【発明の詳細な説明】
新規なメタロプロテアーゼファミリーKUZ
本発明は、1996年８月29日付けの米国特許出願No.60/019,390および本特許出
願と同一の表題および発明者による、1997年７月23日付けの米国特許出願No.60/
＿,＿(事件番号B97-081/p)(これら特許出願各々の全体を本発明の参考とする)に
基く優先権を主張する。
発明の属する分野
本発明は、発生に関与する蛋白質および遺伝子の新規ファミリーに関するもの
である。
発明の背景
細胞-細胞相互作用は、多細胞生物の発生中の、細胞の運命決定およびパター
ン形成の調節において重要な役割を演じている。局所的細胞相互作用において中
心的な役割を演じている進化上保存される経路の一つは、ショウジョウバエ(Dro
sophila)のノッチ(Notch)(N)遺伝子、およびその獣医学的同族体C.エレガンス(e
legans)の遺伝子lin-12およびglp-1によりコードされる膜貫通レセプタによって
媒介される(Artavanis-Tsakonas,S.,et al.(1995)Notch Signaling.Science 268
,225-232に概説されている)。以下これらを全体としてNOTCHレセプタと呼ぶ。幾
つかの証拠は、該NOTCHレセプタのタンパク分解処理が、その機能にとって重要
であることを示唆している。例えば、完全な長さの蛋白質に加えて、NOTCHレセ
プタの細胞内ドメインに対する抗体が、100-120kdのC-末端フラグメント(以下10
0kdフラグメントと呼ぶ)を検出した(例えば、Fehon，R．G.等、(1990)，Cell 61
，523-534;Crittenden，S．L．等、(1994)，Development 120,2901-2911;Aster,
J.等、(1994),Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.59,125-136;Zagouras,P等
、(1995).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92,6414-6418;およびKopan,R.,等、(1996).P
roc.Natl.Acad.Sci.USA 93,
1683-1688を参照のこと)。しかし、該NOTCH活性化のメカニズムは、これまで殆
ど未知である。
神経発生中、単一の神経先駆体が、側部阻害過程(latera linhibition proces
s)を通して、一群の等価な細胞から選抜され、該過程においては、該出現する神
経先駆体細胞は、隣接する先駆体細胞が同一の運命を辿ることを阻止する(Simps
on,P.(1990),Development,109,509-519に概説されている)。ショウジョウバエに
おける遺伝的研究は、側部阻害におけるＮを含む一群の「神経原性遺伝子」を関
連付けた。該神経原性遺伝子の何れかにおける機能喪失(loss-of-function)突然
変異は、表皮を犠牲にして神経細胞の肥大を生ずる(Campos-Ortega,J.A.(1993)I
n:The Development of Drosophila melanogaster，M．BateおよびA．Martinez-A
rias編,pp.1091-1129.Cold Spring Harbor Press,に概説されている)。我々は、
本明細書において、新規な神経原性遺伝子ファミリー:クズバニアン(kuzbanian)
(kuz)を開示する(Rooke,J.,Pan,D.J.,Xu,T.およびRubin,G.Ｍ.(1996),Science,2
73,1227-1231)。これらの開示される蛋白質のKUZファミリーの構成員は、最近定
義された膜貫通蛋白質のADAMファミリーに属することが示され、その構成貢は、
ジスインテグリン(disintegrin)およびメタロプロテアーゼ ドメイン両者を含
んでいる(Wolfsberg,T.G.,等、(1995).J.Cell Biol.131,275-278，並びにBlobel
,C.R等、(1992),Nature,356,248-252,1992;Yagami-Hiromasa,T.,等、(1995),Nat
ure,377,652-656;Black,R.A.,等、(1997),Nature,385,729-733,1997;およびMoss
,M.L.,等、(1997),Nature,385,733-736に概説されている)。
我々は、更に本明細書おいて、天然産KUZ蛋白質の種々の加工した変異型およ
びその活性をも開示する。我々は、プロテアーゼ活性を欠いた変異KUZ蛋白質が
、内在性のKUZ活性を妨害し、かつ支配的に負であるように機能し(このことは、
天然のKUZのプロテアーゼ活性が、その生物学的な機能にとって本質的なもので
あることを示す)、また支配的に負であることが、神経発生中の側部阻害を撹乱
でき、かつ一次神経の過度の生成を結果することを示す。我々は、また胚中のNO
TCHをタンパク分解して該100kdの種を生成することは、該KUZ突然変異体胚内で
は起こり得ず、また成虫盤または組織培養細胞が、NOTCH
のプロセッシングを遮断する（このことは、該一次NOTCH翻訳生成物が、機能的N
OTCHレセプタの正常な生合成の一部として、天然のKUZ蛋白質によりタンパク分
解的に開裂されることを示す）ことをも示す。
発明の概要
本発明は、単離されたKUZポリペプチド、関連する核酸、KUZ-特異的構造およ
び活性を有するそのポリペプチドドメインおよびKUZ機能、特にNotchプロテアー
ゼ活性のモジュレータに関連する方法並びに組成物を提供するものである。KUZ
ポリペプチド、核酸およびそのモジュレータは、Notchシグナル形質導入経路を
調節し、結果として細胞機能の重要なレギュレータを与える。該ポリペプチドは
、形質転換された宿主細胞、対象とするKUZポリペプチドをコードする核酸から
組み替え法により製造するか、あるいは哺乳動物細胞から精製することができる
。本発明は、単離されたKUZハイブリダイゼーションプローブおよびここに開示
するKUZ遺伝子、KUZ-特異的結合剤、例えば特異的抗体と特異的にハイブリッド
化することができるプライマー、並びに本発明の組成物を製造し、該組成物を、
診断(例えば、KUZ転写物用の遺伝子ハイブリダイゼーションスクリーニング)、
治療(例えば、Notchシグナル形質導入を調節するためのKUZプロテアーゼ阻害剤)
および生薬学工業(例えば、免疫源、付随的な天然kuz対立遺伝子を単離するため
の試薬、リガンドおよび鉛に対する生/化学ライブラリーをスクリーニングする
ための試薬および/または薬理的に活性な試薬)において使用する方法を提供する
。
図面の簡単な説明
第１(A)図は、ショウジョウバエ(DKUZ)、マウス(MKUZ)およびツメガエル(XKUZ
)由来の予想されたKUZタンパクの配列図である。MKUZの完全な長さのアミノ酸配
列は、２つの重複するcDNAクローンのヌクレオチド配列から推定された。XKUZの
部分アミノ酸配列は、PCR生成物のヌクレオチド配列から推定された。該PCR生成
物は、ジスインテグリンおよびCysに富むドメインの一部を含んでいる。これら
の配列は、ゲンワークス(Geneworks)ソフトウエア(イ
ンテリゲネティックス（IntelliGenetics))を使用して作成した。２つの種間で
同一の残基は、強調してある。予想された機能的ドメインを、指示した。縮重PC
Rプライマーを設計したアミノ酸配列は、矢印で示されている。kuzのオーソロガ
ス遺伝子も、C.エレガンス(elegans)(GenBank承認番号Nos.D68061およびM79534)
、ラット(Z48444)，ウシ(Z21961)およびヒト(Z48579)中に存在する。
第1(B)図は、本研究で使用した構築物およびその過剰発現表現型のまとめであ
る。種々のドメインを陰影により示す。星印は、点突然変異が導入された位置を
示す。構築体1-9は、DKUZに基くものであり、一方でMKUZDNは、MKUZに基くもの
である。略号:++,強力な表現型;+,弱い表現型;0,表現型なし。
第1(C)図は、DKUZ、MKUZおよびXKUZの模式的な図である。与えられた百分率は
、MKUZとDKUZまたはXKUZとの間の指定されたドメインにおける配列の同等性を意
味する。
第２図は、KUZプロテアーゼが、如何にして該細胞外ドメイン上でNOTCHをプロ
セッシングして、N-末端細胞外フラグメントおよび該膜貫通および細胞質ドメイ
ンを含むC-末端100kdフラグメントを生成できるかを、模式的に示す図である。
これら２つのフラグメントは、一緒に結合されたままであって、該SEVENLESSレ
セプタの突然変異と同様に、能力NOTCHレセプタとして機能し得る(Simon et al.
,1989)。
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、ショウジョウバエ、ヒト、マウスおよびツメガエルを包含する広範
囲に渡る源から単離された単離KUZポリペプチド、並びに天然産のおよび変更さ
れた分泌型の対立遺伝子変異型、KUZ-特異的配列および/または生活性をもつ欠
失突然変異体および保存性アミノ酸置換を含む突然変異体を提供する。SEQ ID N
OS:1,3,5,7および９は、記載されたKUZファミリーの、夫々ショウジョウバエ、
ヒト膜貫通、ヒト可溶性(膜貫通ドメインを欠いている)、マウスおよびツメガエ
ル構成員をコードする例示的天然cDNAを示す。SEQ ID NOS:2,4,6,8および10は、
対応するコードされた完全な長さのKUZタンパクを示す。該
kuzファミリーの付随的な構成員の単離のために使用した方法は、以下におよび
実施例に記載する。
好ましい翻訳/欠失突然変異体は、少なくとも10、好ましくは少なくとも15の
より好ましくは少なくとも20の残基をもつSEQ ID NOS:2,4,6,8および10の少なく
とも一つのドメインを含む。特に、KUZ誘動体は、置換、付加または欠失によりK
UZ配列を変更することにより、作成することができる。この変更は、機能的に等
価な分子を与える。ヌクレオチドコード配列の縮重のために、kuz遺伝子と実質
的に同一のアミノ酸配列をコードする他のDNA配列を、本発明の実施のために使
用することができる。これらは、kuz遺伝子の全てまたは一部を含むヌクレオチ
ド配列を含むが、これらに制限されず、該kuz遺伝子は、該配列内で機能的に等
価なアミノ酸残基をコードする種々の置換により変更され、かくしてサイレント
変化を生じる。同様に、本発明の該KUZ誘動体は、一次アミノ酸配列として、変
更された配列を含むKUZタンパク質の全てまたはその一部を含むものを包含する
が、これらに制限されない。該変更された配列においては、機能的に等価なアミ
ノ酸配列は、サイレント変化において生じる該配列内の残基と置換される。例え
ば、該配列内の１以上のアミノ酸残基は、機能的に等価なものとして機能して、
サイレント変化をもたらす同様な極性の他のアミノ酸により置換できる。該配列
内のアミノ酸の、保存性の置換は、該アミノ酸が属している該組の他の構成員か
ら選択することができる。例えば、該非極性(疎水性)のアミノ酸は、アラニン、
ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファ
ンおよびメチオニンを含む。極性の中性アミノ酸は、グリシン、セリン、スレオ
ニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンを含む。正に帯
電した(塩基性)のアミノ酸は、アルギニン、リジンおよびヒスチジンを含む。負
に帯電した(酸性)アミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸を包含する。
本発明の特定の態様においては、KUZタンパクの少なくとも10個の(連続する)
アミノ酸からなる、該KUZタンパクのフラグメントからなるまたはこれを含む、
タンパクを、提供する。他の態様において、該フラグメントは、該KUZタンパク
の少なくとも15または20または50個のアミノ酸からなっている。
特定の態様においては、このようなフラグメントは、35、100または200個のアミ
ノ酸以下である。KUZの誘導体または同族体は、KUZタンパクまたはそのフラグメ
ントに対して実質的に相同(例えば、あるドメインを含む同等なサイズのアミノ
酸配列に渡り、例えば少なくとも30％、50％、70％または90％の同一性をもつ)
であるペプチドあるいはそのコード核酸が、コードKUZ配列とハイブリッド化す
ることのできるペプチドを包含するが、これらに制限されない。
該ドメインは、KUZドメイン特異性、例えばKUZ-特異的プロテアーゼまたはプ
ロテアーゼ阻害活性、ジスインテグリンまたはジスインテグリン阻害活性、リガ
ンド/抗体結合または結合阻害、免疫原性等を与える。これについては、例えば
第1A-C図に同定されたドメインを参照のこと。好ましいドメインは、NOTCHタン
パクを開裂する。KUZ-特異的活性または機能は、公知のインビトロ、細胞ベース
、またはインビボアッセイ、例えば動物内等でのインビトロ結合アッセイ、細胞
培養アッセイ(例えば、遺伝子療法、トランスジェニック等)により決定すること
ができる。結合アッセイは、KUZポリペプチドと結合ターゲットとの分子的な相
互作用が評価される、任意のアッセイを包含する。該結合ターゲットは、天然の
細胞内結合ターゲット、例えばKUZ基質、KUZ調節タンパク、あるいはKUZ活性ま
たはその局在化を直接調節する他のレギュレータまたは天然起源以外の結合ター
ゲット、例えば抗体等の特異的免疫タンパク、または例えば以下に記載するよう
な、スクリーニングアッセイ等により同定されるようなKUZ特異的試薬であり得
る。KUZ-結合特異性は、プロテアーゼ活性または結合平衡定数(通常、少なくと
も約107M-1、好ましくは少なくとも約108M-1、より好ましくは少なくとも約109M-1
)、該対象とするポリペプチドの、KUZ-発現細胞内で負の突然変異体として機
能する能力、異種宿主(例えば、ゲッシ目またはラビット)内でKUZ特異的抗体を
分泌する能力等によりアッセイすることができる。好ましいKUZポリペプチドの
該KUZ結合特異性は、必然的にHoward,L.,etal.(1996).Biochem.J.317,45-50のウ
シタンパクの結合特異性とは区別される。
該請求されたKUZポリペプチドは、単離されるか、純粋である:「単離された」
ポリペプチドは、その天然状態において結合している物質の少なくとも幾つかを
伴うことはなく、好ましくは与えられたサンプル中の全ポリペプチドの少なくと
も約0.5重量％およびより好ましくは少なくとも約５重量％で含まれており、ま
た純粋なポリペプチドは、与えられたサンプル中の全ポリペプチドの少なくとも
約90重量％および好ましくは少なくとも約99重量％を構成する。該KUZポリペプ
チドおよびポリペプチドドメインは、合成し、組み換え技術により製造し、もし
くは哺乳動物、好ましくはヒト細胞から精製することができる。広範囲に渡る分
子的および生化学的な方法が、生化学的な合成、目的とする組成物の分子発現お
よび精製のために利用可能である。これについては、例えばMolecular Cloning,
A Laboratory Manual(Sambrook,et al.コールドスプリングハーバーラボラトリ
ー(Cold Spring Harbor Laboratory))、Current Protocols in Molecular Biolo
gy（編者:Ausubel，et al，Greene Publ．Assoc.，Wiley-Interscience，NY）。
あるいはその他の当分野で公知の方法を使用できる。バクテリア細胞(例えば、E
.coh)、酵母(例えば、S．セレビシアエ(Cerevisiae))、動物細胞(例えば、CHO,3
T3,BHK,バクロウイルス-相溶性昆虫細胞等)における、異種組み換えタンパクの
、発現のための材料および方法。該KUZポリペプチドおよび/またはそのドメイン
は、他のタンパクと複合化されない状態で、広範囲の非共有結合で複合化された
状態で、および結合複合体、他のKUZまたは非-KUZポリペプチド配列と共有結合
による複合化された状態(ホモまたはヘテロキメラタンパク)等で与えることがで
きる。
本発明は、請求されたKUZポリペプチドに対して特異的な結合試薬を提供し、
これらは基質、アゴニスト、アンタゴニスト、天然産の細胞内結合ターゲット等
を包含し、また本発明はこのような薬剤の同定並びに製造方法、および該薬物の
診断、治療並びに薬学的な発展における利用にも関連する。例えば、特異的結合
剤は、種々の診断並びに治療用途において、特に疾患または疾患予後が、該タン
パクの関与する経路の不適当な利用と関連する場合に有用である。新規なKUZ-特
異的結合剤は、KUZ-特異的レセプター、例えば体細胞により組み換えられたポリ
ペプチドレセプター、例えば特異的抗体またはT-細胞抗原レセプター(例えば、H
arlow and Lane(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor La
boratoryを参照のこと)、および1-、2-および3-ハイブリッドスク
リーニング等のアッセイにより同定された他の天然の細胞内結合試薬、以下に記
載するような化学ライブラリーのスクリーニングにおいて同定された他の非天然
の細胞内結合試薬等を包含する。特に、興味ある試薬は、KUZ機能例えばKUZ-依
存性タンパク分解プロセッシングを調節する。例えば、広範囲に及ぶKUZNotchプ
ロテアーゼ活性の阻害剤は、Notch関連シグナル導入の調節のために使用できる
。メタロプロテアーゼおよびジスインテグリン並びにこのような阻害剤の設計方
法は、当分野で周知であり、例えばMatrisian,L.TIG,6:(1990),Hooper,N.FEBS L
et.354:1-6(1994),Haas et al.,Cur.Op.Cell Bio.6:656-662(1994),等に記載さ
れている。阻害剤の例は、公知の組のメタロプロテアーゼ阻害剤、KUZ-由来のペ
プチド阻害剤、特に支配的に負の欠失突然変異体等を包含する。KUZ特異性およ
び活性は、プロテアーゼパネルを使用した高処理量のプロテアーゼアッセイで容
易に定量できる。
従って、本発明は、細胞内でNotchに関与するシグナル導入を調節する方法を
提供し、該方法は、例えば該細胞とプロテアーゼ阻害剤とを接触させることによ
り、KUZプロテアーゼ活性を調節する工程を含む。該細胞は、培養液中に、また
はその場、即ち天然の宿主中に存在できる。その場で細胞に適用する方法で使用
するためには、本発明の組成物は、更にしばしば生理的に許容される賦形剤およ
び/または他の薬理的に活性な薬物をも含み、製薬上許容される組成物が生成さ
れる。従って、本発明は、該組成物の投薬上有利な処方物を提供し、該処方物は
、種々の容器内に収容することのできる投与単位を含む。本発明の投与方法は、
一般的に該細胞と有効量の本発明の化合物または製薬上許容される組成物とを接
触させるか、または該宿主に投与することを含む。本発明の組成物および化合物
、並びにその製薬上許容される塩は、任意の有効な方法、例えば経口、非経口ま
たは局所経路で宿主に投与することができる。好ましい阻害剤は、哺乳動物宿主
において経口的に活性である。
一態様において、本発明は、製薬上許容される賦形剤、例えば滅菌塩水または
他の媒体、ゼラチン、オイル等と組み合わせて、製薬上許容される組成物を形成
する化合物を提供する。該組成物および/または化合物は、単独でまたは任意の
有利な担体、希釈剤等との組み合わせとして、投与することができ、またこのよ
うな投与は、単一または多重投与型として与えることができる。有用な担体は、
固体、半固体または水または非毒性有機媒体を包含する液状媒体を包含する。も
う一つの態様において、本発明は、該化合物をプロドラッグとして提供し、該プ
ロドラッグは該レシピエント宿主により、代謝によって目的の化合物に転化でき
る。広範囲に及ぶプロドラッグ処方物が、当分野で公知である。該組成物は、錠
剤、カプセル剤、ロゼンジ、トローチ、硬質キャンデー、粉剤、スプレー剤、ク
リーム、坐剤等として提供できる。薬理的に許容される投与型またはバルクとし
てのこのような組成物は、広範囲に及ぶ容器内に収容することができる。例えば
、投与単位は、種々の容器、例えばカプセル、ピル等に収容することができる。
該組成物は、有利には上記化合物とは異なる、他の治療並びに予防薬剤と組み
合わせることができ、および/またはこれらと組み合わせて使用することができ
る。多くの例において、該目的の組成物との組み合わせによる投与は、かかる薬
物の有効性を高める。これについては、例えばGoodman & Gilman's The Pharmac
ological Basis of Therapeutics,9thEd.,1996,McGraw-Hillを参照することがで
きる。診断用途のためには、該阻害剤または他のKUZ結合剤は、例えば蛍光物質
、放射性物質、化学発光物質、または他の容易に検出できる分子等により、直接
該結合剤と複合化するか、あるいは該結合剤に対して特異的なプローブと複合化
することにより、標識できる。
本発明によれば、KUZタンパク、そのフラグメントまたは他の誘導体、または
その同族体を、免疫原として使用して、このような免疫原を認識する抗体を生成
することができる。このような抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメ
ラ、単鎖、Fabフラグメント、およびFab発現ライブラリーを含むが、これらに制
限されない。特定の態様においては、ヒトKUZに対する抗体を生成する。もう一
つの態様においては、KUZの該細胞外ドメインに対する抗体を生成する。更に別
の態様においては、KUZの該細胞内ドメインに対する抗体を生成する。
当分野で公知の種々の手順が、KUZタンパクまたはその誘導体もしくは類似体
に対するポリクローナル抗体の製造のために使用できる。特定の一態様では、SE
Q ID NOS:1,3,5,7または９またはそのサブ配列からなる群から選択される配列に
よってコードされる、該KUZタンパクのエピトープに対する、ウサギポ
リクローナル抗体を得ることができる。抗体の製造のためには、種々の宿主動物
を、天然のKUZタンパク、またはその合成産物、またはその誘導体(例えば、フラ
グメント)を、注射することにより免疫性を付与することができ、ここで該宿主
動物は、例えばウサギ、マウス、ラット等を含むが、これらに制限されない。該
宿主の種類に応じて、種々のアジュバントを使用して、免疫応答性を高めること
ができ、該アジュバントとしては、フロインド(完全および不完全)、水酸化アル
ミニウム等の無機ゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン
、ペプチド、オイルエマルション、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニト
ロフェノール等の界面活性物質、およびBCG(bacille Calmette-Guerin)およびコ
リネバクテリウムパルバム(corynebacterium parvum)等の潜在的に有用なヒトア
ジュバントを包含するが、これらに限定されない。
KUZタンパク配列またはその類似体に対するモノクローナル抗体の調製のため
には、培地内での連続的な細胞系による抗体分子の製造をもたらす、任意の技術
が利用できる。例えば、最初にKohlerおよびMilstein(1975,Nature 256:495-497
)により開発された、ハイブリドーマ技術、並びにトリオーマ技術、ヒトB-細胞
ハイブリドーマ技術(Kozbor et al.,1983,Immunology Today 4:72)、およびヒト
モノクローナル抗体を製造するための、EBV-ハイブリドーマ技術(Cole et al.,1
985,in Monodonal antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96
)を挙げることができる。本発明の付随的な態様において、モノクローナル抗体
は、無菌動物中で、最近の技術(PCT/US90/02545)を利用して製造することができ
る。本発明によれば、ヒト抗体を使用することができ、またヒトハイブリドーマ
を使用して、得ることができ(Cote et al.,1983,Proc.Nad.Acad.Sci.U.S.A.80:2
026-2030)あるいはインビトロで、ヒトＢ細胞をEBVウイルスで形質転換すること
により得ることができる(Cole et al.,1985,in Monoclonal Antibodies and Can cer Therapy
,Alan R.Liss,pp.77-96)。事実、本発明によれば、適当な生物学的
な活性をもつ、ヒト抗体分子由来の遺伝子と共に、KUZに対して特異的なマウス
抗体分子由来の遺伝子をスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の製造
のために開発された技術
（Morrison et al.,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6851-6855;Neuberger e
t al.,1984,Nature 312:604-608;Takeda et al.,1985,Nature 314:452-454）を
利用することができ、このような抗体は、本発明の範囲内にある。
本発明によれば、単鎖抗体の製造のために記載された技術（U.S．P．No．4,94
6,778）を、KUZ-特異的単鎖抗体の製造のために採用することができる。本発明
の付随的な態様では、Fab発現ライブラリーの構築のために記載された技術(Huse
et al.,1989,Science 246:1275-1281)を利用して、KUZタンパク、その誘導体ま
たは類似体に対して所定の特異性をもつモノクローナルFabフラグメントを迅速
かつ容易に同定することが可能となる。
該分子のイデオタイプを含む、抗体フラグメントは、公知の技術により生成で
きる。例えば、このようなフラグメントは、該抗体分子のペプシン消化により生
成し得るF(ab')2、該F(ab')2フラグメントのジスルフィドブリッジを還元するこ
とにより生成し得るFab'フラグメントおよび該抗体分子をパパインおよび還元剤
で処理することにより生成し得るFabフラグメントを包含するが、これらに制限
されない。
抗体の製造において、該所定の抗体のスクリーニングは、当分野で公知の技術
、例えばELISA(酵素-結合イムノソーベントアッセイ)により行うことができる。
例えば、KUZタンパクの特異的ドメインを識別する抗体を選択するために、生成
したハイブリドーマを、このようなドメインを含むKUZフラグメントと結合する
生成物につきアッセイすることができる。ヒトKUZに対して免疫特異的な抗体を
選別するためには、ヒトKUZに対する正の結合、および他の種のKUZに対する結合
性の欠如を基にして、選択することができる。上記の抗体は、本発明の該タンパ
ク配列の局在化および活性と関連して、例えばこれらのタンパクの描写、適当な
生理的サンプルサンプル内での、その濃度測定のための、当分野で公知の方法、
診断的方法等において利用できる。KUZタンパクのあるドメインに対して特異的
な抗体をも提供する。特定の一態様においては、KUZのNotch-結合フラグメント
と結合する抗体を提供する。
本明細書に記載したKUZポリペプチドのアミノ酸配列を、選択された発現系に
対して最適化された、KUZポリペプチド-コード核酸を、逆翻訳するために
使用し（Honer et al.(1993)Gene 136,323-328;Martin et al.(1995)Gene 154,1
50-166）あるいは天然のKUZ-コード核酸配列の単離において使用するための、縮
重オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブを生成するのに使用する(“GCG
”ソフトウエアー、Genetics Computer Group,Inc,Madison WI)。KUZ-コード核
酸は、KUZ-発現ベクターで使用され、かつ例えば発現およびスクリーニングのた
めに、組み換え宿主細胞に組み込まれ、例えばKUZ-調節細胞機能等に関連した疾
患に対する候補薬剤の薬効等の、機能的研究のために、トランスジェニック動物
に組み込まれる。
本発明は、またSEQ ID NO:1,3,5,7または９を含み、これと特異的にハイブリ
ッド化するのに十分な(即ち、対応する種由来の胚cDNAライブラリーの存在下で
、および好ましくはHoward and Glynn(1995)に記載されているように、BMP cDNA
の存在下で、夫々特異的にSEQ ID NO:1,3,5,7または９とハイブリッド化する)、
KUZ cDNA特異的配列をもつ、核酸ハイブリダイゼーションプローブおよび複製/
増幅プライマーをも提供する。このようなプライマーまたはプローブは、その長
さにおいて少なくとも12、好ましくは少なくとも24、より好ましくは少なくとも
36および最も好ましくは少なくとも96塩基である。特異的なハイブリッド化を立
証するためには、厳密な条件、即ち(1)洗浄のためには低イオン強度および高温
、例えば0.015Ｍ NaCl/0.0015Ｍナトリウムチトレート(sodium titrate)/0.1％
SDS、50℃を使用すること、または(2)ハイブリダイゼーション中、変性剤、例え
ばホルムアミド、例えば0.1％ウシ血清アルブミン/0.1％フィコール(Ficoll)/0.
1％ポリビニルピロリドン/50ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ6.5、750ｍＭ NaCl
,75ｍＭクエン酸ナトリウム、42℃)を含む50％（vol/vol）ホルムアミドを使用
することが必要とされる。もう一つの例は、50％ホルムアミド、5xSSC(0.75Ｍ N
aCl,0.075Ｍクエン酸ナトリウム),50ｍＭ燐酸ナトリウム(ｐＨ6.8),0.1％ピロ燐
酸ナトリウム、5xデンハーツ(Denhardt's)溶液、超音波処理したサケ精液DNA(50
(g/ｍｌ),0.1％ SDS,および10％硫酸デキストラン(42℃)の使用である。ここで
は、42℃での0.2xSSCおよび0.1％ SDSによる洗浄を伴う。KUZ核酸も、配置アル
ゴリズム、例えば
BLASTXを使用して識別できる(Altschul et al(1990)Basic Local AhgnmentSearc
h Tool,J Mol Biol 215,403-410)。
本発明の核酸は、合成/非天然配列であり得および/または単離された、即ち天
然状態において結合していた物質の少なくとも幾つかを含まないものであり、好
ましくは与えられた画分中に存在する全核酸の少なくとも約0.5重量％、好まし
くは少なくとも約５重量％を構成し、また通常は組み換え体であり、このことは
これらが非天然配列または天然の染色体に結合しているもの以外のヌクレオチド
と結合した、天然配列を含むことを意味する。SEQ ID NO:1,3,5,7または９の該
ヌクレオチド配列または目的のそのフラグメントを含有する組み換え核酸は、こ
のような配列またはフラグメントをその末端に含み、天然の染色体に結合してい
るもの以外の配列により直接フランキングされ(即ち、該配列と隣接し)、あるい
は末端にあるか、あるいは天然の染色体に結合しているもの以外の配列により直
接フランキングされた、10kb未満、好ましくは2kb未満の天然のフランキング領
域によりフランキングされている。該核酸は、通常RNAまたはDNAであるが、改善
された安定性などを与えるために、他の塩基またはヌクレオチド同族体を含む核
酸を使用することが、しばしば有利である。
本発明の核酸は、広範囲に渡る用途を有する。該用途は、例えば翻訳可能な転
写体、ノックイン/アウトベクター、ハイブリダイゼーションプローブ、PCRプラ
イマー、診断用の核酸等;KUZ遺伝子および遺伝子転写体の存在の検出、付随的な
KUZ遺伝子同族体および構造的類似体をコードする核酸の検出または増幅におけ
る使用を包含する。診断において、KUZハイブリッド化プローブは、臨床的およ
び研究室におけるサンプル中の野生型および突然変異KUZ対立遺伝子を同定する
上で有用であることが分かっている。突然変異対立遺伝子は、高処理量の臨床的
診断用の、対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチド(ASO)プローブを製造するの
に使用される。治療においては、治療KUZ核酸は、細胞発現または活性KUZの細胞
内濃度または利用性を調節するのに使用される。
本発明は、試薬、化合物または鉛化合物の、KUZ調節性細胞機能レベルでの薬
物活性についての、効果的な同定方法をも提供する。一般的に、これらのスクリ
ーニング法は、天然のKUZ結合ターゲット、例えばNotchタンパク等との
KUZ相互作用を調節する化合物についてのアッセイを含む。結合剤についての幅
広いアッセイが提供され、これらはプロテアーゼアッセイ、イムノアッセイ、細
胞ベースのアッセイ等を包含する、標識インビトロタンパク-タンパク結合アッ
セイ等を包含する。これらの方法は、鉛化合物に対する化学ライブラリーのスク
リーニング用の、自動化された、コスト効率のよい高処理量のスクリーニングに
対して応用可能である。同定された試薬は、動物およびヒトに対する製薬工業に
おける用途が、見出されており、例えばこれらの試薬を、インビトロおよびイン
ビボアッセイで、誘導化および再スクリーニングして、活性を最適化し、かつ製
薬上の開発に対する毒性を最小化することができる。
例示的インビトロ結合アッセイは、KUZポリペプチドを含有する成分の混合物
を使用し、該ポリペプチドは他のペプチドまたはポリペプチド、例えば検出また
はアンカーリング等のためのタッグとの融合生成物の一部であり得る。該アッセ
イ混合物は、天然の細胞内KUZ結合ターゲットを含む。特定の一態様においては
、該結合ターゲットは、KUZプロテアーゼ活性をもつNotchタンパク由来の基質で
ある。このような基質は、特異的KUZ-開列性のペプチド結合および少なくとも5
、好ましくは少なくとも10およびより好ましくは少なくとも20個の天然産の、各
側部に直接フランキングした残基を含む。天然の完全な長さの結合ターゲットを
使用できるが、その一部(例えば、ペプチド)を使用することが、しばしば好まし
い。但し、該一部は該アッセイにおいて有利に測定できる、目的のKUZポリペプ
チドに対する結合アフィニティーを与えるものである必要がある。該アッセイ混
合物は、また候補薬剤をも含む。候補薬剤は、多数の化学物質群を包含するが、
これらは典型的には有機化合物、好ましくは小さな有機化合物であり、また合成
または天然の化合物のライブラリーを含む、広範囲に渡る源から得られる。種々
の他の試薬も、該混合物に含めることができる。これらは、ATPまたはATP類似体
(プロテアーゼアッセイ用)、塩、緩衝液、アルブミン等の中性タンパク、洗浄剤
、非特異的プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤などの試薬を含み
、これらを使用することができる。
該候補薬剤の存在のために、該KUZポリペプチドが、細胞性結合ターゲット、
基準結合アフィニティーをもつその一部または類似体と結合する条件下で、得ら
れる混合物をインキュベートする。この混合物の成分は、所定の結合を与える任
意の順序で添加することができ、またインキュベーションは、最適の結合を容易
に形成する任意の温度にて実施することができる。インキュベーション時間は、
同様に最適の結合を形成するように選択されるが、迅速で、高処理量のスクリー
ニングの達成を容易にすべく最小とされる。
インキュベーション後、該試薬側に偏ったKUZポリペプチドと一以上の結合タ
ーゲットとの間の結合は、任意の有利な方法により検出される。KUZプロテアー
ゼアッセイのためには、「結合」は、一般的にKUZ基質開列生成物の生成により
検出される。本態様においては、プロテアーゼ活性は、ラベルの該基質から該形
成中のより小さな開列生成物への、見かけ上の移動により定量され、ここで該ラ
ベルは放射能、ルミネッセンス、光学または電子密度等により直接的に検出でき
、あるいはエピトープタッグ等により間接的に検出できる。該ラベルおよび他の
アッセイ成分の特性に応じて、種々の方法を使用して、該ラベルを、例えば光学
または電子密度、放射能放出、非放射性エネルギー伝達等により、あるいは間接
的に抗体結合等により検出することができる。
該試薬の不在下での、KUZポリペプチドの該ターゲットに対する、結合アフィ
ニティーと、該試薬の存在下での該アフィニティーとの差違は、該試薬が、該KU
Zポリペプチドの該KUZ結合ターゲットとの結合を調節することを示している。類
推により、以下に記載する細胞ベースのアッセイにおいては、該試薬の存在下ま
たは不在下での、シグナル導入のKUZ-依存性調節における差違は、該試薬がKUZ
機能を調節することを示す。本明細書で使用する用語「差違」は、実質的に有意
であり、好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも90％の差違を表
す。
該kuz遺伝子が、過度に発現、過少発現、誤発現または変異体として発現され
る、変更されたDrosophila宿主は、該KUZポリペプチドのアンタゴニストまたは
アゴニストである化合物を同定し、かつ該KUZポリペプチドと相互作用する生成
物をコードするのに使用される。該同定は、公知の方法を使用して実施される(X
u et al.,Genes and Devel.,p464-475(1990),Simon et al,Cell,67:701-716(199
1)and Fortini et al.,Cell,79:273-282(1994))。
該KUZポリペプチドとそのリガンド/天然結合ターゲットとの相互作用を調節す
る試薬は、KUZ機能と関連する生物学的過程を、例えばKUZポリペプチドを含有す
る細胞と、このような試薬とを接触させることにより(例えば、このような細胞
を含む対象に該試薬を投与する)調節するのに使用できる。KUZポリペプチドによ
り媒介される生物学的過程は、KUZポリペプチドがリガンドと結合した場合に、
例えば細胞分化、細胞発生および神経の分化を媒介する、種々の細胞的事象を包
含する。これらの試薬は、またKUZ基質によって影響される過程を調節するため
にも利用され、例えば神経形成に関与する当分野で公知のペプチドである、Notc
hは、白血病の幾つかの形態において過度に発現される(Ellison et al.,Cell,66
:649-661(1991))。
本発明は、更にKUZポリペプチド-媒介活性に関与する細胞を、該KUZポリペプ
チドまたはkuzリガンドが細胞内で発現されるか否かを決定することによる、同
定方法をも提供する。このような方法は、神経形成に関与する細胞および事象を
同定する上で有用である。一例において、細胞抽出物を調製し、種々の免疫学的
なおよび核酸技術によりアッセイして、KUZポリペプチドが発現されるか否かを
決定する。該KUZポリペプチドの存在は、細胞の神経形成への関与またはその程
度の尺度を与える。
本発明は、またKUZシグナル伝達経路のモジュレータを評価するための種々の
方法並びに組成物をも提供する。例えば、本発明は、少なくとも一つの構造的お
よび機能的に破壊されたKUZ対立遺伝子をもつ、形質転換したヒト以外の動物、
例えばハエ(例えば、Drosophila)、虫(例えば、C.elegans)、マウス等を提供す
る。特定の態様において、該動物は、KUZ対立遺伝子座内に導入遺伝子を含み、
これは選択可能なマーカーをコードし、かつ該KUZ対立遺伝子のエキソンの少な
くとも一つを置換する。より具体的には、該導入遺伝子は、該座において該天然
のKUZ対立遺伝子との十分な相補性をもつ3'および5'領域を含み、該導入遺伝子
と該天然のKUZ対立遺伝子との相同組み換えを行うことを可能とする。このよう
な動物は、KUZ機能における宿主の欠損に及ぼす、候補薬物の影響を決定する有
用な方法を与える。
上記のように、本発明は該目的とする組成物を製造し、使用するための様々な
方法を提供する。付随的な例として、本発明は、KUZ対立遺伝子における宿主の
欠損に及ぼす、候補薬物の効果を決定するための方法を提供する。例えば、この
方法は、少なくとも一つの破壊されたKUZ対立遺伝子をもつ形質転換された動物
と、候補薬物とを接触させ、かつこの接触段階に応答する、該動物内の生理的変
化の有無を検出する工程を含む。本発明は、またKUZ機能阻害剤の副作用を評価
する方法をも提供し、該方法は、例えば少なくとも一つの破壊されたKUZ対立遺
伝子をもつ形質転換された動物と、候補薬物とを接触させ、かつこの接触段階に
応答する、該動物内の生理的変化の有無を検出する工程を含み、ここで生理的変
化の存在は、該阻害剤がKUZ機能阻害を超える副作用をもつことを示す。
更に説明することなしに、当業者は、上記の説明および以下の例示的実施例を
利用して、本発明の化合物を製造しかつ使用し、また特許請求した方法を実施す
ることができる。従って、以下の実施例は、本発明の好ましい態様を具体的に指
摘するものであり、また以下の説明が何等本発明を限定するものではないと理解
すべきである。その他の一般的な構成は、当業者には明白であろう。本明細書に
おいて引用した全ての刊行物および特許出願は、各々の刊行物および特許出願が
、具体的にかつ個別的に、参考文献として本明細書に組み入れるべきものと、明
記されているものとする。
実施例実施例1:ショウジョウバエKUZポリペプチド/遺伝子の同定
側部阻害に関与する遺伝子を、FLP/FRT染色体を使用して、スクリーニングし
、モザイク動物中の突然変異クローンを製造し(T.Xu & G.M.Rubin,Development
117:1223(1993);T.Xu&S.Harrison Methods in Cell Biology 44:655(1994))、ま
た本明細書においてkuzbanian(kuz)と命名する遺伝子群の幾つかの対立遺伝子を
単離した。該kuz遺伝子座を、単一の相補群により定義した。該群は、染色体位
置34C4,5に対するマッピングを行い、かつ1(2)34Da群に対応する(A.C.Spradhng
et al.PNAS,92:10824(1995)。該kuzの表現型解析の殆どは、無機能対立遺伝子ku
ze29-4を用いて実施した。Kuze29-4は、
切除対立遺伝子であり、該kuz遺伝子の5'末端における約2.4kbが除去され、その
プロモータ領域におけるDNAおよび第一および第二エキソンを含む。４つのP[lac
Z;w+]挿入部1(2)k11804、1(2)k01403、1(2)k07601および1(2)k14701は、ハイポ
モルフkuz対立遺伝子である。これらは、該第一のkuzエキソンまたは該第一のイ
ントロンの何れかに挿入される。これらのＰ挿入物の正確な切除は、該関連する
kuz表現型を反転する。Kuz1は、該第一のエキソン内またはその近傍に、DNAの4.
3kbの挿入により生じる元のkuz対立遺伝子である。17個の付随的なX-線誘導kuz
対立遺伝子が、該FLP/FRTモザイクスクリーン内に分離される。
10kbの、対立遺伝子kuze29-4内の削除された領域由来の、DNAフラグメントを
使用して、Drosophilaの全成虫盤cDNAライブラリーをスクリーニングした。この
領域にマッピングされる２つの重複する1.2kb cDNAsが、回収された。完全な長
さのkuz cDNA,NB1は、プローブとして該小さなcDNAクローンを使用して、胚cDNA
ライブラリーから単離した(Kuz cDNA Genbank承認番号:U60591)。
走査型電子顕微鏡(SEM)および胚染色並びに成虫の目の切片作成を、標準的な
手順に従って実施した(A.Tomlinson&D.F.Ready,Dev Biol.123:264(1987);T.Xu&S
.Artavanis-Tsakonas,Genetics 126,665(1990))。ホモ接合kuzクローンをもつ、
成熟モザイクハエにおける、多数の剛毛をもつ表現型を示す、走査型電子顕微鏡
写真（SEM）は、エベラル(aeveral)長刺毛および微刺毛位置に、過剰の剛毛を有
し、一方で他のものは同じ領域において失われていることを明らかにした。目に
おけるkuzクローンを示すSEMsは、個眼の規則的なアレーが重度に破壊されてお
り、該クローンの中心に向かって、光レセプターの密度が異常に低く、かつ個眼
内で十分に組織化されておらず、かつ該クローンの境界部分におけるキメラ個眼
は、着色された野生型の光レセプター細胞および突然変異末着色光レセプターと
の混合物を含む、ことを立証した。神経特異的抗-Elavで染色された胚の共焦像
は、母性および接合子kuz生成物に関する要件を明らかにしている。kuzの接合子
性の複製一つをもつ、kuz母性ヌル胚（T.B.Chou & N.Perrimon,Genetics 131:64
3(1992)に記載されているように、ovoD突然変異
を利用して生成した)は、野生型に比して、該胚の大部分が神経組織として分化
し、また母性および接合子kuz生成物をもつkuzヌル胚の表面の外観は、殆どの細
胞が神経の運命を受け入れることを示す、ことを明らかにしている。この同一の
胚の低焦点面は、該胚の周辺近傍の細胞全てが、神経細胞であることを示した。
kuzの接合子性の複製体一つをもつ、kuz母性ヌル胚のクチクラ調製は、クチクラ
の小さなパッチが、該胚の背面部に発現することを示した。これは恐らく、クチ
クラを調製できなかった残りの細胞が、神経の運命を受け入れたことを示し、前
の表現型と一致する。Kuzヌル胚のクチクラ調製は、発現したクチクラの小さな
点に過ぎないことを示した。これら胚の殆どは、クチクラを全く示さない。
kuz変異クローンをもつ動物は、各知覚剛毛が正常に観察される位置において
、知覚剛毛のクラスターを示す。個々の剛毛をもつ別々の腔が観測され、反射作
用テストにおける変異剛毛の刺激は、脚部浄化応答を誘発し、このことは変異ク
ラスターが多数の知覚剛毛を含むが、多数の羽軸は含まないことを示している(P
.Vandervorst & A.Ghysen,Nature 286:65(1980))。この多重剛毛表現型は、幾つ
かの神経原性遺伝子、例えばNotch(N)およびshaggy(sgg，これはzeste-white ３
としても知られている)に関するクローンの突然変異体において観測され、また
末梢神経系の発現中の、側部阻害の失敗を示すものである(S.Artavanis-Tsakona
s，et al，Trends in Genetics 7:403(1991);J.S.Campos-Ortega(1993);Jan
，YN．& Jan，L.Y.，id.，pp.1207-1244;Romani,S.et al.,Genes Dev.3:997(19
89);Artavanis-Tsakonas,S.et al.,Science268:225(1995);Heitzler,P.& Simpso
n,P.(1991).Cell 64,1083-1092)。
該Ｎ表現型とは違って、kuzクローンはエピトープ剛毛を生成しない。このこ
とは、kuzが神経前クラスター間の正確な間隔に対しては不要であることを意味
する。成虫の目の変異クローンは、個眼の規則的なアレーを酷く破壊した。この
ようなモザイク眼を貫通する薄い部分は、変異光レセプターが、正確に組織化さ
れて、個眼を形成していないことを示している。
該KUZポリペプチドが、中枢神経系(CNS)の発生に必要であるか否かを決定する
ために、任意の母性的に誘導されたKUZポリペプチドをもたず、かつ該kuz
遺伝子の接合子の複製物を一つもつ、あるいはもたない胚を製造した。該胚を、
該Elavタンパクに対する神経特異的抗体で染色することにより検討した(Bier,E.
et al.,Science 240:913(1988);Robinow,S.et al.,J.Neurobiol.22,443(1991))
。接合子性のkuz遺伝子の一複製をもつ母性ヌル胚は、該胚の腹側における該CNS
の過形成および組織破壊を示した。これは、Ｎ変異胚の神経形成
192:62(1983))。しかし、全ての母性並びに接合子性のKUZポリペプチドを欠いた
胚は、より一層重度の神経形成表現型をもつ。神経系の肥大は、腹側の領域に制
限されないが、該胚は抗-Elavにより全体として染色された。このことは、該胚
中のより多くの細胞が、神経細胞として発現したことを示している。このような
重度の神経形成表現型は、sggヌル胚と類似している（Bourouis,M．et al.,Natu
re 341:442(1989))。該抗体により十分に修正された胚のクチクラ合成は、以下
の結果を与える:該kuz遺伝子の一複製体をもつ、母性ヌル胚は、背側に小さなク
チクラのパッチを生成するが、このことは、該腹側の細胞の多くが表皮の犠牲の
下に、神経の命運を受け入れるという観測と一致する。KUZポリペプチドを欠い
た胚は、殆どまたは全くクチクラを製造しないが、このことは多くの細胞が、神
経細胞となり、クチクラを分泌するために極少数の表皮細胞のみを残す場合には
、当然予想されることである。
成虫の知覚剛毛の発現に関する更なる解析を行って、側部阻害における該KUZ
ポリペプチドに関する特異的な役割を決定した。該yellow(y)およびcrinkle(ck)
マーカーの突然変異を利用して、該成虫のクチクラにおけるクローンを標識した
。これは、個々の細胞の遺伝子型を決定し、結果として該kuz変異表現型の自律
性を調べることを可能とした。このような分析は、該側部阻害過程に関与する遺
伝子についての、送り出しおよび受け入れ的役割間の識別を可能とする(Heitzle
r,P.et al,Cell 64:1083(1991))。
側部阻害における該KUZポリペプチドに関する役割は、変異クラスター内の全
ての知覚剛毛がkuz-であり、野生型の剛毛は、クラスター中に存在し得ないとい
う観測により示唆される。kuz-クローンのSEM（各kuz-細胞は、ck-およびy-でも
ある）は、該ck-突然変異が、表皮細胞中でおよび知覚剛毛の無効にされ
た羽軸において、過度のトリコームを生ずることを明らかにしたが、これらの形
態学的変化は、変異体と野生型の細胞との間の境界を正確に決定することを可能
とする。全ての微刺毛および長刺毛が全く存在しないことが、該クローンの内部
において観測される。というのは、羽軸、腔、またはニューロン(裸の細胞)が、
全く観測されないからである。正常な剛毛一におけるKuz-変異細胞は、クローン
境界において剛毛を形成し、そこでこれらは野生型細胞と接触する。クローン境
界における該多数の長刺毛クラスターの一つの、高-倍率の視野は、このおよび
他のクラスターの各剛毛が、常にck-およびy-であることを示し、このことはク
ラスター中の全ての剛毛がkuz-であることを立証している。野生型の剛毛は、多
重剛毛クラスター中には全く観測されない。顕著にkuz-性のクローンは、y-w-hs
FLP1;kuse29-4ck-P[FRT]40A/P[y+]P[w+]PFRT]40A第一齢幼虫内で、T.Xu & G.M.R
ubin，Development 117:1223(1993)およびT.Xu & S.Harrison,Methods in Cell
Biology 44:655(1994)に記載されたプロトコールに従って生成された。
成虫のクチクラにおける、kuz-クローンに関するモザイク解析は、該kuzタン
パクについての、二つの異なる機能を示す。第一に、過度の剛毛の形成により証
拠付けられる、側部阻害の失敗は、kuz-変異細胞においてのみ起こる。この細胞
自律型変異体表現型は、正常な発育中に、阻害シグナルを受け取るためには、該
kuzタンパクが、細胞内で必要とされることを示す。正常な剛毛形成位置におけ
るkuz-細胞は、これらが野生型の細胞と接触している場合にのみ剛毛となり、こ
のことは、野生型の動物においては、該KUZポリペプチドが正のシグナルとして
作用するか、該剛毛の発現のための、正のシグナルの放出に関与していることを
示す。従って、細胞が神経先駆体としての運命を受け入れることを阻止するため
に、kuzに関する細胞自律性要件がある。我々は、該出現する神経細胞からの阻
害シグナルを受け取るために、細胞内で該KUZポリペプチドが必要とされるもの
と結論付ける。野生型のKUZポリペプチド機能を有する該前神経クラスター内の
細胞は、該阻害シグナルを受け取り、表皮となるよう強制され、一方でkuz-細胞
は、阻害できず、神経先駆体細胞として生育する。該KUZポリペプチドに関する
第二の明確な役割は、同一のモザイク分析により明らかにされ
た。全ての変異剛毛クラスターは、クローン境界で製造され、そこで変異細胞は
野生型の細胞と接触する。クローン内部では、剛毛は、単一でもクラスターとし
ても、全く製造されなかった。従って、大きなkuz-クローンは、毛髪分泌表皮細
胞のみを含む剛毛をもたない裸のパッチを生ずる。この表現型は、剛毛の発現に
は、該KUZポリペプチドに関する細胞自律性の要件がないことを示している。従
って、Kuzは成熟表皮の形成中の、神経形成-促進および神経形成-阻害過程両者
に関与している。
該KUZポリペプチド機能の分子論的基礎を明らかにするために、kuz遺伝子をク
ローニングし、完全な長さのcDNAを得た。該kuz cDNAは、ADAM群(ADAM群の構成
員は、「ジスインテグリンおよびメタロプロテアーゼドメイン」を含む)として
知られる、該メタロプロテアーゼ-ジスインテグリン群の、1,239アミノ酸膜に広
がるタンパクをコードする読み取り枠を含んでいた。該KUZメタロプロテアーゼ
ドメインは、また保存された亜鉛-結合サイトをも含む(Jiang,W.& Bond,J.S.(19
92).FEBS Letters 312,110-114)。同様に、他のジスインテグリンKUZは、システ
イン残基の特徴的な間隔を有し、これはレセプターに対するその直接的結合のた
めに必要とされる(Niewiarowski，S．et al.,Seminars in Hematology 31:289(1
994))。これらシステインは、該KUZポリペプチド内に、他のジスインテグリンド
メインに分配される、多くの付随的な残基と共に保存されている。この群におい
て、多重ドメイン構造をもつ多くのタンパクが、タンパク分解処理により種々の
機能をもつ多数のペプチドを生成する(Blobel,C.P.et al.,J.Cell Biol.111:69(
1990);Neeper,M.P.et al.,Nucleic Acids Res.18:4255(1990);Au,L.C.,et al,Bi
ochem.Biophys.Res.Commun.181:585(1991))。kuzのメタロプロテアーゼおよびジ
スインテグリンドメインは、完全な長さの先駆体から開列させて、これらドメイ
ンの可溶性および膜-結合形両者を生成することができる。このようなKUZポリペ
プチドのタンパク分解生成物は、種々のKUZポリペプチド機能を実現するために
使用できる。実施例2:二種のヒト由来のおよび一種のマウス由来のKUZポリペプチド/遺伝子の 同定
ショウジョウバエkuz遺伝子の核酸配列を、ショウジョウバエ以外の生物由来
の核酸分子をコードするkuzを増幅するためのPCRプライマーを生成するために利
用した。0.9kb cDNAフラグメントを、PCRプライマーを使用して、ヒト幼児脳のc
DNAライブラリー(クロンテック、ストラタジーヌ)から増幅した。このフラグメ
ントをクローニングし、該ヒト幼児脳のcDNAライブラリー(クロンテック、スト
ラタジーヌ)をスクリーニングするためのプローブとして使用した。3.5kbの挿入
断片を含むクローンを得た(SEQ ID NO:3)。このクローンは、749個のアミノ酸を
含むタンパクをコードする完全な長さのコード配列を含んでいた。３種の付随的
なクローンを得たが、これらは変異体制限消化パターンを示した。これらクロー
ンの配列解析は、該ヒトKUZポリペプチドの第二の型を同定した。該KUZポリペプ
チドの第二の型は、長さ330アミノ酸に相当するタンパクをコードする(SEQ ID N
O:6)。該ヒトkuzコード配列の１フラグメントを、マウス胎児脳cDNAライブラリ
ー用のプローブとして使用した。４種の単離されたクローンの一つを、配列決定
したところ、4kbの挿入断片を含んでおり、これはマウスKUZ cDNA(SEQ ID NO:7)
を表す。
種々のマウスおよびヒト組織から単離したRNAを使用して実施例した、ノーザ
ンブロット法は、胎児および成人における発現を示した。該ヒト型各々に対して
特異的なプローブとの該ブロットのハイブリッド化は、該転写体各々が、該２つ
の型の一方に対して特有であることを明らかにした。このことは、これら２つの
同定されたmRNA転写体が、夫々該２つのヒト型の各々を表すことを示す。該成人
および胎児ノーザンブロットに見られる発現の可変パターンは、該KUZポリペプ
チドの発生上の役割を示している。ここで、短い型は、成人の組織において支配
的であり、一方で完全な長さの型は、胎児組織および成人の脳において支配的で
ある。該成人の脳の全領域が、これら両者の型を発現した。実施例3:KUZBANIANは、NOTCHのタンパク分解プロセッシングを調節し、かつショ ウジョウバエおよび獣医学的神経形成中の側部阻害を媒介する
KUZの種々のドメインが、どのようにしてその生物学的機能に寄与するかを検
討するために、完全な長さのおよび種々のKUZのN-およびC-末端切頭体を
生成し(例えば、構築体1-4および7,第1B図)、かつショウジョウバエの生育中の
網膜内で、該pGMRベクター(Hay,B.A.,Wolff,T.& Rubin,G.M.(1994)Development
120,2121-2129)の存在下で発現された。該プロテアーゼドメインをもたない、こ
れらの例示した接頭の一つ(7)は、支配的な粗雑な目の表現型を与えた。我々は
、該pDMRベクターを使用して、KUZ接頭を発現させた。該ベクターは、該decapen
taplegic(dpp)原基特異的エンハンサーエレメント(実験手順を参照のこと)を含
み、該エレメントは、肉帯および羽根の一部を包含する、幾つかの組織における
遺伝子発現を駆り立て、これら二種の組織は、kuz突然変異クローンにおいて影
響されることが知られている。pDMRの下での構築体７の発現は、羽根の該肉帯お
よびNotch上の過剰の剛毛を与えた。これらの表現型は、kuz機能喪失突然変異用
の、体細胞クローンホモ接合において見られるものと類似し、このことはこの構
築体が、内因性のkuz活性で妨害することにより、主として負の様式で機能する
ことを示す。我々は、またこの構築体を由来とする該変異表現型が、主として該
内因性のkuz遺伝子の１複製体を除去することにより、高められることを観察し
た。即ち、この構築体を担持するkuz/+個々の表現型は、+/+個々の表現型に比し
てより厳密である。逆に、完全な長さのKUZを発現するトランスジーヌ由来の付
随的な野生型KUZタンパクが、これらの表現型を抑制する。我々は、該特定の支
配的に負の構築体７を、以下KUZDN(支配的に負のKUZ)と呼ぶ。
該プロテアーゼドメインの機能的関連性を直接扱うために、我々は完全な長さ
のKUZに、該プロテアーゼドメインの推定上の亜鉛結合サイト(第1A図)において
、点突然変異(E606 to A)を導入した。このグルタメートは、触媒的残基である
と考えられ、またあらゆる公知のメタロプロテアーゼ内に完全に保存されている
(Jiang&Bond，1992)。かくして、この点突然変異は、プロテアーゼ活性を壊滅さ
せるはずであり、一方でKUZのたの活性には殆ど影響を与えない。事実、KUZE606 A
（構築体８、第1B図）は、幾分弱いが、KUZDNに見られるものと同様な、支配的
な表現型を与えた。
ショウジョウバエの成虫の肉帯は、２つの型の知覚剛毛、長刺毛および微刺毛
を有する。該長刺毛を生成する該知覚器官プリカーサー細胞を、殆どは第三齢幼
虫期の、側部阻害により、等価な細胞のプールから選択し、一方で微刺毛の該SO
Psは、蛹の初期段階において選抜する(Huang,F,et al.(1991).Development 111,
1087-1095;Hartenstein,V.&Posakony,J.W(1989).Development 107,389-405)。Ｎ
は、この過程に対して必要とされ、また幼虫および蛹期におけるＮ機能の除去は
、剛毛のこれら２つの型に様々な影響を与える(Hartenstein,V.& Posakony,J.W(
1990).Dev.Biol.142,13-30)。KUZが、側部阻害のために必要とされる場合、これ
らの時点においてKUZDNを発現することにより、同様な表現型が形成できるもの
と、我々は予想した。我々は、該hsp70プロモータの調節下で、KUZDNを含むハエ
を生成し、幼虫および蛹発育期の種々の時点で、１時間の熱パルスを印加した。
我々は、第三齢幼虫期における熱パルスの印加は、過度の長刺毛のみを与えるが
、蛹初期段階に印加された熱パルス（蛹殻形成後(APF)0-13時間）は、過剰な微
刺毛のみを与えることを観測した。これは、これらの期間に渡り、温度感受性の
Ｎ対立遺伝子を使用して(Hartenstein & Posakony,1990)、Ｎ機能を除去するこ
とにより生ずる表現型と同様である。これらの時点は、各剛毛型に対するSOPsを
、等価な細胞のプールから選択した場合の期間と一致する(Huang et al.,1991;H
artenstein & Posakony,1989)。このことは、KUZDNが、SOPsの選択中の側部阻害
により妨害されることを示す。
Kuz変異クローンは、他の組織、例えば目に影響を与える。我々は、該roughエ
ンハンサーの制御下で、KUZDNを発現させることにより、kuz機能を撹乱したが、
これは全ての細胞中で、形態形成の溝部並びに一時的ではあるが、該溝部の背後
のR2,R5,R3およびR4における遺伝子発現を誘発する(Hebedein,U.,et al.(1994).
Mech.Dev.48,35-49)。該rough/KUZDNトランスジーヌをもつハエは、各個眼にお
いて過剰な光レセプターを有していた。これらのトランスジェニックハエにおけ
る、神経の分化は、目の成虫盤における、ニューロンマーカーであるELAVによる
染色を伴った。該成虫の目の表現型と同様に、我々は、発育中の網膜内の各個眼
クラスターへの、過剰なニュウーンの補給を観測した。
これらの実験は、各個眼に補給される光レセプターニュウーンの数を制限するた
めには、kuz機能が必要であることを示している。
神経の運命を決定付ける際の機能以外にも、kuzは、神経の発育の後の段階に
おける軸索の伸長のためにも必要とされる(Fambrough,D.，et al.(1996).Proc.N
atl.Acad.Sci.USA93,13233-13238)。我々は、該GAL4-UAS系を使用して、該ELAV
プロモータの調節の下で、KUZDNを発現させた(Brand,A.H.，& Perrimon,N.(1993
).Development 118，401-415)。該ELAVプロモータは、成熟中のおよび成熟ニュ
ーロンにおける遺伝子発現を誘発するが、神経芽細胞では誘発せず、従って神経
の運命決定における、kuzに関する要件を無視することが可能となる。我々は、
発育中のニューロンにおいてKUZDNを発現する胚が、軸索経路において大きな欠
陥、例えば長い軸索管の崩壊を示すことを観測した。一般的に、この表現型は、
接合子性のkuz変異胚において観測されるものと類似している(Fambrough et al.
,1996)。このことは、KUZが、軸索により統合され、かつ該細胞外マトリックス
を介して、成長円錐を伸長するために、該軸索により要求される、タンパク分解
活性をもたらす。
データベース探索は、Ｃ．エレガンス、ラット、ウシおよびヒトにおける推定
kuzオーソロガス遺伝子を表す配列を明らかにした。まず、ウシ同族体を、イン
ビトロにてミエリン塩基性タンパクに対して、タンパク分解活性をもつものとし
て単離した(Howard et al.，1996)。我々は、完全な長さのマウスkuz同族体を表
すcDNAを単離し、かつ配列決定した。このマウスタンパク(MKUZ)は、その一次配
列において、ショウジョウバエのKUZ(DKUZ，第１図)と45％の同一性を、またウ
シタンパクと95％の同一性を示す。MKUZとDKUZとの配列同一性は、全コード領域
に渡っているが、他の獣医学的なKUZ同族体と同様に、MKUZはより一層短い細胞
内ドメインを有している。MKUZの該細胞内ドメインは、９個のアミノ酸残基(934
-942)からなる広がりを含み、これは、DKUZについては完全に保存されている。
この配列類似性の機能的な重要性を決定するために、我々はこの領域におけるい
くつかの保存された残基に、KUZDN変異体を導入し(936TPSS939 to AAAA;構築体9
、第1B図)、またこれらの突然変異体が著しく減じられたKUZDNをもつことを見出
した。
上記KUZDNの構造に基いて、該プロテアーゼドメインをもたないMKUZ(MKUZDN，
第1B図)の、支配的に負の形態のものを操作した。該pDMRベクターを使用して、
ショウジョウバエ内で過度に発現させた場合に、MKUZDNはそのショウジョウバエ
のかたわれにより生成されるものと類似する支配的な表現型を与えた。MKUZの獣
医学における神経形成への直接的関与をテストするために、我々はMKUZDNをコー
ドする、インビトロで転写されたmRNAを、ツメガエルの胚に注入した。ツメガエ
ルにおける一次ニューロンは、正確かつ簡単なパターンで生成され、またその神
経的に特異的なβ-tubulin遺伝子(N-tubulin)の発現により同定できる。このア
ッセイは、側部阻害によるツメガエル内での、一次ニューロンの選抜における、
ある神経形成遺伝子に関する保存された役割を立証するために、以前に使用され
た(Chitnis,A.，et al.(1995).Nature375，761-766)。kuz-様の活性が、ツメガ
エル内での側部阻害過程のために必要とされる場合には、一次ニューロンの過形
成をもたらすために、我々はこの内因性のkuz活性による妨害を予想した。事実
、MKUZDNをコードするmRNAの注入は、過剰なN-tubulin正細胞を結果する。kuzが
、一群の能力細胞からのニューロンとして、分化する細胞数を制限するように作
用するという見解と一致して、これらの過剰なN-tubulin正の細胞は、一次神経
形成ドメインに制限され、かつ異所性位置においては、観測されなかった。
ツメガエルにおける一次神経形成中の内因性kuz活性に関する更なる証拠を与
えるために、我々はツメガエルkuz同族体(Xkuz)の発現パターンを検討した。Xku
z(第１図)の一部を表すcDNAフラグメントを単離し(実験手順を参照のこと)、極
めて厳密なその場でのハイブリダイゼーションのための、RNAプローブを生成す
るのに使用した。Xkuzは、原腸形成および神経板形成段階において、均一に発現
され、一次神経形成のドメインを含む。より高齢の胚においては、Xkuzは広範囲
にに渡り発現が継続され、神経組織内では高いレベルで発現される。従って、Xk
uzは、ツメガエルの一次神経形成における重要な役割のために、適当な時間およ
び場所で発現される。
我々は、機能獲得Ｎ変異体と機能喪失kuz変異体とを組み合わせることにより
生成される、該表現型を検討することにより、Ｎおよびkuzの作用順序を決
定する方法を求めた。蛸の初期段階(7-9時間APF)における、該熱ショックプロモ
ータ(hs-Ｎact)の作用下での、NOTCH(Artavanis-Tsakonas et al.，1995におい
て概説されている)の活性化型の発現は、肉帯上の微刺毛の喪失に導き、該逆の
表現型の過剰な微刺毛が、機能喪失kuz変異体クローンにおいてみられる。我々
は、微刺毛に着眼した。というのは、これらの剛毛に対する該SOPsが、長刺毛の
ものと比較して、より同時に生成され(Huang et al.,1991;Hartenstein & Posak
ony，1989)、また結果として、7-9時間のAPFにおける、熱ショックの単一パルス
が、hs-Ｎactハエの該肉帯上の、微刺毛の再現性のある喪失をもたらすからであ
る。kuzが遺伝子的にＮの下流で作用する場合には、Ｎactとkuzとの組み合わせ
は、余分の微刺毛の該kuz表現型を表示するはずである。逆に、kuzが遺伝子的に
Ｎの上流で作用する場合には、Ｎactとkuzとの組み合わせは、微刺毛を喪失した
Ｎactの表現型を表示するはずである。我々は、Nactとkuzとの組み合わせが、Ｎact
の表現型を表示したことを観測した。このことは、kuzが遺伝子的にＮの上流
で作用することを示す。この結果は、KUZが、同一の生化学的経路において、NOT
CHの上流で作用するか、あるいはこれと並行して作用することを意味する。
我々は、kuzとＮとの間に投与量感受性の遺伝子的相互作用を観測したが、こ
のことはkuzおよびＮの活性レベルが厳密に釣り合っていることを示す。我々は
、弱いdpp-KUZDNトランスジーヌを利用し、これは野生型に見られる２個の代わ
りに、平均して３個の後部小盾板状の剛毛を与えた。異種性のＮ変異体は、正常
な数の後部小盾板状の剛毛をもつが、この遺伝的な背景は、該弱いdpp-KUZDNト
ランスジーヌ由来の該表現型を大幅に増大し、結果として平均5.2個(n=50)の剛
毛が観測された。更に、Ｎ遺伝子の追加の複製物をもつハエに
おいては、このKUZDNトランスジーヌ由来の該余分の剛毛表現型は、完全に抑制
されて、２個の剛毛が観測された。このことは、これら活性間の複雑なこの釣り
合いは、kuzとＮとが、共通の生物学的過程において、厳密に関連していること
を示している。
我々は、ドロソフィアシュナイダー(Drosophila Schneider)2(S2)細胞培養物
中のKUZ機能の摂動が、NOTCHプロセッシングに影響を与えるか否かを検討した。
S2細胞は、如何なる内因性NOTCHタンパクをも発現しない(Fehonetal.，1990)が
、高濃度のkuz mRNAを発現する。完全な長さのＮ構築体のトランスフェクション
に際して、NOTCHの該細胞内のドメインに対して生成されたモノクローナル抗体C
17.9C6は、完全な長さのNOTCH(約300kd)および約100kdのC-末端フラグメントを
検出できる(Fehon et al.，1990)。我々は、kuzがS2細胞内での、この100kdの種
の生成に関与している場合には、KUZDNの発現はこの表現型事象により妨害され
るものと理由付けした。事実、KUZDNの発現は、S2細胞内での、この100kdの種を
殆ど壊滅するが、該300kdの種は、大幅に影響されることはなかった。このこと
は、kuzが該NOTCHプロセッシングのために必要であることを示している。完全な
長さのKUZの過剰な発現が、神経形成を撹乱しなかったというトランスジェニッ
クハエに関する我々の結果と一致して、完全な長さのKUZ構築体のトランスフェ
クションは、S2細胞内でのNOTCHプロセッシングに影響を与えなかった。
次に、我々は成虫盤の発現において、同様な実験を行った。前に記載したよう
に、熱ショックプロモータの制御下にある、NOTCHを含むトランスジェニックハ
エでは、第三幼虫齢段階での、１時間の熱ショックは、その肉帯上に余分の剛毛
を与えた。同一の熱ショック処理は、また羽根にノッチを、またその目に余分な
光レセプターを与えた。我々は、これら動物における、KUZDNの誘導後に、該羽
根および目におけるNOTCHプロセッシングの該事態を追跡した。トランスフェク
ションされたS2細胞におけるように、mAb C17.9C6は、正常に第三齢の成虫盤段
階でのタンパク抽出液中の300kdおよび100kd NOTCH種を検出する。１時間の熱シ
ョックによるKUZDNの誘発後、該100kdの種は消失し、誘発後４時間目には、該10
0kd種は、殆ど検出不能であり、一方で該300
kd種は、高レベルまで蓄積された。該熱ショックの15時間後には、該100kd種は
、野生型レベルまで回復したが、このことは恐らく、該熱ショックに応答して合
成された該KUZDNタンパクの分解を反映しているものと思われる。KUZDN発現の際
の、該100kd種の減少と、成虫組織内の該結果的な神経形成表現型との間のこの
相関は、該100kd NOTCH型の機能上の重要性が、インビボで検出されたことを意
味する。
最後に、我々は、kuzヌル変異胚中のNOTCHプロセッシングを検討した。kuzは
、母性的寄与(上記文献)をもつことが知られているので、我々は、生殖細胞系を
生成して、全てのKUZ機能をもたない胚を得た。我々は、mAb C17.9C6が、野生型
胚中には、300kdおよび100kd種を検出したが、kuzヌル胚中には該300kdの種のみ
が検出されることを見出した。この観察は、KUZDNの発現により我々が生成した
該表現型が、kuz以外の遺伝子、例えば該ADAM群に属する他の構成目の妨害によ
るものではなく、またkuzが、NOTCHのタンパク分解性のプロセッシングを必要と
していることを示している(第２図)。
我々の研究は、他の遺伝子に適用可能なADAMタンパクの支配的に負の形態を、
操作するための一般的な方法を提供する。全てのADAMはジスインテグリン-様の
およびメタロプロテアーゼ-様のドメインを有しているが、幾つかのADAMは、該
メタロプロテアーゼドメインに共通の活性サイトをもたない。これらの「プロテ
アーゼをもたない」ADAMは、本明細書に記載したKUZの支配的に負の形態と類似
し、また内因性の阻害剤として機能できる。
実験手順：プラスミド構築体：我々はまず、該pGMRベクター(Hay et al.，199
4)を使用して、目内で、完全な長さのKUZおよび幾つかのＮ-およびＣ-末端欠失
構築物を発現させた。これらの構築体は、1,2,3,4および７を含む。支配的に負
の形態(KUZDN)として７を同定する際には、我々はもう一つの発現ベクターpDMR
を使用して、構築体1,4,5,6,7,8および９を発現させた。該pDMRベクターは、該d
pp原基特異的エンハンサーを使用して、羽根および肉帯を包含する多数の組織に
おける造伝子発現を推進している。pDMRは、以下の工程に従って構築した。まず
、Casperhs内の熱ショック応答性エレメント(Pirotta,V．(1988),ベクターズ(Ve
ctors):モレキュラークローニングベクターズおよびその
利用(A Survey of Molecular Cloning Vectors and their Uses))を除去して、C
asperhs-1を製造した。4.3kb dpp原基特異的エンハンサー(Staehing-Hampton,K.
,et al.(1994),Cell Growth Differ.,5,585-593)を、Casperhs-1内のhsp70基礎
プロモータの上流側に挿入して、pDMR(dpp媒介レポーター)を製造した。また、
構築体7(KUZDN)をpUAST(Brand and Perrimon,1993)およびpCasperhsにクローニ
ングして、夫々UAS/KUZDNおよびhs/KUZDNを生成した。roughエンハンサーエレメ
ント(Heberlein et al.,1994)を、次にhs/KUZDNに挿入して、rough/KUZDNを生成
した。構築体１（完全な長さのKUZ)および7(KUZDN)をも、S2細胞発現ベクターで
あるpRMHa-3(Bunch,T．A.,et al.(1988)Ncl.Acids Res.16,1043-1061)内のメタ
ロチオネインプロモーターの下流側にクローニングした。この構築体１〜９のヌ
クレオチド配位は、GenBank承認番号U60591と同一の番号付けによれば、以下の
通りである。１および8:723-5630:2:723-3578;3:723-3462;4:723-2757;5:1957-2
757;6:1957-5630;7および9:2757-5630。全てのN-末端欠失構築体に対して、シグ
ナルペプチドを含むDNAフラグメント(ヌクレオチド723-940)は、その5'末端に与
えられることに注意すべきである。サイト特異的突然変異形成は、ストラタジー
ヌクイックチェンジ(Stratagene's QuickChange)システムを利用して実施例した
。
MKUZDNは、N-末端切頭法により製造した。該方法では、MKUZのproおよび触媒
ドメインが除去される。該MKUZの残部(ヌクレオチド1483-2573)を、ショウジョ
ウバエのKUZのシグナルペプチドを含む、DNAフラグメント(723-940,U60591にお
けるヌクレオチド配位による)に連結して、MKUZDN-1を生成するか、あるいはMKU
Zのシグナルペプチドを含む、フラグメント（ヌクレオチド1-248）に連結して、
MKUZDN-2を生成する。MKUZDN-1を、ショウジョウバエ内での過剰発現のために、
pDMRおよびpUASTにサブクローニングし、またMKUZDN-2を、ツメガエル胚へのRNA
注入（以下の記載を参照のこと)のために、変性したCS2＋ベクター内にサブクロ
ーニングした(Tumer,D.L.＆Weintraub,H.(1994).GenesDev.8,1434-1447.)。
マウスおよびツメガエル由来のkuz同族体の特徴付け:kuzに類似するラット遺
伝子の配列に相当するPCRプライマー(GenBank承認番号:Z48444)を使用して、マ
ウス脳のcDNAライブラリーからのフラグメントを増幅した。次に、PCR生成物を
使用して、マウスPCC4細胞系(Stratagene)からのoligo(dT)およびランダムに感
作されたcDNAライブラリーをスクリーニングした。２つの重複するcDNA、即ちmk
uz2およびmkuz3を、特徴付けかつ配列決定した。これらは、ともに全コード領域
を含んでいた。mkuz２は、ヌクレオチド430to2573から伸び、またmkuz3はヌクレ
オチド１to1345から伸びている。
ツメガエルのkuzを、縮重したプライマー(XK1)および(XK4)を使用したPCRによ
りクローニングした。該プライマーは、夫々ショウジョウバエのKUZ配列HNFGSPH
DおよびGYCDVFに対応する。第18段階のツメガエル胚を由来とする第一のストラ
ンドcDNAを、標準的なPCR反応における鋳型として使用し、また該反応のアニー
リング温度は、50℃であった。予想されたサイズのPCR生成物を、精製し、ショ
ウジョウバエのKUZ配列EECDCGに相当するネスト(nested)プライマー(XK3)および
をXK4を使用する、別のPCR反応における鋳型として使用した。このPCR生成物を
、Bluescriptにサブクローニングし、かつ配列決定した。アンチセンスRNAを、
標準的な手順(Harland,R.(1991).Meth.CellBiol.36,685-695)に従って、ツメガ
エル胚のその場での全量ハイブリダイゼーショ用のプローブとして使用した。
ツメガエル胚へのRNAの注入のために、MKUZDN-2を、CS2＋ベクター由来のSP6
RNAポリメラーゼを使用して、その場で合成した。核の1acZ RNAは、プラスミドp
SP6nucBGalから合成した。500pgのMKUZDNRNAを、100pgのlacZ RNAと共に、2-4細
胞段階におけるツメガエル胚の一つの割球に、注入した。また、lacZ RNAを、コ
ントロールとして、単独で注入した。胚は、神経板段階において、固定させ、か
つRed-Gal(Research Organics,Inc.)で染色した。ついで、胚を神経特異的なβ-
tubulinプローブを使用した、その場でのハイブリダイゼーションのために処理
した。
ショウジョウバエの遺伝学:kuzとNotchとの間のエピスタシスのために、該熱
ショックプロモータ(Ｘ染色体上のITM3A挿入片、Lieber,T.,et al.(1993).
Genes Dev．7,1949-1965）の制御下にある、NOTCH(Ｎact)の細胞質ドメインのみ
を含む活性化されたＮ構築体およびヌルkuz対立遺伝子e29-4(Rooke etal.，1996
）を使用した。遺伝子型ITM3A/+;e29-4ck FRT40A/+のハエを、hsFlp/Y;FRT40Aと
交雑させた。このような交雑種を由来とする子孫を、産卵後の24〜48時間、38℃
にて１時間の熱シヨック処理にかけ、kuz変異クローンを誘発させ、また更に7-9
時間のAPFにおいて、更に１時間の熱ショックにかけて、Ｎactの発現を誘発させ
た。成熟したハエを、走査型電子顕微鏡観察のために処理し、該クローンを、Ro
oke et al.(1996)におけるように、細胞自律性ck表皮毛髪マーカーにより同定し
た。
kuz生殖細胞系クローンを、Rooke et al.(1996)におけるようにして生成した
。生殖細胞系クローンをもつメスを、e29-4/CyOのオスと交配させた。母性並び
に接合子性寄与両者に欠けるkuzヌル胚は、胚の後期段階において、１個のkuzの
接合子性複製体が残されている母性ヌル胚とは識別可能である。というのは、ku
zヌル胚は、クチクラを全く発現することができず、一方で父性により救済され
た胚は、幾分かのクチクラ構造を発現するからである。kuzヌル胚を、タンパク
抽出物の製造のために、手作業で取り出した。
タンパク抽出物および免疫ブロット法:約2x106個のS2細胞、50個の胚、または
16個の第三齢幼虫の成虫盤を、各抽出のために使用した。これらの物質を、ホモ
ジナイズし、氷上で20分間、10mMのKCl、mMのトリス(Tris;pH7.5)、0.1％のメル
カプトエタノール、１mMのEDTA＋プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤(ロ
イペプチン、アプロチニン、PMSFおよびバナジン酸ナトリウム)を含む90μlのバ
ッファー中で、インキュベートした。2000rpmの低速回転での、５分間の遠心分
離処理後、上澄を集めた。12μlの上澄を6％SDSポリアクリルアミドゲル上で泳
動させた。ブロット法、抗体インキュベーション、およびECLキットを使用する
化学発光による検出を、Fehon et al.(1990)に記載のようにして、実施した。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｎ 9/50 Ｃ１２Ｐ 21/08
Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｑ 1/37
Ｃ１２Ｑ 1/37 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ
Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ
33/50 33/53 Ｙ
33/53 33/566
33/566 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ
Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ
，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ
，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，
ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ
Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ
，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，
ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ
Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ
，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，
ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ
(72)発明者 ルービン ジェラルド エム
アメリカ合衆国 カリフォルニア州
94720 バークレイ（番地なし）ユニバー
シティ オブ カリフォルニア ハワード
ヒューズ メディカル インスティテュ
ート アンド デパートメント オブ モ
レキュラー アンド セル バイオロジー
(72)発明者 パン デュオジア
アメリカ合衆国 カリフォルニア州
94720 バークレイ（番地なし）ユニバー
シティ オブ カリフォルニア ハワード
ヒューズ メディカル インスティテュ
ート アンド デパートメント オブ モ
レキュラー アンド セル バイオロジー
(72)発明者 ルーク ジェニー
アメリカ合衆国 コネチカット州 06536
ニューヘヴン（番地なし）イェイル ユ
ニヴァーシティ スクール オブ メディ
シン デパートメント オブ ジェネティ
ックス ボイヤー センター フォア モ
レキュラー メディシン
(72)発明者 ヤーヴァリ レーザ
アメリカ合衆国 コネチカット州 06536
ニューヘヴン（番地なし）イェイル ユ
ニヴァーシティ スクール オブ メディ
シン デパートメント オブ ジェネティ
ックス ボイヤー センター フォア モ
レキュラー メディシン
(72)発明者 シュー ティアン
アメリカ合衆国 コネチカット州 06536
ニューヘヴン（番地なし）イェイル ユ
ニヴァーシティ スクール オブ メディ
シン デパートメント オブ ジェネティ
ックス ボイヤー センター フォア モ
レキュラー メディシン