JP2001514494A

JP2001514494A - 新規なジスインテグリンメタロプロテアーゼ、変異体、フラグメントなどの使用

Info

Publication number: JP2001514494A
Application number: JP53694698A
Authority: JP
Inventors: ティンダル，マイケル，ハワード．; ハッキ，タリク，メイムード．
Original assignee: Procter and Gamble Co
Current assignee: Procter and Gamble Co
Priority date: 1997-02-25
Filing date: 1998-02-25
Publication date: 2001-09-11
Also published as: NO994056L; NO994056D0; EP0977775A2; WO1998037092A2; WO1998037092A3; CA2281085A1; HUP0100780A2; AU6181798A

Abstract

(57)【要約】本発明は、ジスインテグリンタンパク質に結合可能な化合物を同定する方法、ならびに試料中のジスインテグリンタンパク質に結合可能な化合物の量および親和性を測定する方法に関する。本発明はさらに、これらの目的に有用な、ジスインテグリンタンパク質に対する組換え発現ベクターを含有する宿主細胞、ジスインテグリンタンパク質をコードする組換え発現ベクター、およびヒトジスエンテグリンタンパク質、そのフラグメント、またはその変異体に関する。本発明は、さらに、キット形式での製造および使用が可能な、変形性関節症およびメタロプロテアーゼに基づくその他の疾患をｉｎｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏでスクリーニングする方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】新規なジスインテグリンメタロプロテアーゼ、変異体、フラグメントなどの使用発明の分野発明は、新規なタンパク質、そのフラグメント、および変異体に関するものであり、ならびに変形性関節炎およびメタロプロテアーゼのアップレギュレーションにより特徴づけられる他の疾患を含む疾患のための、検出および検査薬におけるそれの使用に関する。背景多くの酵素は、構造タンパク質を分解し、メタロプロテアーゼと構造的に関連する。これらには、ヒト皮膚繊維芽細胞コラーゲナーゼ、ヒト皮膚繊維芽細胞ゲラチナーゼ、ヒト痰コラゲナーゼおよびヒト痰ゲラチナーゼ、ならびにヒトストロメライシンが含まれる。Ｓ．Ｅ．Ｗｈｉｔｈａｍ他、Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｈｕｍａｎｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎａｎｄｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅｂｙｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ、ＢｉｏｃｈｅｍＪ.、２４０巻、９１３頁、１９８６年を参照して頂きたい。Ｇ．Ｉ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇ他、ＨｕｍａｎＦｉｂｒｏｂｌａｓｔＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ.、２６１巻、６６０頁、１９８６年も参照して頂きたい。金属依存性（例えば、亜鉛）は、「メタロプロテアーゼ」として知られる、これらの構造的関連性のある酵素の共通の特徴である。これらの酵素の生成および活性を制御することは、組織構築の正常な発達において、重要な役割を果たす。しかしながら、これらの酵素は、過度になると、結合組織の病理学的破壊を引き起こす。一般に、Ｊ．Ｓａｕｓ他、ＴｈｅＣｏｍｐｌｅｔｅＰｒｉｍａｒｙＳｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＨａｍａｎＭａｔｒｉｘＭｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ−３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ.、２６３巻、６７４２頁、１９８８年を参照して頂きたい。これらの多くが、アンジオテンシン変換酵素およびエンケファリナーゼのような、亜鉛含有メタロプロテアーゼである。コラーゲナーゼ、ストロメライシン、および関連酵素は、慢性関節リウマチ(Ｍｕｌｌｉｎｓ．Ｄ．Ｅ．他、ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ、６９５巻、１１７〜２１４頁、１９８３年)；変形性関節症(Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｂ．他、ＤｒｕｇｓｏｆｔｈｅＦｕｔｕｒｅ、１５巻、４９５〜５０８頁、１９９０年)；腫瘍細胞の転移(ｉｂｉｄ，Ｂｒｏａｄｈｕｒｓｔ，Ｍ．Ｊ．他、欧州特許出願第２７６，４３６号(１９８７年公開)、Ｒｅｉｃｈ，Ｒ他、４８ＣａｎｃｅｒＲｅｓ、３３０７〜３３１２へ頁、１９８８年) ；および種々の潰瘍状態を含む、多くの疾患症候群を仲介することにおいて重要である。アルカリやけどの結果として、またはシュードモナスアエルギノサ(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ)、アカントアメーバ(Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ)、単純ヘルペス(Ｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘ)、およびワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎｉａｖｉｒｕｓｅｓ）による感染の結果、角膜において潰瘍状態となる。実際に、ガン組織中でメタロプロテアーゼを測定すると、転移潜在能力（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃｐｏｔｅｎｔｉａｌ）と相関して、メタロプロテアーゼが増加していることが示唆される。Ｍ．Ｊ．Ｄｕｔｔｙ他、Ａｓｓａｙｏｆｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅｔｙｐｅ８ａｎｄ９ｂｙＥＬＩＳＡｉｎｈｕｍａｎｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、７１巻、１０２５頁、１９９５年）を参照して頂きたい。メタロプロテアーゼの望ましくない活性により特徴づけられるその他の疾患には、歯周疾患、表皮性水庖症、および強膜炎が含まれる。多くの疾病状態においてメタロプロテアーゼが関与していること考慮して、これらの酵素に対する阻害剤を調製する試みがなされてきた。多数のそのような阻害剤が文献に開示されている。本発明は、このプロテアーゼにより仲介されまたは調節される疾患の治療における活性を増大する、好ましくはこのプロテアーゼに特異的な、新規な阻害剤を提供することを試みる。メタロプロテアーゼ阻害剤は、少なくとも部分的には、構造タンパク質の分解により引き起こされる疾患の治療に有用である。種々の阻害剤が調製されてきたが、そのような疾患を治療する薬をデザインするためのメタロプロテアーゼ阻害剤スクリーンに対する絶え間ないニーズがある。多くの疾患状態とマトリクスメタロプロテアーゼとの関連性から、これらの酵素の阻害剤を同定する試みがなされてきた。例えば、ＴａｐＩ−２および１，１０−フェナントロリンは、メタロプロテアーゼ阻害剤として知られている。Ｊ．Ａｒｒｉｂａｓ他、ＤｉｖｅｒｓｅＣｅｌｌＳｕｒｆａｃｅＰｒｏｔｅｉｎＥｃｔｏｄｏｍａｉｎｓＡｒｅＳｈｅｄｂｙａＳｙｓｔｅｍＳｅｎｓｉｔｉｖｅｔｏＭｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒｓ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ.、２７１巻、１１３７６頁、１９９６年）を参照して頂きたい。メタロプロテアーゼは、非常に種々の機能を有する、広い分類のタンパク質である。ジスインテグリン（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ）は、亜鉛メタロプロテアーゼであり、ヘビ毒液に豊富にある。哺乳動物のジスインテグリンは、約１８個の既知の亜族を有するタンパク質のファミリーである。これは、細胞接着を破壊するものとして作用し、そして再生産（例えば、精子による卵の受精（それらの融合を含む）および精子の成熟）に活性であることも知られている。これらのプロテアーゼおよび他の多くのものは、分子生物学および生物化学において明らかにされていない。結果として、遺伝子配列の保存先の遺伝子バンクにより、ジスインテグリンのフラグメントをコードするとされるものを含む、いくつかのメタロプロテアーゼの配列が提供されている。例えば、１９９４年２月２５日付けの遺伝子バンク登録番号Ｚ４８４４４では、ラットジスインテグリンメタロプロテアーゼ遺伝子であるとされるラット遺伝子のヌクレオチド２４０７個を開示し、１９９５年３月２日付けの遺伝子バンク登録番号Ｚ４８５７９では、ヒトジスインテグリンメタロプロテアーゼ遺伝子であるとされる遺伝子の部分ヌクレオチド１８２４個を開示し、１９９４年８月２５日付けの遺伝子バンク登録番号Ｚ２１９６１では、ウシ亜鉛プロテアーゼ遺伝子であるとされる遺伝子の部分ヌクレオチド２３９７個を開示している。非常に種々のメタロプロテアーゼがあるゆえ、ｉ）特定のメタロプロテアーゼを特異的に検出する方法、およびｉｉ）阻害剤候補を同定する方法に対して絶え間ないニーズがある。メタロプロテアーゼを特異的な疾患状態に関与させること、およびそのような疾患を検出し、最終的には治療し、制御し、治療法をデザインするためのツールとしてこれらのメタロプロテアーゼを用いることは好都合であろう。本発明の目的本発明の目的は、ジスインテグリンタンパク質に結合可能な化合物を同定する方法を提供することである。本発明の目的は、さらに、ジスインテグリンタンパク質をコードする組換え発現ベクターを含有する宿主細胞、およびジスインテグリンタンパク質をコードする組換え発現ベクターを提供することである。本発明の目的は、ガン、関節症（強直性脊椎炎、慢性関節リウマチ、痛風性関節炎(痛風)、炎症性関節炎、ライム病、および変形性関節炎を含む）などのメタロプロテアーゼが仲介する疾患をスクリーニングする方法を提供する。本発明の目的はさらに、スクリーンにおいて有用な、タンパク質の単離において有用な、またはタンパク質の標的部分として有用な、タンパク質に対する抗体を提供することである。本発明の要旨本発明は、ジスインテグリンメタロプロテアーゼに結合可能な化合物を同定する方法と、試料中のジスインテグリンタンパク質に結合可能な化合物の量および親和性を測定する方法とを提供する。本発明はさらに、ジスインテグリンタンパク質に対する組換え発現ベクターを含有する宿主細胞と、これらの目的に有用な、ジスインテグリンタンパク質に対する組換え発現ベクターを含有する宿主細胞、本発明はさらに、これらの目的に有用な、ジスインテグリンタンパク質をコードする組換え発現ベクターを含有する宿主細胞、ジスインテグリンタンパク質をコードする組換え発現ベクター、およびヒトジスエンテグリンタンパク質、そのフラグメント、またはその変異体とを提供する。本発明はさらに、キット形式での製造および使用が可能な、変形性関節症およびメタロプロテアーゼに基づくその他の疾患をｉｎｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏでスクリーニングする方法を提供する。詳細な説明「遺伝子」という用語は、成熟タンパク質またはその前駆体を生成するのに必要な制御配列およびコード配列を含有するＤＮＡ配列をいう。タンパク質は、所望の酵素活性を保持する限り、全長コード配列によりコードされていても、該コード配列のいずれかの部分によりコードされていてもよい。本明細書中で用いられる「オリゴヌクレオチド」という用語は、２つまたはそれ以上の、通常は３より多い、典型的には１０より多い、最高で１００またはそれ以上の（しかしながら、２０から３０の間が好ましい）デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドから構成される分子として定義する。正確なサイズは、オリゴヌクレオチドの第一義的な機能または用途に依存する、多くの要因に依存する。オリゴヌクレオチドは、化学合成、ＤＮＡ複製、制限エンドヌクレアーゼ消化、逆転写、またはそれらの組み合わせを含む、任意の方法で生成することができる。１つのモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸が、ホスジエステル結合を介して、一方向に、近くのモノヌクレオチドペントース環の３’酸素に結合される方法で、モノヌクレオチドが反応してオリゴヌクレオチドがつくられるゆえ、オリゴヌクレオチドの末端は、５’リン酸がモノヌクレオチドペントース環の３ ’酸素に結合されない場合を「５’末端」とし、３’酸素が次のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸に結合されない場合を「３’末端」とする。本明細書中に用いる核酸配列は、より大きいオリゴヌクレオチドに対し内部にある場合でさえ、５’末端および３’末端を有するということができる。２つの異なるオーバーラップしないオリゴヌクレオチドが、同じ直鎖の相補的核酸配列の異なる領域とアニールし、一方のオリゴヌクレオチドの３’末端が他方のオリゴヌクレオチドの５’末端の方向に向いている場合、前者を「上流」のオリゴヌクレオチドといい、後者を「下流」のオリゴヌクレオチドということができる。「プライマー」という用語は、プライマーの伸長が開始される条件下に置かれたとき、合成の開始点として作用することが可能であるオリゴヌクレオチドをいう。オリゴヌクレオチド「プライマー」は、精製した制限消化物のような天然に存在するものでも、あるいは合成して作製したものでもよい。鋳型の特異的配列の鎖に「実質的に」相補的であるプライマーを選択する。プライマーは、プライマーが伸長するための鋳型鎖とハイブリダイゼーションするのに充分に相補的でなければならない。プライマー配列は、鋳型の正確な配列を反映する必要はない。例えば、プライマー配列の残り部分が実質的に鎖に相補的であるならば、非相補的なヌクレオチドフラグメント断片をプライマー５’末端に付着することができる。プライマー配列が、プライマー伸長産物の合成を目的としてハイブリダイズしそれにより鋳型−プライマー複合体を形成するのに鋳型の配列と充分に相補的であるならば、非相補的な塩基またはより長い配列をプライマー中に散在することもできる。「ハイブリダイゼーション」法は、標的核酸（検出する配列）に相補的な配列をアニールすることを伴う。相補的配列を含有する２つの核酸ポリマーが、互いに出会って、塩基対相互作用によりアニールすることができることは、よく理解されている現象である。ＭａｒｍｕｒおよびＬａｎｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、４６巻、４５３頁、１９６０年、ならびにＤｏｔｙ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、４６巻、４６１頁、１９６０年による「ハイブリダイゼーション」法の最初の観察に続き、この方法は精巧なものとされ、近代生物学の必須のツールとなった。それにもかかわらず、多数の問題が、ヒトの診断におけるツールとして、ハイブリダイゼーションの幅広いスケールでの使用を妨げている。より困難な問題の中には、１）ハイブリダイゼーションの非効率、２）ゲノムＤＮＡ混合物中の特異的標的配列の濃度の低さ、および３）単に部分的に相補的なプローブと標的物とのハイブリダイゼーションがある。効率性に関しては、ハイブリダイゼーション反応では、プローブ−標的複合体の起こり得る数の一部だけ形成されることが、実験において観察される。このことは、特に、短いオリゴヌクレオチド（長さが１００塩基未満）についても当てはまる。ａ）２次構造相互作用または３次構造相互作用ゆえに、ハイブリダイゼーションが起こらないこと、ｂ）標的配列を含有するＤＮＡ鎖が、該ＤＮＡ鎖の相補鎖に再びハイブリダイズすること(再びアニールすること)、および、ｃ）ある標的分子は、固体表面に標的核酸を固定化したハイブリダイゼーションフォーマットにおいて用いられる場合に、ハイブリダイゼーションを妨げられること、の３つの基本的な原因がある。プローブ配列が、標的配列すなわち標的物の一次構造に完全に相補的である場合あっても、高次構造の再配列により標的配列がプローブに接近するようにする必要がある。これらの高次構造の再配列は、分子の２次構造または３次構造のいずれかに関わるものであってよい。２次構造は、分子内結合により定められる。ＤＮＡまたはＲＮＡ標的の場合、これは、（２つの異なる鎖のハイブリダイゼーションとは対照的に）１つの連続的な塩基鎖内でのハイブリダイゼーションから成る。分子内結合の程度および位置に応じて、プローブを、ハイブリダイゼーションを妨げている標的配列と置換することができる。より長い標的相補鎖が再生しまたは再びアニールすることができるという事実により、オリゴヌクレオチドプローブと変性した二本鎖ＤＮＡとの溶液ハイブリダイゼーションは、さらに複雑である。ハイブリダイズしたプローブは、この過程により再び置換される。これにより、プローブおよび標的の出発濃度に相関して、ハイブリダイゼーション生成率は低くなる(「適用される範囲」は低くなる)。標的配列の濃度が低いことに関しては、標的配列を含有するＤＮＡフラグメントは通常、ゲノムＤＮＡ中での相対的存在比が低い。これは、大きな技術的困難性を示している。オリゴヌクレオチドプローブを用いる慣用技術のほとんどは、そのような低濃度でハイブリダイゼーションを検出するのに必要な感受性を欠く。溶液での標的配列の低濃度の問題に対する試みは、検出する指標を増幅することである。これは非常にしばしば、１つまたは複数の標識をオリゴヌクレオチドプローブ上に配置することを伴う。非放射線活性標識の場合、最も親和性のある試薬でさえ、オリゴヌクレオチドプローブを用いて、ゲノムＤＮＡ中の単一コピー遺伝子を検出するには適していないことが判明している。Ｗａｌｌａｃｅ他、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、６７巻、７５５頁、１９８５年を参照して頂きたい。放射線活性オリゴヌクレオチドプローブの場合、非常に高い特異的活性だけが、満足する結果を示すことが判明している。ＳｔｕｄｅｎｃｋｉおよびＷａｌｌａｃｅ、ＤＮＡ、３巻、１頁、１９８４年、およびＳｔｕｄｅｎｃｋｉ他、ＨｕｍａｎＧｅｎｅｔｉｃｓ、３７巻、４２頁、１９８５年を参照して頂きたい。本明細書中に引用により取り入れるＫ．Ｂ．Ｍｕｌｌｉｓ他、Ｕ．Ｓ．特許第４，６８３，１９５号および４，６８３，２０２号には、クローニングまたは精製を行わずに、あらゆるＤＮＡ混合物中における標的配列セグメントの濃度を増加する方法が記載されている。標的配列を増幅するこの方法（該方法は、標的分子を作製するために、本発明と結びつけて用いられる）は、大量の過剰な２つのオリゴヌクレオチドプライマーを所望の標的配列を含有するＤＮＡ混合物に入れること、続いてＤＮＡポリメラーゼの存在下における厳密な配列の熱的サイクルから成る。２つのプライマーは、二本鎖標的配列の各々の鎖に相補的である。増幅を行うため、混合物を変性し、次いでプライマーを標的分子内の相補的な配列にアニールする。アニール後、プライマーを伸長して、新たな一対の相補鎖を形成する。変性、プライマーのアニール、およびプライマーの伸長の工程は、何回も繰り返され(すなわち、変性、アニール、および伸長は、１「サイクル」を構成し、非常に多数の「サイクル」が可能である)、高濃度の、所望する標的配列の増幅セグメントを得ることができる。標的配列の増幅セグメントの長さは、お互いのプライマーの相対的位置により決定される。したがって、この長さは、制御可能なパラメーターである。該手順の繰り返しゆえに、該方法は、発明者により「ポリメラーゼ連鎖反応」(以下、本明細書中でＰＣＲ)として言及されている。所望する標的配列増幅セグメントは、混合物中で（濃度に関して）主な配列となるゆえ、それらは「ＰＣＲ増幅」という。ＰＣＲを用い、異なるいくつかの方法（例えば、標識プローブを用いてハイブリダイゼーションすること；ビオチン化プライマーを導入し、続いてアビジン‐ 酵素結合の検出すること；³²Ｐ標識したデオキシリボヌクレオチド３リン酸（例えば、ｄＣＴＰまたはｄＡＴＰ）を増幅セグメントに導入すること）により、検出可能なレベルまで、ゲノムＤＮＡ中の特異的な標的配列の単一コピーを増幅することが可能である。ゲノムＤＮＡだけでなく、あらゆるオリゴヌクレオチド配列を、適当なプライマー分子の組を用いて増幅することができる。特に、ＰＣＲ自体によりつくり出された増幅セグメントは、それ自体、次のＰＣＲ増幅での有効な鋳型である。ＰＣＲ増幅法では、特異的配列が、上下変動がほとんどなくなる約１０^-8Ｍの濃度に達することが知られている。典型的な反応体積は、１００μｌであり、６ ×１０¹¹個の二本鎖産物分子の収量に対応する。相補性に関しては、ハイブリダイゼーションが、完全相補性を示しているのか、または部分相補性を示しているのかを判断することが、ある種の診断用途において重要となる。例えば病原性のＤＮＡまたはＲＮＡ（ウイルス、バクテリア、菌類、マイコムラズマ、原生動物などに由来するもの）の存在または非存在を単に測定することを望む場合には、問題とされる配列が存在する場合に、ハイブリダイゼーション法により、ハイブリダイゼーションを確保することだけが重要であり、この場合、部分的に相補的なプローブおよび完全に相補的なプローブの双方がハイブリダイズする条件の選択が可能である。しかしながら、別の診断用途では、ハイブリダイゼーション法が、部分相補性と完全相補性とを区別することが要求される。これは、遺伝子の多型性を検出するのに重要である。例えば、ヒトヘモグロビンは、主に、４つのポリペプチド鎖から成る。これらの鎖の中の２つは、アミノ酸１４１個の同一の鎖（アルファ鎖）であり、これらの鎖の中の２つは、アミノ酸１４６個の同一の鎖（ベータ鎖）である。ベータ鎖をコードする遺伝子は、多型性を示すことが知られている。正常な対立遺伝子は、第６番目の位置にグルタミン酸を有するベータ鎖をコードしている。変異型の対立遺伝子は、第６番目の位置にバリンを有するベータ鎖をコードしている。アミノ酸におけるこの値の違いは、臨床上鎌状赤血球性貧血として知られる、意義深い（個々が変異型の対立遺伝子に対してホモ接合である場合に最も意義深い）生理学的影響力を有する。アミノ酸変化の遺伝子的な根拠は、正常な対立遺伝子ＤＮＡ配列と変異型の対立遺伝子ＤＮＡ配列との間の１塩基の差に関係する。他の技術（制限酵素分析など）を組み合わさせない限り、完全相補性だけでなく部分相補性の双方の場合において同じレベルのハイブリダイゼーションを可能とする方法は、プローブが正常な標的配列および異型の標的配列の双方にハイブリダイズするような用途には、一般に適していない。ハイブリダイゼーションは、用いる方法にかかわらず、分析する配列（標的配列）と検査を行うために用いるＤＮＡフラグメント（プローブ）との間に、ある程度の相補性を必要とする。（全く相補性がなくても結合が得ることができるが、この結合は特異的でなく、除外されることは当然である。）本明細書中で用いる核酸配列の相補物は、一方の配列の５’末端が他方の配列の３’末端と対になるように核酸配列にアラインした場合に「逆平行関係」にあるオリゴヌクレオチドを指す。天然の核酸では一般に見い出されないある塩基を、本発明の核酸配列に含めることができ、該塩基には、例えば、イノシンおよび７−ジアザグアニジンが含まれる。相補性は完全である必要はなく、安定な二本鎖には、ミスマッチな塩基対または対合しない塩基が含まれていてもよい。核酸技術分野の当業者は、例えば、オリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチドの塩基組成および塩基配列、イオン強度、ならびにミスマッチな塩基対の発生率を含む多くの変化要素を経験的に考慮して、二本鎖の安定性を決めることができる。融解温度すなわち「Ｔ_m」により、核酸二本鎖の安定性を測定する。特異的な条件下における特定の核酸二本鎖のＴ_mは、平均で半分の塩基対が解離する温度である。核酸のＴ_mを計算するための式は、当該技術分野で周知である。鎖の引用により示されるように、Ｔ_mの概算値は、Ｔ_m−８１．５℃＋１６．６ｌｏｇＭ＋．４１（％ＧＣ） −０．６１（％形態）−５００／Ｌの式により計算される。式中、Ｍは、一価のカチオンであり、％ＧＣは、ＤＮＡ中のグアノシンヌクレオチドおよびシトシンヌクレオチドの百分率であり、％形態は、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの百分率であり、そしてＬは、ハイブリッドの塩基対長である(例えば、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１５２巻、４０１頁、１９８７年におけるＧｕｉｄｅｔｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｓ．Ｌ．ＢｅｒｇｅｒおよびＡ．Ｒ．Ｋｉｍｍｅｌ編を参照して頂きたい)。本明細書中で用いられる「プローブ」という用語は、プローブ中の少なくとも１つの配列が核酸中の他方の配列と相補的であるゆえ、核酸中のもう一方の配列と二本鎖構造を形成する、標識したオリゴヌクレオチドをいう。本明細書中で用いられる「標識」という用語は、検出可能な（好ましくは定量化が可能な）シグナルを提供するのに用いることができ、そして核酸またはタンパク質に結合することができる、あらゆる原子または分子をいう。標識は、蛍光、放射線活性、比色、重量測定、Ｘ線の散乱または吸収、磁気、および酵素活性などの検出可能なシグナルを提供することができる。このような標識を、本発明のオリゴヌクレオチドに付加することができる。「核酸基質」および「核酸鋳型」という用語は、本明細書中で互換的に用いられ、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡを含むことができる核酸分子をいう。「実質的に一本鎖である」という用語は、核酸基質に関する引用で用いる場合、鎖間塩基対相互作用によりつなぎ合わさっている２つの核酸鎖として存在している二本鎖基質とは対照的に、基質分子が、主に１つの核酸鎖として存在していることを意味する。本明細書中で用いられる「配列変化」という用語は、２つの核酸鋳型間での核酸配列の相違をいう。例えば、野生型構造遺伝子およびこの野生型構造遺伝子の変異型では、１塩基置換の存在することにより、および／または１つもしくは複数のヌクレオチドの欠失または挿入により、配列が変化している。これら２つの形態の構造遺伝子では、互いに配列が変化しているという。さらに別の変異型の構造遺伝子も存在することができる。この別の変異型は、野生型遺伝子および該遺伝子の最初の変異型の双方で、配列形態が変化しているという。本発明では、１つまたは複数の遺伝子形態間で比較を行って配列変化を検出することは必要ではないが、引用により本明細書中に取り入れられる米国特許出願番号第０８／２３１，４４０号に記載されている特定のハイブリダイゼーション条件を用いて、本発明のオリゴ／固体支持マトリクスを用いてそのような比較が可能であることは、注記すべきことである。「遺伝子配列と対合しまたは相補的であるオリゴヌクレオチドプライマー」は、一本鎖核酸または二本鎖核酸の鋳型依存性の合成を容易にすることができるオリゴヌクレオチドプライマーをいう。遺伝子配列に対合しまたは相補的であるオリゴヌクレオチドプライマーは、ＰＣＲや逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）などに用いることができる。「コンセンサス遺伝子配列」は、２つ以上の遺伝子配列の比較により得られる遺伝子配列であって、所定の遺伝子セグメント中に非常にしばしば存在するヌクレオチドを表す遺伝子配列をいう。コンセンサス遺伝子配列は、基準の配列である。本明細書中で用いる「タンパク質」および「プロテアーゼ」という用語は、メタロプロテアーゼをいう。「メタロプロテアーゼ」という用語は、ネイティブの金属依存性プロテアーゼ、またはその機能を依然として保持している、そのフラグメント、変異体、もしくはホモログである。本発明は、組換え法、ｉｎｖｉｔｒｏ法、または標準的なペプチド合成により調製される、異なる種に由来するメタロプロテアーゼ（または「ジスインテグリン」）を企図している。該タンパク質は、ヒトジスインテグリンまたはそれらの変異体であることが好ましい。タンパク質の変異体を定義する目的のため、好適な「ネイティブ」のタンパク質が、遺伝子バンク登録番号Ｚ４８５７９に部分記載されており、この内容を本明細書中に引用により取り入れ、以下の配列において引用する。ホモログジスインテグリンには、当該技術分野で理解されているように、少なくとも９０％が相同である全タンパク質、またはそのフラグメントが含まれる。種間において、挿入または欠失を含むある変化が起こることが認められており、該変化は機能を変えても、変えなくてもよいものである。例えば、ペプチド配列に基づき該タンパク質と９５％相同であるラットタンパク質、および最初の３００塩基対に基づき９７〜９８％相同であるウシタンパク質（ＤＮＡ配列に基づく）は、双方ともホモログと認められる。１９９４年２月２５日の引用の遺伝子バンク登録番号Ｚ４８４４４号では、ラットジスインテグリンメタロプロテアーゼ遺伝子と述べている２４０７塩基のラット遺伝子が開示され、１９９４年８月２５日付けの遺伝子バンク登録番号Ｚ２１９６１号では、ウシ亜鉛メタロプロテアーゼ遺伝子とされる遺伝子配列の２３９７塩基の部分配列が開示されている。このメタロプロテアーゼは、下記のようにヒトジスインテグリンであることが好ましい。「抗体」という用語は、ジスンテグリンに対する抗体、またはそのフラグメントをいう。これらの多くはモノクローナルおよびポリクローナルであり、いくつかの起源のいずれからも得ることができる。本発明は、タンパク質技術分野またはペプチド枝術分野のいずれかの方法により作製される、これらの抗体のフラグメントをも企図している。「疾患スクリーン」という用語は、疾患または疾患状態のスクリーンに関する。疾患状態は、生理学的な、細胞の、または生化学的な疾患症状発現である。ＥＬＩＳＡなどの標準的な技術を用いて、体組織または動物培養流もしくは細胞培養流でこのスクリーンを用いることが好ましい。この疾患スクリーンは、全身的に投与された上記の標識抗体などによる全身における疾患の「マッピング」も企図しており、検出方法にかかわらないが、そのような検出方法には、蛍光、Ｘ線 (ＣＡＴスキャンを含む)、ＮＭＲ（ＭＲＩを含む）などが含まれることが好ましい。「化合物スクリーン」という用語は、化合物を見つけ出すこと、プロテアーゼに対する化合物の親和性を測定すること、またはスクリーンに基づいて化合物をデザインしもしくは選択することとに関する、方法およびスクリーンに関する。別の態様において、「化合物スクリーン」という用語は、当該技術分野で認められているような、ドラッグデザイン、好ましくは「合理的なドラッグデザイン」用の３次元構造の使用を企図している。プロテアーゼは、「本質的に純粋な形態」であることが好ましいが、「本質的に純粋な形態」とは、実験または特性決定において有効なものとなるように妥当な範囲で（ｒｅａｓｏｎａｂｌｙ）他の不純物を含まないタンパク質を指す。このスクリーニング方法を用れば、プロテアーゼに結合する、好ましくはプロテアーゼを阻害する、化学者によりまたは天然でつくられたか否かにかかわらない、新規な構造を見つけ出すことにおいて、当業者の手助けとなる。これらの「阻害剤」は、プロテアーゼ活性の制御または調節に有用なものとすることができ、したがってこれらが機能する生物学的カスケードの調節に用いることができる。「ジスインテグリン」という用語は、ジスインテグリン、またはその機能を保持する、そのフラグメント、その変異体、もしくはそのホモログをいう。この用語は、アグレカナーゼ(ａｇｇｒｅｃａｎａｓｅ)、および組織リモデリングに関連しまたはこれを調節する他のプロテアーゼを企図する。これは、組換え法、ｉｎｖｉｔｒｏ法、または標準的なペプチド合成により調製される、異なる種由来のジスインテグリンを企図する。タンパク質は、ヒトジスインテグリンまたはそれらの変異体であることが好ましい。タンパク質の変異体を定義する目的のために、好適な「ネイティブ」のタンパク質が、遺伝子バンク登録番号Ｚ４８５７９に部分記載されており、この内容を本明細書中に引用により取り入れ、以下の配列において引用する。配列番号１は、そのＤＮＡ配列のフラグメントとその転写物を記載したものであり、配列番号２は該遺伝子によりコードされるタンパク質を記載したものである。ホモログジスインテグリンには、当該技術分野で理解されているように少なくとも９０％相同である全タンパク質、またはそのフラグメントが含まれる。例えば、アミノ酸配列に基づき、配列番号１を含有するＤＮＡまたはｃＤＮＡに由来する配列番号２のタンパク質と９５％相同であるラットタンパク質、および９７〜９８％相同であるウシタンパク質（同様の由来）は、双方ともホモログと認められる。他の有機体からクローニングされるホモログｃＤＮＡは、ホモログのタンパク質を産生する。同様に、アミノ酸配列のみに基づいて、タンパク質をホモログと認められることができる。アミノ酸シークエンスの実際的な制限により、例えば、タンパク質の最初の５０個のアミノ酸を比較して、タンパク質が他のものと相同であるかを決定することができる。したがって、９０％の相同では、ホモログタンパク質の最初の５０個のアミノ酸鎖中に５個の異なるアミノ酸が許容される。縮重した遺伝子コードは、異なるＤＮＡ配列に対して、同等の転写物、したがって同じタンパク質を提供することを、当業者は理解している。ある場合において、同じタンパク質をコードするが、ネイティブなＤＮＡとは異なるＤＮＡ配列の調製には、 −−−シークエンスまたは合成を容易にすること、 −−−タンパク質の発現を増加させること、および −−−ある種の異種宿主はある種のコドンを他よりも好むことを考慮に入れる。これらの実際的な考慮は周知であり、本発明の使用者に有益となる実施態様を提供する。したがって、ナイティブのＤＮＡは、本発明で想定される唯一の実施態様ではないことを明確に企図している。さらに、タンパク質フラグメントは、スクリーニングやドラッグデザインなどに有用なものとすることができ、タンパク質全体が本発明の使用には必ずしも必要ではないことは、当業者に明らかであろう。したがって、タンパク質およびそれの使用の開示が、有用なペプチドフラグメントを企図していることを当業者が理解しているということは明らかに企図されている。タンパク質の発現、精製の収率、安定性、および溶解性などの実際的な考慮は、フラグメントを用いるか否かを選択するとき、および用いるフラグメントを選択するときに、当業者により考慮される。結果として、この開示があれば、当該技術分野における日常的な操作を用いて、当業者はタンパク質のフラグメントを用いた本発明を実施することができる。したがって、本発明はさらに、遺伝子の核酸配列全体より少ない配列の使用、およびタンパク質のアミノ酸配列全体より少ない配列の使用を具体的に企図している。タンパク質フラグメントをスクリーニングやドラッグデザインなどで用いることができ、タンパク質全体は本発明を使用するためには必ずしも必要ではない。タンパク質自体を用いて、該タンパク質に対する低分子の結合活性を測定することができる。酵素標的を用いるドラッグスクリーニングは、当該技術分野で用いられており、自動化された高処理技術を用いて行なうことができる。タンパク質自体またはプロテアーゼ自体を用いて、タンパク質に対する低分子の結合活性を測定することができる。酵素標的を使用したドラッグスクリーニングは、当該技術分野で用いられており、自動化された高処理技術を用いて行なうことができる。ジスインテグリン活性の阻害は、変形性関節症の治療、および関節軟骨の変性や組織リモデリングなどのマトリクス分解を有する他の組織の変性を伴う疾患の治療における効力の予測変数となることができる。遺伝子治療理論に拘束されるものではないが、メタロプロテアーゼは、組織での変形性関節症の際、アップレギュレートであると考えられる。驚くべきことに、我々は、ヒトジスインテグリンが、変形性関節症の状態の際、ヒト軟骨細胞中でアップレギュレートであることを見つけ出した。シグナル形質導入の機構を阻害することは、変形性関節症でのカスケード反応の途絶、および軟骨の変性を伴うその他の疾患において有効である。アップレギュレートが関節症発症の原因である場合、この遺伝子の活性を妨げることは変形性関節症の治療に有効なものとすることができることを、当業者は理解している。これは、遺伝子（すなわちアンチセンス）治療を含む、いくつかの方法のいずれによっても行われる。プロテアーゼの精製組換えジスインテグリン、または全長該タンパク質のフラグメントを含有する、哺乳動物、酵母、昆虫、または真核細胞から得られる培地、細胞抽出物、または封入体を、ジスインテグリンまたはジスインテグリンフラグメントの精製に用いる。連続的なクロマトグラフィー樹脂による精製の前、または分離の最終段階の後に、変性ジスインテグリンから成る溶液をリホールドする。所望ならば、オクチルグルコシド、尿素、またはジメチルスルホキシドなどの界面活性剤、変性剤、または有機溶媒の１つまたは組み合わせの存在下で、培地、細胞抽出物、または可溶化ジスインテグリンを調製する。不純となっている細胞材料から組換えジスインテグリンを分離するために、イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーを、それぞれまたは組み合わせて用いる。このような物質をカラムにアプライし、そしてｐＨの調整、イオン強度の変化、変性剤の添加、および／または有機溶媒の使用により、ジスインテグリンを溶離する。一般的には、次いで、ジスインテグリンの部位特異的な精製のために、ジスインテグリン含有溶液を、イムノアフィニティーカラムまたはリガンドアフィニティーカラムに通す。イムノアフィニティーカラムは、セファロース４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）にまたは別の類似基材などの固体支持体に固定化された、ジスインテグリンに特異的な抗体を含む。好ましくは、カラムを洗浄して結合していないタンパク質を取り除き、そして低ｐＨグリシンバッファーまたは高イオン強度によりジスインテグリンを溶離する。リガンドアフィニティーカラムは、ジスインテグリンの活性部位、または活性部位に近接したもしくは活性部位を除去した部分に特異性を有することができる。カラムを洗浄し、そして溶離バッファーに競合分子を添加することによりジスインテグリンを溶離する。ベンズアミジン、ルペプチン(ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ)、ホスホルアミドン(ｐｈｓｐｈｏｒａｍｉｄｏｎ) 、フッ化フェニルメチルスルホニル、および１，１０−フェナントロリンなどの１つまたは複数のプロテアーゼ阻害剤を含有するプロテアーゼ阻害剤のカクテルは、精製処理全体を通して存在することが好ましい。オクチルチオグルコシドおよびトライトンＸ−１００またはグリセロールなどの化学剤を添加して、ジスインテグリンの溶解性および安定性を増大することもできる。所望ならば、タンパク質の最終精製を、クロマトグラフィー支持体を通してゲル濾過により行う。プロテアーゼ阻害剤本発明プロテアーゼを用いて、プロテアーゼの阻害剤を見つけ出すことができる。したがって、本発明プロテアーゼは、スクリーニングのツールとして、または合理的なドラッグデザインに有用である。理論に拘束されるものではないが、プロテアーゼは、細胞のリモデリングを調節することができ、実際に細胞外マトリクスのリモデリングを促進し、したがって組織分解を促進することができる。したがって、ジスインテグリンの阻害は、これらの過程により特徴づけられる疾患の治療に対する治療ルートを提供するものである。スクリーニングにおいて、薬化合物を用いて、阻害の特質および量の双方を測定することができる。結果として、スクリーニングは、これらの疾患の治療に有用な活性体、好ましくは低分子活性体の選択についての情報を提供する。治療において、低分子量の合成メタロプロテアーゼ阻害剤（マトリクスメタロプロテアーゼを阻害することに用いるものなど）を結合することにより、ジスインテグリンメタロプロテアーゼ活性を阻害することを用いれば、細胞外マトリクスのリモデリングを阻害するであろう。タンパク質に対する抗体メタロプロテアーゼ阻害剤を抗体またはそのフラグメントに結合することにより、メタロプロテアーゼを標的とすることができる。結合方法は、当該技術分野で知られている。次いで、これらの抗体は、治療および阻害剤用量をモニターすることの双方に有用である。本発明の抗体を、固体支持体に結合することもできる。所望のメタロプロテアーゼ、好ましくはジスインテグリンの精製用の親和性試薬として、これらの結合物を用いることができる。別の態様において、標識と本発明の抗体を直接結合することができる。抗体がメタロプロテアーゼに結合しているとき、該標識を用いて、ｉｎｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏ細胞培養物中の比較的高レベルのメタロプロテアーゼの存在を検出することができる。例えば、意図する標的組織のマーカーと特異的に反応する、標的リガンドを用いることができる。本発明化合物を標的リガンドに結合する方法は周知であり、担体への結合方法（下記）と同様である。結合物を製剤化し、上記のように投与する。抗体の調製および使用いくつかの方法により抗体を産生することができ、例えば、タンパク質をマウスやウサギなどを含む適当な（例えば、哺乳動物）対象に注射する。好適なプロトコルには、血清中の抗体の産生を増進する計画にしたがって、アジュバント存在下で免疫原を繰り返し注射することが含まれる。今や当該技術分野で標準的なイムノアッセイ方法を用いて、免疫血清のタイターを容易に測定することができる。得られた抗血清を直接使用し、または、抹消血リンパ球もしくは免疫された動物の脾臓を回収して抗体産生細胞を不死化することによりモノクローナル抗体を得て、続いて標準的なイムノアッセイ技術を用いて適当な抗体の産生体を同定することができる。モノクローナルまたはポリクローナル調製品は、本発明の化合物を用いるモニタリング治療または予防摂生に有用である。本発明の抗体調製品を使った標準的なイムノアッセイ技術を用い、治療プロトコール中の種々の時間におけるタンパク質の存在について、血液、血清、尿、または唾液などから得られる適当な試料を検査することができる。標準的な結合方法を用いて、これらの抗体を、Ｔｃ−９９またはＩ−１３１などのシンチグラフィー標識などの標識と結合することもできる。標識化合物を対象に投与し、ｉｎｖｉｖｏでの過剰な量の１つ以上のメタロプロテアーゼの存在位置を測定することができる。したがって、タンパク質に対する標識抗体は、疾患を示すこのような発現増加のスクリーニングのツールとして働く。したがって、メタロプロテアーゼを選択的に結合する抗体の能力は、インサイチューのこれらの酵素分布をマップするのに利用される。該技術を組織学的方法において用いることができ、標識抗体を競合イムノアッセイにおいて用いることができる。既知の方法を用いて、抗体を他の化合物または基材に有利に結合することができる。例えば、カルボキシル官能基を有する基材であるカルボキシル残基をアルデヒドに還元し、そして側鎖アミノ基との反応により担体に結合し、続いて任意選択で、形成されたイミノ結合を還元することができる。ジシクロヘキシルカルボジイミドまたはその他のカルボジイミド脱水試薬などの縮合試薬を用いて、カルボキシル残基を側鎖アミノ基と反応させることもできる。リンカー化合物を用いて結合することもできる。ホモ二官能リンカーおよびヘテロ二官能化合物リンカーをＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ社（イリノイ州ロックフォード）から入手する。これらの化合物は、適当なクロマトグラフィー基材に結合した場合、タンパク質を単離するのに有用である。アフィニティークロマトグラフィーを用いる分離方法は当該技術分野で知られており、当業者が理解している範囲内にある。疾患マーカー上記で述べたように、本発明は、疾患組織の試料を含む試料中でのメタロプロテアーゼ遺伝子の発現を検出することを企図している。本発明は、核酸の起源の性質（ＤＮＡであるか、ＲＮＡであるか）により制限されることを意図しておらず、哺乳動物（例えば、ガン組織やリンパ球）の起源を含むがこれには限定しない種々の起源を企図している。理論に拘束されるものではないが、遺伝子、好ましくはこの遺伝子の発現は、制限的な組織分布を有していてもよく、その発現は、潜在的な変形性関節症メディエーターにより、アップレギュレートされる。例えば、この遺伝子（したがって該遺伝子のタンパク質）の関節軟骨細胞での発現の増大は、最初期の無症候性の段階を含む発達と、変形性関節症の進行とをモニターするためのマーカーを提供する。したがって、該タンパク質に対して作製された抗体は、疾患を示すこのような発現の増大に対するスクリーニングのツールとして働く。さらに、疾患スクリーンで抗体を用いる場合、該抗体を、発色団または発蛍光団を含む物質に結合することができ、またはある条件で発色団または発蛍光団を産生する酵素に結合することができる。これらの結合物質および結合方法は、当該技術分野で周知である。このような方法で用いた場合、イムノアッセイによるタンパク質の検出は、当業者には難しいものではない。メタロプロテアーゼの分布またはこれらのプロテアーゼ濃度の増加レベルを較正および検出するために、例えば体液（血清、尿、および滑液）をこの方法でクリーニングすることができる。このように用いる場合、本発明は、変形性関節症、その他の関節性軟骨変性疾患、または細胞外マトリクスの分解またはリモデリングにより特徴づけられるその他の疾患などのメタロプロテアーゼが仲介する疾患の有用な診断マーカーおよび／または臨床マーカーとなる。疾患が検出されれば、症状または衰弱が始まる前に疾患を治療することができる。さらに、上記の検出または治療のため、このような抗体を標的患部組織に用いることができる。核酸由来ツール細胞の核酸の内容は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）である。ＤＮＡは、細胞の遺伝的な計画を含んでいる。ＲＮＡは、ＤＮＡ配列に基づいたタンパク質生成において中間体として関与する。ＲＮＡは、細胞内で、翻訳に関与するストラクチュラルＲＮＡ(すなわち、リボゾームＲＮＡ「ｒＲＮＡ」 )、トランスファーＲＮＡ(「ｔＲＮＡ」)、およびメッセンジャーＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」）の３つの形態で存在する。ｍＲＮＡは、ＤＮＡ中にコードされる遺伝子情報と対応するタンパク質との間の中間体分子であるため、任意の所与の時間における細胞のｍＲＮＡ成分は、細胞の生理学的な状態を表している。したがって、細胞の分子生物学を研究し利用するために、ｍＲＮＡを精製すること（試料のすべての核酸からｍＲＮＡを精製することを含む）ができることが重要である。ＲＮＡの調製は、ＲＮＡを分解するＲＮａｓｅ（例えば、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ．他、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、１８８〜１９０頁、１９８２年）の存在により複雑となる。さらに、増幅可能なＲＮＡの調製は、ＲＮＡに関連するリボ核タンパク質の存在により困難となる（Ｒ．Ｊ．Ｓｌａｔｅｒ、Ｉｎ：ＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、Ｊ．Ｍ．ＷａｌｔｅｒおよびＷ．Ｇａａｓｔｒａ、Ｍａｃｍｉｌｌａｎ編、ニューヨーク州、１１３〜１２０頁、１９８３年を参照して頂きたい。）一般的に、細胞由来の核酸の精製に含まれる工程は、１）細胞溶解と、２）細胞ヌクレアーゼの不活性化と、３）細胞破壊物および他の核酸からの所望の核酸の分離とを含む。細胞溶解は、酵素処理、界面活性剤処理、またはカオトロピック剤処理を含む種々の方法により達成することができる。細胞ヌクレアーゼの不活性化は、プロテアーゼを用いることおよび／または強塩を用いることにより達成することができる。最後に、所望の核酸の分離は、一般的に、フェノールまたはフェノール−クロロホルムで核酸を抽出することにより達成することができる。この方法では、試料を、水層（核酸を含んでいる）および有機層（タンパク質を含むその他の細胞成分を含んでいる）に分ける。一般的に用いられるプロトコールでは、フェノール結合塩の使用を必要とし(Ｐ．ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＮ，Ｓａｃｃｈｉ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、１６２巻、１５６頁、１９８７年)、またはタンパク質を除去する遠心工程を行う(Ｒ．Ｊ．Ｓｌａｔｅｒ、上記)。核酸分画が細胞から単離されると、ｍＲＮＡ分子の構造を、ＤＮＡおよびその他のＲＮＡ分子からのｍＲＮＡの精製の補助に用いることができる。高等生物のｍＲＮＡは通常、その３’末端においてポリアデニル化されているため(「ポリ− Ａテイル」または「ポリ−Ａトラック」)、細胞からｍＲＮＡを単離する１つの方法は、ポリ−Ａテイルを、セルロースなどの支持体に結合されているそれの相補的な配列（すなわち、オリゴ−ｄＴ）と結合させることに基づいている。一般に、ハイブリダイズしたｍＲＮＡ／オリゴ−ｄＴを、遠心分離により、または磁気形式の場合には磁場にさらすことにより、試料中に存在する他の成分から分離する。ハイブリダイズしたｍＲＮＡ／オリゴ−ｄＴを他の試料成分から分離したら、通常、ｍＲＮＡをオリゴ−ｄＴから取りはずす。しかしながら、ある種の用途においては、ｍＲＮＡを、固体支持体に結合しているオリゴ−ｄＴに結合したままにしておくことができる。オリゴ−ｄＴが結合されている非常に種々の固体支持体が開発され、市販されている。ラテックスビーズおよび常磁性粒子に共役結合しているオリゴ−ｄＴを有する形式のものも開発され市販されているが、セルロースが依然として、ほとんどのオリゴ−ｄＴシステムにおける最も一般的な支持体である。ビオチン化オリゴ−ｄＴが溶液中でｍＲＮＡにアニールするビオチン−アビジン系において、常磁性粒子を用いることができる。次いで、該ハイブリットを、ストレプトアビジンでコーティングした常磁性粒子で捕捉し、磁場を用いて分離する。これらの方法に加え、スパン−カラム形式のものにおいて真核生物の全ＲＮＡからポリアデニル化ＲＮＡをアフィニティ−精製するなどの、別のものも存在する。これらのアプローチによりポリ−ＡｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションが可能となるが、効果および感度においては異なる。１つの実施態様において、ｍＲＮＡを逆転写酵素で処理してｃＤＮＡを作製する。ｃＤＮＡは、プライマー伸長およびプライマーを用いる下記のＰＣＲで用いられる。したがって、本発明は、下記のプライマーを用いたプライマー伸長により検出可能な核酸分子を企図している。プライマー伸長（およびＰＣＲ）は、（部分的に相補的な核酸とのハイブリダイゼーションとは対照的に）相補的な核酸だけがハイブリダイズするように、条件(いわゆる「ハイストリンジエンシ一条件」 )下で行うことができる。これらの条件には、二本鎖の融解温度またはその近くの温度でアニールすることを含む。特異的なジスインテグリンメタロプロテアーゼ遺伝子に対してディレクトされているプライマー本発明は、ジスインテグリンメタロプロテアーゼ遺伝子の発現を他の中から検出するのに有用な、新規なジスインテグリンメタロプロテアーゼ遺伝子の、全長タンパク質コード領域の部分核酸配列を提供する。１つの実施態様において、この部分配列の一部に対してディレクトされているプライマーを用いて、該遺伝子配列の存在または不存在を検出することができる。これらのプライマーを用いて、該遺伝子全体を提示するｃＤＮＡクローンを同定することができ、これにより、宿主細胞におけるジスインテグリンメタロプロテアーゼまたはそのフラグメント（または変異体）をコードする該核酸配列の組換え発現が可能となる。好適なプライマーは、プライマー配列番号９（５’−ＡＧＣＣＴＧＴＧＴＣ− ３’）および配列番号１０（５’−ＡＧＣＣＴＧＴＧＴＣＴＧＡＡＣＣＡＣＴ− ３’）である。しかしながら、配列番号５および配列番号１に定められている配列から、その他のプライマーも容易にデザインすることができる。ディファレンシャルディスプレイによる生物学的試料の比較方法反応物由来の産物の特徴により、増幅が成功したかを確認することができる。伸長産物またはＰＣＲ産物を検出する方法より、本発明が制限されることは意図していない。１つの実施態様において、ＰＣＲ産物を、２％アガロースゲル（ＢＲＬ）を用いて高分解能アガロースゲル電気泳動により分析し、エチジウムブロマイド染色およびＵＶトランスイルミネーションにより、増幅されたＤＮＡフラグメントを可視化する。本発明は、１つの実施態様において、電気泳動を用いて産物の形成を確認し、試料間の結果を比較することを企図している。したがって、本発明は、核酸（例えば、ｃＤＮＡまたはＲＴ−ｍＲＮＡ）混合物中の新規なジスインテグリンメタロプロテアーゼ遺伝子の配列を検出することを企図している。核酸混合物についてＰＣＲを行い、産物をゲルに流すことにより、プライマーにより特徴づけられる配列を含む核酸を「単離」する。次いで、ゲルからバンドを切り出すことにより(または電気的溶離などの他の方法により) 、産物を「精製」する。配列リストの概要読者の補助のため、配列リストの相互関係を以下に記載する。配列番号１は、断片的なＤＮＡ配列であり、配列番号３の一部である。配列番号１の最初の塩基（シトシンまたはＣ）は、配列番号３の９４０番目の塩基である。重なっている所のＤＮＡ配列は同一である。配列番号２および配列番号４はそれぞれ、配列番号１および配列番号３の発現アミノ酸配列である。配列番号２の最初のアミノ酸配列であるＧｌｎは、配列番号４の３０９番目のアミノ酸である。この２つの配列は、タンパク質カルボキシル末端まで相同である。配列番号７は、ディファレンシャルディスプレイ実験によって与えられたＤＮＡセンス鎖である。配列番号７の最初の塩基は、配列番号１の塩基１３７１に対応し、配列番号３の塩基２３１０に対応する。これらの配列は、配列番号１の塩基１８２２および配列番号３の塩基２７６１までの４５２塩基について、相同である。配列番号１と配列番号３の最後の２塩基における違いは、シークエンスにおける誤りまたはＰＣＲに見出される一般的な複製の誤りに起因するか、あるいはクローニングベクターの一部である。配列番号７は、相同部分よりも２８４塩基延びており、したがって配列番号１および配列番号３の末端を大きく超えている。さらに、配列番号７の塩基４７７〜７１６は、配列番号６である。配列番号６は、ディファレンシャルディスプレイクローニングにより見い出されたアンチセンス鎖である配列番号５のセンス鎖である。したがって、配列番号６は、これがｍＲＮＡ中に現れる場合、ＤＮＡの向きを示す。これらの２つの配列は、この遺伝子の３’末端の近くに見られる。配列番号７の塩基４５２から３’末端は、配列番号１および配列番号３と異なるが、それにもかかわらず配列番号７は有効である。発現ペプチド配列が、この相違により影響を受けないことを示していることは重要である。選択的ポリアデニル化シグナルを用いているゆえに、これらの塩基は、配列番号１および配列番号３に現れないようである。配列番号８は、新規な全長ＤＮＡ配列である。配列番号９は、新規な配列番号８の発現タンパク質である。配列番号９は、配列番号４のアミノ酸１６２（Ｓｅｒ）〜２１３（Ｔｒｙ）が、配列番号９の１６２位においてＡｓｎの１残基に置換されている点で、配列番号４とは異なる。その変化は、ＤＮＡ中において全部で１５３塩基となる塩基５０１〜６５４の欠失により反映されており、リーディングフレームはそのままであるが、１残基が変化し、配列番号４に存在する５１個のアミノ酸を欠失している。配列番号１０および配列番号１１は、ＰＣＲにおいて有用なアンチセンスプライマーであり、配列番号７の３’末端のインバースであり、プライマーについてのその他の配列は、本明細書中で引用する配列を使用して当業者により識別できる。実施例以下の非限定的な実施例は、本発明の好適な実施態様を例示し、本発明の使用について簡潔に記載したものである。これらの実施例は、当業者の手引きのために提供され、本発明をまったく限定するものではない。本開示またはこれらの実施例を用いることにより、当業者は請求の範囲に記載された発明を作製し、使用することができる。標準的な出発物質をこれらの実施例で用いる。これらの物質の多くは、知られており、市販されている。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉＣＪ２３６およびＪＭ１０１は既知の株であり、ｐＵＢ１１０は既知の方法であり、Ｋｕｎｋｅｌ突然変異誘発法は当該技術分野で周知である。さらに、ある種の細胞系およびｃＤＮＡは市販されており、例えば、Ｕ−９３７はＣｌｏｎｔｅｃｈＩｎｃ社（カルフォルニア州パロアルト）から市販されている。発現系により、および種々の宿主における種々の方法により、変異体を作製することができ、これらの方法は、分子生物学、生物化学、またはバイオテクノロジーに関係するその他の技術分野における当業者の実施範囲内にある。実施例１非刺激およびインターロイキン１で刺激した正常なヒト関節軟骨細胞の培養物から、ＲＮＡを単離する。ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡとする。一連の任意のプライマーを用いて、該ｃＤＮＡを、変形ディファレンシャルディスプレイ法にかける。刺激した関節軟骨および非刺激関節軟骨双方から生成されたＰＣＲ産物を、ポリアクリルアミドゲル上の隣接した列において電気泳動する。相違的に発現しているバンド（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｂａｎｄ）をゲルから切り出し、クローニングし、そしてシークエンスする。ＲＮａｓｅプロテクションおよび核の移動実験により、遺伝子の相違的発現を確認する。実施例２インターロイキン１で刺激したヒト関節（大腿骨頭）軟骨細胞の初代培養物に由来するタンパク質をコードする新規な部分ヒトｃＤＮＡを、既知の方法を用いてクローニングする。同じ配列が見い出され、ヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして全長クローンを得ることにより、遺伝子を完全なものとする。実施例３既知の方法を用いて、実施例２のクローニングしたＤＮＡをｐＵＢ１１０中に組み込む。このプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換して、新たな変異体を作製するための部位特定突然変異誘発用の鋳型を提供するのに用いられる。Ｋｕｎｋｅｌ突然変異誘発法を行い、Ｇｌｎ１をＡｌａに変えた。実施例４ＩＯＤＯＢＥＡＤＳ（Ｐｉｅｒｃｅ社、イリノイ州ロックフォード；非多孔性ポリスチレンビーズ上の固定化クロラミン−Ｔ(ｃｈｌｏｒａｍｉｎｅ−Ｔ)）を用いて、［¹²⁵Ｉ］ジスインテグリン抗体を調製する。凍結乾燥した抗体（２μ ｌ）を、１０ｍＭの酢酸５０μｌ中に溶解し、氷上でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｓｉｇｍａ社、ミズーリ州セントルイス）４５０μｌに加える。チューブに、５μｌ中¹²⁵Ｉ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、イリノイ州アーリントンハイツ）( ２２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ)５００μキュリーを加え、ＩＯＤＯＢＥＡＤを１つ加える。時々振とうしながら、氷上で１０分間、反応物をインキュベートする。次いで、ＩＯＤＯＢＥＡＤから得られる反応物を除去することにより、反応を終了する。混合物をＰＤ−１０ゲル濾過カラムにアプライして、未反応の¹²⁵Ｉを取り除く。実施例５ジスインテグリンメタロプロテアーゼ螢光原基質ペプチド（Ｂａｃｈｅｍ、ＧｕｅｌｐｈＭｉｌｌｓ、ＫｉｎｇｏｆＰｒｕｓｓｉａ、ペンシルベニア州）をジスインテグリンと混合し、コントロールとして２分後の螢光の変化を評価する。次いで、分離流出中の評価する化合物（メタロプロテアーゼ阻害剤）の存在下、２〜１２時間にわたって種々の時点で評価をしながら、螢光原ペプチドをジスインテグリンと混合する。標準的な方法論を用いてデータを評価し、評価化合物の相対結合度を求める。実施例６患者の左膝から滑液０．５ｍｌをとり、ジスインテグリンの上昇レベルをＥＬＩＳＡで検査する。結果は、正常なジスインテグリンのレベルよりも高いことを示している。予防用量のジスインテグリン阻害剤を長時間にわたり経口投与して患者を処方するか、診療所を出る前に同じものを左膝に注射することにより患者に投与する。実施例７ジスインテグリンメタロプロテアーゼ活性の阻害により、細胞外マトリクスリモデリングの阻害を見つけ出す。低分子量の合成メタロプロテアーゼ阻害剤（マトリクスメタロプロテアーゼを阻害するものなど）を用いて、組織保全性およびプロテオグリカンをモニターする。関節軟骨由来のＩＬ−１で刺激したウシ鼻軟骨試料を、１マイクロモルの低分子量ジスインテグリン阻害剤の溶液中で増殖させる。実験を制御し、そして阻害剤なしで増殖させた同一の培養物と比較する。７日後の培養物の分析により、阻害された培養物は、組織の分解がより少なく、培養血清中に存在するプリテオグリカンがより少ないことを示している。この結果は、アグレカナーゼの活性が阻害されたことと一致する。アグレカナーゼの阻害は、組織分解を妨げ、プリテオグリカンの放出を減じる。実施例８膜結合型のジスインテグリンメタロプロテアーゼドメインの放出となるタンパク質分解処理の阻害は、膜結合ジスインテグリン分子の「第２メッセンジャー」シグナル伝達を阻害する。このような第２メッセンジャーのシグナル伝達により、細胞表現型の変化、遺伝子発現の変化、および有糸分裂活性の変化などとなる。ジスインテグリンを含むことが知られている細胞をセリンプロテアーゼで処理する。この細胞から放出されたタンパク質を標準的な方法で測定する。特に、メタロプロテアーゼの活性を文献記載の方法によりモニターする。放出されたメタロプロテアーゼの量は、該細胞の処理に用いたセリンタンパク質の量と相関する。ジスインテグリンメタロプロテアーゼの開裂および放出の後、ホスホチロシンに特異的なモノクローナル抗体を用いて分子内タンパク質のウエスタンブロット分析により、コントロールに対するｓｒｃチロシンキナーゼ活性の増加分を測定する。コントロールは、セリンプロテアーゼで処理していない細胞である。細胞中（または細胞培養中）のｓｒｃチロシンキナーゼ活性を文献記載の方法で測定する。ジスインテグリンのメタロプロテアーゼドメインの放出も、文献記載の方法でモニターする。メタロプロテアーゼドメインの放出と分子内ｓｒｃチロシンキナーゼ活性の増加分の間には、直接的な相関がある。この結果は、ｓｒｃチロシンキナーゼカスケードを刺激すると、ジスインテグリン仲介細胞シグナリングが刺激されることと一致する。実施例９ＲＧＤ配列を含有するペプチドを用いて、インテグリン結合を測定する。分子間接着分子または細胞外マトリクス構成成分を阻害すると、そのような相互作用に関連する、細胞の形状の変化を含む表現型の変化を阻害する結果となる。顕微鏡により視覚的に認められる細胞形状の変化を用いて、競合アッセイにより、インテグリン結合を測定する。該ペプチドはそのような細胞の変化を阻害する。この結果は、ジスインテグリンの相互作用と競合すること、またはジスインテグリンの相互作用を妨げることと矛盾していない。ＲＧＤペプチドは、軟骨細胞での細胞変化を阻害する。マトリクス合成の増加およびマトリクスメタロプロテアーゼ活性の促進に特徴づけられる変形性関節症の表現型は、起こらない。その他の容易に分析可能な細胞の変化を用いて、遺伝子発現や有糸分裂活性の変化などを含むこの結果をモニターする。実施例１０低分子量のメタロプロテアーゼ阻害剤を用いて、実施例７に記載した方法にしたがって組織培養を処理する。細胞膜からのＴＮＦ−αの放出を文献記載の方法で測定する。実施例７の阻害剤は、細胞膜から分泌されるＴＮＦ−αの量も減じる。したがって、ジスインテグリンメタロプロテアーゼ活性の阻害は、ジスインテグリンが関連する炎症のカスケードおよび分泌酵素の活性を阻害する結果となることが企図されている。細胞膜などからのサイトカインまたはＩＬ−１の放出をモニターしても同じ結果となることが企図されている。実施例１１疾患のディファレンシャルディスプレイスクリーニング非刺激およびインターロイキン１で刺激した正常なヒト関節軟骨細胞の培養物から、ＲＮＡを単離する。ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡとする。上で言及したプライマーを用いて、ｃＤＮＡを増幅する(ＰＣＲ)。刺激した関節軟骨および非刺激関節軟骨双方から生じたＰＣＲ産物を、ポリアクリルアミドゲル上の隣接した列において電気泳動する。相違的に発現しているバンド（すなわち、刺激された細胞でのみに見られるバンドで、非刺激細胞では有意なまたは検出可能なレベルで発現していない）をゲルから切り出し、クローニングし、そしてシークエンスする。配列番号５に部分配列を示す。この配列は、ラットメタロプロテアーゼ（上記）と約６０％の相同を示すことが判明した。この配列は、ヒトメタロプロテアーゼと約８５％の相同を示すことが判明した(遺伝子バンク登録番号第Ｚ４８５９７を参照のこと、配列番号２を参照のこと)。実施例１２腫瘍の転移潜在能力のスクリーニングメタロプロテアーゼ遺伝子発現について、ガン組織を検査した。上で言及したプライマーを、試料からの抽出した核酸でのＰＣＲにおいて用いる。高レベルの転写物は、転移潜在能力を示している。実施例１３発現阻害剤のドラッグスクリーンメタロプロテアーゼ遺伝子発現の阻害剤候補を、ｉｎｖｉｔｒｏでスクリーニングする。インターロイキンで刺激した正常な関節軟骨細胞培養物を、ｉｎｖｉｔｒｏで阻害剤候補にさらす。ＲＮＡを単離し、逆転写してｃＤＮＡとする。上で言及したプライマーを用いて、ｃＤＮＡを増幅する(ＰＣＲ)。阻害剤にさらした軟骨細胞および阻害していない関節軟骨双方から産生されたＰＣＲ産物を、ポリアクリルアミドゲル上の隣接した列において電気泳動する。ＰＣＲ産物の減少レベルにより阻害剤を同定する。実施例１４メタロプロテアーゼ阻害剤のドラッグスクリーンメタロプロテアーゼそれ自体の阻害剤候補を、ｉｎｖｉｔｒｏでスクリーニングする。正常なヒト関節軟骨細胞のインターロイキン−１刺激培養物の培養上清を、阻害剤候補の存在下または非存在下で、適当なメタロプロテアーゼ基質（例えば、マトリクスタンパク質）でアッセイする。既知の阻害剤（例えば、ＳｉｇｍａＣｏ．社、セントルイスから市販されている１，１０−フェナントロリン）をコントロールとして用いる。基質（例えば、ジスインテグリンメタロプロテアーゼ蛍光原基質）分解の減少レベルにより、阻害剤を同定する。実施例１５標準的なスクリーニング技術を用いて、単球様細胞ｃＤＮＡ系ライブラリーであるＵ−９３７から１４００ｂｐのクローンを単離する。該最初の配列は、短縮されたクローンであり、５’末端部分が欠けている。既知の方法である５’Ｒ．Ａ．Ｃ．Ｅ．（ＲａｐｉｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ５’ｃ−ＤＮＡＥｎｄｓ、ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，ＡＧｕｉｄｅｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｎｉｓ他、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ社、１９９０年、の第４章（２８〜３８頁）およびｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓなどを参照のこと）を用いて５’末端を生じさせて、該残存５’配列を含有する１６００ｂｐのクローンを生じる。これら２つの配列は一緒に配列番号８を提供し、該ペプチド配列は配列番号８に由来する。実施例１６プライマーの配列番号９（５’−ＡＧＣＣＴＧＴＧＴＣ−３’）および配列番号１０（５’−ＡＧＣＣＴＧＴＧＴＣＴＧＡＡＣＣＡＣＴ−３’）を、ｍＲＮＡのディファレンシャルディスプレイ（ｄｄｒｄ−ＰＣＲ）で用いる。ｓｓｃＤＮＡ２〜５ｎｇをＰＣＲで用いる。反応物を、薄肉チューブ２μｌで氷上において予め冷却する。各チューブには、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８．５)、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ₂、１ｍＭの各ｄＮＴＰ、２〜５ｎｇのｓｓｃＤＮＡ、１０ｐモルの上記の各プライマー、０．５μlのα−Ｐ³³ｄＣＴＰ(１０μＣｉ／μl、Ａｍｅｒｓｈａｍ社)、および２０μlになるように水が含まれる。Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＳｙｓｔｅｍ２４００ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ(Ｐｅｒｋｉｎｇ−Ｅｌｍｅｒ社、コネティカット州ノーウォーク)用いて、混合物に対し、変性(９０℃、３０秒)、アニール(３６℃、３０秒 )、および伸長（７２℃、１分）を３５サイクル行う。この方法により、ＩＬ−１を処理した軟骨細胞は、この遺伝子に関連するｍＲＮＡを発現した。一方、処理していない（ＩＬ−１なし）コントロール軟骨細胞は検出可能なｍＲＮＡを発現しなかった。実施例１７高処理スクリーニングを容易に行うことができるアッセイシステムキネティック酵素阻害アッセイにおいて、蛍光原を用い、ジスインテグリンのプロテアーゼ活性を測定する。クローニングしたジスインテグリン酵素および低ＭＷ蛍光標識タンパク質を基質として用いる。室温における基質分子の開裂後に蛍光を測定することにより、酵素活性を定量化する。このアッセイは、簡単でかつ自動化が非常に容易である。標準的な技術を用いて、このアッセイを９６個または３８４個のウェルプレートに用いる。本明細書中に記載されたすべての引用は、その内容を引用することにより、本明細書中に取り入れる。対象発明の具体的な実施態様を記載したが、本発明の真意および範囲から逸脱することなく、対象発明の種々の変化および変更を行うことが可能であることは、当業者にとっては自明であろう。付随する請求の範囲において、本発明の範囲内にあるそのような変更はすべて包含することを意図する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ティンダル，マイケル，ハワード. アメリカ合衆国 45215 オハイオ州ワイオミングコディーパス 620 (72)発明者ハッキ，タリク，メイムード. アメリカ合衆国 44118 オハイオ州クリーブランドハイツカンタベリーロード 2625

Claims

【特許請求の範囲】１．ジスインテグリン拮抗作用のスクリーンと、ドラッグデザインと、スクリーンニングとに用いることが可能な配列番号９のヒトジスインテグリンまたはそのフラグメントをコードする、関節炎の発達の際に相違的に発現することを特徴とする、ＤＮＡフラグメント。２．請求項１に記載のＤＮＡによりコードされる、本質的に純粋な形態であることを特徴とする、ヒトジスインテグリンまたはそのフラグメント。３．請求項１に記載のジスインテグリンを含むことを特徴とするヒトジスインテグリンに結合可能な化合物のスクリーニング方法。４．請求項１に記載のジスインテグリンを含むことを特徴とするヒトジスインテグリンに結合可能な化合物用のスクリーニングキット。５．請求項２に記載のジスインテグリンに対する抗体またはそのフラグメントを含有することを特徴とする、変形性関節症のスクリーニングキット。６．請求項１に記載のＤＮＡを含有することを特徴とする発現ベクターまたはプラスミド。７．配列番号８に定められている配列を含有することを特徴とする請求項１に記載の単離核酸分子。８．配列番号１０および配列番号１１から成る群から選択されるプライマーを用いたプライマー伸長により検出が可能であることを特徴とする請求項１に記載の核酸分子。９．Ａ）インターロイキン−１で刺激した軟骨細胞培養物の一部をメタロプロテアーゼ遺伝子発現阻害剤の候補にさらすことと、Ｂ）前記さらした一部から、メタロプロテアーゼ遺伝子に対応するｍＲＮＡを含むＲＮＡを単離することと、Ｃ）前記さらした一部から得られる前記メタロプロテアーゼ遺伝子の前記ｍＲＮＡのレベルを、前記さらしていない軟骨細胞培養物部分でのｍＲＮＡレベルと比較することと、Ｄ）阻害剤であることを示す、前記ｍＲＮＡの減少レベルを観測することとを含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。１０．Ａ）阻害剤候補の存在下と、コントロール阻害剤の存在下と、阻害剤の非存在下とで増殖した、インターロイキン−１で刺激した正常なヒト関節軟骨細胞培養物の培養上清の試料を単離すること、Ｂ）各試料に、メタロプロテアーゼ活性の検出が可能な基質を加えることと、Ｃ）各試料のメタロプロテアーゼ活性レベルを検出することとを含む請求項３に記載の方法。