JP2001514494A - 新規なジスインテグリンメタロプロテアーゼ、変異体、フラグメントなどの使用 - Google Patents
新規なジスインテグリンメタロプロテアーゼ、変異体、フラグメントなどの使用Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、ジスインテグリンタンパク質に結合可能な化合物を同定する方法、ならびに試料中のジスインテグリンタンパク質に結合可能な化合物の量および親和性を測定する方法に関する。本発明はさらに、これらの目的に有用な、ジスインテグリンタンパク質に対する組換え発現ベクターを含有する宿主細胞、ジスインテグリンタンパク質をコードする組換え発現ベクター、およびヒトジスエンテグリンタンパク質、そのフラグメント、またはその変異体に関する。本発明は、さらに、キット形式での製造および使用が可能な、変形性関節症およびメタロプロテアーゼに基づくその他の疾患をin vivoまたはin vitroでスクリーニングする方法に関する。
Description
【発明の詳細な説明】
新規なジスインテグリンメタロプロテアーゼ、変異体、フラグメントなどの使用
発明の分野
発明は、新規なタンパク質、そのフラグメント、および変異体に関するもので
あり、ならびに変形性関節炎およびメタロプロテアーゼのアップレギュレーショ
ンにより特徴づけられる他の疾患を含む疾患のための、検出および検査薬におけ
るそれの使用に関する。
背景
多くの酵素は、構造タンパク質を分解し、メタロプロテアーゼと構造的に関連
する。これらには、ヒト皮膚繊維芽細胞コラーゲナーゼ、ヒト皮膚繊維芽細胞ゲ
ラチナーゼ、ヒト痰コラゲナーゼおよびヒト痰ゲラチナーゼ、ならびにヒトスト
ロメライシンが含まれる。S.E.Whitham他、Comparison
of human stromelysin and collagenase
by cloning and sequence analysis、Bi
ochem J.、240巻、913頁、1986年を参照して頂きたい。G.
I.Goldberg他、Human Fibroblast Collage
nase、J.Biol.Chem.、261巻、660頁、1986年も参照
して頂きたい。金属依存性(例えば、亜鉛)は、「メタロプロテアーゼ」として
知られる、これらの構造的関連性のある酵素の共通の特徴である。
これらの酵素の生成および活性を制御することは、組織構築の正常な発達にお
いて、重要な役割を果たす。しかしながら、これらの酵素は、過度になると、結
合組織の病理学的破壊を引き起こす。一般に、J.Saus他、The Com
plete Primary Structure of Haman Mat
rix Metalloprotease−3、J.Biol.Chem.、2
63巻、6742頁、1988年を参照して頂きたい。これらの多くが、アンジ
オテンシン変換酵素およびエンケファリナーゼのような、亜鉛含有メタロプロテ
アーゼである。コラーゲナーゼ、ストロメライシン、および関連酵素は、慢性関
節リウマチ(Mullins.D.E.他、Biochim Biophys
Acta、695巻、117〜214頁、1983年);変形性関節症(Hend
erson,B.他、Drugs of the Future、15巻、49
5〜508頁、1990年);腫瘍細胞の転移(ibid, Broadhurs
t,M.J.他、欧州特許出願第276,436号(1987年公開)、Reic
h,R他、48Cancer Res、3307〜3312へ頁、1988年)
;および種々の潰瘍状態を含む、多くの疾患症候群を仲介することにおいて重要
である。アルカリやけどの結果として、またはシュードモナスアエルギノサ(P
seudomonas aeruginosa)、アカントアメーバ(Acant
hamoeba)、単純ヘルペス(Herpes simplex)、およびワク
シニアウイルス(vaccinia viruses)による感染の結果、角膜
において潰瘍状態となる。
実際に、ガン組織中でメタロプロテアーゼを測定すると、転移潜在能力(me
tastatic potential)と相関して、メタロプロテアーゼが増
加していることが示唆される。M.J.Dutty他、Assay of ma
trix metalloprotease type 8 and 9 by
ELISA in human breast cancer、Br.J.C
ancer、71巻、1025頁、1995年)を参照して頂きたい。
メタロプロテアーゼの望ましくない活性により特徴づけられるその他の疾患に
は、歯周疾患、表皮性水庖症、および強膜炎が含まれる。多くの疾病状態におい
てメタロプロテアーゼが関与していること考慮して、これらの酵素に対する阻害
剤を調製する試みがなされてきた。多数のそのような阻害剤が文献に開示されて
いる。本発明は、このプロテアーゼにより仲介されまたは調節される疾患の治療
における活性を増大する、好ましくはこのプロテアーゼに特異的な、新規な阻害
剤を提供することを試みる。
メタロプロテアーゼ阻害剤は、少なくとも部分的には、構造タンパク質の分解
により引き起こされる疾患の治療に有用である。種々の阻害剤が調製されてきた
が、そのような疾患を治療する薬をデザインするためのメタロプロテアーゼ阻害
剤スクリーンに対する絶え間ないニーズがある。
多くの疾患状態とマトリクスメタロプロテアーゼとの関連性から、これらの酵
素の阻害剤を同定する試みがなされてきた。例えば、TapI−2および1,1
0−フェナントロリンは、メタロプロテアーゼ阻害剤として知られている。J.
Arribas他、Diverse Cell Surface Protei
n Ectodomains Are Shed by a System S
ensitive to Metalloprotease Inhibito
rs、J.Biol.Chem.、271巻、11376頁、1996年)を参
照して頂きたい。
メタロプロテアーゼは、非常に種々の機能を有する、広い分類のタンパク質で
ある。ジスインテグリン(disintegrin)は、亜鉛メタロプロテアー
ゼであり、ヘビ毒液に豊富にある。哺乳動物のジスインテグリンは、約18個の
既知の亜族を有するタンパク質のファミリーである。これは、細胞接着を破壊す
るものとして作用し、そして再生産(例えば、精子による卵の受精(それらの融
合を含む)および精子の成熟)に活性であることも知られている。
これらのプロテアーゼおよび他の多くのものは、分子生物学および生物化学に
おいて明らかにされていない。結果として、遺伝子配列の保存先の遺伝子バンク
により、ジスインテグリンのフラグメントをコードするとされるものを含む、い
くつかのメタロプロテアーゼの配列が提供されている。例えば、1994年2月
25日付けの遺伝子バンク登録番号Z48444では、ラットジスインテグリン
メタロプロテアーゼ遺伝子であるとされるラット遺伝子のヌクレオチド2407
個を開示し、1995年3月2日付けの遺伝子バンク登録番号Z48579では
、ヒトジスインテグリンメタロプロテアーゼ遺伝子であるとされる遺伝子の部分
ヌクレオチド1824個を開示し、1994年8月25日付けの遺伝子バンク登
録番号Z21961では、ウシ亜鉛プロテアーゼ遺伝子であるとされる遺伝子の
部分ヌクレオチド2397個を開示している。
非常に種々のメタロプロテアーゼがあるゆえ、i)特定のメタロプロテアーゼ
を特異的に検出する方法、およびii)阻害剤候補を同定する方法に対して絶え
間ないニーズがある。
メタロプロテアーゼを特異的な疾患状態に関与させること、およびそのような
疾患を検出し、最終的には治療し、制御し、治療法をデザインするためのツール
としてこれらのメタロプロテアーゼを用いることは好都合であろう。
本発明の目的
本発明の目的は、ジスインテグリンタンパク質に結合可能な化合物を同定する
方法を提供することである。
本発明の目的は、さらに、ジスインテグリンタンパク質をコードする組換え発
現ベクターを含有する宿主細胞、およびジスインテグリンタンパク質をコードす
る組換え発現ベクターを提供することである。
本発明の目的は、ガン、関節症(強直性脊椎炎、慢性関節リウマチ、痛風性関
節炎(痛風)、炎症性関節炎、ライム病、および変形性関節炎を含む)などのメタ
ロプロテアーゼが仲介する疾患をスクリーニングする方法を提供する。
本発明の目的はさらに、スクリーンにおいて有用な、タンパク質の単離におい
て有用な、またはタンパク質の標的部分として有用な、タンパク質に対する抗体
を提供することである。
本発明の要旨
本発明は、ジスインテグリンメタロプロテアーゼに結合可能な化合物を同定す
る方法と、試料中のジスインテグリンタンパク質に結合可能な化合物の量および
親和性を測定する方法とを提供する。
本発明はさらに、ジスインテグリンタンパク質に対する組換え発現ベクターを
含有する宿主細胞と、これらの目的に有用な、ジスインテグリンタンパク質に対
する組換え発現ベクターを含有する宿主細胞、本発明はさらに、これらの目的に
有用な、ジスインテグリンタンパク質をコードする組換え発現ベクターを含有す
る宿主細胞、ジスインテグリンタンパク質をコードする組換え発現ベクター、お
よびヒトジスエンテグリンタンパク質、そのフラグメント、またはその変異体と
を提供する。
本発明はさらに、キット形式での製造および使用が可能な、変形性関節症およ
びメタロプロテアーゼに基づくその他の疾患をin vivoまたはin vi
troでスクリーニングする方法を提供する。詳細な説明
「遺伝子」という用語は、成熟タンパク質またはその前駆体を生成するのに必
要な制御配列およびコード配列を含有するDNA配列をいう。タンパク質は、所
望の酵素活性を保持する限り、全長コード配列によりコードされていても、該コ
ード配列のいずれかの部分によりコードされていてもよい。
本明細書中で用いられる「オリゴヌクレオチド」という用語は、2つまたはそ
れ以上の、通常は3より多い、典型的には10より多い、最高で100またはそ
れ以上の(しかしながら、20から30の間が好ましい)デオキシリボヌクレオ
チドまたはリボヌクレオチドから構成される分子として定義する。正確なサイズ
は、オリゴヌクレオチドの第一義的な機能または用途に依存する、多くの要因に
依存する。オリゴヌクレオチドは、化学合成、DNA複製、制限エンドヌクレア
ーゼ消化、逆転写、またはそれらの組み合わせを含む、任意の方法で生成するこ
とができる。
1つのモノヌクレオチドペントース環の5’リン酸が、ホスジエステル結合を
介して、一方向に、近くのモノヌクレオチドペントース環の3’酸素に結合され
る方法で、モノヌクレオチドが反応してオリゴヌクレオチドがつくられるゆえ、
オリゴヌクレオチドの末端は、5’リン酸がモノヌクレオチドペントース環の3
’酸素に結合されない場合を「5’末端」とし、3’酸素が次のモノヌクレオチ
ドペントース環の5’リン酸に結合されない場合を「3’末端」とする。本明細
書中に用いる核酸配列は、より大きいオリゴヌクレオチドに対し内部にある場合
でさえ、5’末端および3’末端を有するということができる。
2つの異なるオーバーラップしないオリゴヌクレオチドが、同じ直鎖の相補的
核酸配列の異なる領域とアニールし、一方のオリゴヌクレオチドの3’末端が他
方のオリゴヌクレオチドの5’末端の方向に向いている場合、前者を「上流」の
オリゴヌクレオチドといい、後者を「下流」のオリゴヌクレオチドということが
できる。
「プライマー」という用語は、プライマーの伸長が開始される条件下に置かれ
たとき、合成の開始点として作用することが可能であるオリゴヌクレオチドをい
う。オリゴヌクレオチド「プライマー」は、精製した制限消化物のような天然に
存在するものでも、あるいは合成して作製したものでもよい。
鋳型の特異的配列の鎖に「実質的に」相補的であるプライマーを選択する。プ
ライマーは、プライマーが伸長するための鋳型鎖とハイブリダイゼーションする
のに充分に相補的でなければならない。プライマー配列は、鋳型の正確な配列を
反映する必要はない。例えば、プライマー配列の残り部分が実質的に鎖に相補的
であるならば、非相補的なヌクレオチドフラグメント断片をプライマー5’末端
に付着することができる。プライマー配列が、プライマー伸長産物の合成を目的
としてハイブリダイズしそれにより鋳型−プライマー複合体を形成するのに鋳型
の配列と充分に相補的であるならば、非相補的な塩基またはより長い配列をプラ
イマー中に散在することもできる。
「ハイブリダイゼーション」法は、標的核酸(検出する配列)に相補的な配列
をアニールすることを伴う。相補的配列を含有する2つの核酸ポリマーが、互い
に出会って、塩基対相互作用によりアニールすることができることは、よく理解
されている現象である。MarmurおよびLane、Proc.Natl.A
cad.Sci.USA、46巻、453頁、1960年、ならびにDoty他
、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、46巻、461頁、196
0年による「ハイブリダイゼーション」法の最初の観察に続き、この方法は精巧
なものとされ、近代生物学の必須のツールとなった。それにもかかわらず、多数
の問題が、ヒトの診断におけるツールとして、ハイブリダイゼーションの幅広い
スケールでの使用を妨げている。より困難な問題の中には、1)ハイブリダイゼ
ーションの非効率、2)ゲノムDNA混合物中の特異的標的配列の濃度の低さ、
および3)単に部分的に相補的なプローブと標的物とのハイブリダイゼーション
がある。
効率性に関しては、ハイブリダイゼーション反応では、プローブ−標的複合体
の起こり得る数の一部だけ形成されることが、実験において観察される。このこ
とは、特に、短いオリゴヌクレオチド(長さが100塩基未満)についても当て
はまる。a)2次構造相互作用または3次構造相互作用ゆえに、ハイブリダイゼ
ー
ションが起こらないこと、b)標的配列を含有するDNA鎖が、該DNA鎖の相
補鎖に再びハイブリダイズすること(再びアニールすること)、および、c)ある
標的分子は、固体表面に標的核酸を固定化したハイブリダイゼーションフォーマ
ットにおいて用いられる場合に、ハイブリダイゼーションを妨げられること、の
3つの基本的な原因がある。
プローブ配列が、標的配列すなわち標的物の一次構造に完全に相補的である場
合あっても、高次構造の再配列により標的配列がプローブに接近するようにする
必要がある。これらの高次構造の再配列は、分子の2次構造または3次構造のい
ずれかに関わるものであってよい。2次構造は、分子内結合により定められる。
DNAまたはRNA標的の場合、これは、(2つの異なる鎖のハイブリダイゼー
ションとは対照的に)1つの連続的な塩基鎖内でのハイブリダイゼーションから
成る。分子内結合の程度および位置に応じて、プローブを、ハイブリダイゼーシ
ョンを妨げている標的配列と置換することができる。
より長い標的相補鎖が再生しまたは再びアニールすることができるという事実
により、オリゴヌクレオチドプローブと変性した二本鎖DNAとの溶液ハイブリ
ダイゼーションは、さらに複雑である。ハイブリダイズしたプローブは、この過
程により再び置換される。これにより、プローブおよび標的の出発濃度に相関し
て、ハイブリダイゼーション生成率は低くなる(「適用される範囲」は低くなる)。
標的配列の濃度が低いことに関しては、標的配列を含有するDNAフラグメン
トは通常、ゲノムDNA中での相対的存在比が低い。これは、大きな技術的困難
性を示している。オリゴヌクレオチドプローブを用いる慣用技術のほとんどは、
そのような低濃度でハイブリダイゼーションを検出するのに必要な感受性を欠く
。
溶液での標的配列の低濃度の問題に対する試みは、検出する指標を増幅するこ
とである。これは非常にしばしば、1つまたは複数の標識をオリゴヌクレオチド
プローブ上に配置することを伴う。非放射線活性標識の場合、最も親和性のある
試薬でさえ、オリゴヌクレオチドプローブを用いて、ゲノムDNA中の単一コピ
ー遺伝子を検出するには適していないことが判明している。Wallace他、
Biochimie、67巻、755頁、1985年を参照して頂きたい。放射
線活性オリゴヌクレオチドプローブの場合、非常に高い特異的活性だけが、満足
す
る結果を示すことが判明している。StudenckiおよびWallace、
DNA、3巻、1頁、1984年、およびStudencki他、Human
Genetics、37巻、42頁、1985年を参照して頂きたい。
本明細書中に引用により取り入れるK.B.Mullis他、U.S.特許第
4,683,195号および4,683,202号には、クローニングまたは精
製を行わずに、あらゆるDNA混合物中における標的配列セグメントの濃度を増
加する方法が記載されている。標的配列を増幅するこの方法(該方法は、標的分
子を作製するために、本発明と結びつけて用いられる)は、大量の過剰な2つの
オリゴヌクレオチドプライマーを所望の標的配列を含有するDNA混合物に入れ
ること、続いてDNAポリメラーゼの存在下における厳密な配列の熱的サイクル
から成る。2つのプライマーは、二本鎖標的配列の各々の鎖に相補的である。増
幅を行うため、混合物を変性し、次いでプライマーを標的分子内の相補的な配列
にアニールする。アニール後、プライマーを伸長して、新たな一対の相補鎖を形
成する。変性、プライマーのアニール、およびプライマーの伸長の工程は、何回
も繰り返され(すなわち、変性、アニール、および伸長は、1「サイクル」を構
成し、非常に多数の「サイクル」が可能である)、高濃度の、所望する標的配列
の増幅セグメントを得ることができる。標的配列の増幅セグメントの長さは、お
互いのプライマーの相対的位置により決定される。したがって、この長さは、制
御可能なパラメーターである。該手順の繰り返しゆえに、該方法は、発明者によ
り「ポリメラーゼ連鎖反応」(以下、本明細書中でPCR)として言及されている
。所望する標的配列増幅セグメントは、混合物中で(濃度に関して)主な配列と
なるゆえ、それらは「PCR増幅」という。
PCRを用い、異なるいくつかの方法(例えば、標識プローブを用いてハイブ
リダイゼーションすること;ビオチン化プライマーを導入し、続いてアビジン‐
酵素結合の検出すること;32P標識したデオキシリボヌクレオチド3リン酸(例
えば、dCTPまたはdATP)を増幅セグメントに導入すること)により、検
出可能なレベルまで、ゲノムDNA中の特異的な標的配列の単一コピーを増幅す
ることが可能である。ゲノムDNAだけでなく、あらゆるオリゴヌクレオチド配
列を、適当なプライマー分子の組を用いて増幅することができる。特に、PCR
自体によりつくり出された増幅セグメントは、それ自体、次のPCR増幅での有
効な鋳型である。
PCR増幅法では、特異的配列が、上下変動がほとんどなくなる約10-8Mの
濃度に達することが知られている。典型的な反応体積は、100μlであり、6
×1011個の二本鎖産物分子の収量に対応する。
相補性に関しては、ハイブリダイゼーションが、完全相補性を示しているのか
、または部分相補性を示しているのかを判断することが、ある種の診断用途にお
いて重要となる。例えば病原性のDNAまたはRNA(ウイルス、バクテリア、
菌類、マイコムラズマ、原生動物などに由来するもの)の存在または非存在を単
に測定することを望む場合には、問題とされる配列が存在する場合に、ハイブリ
ダイゼーション法により、ハイブリダイゼーションを確保することだけが重要で
あり、この場合、部分的に相補的なプローブおよび完全に相補的なプローブの双
方がハイブリダイズする条件の選択が可能である。しかしながら、別の診断用途
では、ハイブリダイゼーション法が、部分相補性と完全相補性とを区別すること
が要求される。これは、遺伝子の多型性を検出するのに重要である。例えば、ヒ
トヘモグロビンは、主に、4つのポリペプチド鎖から成る。これらの鎖の中の2
つは、アミノ酸141個の同一の鎖(アルファ鎖)であり、これらの鎖の中の2
つは、アミノ酸146個の同一の鎖(ベータ鎖)である。ベータ鎖をコードする
遺伝子は、多型性を示すことが知られている。正常な対立遺伝子は、第6番目の
位置にグルタミン酸を有するベータ鎖をコードしている。変異型の対立遺伝子は
、第6番目の位置にバリンを有するベータ鎖をコードしている。アミノ酸におけ
るこの値の違いは、臨床上鎌状赤血球性貧血として知られる、意義深い(個々が
変異型の対立遺伝子に対してホモ接合である場合に最も意義深い)生理学的影響
力を有する。アミノ酸変化の遺伝子的な根拠は、正常な対立遺伝子DNA配列と
変異型の対立遺伝子DNA配列との間の1塩基の差に関係する。
他の技術(制限酵素分析など)を組み合わさせない限り、完全相補性だけでな
く部分相補性の双方の場合において同じレベルのハイブリダイゼーションを可能
とする方法は、プローブが正常な標的配列および異型の標的配列の双方にハイブ
リダイズするような用途には、一般に適していない。ハイブリダイゼーションは
、
用いる方法にかかわらず、分析する配列(標的配列)と検査を行うために用いる
DNAフラグメント(プローブ)との間に、ある程度の相補性を必要とする。(
全く相補性がなくても結合が得ることができるが、この結合は特異的でなく、除
外されることは当然である。)
本明細書中で用いる核酸配列の相補物は、一方の配列の5’末端が他方の配列
の3’末端と対になるように核酸配列にアラインした場合に「逆平行関係」にあ
るオリゴヌクレオチドを指す。天然の核酸では一般に見い出されないある塩基を
、本発明の核酸配列に含めることができ、該塩基には、例えば、イノシンおよび
7−ジアザグアニジンが含まれる。相補性は完全である必要はなく、安定な二本
鎖には、ミスマッチな塩基対または対合しない塩基が含まれていてもよい。核酸
技術分野の当業者は、例えば、オリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチド
の塩基組成および塩基配列、イオン強度、ならびにミスマッチな塩基対の発生率
を含む多くの変化要素を経験的に考慮して、二本鎖の安定性を決めることができ
る。
融解温度すなわち「Tm」により、核酸二本鎖の安定性を測定する。特異的な
条件下における特定の核酸二本鎖のTmは、平均で半分の塩基対が解離する温度
である。核酸のTmを計算するための式は、当該技術分野で周知である。鎖の引
用により示されるように、Tmの概算値は、
Tm−81.5℃+16.6 logM+.41(%GC)
−0.61(%形態)−500/L
の式により計算される。式中、Mは、一価のカチオンであり、%GCは、DNA
中のグアノシンヌクレオチドおよびシトシンヌクレオチドの百分率であり、%形
態は、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの百分率であり、そしてL
は、ハイブリッドの塩基対長である(例えば、Methods in Enzy
mology 152巻、401頁、1987年におけるGuide to M
olecular Cloning Techniques、S.L.Berg
erおよびA.R.Kimmel編を参照して頂きたい)。
本明細書中で用いられる「プローブ」という用語は、プローブ中の少なくとも
1つの配列が核酸中の他方の配列と相補的であるゆえ、核酸中のもう一方の配列
と二本鎖構造を形成する、標識したオリゴヌクレオチドをいう。
本明細書中で用いられる「標識」という用語は、検出可能な(好ましくは定量
化が可能な)シグナルを提供するのに用いることができ、そして核酸またはタン
パク質に結合することができる、あらゆる原子または分子をいう。標識は、蛍光
、放射線活性、比色、重量測定、X線の散乱または吸収、磁気、および酵素活性
などの検出可能なシグナルを提供することができる。このような標識を、本発明
のオリゴヌクレオチドに付加することができる。
「核酸基質」および「核酸鋳型」という用語は、本明細書中で互換的に用いら
れ、一本鎖または二本鎖のDNAまたはRNAを含むことができる核酸分子をい
う。
「実質的に一本鎖である」という用語は、核酸基質に関する引用で用いる場合
、鎖間塩基対相互作用によりつなぎ合わさっている2つの核酸鎖として存在して
いる二本鎖基質とは対照的に、基質分子が、主に1つの核酸鎖として存在してい
ることを意味する。
本明細書中で用いられる「配列変化」という用語は、2つの核酸鋳型間での核
酸配列の相違をいう。例えば、野生型構造遺伝子およびこの野生型構造遺伝子の
変異型では、1塩基置換の存在することにより、および/または1つもしくは複
数のヌクレオチドの欠失または挿入により、配列が変化している。これら2つの
形態の構造遺伝子では、互いに配列が変化しているという。さらに別の変異型の
構造遺伝子も存在することができる。この別の変異型は、野生型遺伝子および該
遺伝子の最初の変異型の双方で、配列形態が変化しているという。本発明では、
1つまたは複数の遺伝子形態間で比較を行って配列変化を検出することは必要で
はないが、引用により本明細書中に取り入れられる米国特許出願番号第08/2
31,440号に記載されている特定のハイブリダイゼーション条件を用いて、
本発明のオリゴ/固体支持マトリクスを用いてそのような比較が可能であること
は、注記すべきことである。
「遺伝子配列と対合しまたは相補的であるオリゴヌクレオチドプライマー」は、
一本鎖核酸または二本鎖核酸の鋳型依存性の合成を容易にすることができるオリ
ゴヌクレオチドプライマーをいう。遺伝子配列に対合しまたは相補的であるオリ
ゴヌクレオチドプライマーは、PCRや逆転写−PCR(RT−PCR)などに
用いることができる。
「コンセンサス遺伝子配列」は、2つ以上の遺伝子配列の比較により得られる
遺伝子配列であって、所定の遺伝子セグメント中に非常にしばしば存在するヌク
レオチドを表す遺伝子配列をいう。コンセンサス遺伝子配列は、基準の配列であ
る。
本明細書中で用いる「タンパク質」および「プロテアーゼ」という用語は、メ
タロプロテアーゼをいう。「メタロプロテアーゼ」という用語は、ネイティブの
金属依存性プロテアーゼ、またはその機能を依然として保持している、そのフラ
グメント、変異体、もしくはホモログである。本発明は、組換え法、in vi
tro法、または標準的なペプチド合成により調製される、異なる種に由来する
メタロプロテアーゼ(または「ジスインテグリン」)を企図している。該タンパク
質は、ヒトジスインテグリンまたはそれらの変異体であることが好ましい。タン
パク質の変異体を定義する目的のため、好適な「ネイティブ」のタンパク質が、
遺伝子バンク登録番号Z48579に部分記載されており、この内容を本明細書
中に引用により取り入れ、以下の配列において引用する。ホモログジスインテグ
リンには、当該技術分野で理解されているように、少なくとも90%が相同であ
る全タンパク質、またはそのフラグメントが含まれる。種間において、挿入また
は欠失を含むある変化が起こることが認められており、該変化は機能を変えても
、変えなくてもよいものである。例えば、ペプチド配列に基づき該タンパク質と
95%相同であるラットタンパク質、および最初の300塩基対に基づき97〜
98%相同であるウシタンパク質(DNA配列に基づく)は、双方ともホモログ
と認められる。1994年2月25日の引用の遺伝子バンク登録番号Z4844
4号では、ラットジスインテグリンメタロプロテアーゼ遺伝子と述べている24
07塩基のラット遺伝子が開示され、1994年8月25日付けの遺伝子バンク
登録番号Z21961号では、ウシ亜鉛メタロプロテアーゼ遺伝子とされる遺伝
子配列の2397塩基の部分配列が開示されている。このメタロプロテアーゼは
、下記のようにヒトジスインテグリンであることが好ましい。
「抗体」という用語は、ジスンテグリンに対する抗体、またはそのフラグメン
トをいう。これらの多くはモノクローナルおよびポリクローナルであり、いくつ
かの起源のいずれからも得ることができる。本発明は、タンパク質技術分野また
はペプチド枝術分野のいずれかの方法により作製される、これらの抗体のフラグ
メントをも企図している。
「疾患スクリーン」という用語は、疾患または疾患状態のスクリーンに関する
。疾患状態は、生理学的な、細胞の、または生化学的な疾患症状発現である。E
LISAなどの標準的な技術を用いて、体組織または動物培養流もしくは細胞培
養流でこのスクリーンを用いることが好ましい。この疾患スクリーンは、全身的
に投与された上記の標識抗体などによる全身における疾患の「マッピング」も企
図しており、検出方法にかかわらないが、そのような検出方法には、蛍光、X線
(CATスキャンを含む)、NMR(MRIを含む)などが含まれることが好まし
い。
「化合物スクリーン」という用語は、化合物を見つけ出すこと、プロテアーゼ
に対する化合物の親和性を測定すること、またはスクリーンに基づいて化合物を
デザインしもしくは選択することとに関する、方法およびスクリーンに関する。
別の態様において、「化合物スクリーン」という用語は、当該技術分野で認めら
れているような、ドラッグデザイン、好ましくは「合理的なドラッグデザイン」
用の3次元構造の使用を企図している。プロテアーゼは、「本質的に純粋な形態
」であることが好ましいが、「本質的に純粋な形態」とは、実験または特性決定
において有効なものとなるように妥当な範囲で(reasonably)他の不
純物を含まないタンパク質を指す。このスクリーニング方法を用れば、プロテア
ーゼに結合する、好ましくはプロテアーゼを阻害する、化学者によりまたは天然
でつくられたか否かにかかわらない、新規な構造を見つけ出すことにおいて、当
業者の手助けとなる。これらの「阻害剤」は、プロテアーゼ活性の制御または調
節に有用なものとすることができ、したがってこれらが機能する生物学的カスケ
ードの調節に用いることができる。
「ジスインテグリン」という用語は、ジスインテグリン、またはその機能を保
持する、そのフラグメント、その変異体、もしくはそのホモログをいう。この用
語は、アグレカナーゼ(aggrecanase)、および組織リモデリングに関
連しまたはこれを調節する他のプロテアーゼを企図する。これは、組換え法、i
n vitro法、または標準的なペプチド合成により調製される、異なる種由
来のジスインテグリンを企図する。タンパク質は、ヒトジスインテグリンまたは
それらの変異体であることが好ましい。タンパク質の変異体を定義する目的のた
めに、好適な「ネイティブ」のタンパク質が、遺伝子バンク登録番号Z4857
9に部分記載されており、この内容を本明細書中に引用により取り入れ、以下の
配列において引用する。配列番号1は、そのDNA配列のフラグメントとその転
写物を記載したものであり、配列番号2は該遺伝子によりコードされるタンパク
質を記載したものである。ホモログジスインテグリンには、当該技術分野で理解
されているように少なくとも90%相同である全タンパク質、またはそのフラグ
メントが含まれる。例えば、アミノ酸配列に基づき、配列番号1を含有するDN
AまたはcDNAに由来する配列番号2のタンパク質と95%相同であるラット
タンパク質、および97〜98%相同であるウシタンパク質(同様の由来)は、
双方ともホモログと認められる。他の有機体からクローニングされるホモログc
DNAは、ホモログのタンパク質を産生する。
同様に、アミノ酸配列のみに基づいて、タンパク質をホモログと認められるこ
とができる。アミノ酸シークエンスの実際的な制限により、例えば、タンパク質
の最初の50個のアミノ酸を比較して、タンパク質が他のものと相同であるかを
決定することができる。したがって、90%の相同では、ホモログタンパク質の
最初の50個のアミノ酸鎖中に5個の異なるアミノ酸が許容される。
縮重した遺伝子コードは、異なるDNA配列に対して、同等の転写物、したが
って同じタンパク質を提供することを、当業者は理解している。ある場合におい
て、同じタンパク質をコードするが、ネイティブなDNAとは異なるDNA配列
の調製には、
−−−シークエンスまたは合成を容易にすること、
−−−タンパク質の発現を増加させること、および
−−−ある種の異種宿主はある種のコドンを他よりも好むこと
を考慮に入れる。
これらの実際的な考慮は周知であり、本発明の使用者に有益となる実施態様を
提供する。したがって、ナイティブのDNAは、本発明で想定される唯一の実施
態様ではないことを明確に企図している。
さらに、タンパク質フラグメントは、スクリーニングやドラッグデザインなど
に有用なものとすることができ、タンパク質全体が本発明の使用には必ずしも必
要ではないことは、当業者に明らかであろう。したがって、タンパク質およびそ
れの使用の開示が、有用なペプチドフラグメントを企図していることを当業者が
理解しているということは明らかに企図されている。
タンパク質の発現、精製の収率、安定性、および溶解性などの実際的な考慮は
、フラグメントを用いるか否かを選択するとき、および用いるフラグメントを選
択するときに、当業者により考慮される。結果として、この開示があれば、当該
技術分野における日常的な操作を用いて、当業者はタンパク質のフラグメントを
用いた本発明を実施することができる。
したがって、本発明はさらに、遺伝子の核酸配列全体より少ない配列の使用、
およびタンパク質のアミノ酸配列全体より少ない配列の使用を具体的に企図して
いる。タンパク質フラグメントをスクリーニングやドラッグデザインなどで用い
ることができ、タンパク質全体は本発明を使用するためには必ずしも必要ではな
い。タンパク質自体を用いて、該タンパク質に対する低分子の結合活性を測定す
ることができる。酵素標的を用いるドラッグスクリーニングは、当該技術分野で
用いられており、自動化された高処理技術を用いて行なうことができる。
タンパク質自体またはプロテアーゼ自体を用いて、タンパク質に対する低分子
の結合活性を測定することができる。酵素標的を使用したドラッグスクリーニン
グは、当該技術分野で用いられており、自動化された高処理技術を用いて行なう
ことができる。
ジスインテグリン活性の阻害は、変形性関節症の治療、および関節軟骨の変性
や組織リモデリングなどのマトリクス分解を有する他の組織の変性を伴う疾患の
治療における効力の予測変数となることができる。遺伝子治療
理論に拘束されるものではないが、メタロプロテアーゼは、組織での変形性関
節症の際、アップレギュレートであると考えられる。驚くべきことに、我々は、
ヒトジスインテグリンが、変形性関節症の状態の際、ヒト軟骨細胞中でアップレ
ギュレートであることを見つけ出した。シグナル形質導入の機構を阻害すること
は、変形性関節症でのカスケード反応の途絶、および軟骨の変性を伴うその他の
疾患において有効である。アップレギュレートが関節症発症の原因である場合、
この遺伝子の活性を妨げることは変形性関節症の治療に有効なものとすることが
できることを、当業者は理解している。
これは、遺伝子(すなわちアンチセンス)治療を含む、いくつかの方法のいず
れによっても行われる。プロテアーゼの精製
組換えジスインテグリン、または全長該タンパク質のフラグメントを含有する
、哺乳動物、酵母、昆虫、または真核細胞から得られる培地、細胞抽出物、また
は封入体を、ジスインテグリンまたはジスインテグリンフラグメントの精製に用
いる。連続的なクロマトグラフィー樹脂による精製の前、または分離の最終段階
の後に、変性ジスインテグリンから成る溶液をリホールドする。所望ならば、オ
クチルグルコシド、尿素、またはジメチルスルホキシドなどの界面活性剤、変性
剤、または有機溶媒の1つまたは組み合わせの存在下で、培地、細胞抽出物、ま
たは可溶化ジスインテグリンを調製する。不純となっている細胞材料から組換え
ジスインテグリンを分離するために、イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水
性相互作用クロマトグラフィーを、それぞれまたは組み合わせて用いる。このよ
うな物質をカラムにアプライし、そしてpHの調整、イオン強度の変化、変性剤
の添加、および/または有機溶媒の使用により、ジスインテグリンを溶離する。
一般的には、次いで、ジスインテグリンの部位特異的な精製のために、ジスイン
テグリン含有溶液を、イムノアフィニティーカラムまたはリガンドアフィニティ
ーカラムに通す。イムノアフィニティーカラムは、セファロース4B(Phar
macia社)にまたは別の類似基材などの固体支持体に固定化された、ジスイ
ンテグリンに特異的な抗体を含む。好ましくは、カラムを洗浄して結合していな
いタンパク質を取り除き、そして低pHグリシンバッファーまたは高イオン強度
によりジスインテグリンを溶離する。リガンドアフィニティーカラムは、ジスイ
ンテグリンの活性部位、または活性部位に近接したもしくは活性部位を除去した
部分に特異性を有することができる。カラムを洗浄し、そして溶離バッファーに
競合分子を添加することによりジスインテグリンを溶離する。ベンズアミジン、
ルペ
プチン(leupeptin)、ホスホルアミドン(phsphoramidon)
、フッ化フェニルメチルスルホニル、および1,10−フェナントロリンなどの
1つまたは複数のプロテアーゼ阻害剤を含有するプロテアーゼ阻害剤のカクテル
は、精製処理全体を通して存在することが好ましい。オクチルチオグルコシドお
よびトライトンX−100またはグリセロールなどの化学剤を添加して、ジスイ
ンテグリンの溶解性および安定性を増大することもできる。所望ならば、タンパ
ク質の最終精製を、クロマトグラフィー支持体を通してゲル濾過により行う。プロテアーゼ阻害剤
本発明プロテアーゼを用いて、プロテアーゼの阻害剤を見つけ出すことができ
る。したがって、本発明プロテアーゼは、スクリーニングのツールとして、また
は合理的なドラッグデザインに有用である。理論に拘束されるものではないが、
プロテアーゼは、細胞のリモデリングを調節することができ、実際に細胞外マト
リクスのリモデリングを促進し、したがって組織分解を促進することができる。
したがって、ジスインテグリンの阻害は、これらの過程により特徴づけられる疾
患の治療に対する治療ルートを提供するものである。
スクリーニングにおいて、薬化合物を用いて、阻害の特質および量の双方を測
定することができる。結果として、スクリーニングは、これらの疾患の治療に有
用な活性体、好ましくは低分子活性体の選択についての情報を提供する。
治療において、低分子量の合成メタロプロテアーゼ阻害剤(マトリクスメタロ
プロテアーゼを阻害することに用いるものなど)を結合することにより、ジスイ
ンテグリンメタロプロテアーゼ活性を阻害することを用いれば、細胞外マトリク
スのリモデリングを阻害するであろう。タンパク質に対する抗体
メタロプロテアーゼ阻害剤を抗体またはそのフラグメントに結合することによ
り、メタロプロテアーゼを標的とすることができる。結合方法は、当該技術分野
で知られている。次いで、これらの抗体は、治療および阻害剤用量をモニターす
ることの双方に有用である。
本発明の抗体を、固体支持体に結合することもできる。所望のメタロプロテア
ーゼ、好ましくはジスインテグリンの精製用の親和性試薬として、これらの結合
物
を用いることができる。
別の態様において、標識と本発明の抗体を直接結合することができる。抗体が
メタロプロテアーゼに結合しているとき、該標識を用いて、in vivoまた
はin vitro細胞培養物中の比較的高レベルのメタロプロテアーゼの存在
を検出することができる。
例えば、意図する標的組織のマーカーと特異的に反応する、標的リガンドを用
いることができる。本発明化合物を標的リガンドに結合する方法は周知であり、
担体への結合方法(下記)と同様である。結合物を製剤化し、上記のように投与
する。抗体の調製および使用
いくつかの方法により抗体を産生することができ、例えば、タンパク質をマウ
スやウサギなどを含む適当な(例えば、哺乳動物)対象に注射する。好適なプロ
トコルには、血清中の抗体の産生を増進する計画にしたがって、アジュバント存
在下で免疫原を繰り返し注射することが含まれる。今や当該技術分野で標準的な
イムノアッセイ方法を用いて、免疫血清のタイターを容易に測定することができ
る。
得られた抗血清を直接使用し、または、抹消血リンパ球もしくは免疫された動
物の脾臓を回収して抗体産生細胞を不死化することによりモノクローナル抗体を
得て、続いて標準的なイムノアッセイ技術を用いて適当な抗体の産生体を同定す
ることができる。
モノクローナルまたはポリクローナル調製品は、本発明の化合物を用いるモニ
タリング治療または予防摂生に有用である。本発明の抗体調製品を使った標準的
なイムノアッセイ技術を用い、治療プロトコール中の種々の時間におけるタンパ
ク質の存在について、血液、血清、尿、または唾液などから得られる適当な試料
を検査することができる。
標準的な結合方法を用いて、これらの抗体を、Tc−99またはI−131な
どのシンチグラフィー標識などの標識と結合することもできる。標識化合物を対
象に投与し、in vivoでの過剰な量の1つ以上のメタロプロテアーゼの存
在位置を測定することができる。したがって、タンパク質に対する標識抗体は、
疾患を示すこのような発現増加のスクリーニングのツールとして働く。
したがって、メタロプロテアーゼを選択的に結合する抗体の能力は、インサイ
チューのこれらの酵素分布をマップするのに利用される。該技術を組織学的方法
において用いることができ、標識抗体を競合イムノアッセイにおいて用いること
ができる。
既知の方法を用いて、抗体を他の化合物または基材に有利に結合することがで
きる。例えば、カルボキシル官能基を有する基材であるカルボキシル残基をアル
デヒドに還元し、そして側鎖アミノ基との反応により担体に結合し、続いて任意
選択で、形成されたイミノ結合を還元することができる。ジシクロヘキシルカル
ボジイミドまたはその他のカルボジイミド脱水試薬などの縮合試薬を用いて、カ
ルボキシル残基を側鎖アミノ基と反応させることもできる。リンカー化合物を用
いて結合することもできる。ホモ二官能リンカーおよびヘテロ二官能化合物リン
カーをPierce Chemical Company社(イリノイ州ロック
フォード)から入手する。
これらの化合物は、適当なクロマトグラフィー基材に結合した場合、タンパク
質を単離するのに有用である。アフィニティークロマトグラフィーを用いる分離
方法は当該技術分野で知られており、当業者が理解している範囲内にある。疾患マーカー
上記で述べたように、本発明は、疾患組織の試料を含む試料中でのメタロプロ
テアーゼ遺伝子の発現を検出することを企図している。本発明は、核酸の起源の
性質(DNAであるか、RNAであるか)により制限されることを意図しておら
ず、哺乳動物(例えば、ガン組織やリンパ球)の起源を含むがこれには限定しな
い種々の起源を企図している。
理論に拘束されるものではないが、遺伝子、好ましくはこの遺伝子の発現は、
制限的な組織分布を有していてもよく、その発現は、潜在的な変形性関節症メデ
ィエーターにより、アップレギュレートされる。例えば、この遺伝子(したがっ
て該遺伝子のタンパク質)の関節軟骨細胞での発現の増大は、最初期の無症候性
の段階を含む発達と、変形性関節症の進行とをモニターするためのマーカーを提
供する。したがって、該タンパク質に対して作製された抗体は、疾患を示すこの
よ
うな発現の増大に対するスクリーニングのツールとして働く。
さらに、疾患スクリーンで抗体を用いる場合、該抗体を、発色団または発蛍光
団を含む物質に結合することができ、またはある条件で発色団または発蛍光団を
産生する酵素に結合することができる。これらの結合物質および結合方法は、当
該技術分野で周知である。このような方法で用いた場合、イムノアッセイによる
タンパク質の検出は、当業者には難しいものではない。メタロプロテアーゼの分
布またはこれらのプロテアーゼ濃度の増加レベルを較正および検出するために、
例えば体液(血清、尿、および滑液)をこの方法でクリーニングすることができ
る。
このように用いる場合、本発明は、変形性関節症、その他の関節性軟骨変性疾
患、または細胞外マトリクスの分解またはリモデリングにより特徴づけられるそ
の他の疾患などのメタロプロテアーゼが仲介する疾患の有用な診断マーカーおよ
び/または臨床マーカーとなる。疾患が検出されれば、症状または衰弱が始まる
前に疾患を治療することができる。
さらに、上記の検出または治療のため、このような抗体を標的患部組織に用い
ることができる。核酸由来ツール
細胞の核酸の内容は、デオキシリボ核酸(DNA)およびリボ核酸(RNA)
である。DNAは、細胞の遺伝的な計画を含んでいる。RNAは、DNA配列に
基づいたタンパク質生成において中間体として関与する。RNAは、細胞内で、
翻訳に関与するストラクチュラルRNA(すなわち、リボゾームRNA「rRNA」
)、トランスファーRNA(「tRNA」)、およびメッセンジャーRNA(「mR
NA」)の3つの形態で存在する。mRNAは、DNA中にコードされる遺伝子
情報と対応するタンパク質との間の中間体分子であるため、任意の所与の時間に
おける細胞のmRNA成分は、細胞の生理学的な状態を表している。したがって
、細胞の分子生物学を研究し利用するために、mRNAを精製すること(試料の
すべての核酸からmRNAを精製することを含む)ができることが重要である。
RNAの調製は、RNAを分解するRNase(例えば、T.Maniati
s.他、Molecular Cloning、Cold Spring Ha
rbor Laboratory、188〜190頁、1982年)の存在によ
り複雑となる。さらに、増幅可能なRNAの調製は、RNAに関連するリボ核タ
ンパク質の存在により困難となる(R.J.Slater、In:Techni
ques in Molecular Biology、J.M.Walter
およびW.Gaastra、Macmillan編、ニューヨーク州、113〜
120頁、1983年を参照して頂きたい。)
一般的に、細胞由来の核酸の精製に含まれる工程は、1)細胞溶解と、2)細
胞ヌクレアーゼの不活性化と、3)細胞破壊物および他の核酸からの所望の核酸
の分離とを含む。細胞溶解は、酵素処理、界面活性剤処理、またはカオトロピッ
ク剤処理を含む種々の方法により達成することができる。細胞ヌクレアーゼの不
活性化は、プロテアーゼを用いることおよび/または強塩を用いることにより達
成することができる。最後に、所望の核酸の分離は、一般的に、フェノールまた
はフェノール−クロロホルムで核酸を抽出することにより達成することができる
。この方法では、試料を、水層(核酸を含んでいる)および有機層(タンパク質
を含むその他の細胞成分を含んでいる)に分ける。一般的に用いられるプロトコ
ールでは、フェノール結合塩の使用を必要とし(P.Chomczynskiお
よびN,Sacchi、Anal.Biochem、162巻、156頁、19
87年)、またはタンパク質を除去する遠心工程を行う(R.J.Slater、
上記)。
核酸分画が細胞から単離されると、mRNA分子の構造を、DNAおよびその
他のRNA分子からのmRNAの精製の補助に用いることができる。高等生物の
mRNAは通常、その3’末端においてポリアデニル化されているため(「ポリ−
Aテイル」または「ポリ−Aトラック」)、細胞からmRNAを単離する1つの方法
は、ポリ−Aテイルを、セルロースなどの支持体に結合されているそれの相補的
な配列(すなわち、オリゴ−dT)と結合させることに基づいている。一般に、
ハイブリダイズしたmRNA/オリゴ−dTを、遠心分離により、または磁気形
式の場合には磁場にさらすことにより、試料中に存在する他の成分から分離する
。ハイブリダイズしたmRNA/オリゴ−dTを他の試料成分から分離したら、
通常、mRNAをオリゴ−dTから取りはずす。しかしながら、ある種の用途に
お
いては、mRNAを、固体支持体に結合しているオリゴ−dTに結合したままに
しておくことができる。
オリゴ−dTが結合されている非常に種々の固体支持体が開発され、市販され
ている。ラテックスビーズおよび常磁性粒子に共役結合しているオリゴ−dTを
有する形式のものも開発され市販されているが、セルロースが依然として、ほと
んどのオリゴ−dTシステムにおける最も一般的な支持体である。ビオチン化オ
リゴ−dTが溶液中でmRNAにアニールするビオチン−アビジン系において、
常磁性粒子を用いることができる。次いで、該ハイブリットを、ストレプトアビ
ジンでコーティングした常磁性粒子で捕捉し、磁場を用いて分離する。これらの
方法に加え、スパン−カラム形式のものにおいて真核生物の全RNAからポリア
デニル化RNAをアフィニティ−精製するなどの、別のものも存在する。これら
のアプローチによりポリ−AmRNAとのハイブリダイゼーションが可能となる
が、効果および感度においては異なる。
1つの実施態様において、mRNAを逆転写酵素で処理してcDNAを作製す
る。cDNAは、プライマー伸長およびプライマーを用いる下記のPCRで用い
られる。したがって、本発明は、下記のプライマーを用いたプライマー伸長によ
り検出可能な核酸分子を企図している。プライマー伸長(およびPCR)は、(
部分的に相補的な核酸とのハイブリダイゼーションとは対照的に)相補的な核酸
だけがハイブリダイズするように、条件(いわゆる「ハイストリンジエンシ一条件」
)下で行うことができる。これらの条件には、二本鎖の融解温度またはその近く
の温度でアニールすることを含む。特異的なジスインテグリンメタロプロテアーゼ遺伝子に対してディレクトされて いるプライマー
本発明は、ジスインテグリンメタロプロテアーゼ遺伝子の発現を他の中から検
出するのに有用な、新規なジスインテグリンメタロプロテアーゼ遺伝子の、全長
タンパク質コード領域の部分核酸配列を提供する。1つの実施態様において、こ
の部分配列の一部に対してディレクトされているプライマーを用いて、該遺伝子
配列の存在または不存在を検出することができる。これらのプライマーを用いて
、該遺伝子全体を提示するcDNAクローンを同定することができ、これにより
、
宿主細胞におけるジスインテグリンメタロプロテアーゼまたはそのフラグメント
(または変異体)をコードする該核酸配列の組換え発現が可能となる。
好適なプライマーは、プライマー配列番号9(5’−AGCCTGTGTC−
3’)および配列番号10(5’−AGCCTGTGTCTGAACCACT−
3’)である。しかしながら、配列番号5および配列番号1に定められている配
列から、その他のプライマーも容易にデザインすることができる。ディファレンシャルディスプレイによる生物学的試料の比較方法
反応物由来の産物の特徴により、増幅が成功したかを確認することができる。
伸長産物またはPCR産物を検出する方法より、本発明が制限されることは意図
していない。1つの実施態様において、PCR産物を、2%アガロースゲル(B
RL)を用いて高分解能アガロースゲル電気泳動により分析し、エチジウムブロ
マイド染色およびUVトランスイルミネーションにより、増幅されたDNAフラ
グメントを可視化する。本発明は、1つの実施態様において、電気泳動を用いて
産物の形成を確認し、試料間の結果を比較することを企図している。
したがって、本発明は、核酸(例えば、cDNAまたはRT−mRNA)混合
物中の新規なジスインテグリンメタロプロテアーゼ遺伝子の配列を検出すること
を企図している。核酸混合物についてPCRを行い、産物をゲルに流すことによ
り、プライマーにより特徴づけられる配列を含む核酸を「単離」する。次いで、
ゲルからバンドを切り出すことにより(または電気的溶離などの他の方法により)
、産物を「精製」する。配列リストの概要
読者の補助のため、配列リストの相互関係を以下に記載する。
配列番号1は、断片的なDNA配列であり、配列番号3の一部である。配列番
号1の最初の塩基(シトシンまたはC)は、配列番号3の940番目の塩基であ
る。重なっている所のDNA配列は同一である。
配列番号2および配列番号4はそれぞれ、配列番号1および配列番号3の発現
アミノ酸配列である。配列番号2の最初のアミノ酸配列であるGlnは、配列番
号4の309番目のアミノ酸である。この2つの配列は、タンパク質カルボキシ
ル末端まで相同である。
配列番号7は、ディファレンシャルディスプレイ実験によって与えられたDN
Aセンス鎖である。配列番号7の最初の塩基は、配列番号1の塩基1371に対
応し、配列番号3の塩基2310に対応する。これらの配列は、配列番号1の塩
基1822および配列番号3の塩基2761までの452塩基について、相同で
ある。配列番号1と配列番号3の最後の2塩基における違いは、シークエンスに
おける誤りまたはPCRに見出される一般的な複製の誤りに起因するか、あるい
はクローニングベクターの一部である。配列番号7は、相同部分よりも284塩
基延びており、したがって配列番号1および配列番号3の末端を大きく超えてい
る。
さらに、配列番号7の塩基477〜716は、配列番号6である。配列番号6
は、ディファレンシャルディスプレイクローニングにより見い出されたアンチセ
ンス鎖である配列番号5のセンス鎖である。したがって、配列番号6は、これが
mRNA中に現れる場合、DNAの向きを示す。これらの2つの配列は、この遺
伝子の3’末端の近くに見られる。
配列番号7の塩基452から3’末端は、配列番号1および配列番号3と異な
るが、それにもかかわらず配列番号7は有効である。発現ペプチド配列が、この
相違により影響を受けないことを示していることは重要である。選択的ポリアデ
ニル化シグナルを用いているゆえに、これらの塩基は、配列番号1および配列番
号3に現れないようである。
配列番号8は、新規な全長DNA配列である。配列番号9は、新規な配列番号
8の発現タンパク質である。配列番号9は、配列番号4のアミノ酸162(Se
r)〜213(Try)が、配列番号9の162位においてAsnの1残基に置
換されている点で、配列番号4とは異なる。その変化は、DNA中において全部
で153塩基となる塩基501〜654の欠失により反映されており、リーディ
ングフレームはそのままであるが、1残基が変化し、配列番号4に存在する51
個のアミノ酸を欠失している。
配列番号10および配列番号11は、PCRにおいて有用なアンチセンスプラ
イマーであり、配列番号7の3’末端のインバースであり、プライマーについて
のその他の配列は、本明細書中で引用する配列を使用して当業者により識別でき
る。実施例
以下の非限定的な実施例は、本発明の好適な実施態様を例示し、本発明の使用
について簡潔に記載したものである。これらの実施例は、当業者の手引きのため
に提供され、本発明をまったく限定するものではない。本開示またはこれらの実
施例を用いることにより、当業者は請求の範囲に記載された発明を作製し、使用
することができる。
標準的な出発物質をこれらの実施例で用いる。これらの物質の多くは、知られ
ており、市販されている。例えば、E.coli CJ236およびJM101
は既知の株であり、pUB110は既知の方法であり、Kunkel突然変異誘
発法は当該技術分野で周知である。さらに、ある種の細胞系およびcDNAは市
販されており、例えば、U−937はClontech Inc社(カルフォル
ニア州パロアルト)から市販されている。
発現系により、および種々の宿主における種々の方法により、変異体を作製す
ることができ、これらの方法は、分子生物学、生物化学、またはバイオテクノロ
ジーに関係するその他の技術分野における当業者の実施範囲内にある。
実施例1
非刺激およびインターロイキン1で刺激した正常なヒト関節軟骨細胞の培養物
から、RNAを単離する。RNAを逆転写してcDNAとする。一連の任意のプ
ライマーを用いて、該cDNAを、変形ディファレンシャルディスプレイ法にか
ける。
刺激した関節軟骨および非刺激関節軟骨双方から生成されたPCR産物を、ポ
リアクリルアミドゲル上の隣接した列において電気泳動する。相違的に発現して
いるバンド(differentially expressed band)
をゲルから切り出し、クローニングし、そしてシークエンスする。RNaseプ
ロテクションおよび核の移動実験により、遺伝子の相違的発現を確認する。
実施例2
インターロイキン1で刺激したヒト関節(大腿骨頭)軟骨細胞の初代培養物に
由来するタンパク質をコードする新規な部分ヒトcDNAを、既知の方法を用い
てクローニングする。同じ配列が見い出され、ヒトcDNAライブラリーをスク
リーニングして全長クローンを得ることにより、遺伝子を完全なものとする。
実施例3
既知の方法を用いて、実施例2のクローニングしたDNAをpUB110中に
組み込む。
このプラスミドは、E.coliを形質転換して、新たな変異体を作製するた
めの部位特定突然変異誘発用の鋳型を提供するのに用いられる。Kunkel突
然変異誘発法を行い、Gln1をAlaに変えた。
実施例4
IODOBEADS(Pierce社、イリノイ州ロックフォード;非多孔性
ポリスチレンビーズ上の固定化クロラミン−T(chloramine−T))を
用いて、[125I]ジスインテグリン抗体を調製する。凍結乾燥した抗体(2μ
l)を、10mMの酢酸50μl中に溶解し、氷上でリン酸緩衝生理食塩水(P
BS)(Sigma社、ミズーリ州セントルイス)450μlに加える。チュー
ブに、5μl中125I(Amersham社、イリノイ州アーリントンハイツ)(
2200Ci/mmol)500μキュリーを加え、IODOBEADを1つ加
える。時々振とうしながら、氷上で10分間、反応物をインキュベートする。次
いで、IODOBEADから得られる反応物を除去することにより、反応を終了
する。混合物をPD−10ゲル濾過カラムにアプライして、未反応の125Iを取
り除く。
実施例5
ジスインテグリンメタロプロテアーゼ螢光原基質ペプチド(Bachem、G
uelph Mills、King of Prussia、ペンシルベニア州
)をジスインテグリンと混合し、コントロールとして2分後の螢光の変化を評価
する。次いで、分離流出中の評価する化合物(メタロプロテアーゼ阻害剤)の存
在下、2〜12時間にわたって種々の時点で評価をしながら、螢光原ペプチドを
ジスインテグリンと混合する。標準的な方法論を用いてデータを評価し、評価化
合物の相対結合度を求める。
実施例6
患者の左膝から滑液0.5mlをとり、ジスインテグリンの上昇レベルをEL
ISAで検査する。結果は、正常なジスインテグリンのレベルよりも高いことを
示している。予防用量のジスインテグリン阻害剤を長時間にわたり経口投与して
患者を処方するか、診療所を出る前に同じものを左膝に注射することにより患者
に投与する。
実施例7
ジスインテグリンメタロプロテアーゼ活性の阻害により、細胞外マトリクスリ
モデリングの阻害を見つけ出す。低分子量の合成メタロプロテアーゼ阻害剤(マ
トリクスメタロプロテアーゼを阻害するものなど)を用いて、組織保全性および
プロテオグリカンをモニターする。
関節軟骨由来のIL−1で刺激したウシ鼻軟骨試料を、1マイクロモルの低分
子量ジスインテグリン阻害剤の溶液中で増殖させる。実験を制御し、そして阻害
剤なしで増殖させた同一の培養物と比較する。
7日後の培養物の分析により、阻害された培養物は、組織の分解がより少なく
、培養血清中に存在するプリテオグリカンがより少ないことを示している。この
結果は、アグレカナーゼの活性が阻害されたことと一致する。アグレカナーゼの
阻害は、組織分解を妨げ、プリテオグリカンの放出を減じる。
実施例8
膜結合型のジスインテグリンメタロプロテアーゼドメインの放出となるタンパ
ク質分解処理の阻害は、膜結合ジスインテグリン分子の「第2メッセンジャー」
シグナル伝達を阻害する。このような第2メッセンジャーのシグナル伝達により
、細胞表現型の変化、遺伝子発現の変化、および有糸分裂活性の変化などとなる
。
ジスインテグリンを含むことが知られている細胞をセリンプロテアーゼで処理
する。この細胞から放出されたタンパク質を標準的な方法で測定する。特に、メ
タロプロテアーゼの活性を文献記載の方法によりモニターする。放出されたメタ
ロプロテアーゼの量は、該細胞の処理に用いたセリンタンパク質の量と相関する
。
ジスインテグリンメタロプロテアーゼの開裂および放出の後、ホスホチロシン
に特異的なモノクローナル抗体を用いて分子内タンパク質のウエスタンブロット
分析により、コントロールに対するsrcチロシンキナーゼ活性の増加分を測定
する。コントロールは、セリンプロテアーゼで処理していない細胞である。
細胞中(または細胞培養中)のsrcチロシンキナーゼ活性を文献記載の方法
で測定する。ジスインテグリンのメタロプロテアーゼドメインの放出も、文献記
載の方法でモニターする。メタロプロテアーゼドメインの放出と分子内srcチ
ロシンキナーゼ活性の増加分の間には、直接的な相関がある。この結果は、sr
cチロシンキナーゼカスケードを刺激すると、ジスインテグリン仲介細胞シグナ
リングが刺激されることと一致する。
実施例9
RGD配列を含有するペプチドを用いて、インテグリン結合を測定する。分子
間接着分子または細胞外マトリクス構成成分を阻害すると、そのような相互作用
に関連する、細胞の形状の変化を含む表現型の変化を阻害する結果となる。顕微
鏡により視覚的に認められる細胞形状の変化を用いて、競合アッセイにより、イ
ンテグリン結合を測定する。該ペプチドはそのような細胞の変化を阻害する。
この結果は、ジスインテグリンの相互作用と競合すること、またはジスインテ
グリンの相互作用を妨げることと矛盾していない。RGDペプチドは、軟骨細胞
での細胞変化を阻害する。マトリクス合成の増加およびマトリクスメタロプロテ
アーゼ活性の促進に特徴づけられる変形性関節症の表現型は、起こらない。その
他の容易に分析可能な細胞の変化を用いて、遺伝子発現や有糸分裂活性の変化な
どを含むこの結果をモニターする。
実施例10
低分子量のメタロプロテアーゼ阻害剤を用いて、実施例7に記載した方法にし
たがって組織培養を処理する。細胞膜からのTNF−αの放出を文献記載の方法
で測定する。実施例7の阻害剤は、細胞膜から分泌されるTNF−αの量も減じ
る。
したがって、ジスインテグリンメタロプロテアーゼ活性の阻害は、ジスインテ
グリンが関連する炎症のカスケードおよび分泌酵素の活性を阻害する結果となる
ことが企図されている。細胞膜などからのサイトカインまたはIL−1の放出を
モニターしても同じ結果となることが企図されている。
実施例11 疾患のディファレンシャルディスプレイスクリーニング
非刺激およびインターロイキン1で刺激した正常なヒト関節軟骨細胞の培養物
から、RNAを単離する。RNAを逆転写してcDNAとする。上で言及したプ
ライマーを用いて、cDNAを増幅する(PCR)。刺激した関節軟骨および非刺
激関節軟骨双方から生じたPCR産物を、ポリアクリルアミドゲル上の隣接した
列において電気泳動する。相違的に発現しているバンド(すなわち、刺激された
細胞でのみに見られるバンドで、非刺激細胞では有意なまたは検出可能なレベル
で発現していない)をゲルから切り出し、クローニングし、そしてシークエンス
する。配列番号5に部分配列を示す。この配列は、ラットメタロプロテアーゼ(
上記)と約60%の相同を示すことが判明した。この配列は、ヒトメタロプロテ
アーゼと約85%の相同を示すことが判明した(遺伝子バンク登録番号第Z48
597を参照のこと、配列番号2を参照のこと)。
実施例12 腫瘍の転移潜在能力のスクリーニング
メタロプロテアーゼ遺伝子発現について、ガン組織を検査した。上で言及した
プライマーを、試料からの抽出した核酸でのPCRにおいて用いる。高レベルの
転写物は、転移潜在能力を示している。
実施例13 発現阻害剤のドラッグスクリーン
メタロプロテアーゼ遺伝子発現の阻害剤候補を、in vitroでスクリー
ニングする。インターロイキンで刺激した正常な関節軟骨細胞培養物を、in
vitroで阻害剤候補にさらす。RNAを単離し、逆転写してcDNAとする
。上で言及したプライマーを用いて、cDNAを増幅する(PCR)。阻害剤にさ
らした軟骨細胞および阻害していない関節軟骨双方から産生されたPCR産物を
、ポリアクリルアミドゲル上の隣接した列において電気泳動する。PCR産物の
減少レベルにより阻害剤を同定する。
実施例14 メタロプロテアーゼ阻害剤のドラッグスクリーン
メタロプロテアーゼそれ自体の阻害剤候補を、in vitroでスクリーニ
ングする。正常なヒト関節軟骨細胞のインターロイキン−1刺激培養物の培養上
清を、阻害剤候補の存在下または非存在下で、適当なメタロプロテアーゼ基質(
例えば、マトリクスタンパク質)でアッセイする。既知の阻害剤(例えば、Si
gma Co.社、セントルイスから市販されている1,10−フェナントロリ
ン)をコントロールとして用いる。基質(例えば、ジスインテグリンメタロプロ
テアーゼ蛍光原基質)分解の減少レベルにより、阻害剤を同定する。
実施例15
標準的なスクリーニング技術を用いて、単球様細胞cDNA系ライブラリーで
あるU−937から1400bpのクローンを単離する。該最初の配列は、短縮
されたクローンであり、5’末端部分が欠けている。既知の方法である5’R.
A.C.E.(Rapid Amplification of 5’c−DN
A Ends、PCR Protocols,A Guide to Meth
ods and Applications、Innis他、Academic
Press社、1990年、の第4章(28〜38頁)およびreferen
cesなどを参照のこと)を用いて5’末端を生じさせて、該残存5’配列を含
有する1600bpのクローンを生じる。これら2つの配列は一緒に配列番号8
を提供し、該ペプチド配列は配列番号8に由来する。
実施例16
プライマーの配列番号9(5’−AGCCTGTGTC−3’)および配列番
号10(5’−AGCCTGTGTCTGAACCACT−3’)を、mRNA
のディファレンシャルディスプレイ(ddrd−PCR)で用いる。sscDN
A2〜5ngをPCRで用いる。反応物を、薄肉チューブ2μlで氷上において
予め冷却する。各チューブには、50mMのTris−HCl(pH 8.5)、
50mMのKCl、1.5mMのMgCl2、1mMの各dNTP、2〜5ng
のsscDNA、10pモルの上記の各プライマー、0.5μlのα−P33dC
TP(10μCi/μl、Amersham社)、および20μlになるように水が
含まれる。Perkin−Elmer System 2400 Therma
l Cycler(Perking−Elmer社、コネティカット州ノーウォ
ーク)用いて、混合物に対し、変性(90℃、30秒)、アニール(36℃、30秒
)、
および伸長(72℃、1分)を35サイクル行う。
この方法により、IL−1を処理した軟骨細胞は、この遺伝子に関連するmR
NAを発現した。一方、処理していない(IL−1なし)コントロール軟骨細胞
は検出可能なmRNAを発現しなかった。
実施例17 高処理スクリーニングを容易に行うことができるアッセイシステム
キネティック酵素阻害アッセイにおいて、蛍光原を用い、ジスインテグリンの
プロテアーゼ活性を測定する。クローニングしたジスインテグリン酵素および低
MW蛍光標識タンパク質を基質として用いる。室温における基質分子の開裂後に
蛍光を測定することにより、酵素活性を定量化する。このアッセイは、簡単でか
つ自動化が非常に容易である。
標準的な技術を用いて、このアッセイを96個または384個のウェルプレー
トに用いる。
本明細書中に記載されたすべての引用は、その内容を引用することにより、本
明細書中に取り入れる。
対象発明の具体的な実施態様を記載したが、本発明の真意および範囲から逸脱
することなく、対象発明の種々の変化および変更を行うことが可能であることは
、当業者にとっては自明であろう。付随する請求の範囲において、本発明の範囲
内にあるそのような変更はすべて包含することを意図する。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考)
G01N 33/53 C12N 15/00 ZNAA
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L
U,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF
,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,
SN,TD,TG),AP(GH,GM,KE,LS,M
W,SD,SZ,UG,ZW),EA(AM,AZ,BY
,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM),AL,AM
,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BY,
CA,CH,CN,CU,CZ,DE,DK,EE,E
S,FI,GB,GE,GH,GM,GW,HU,ID
,IL,IS,JP,KE,KG,KP,KR,KZ,
LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV,MD,M
G,MK,MN,MW,MX,NO,NZ,PL,PT
,RO,RU,SD,SE,SG,SI,SK,SL,
TJ,TM,TR,TT,UA,UG,UZ,VN,Y
U,ZW
(72)発明者 ティンダル,マイケル,ハワード.
アメリカ合衆国 45215 オハイオ州 ワ
イオミング コディー パス 620
(72)発明者 ハッキ,タリク,メイムード.
アメリカ合衆国 44118 オハイオ州 ク
リーブランド ハイツ カンタベリー ロ
ード 2625
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.ジスインテグリン拮抗作用のスクリーンと、ドラッグデザインと、スクリー ンニングとに用いることが可能な配列番号9のヒトジスインテグリンまたはその フラグメントをコードする、関節炎の発達の際に相違的に発現することを特徴と する、DNAフラグメント。 2.請求項1に記載のDNAによりコードされる、本質的に純粋な形態であるこ とを特徴とする、ヒトジスインテグリンまたはそのフラグメント。 3.請求項1に記載のジスインテグリンを含むことを特徴とするヒトジスインテ グリンに結合可能な化合物のスクリーニング方法。 4.請求項1に記載のジスインテグリンを含むことを特徴とするヒトジスインテ グリンに結合可能な化合物用のスクリーニングキット。 5.請求項2に記載のジスインテグリンに対する抗体またはそのフラグメントを 含有することを特徴とする、変形性関節症のスクリーニングキット。 6.請求項1に記載のDNAを含有することを特徴とする発現ベクターまたはプ ラスミド。 7.配列番号8に定められている配列を含有することを特徴とする請求項1に記 載の単離核酸分子。 8.配列番号10および配列番号11から成る群から選択されるプライマーを用 いたプライマー伸長により検出が可能であることを特徴とする請求項1に記載の 核酸分子。 9.A)インターロイキン−1で刺激した軟骨細胞培養物の一部をメタロプロテ アーゼ遺伝子発現阻害剤の候補にさらすことと、 B)前記さらした一部から、メタロプロテアーゼ遺伝子に対応するmRNAを含 むRNAを単離することと、 C)前記さらした一部から得られる前記メタロプロテアーゼ遺伝子の前記mRN Aのレベルを、前記さらしていない軟骨細胞培養物部分でのmRNAレベルと比 較することと、 D)阻害剤であることを示す、前記mRNAの減少レベルを観測することと を含むことを特徴とする請求項3に記載の方法。 10.A)阻害剤候補の存在下と、コントロール阻害剤の存在下と、阻害剤の非 存在下とで増殖した、インターロイキン−1で刺激した正常なヒト関節軟骨細胞 培養物の培養上清の試料を単離すること、 B)各試料に、メタロプロテアーゼ活性の検出が可能な基質を加えることと、 C)各試料のメタロプロテアーゼ活性レベルを検出することと を含む請求項3に記載の方法。
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