스인테그린 단백질에 결합할 수 있는 화합물의 양 및 친화도를 측정하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 디스인테그린 단백질에 대한 재조합 발현 벡터 및 디스인테그린 단백질에 대해 코딩하는 재조합 발현벡터를 포함하는 숙주세포 및 이러한 목적에 유용한 인간 디스인테그린 메탈로프로테아제 단백질, 이의 단편 또는 돌연변이체를 제공한다.

본 발명은 또한 키트 형태로 제조 및 사용할 수 있는, 골관절염 및 암과 같은 메탈로프로테아제에 기초한 질병의 생체내 또는 실험관 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명은 신규의 단백질, 이의 단편 및 돌연변이체, 및 골관절염 및 메탈로프로테아제의 상향 조절(up regulation) 을 특징으로 하는 기타 질병을 포함한 질병에 대한 약제의 검출 및 시험에서의 이의 용도에 관한 것이다.

용어 "유전자"는 성숙한 단백질 또는 이의 전구체의 생산에 필요한 조절 및 코딩 서열을 포함한 DNA 서열을 의미한다. 단백질은 전장의 코딩서열 또는 원하는 효소 활성이 보유되는한 코딩서열의 임의의 일부로 코딩될 수 있다.

용어 "올리고뉴클레오티드" 는 둘이상의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드로 구성된 분자로 정의되며, 통상적으로 3 이상, 전형적으로는 10 이상 및 100 이하 또는 그이상이다 (바람직하게는 20 내지 30 이다). 정확한 크기는 많은 요소에 좌우될 것이며, 이는 올리고뉴클레오티드의 궁극적 기능 또는 용도에 좌우된다. 올리고뉴클레오티드는 화학적 합성, DNA 복제, 제한 엔도뉴클레아제 소화 역전사 또는 이들이 조합을 포함한 방법들에 의해 발생될 수 있다.

모노뉴클레오티드는 하나의 모노뉴클레오티드 펜토오즈 고리의 5' 포스페이트가 포스포디에스테르 연결을 통해 한방향으로 그 이웃의 3' 산소에 결합하게 되는 방식으로 올리고뉴클레오티드를 만들도록 반응하기 때문에, 올리고뉴클레오티드의 말단은, 이의 5' 포스페이트가 모노뉴클레오티드 펜토오즈 고리의 3' 산소에 연결되지 않았으면 "5' 말단" 으로 칭하고, 이의 3' 산소가 후속의 모노뉴클레오티드 펜토오즈 고리의 5' 포스페이트에 연결되지 않았으면 "3' 말단" 으로 칭한다. 여기에서 핵산서열은, 비록 내부 내지 좀더 큰 올리고뉴클레오티드일지라도, 5' 말단 및 3' 말단을 갖는 것으로 말할 수 있다.

두개의 상이한 비중첩 올리고뉴클레오티드가 동일한 선형 상보 핵산 서열의 상이한 영역에 어닐링하고, 한 올리고뉴클레오티드의 3' 말단이 다른 올리고뉴클레오티드의 5'말단 쪽으로 향하는 경우, 전자는 "상류(upstream)" 올리고뉴클레오티드로 부르고, 후자는 "하류(downstream)" 올리고뉴클레오티드로 부른다.

용어 "프라이머" 는 프라이머 신장이 개시되는 조건하에 놓여질때 합성의 개시점으로서 작용할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 올리고뉴클레오티드 "프라이머" 는 정제된 제한 소화에서 처럼, 자연적으로 발생하거나 또는 합성 생산될 수 있다.

프라이머는 주형의 특정 서열 가닥에 "실질적으로" 상보적이도록 선택한다. 프라이머는 프라이머 신장이 발생하는 주형가닥과 하이브리다이즈하도록 충분하게 상보적이어야 한다. 프라이머 서열은 주형의 정확한 서열을 반영할 필요는 없다. 예컨대, 비상보적 뉴클레오티드 단편은 프라이머의 5' 말단에 결합할수 있으며, 프라이머 서열의 나머지는 가닥에 실질적으로 상보적이다. 비상보적 염기 또는 더 긴 서열은 프라이머에 산재할 수 있으나, 단 프라이머 서열은 하이브리다이즈하는 주형의 서열과 충분한 상보성을 갖어, 프라이머의 신장 생성물의 합성을 위한 주형 프라이머 복합체를 형성한다.

"하이브리드화" 방법에는 목표 핵산(검출하고자 하는 서열)에 대한 상보 서열의 어닐링이 포함된다. 상호 발견하여 염기쌍 상호작용을 통해 어닐링하는 상보 서열을 포함하는 핵산의 두 중합체의 능력은 공지된 현상이다. 마머 및 레인에 의한 "하이브리드화"과정의 초기 관찰 [Proc.Natl.Acad. Sci.USA 46:453(1960) and Doty et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 46:461 (1960)] 이후 이러한 과정은 현대 생물학의 필수의 도구로 개선되었다. 그럼에도 불구하고, 수많은 문제점이 인간 진단학에서의 도구로서 하이브리드화 방법의 광범위한 사용을 막아왔다. 이들중 좀더 힘겨운 문제점은; 1)하이브리드화법의 비효율; 2)genomic DNA 의 혼합물에서의 특정 목표 서열의 저농도; 및 3) 단지 부분적인 상보 프로브 및 목표의 하이브리드화이다.

효율에 있어서, 단지 가능한 수의 일부의 프로브-목표 복합체만이 하이브리드화 반응에서 형성됨이 실험적으로 관찰되었다. 이것은 짧은 올리고뉴클레오티드 프로브 (100 염기 미만길이) 에 특히 해당하다. 여기에는 세가지의 근본적인 원인이 있다 : a) 하이브리드화는 2 차 또는 3 차 구조의 상호작용으로 인해 일어나지 않을 수 있으며;b) 목표 서열을 포함하는 DNA 가닥은 이들의 상보 가닥에 재하이브리다이즈하며 (재어닐링);c) 몇몇의 목표 분자는 목표 핵산을 고형물 표면에 고정화시키는 하이브리드화 포맷에서 사용하는 경우 하이브리드화가 되지 않는다.

프로브의 서열이 목표물의 서열, 즉 목표물의 1 차구조에 완전히 상보적인 경우에서 조차, 목표 서열은 고급 구조의 재배열을 통해 프로브에 접근가능하여야 한다. 이러한 고급구조 재정렬은 분자의 2 차 구조 또는 3 차 구조에 관계할 수 있다. 2차 구조는 분자내 결합으로 결정된다. DNA 또는 RNA 목표물의 경우에서, 이것은 염기의 단일, 연속 가닥내 하이브리드화로 구성된다 (두개의 상이한 가닥사이의 하이브리드화와 반대). 분자내 결합의 정도 및 위치에 따라, 프로브는 하이브리드화를 방해하는 목표 서열로부터 치환될 수 있다.

변성 이중가닥 DNA에 대한 올리고뉴클레오티드 프로브의 용액 하이브리드화는 더 긴 상보 목표 가닥이 재생 또는 재어닐링할 수 있다는 사실에 의해 좀더 복잡해진다. 다시, 하이브리드화 프로브는 이러한 공정에 의해 치환된다. 이것은 프로브 및 목표물의 처음 농도와 비교하여 낮은 수율의 하이브리드화(낮은 "커버리지") 을 가져온다.

낮은 목표 서열 농도와 관련하여, 목표 서열을 포함한 DNA 단편은 통상적으로 genomic DNA 에서 상대적으로 풍부하지 않다. 이것은 큰 기술적 어려움을 제공한다 :올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 대부분의 통상적 방법은 이러한 낮은 수준에서 하이브리드화를 검출하는데 필요한 감도가 부족하다.

목표 서열 농도 문제에 대한 용액에서의 하나의 시도는 시그널 검출의 증폭이다. 종종 이것은 하나이상의 표식을 올리고뉴클레오티드 프로브상에 위치시키는 것을 수반한다. 비방사선 표식의 경우에서, 최고의 친화성 시약조차 올리고뉴클레오티드 프로브로 genomic DNA 에서 단일 카피 유전자의 검출에는 부적합한 것으로 발견되었다. 참조 Wallace et al., Biochimie 67:755 (1985). 방사선 올리고뉴클레오티드 프로브의 경우에서,단지 극히 높은 특이적 활성만이 만족스런 결과를 보임이 발견되었다. 참고, Studencki and Wallace, DNA 3:1 (1984) and Studencki et al., Human Genetics 37:42 (1985).

여기에 참조로 포함되어 있는 K.B.Mullis et al., U.S. Patent Nos. 4,683,195 및 4,683,202 에는 클로닝 또는 정제없이 임의의 DNA 의 혼합물에서 목표 서열의 단편의 농도를 증가시키는 방법이 기재되어 있다. 목표 서열을 증폭하는 이 방법은 (목표 분자를 제조하기 위하여 본 발명과 병행하여 사용할 수 있는) 과량의 두 올리고뉴클레오티드 프라이머를 원하는 목표 서열을 포함하는 DNA 혼합물에 도입후, 및 DNA 폴리머라아제의 존재하에서 정확한 순서의 열주기를 실행하는 것으로 구성된다. 두개의 프라이머는 이들의 이중 가닥 목표 서열의 각각 서열에 상보적이다. 증폭을 실시하기 위해서는, 혼합물을 변성시키고, 이어서 프라이머를 목표분자내에서 이들의 상보 서열에 어닐링시킨다. 어닐링후, 프라이머는 폴리머라아제로 신장시켜 새로운 쌍의 상보가닥을 형성시킨다. 변성, 프라이머 어닐링 및 프라이머 신장은 수회 반복하여 (즉, 변성, 어닐링 및 신장은 하나의 "주기" 를 이루고, 많은 "주기들"이 있을 수 있다) 원하는 목표 서열의 증폭된 고농도의 단편을 수득한다. 원하는 목표 서열의 증폭된 단편의 길이는 상호 관련하여 프라이머의 상대적 위치로 결정하므로, 이 길이는 조절가능하는 변수이다. 공정의 반복적인 면 덕분으로, 이 방법은 "폴리머라아제 사슬 반응" (이후 PCR 이라 칭함) 로 본 발명자에 의해 명명되었다. 목표 서열의 원하는 증폭된 단편이 혼합물내에서 주도적인 서열(농도 면에서) 이 되기 때문에, 이것은 "PCR 증폭된" 이로 불리운다.

PCR 을 이용하여, genomic DNA 내 특정 목표 서열의 단일 카피를 여러 상이한 방법학으로 검출가능한 수준으로 증폭하는 것이 가능하다 (예컨대, 표식된 프로브에 의한 하이브리드화;바이오티닐화 프라이머의 도입후 아비딘-효소 결합물 검출;³²P 표식된 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트, 예컨대, dCTP 또는 dATP 의 증폭된 단편으로의 도입). genomic DNA 외에, 임의의 올리고뉴클레오티드 서열은 적당한 세트의 프라이머 분자로 증폭시킬 수 있다. 특히, PCR 공정 자체에 의해 생성된 증폭된 단편 자체는 후속 PCR 증폭을 위한 유효한 주형이다.

PCR 증폭 공정은 대략 10^-8M 의 특정 목표 서열의 고평 농도에 도달하는 것으로 알려져 있다.

상보성과 관련하여, 몇몇의 진단 용도가 하이브리드화가 완전한 또는 부분적인 상보성을 나타내는가를 결정하는데 중요하다. 예컨대, 단순히 병원균 DNA 또는 RNA (예컨대 바이러스, 박테리아, 곰팡이, 마이코플라즈마, 원생동물유래) 의 존재 또는 부재를 검출하고자 하는 경우, 하이브리드화 방법은 관련 서열이 존재하는 경우에서의 하이브리드화를 확보하고; 부분적으로 상보적인 프로브 및 완전히 상보적인 프로브가 하이브리다이즈할 조건을 선택하는 것만이 중요하다. 그러나, 다른 진단 용도는 하이브리드화 방법이 부분 및 완전한 상보성을 구분하는 것을 필요로 할 것이다. 유전적 다형을 검출하는 것이 중요할 수 있다. 예컨대, 인간 헤모글로빈은 부분적으로 4 개의 폴리펩티드 사슬로 구성되어 있다. 이러한 사슬들중 두개는 141 아미노산의 동일한 사슬 (알파사슬) 이고, 이 사슬들중 2 개는 146 아미노산의 동일한 사슬 (베타사슬) 이다. 베타사슬을 코딩하는 유전자는 다형을 나타내는 것으로 알려져 있다. 보통의 대립유전자는 6 번째 위치에서 글루탐산을 갖는 베타 사슬을 코딩한다. 돌연변이 대립유전자는 6 번째 위치에서 발린을 갖는 베타사슬을 코딩한다. 아미노산에서의 이러한 차이는 낫세포빈혈증으로 임상적으로 알려진 심각한 생리학적 영향을 갖는다 (개인이 돌연변이 대립유전자에 동측인 경우 가장심각함). 아미노산 변화의 유전적 기초에는 정상의 대립유전자 DNA 서열 및 돌연변이 대립유전자 DNA 서열사이의 단일 염기 차이를 수반하는 것으로 잘 알려져 있다.

다른 기술(예컨대 제한 효소 분석) 과 병행하지 않으면, 부분적 및 완전한 상보성의 경우에서의 동일한 수준의 하이브리드화를 허용하는 방법은 이러한 용도에는 통상적으로 부적합하며; 프로브는 정상 및 돌연변이 목표 서열 양쪽에 하이브리다이즈할 것이다. 사용하는 방법과는 무관하게, 하이브리드화에는 분석하는 서열 (목표 서열)과 시험을 수행하기 위하여 사용하는 DNA 의 단편 (프로브) 사이에서 약간의 상보성이 요구된다. (물론, 임의의 상보성없이 결합을 얻을 수 있으나, 이러한 결합은 비특이적이고 피해야 한다).

여기에서 사용하는 바와 같은 핵산 서열의 보충물은, 한 서열의 5' 말단을 다른 서열의 3'말단과 쌍이 되도록 핵산 서열과 정렬하는 경우, "반평행 연합(antiparallel association)" 인 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 천연 핵산에서 통상적으로 발견되지 않는 특정 염기가 본 발명의 핵산에 포함될 수 있으며, 예컨대, 완전할 필요가 없는, 이노신 및 7-데아자구아닌 상보성을 갖는 것들이 포함되며; 안정한 듀플렉스는 잘못 짝지워진 염기쌍 또는 짝지워지지 않은 염기를 함유할 수 있다. 핵산 기술의 분야에서의 당업자는 예컨대 올리고뉴클레오티드의 길이, 올리고뉴클레오티드의 염기 조성 및 서열, 잘못 짝지워진 염기쌍의 이온 강도 및 발생을 포함한 많은 변수를 경험적으로 고려하여 듀플렉스의 안정성을 결정할 수 있다.

핵산 듀플렉스의 안정성은 용융점 또는 "Tm" 으로 측정한다. 특정 조건하에서의 특정 핵산 듀플렉스의 Tm 은 평균적으로 염기쌍의 반이 분리되는 온도이다. 핵산의 Tm 을 계산하기 위한 방정식은 당업계에 잘 알려져 있다. 참조선으로 나타낸 바와 같이, Tm 값의 평가는 다음 방정식으로 계산할 수 있다 :

Tm-81.5℃+16.6logM+.41(%GC)-0.61(%form)-500/L

식중 M 은 일가양이온의 몰농도이고, %GC 는 DNA 내 구아노신 및 시토신 뉴클레오티드의 백분율이며, %form 은 하이브리드화 용액내 포름아미드의 백분율이고, L 은 염기쌍내 하이브리드의 길이이다 [참조,예컨대, Guide to Molecular Cloning Techniques, Ed. S.L. Berger and A.R. Kimmel, in Methods in Enzymology Vol.152, 401 (1987)]. 다른 참조문헌에는 구조 및 서열 특성을 Tm 의 계산에 고려하는 좀더 정교한 계산이 포함되어 있다.

여기에서 사용하는 용어 "프로브"는 프로브내 하나이상의 서열과 다른 핵산내 서열과의 상동성으로 인해, 다른 핵산내 서열과 듀플렉스 구조를 형성하는 표식된 올리고뉴클레오티드를 의미한다.

여기에서 사용하는 용어 "표식"은 검출가능한(바람직하게는 양적으로) 시그널을 제공하는데 사용할 수 있고,핵산 또는 단백질에 부착될 수 있는 임의의 원자 또는 분자를 의미한다. 표식은 시그널 검출가능한 형광, 방사선, 색도측정, 중력측정, X-선회절 또는 흡수, 자기, 효소활성 등을 제공할 수 있다. 이러한 표식은 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 첨가할 수 있다.

용어 "핵산 기질" 및 "핵산 주형" 은 여기에서 같은 뜻으로 사용되고, 단일 또는 이중가닥 DNA 또는 RNA 를 포함할 수 있는 핵산 분자를 의미한다.

핵산 기질과 관련하여 사용하는 경우에서 용어 "실질적으로 단일 가닥인"은 기질 분자가 가닥간 염기쌍 상호작용에 의해 함께 유지되는 두가닥의 핵산으로서 존재하는 이중가닥 기질과 대비하여 단일가닥의 핵산으로 주로 존재함을 의미한다.

여기에서 사용하는 용어 "서열 변이" 는 두 핵산 주형사이의 핵산 서열에서의 차이를 의미한다. 예컨대, 야생형 구조 유전자 및 이런 야생형 구조 유전자의 돌연변이체 형태는 단일 염기 치환 및/또는 하나이상의 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실의 존재로 서열에서 변할 수 있다. 이러한 두 형태의 구조 유전자는 상호로부터 서열에 있어서 변한다 알려져 있다. 구조 유전자의 두번째 돌연변이체 형태가 존재할 수 있다. 이러한 두번째 돌연변이체 형태는 야생형 유전자 및 유전자의 첫번째 돌연변이체 형태를 서열형태에서 변화시킨다고 알려져 있다. 본 발명에서는 서열변이를 검출하는 하나이상의 형태의 유전자를 비교하는 것을 필요치 않는 반면, 이러한 비교는 여기에 참조로 포함되어 있는 미국 특허출원 시리얼 번호 08/231,440 에 기재되어 있는 바와 같은 특별한 하이브리드화 조건을 이용하여 본 발명의 올리고/고형 지지체 매트릭스와 비교가능함에 주목하여야 한다.

"유전자 서열에 합치되거나 상보적인 올리고뉴클레오티드 프라이머" 는 단일 또는 이중가닥 핵산의 주형의존 합성을 촉진할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 의미한다. 유전자 서열에 합치되거나 상보적인 올리고뉴클레오티드 프라이머는 PCR, 역전사효소-PCR(RT-PCR) 등에 사용될 수 있다.

"컨센서스 유전자 서열" 은 둘이상의 유전자 서열의 비교로 유래되고, 유전자의 주어진 단편에 가장 빈번히 존재하는 뉴클레오티드가 기술되어 있는 유전자 서열을 의미하고; 컨센서스 서열은 표준 서열이다.

여기에서 사용하는 바와 같은 용어 "단백질" 및 "프로테아제" 는 메탈로프로테아제를 의미한다. 용어 "메탈로프로테아제" 는 천연 금속 의존 프로테아제, 이의 단편, 여전히 이의 기능을 함유하고 있는 돌연변이체 또는 상동체를 의미한다. 본 발명은 상이한 종으로부터 유래한 메탈로프로테아제 (또는 "디스인테그린"), 및 재조합 방법, 실험관 방법, 또는 표준 펩티드 합성으로 제조한 메탈로프로테아제에 관한 것이다. 바람직하게는 단백질은 인간 디스인테그린 또는 이의 돌연변이체이다. 단백질의 돌연변이체를 정의하기 위한 목적으로 바람직한 "천연" 단백질이 여기에 참조로 포함되어 있는 GenBank 기탁번호 #Z48579 에 부분적으로 기술되어 있고, 이하의 서열에 언급되어 있다. 상동체 디스인테그린에는 당업계에서 이해되고 있는 바와 같은 적어도 90% 상동성을 갖는 전(whole)단백질 또는 이의 단편이 포함된다. 몇몇의 종간 변이가 기능을 변경시키거나 시키지 않을 수 있는 삽입 또는 결실을 포함하여 발생할 수 있음이 인정된다. 예컨대,펩티디 서열에 기초한 단백질에 95% 상동성인 래트 단백질 및 처음의 300 bp 에 기초하여 97-98% 상동성인 소단백질 (DNA서열 기초) 은 모두 상동체인 것으로 간주된다. 참고로 GenBank 기탁번호 #Z48444 (1994.2.25)에는 래트 디스인테그린 메탈로프로테아제 유전자인 것으로 알려는 래트 유전자의 2407 염기가 개시되어 있고; GenBank 기탁번호 #Z21961 (1994.10.25) 에는 소아연 메탈로프로테아제 유전자인 것으로 알려진 유전자의 부분 서열의 2397 염기가 개시되어 있다. 바람직하게는, 이 메탈로프로테아제는 하기에 기술되어 있는 바와 같은 인간 디스인테그린이다.

용어 "항체" 는 디스인테그린에 대한 항체 또는 이의 단편을 의미한다. 이것은 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있고, 임의의 여러 원천으로부터 유래할 수 있다. 본 발명은 또한 단백질 또는 펩티드 기술에서 임의의 방법으로 제조된 상기 항체의 단편을 포함한다.

용어 "질병 스크린" 은 질병 또는 질병상태에 대한 스크린을 의미한다. 질병 상태는 질병의 생리학적 또는 세포 또는 생화학적 발병이다. 바람직하게는 이러한 스크린은 ELISA 와 같은 표준기술을 이용하여 동물의 신체 조직 또는 유체 또는 세포 배양물에 대해 사용한다. 이는 또한 체계적으로 상기 기술되어 있는 바와 같이 표식된 항체에 의한 전신내 질병의 맵핑을 포함한다 : 검출 방법과 무관하게, 바람직한 이러한 검출 방법에는 형광, X-선 (CAT 스캔 포함), NMR (MRI 포함) 등이 포함된다.

용어 "화합물 스크린" 은 화합물을 찾고, 이들의 프로테아제에 대한 친화도의 측정, 또는 스크린에 기초한 화합물의 설계 또는 선별과 관련된 방법 및 스크린에 관한 것이다. 다른 구현예에 있어서, 약제 설계, 바람직하게는 당업계에서 알려진 바와 같이 " 래셔널(rational) 약제 설계" 에 대한 3 차원구조의 사용이 포함된다. 프로테아제는 실험 또는 특성화에 유용하도록 하기 위하여, "본질적으로 순수한 형태" 인 것이 바람직할 수 있으며, 이는 상당히 다른 불순물이 없는 단백질을 의미할 수 있다. 이러한 스크리닝 방법의 사용은 당업자가 화학자에 의해 만드어졌거나 또는 천연적으로 만들어 졌건, 새로운 구조물을 발견하는데 도움을 주며, 이는 프로테아제에 결합하거나 바람직하게는 억제한다. 이러한 "억제제" 는 프로테아제의 활성을 조절하거나 조정하는데 있어 유용할 수 있으며, 이들이 기능하는 생물학적 케스케이드를 조정하는데 이용할 수 있다. 이 접근법은 새로운 약제학적으로 유용한 화합물을 제공한다.

용어 "디스인테그린" 은 디스인테그린, 이의 단편, 이의 돌연변이체 또는 이의 기능을 여전히 보유하는 상동체를 의미한다. 이러한 용어는 앤그리카나아제, 및 조직 리모델링을 수반하거나 조절하는 기타 프로테아제를 포함한다. 이것에는 상이한 종으로부터 유래한 디스인테그린, 및 재조합 방법, 실험관 방법, 또는 표준 펩티드 합성으로 제조된 것들이 포함된다. 바람직하게는 단백질은 인간 디스인테그린 또는 이의 돌연변이체이다. 돌연변이체를 정의하기 위해서, 참조로 단백질이 여기에 참조로 포함되어 있는 GenBank 기탁번호 #Z48579 에 부분적으로 기술되어 있고, 하기의 서열에서 언급되어 있다. SEQ ID NO : 1 에는 상기 DNA 서열의 단편 및 이의 전사체가 기술되어 있고, SEQ ID NO : 2 에는 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 기재되어 있다. 디스인테그린 상동체에는 당업계에 알려진 바와 같이 적어도 90% 의 상동성을 갖는 전단백질 또는 이의 단편이 포함된다. 예컨대, SEQ ID NO : 1 을 함유한 DNA 또는 cDNA 서열에서 유래한 아미노산 서열에 기초한 SEQ ID NO : 2 의 것과 95% 상동성인 래트 단백질 및 97-98% 상동성인 소단백질 (유사하게 유래된) 은 모두 상동체인 것으로 인정된다. 따라서 다른 유기체로부터 클로닝된 이런 상동성 cDNA 는 상동성 단백질을 유발한다.

마찬가지로 단백질은 아미노산 서열만을 기초로한 상동체로 간주될 수 있다. 아미노산 시퀀싱의 실제적 제한은 예컨대 단백질의 처음 50 아미노산의 비교를 이용하여 단백질이 다른 단백질에 상동인지를 결정할 수 있도록 해주는 것이다. 따라서 90% 상동성은 상동 단백질의 처음 50 아미노산의 사슬에서 5 개의 상이한 아미노산을 허용한다.

당업자는 유전 코드의 퇴화는 동일한 전사체를 제공하는 상이한 DNA 서열, 따라서 동일한 단백질을 제공하는 것을 알 수 있을 것이다. 특정의 경우에서, 동일한 단백질을 코딩하나 천연 DNA 와 상이한 DNA 서열의 제조에는 :

- 시퀀싱 또는 합성의 용이함;

- 단백질의 증가된 발현 ; 및

- 기타의 것보다 특정 코돈에 대한 특정 이질성 숙주의 선호가 포함된다.

이러한 실제적인 고려는 널리 알려져 있으며 본 발명의 사용자에게 유익할 수 있는 구현예를 제공한다. 따라서, 천연 DNA 는 본 발명에서 그려본 유일한 구현예는 아님은 명백해진다.

또한, 단백질의 단편은 스크리닝, 약제 설계등에 사용할 수 있고, 전 단백질은 본 발명을 이용하기 위하여 필요치 않을 것은 당업자에게는 분명하다. 따라서 당업자는 단백질의 개시 및 이의 사용은 유용한 펩티드 단편을 포함함을 이해할 것임이 분명해진다.

단백질 발현, 정제 수율, 안정성, 용해도등의 실제적 고려는 단편, 및 사용된 단편을 사용할지를 선택하는 경우 당업자에게 고려된다. 그 결과, 당업계에서 통상적인 방법을 이용하여, 당업자는 주어진 이 개시에 따라 단백질의 단편을 이용하여 본 발명을 실시할 수 있다.

따라서, 본 발명은 유전자에 대한 전 핵산서열 보다 모자라게, 단백질의 전 아미노산 서열보다 모자라게 사용하는 것을 특히 포함한다. 단백질의 단편은 스크리닝, 약제 설계등에 사용할 수 있고, 전 단백질은 본 발명을 사용하고자 하는 목적에는 필요치 않을 수 있다. 단백질 자체는 소분자의 단백질에 대한 결합활성을 측정하는데 사용할 수 있다. 효소 목표를 이용한 약제 스크리닝은 당업계에서 사용되고 있고, 자동화된 고산출 기술을 이용하여 사용할 수 있다.

단백질 또는 프로테아제 자체는 소분자의 단백질에 대한 결합활성을 측정하는데 이용할 수 있다. 효소 목표를 이용한 약제 스크리닝은 당업계에서 사용되고 있고, 자동화된 고산출 기술을 이용하여 사용할 수 있다.

디스인테그린 활성의 억제는 골관절염, 및 조직 리모델링등과 같은 매트릭스 분해를 갖는 관절 연골 및 기타 조직의 변성을 수반하는 기타 질환의 치료에서의 효능의 지시계가 될 수 있다.

유전자 치료

이론에 의한 구애됨이 없이, 메탈로프로테아제는 조직에서 골관절염 동안 상향 조정되는 것으로 생각된다. 본 발명자는 놀랍게도 인간 디스인테그린은 골관절 상태동안 인간 연골세포에서 상향조절되는 것을 발견하였다. 시그널 전도 메카니즘의 억제는 골관절염 및 연골분해를 수반하는 기타질환에서 연쇄폭포 현상을 정지시키는데 효과적이다. 당업자는 만일 상향 조절이 관절염의 발병원인이라면, 이러한 유전자의 활성을 방해하는 것은 골관절염의 치료에 유용할 수 있다는 것을 인정할 것이다.

이것은 유전자 (즉, 안티센스) 치료를 포함한 임의의 여러 방법에 의해 행해진다.

프로테아제의 정제

재조합 디스인테그린 또는 전장의 단백질의 단편을 함유하는 포유류, 이스트, 곤충 또는 진핵세포유래의 배지, 세포 추출물 또는 봉입체는 디스인테그린 또는 디스인테그린의 단편을 정제하는데 사용한다. 변성 디스인테그린으로 구성된 용액은 연속 크로마토그래피 수지를 횡단시키는 정제전 또는 분리의 최종 단계후에 재접혀질 수 있다. 필요에 따라, 하나의 세제, 변성제 또는 유기 용매, 예컨대 옥틸글루코시드,우레아 또는 디메틸술폭시드 또는 이들의 조합하에서 배지, 세포 추출물 또는 가용화된 디스인테그린을 제조한다. 이온 교환 및 소수 상호작용 크로마토그래피는 개별적으로 사용하거나 또는 세포물질을 오염시키는 것으로부터 재조합 디스인테그린을 분리하기 위하여 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 물질은 컬럼에 가하고, 디스인테그린은 pH 의 적정, 이온 강도에서의 변화, 변성제의 첨가 및/또는 유기 용매의 사용으로 용출된다. 이어서, 전형적으로, 디스인테그린을 함유하는 용액을 디스인테그린의 부위 특이적 정제를 위해 항체 친화성 컬럼 또는 리간드 친화성 컬럼상에 통과시킨다. 면역친화성 컬럼은 Sepharose 4B(Pharmacia)와 같은 고형 지지체 또는 기타 유사 재료상에 고정화된 디스인테그린에 특이적인 항체를 함유한다. 바람직하게는, 컬럼은 세정하여 비결합 단백질을 제거하고, 디스인테그린을 저 pH 글리신 버퍼 또는 고이온 강도를 통해 용출시킨다. 리간드 친화성 컬럼은 디스인테그린의 활성 부위 또는 활성부위에 인접한 또는 부위로부터 제거된 분자의 일부에 대한 특이성을 갖을 수 있다. 컬럼은 세정하고, 디스인테그린을 용출버퍼에 경쟁적인 분자를 첨가하여 용출시킨다. 바람직하게는, 하나이상의 프로테아제 억제제, 예컨대 벤즈아미딘, 류펩틴, 포스포아미돈, 페닐메틸술포닐 플로라이드 및 1,10-펜안트롤린을 함유하는 프로테아제 억제제 칵테일이 정제절차 전반에 걸쳐 존재한다. 옥틸티오글루코시드 및 Triton X-100 과 같은 다양한 세제 또는 글리세롤과 같은 화학제를 디스인테그린 용해도 및 안정성을 증가시키기 위하여 첨가할 수 있다. 단백질의 최종 정제는 필요에 따라 크로마토그래피 지지체를 횡단시켜 겔여과로 달성될 수 있다.

프로테아제의 억제제

본 발명의 프로테아제는 프로테아제의 억제제를 찾는데 사용할 수 있다. 따라서 이는 스크리닝 도구로서 또는 래셔널 약제 설계에 유용하다. 이론에 구애받지 않고, 프로테아제는 세포 리모델링을 조절하고, 사실 세포외 매트릭스 리모델링을 강화시켜 조직 붕괴를 강화시킬 수 있다. 따라서 디스인테그린의 억제는 이러한 과정을 특징으로 하는 질병의 치료에 대한 치료학적 경로를 제공한다.

스크리닝시, 약제 화합물을 사용하여 억제의 질 및 양 모두를 측정할 수 있다. 그 결과 이러한 스크리닝은 활성, 바람직하게는 소분자 활성의 선별을 위한정보를 제공하며, 이는 이러한 질병을 치료하는데 유용하다.

치료시, 소분자량의 결합을 통한 디스인테그린 메탈로프로테아제 활성의 억제, 매트릭스 메탈로프로테아제를 억제하는데 사용하는 것과 같은 합성 메탈로프로테아제 억제제는 세포외 매트릭스 리모델링을 억제하는데 사용한다.

단백질에 대한 항체

메탈로프로테아제는 메탈로프로테아제 억제제를 이의 항체 또는 단편에 결합시켜 목표화시킬 수 있다. 결합 방법은 당업계에 알려져 있다. 따라서 이러한 항체는 치료 및 억제제의 용량을 모니터하는데 유용하다.

본 발명의 항체는 또한 고형의 지지체상에 결합될 수 있다. 이러한 결합체는 원하는 메탈로프로테아제, 바람직하게는 디스인테그린의 정제를 위한 친화성 시약으로 사용할 수 있다.

또 하나의 양상으로, 본 발명의 항체는 표식에 직접적으로 결합된다. 항체가 메탈로프로테아제에 결합하는 경우, 표식은 생체내 또는 실험관 세포 배양에서 메탈로프로테아제의 상대적으로 높은 수준의 존재를 검출하는데 사용할 수 있다.

예컨대,의도하는 목표 조직에 대한 마커와 특별히 반응하는 목표 리간드를 사용할 수 있다. 본 발명의 화합물을 목표 리간드에 결합시키는 방법은 공지되어 있어 있으며, 담체에 결합시키는 후술되어 있는 방법과 유사하다. 결합체는 상술한 바와 같이 제형화하여 투여한다.

항체의 제조 및 사용

항체는 여러 방법으로 제조할 수 있으며, 예컨대, 단백질은 마우스, 토끼등을 포함한 적합한 (예, 포유류) 피검자에게 주사할 수 있다. 바람직한 프로토콜에는 혈청에서 항체의 생산을 높이는 스케쥴에 따라 보조제의 존재에서 면역원의 반복 주사를 수반한다. 면역 혈청의 적정은 현재 당업계에서 표준이 된 면역검정 절차를 이용하여 쉽게 측정할 수 있다.

수득한 항혈청은 직접적으로 사용할 수 있거나, 또는 모노클로날 항체는 면역화된 동물의 말초혈액 림프구 또는 비장을 수집하고 항체 생산 세포를 죽지않게 한후, 표준 면역검정 기술을 이용하여 적합한 항체 생산자를 확인하여 수득할 수 있다.

폴리클로날 또는 모노클로날 제제는 본 발명의 화합물을 수반하는 치료 또는 예방 양생법을 모니터하는데 유용하다. 혈액, 혈청, 소변, 또는 타액으로부터 유래한 것과 같은 적합한 시료는 본 발명의 항체 제제를 사용하는 표준 면역검정 기술을 이용하여 치료 프로토콜동안 다양한 시점에서 단백질의 존재에 대해서 시험할 수 있다.

이러한 항체는 또한 신티그래픽 표식, 예컨대 Tc-99 또는 I-131 와 같은 표식에 표준 결합 방법을 이용하여 결합시킬 수 있다. 표식된 화합물은 피검자에게 투여하여 생체내에서 하나이상의 메탈로프로테아제의 과량의 위치를 측정한다. 따라서 단백질에 대한 표식된 항체는 질병을 나타내는 이러한 강화된 발현에 대한 스크리닝 도구로서 작동할 것이다.

따라서 선택적으로 메탈로프로테아제에 결합하는 항체의 능력은 인시튜에서 이러한 효소의 분포를 지도화하는 이점을 갖는다. 이 기술은 또한 조직학적 절차에서 사용할 수 있고, 표식된 항체는 경쟁적 면역검정에서 사용할 수 있다.

항체는 유리하게는 공지의 방법을 이용하여 다른 화합물 또는 물질에 결합된다. 예컨대, 카르복실 관능성을 갖는 물질을 들 수 있으며, 여기에서 카르복실 잔기는 알데히드로 환원되어, 측쇄 아미노기와 반응을 통해 담체에 결합할 수 있으며, 임의적으로 형성된 이미노 결합의 환원이 뒷따를 수 있다. 또한 카르복실 잔기는 디시클로헥실 카르보디이미드와 같은 축합제 또는 카르보디이미드 탈수화제를 이용하여 측쇄 아미노기와 반응시킬 수 있다. 링커 화합물이 또한 결합을 실시하는데 이용할 수 있고; 호모2관능 및 헤테로2관능 링커가 피어스 케미칼사로 부터 구입가능하다 (Rockford, I11).

이러한 항체는 적합한 크로마토그래피 물질과 결합시키는 경우 단백질을 단리시키는데 유용하다. 친화성 크로마토그래피를 이용하는 분리방법은 당업계에 공지되어 있고, 당업자의 범위내이다.

질병 마커

상술한 바와 같이, 본 발명은 병에 걸린 조직의 시료를 포함한 시료에서 메탈로프로테아제 유전자의 발현을 검출하는 것을 포함한다. 본 발명은 핵산 (DNA 또는 RNA 이든) 의 원천의 성질에 의해서 제한되는 것은 아니며; 포유류(에, 암조직, 림프구등) 원천에만 한정되는 것은 아니며 다양한 원천이 포함된다.

이론에 구애받지 않고, 유전자의 발현, 바람직하게는 이러한 유전자는 제한된 조직 분포를 갖을 수 있으며, 이의 발현은 잠재적 골관절염 매개체에 의해 상향 조절된다. 예컨대 관절 연골세포에서의 이러한 유전자 (및 이의 단백질) 의 향상된 발현은 최초의 증상단계를 포함한 발육 및 골관절염의 진행을 모니터하는 마커를 제공한다. 따라서 단백질로 모여진 항체는 질병을 나타내는 이러한 향상된 발현에 대한 스크리닝 도구를 작동시킨다.

또한, 질병 스크리닝에서 사용하는 경우, 항체는 크로모포어 또는 플루오로포어를 함유한 물질에 결합되거나, 또는 특정 조건에서 크로모포어 또는 플루오로포어를 생산하는 효소에 결합할 수 있다. 이러한 결합 물질 및 방법은 당업계에 공지되어 있다. 이런 방식으로 사용하는 경우, 면역검정에 의한 단백질의 검출은 당업자에게는 즉각적이다. 체액,(혈청, 소변, 활액) 은, 예컨대, 측정, 및 메탈로프로테아제의 분포의 검정 또는 이러한 프로테아제의 증가된 수준을 위해 상기의 방식으로 스크리닝할 수 있다.

이러한 방식으로 사용하는 경우, 본 발명은 메탈로프로테아제 중재 질환, 예컨대 골관절염 또는 기타 관절 연골 퇴행 질환 또는 세포외 매트릭스의 분해 또는 리모델링을 특징으로 하는 기타 질환에 대한 유용한 진단 및/또는 임상 마커이다. 질병을 검출한 경우, 이는 증상 또는 쇠약화의 발증전에 치료할 수 있다.

더욱이, 이러한 항체는 전술한 바와 같은 검출 또는 치료를 위해 병든 조직을 목표화하는데 사용할 수 있다.

핵산 유래 도구

세포의 핵산 내용물은 데옥시리보핵산 (DNA) 및 리보핵산 (RNA) 로 구성된다. DNA 는 세포의 유전적 청사진을 포함한다. RNA 는 DNA 서열에 기초한 단백질의 제조에서 중간체로서 관여된다. RNA 는 세포내에서 세 형태, 구조 RNA(즉, 리보좀 RNA "rRNA"), 전사 RNA ("tRNA") (번역에 관여) 및 메신저 RNA ("mRNA") 로 존재한다. mRNA 는 DNA 에서 코딩되는 유전정보와 대응하는 단백질의 중간역활 분자이기 때문에, 임의의 주어진 시간에서의 세포의 mRNA 성분은 세포의 생리학적 상태를 대표한다. 세포의 분자 생물학을 연구 및 이용하기 위해서는, 시료의 총 핵산으로부터 mRNA 를 정제하는 것을 포함하여 mRNA 를 정제할 수 있는 것이 중요하다.

RNA 의 제조는 RNA 를 분해시키는 리보뉴클레아제의 존재로 인해 까다롭다 (예, T.Maniatis et al., Molecular Cloning, pp. 188-190, Cold Spring Harbor Laboratory [1982]). 더욱이, 증폭가능한 RNA 의 제조는 RNA 와 관련하여 리보뉴클레오단백질의 존재에 의해 어렵게 된다 (참조, R,J. Slater, In: Techniques in Molecular Biology, J.M. Walter and W. Gaastra, eds., Macmillan, NY, pp. 113-120 [1983]).

전형적으로는, 세포유래의 핵산의 정제에 관여하는 단계에는 1) 세포 붕해; 2)세포 뉴클레아제의 불활성화; 및 3) 세포 찌꺼기 및 기타 핵산으로부터 원하는 핵산의 분리가 포함된다. 세포 붕해는 효소, 세제 또는 카오트로픽제 처리를 포함한 다양한 방법을 통해 달성될 수 있다. 세포 뉴클레아제의 불활성화는 프로테아제 및/또는 강염의 사용으로 달성될 수 있다. 최종적으로, 원하는 핵산의 분리는 전형적으로 핵산을 페놀 또는 페놀-클로로포름으로 추출하여 달성되며; 이 방법은 시료를 수상(핵산 함유) 및 유기상(단백질을 포함한 기타 세포성분을 함유) 으로 분할시켜 달성한다. 통상적으로 사용되는 프로토콜에는 페놀과 병행하여 염의 사용을 필요로 하거나 (P.Chomczynski and N.Sacchi.Anal.Biochem.162:156[1987]), 또는 단백질을 제거하는 원심분리단계 (R.J. Slater, supra) 를 사용한다.

일단 핵산 분획이 세포로부터 단리되면, mRNA 분자의 구조는 DNA 및 기타 RNA 분자로부터 mRNA 를 정제하는데 있어 도우는데 사용할 수 있다. 고등 유기체의 mRNA 는 통상적으로 이의 3'말단상에서 폴리아데닐화 ("폴리-A 꼬리" 또는 "폴리-A 트랙")되기 때문에, 세포로부터 RNA 를 단리하는 하나의 수단은 폴리-A 꼬리를 셀룰로오즈와 같은 지지체상에 연결되는 이의 상보 서열 (즉, 올리고-dT) 과 결합시키는 것을 기초로 한다. 통상적으로, 하이브리다이즈된 mRNA/올리고-dT 는 원심분리를 통해 시료내 존재하는 기타 성분으로부터 분리하거나, 또는 자기 포맷의 경우에서는 자기장에 노출시킨다. 일단 하이브리다이즈된 mRNA/올리고-dT 가 기타 시료 성분으로부터 분리되면, mRNA 는 통상적으로 올리고-dT 로 부터 제거한다. 그러나, 몇몇의 용도를 위해, mRNA 는 고형 지지체에 연결된 올리고-dT 에 결합된 채 남아있을 수 있다.

올리고-dT 가 연결된 매우 다양한 고형 지지체가 개발되어 시판되고 있다. 비록 락텍스 비드 및 상자성 입자에 공유결합된 올리고-dT 를 갖는 포맷이 개발 시판되고 있지만, 셀룰로오즈는 대부분의 올리고-dT 시스템에 대한 가장 일반적인 지지체로 남아있다. 상자성 입자는 바이오틴-아비딘 시스템에서 사용될 수 있고, 바이오티닐화 올리고-dT 는 용액내에서 mRNA 에 어닐링된다. 이어서 하이브리드는 스트렙타비딘-피복 상자성 입자로 포획하여, 자기장을 이용하여 분리시킨다. 이러한 방법외에, 스푼-컬럼 포맷내 진핵세포 총 RNA 로부터 폴리아데닐화 RNA 의 친화성 정제와 같은 변형이 존재한다. 이러한 접근법은 폴리-A mRNA 의 하이브리드화를 허용하나, 효율 및 감도에 있어서 다양하다.

하나의 구현예로서, mRNA 는 역전사효소로 처리하여 cDNA 를 제조한다. cDNA 는 프라이머 신장 및 후술되는 프라이머를 이용한 PCR 에서 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 후술되는 프라이머를 이용한 프라이머 신장으로 검출가능한 핵산 분자를 포함한다. 프라이머 신장 (및 상기 물질에 대한 PCR) 은 상보핵산이 하이브리다이즈 (부분적 상보 핵산과의 하이브리드화에 반대되는) 할 정도의 조건(소위 "고염격 조건") 하에서 실행할 수 있다. 이러한 조건은 듀플렉스의 융점 또는 부근에서의 어닐링을 포함한다.

특이적 디스인테그린 메탈로프로테아제 유전자에 대한 프라이머

본 발명은 기타의 것들중에서 디스인테그린 메탈로프로테아제 유전자 발현의 검출에 유용한 신규의 디스인테그린 메탈로프로테아제 유전자의 부분 핵산 전장 단백질 코딩 영역 서열을 제공한다. 하나의 구현예로, 이러한 부분서열의 일부에대한 프라이머는 유전자 서열의 존재 또는 부재의 검출에 사용된다. 이러한 프라이머는 또한 전 유전자를 나타내고, 디스인테그린 메탈로프로테아제 또는 이의 단편 (또는 돌연변이체) 를 코딩하는 핵산 서열의 숙주세포에서 재조합 발현을 허용하는 cDNA 클론의 동정에 사용할 수 있다.

바람직한 프라이머는 프라이머 SEQ ID NO : 9 (5'-AGCCTGTGTC-3') 및 SEQ ID NO : 10 (5'-AGCCTGTGTCTGAACCACT-3') 이다. 그러나, 다른 프라이머도 SEQ ID NO : 5 및 SEQ ID NO : 1 에 기재된 서열로부터 용이하게 설계할 수 있다.

특성적 표시에 의한 생물학적 시료의 비교방법

성공적인 증폭은 반응으로부터 생성물을 특성화하여 확인할 수 있다. 본 발명은 신장 생성물 또는 PCR 산물이 검출되는 방법에 의해 제한되는 것은 아니다. 하나의 구현예로, PCR 산물은 2% 아가로오스 겔(BRL) 를 이용하여 고분해 아가로오스 겔 전기영동으로 분석하고, 증폭된 DNA 단편은 에티듐 브로마이드 염색및 UV 투조로 가시화한다. 본 발명은 하나의 구현예로 전기영동을 이용하여 생산물 형성을 확인하고 시료간 결과를 비교하는 것을 포함한다.

그래서, 본 발명은 핵산 (예, cDNA 또는 RT-mRNA) 의 혼합물에서 새로운 디스인테그린 메탈로프로테아제 유전자의 서열을 검출하는 것을 포함한다. 핵산의 혼합물에 대해 PCR 을 실시하고, 생성물을 겔상에서 운행시켜, 프라이머에 의해 한정된 서열을 함유하는 핵산을 단리시킨다. 이후 생성물은 겔로부터 밴드를 절단하여 (또는 전기용출과 같은 다른 적합한 방법으로) 정제시킬 수 있다.

서열목록의 요약

참고로 서열목록의 상호관계를 하기에 기술하였다.

SEQ ID NO : 1 는 단편 DNA 서열이고, SEQ ID NO : 3 의 일부이다. SEQ ID NO : 1 의 첫번째 염기 (시토신 또는 C) 는 SEQ ID NO : 3 의 염기 940 이다. DNA 서열은 겹쳐지는 부분에서는 동일하다.

SEQ ID NO :2 및 SEQ ID NO : 4 는 각각 SEQ ID NO :1 및 SEQ ID NO :3 의 발현된 아미노산 서열이다. SEQ ID NO : 2 의 첫번째 아미노산, Gln, 은 SEQ ID NO : 4 의 309 번째 아미노산이다. 두개의 서열은 단백질의 카르복시 말단에 상동이다.

SEQ ID NO : 7 은 특성적 표시 실험에 의해 제공된 DNA 의 센스 가닥이다. SEQ ID NO : 7 의 첫번째 염기는 SEQ ID NO : 1 의 염기 1371 에 해당하고, SEQ ID NO : 3 의 염기 2310 에 해당한다. 이러한 서열은 SEQ ID NO : 1 의 452 염기, 염기 1822 및 SEQ ID NO : 3 의 염기 2761 에 상동한다. SEQ ID NO : 1 및 SEQ ID NO : 3 의 마지막 두 염기에서의 차이는 시퀀싱에서의 에러 또는 PCR 에서 발견되는 통상의 복제 에러에 기인하거나, 또는 클로닝 벡터의 일부일 수 있다. SEQ ID NO : 7 은 상동부분을 넘어서 약간의 284 염기까지 지속되어, SEQ ID NO :1 및 SEQ ID NO : 3 의 말단을 넘어선다.

또한, SEQ ID NO : 7 의 염기 477 내지 716 은 SEQ ID NO : 6 이다. SEQ ID NO : 6 은 SEQ ID NO : 5 의 센스가닥이고, 이는 분화 디스플레이 클로닝을 통해 발견되는 안티센스 가닥이다. 따라서 SEQ ID NO : 6 은 mRNA 에서 나타나는 것과 같은 DNA 방향을 보인다. 이러한 두 서열은 상기 유전자의 3'말단 부근에서 발견된다.

비록 SEQ ID NO : 7 의 염기 452 에서 3' 말단까지는 SEQ ID NO :1 및 SEQ ID NO : 3 과 상이하지만, SEQ ID NO : 7 은 그럼에도 불구하고 유효하다. 발현된 펩티드 서열은 이러한 차이에 의해 영향받지 않음에 주목하여야 한다. 또하나의 폴리아데닐화 시그널의 사용 때문에 SEQ ID NO :1 및 SEQ ID NO : 3 에서 상기 염기들은 나타나지 않기 쉽다.

SEQ ID NO : 8 은 새로운 전장의 DNA 서열이다. SEQ ID NO : 9 는 SEQ ID NO : 8 의 새로운 발현 단백질이다. SEQ ID NO : 9 는 SEQ ID NO : 4 의 아미노산 162 (Ser)-213(Tyr)이 SEQ ID NO : 9 의 위치 162 에서 시그널 잔기, Asn 로 치환된다는 점에서 SEQ ID NO : 4 와는 상이하다. 이러한 변화는 총 153 개의 염기에 해당하는 염기 501-654 를 결실시킴으로써 DNA 에서 반영되며, 그 결과 SEQ ID NO : 4 에 존재하는 51 아미노산을 결실시키고 하나의 잔기를 변화시키는 것만 제외하고 판독 프레임은 온전히 남게되다.

SEQ ID NO : 10 및 SEQ ID NO : 11 은 PCR 에서 유용한 안티센스 프라이머이고, SEQ ID NO : 7 의 3' 말단의 역이며, 프라이머에 대한 기타 서열은 여기에서 언급되어 있는 서열을 이용하여 당업자에 의해 인식될 수 있다.

하기의 비제한 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 설명하며, 본 발명의 용도를 간략하게 기술한다. 이러한 실시예는 당업자에게 가이드라인으로써 제공되는 것이며, 본 발명을 어떤 경우에서도 제한하는 것은 아니다. 이러한 개시 및 실시예로 무장하여, 당업자는 청구된 발명을 제조 및 이용할 수 있다.

표준 출발 물질이 이러한 실시예를 위하여 사용된다. 이러한 많은 물질은 공지되어 있고 시판되고 있다. 예컨대, 대장균 CJ236 및 JM101 은 공지된 균주이고, pUB110 은 공지된 플라스미드이며, 컨켈법 돌연변이가 또한 당업계에 공지되어 있다. 또한 특정 세포주 및 cDNA 는 예컨대 U-937 (Clontech Inc., Palo Alto, California)로 구입할 수 있다.

돌연변이체는 다양한 숙주에서 다양한 방법 및 발현 시스템으로 만들어 질 수 있으며, 이러한 방법은 분자 생물학, 생화학 또는 기타 생물공학관련 기술에서 당업자의 실시 범위내이다.

실시예 1

RNA 는 정상 인간 관절 연골세포의 비자극 및 인터루킨-1 자극 배양물로부터 단리시킨다. RNA 는 cDNA 로 역전사시킨다. cDNA 는 일련의 랜덤 프라이머를 이용하여 수정된 특성적 표시 절차에 건다.

자극 및 비자극된 연골세포에서 발생하는 PCR 시료를 폴리아크릴아미드 겔상의 인접한 레인에서 전기영동시킨다. 특성적으로 발현된 밴드를 겔로부터 절단하고, 클로닝하여 서열화시킨다. 유전자의 특성적 발현은 RNAase 보호 및 뉴클리어 런 온 (nuclear run on) 실험으로 확인한다.

실시예 2

단백질을 코딩하는 새로운 부분 인간 cDNA 는 인터루킨-1 자극 인간 관절(대퇴골 머리부분) 연골세포의 일차 배양물로부터 공지의 방법으로 클로닝시킨다. 동일한 서열이 발견되고, 인간 cDNA 라이브러리를 스크리닝하여 전장의 클론을 수득하여 유전자를 완결시킨다.

실시예 3

실시예 2 의 클론된 DNA 는 공지의 방법을 이용하여 pUB110 에 위치시킨다. 이러한 플라스미드는 대장균을 형질전환시키는데 사용하고, 부위 돌연변이용 주형을 제공하여 새로운 돌연변이체를 생성시킨다. 컨켈법 돌연변이를 Gln 1 를 Ala 로 변경하여 실행한다.

실시예 4

[¹²⁵I] 디스인테그린 항체는 IODOBEADS (Pierce, Rochford, IL: 비다공성 폴리스티렌 비드상에 비고정된 클로로아민-T) 를 이용하여 제조한다. 친액성 항체 (2㎍) 을 10mM 아세트산의 50㎕ 에 넣어, 빙상의 포스페이트 완충 염수 (PBS) (Sigma, St. Louis, MO) 450㎕ 에 가한다. 튜브에 500 μCurie 의¹²⁵I (Amersham, Arlington Heights, IL)(2200Ci/mmol) 를 5㎕ 및 IODOBEADS 한개를 첨가한다. 반응을 간헐적으로 진탕하면서 빙상에서 10 분간 인큐베이션시킨다. 이어서 반응을 IODOBEADS 로부터 반응을 제거하여 종결시킨다. 비반응된¹²⁵I 를 제가하기 위하여, 혼합물을 PD-10 겔여과컬럼에 적용한다.

실시예 5

형광발생 디스인테그린 메탈로프로테아제 기질 펩티드 (Bechem, Guelph Mills, King of Prussia, Pa) 를 디스인테그린과 함께 혼합하고, 형광에서의 변화를 대조군으로써 2 분후에 평가한다. 이어서 형광발생 페티드를 화합물 (메탈로프로테아제 억제제) 의 존재에서 디스인테그린과 혼합하여 분리된 실험에서 평가를 위해, 2 내지 12 시간에 걸친 다양한 시점에서 평가한다. 표준 방법학을 이용하여 데이타를 평가하여 평가된 화합물의 상대 결합을 제공한다.

실시예 6

환자의 왼쪽 무릎의 활액 0.5 ml 를 수거하여 ELISA 로 디스인테그린의 증가된 수준을 시험한다. 결과는 정상의 디스인테그린 수준보다 높음을 나타낸다. 혼자는 시간을 두고 경구투여되는 디스인테그린 억제제의 예방용량을 처방하거나 의료실을 떠나기전 왼쪽 무릎에 상기 물질을 주사한다.

실시예 7

세포외 매트릭스 리모델링의 억제는 디스인테그린 메탈로프로테아제 활성의 억제를 통해 조사한다. 소분자량을 이용하여, 합성 메탈로프로테아제 억제제, 에컨대 매트릭스 메탈로프로테아제를 억제하는데 사용하는 것을 이용하여 조직의 무결함 및 프로테오글리칸을 모니터한다.

IL-1 자극 소비연골유래 관절 연골의 시료를 소분자량의 디스인테그린 억제제의 1mmol 용액에서 육성한다. 실험은 조절하여 억제제 없이 육성된 동일한 배양물과 비교한다.

7 일후 배양물의 분석은 억제된 배양물은 덜 조직이 파괴되고 배양물의 혈청내 프로테오글리칸이 덜 존재함을 보여준다. 결과는 억제된 애그리카나아제 활성과 일치한다. 애그리카나아제의 억제는 조직 파괴를 억제하고 프로테오글리칸의 방출을 감소시킨다.

실시예 8

디스인테그린 메탈로프로테아제 도메인의 막결합 형태로부터의 방출을 초래하는 단백분해 공정의 억제는 막결합 디스인테그린 분자의 "2 차 메신저" 시그널을 억제한다. 이러한 2 차 메신저 시그널링은 세포 표현형 변화, 유전자 발현에서의 변화, 유사분열 활성에서의 변화등을 가져온다.

디스인테그린을 함유하는 것으로 알려진 세포를 세린 프로테아제로 처리한다. 세포로부터 방출된 단백질은 표준방법으로 측정한다. 구체적으로는 메탈로프로테아제 활성을 문헌의 방법을 통해 모니터한다. 방출된 메탈로프로테아제의 양은 세포를 처리하는데 사용한 세린 프로테아제의 양과 상관관계가 있다.

대조군에 대한, src 티로신 키나아제 활성에서의 증가는 디스인테그린 메탈로프로테아제의 절단 및 방출후 포스포티로신에 특이적인 모노클로날 항체를 이용하여 세포내 단백질의 웨스턴 블롯 분석으로 측정한다. 대조군은 세린 프로테아제로 처리하지 않은 세포이다.

세포(또는 세포 배양물) 에서의 src 티로신 키나아제 활성은 문헌의 방법으로 측정한다. 또한 디스인테그린의 메탈로프로테아제 도메인의 방출은 문헌의 방법을 통해 모니터한다. 메탈로프로테아제 도메인의 방출과 세포내 src 티로신 케스케이드의 자극에 의한 디스인테그린-중재 세포 시그널링의 자극과 일치한다.

실시예 9

인테그린 결합은 서열 RGD 를 포함하는 펩티드로 측정한다. 세포간 유착분자의 억제, 또는 세포외 매트릭스 성분은 이러한 상호작용과 관련된 세포형상에서의 변화를 포함한 표현형 변화의 억제를 초래한다. 인테그린 결합은 현미경을 통해 볼수 있는 형태에서의 세포변화를 이용하여 경쟁분석을 통해 측정한다. 펩티드는 이러한 세포변화를 억제한다.

이 결과는 디스인테그린과의 경쟁 또는 상호작용의 차단과 일치한다. RGD 펩티드는 연골세포에서 세포변화를 억제한다. 증가된 매트릭스 합성 및 촉진된 매트릭스 메탈로프로테아제 활성을 특징으로 하는 골관절염 표현형은 발생하지 않는다. 기타 용이하게 분석가능한 세포변화는 유전자 발현, 유사분열활성에서의 변화등을 포함하는 상기의 결과를 모니터하는데 사용할 수 있다.

실시예 10

소분자량의 메탈로프로테아제 억제제를 사용하여 실시예 7 의 방법에 따른 조직 배양물을 처리한다. 세포막으로부터의 TNF-α의 방출은 문헌의 방법으로 측정한다. 실시예 7 의 억제제는 또한 세포막으로부터 분비된 TNF-α의 양을 감소시킨다.

따라서, 디스인테그린 메탈로프로테아제 활성의 억제는 디스인테그린 관련 염증 케스케이드 및 세크레타아제 활성의 억제를 초래할 것이 예기된다. 세포막으로부터의 사이토킨 또는 IL-1 의 방출등을 모니터하는것은 동일한 결과를 생성시킬 것으로 예기된다.

실시예 11

질병에 대한 특성적 표시 스크리닝

RNA 는 정상인의 관절 연골세포의 비자극 및 인터루킨-1 자극 배양물로부터 단리시킨다. RNA 는 cDNA 로 역전사시킨다. cDNA 는 전술한 프라이머를 이용하여 증폭시킨다 (PCR). 자극 및 비자극된 연골세포로부터 발생한 PCR 시료를 폴리아크릴아미드 겔상의 인접한 레인에서 전기영동시킨다. 특성적으로 발현된 밴드(즉, 단지 자극된 세포에서 발견되며, 비자극된 세포에서 현저한 또는 검출가능한 수준에서 발현되지 않는 밴드)를 겔로부터 절단한후, 클론시켜 부분적으로 시퀀싱시킨다. 부분 서열은 SEQ ID NO :5 에 나타내었고, 서열은 메탈로프로테아제에 대해 약 60% 의 상동성을 보이는 것으로 밝혀졌다. (상기참조). 서열은 인간 메탈로프로테아제에 대해 약 85% 상동성을 보이는 것으로 밝혀졌다 (참조 Gen Bank Acession #Z48579, 도 2참조).

실시예 12

종양의 전이 포텐셜에 대한 스크리닝

종양 조직을 메탈로프로테아제 유전자 발현에 대하여 시험한다. 시료유래의 추출된 핵산에 대하여 전술한 프라이머를 PCR 에서 사용한다. 고수준의 전사체는 전이 포텐셜을 시사한다.

실시예 13

발현 억제제에 대한 약제 스크리닝

메탈로프로테아제 유전자 발현의 후보 억제제는 실험관에서 스크리닝한다. 정상인 관절 연골세포의 인터루킨-1 자극 배양물은 실험관에서 후보 억제제에 노출시킨다. RNA 는 단리하여 cDNA 에 역전사시킨다. cDNA 는 전술한 프라이머를 이용하여 증폭시킨다 (PCR). 억제제에 노출된 연골세포 및 비억제된 연골세포로부터 발생한 PCR 시료는 폴리아크릴아미드 겔상의 인접 레인에서 전기영동시킨다. PCR 산물의 감소된 수준은 억제제를 동정케한다.

실시예 14

메탈로프로테아제 억제제에 대한 약제 스크리닝

메탈로프로테아제 자체의 후보 억제제는 실험관에서 스크리닝한다. 정상인 관절 연골세포의 인터루킨-1 자극 배양물의 배양 상층액은 후보 억제제의 존재 및 부재하에서 적합한 메탈로프로테아제 기질 (예, 매트릭스 단백질) 에 대해 분석하다. 공지된 억제제를 대조군으로서 사용한다 (예, 1,10-펜안트롤린, Sigma Co., St. Louis). 기질 (예, 형광발생 디스인테그린 메탈로프로테아제 기질) 분해의 감소된 수준은 억제제를 동정케한다.

실시예 15

1400BP 클론을 U-937, 단구유사 세포 cDNA 주 라이브러리로부터 표준 스크리닝 기술을 통해 단리시킨다. 최초 서열은 5' 말단의 일부가 누락된 끝이잘린 클론이다. 5' 말단을 공지된 기술인 5'R.A.C.E (Rapid Amplification of 5 cDNA Ends, 참조, 예, Chapter 4 (pages 28-38), and references therein of PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Innis, et al, eds. 1990 Academic Press) 로 발생시킨 결과, 잔류 5' 서열을 포함하는 1600 bp 클론이 발생한다. 이러한 두 서열은 함께 펩티드 서열이 유래하는 SEQ ID NO : 8 을 제공한다.

실시예 16

프라이머 SEQ ID NO : 9 (5'-AGCCTGTGTC-3') 및 SEQ ID NO : 10 (5'-AGCCTGTGTCTGAACCACT-3') 은 mRNA (ddrd-PCR) 의 특성적인 표시에 사용한다. 2-5ng 의 sscDNA 를 PCR 에서 사용한다. 반응물을 빙상에서 2.0㎕ 의 얇은벽의 튜브에서 예비냉각시킨다. 50mM TrisHCl (pH8.5), 50mM KCl, 1.5mM MgCl₂, 1mM 의 각각의 dNTP, 2-5ng 의 sscDNA, 10pmole 의 각각의 상기 프라이머, 0.5㎕ 의 α-P33 dCTP (10μCi/㎕, Amersham) 및 물을 20㎕ 로 각각의 튜브는 함유한다. 혼합물을 변성 (94℃ 에서 30초), 어닐링 (36℃ 에서 30초) 및 신장 (72℃ 에서 1분)의 35 주기를 Perkin-Elmer System 2400 Thermal Cycler (Perking-Elmer, Norwalk,CT) 를 이용하여 실시한다.

이러한 방법으로, IL-1 처리 연골세포는 이러한 유전자와 관련된 mRNA 를 발현시키는 반면, 비처리된 (IL-1 없음) 대조군 연골세포는 검출가능하지 않는 mRNA 를 발현시킨다.

실시예 17

고산출 스크리닝에 대해 수정가능한 분석 시스템

디스인테그린의 프로테아제 활성은 형광 기질을 이용하여 키네틱 효소 억제분석으로 측정한다. 클론된 디스인테그린 효소를 이용하고, 소분자량의 형광표식 단백질을 기질로서 사용한다. 효소활성은 실온에서의 기질 분자의 절단후 형광의 측정에 의해 정량화한다. 이러한 분석은 단순하고 자동화하기에 매우 용이하다. 표준기술을 이용하여, 이런 분석은 96 또는 384 웰 플레이트에 채택한다.

여기에 기술된 모든 참고문헌은 참고로 본 명세서에 포함되어 있다.

본 발명의 특정 구현예가 기재되어 있는 반면, 당업자에게는 본 발명의 다양한 변화 및 수정이 본 발명의 취지 및 범위로부터 벗어남이 없이 가능함이 명백해 질 것이다. 첨부된 청구범위에서, 본 발명의 범위내인 이러한 모든 수정이 포함된다.

서열목록

(1) 일반 정보 :

(i) 출원인 : 틴달, 마이클 에이치

하퀴, 타리큐 엠

(ii) 발명의 명치 : 신규의 디스인테그린 메탈로프로테아제, 이의 돌연변이체, 단편등의 용도

(iii) 서열의 수 : 11

(iv) 통신선 :

(A)수신인 : 더 프록터 앤드 갬블 컴퍼니

(B) 거리 : 8700 매슨-몽고메리 로드

(C)시 : 매슨

(D) 주: 오하이오

(E) 국각 ; 미국

(F) 우편번호 : 45040-9462

(v) 컴퓨터 판독 형태 :

(A) 매체형 : 프로피디스크

(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환성

(C) 작동시스템 : PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어 : PatentIn Release #1.0, Version #1.30

(vi) 현 출원 데이타 :

(A) 출원번호 :

(B) 출원일 :

(C) 분류 :

(viii) 대리인 정보

(A) 성명 : 헤이크 리차드 에이

(B) 등록번호:

(C) 참조번호 :

(ix) 통신정보 :

(A) 전화 : 513/622-0087

(B) 팩스 : 513/622-0270

(2) SEQ ID NO : 1 의 정보 :

(i) 서열특성 :

(A) 길이 :1824bp

(B) 형태 : 핵산

(C) 가닥 : 단일

(D) 토포로지 ; 선형

(ii) 분자 유형 : DNA (genomic)

(ix) 특징 :

(A) 명칭 : CDS

(B) 위치 : 2..1477

(xi) 서열의 기재방법 : SEQ ID NO : 1:

(2) SEQ ID NO : 2 의 정보 :

(i) 서열특성 :

(A) 길이 :492 아미노산

(B) 형태 : 아미노산

(D) 토포로지 ; 선형

(ii) 분자 유형 : 단백질

(xi) 서열의 기재방법 : SEQ ID NO : 2:

(2) SEQ ID NO : 3 의 정보 :

(i) 서열특성 :

(A) 길이 :2763bp

(B) 형태 : 핵산

(C) 가닥 : 단일

(D) 토포로지 ; 선형

(ii) 분자 유형 : DNA (genomic)

(ix) 특징 :

(A) 명칭 : CDS

(B) 위치 : 17..2414

(xi) 서열의 기재방법 : SEQ ID NO : 3:

(2) SEQ ID NO : 4 의 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 :799 아미노산

(B) 형태 : 아미노산

(D) 토포로지 ; 선형

(ii) 분자 유형 : 단백질

(xi) 서열의 기재방법 : SEQ ID NO : 4:

(2) SEQ ID NO : 5 의 정보 :

(i) 서열특성 :

(A) 길이 :239bp

(B) 형태 : 핵산

(C) 가닥 : 단일

(D) 토포로지 ;

(ii) 분자 유형 : DNA (genomic)

(iv) 안티센스 : 있음

(xi) 서열의 기재방법 : SEQ ID NO : 5:

(2) SEQ ID NO : 6 의 정보 :

(i) 서열특성 :

(A) 길이 :239bp

(B) 형태 : 핵산

(C) 가닥 : 단일

(D) 토포로지 ; 선형

(ii) 분자 유형 : DNA (genomic)

(xi) 서열의 기재방법 : SEQ ID NO : 6:

(2) SEQ ID NO : 7 의 정보 :

(i) 서열특성 :

(A) 길이 : 736bp

(B) 형태 : 핵산

(C) 가닥 : 단일

(D) 토포로지 ; 선형

(ii) 분자 유형 : DNA (genomic)

(xi) 서열의 기재방법 : SEQ ID NO : 7:

(2) SEQ ID NO : 8 의 정보 :

(i) 서열특성 :

(A) 길이 :2625bp

(B) 형태 : 핵산

(C) 가닥 : 단일

(D) 토포로지 ; 선형

(ii) 분자 유형 : DNA (genomic)

(ix) 특징 :

(A) 명칭 : CDS

(B) 위치 : 17..2263

(xi) 서열의 기재방법 : SEQ ID NO : 8:

(2) SEQ ID NO : 9 의 정보 :

(i) 서열특성 :

(A) 길이 : 749 아미노산

(B) 형태 : 아미노산

(D) 토포로지 ; 선형

(ii) 분자 유형 : 단백질

(xi) 서열의 기재방법 : SEQ ID NO : 9:

(2) SEQ ID NO : 10 의 정보 :

(i) 서열특성 :

(A) 길이 : 10bp

(B) 형태 : 핵산

(C) 가닥 : 단일

(D) 토포로지 ; 선형

(ii) 분자 유형 : DNA (genomic)

(xi) 서열의 기재방법 : SEQ ID NO : 10:

(2) SEQ ID NO : 11 의 정보 :

(i) 서열특성 :

(A) 길이 : 19bp

(B) 형태 : 핵산

(C) 가닥 : 단일

(D) 토포로지 ; 선형

(ii) 분자 유형 : DNA (genomic)

(xi) 서열의 기재방법 : SEQ ID NO : 11:

Claims (10)

1. 디스인테그린 길항, 약제 설계 및 스크리닝에 대한 스크린으로서 사용할 수 있는, 관절염 발생동안 특성적으로 발현되는 SEQ ID NO : 9 의 인간 디스인테그린 또는 이의 단편을 코딩하는 DNA 단편.
2. 본질적으로 순수 형태인, 제 1 항의 DNA 에 의해 코딩되는 인간 디스인테그린 또는 이의 단편.
3. 제 1 항의 디스인테그린을 함유하는, 인간 디스인테그린에 결합할 수 있는 화합물용 스크리닝 방법.
4. 제 1 항의 디스인테그린을 함유하는 인간 디스인테그린에 결합할 수 있는 화합물의 스크리닝 키트.
5. 제 2 항의 인간 디스인테그린에 대한, 항체 또는 이의 단편을 함유하는 골관절염용 스크리닝 키트.
6. 제 1 항의 DNA 를 함유하는 발현 벡터 또는 플라스미드.
7. SEQ ID NO : 8 에 기재된 서열을 함유하는, 제 1 항의 단리된 핵산 분자.
8. SEQ ID NO :10 및 SEQ ID NO : 11 으로 구성된 군으로 부터 선택된 프라이머를 이용하여 프라이머 신장으로 검출가능한 제 1 항의 핵산 분자.
9. 제 3 항에 있어서, 하기의 단계들을 특징으로하는 방법 :

   A) 메탈로프로테아제 유전자 발현의 후보 억제제에 연골세포의 인터루킨-1 자극 배양물의 일부를 노출시키는 단계;

   B) 메탈로프로테아제 유전자에 해당하는 mRNA 를 함유하는 RNA 를 상기 노출된 부분으로부터 단리하는 단계;

   C) 상기 노출된 부분에서 유래한 상기 메탈로프로테아제 유전자의 상기 mRNA 의 수준과 상기 비노출된 부분에서의 수준을 비교하는 단계; 및

   D) 억제제의 지시계로서의 상기 mRNA 의 감소된 수준을 관찰하는 단계.
10. 제 3 항에 있어서, 하기의 단계들을 특징으로 하는 방법 :

    A) 후보 억제제 및 대조군 억제제의 존재 및 임의의 억제제의 부재에서 육성한 정상인 관절 연골세포의 인터루킨-1 자극 배양물의 배양 상층액의 시료를 단리하는 단계;

    B)메탈로프로테아제 활성을 검출가능한 기질을 각각의 시료에 첨가하는 단계; 및

    C) 각각의 시료에 대한 메탈로프로테아제 활성의 수준을 검출하는 단계.