ES2240183T3 - Metodo de rastreo para identificar inhibidores de asp2. - Google Patents
Metodo de rastreo para identificar inhibidores de asp2.Info
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Abstract
Un método para rastrear compuestos para identificar aquellos compuestos que inhiben la degradación mediada por Asp 2 de un sustrato polipeptídico, método que comprende: proporcionar en un ensayo libre de células un sistema de reacción que comprende Asp 2 recombinante purificada, opcionalmente como una fusión Fc, y sustrato en un tampón de reacción adecuado; y determinar la magnitud de la degradación del sustrato en presencia del compuesto de ensayo comparada con la magnitud de la degradación en ausencia del compuesto de ensayo, en el que el sustrato peptídico contiene un par de grupos marcadores colocados a ambos lados del sitio de degradación, de manera que la degradación del sustrato resulta directamente en la modulación de una señal fluorescente, un grupo marcador porta el generador de la señal y el otro grupo marcador lleva a cabo la función de modulador, y en el que los grupos marcadores son xantenos seleccionados de rodaminas, rodoles y fluoresceínas, por lo que el espectro de absorción del modulador (aceptor) sobrelapa el espectro de emisión del generador (donante) de manera que se observan cambios en la transferencia de energía después de la degradación del péptido.
Description
Método de rastreo para identificar inhibidores de
Asp2.
La presente invención se refiere a un ensayo
utilizado para identificar compuestos que son potencialmente útiles
en terapia. La presente invención también se refiere a la
utilización de moduladores de la degradación polipeptídica en
terapia.
Las enfermedades relacionadas con la proteína
\beta amiloide (A\beta) son una clase heterogénea de trastornos
caracterizada por la deposición en el cerebro de depósitos
insolubles de la proteína A\beta (Roberts G W, Leigh P N y
Weinberger D. Neuropsychiatric Disorders. Gower Medical press.
Londres 1993). La consecuencia final de un número sustancial de
depósitos de A\beta es la aparición de un síndrome clínico de
disminución cognitiva y demencia incrementada. Se ha visto que
dichos depósitos están presentes en varios síndromes de demencia y
que éstos incluyen enfermedad de Alzheimer, enfermedad de cuerpos de
Lewy corticales, enfermedad de Parkinson y la enfermedad semejante
a Alzheimer en pacientes con síndrome de Down. Además los depósitos
A\beta están presentes en los cerebros de pacientes con
enfermedad vascular y cerebrovascular (Adams J H y Dunchen L W (eds)
Greenfields Neuropathology 5ª Ed. Edward Arnold, Londres 1992) y
estas últimas condiciones pueden predisponer o contribuir a las
enfermedades anteriores.
La enfermedad de Alzheimer (AD) es una enfermedad
degenerativa progresiva del sistema nervioso central caracterizada
clínicamente por demencia y neuropatológicamente por la presencia
de numerosas placas seniles y ovillos neurofibrilares. Típicamente,
AD es una enfermedad de aparición tardía de las personas mayores.
Sin embargo, se ha descrito un pequeño número de linajes en los que
se hereda una forma temprana de la enfermedad como un dominante
autosómico con penetrabilidad dependiente de la edad. Más
comúnmente, la edad de la aparición de la enfermedad es por debajo
de 60 años. Tanto en la aparición temprana como tardía de AD se han
implicado factores genéticos.
La producción y deposición de la proteína \beta
amiloide con los restos 39-43 (A\beta, Gienner,
G.G. y Wong, C.W. Biochem. Biophys. Res. Commun. 120,
885-890 (1984)) en el cerebro es una característica
neuropatológica que no varía de AD. A\beta se produce por
excisión de la glicoproteína integral de membrana tipo 1, Proteína
Precursora Amiloide (APP), mediante las acciones secuenciales de en
primer lugar \beta-secretasas y después
\gamma-secretasas (Selkoe, D.J. Annu. Rev.
Cell. Biol. 10, 373-403 (1994)).
APP puede degradarse en las células por las
\alpha o \beta secretasas, lo que resulta en la liberación de
fragmentos solubles del extremo N-terminal de la
proteína (sAPP\alpha y sAPP\beta). Los fragmentos del extremo
C-terminal unidos a la membrana resultantes
(CTF\alpha y CTF\beta) son sustratos de la
\gamma-secretasa; dando lugar la degradación de
CTF\alpha al péptido p3 de 3kDa y la de CTF\beta al péptido
A\beta. Se ha visto que el evento de degradación de la
\beta-secretasa se produce en diferentes orgánulos
intracelulares, incluyendo el retículo endoplásmico rugoso y la red
trans-Golgi (Hartmann. et al., Nature
Medicine. 3, 1016-1020 (1997), Cook, D.G. et
al., Nature Medicine. 3, 1021-1023
(1997), Wild-Bode, C. et al., J. Biol.
Chem. 272, 16085-16088 (1997)). A\beta se
genera a una velocidad baja intracelularmente antes de su secreción
y se ha publicado que un depósito intraneuronal de A\beta se
acumula con el tiempo en las células en cultivo (Skovronsky, D.M.,
Doms, R.W. y Lee, V.M.-Y. J. Biol. Chem. 141,
1031-1039 (1998)).
Las secretasas implicadas en el procesamiento de
APP no se han identificado, sin embargo, estudios con inhibidores
han sugerido que la \alpha-secretasa es una
metaloproteinasa (Parvathy, S., Hussain, I., Karran, E.H., Turner,
A.J. y Hooper, N.M. Biochemistry 37,
1680-1685 (1998)). Se han propuesto y descartado
diferentes \beta-secretasas candidatas tales como
la proteasoma (Ishiura, S., Tsukahara, T., Tabira, T. y Sugita, H.
FEBS Lett. 257, 388-392 (1989)), la
metaloproteinasa thimet (McDermott, J.R., Biggins, J.A. y Gibson,
A.M. Biochem. Biophys. Res. Commun. 185,
746-752 (1992)), diferentes proteinasas de serina
semejantes a la quimiotripsina (Nelson, R.B., Siman, R., Iqbal,
M.A. y Potter, H. J. Neurochem. 61, 567-577
(1993), Sahasrabudhe, S.R. et al., J. Biol. Chem.
268, 16699-16705 (1993), Savage, M.J. et al.,
Neuroscience 60, 607-619 (1994)), las
metaloproteinasas MP78 (Thompson, A.,
Grueninger-Leitch, F., Huber, G. y Malherde P.
Brain Res. 48, 206-214 (1997)) y MP100
(Huber, G. et al., J. Neurochem. 72,
1215-1223 (1999) y catepsina D (Ladror, U.S.,
Snyder, S.W., Wang, G.T., Holzman, T.F. y Krafft, G.A. J. Biol.
Chem. 269, 18422-18428 (1994)). Recientemente,
se ha publicado que presenilina-1 es bien un único
cofactor diaspartilo para la \gamma-secretasa o es
la \gamma-secretasa (Wolfe, M.S. et al.,
Nature 398, 513-517 (1999)). La Patente
Internacional WO96/40085 propone una
\beta-secretasa candidata aislada a partir de
tejido cerebral humano y células humanas 293 que tiene un peso
molecular aparente en el intervalo de 260 kDa a 300 kDa cuando se
determina mediante cromatografía de exclusión en gel.
Asp 2 (también conocida como endocrepsina 2) es
una aspartil proteinasa transmembrana que presenta unos niveles de
expresión altos en cerebro y páncreas (Patente Europea EP 0855444).
Posteriormente, se ha visto que el resto de la posición 130 es
Valina, y no ácido Glutámico como se había descrito previamente en
la Patente Europea EP0855444 (Hussain, I. et al., Molec.
Cell. Neurosci. 14, 419-427, 1999). La
proteinasa tiene un peso molecular de 60-65 kDa
cuando se determina mediante electroforesis en gel después de una
transfección transitoria en células. La forma madura de Asp 2
empieza en el resto Glu 46 (Sinha, S. et al., Nature
402, 537-540, 1999). También se ha encontrado
una variante de corte y empalme (Patente Internacional
WO00/17369).
Ghosh et al., J. Amer. Chem. Soc. 2000
122, 3522-3523 describen inhibidores de la
memapsina 2 (Asp 2) incluyendo OM99-2
(Glu-Val-Asn-Leu*Ala-Ala-Glu-Phe
en el que * designa el isóstero del estado de transición de
hidroxietileno.
La presente invención se basa en el
descubrimiento de que Asp 2 puede funcionar en la ruta de
degradación de APP de la \beta-secretasa. La
proteinasa tiene muchas de las características esperadas de la
\beta-secretasa, en el sentido de que está
presente en el cerebro, incluyendo el cerebro AD, y que también se
encuentra en líneas celulares que se sabe que producen A\beta y
se co-localiza con APP en Golgi/retículo
endoplásmico de células que expresan de manera estable la isoforma
de APP de 751 aminoácidos. De manera adicional, se ha visto que Asp
2 es una proteína integral de membrana tipo I con el dominio
catalítico en el interior de orgánulos membranosos. La transfección
de Asp 2 en células que expresan APP resulta en un incremento de la
actividad \beta-secretasa en las células, de
manera que se secreta más sAPP\beta en el medio y existe una
acumulación del fragmento del extremo C-terminal
derivado de la acción de la \beta-secretasa. La
mutación de cualquiera de los restos aspartilo catalíticos
propuestos de Asp 2 elimina la producción de estos fragmentos que
son característicos de la degradación de APP por la
\beta-secretasa. Estos descubrimientos sugieren
que la inhibición de la actividad proteolítica de Asp 2 tiene un
valor potencial como una terapia para el tratamiento de
enfermedades relacionadas con la proteína \beta amiloide
incluyendo la Enfermedad de Alzheimer.
Por lo tanto, la presente invención proporciona
un método para rastrear compuestos con el fin de identificar
aquellos compuestos que inhiben la degradación mediada por Asp 2 de
un sustrato polipeptídico o proteico, método que comprende:
proporcionar un sistema de reacción que comprende Asp 2 y sustrato;
y determinar la magnitud de la degradación del sustrato en
presencia del compuesto de ensayo comparada con la magnitud de la
degradación en ausencia del compuesto de ensayo. La invención
también se refiere a compuestos identificados de esta manera y a su
utilización en terapia incluyendo el tratamiento o profilaxis de
enfermedades relacionadas con la proteína \beta amiloide
incluyendo AD.
El sustrato es una proteína o péptido que puede
ser hidrolizado por la enzima Asp 2. Éste puede ser un sustrato
proteico no específico, por ejemplo, caseína, hemoglobina, cadena B
de la insulina, citocromo C, etc. También puede ser la proteína
amiloide precursora recombinante de longitud completa o truncada.
Los sustratos también pueden ser péptidos, que habitualmente son
fragmentos sintéticos de proteínas mayores. Por ejemplo, un péptido
que abarca el sitio de degradación de APP de la
\beta-secretasa puede servir como un sustrato
conveniente, incluyendo este péptido posiblemente la secuencia del
sitio beta del tipo salvaje (de P6 a P5', terminología como
describe Berger, A. y Schecter, I. Philos. Trans. R. Soc.
Lond. [Biol.] 257, 249-264 (1970)).
Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg
(SEQ ID
NO.1)
o la secuencia de la variante Sueca
(de P6 a
P5')
Ile-Ser-Glu-Val-Asn-Leu-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg
(SEQ ID
NO.2)
También pueden utilizarse péptidos más pequeños o
más largos del tipo salvaje o de las secuencias de la variante
Sueca, y otras variantes basadas en estas secuencias.
Las proteínas más grandes modificadas para
codificar secuencias de sustrato de Asp 2 también pueden servir como
sustratos útiles para el rastreo. Por ejemplo, la proteína de unión
a maltosa (MBP) puede modificarse para codificar las secuencias del
sitio beta del tipo salvaje o de la variante Sueca en su extremo
C-terminal para generar
- Proteína de Unión a Maltosa-Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg (sitio beta del tipo salvaje) (SEQ ID NO.3)
- o
- Proteína de Unión a Maltosa-Ile-Ser-Glu-Val-Asn-Leu-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg (sitio beta de la Variante Sueca) (SEQ ID NO.4)
Éstos pueden modificarse adicionalmente para
codificar una etiqueta Q en el extremo C-terminal
(Leu-Ser-Leu-Ser-Gln-Ser-Lys-Val-Leu-Pro-Gly-Pro
(SEQ ID NO.5) para generar
- Proteína de Unión a Maltosa-Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-Leu- Ser-Leu-Ser-Gln-Ser-Lys-Val-Leu-Pro-Gly-Pro (sitio beta del tipo salvaje) (SEQ ID NO.6)
- Proteína de Unión a Maltosa-Ile-Ser-Glu-Val-Asn-Leu-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-Leu- Ser-Leu-Ser-Gln-Ser-Lys-Val-Leu-Pro-Gly-Pro (sitio beta de la Variante Sueca) (SEQ ID NO.7)
Estas proteínas pueden marcarse con fluorescencia
a través de la etiqueta Q para generar sustratos adecuados para
utilizarse en diferentes formatos fluorescentes.
El ensayo puede llevarse a cabo en un sistema de
reacción libre de células o basado en células utilizando formatos
de ensayo convencionales tales como los descritos en la Patente
Internacional WO96/40885.
La enzima Asp 2 utilizada en la presente
invención incluye isoformas que incluyen variantes de corte y
empalme.
Un ensayo basado en células comprenderá una
célula anfitriona cotransfectada con vectores de expresión que
contienen ADN que codifica Asp 2 y el sustrato.
La presencia de los productos de degradación
puede detectarse ensayando el contenido en proteína de la célula
anfitriona utilizando anticuerpos policlonales o monoclonales
frente a los fragmentos del sustrato. Puede utilizarse cualquier
configuración adecuada de inmunoensayo, por ejemplo, ensayo de
transferencia Western o un ELISA.
Un ensayo libre de células comprenderá Asp 2
recombinante purificada, opcionalmente como una fusión Fc, y
sustrato en un tampón de reacción adecuado. Preferiblemente, la
enzima está de manera predominante en la forma madura.
La enzima puede presentarse como una fusión Fc
con el fin de facilitar la purificación utilizando cromatografía de
afinidad con proteína A. De manera adecuada, la región Fc se
obtiene a partir de IgG humana.
En un ensayo libre de células, los productos de
la degradación pueden detectarse mediante inmunoensayo como se ha
descrito más arriba. De manera alternativa, el sustrato peptídico
puede contener un par de grupos marcadores, que se colocan a ambos
lados del sitio de degradación. La degradación separa los
marcadores y este cambio puede detectarse utilizando técnicas que
reflejan la co-localización de estos marcadores. La
detección puede depender de una interacción óptica entre los dos
marcadores o, de manera más general, la generación de la señal
puede depender de su co-localización en el sustrato.
La técnicas basadas en interacciones ópticas incluyen transferencia
de energía fluorescente (FQ), como describe la teoría de Forster, y
transferencia de energía luminiscente (Selvin y Hearst, Proc.
Nat. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 10024). Los ensayos basados en
difusión traslacional o rotacional incluyen espectroscopía de
correlación de fluorescencia (FCS) (Eigen y Rigler, Proc. Nat.
Acad. Sci. USA, 1994, 91, 5740) y polarización de la
fluorescencia (FP) (Levine et al., Anal. Biochem.,
1997, 247, 83). Los ensayos basados en radiactividad incluyen
ensayos de centelleo por proximidad y técnicas de filtración en
nitrocelulosa. Las técnicas de adsorción a superficie incluyen
inmunoensayos con detección de absorbancia, fluorescencia,
quimioluminiscencia o fluorescencia en tiempo resuelto (TRF)
(Wallac OY, Finlandia).
Por lo tanto, la degradación del sustrato resulta
directamente o indirectamente en la modulación de una señal, por
ejemplo, una señal radiactiva, luminiscente o fluorescente.
Un grupo marcador porta el generador de la señal
o es capaz de unirse a un sistema informador diferente. El sistema
informador puede portar el generador de la señal o puede unirse a
un resto señalizador adicional. El otro grupo marcador lleva a cabo
la función de modulador o es capaz de unirse a una molécula de
manera que el complejo de unión lleva a cabo por sí mismo la
función de modulador.
Los ejemplos de grupos generadores de la señal
incluyen marcadores radiactivos, luminiscentes (emisión de estado de
triplete) y fluorescentes (emisión de estado singlete).
Los ejemplos de grupos marcadores capaces de
unirse a un sistema informador diferente incluyen ligandos de
anticuerpos, enzimas y receptores. El sistema informador de
anticuerpo, enzima o receptor está marcado o es capaz de participar
en un inmunoensayo. Un ejemplo adecuado de un ligando de este tipo
es dinitrofenol que puede capturarse con anticuerpo
anti-dinitrofenol seguido de un inmunoensayo
adecuado.
Los ejemplos de grupos moduladores incluyen
restos que modulan las propiedades ópticas de los marcadores
fluorescentes o luminiscentes o del sustrato como un todo cuando
dicho marcador y resto están unidos de manera covalente o no
covalente al sustrato. Después de la degradación proteolítica del
sustrato, las propiedades ópticas del marcador, o de la entidad
molecular como un todo, están moduladas de manera que la actividad
proteolítica puede evaluarse espectroscópicamente.
Los ejemplos de grupos capaces de llevar a cabo
la función de modulador o de unión a una molécula para formar un
complejo modulador incluyen ligandos de proteínas, tales como
ligandos de biotina capaces de unirse a estreptavidina o avidina, o
haptenos de anticuerpos bien en disolución o inmovilizados. Los
ligandos de biotina incluyen biotinas derivatizadas opcionalmente
con grupos espaciadores adecuados como aminohexanoilo.
Los ejemplos de grupos generadores de la señal y
otros grupos moduladores que modulan las propiedades ópticas de un
generador de señal fluorescente incluyen fluoróforos (familias de
moléculas que presentan intervalos espectrales de absorción y
fluorescencia), tales como cumarinas, xantenos (incluyendo
rodaminas, rodoles y fluoresceínas), derivados de fluorescamina,
naftalenos, pirenos, quinolinas, resorufinas,
difluoroboradiazaindacenos, acridinas, piridiloxazoles, isoindoles,
dansilos, dabcilos, dabsilos, benzofuranilos, ftalimidas,
naftalimidas, e hidrazidas ftálicas (incluyendo luminol e
isoluminol).
Los ejemplos de pares marcador/modulador
adecuados incluyen sistemas donante/aceptor de transferencia de
energía fluorescente o de fluorescencia apantallada (FQ)
convencionales tales como rodamina/rodamina, en particular rodamina
verde/tetrametilrodamina, fluoresceínas/rodaminas,
fluoresceínas/cumarinas,
5-dimetilamino-1-naftalensulfonilo
(DANSILO)/ácido
4-(4'-dimetilaminofenilazo)benzoico (DABCILO)
o ácido
5-(2-aminoetil)aminonaftalen-1-sulfónico
(EDANS)/DABCILO donde el espectro de absorción del aceptor se
sobrelapa con el espectro de emisión del donante de manera que los
cambios en la transferencia de energía se observan después de la
degradación del péptido de acuerdo con la teoría de Forster
(1948).
Para la detección utilizando FQ, el par de grupos
marcadores se elige preferiblemente de aminoácidos que presentan
las combinaciones EDANS/DABCILO y fluoresceínas/rodaminas. Más
preferiblemente, el par es 5-(y/o
6)-carboxifluoresceína con 5-(y/o
6)-tetrametilrodamina (TAMRA).
Otros ejemplos de marcadores incluyen iones
lantánido (típicamente terbio y europio) como donantes
luminiscentes para transferencia de energía de resonancia de
lantánidos a aceptores fluorescentes o cromofóricos (por ejemplo,
ejemplificado por tecnología de fluorescencia en tiempo resuelto
homogénea (HTRF) o tecnología de excitación de quelatos de
lantánidos (LANCE)). El apantallamiento acoplado a spin de un
donante lantánido también es posible con un aceptor radical
nitróxido, típicamente un radical piperidiniloxi o pirrolidiniloxi
(Véase M.V. Rogers (1997) DDT 2(4) 156).
Cuando el grupo modulador es un resto que modula
las propiedades ópticas del sustrato como un todo después de la
degradación proteolítica del sustrato, los ejemplos de pares
marcador/modulador adecuados incluyen un marcador fluorescente y un
ligando de una proteína, como un ligando de biotina capaz de unir
estreptavidina o avidina. Los cambios en la difusión rotacional del
péptido que resultan de la degradación pueden evaluarse observando
los cambios en la polarización de la fluorescencia (FP). De manera
alternativa, puede utilizarse espectroscopía de correlación de
fluorescencia (FCS) para evaluar cambios en la difusión
traslacional.
Por lo tanto, para la detección utilizando FP o
FCS, los grupos marcadores se eligen de aminoácidos que portan un
fluoróforo, como se ha definido más arriba, combinados con un
aminoácido que porta un ligando de proteínas como derivados de
biotina, o haptenos tales como difluoroboradiazaindacenos, dansilos,
dinitrofenoles, fluoresceínas, rodaminas y naftalimidas. El par del
grupo marcador es preferiblemente una combinación
fluoróforo/ligando de biotina. Más preferiblemente, el par es
5-(y/o 6)-carboxifluoresceína con biotina ligada a
aminohexanoato (biotina-X).
En un aspecto preferido el par del grupo marcador
proporciona un ensayo de fluorescencia apantallada (FQ), de
polarización de la fluorescencia (FP) o de espectroscopía de
correlación de fluorescencia (FCS).
Los grupos marcadores son preferiblemente
fluoróforos y derivados de ligandos de proteínas de aminoácidos con
cadenas laterales que se pueden modificar químicamente de una
manera fácil tales como lisina, ornitina, cisteína, homocisteína,
serina, homoserina y tirosina.
En un aspecto preferido los grupos marcadores son
o comprenden grupos de lisina modificados de la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R^{1} se selecciona de
grupos marcadores adecuados que están unidos directa o
indirectamente a través de un resto espaciador, a la lisina, de
manera que los grupos marcadores unidos forman un par de grupos
marcadores como se ha descrito más
arriba.
Los sustratos pueden prepararse mediante
cualquier método convencional apropiado de síntesis de péptidos.
Esto incluye estrategias basadas en, por ejemplo, las versiones
Fmoc y Boc de la síntesis en fase sólida e incluye variaciones de
secuencias y de fragmentos, o combinaciones de éstos, para el
ensamblaje de la cadena. También se incluyen los diferentes métodos
para la síntesis química de péptidos mediante el método de
disolución, que utiliza de nuevo ensamblajes de secuencias o
fragmentos, o combinaciones de éstos. También pueden considerarse
otros métodos sintéticos, tales como los basados en acoplamiento
enzimático, etc. Los expertos en la técnica se darán cuenta que
para la síntesis de péptidos existen muchas variaciones posibles,
por ejemplo, comenzar con diferentes grupos protectores, resinas y
espaciadores, reactivos de acoplamiento, disolventes, reactivos de
desbloqueo, etc. Los ejemplos de dichos procesos pueden encontrarse
en libros de texto, incluyendo, por ejemplo, "Solid Phase
Synthesis por J M Stewart y J D Young", San Francisco, Freeman,
1969; "The Chemical Synthesis of Peptides", J Jones, Clarendon
Press, Oxford, 1991; "Principles of Peptide Synthesis", M
Bodanszky, Springer-Verlag, NY, NY, 1984; "Solid
Phase Peptide Synthesis", E Atherton y RC Sheppard, IRL Press,
Oxford University Press, Oxford, 1989. En la conocida serie de
Proceedings de congresos recientes se presentan unos métodos más
modernos, incluyendo, "Innovations and Perspectives in Solid
Phase Synthesis", Ed R Epton, y las conferencias organizadas por
las Sociedades de Péptidos Europea y Americana y publicadas bajo el
título, "Peptides".
La introducción de los grupos marcadores se
consigue mediante métodos convencionales, por ejemplo, mediante la
adición bajo condiciones básicas, de un éster activado (por
ejemplo, succinimidil), un anhídrido mixto (por ejemplo
etoxicarbonil), un cloruro de ácido, una maleimida, un isocianuro o
un derivado isotiocianuro del grupo marcador al sustrato base
(unido a resina o en disolución) en el que un único resto de lisina,
ornitina, serina u homoserina porta en la cadena lateral una amina
primaria o hidroxilo desprotegido. De manera alternativa, el
sustrato base (unido a resina o en disolución) en el que un único
resto de cisteína u homocisteína permanece desprotegido se hace
reaccionar con un haluro de alquilo primario o con un derivado
maleimida del grupo marcador/informador bajo condiciones
básicas.
Generalmente, se conocerá la velocidad de
degradación en ausencia del compuesto de ensayo, así como la
magnitud de la degradación en puntos de tiempo determinados. El
ensayo puede evaluar la inhibición de la degradación en puntos de
tiempo específicos o la velocidad de la degradación.
La degradación del sustrato puede llevarse a cabo
en disolución o utilizando un soporte sólido.
El compuesto de ensayo puede preincubarse con la
proteasa antes de la adición del sustrato o, de manera alternativa,
el sustrato puede añadirse directamente. Las concentraciones
finales de la proteasa y del sustrato se calculan de manera que se
consiga una velocidad de procesamiento adecuada para llevarse a
cabo el ensayo. La reacción puede detenerse, por ejemplo, mediante
la adición de metanol o ácido trifluoroacético, y los productos se
analizan utilizando cualquier sistema convencional.
Por ejemplo, puede utilizarse HPLC de fase
reversa con detección UV (véanse, por ejemplo, Kuo, D, et
al., Biochemistry, 8347 (1994) y Allsop et al.,
Bioorganic and Med. Chem. Lett., 443 (1995)). La actividad de
los compuestos de ensayo puede expresarse como el % de reducción de
la actividad enzimática a concentraciones determinadas. En el
ensayo de HPLC esto se calcula como la reducción del área del
producto comparado con el control. Cuando el sustrato contiene un
par marcador, puede utilizarse, de manera alternativa, metanol o una
proteína de unión exógena para detener la reacción y los productos
se analizan utilizando cualquier sistema convencional apropiado
para los grupos marcadores utilizados.
Los métodos radiactivos incluyen la utilización
de un par biotina/marcador radiactivo. El sustrato es capturado en
las placas flash recubiertas con estreptavidina, lechos de ensayo
de centelleo por proximidad recubiertas con estreptavidina o
mediante técnicas de filtración convencionales (por ejemplo,
nitrocelulosa). La detección del marcador puede llevarse a cabo
mediante contaje de centelleo.
Los métodos de detección de péptidos basados en
anticuerpos incluyen la utilización de un par ligando/ligando, por
ejemplo, marcador biotina/dinitrofenol. Después de la captura
mediante un ligando, por ejemplo en placas recubiertas con
estreptavidina, la detección del sustrato inmovilizado se lleva a
cabo utilizando anticuerpos frente al otro ligando, por ejemplo,
anticuerpos anti-DNP seguido de un inmunoensayo como
un inmunoensayo ligado a enzima (ELISA), fluorescencia en tiempo
resuelto por incremento de la disociación (tecnología DELFIA,
Wallac OY), detección inmunosorbente de luminiscencia,
quimioluminiscencia o fluorescencia.
Los métodos ópticos que evalúan cambios en la
transferencia de energía pueden llevarse a cabo macroscópicamente
mediante la intensidad de fluorescencia total utilizando un
fluorímetro o mediante el procesamiento de la señal de las emisiones
de fotones de moléculas fluorescentes individuales mediante
espectroscopía de correlación de fluorescencia (FCS) utilizando
algoritmos desarrollados, por ejemplo, por Evotec Biosystems GmbH.
Se pueden aplicar algoritmos similares para la determinación de
velocidades de proteolisis utilizando FCS mediante cambios en el
brillo molecular y en el número de partículas de los sustratos
peptídicos marcados doblemente y/o indirectamente.
Cuando el grupo modulador es un resto que modula
las propiedades ópticas del sustrato como un todo después de la
degradación proteolítica del sustrato, los cambios en la
polarización de la fluorescencia (FP) como resultado de la
degradación de, por ejemplo, un péptido marcado doblemente
biotinilado y fluorescente, sin o más preferiblemente con la adición
de, por ejemplo, estreptavidina o avidina, pueden utilizarse para
evaluar la actividad de la proteasa. Los cambios en el tiempo de
difusión de este sustrato peptídico marcado con fluorescencia como
resultado de la proteolisis, sin o con la adición de estreptavidina
o avidina, también pueden evaluarse mediante FCS traslacional. La
polarización de la fluorescencia puede determinarse, por ejemplo,
en un lector de placas de polarización de la fluorescencia.
Los inhibidores que se pueden identificar con el
método de la invención son ligandos del sitio activo que pueden
marcarse para crear reactivos para utilizarse en ensayos de unión
competitiva.
Por lo tanto, la presente invención también
proporciona un método para rastrear compuestos con el fin de
identificar aquellos compuestos que inhiben la degradación mediada
por Asp 2 de un sustrato polipeptídico o proteico, método que
comprende: proporcionar un sistema de reacción que comprende Asp 2
y el ligando del sitio activo marcado; y determinar la magnitud de
la unión del ligando marcado en presencia de un compuesto de ensayo
comparada con la magnitud de unión del ligando marcado en ausencia
del compuesto de ensayo con el fin de determinar la afinidad de la
unión.
La invención también se refiere a compuestos
identificados mediante ésta y a su utilización en terapia
incluyendo el tratamiento o profilaxis de enfermedades relacionadas
con la proteína \beta amiloide incluyendo AD.
Los métodos de ensayo para el ligando son
convencionales e incluyen los basados en difusión traslacional o
rotacional como se ha descrito más arriba para los ensayos de
degradación. En un aspecto preferido el método de rastreo se basa en
polarización de la fluorescencia (FP). Un marcador preferido es un
fluoróforo como se especifica más arriba, preferiblemente rodamina
verde.
El ensayo puede llevarse a cabo en un sistema de
reacción libre de células o basado en células utilizando formatos
de ensayo convencionales tales como los descritos más arriba para
el ensayo de degradación.
Las células anfitrionas se han sometido a
ingeniería genética (transducidas o transformadas o transfectadas)
con vectores que pueden ser, por ejemplo, un vector de clonación o
un vector de expresión. El vector puede estar, por ejemplo, en la
forma de un plásmido, cósmido, fago, etc. Las células anfitrionas
sometidas a ingeniería pueden cultivarse en medios nutritivos
convencionales modificados, según resulte apropiado, para activar
promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes. Las
condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y semejantes,
son las utilizadas previamente con la célula anfitriona seleccionada
para la expresión, y serán aparentes para los expertos en la
técnica.
Los vectores de expresión adecuados incluyen
secuencias de ADN cromosómicas, no cromosómicas y sintéticas, por
ejemplo, derivados de SV40; plásmidos bacterianos; ADN de fagos;
baculovirus; plásmidos de levaduras; vectores obtenidos a partir de
combinaciones de plásmidos y ADN de fagos, ADN vírico como vaccinia,
adenovirus, virus de viruela aviar, y pseudorabia. Sin embargo,
puede utilizarse cualquier otro vector siempre que se pueda replicar
y sea viable en el anfitrión.
La secuencia de ADN apropiada puede insertarse en
el vector mediante diferentes procedimientos. En general, la
secuencia de ADN se inserta en un sitio de restricción de
endonucleasa apropiado mediante procedimientos conocidos en la
técnica. Dichos procedimientos y otros están en el alcance de los
expertos en la técnica.
La secuencia de ADN en el vector de expresión se
une de manera operativa a una secuencia de control de la expresión
apropiada (promotor) para dirigir la síntesis de ARNm. Como
ejemplos representativos de dichos promotores, pueden mencionarse:
promotor LTR o SV40, lac o trp de E.
coli, el promotor P_{L} del fago lambda y otros promotores
conocidos para controlar la expresión de genes en células
procariotas o eucariotas o sus virus. El vector de expresión
también contiene un sitio de unión a ribosomas para la iniciación de
la traslación y un terminador de la transcripción. El vector
también puede incluir secuencias apropiadas para amplificar la
expresión.
Además, los vectores de expresión contienen,
preferiblemente, uno o más genes marcadores que se pueden
seleccionar para proporcionar una marca fenotípica para la
selección de las células anfitrionas transformadas como
dihidrofolato reductasa o resistencia a neomicina en el caso de un
cultivo celular eucariota, o como resistencia a tetraciclina o
ampicilina en E. coli.
El gen puede situarse bajo el control de un
promotor, sitio de unión a ribosomas (para la expresión bacteriana)
y, opcionalmente, un operador (referidos de manera colectiva en la
presente memoria como elementos de "control"), de manera que la
secuencia de ADN que codifica la proteína deseada se transcribe en
ARN en la célula anfitriona transformada con un vector que contiene
esta construcción de expresión. La secuencia codificadora puede
contener o no un péptido señal o una secuencia líder. Las secuencias
de proteínas de la presente invención pueden expresarse utilizando,
por ejemplo, el promotor tac de E. coli o el
promotor del gen de la proteína A (spa) y una secuencia señal. Las
secuencias líder pueden eliminarse en el anfitrión bacteriano
mediante procesamiento postraslacional. Las regiones promotoras
pueden seleccionarse de cualquier gen deseado utilizando vectores
CAT (cloroanfenicol transferasa) u otros vectores con marcadores
que se pueden seleccionar. Dos vectores apropiados son
PKK232-8 y PCM7. Los promotores bacterianos
particulares incluyen lacI, lacZ, T3, T7, gpt, P_{R}, P_{L} de
lambda y trp. Los promotores eucariotas incluyen inmediato temprano
de CMV, timidina quinasa de HSV, SV40 temprano y tardío, LTR de
retrovirus, y metalotioneína-I de ratón. La
selección del vector y promotor adecuados se encuentra dentro de la
capacidad del experto en la técnica.
Además de las secuencias control, puede ser
deseable añadir secuencias reguladoras que permitan la regulación
de la expresión de las secuencias de proteína relacionadas con el
crecimiento de la célula anfitriona. Las secuencias reguladoras son
conocidas para los expertos en la técnica, y los ejemplos incluyen
aquellas que producen la activación o inactivación de la expresión
de un gen en respuesta a un estímulo químico o físico, incluyendo la
presencia de un compuesto regulador. Otros tipos de elementos
reguladores también pueden estar presentes en el vector, por
ejemplo, secuencias amplificadoras.
Un vector de expresión se construye de manera que
la secuencia codificadora particular está localizada en el vector
con las secuencias reguladoras apropiadas, siendo la posición y
orientación de la secuencia codificadora respecto a las secuencias
de control tal que la secuencia codificadora se transcribe bajo el
"control" de las secuencias de control (es decir, la ARN
polimerasa que se une a la molécula de ADN en las secuencias de
control transcribe la secuencia codificadora). La modificación de
las secuencias codificadoras puede ser deseable para lograr este
propósito. Por ejemplo, en algunos casos puede ser necesario
modificar la secuencia de manera que pueda estar unida a las
secuencias de control con la orientación apropiada; es decir, para
mantener el marco de lectura. Las secuencias de control y otras
secuencias reguladoras pueden ligarse a la secuencia codificadora
antes de su inserción en un vector, como los vectores de clonación
descritos más arriba. De manera alternativa, la secuencia
codificadora puede clonarse directamente en un vector de expresión
que contiene las secuencias control y un sitio de restricción
apropiado. La modificación de las secuencias codificadoras también
puede llevarse a cabo para alterar la utilización de codones para
ajustarse a la célula anfitriona elegida, para una expresión
amplificada.
Generalmente, los vectores de expresión
recombinantes incluirán orígenes de replicación y marcadores que se
pueden seleccionar que permiten la transformación de la célula
anfitriona, por ejemplo, gen de resistencia a ampicilina de
E. coli y gen TRP1 de S. cerevisiae, y
un promotor obtenido de un gen con una expresión elevada para
dirigir la transcripción de una secuencia estructural situada más
abajo. La secuencia estructural heteróloga se ensambla en la fase
apropiada con las secuencias de iniciación y terminación de la
traslación y, preferiblemente, con una secuencia líder capaz de
dirigir la secreción de la proteína sometida a traslación al
espacio periplásmico o al medio extracelular. Opcionalmente, la
secuencia heteróloga puede codificar una proteína de fusión
incluyendo un péptido de identificación en el extremo
N-terminal que tenga las características deseadas,
por ejemplo, estabilización o simplificación de la purificación del
producto recombinante expresado.
El vector que contiene la secuencia de ADN
apropiada como se ha descrito más arriba en la presente memoria,
así como un promotor o secuencia de control apropiado, puede
utilizarse para transformar un anfitrión apropiado para permitir al
anfitrión expresar la proteína.
Los ejemplos de vectores de ADN recombinante para
la clonación y de células anfitrionas que éstos pueden transformar
incluyen el bacteriofago \lambda (E. coli), pBR322
(E. coli), pACYC177 (E. coli) pKT230
(bacterias gram-negativas), pGV1106 (bacterias
gram-negativas), pLAFR1 (bacterias
gram-negativas), pME290 (bacterias
gram-negativas distintas de E. coli),
pHV14 (E. coli y Bacillus subtilis),
pBD9 (Bacillus), pIJ61 (Streptomyces), pUC6
(Streptomyces), YIp5 (Saccharomyces), un sistema de
células de insecto de baculovirus, YCp19 (Saccharomyces).
Véanse, de manera general, "DNA Cloning": Vols. I y II,
Glover et al., ed., IRL Press Oxford (1985) (1987) y; T.
Maniatis et al., "Molecular Cloning" Cold Spring Harbor
Laboratory (1982).
En algunos casos, puede ser deseable añadir
secuencias que producen la secreción del polipéptido del organismo
anfitrión, con la degradación posterior de la señal de
secreción.
Los vectores de expresión de levaduras también
son conocidos en la técnica, Véanse, por ejemplo, las Patentes de
EEUU nos. 4.446.235; 4.443.539; 4.430.428; véanse también las
Solicitudes de Patente Europeas 103.409; 100.561; 96.491. pSV2neo
(descrito en Southern, PJ y Berg, PJ, Mol. Appl.
Genet. 1:327-341 (1982)) que utiliza el
promotor tardío de SV40 para dirigir la expresión en células de
mamífero o pCDNAIneo, un vector obtenido a partir de pCDNAI
(Nelson, J et al., Mol. Cell.
Biol. 7:4125-29 (1987)) que utiliza el
promotor CMV para dirigir la expresión. Estos dos últimos vectores
pueden utilizarse para la expresión transitoria o estable
(utilizando resistencia G418) en células de mamífero. Los sistemas
de expresión en células de insectos, por ejemplo,
Drosophila, también son útiles, véanse por ejemplo,
solicitudes PCT WO 90/06358 y WO 92/06212 así como EP 290.261
B1.
La transcripción de ADN por eucariotas superiores
se incrementa mediante la inserción de una secuencia amplificadora
en el vector. Los amplificadores son elementos de ADN que actúan en
cis, habitualmente de aproximadamente 10 a 300 bp que actúan sobre
un promotor para incrementar su transcripción. Los ejemplos
incluyen amplificador de SV40 en la parte tardía del origen de
replicación 100 a 270 pb, un amplificador del promotor temprano de
citomegalovirus, el amplificador de polioma en la parte tardía del
origen de replicación, y amplificadores de adenovirus.
La célula anfitriona que contiene los vectores
anteriores puede ser una célula eucariota superior, como una célula
de mamífero, o una célula eucariota inferior, como una célula de
levadura, o la célula anfitriona puede ser una célula procariota,
como una célula bacteriana. Como ejemplos representativos de
anfitriones apropiados, pueden mencionarse: procariotas por ejemplo
células bacterianas, tales como E. coli,
Streptomyces, Salmonella typhimurium y
eucariotas por ejemplo células fúngicas, como levaduras, células de
insecto, tales como Drosophila y Spodoptera
frugiperda, células de mamífero tales como CHO, COS o
melanoma de Bowes, células de plantas, etc. La selección de un
anfitrión apropiado está en el alcance de los expertos en la
técnica a partir de lo descrito en la presente memoria.
La introducción de la construcción en la célula
anfitriona puede realizarse mediante transfección con fosfato
cálcico, transfección mediada por DEAE-Dextrano, o
electroporación. (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods
in Molecular Biology, (1986)).
Después de la transformación de una cepa de
anfitrión adecuada y del crecimiento de la cepa de anfitrión hasta
una densidad celular apropiada, el promotor seleccionado se induce
mediante medios apropiados (por ejemplo, cambio en la temperatura o
inducción química) y las células se cultivan durante un periodo
adicional.
Las células se recogen típicamente por
centrifugación, se rompen mediante medios físicos o mecánicos, y el
extracto crudo resultante se guarda para una purificación
adicional.
Las células microbianas utilizadas en la
expresión de proteínas pueden romperse mediante cualquier método
conveniente, incluyendo ciclos de
congelación-descongelación, sonicación, rotura
mecánica, o mediante la utilización de agentes lisantes celulares,
siendo dichos métodos muy conocidos por los expertos en la
técnica.
También pueden utilizarse diferentes sistemas de
cultivo de células de mamífero para expresar la proteína
recombinante. Los ejemplos de sistemas de expresión de mamíferos
incluyen las líneas celulares COS-7 de fibroblastos
de riñón de mono, descritas por Gluzman, Cell, 23:175
(1981), y otras líneas celulares capaces de expresar un vector
compatible, por ejemplo, las líneas celulares C127, 3T3, CHO, HeLa
y BHK. Los vectores de expresión de mamíferos comprenderán un
origen de replicación, un promotor y amplificador adecuados, y
también cualquier sitio de unión a ribosomas necesario, sitio de
poliadenilación, sitios de corte y empalme del donante y aceptor,
secuencias de terminación de la transcripción, y secuencias 5'
flanqueantes que no se transcriben. Las secuencias de ADN obtenidas
del corte y empalme de SV40 y los sitios de poliadenilación pueden
utilizarse para proporcionar los elementos genéticos requeridos que
no se transcriben.
Como anfitriones también pueden utilizarse
animales no humanos transgénicos.
Cuando el ensayo de la invención es libre de
células, el método de recuperación del polipéptido expresado
depende del sistema de expresión y del anfitrión seleccionados. Si
el sistema de expresión secreta el polipéptido en el medio de
crecimiento, el polipéptido puede purificarse directamente a partir
del medio. Si el polipéptido no se secreta, se aisla a partir de
lisados celulares o se recupera a partir de la fracción celular de
membrana. Cuando el polipéptido está localizado en la superficie
celular, pueden utilizarse células completas o membranas aisladas
como una fuente de ensayo del producto génico deseado. El
polipéptido expresado en anfitriones bacterianos como E.
coli puede requerir un aislamiento a partir de cuerpos de
inclusión y un replegamiento. La selección de las condiciones de
crecimiento y de los métodos de recuperación adecuados puede
hacerse por los expertos en la técnica.
El polipéptido puede recuperarse y purificarse a
partir de cultivos de células recombinantes mediante métodos que
incluyen precipitación con sulfato amónico o etanol, extracción
ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico,
cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción
hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía de
hidroxilapatito y cromatografía de lectina. Pueden utilizarse etapas
de replegamiento de proteínas, si es necesario, para completar la
configuración de la proteína madura. Finalmente, puede utilizarse
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para las etapas
finales de la purificación.
Dependiendo del anfitrión empleado en un
procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos pueden
estar glicosilados o pueden no estar glicosilados. Los polipéptidos
también pueden incluir un resto del aminoácido metionina
inicial.
Polipéptidos "recombinantes" se refiere a
polipéptidos producidos mediante técnicas de ADN recombinante; es
decir, producidos a partir de células transformadas con una
construcción de ADN exógena que codifica el polipéptido deseado.
Polipéptidos "sintéticos" son aquellos preparados mediante
síntesis química.
Un "replicón" es cualquier elemento genético
(por ejemplo, plásmido, cromosoma, virus) que funciona como una
unidad autónoma de replicación de ADN in vivo; es decir, es
capaz de replicarse bajo su propio control.
Un "vector" es un replicón, como un
plásmido, fago, o cósmido, al que puede unirse otro segmento de ADN
con el fin de que se produzca la replicación del segmento unido.
Una "molécula de ADN de doble cadena" se
refiere a la forma polimérica de desoxirribonucleótidos (bases
adenina, guanina, timina, o citosina) en una hélice de doble
cadena, tanto relajada como superenrrollada. Este término se refiere
sólo a las estructuras primaria y secundaria de la molécula, y no
la limita a ninguna forma terciaria. Por lo tanto, este término
incluye el ADN de cadena doble que se encuentra, entre otros, en las
moléculas de ADN lineales (por ejemplo, fragmentos de restricción),
virus, plásmidos, y cromosomas. En la discusión sobre la estructura
de moléculas particulares de ADN de cadena doble, en la presente
memoria se pueden describir secuencias de acuerdo con la convención
normal de proporcionar sólo la secuencia en la dirección 5' a 3' a
lo largo de la cadena con sentido del ADN.
Una "secuencia de ADN codificadora de" o una
"secuencia de nucleótidos que codifica" una proteína
particular, es una secuencia de ADN que se transcribe y se somete a
traslación para dar lugar a un polipéptido cuando se sitúa bajo el
control de secuencias reguladoras apropiadas.
Una "secuencia de promotor" es una región de
ADN reguladora capaz de unirse a la ARN polimerasa en una célula y
de iniciar la transcripción de una secuencia codificadora situada
más abajo (dirección 3'). Dentro de la secuencia del promotor se
encuentra un sitio de iniciación de la transcripción (definido
convenientemente mediante mapeo con la nucleasa S1), así como
dominios de unión de proteínas (secuencias consenso) responsables de
la unión de la ARN polimerasa. Los promotores eucariotas contienen
habitualmente, pero no siempre, cajas "TATA" y cajas
"CAT".
Las "secuencias de control" de ADN se
refieren de manera colectiva a secuencias de promotor, sitios de
unión a ribosomas, señales de poliadenilación, secuencias de
terminación de la transcripción, dominios reguladores superiores,
amplificadores, y semejantes, que de manera colectiva proporcionan
la expresión (es decir, la transcripción y traslación) de una
secuencia codificadora en una célula anfitriona.
Una secuencia de control "dirige la
expresión" de una secuencia codificadora en una célula cuando la
ARN polimerasa se une a la secuencia del promotor y transcribe la
secuencia codificadora en ARNm, que después se somete a traslación
para dar lugar al polipéptido codificado por la secuencia
codificadora.
Una "célula anfitriona" es una célula que ha
sido transformada o transfectada, o que es capaz de transformación
o transfección mediante una secuencia de ADN exógena.
Una célula ha sido "transformada" mediante
ADN exógeno cuando dicho ADN exógeno ha sido introducido dentro de
la membrana celular. El ADN exógeno puede estar o no integrado
(unido covalentemente) en el ADN cromosómico que forma el genoma de
la célula. En procariotas y levaduras, por ejemplo, el ADN exógeno
puede mantenerse en un elemento episomal, como un plásmido.
Respecto a las células eucariotas, una célula transformada o
transfectada de manera estable es una en la que el ADN exógeno se ha
integrado en el cromosoma de manera que se hereda por las células
hijas a través de la replicación cromosómica. Esta estabilidad se
demuestra por la capacidad de la célula eucariota de establecer
líneas celulares o clones comprendidos de una población de células
hijas que contiene el ADN exógeno.
Un "clon" es una población de células
obtenida a partir de una única célula o un ancestro común por
mitosis. Una "línea celular" es un clon de una célula primaria
que es capaz de crecer de manera estable in vitro durante
muchas generaciones.
La presente invención también está dirigida a
compuestos que son inhibidores de la degradación de APP modulada
por Asp 2, y a su utilización en el tratamiento de enfermedades
relacionadas con la proteína \beta amiloide incluyendo la
Enfermedad de Alzheimer.
La invención proporciona además la utilización de
un compuesto de acuerdo con la invención para la preparación de un
medicamento para inhibir la degradación de APP modulada por Asp 2,
en particular, para el tratamiento de enfermedades relacionadas con
la proteína \beta amiloide incluyendo la Enfermedad de
Alzheimer.
La invención proporciona además un método para
inhibir la degradación de APP modulada por Asp 2, en particular, el
tratamiento o profilaxis de enfermedades relacionadas con la
proteína \beta amiloide incluyendo la Enfermedad de Alzheimer,
método que comprende administrar a un paciente una cantidad eficaz
de un compuesto de la invención.
Cuando se utilizan en terapia, los compuestos de
la invención se formulan de acuerdo con prácticas farmacéuticas
estándar.
Por lo tanto, la presente invención también
proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto
de la invención y un vehículo aceptable desde un punto de vista
farmacéutico.
Los compuestos que son activos cuando se
administran oralmente pueden formularse como líquidos, por ejemplo,
jarabes, suspensiones o emulsiones, comprimidos, cápsulas y
pastillas.
Una formulación líquida consistirá generalmente
de una suspensión o disolución del compuesto o sal aceptable desde
un punto de vista farmacéutico en un vehículo líquido adecuado, por
ejemplo, etanol, glicerina, disolvente no acuoso, por ejemplo,
polietilenglicol, aceites, o agua, con una agente de suspensión,
conservante, saporífero o colorante.
Una composición en la forma de un comprimido
puede prepararse utilizando cualquier vehículo farmacéutico
adecuado utilizado de manera rutinaria para preparar formulaciones
sólidas. Los ejemplos de dichos vehículos incluyen estearato de
magnesio, almidón, lactosa, sacarosa y celulosa.
Una composición en la forma de una cápsula puede
preparase utilizando procedimientos de encapsulación rutinarios.
Por ejemplo, los sedimentos que contienen el ingrediente activo
pueden prepararse utilizando vehículos estándar y después utilizarse
para rellenar una cápsula de gelatina dura; de manera alternativa,
puede prepararse una dispersión o suspensión utilizando cualquier
vehículo farmacéutico adecuado, por ejemplo, gomas acuosas,
celulosas, silicatos o aceites y la dispersión o suspensión puede
utilizarse para rellenar una cápsula de gelatina blanda.
Las composiciones parenterales típicas consisten
en una disolución o suspensión del compuesto o sal aceptable desde
un punto de vista farmacéutico en un vehículo acuoso estéril o
aceite aceptable para administración parenteral, por ejemplo
plietilenglicol, polivinil pirrolidona, lecitina, aceite de
cacahuete o aceite de sésamo. De manera alternativa, la disolución
puede liofilizarse y después reconstituirse con un disolvente
adecuado justo antes de la administración.
Una formulación en supositorio típica comprende
un compuesto de fórmula (I) o una sal de éste aceptable desde un
punto de vista farmacéutico que es activo cuando se administra de
esta forma, con un agente de unión y/o lubricante como glicoles
poliméricos, gelatinas o mantequilla de cacao u otras ceras o
grasas vegetales o sintéticas con punto de fusión bajo.
Preferiblemente, la composición está en forma de
dosis unitaria como un comprimido o cápsula.
Cada dosis unitaria para la administración oral
contiene preferiblemente de 1 a 250 mg (y para la administración
parenteral contiene preferiblemente de 0,1 a 25 mg) de un inhibidor
de la invención.
El régimen diario de dosificación para un
paciente adulto puede ser, por ejemplo, una dosis oral de entre 1
mg y 500 mg, preferiblemente entre 1 mg y 250 mg, o una dosis
intravenosa, subcutánea, o intramuscular de entre 0,1 mg a 100 mg,
preferiblemente entre 0,1 mg y 25 mg, del compuesto de la fórmula
(I) o de una sal de éste aceptable desde un punto de vista
farmacéutico calculado como la base libre, siendo administrado el
compuesto de 1 a 4 veces por día. Los compuestos se administrarán
durante un periodo de terapia continua.
La presente invención se describirá
adicionalmente con referencia a los ejemplos siguientes; sin
embargo, debe entenderse que la presente invención no está limitada
a dichos ejemplos. Todas las partes o cantidades, a no ser que se
especifique otra cosa, son por peso.
El ADN que codifica Asp 2 se clonó en un vector
de expresión para la expresión transitoria en células de mamífero.
El gen de Asp 2 se amplificó con los cebadores
5' TATTATCTACTCGAGCCACCATGGCCCAAGCCCTGCC 3' (SEQ
ID NO.8) y
5' GTTAATATAAAGCTTCAGCAGGGAGATGTCATCAGC 3' (SEQ
ID NO.9)
y se clonó en pCR2.1 (Invitrogen). Después el gen
de Asp 2 se ligó a pcDNA3.1aMycHis (Invitrogen) digerido con Eco
R I/Hind III.
Se cultivaron células de neuroblastoma humano
SH-SY5Y que sobreexpresan la isoforma de APP humana
695, (SH-SY5Y APP695) en medio esencial Dulbecco
Modificado:F12 suplementado con 10% suero fetal bovino (v/v),
penicilina (50 unidades/ml), estreptomicina (50 \mug/ml), 2 mM
glutamina y 260 \mug/ml higromicina B a 37ºC en una atmósfera
humidificada de 10% CO_{2}/90% aire. Se cultivaron células
COS-7 APP751, tipo salvaje y con la mutación Sueca
APP (Haass, C. et al., Nature Med.
1:1291-1296 (1995)), Lys 595\rightarrowAsn y Met
596\rightarrowLeu (numeración APP 695), en el medio anterior pero
con 300 \mug/ml higromicina B. Para la transfección transitoria,
las células se sembraron a una confluencia de \sim60% en frascos
de cultivo de 75 cm^{2} y se transfectaron utilizando Reactivo
LipofectAMINE PLUS (Life Technologies) como describe el fabricante.
24 h después de la transfección el medio se cambió a
OptiMEM-1 (10 ml). El medio se recogió 24 h después,
se centrifugó brevemente (500 x g durante 10 min) para eliminar
cualquier célula y después se concentró utilizando concentradores
Centriprep 10 (Amicon). Las células se recogieron mediante
disociación a partir de los frascos utilizando un tampón de
disociación celular libre de enzimas (Life Technologies) y se
lisaron mediante incubación durante 30 min a 4ºC en 50 mM Tris/HCl
pH 7,4, 1% Triton X-100 que contiene un conjunto de
inhibidores de proteasas (Boehringer Mannheim). Después de
centrifugar (3.000 x g durante 5 min) el sobrenadante se aspiró y
se almacenó a -20ºC hasta el ensayo.
Un ADNc que codifica Asp 2 con una etiqueta de
epítopo Myc se transfectó en células COS-7
APP-751. Las células se fijaron y procesaron para
inmunofluorescencia indirecta como se describe en Spector, D.L.,
Goldman, R.D. y Leinwald, L.A. Cells, in a laboratory Manual, 3,
105.3, Cold Spring Harbor Lab Press, Cold Spring Harbor, Nueva York
(1998). APP se visualizó utilizando el anticuerpo
anti-extremo C-terminal Ab54. Los
anticuerpos control fueron, Anti-proteína 58 K de
golgi monoclonal de Sigma, Antígeno 1 Endosómico Temprano
monoclonal (EEA1) de Transduction Labs, Anti-KDEL
monoclonal de Stressgen, anti-Myc monoclonal de
SantaCruz Biotechnology. La detección fue con los anticuerpos Alexa
488 marcado anti-ratón o Alexa 568 marcado
anti-conejo de Molecular Probes. La microscopía se
llevó a cabo utilizando un microscopio confocal Leica.
Inmunohistoquímica de Asp 2: secciones de 10
\mum de hipocampo y cortex frontal y temporal fijadas con
paraformaldehido de dos pacientes con la enfermedad de Alzheimer
(mujeres, edades 62 y 89) y de dos controles mayores (mujeres,
edades 80 y 86) se rehidrataron y marcaron con un anticuerpo frente
a Asp 2 mediante incubación durante toda la noche a 4ºC. Para el
procesamiento posterior se utilizó el sistema
biotina-avidina (con anticuerpo de cabra
anti-conejo biotinilado) y el cromógeno,
diaminobencidina (Laboratorios Vector).
Los mutantes del sitio activo de Asp 2 se
construyeron con el kit de mutagénesis Stratagene QuickChange. Se
diseñaron dos oligonucleótidos para introducir cada Asp en Asn,
\newpage
D93N1:
5' CTCAACATCCTGGTGAATACAGGCAGCAGTAAC 3' (SEQ ID
NO.10)
D93N2:
5' GTTACTGCTGCCTGTATTCACCAGGATGTTGAG 3' (SEQ ID
NO.11)
D289N1:
5' GACAAGAGCATTGTGAACAGTGGCACCACCAAC 3' (SEQ ID
NO.12)
D289N2:
5' GTTGGTGGTGCCACTGTTCACAATGCTCTTGTC 3' (SEQ ID
NO.13)
(las posiciones D93 y D289 referidas arriba
corresponden a las posiciones D48 y D244 de la proteína
madura).
Las mutaciones se introdujeron en la construcción
pcDNA3.1a Asp 2, siguiendo el protocolo QuickChange. Los mutantes se
secuenciaron para asegurar la presencia de la mutación del sitio
activo deseada y la ausencia de mutaciones PCR.
Se mezclaron muestras de lisados celulares (20
\mug) o medio (15 \mul de medio concentrado 20 veces) con un
volumen igual de tampón de muestra Laemmli (0,5 M Tris/HCl, pH 6,8,
10% (p/v) SDS, 0,1% azul de bromofenol, 20% (v/v) glicerol y 5%
\beta-mercaptoetanol) y se sometieron a
electroforesis utilizando geles de 10% Tris glicina SDS
poliacrilamida pre-cargados (Novex). Después de la
electroforesis, los geles se electrotransfirieron a PVDF a 100V
durante 60 min utilizando el aparato de transferencia húmeda
(Novex), el tampón de transferencia consistió en 35 mM Tris HCl,
193 mM glicina y 20% metanol (v/v). Después de la transferencia,
las membranas se bloquearon en 5% Marvel, disolución salina
tamponada con fosfato (PBS), 0,1% Tween-20 durante
3 h a temperatura ambiente. Después las membranas se incubaron con
anticuerpo primario en 2% de albúmina de suero bovino, PBS, 0,1%
Tween-20 durante toda la noche a 4ºC. Se utilizó el
anticuerpo anti-His_{6} (Boehringer Mannheim) a
una dilución de 1:1.000; el anticuerpo producido frente al extremo
C-terminal de APP (secuencia de aminoácidos
676-695), Ab54 (Allsop, D. et al., en
Alzheimer's Disease: Biology, Diagnostics and Therapeutics,
eds Iqbal, K., Winblad, B., Nishimura, T., Takeda, M. y Wisneski,
H.M., 717-727, John Wiley, Nueva York (1997)), se
utilizó a una dilución de 1:25.000, anticuerpo WO2 (Ida, N. et
al., J. Biol. Chem. 271:22908-22914
(1996)) que se produjo frente a los aminoácidos 1-16
del dominio A\beta de APP se utilizó a una dilución de 1:3.000 y
el anticuerpo 1A9 producido frente a la región del neoepítopo de
APP soluble generado después de la degradación por la
\beta-secretasa (Le Brocque, D. et al.,
Biochem. 37:14558-14565 (1998)) se utilizó a
una dilución de 1:3.000. El anticuerpo unido se detectó utilizando
un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa (Sigma) y con un
anticuerpo adicional anti-peroxidasa para las
membranas ensayadas con el anticuerpo 1A9 y anticuerpo WO2, junto
con el método de detección de quimioluminiscencia amplificada (ECL)
(Amersham).
En el caso de los fragmentos del extremo
C-terminal de APP, se mezclaron lisados celulares
(20 \mug) con un volumen igual de tampón de muestra Laemmli (0,5 M
Tris/HCl, pH 6,8, 10% (p/v) SDS, 0,1% azul de bromofenol, 20% (v/v)
glicerol y 5% \beta-mercaptoetanol) y se
sometieron a electroforesis utilizando geles de
10-20% Tris tricina SDS poliacrilamida
pre-cargados (Novex). Después de la electroforesis,
los geles se electrotransfirieron a nitrocelulosa 0,45 \mum a
0,38A durante 35 min utilizando el aparato de transferencia húmeda
(Novex), el tampón de transferencia consistió en 35 mM Tris HCl, 193
mM glicina, 0,01% SDS y 20% metanol (v/v). Después de la
transferencia, el blot se sometió a microondas en PBS hirviendo
durante 10 min. Después de la transferencia, en el caso de la
detección con Ab54 las membranas se bloquearon en 5% leche en
polvo, disolución salina tamponada con fosfato (PBS), 0,1%
Tween-20 durante 1 h a temperatura ambiente. Después
las membranas se incubaron con Ab54 (utilizado a una dilución de
1:25.000) en 2% albúmina de suero bovino, PBS, 0,1%
Tween-20 durante toda la noche a 4ºC. En el caso de
WO2, las membranas se bloquearon en 10% leche en polvo, PBS durante
1 hora a temperatura ambiente. Después, las membranas se incubaron
con WO2 a 1 \mug/ml en PBS toda la noche a 4ºC. El anticuerpo
unido se detectó utilizando un anticuerpo secundario conjugado con
peroxidasa (Sigma) junto con el método de detección de
quimioluminiscencia amplificada (ECL) (Amersham).
El hipocampo AD y control se tiñeron
inmunológicamente para Asp 2 con un antisuero policlonal purificado
de proteína A frente a una secuencia peptídica obtenida a partir de
Asp 2. Se vio una clara tinción neuronal, pero no se vio tinción
asociada con astrocitos, microglia u oligodendrocitos. Aunque
algunas neuronas parecía que estaban marcadas más intensamente que
otras, todas mostraron un patrón de tinción similar con la
inmunoreactividad localizada sólo en el citoplasma del pericarion y
dendritas. La tinción de dendritas raramente se extendía más de
10-15 \mum y no se observó marcaje axonal. Dentro
de los cuerpos celulares positivos, la tinción no era uniforme y
mostraba una granulación leve. La tinción intraneuronal también fue
evidente en el cortex frontal y temporal y en el cerebro de los
sujetos control.
Se vio que Asp 2 estaba presente en células
SH-SY5Y sin transfectar que expresaban de manera
estable la isoforma 695 de APP (SH-SY5Y
APP-695) y en células COS-7 que
expresaban la isoforma 751 de APP (COS-7
APP-751). El nivel de Asp se incrementó después de
la transfección transitoria con el vector pcDNA3.1 que portaba el
gen Asp 2. Después de la transfección transitoria con la proteína,
Asp 2 estaba presente como una banda principal de 65kDa. Después de
una exposición prolongada del blot ECL se evidenció una banda débil
a 60 kDa. Los experimentos de desglicosilación mostraron que estas
dos bandas eran formas glicosiladas de manera diferente de la
misma
proteína.
proteína.
El vector pcDNA3.1 que porta Asp 2 etiquetada con
el epítopo Myc se transfectó en células COS-7
APP-751. De manera consistente con otros trabajos
(Kuentzel, S.L., Ali, S.M., Altman, R.A., Greenberg, B.D y Raub,
T.J. J. Biochem. 295, 367-378 (1993),
Walter, J. et al., Mol. Med. 2,
673-691 (1996)), APP se localizaba claramente en la
región de Golgi/retículo endoplásmico como reveló la tinción
específica yuxtanuclear y una tinción reticular más general de la
célula. Asp 2 mostró esencialmente la misma distribución subcelular
y una co-localización clara con APP en células
COS-7 APP-751. De manera
interesante, la co-localización no es absoluta; APP
se detectó más fácilmente hacia la periferia celular que Asp 2.
Esto sugiere que estas dos proteínas pueden segregarse al
procesarse y transportarse en el interior celular. La distribución
de estas dos proteínas es bastante distinta de la distribución de
marcadores que definen el endosoma temprano y el retículo
endoplásmico.
Tanto los mutantes del sitio activo como Asp 2 se
expresaron en niveles similares en las células
SH-SY5Y APP-695. Se observó un
incrementó de sAPP\beta (110 kDa) en el medio de células
transfectadas con Asp 2 comparado con las células control
transfectadas con el vector vacío pcDNA3.1MycHis. No se observó
incrementó de sAPP\beta secretada de células transfectadas con
los mutantes Asp-Asn D93N o D289N. En contra de lo
observado con sAPP\beta, Asp 2 no tuvo efecto en la secreción de
APP\alpha soluble o de APP de longitud completa en la célula.
Los fragmentos del extremo
C-terminal de APP se detectaron en células
COS-7 que expresan de manera estable
APP-751 con y sin mutación Sueca. Se detectaron
bandas de 12 kDa y 10 kDa con Ab54 producido frente a la región
C-terminal de APP. El fragmento de 12 kDa fue
inmunoreactivo con el anticuerpo WO2 que es específico de los restos
5-9 de A\beta humana y es, por lo tanto, el
fragmento del extremo C-terminal producido por la
acción de la \beta-secretasa (CTF\beta). La
banda del fragmento de 10 kDa no fue inmunoreactiva con este
anticuerpo y, en base a esto y a su peso molecular es, por lo tanto,
CTF\alpha, el fragmento del extremo C-terminal
producido por la acción de la \alpha-secretasa. El
fragmento del extremo C-terminal producido por la
acción de la \gamma-secretasa no se detectó; esto
puede deberse a los bajos niveles de este fragmento o a su rápida
desaparición en la célula.
La transfección con Asp 2 resultó en una
acumulación del CTF de 12 kDa en células COS-7
APP-751 como se detectó con los anticuerpos Ab54 y
WO2. La transfección transitoria con Asp 2 también produjo una
acumulación de este CTF de 12 kDa obtenido por la acción de la
\beta-secretasa en células COS-7
que expresan APP-751 con la mutación Sueca.
No hubo un incremento de CTF\beta con los
mutantes del sitio activo D93N y D289N, confirmando, por lo tanto,
que la expresión de endocrepsina-2 codifica una
proteinasa funcional que requiere la presencia de los dos residuos
aspárticos catalíticos.
Un fragmento de ADNc que codifica Asp 2,
aminoácidos 1 a 460 (EP855444 pero con 130 Glu->Val), se
subclonó para crear una proteína de fusión con inmunoglobulina
humana, restos 99-330 de IgG1, y se clonó en un
vector de expresión de mamíferos pCDN (Aiyar et al). El
plásmido se linealizó mediante digestión con Not 1 (15 \mug ADN,
37ºC, toda la noche), se precipitó y se resuspendió en 50 \mul
tampón 1X TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,5). El ADN se sometió a
electroporación, utilizando un Bio-Rad Gene Pulser
(Laboratorios Bio-Rad) en una línea celular de
ovario de hamster chino (CHO E1A) (obtenida a partir de
DG-44 (Urlaub et al) adaptada para crecer
en suspensión en medio de mantenimiento) utilizando la técnica de
Hensley et al. Las células se plaquearon en placas de
cultivo de 96 pocillos a 5 x 10^{5} células/placa en medio de
mantenimiento durante 24 h antes de la selección. Las células se
seleccionaron en medio de mantenimiento sin nucleósidos (medio de
selección). El medio condicionado de colonias individuales se
ensayó utilizando un método de detección por
electroquimioluminiscencia en un analizador Origen (IGEN); la
tecnología está revisada en Yang et al 1994. Una colonia con
una expresión alta se aumento de escala en frascos de agitación de
250 ml que contienen 30 litros de medio de selección para generar
el medio condicionado para la purificación.
Aiyar, N., Baker, E., Wu, H-L,
E., Nambi, P., Edwards, R.M., Trill, J.J., Ellis, C., Bergsma, D.
Human AT1 receptor is a single copy gene: characterization in a
stable cell line. Molecular and Cellular Biochemistry 131:
75-86, 1994.
Urlaub, G., Kas, E., Carothers, A.M. y Chasin,
L.A. (1983) Cell 33, 405-412.
Hensley, P., McDevitt, P.J., Brooks, I., Trill,
J.J., Feild, J.A., McNulty, D.E., Connor, J.R., Griswold, D.E.,
Kumar, V., Kopple, K.D., Carr, S.A., Dalton, B.J., Johanson, K. The
soluble form of E-selectin is an asymmetric monomer:
Expression, purification and characterization of the recombinant
protein. J. Biol. Chem. 269: 23949-23958, 1994.
Yang, H., Leland, J.K., Yost, D., Massey, R.J.
Electrochemiluminescence: A new diagnostic and reasearch tool.
Biotechnology, 12: 193-194, 1994.
Asp 2 - Fc preparada como se indica más arriba se
capturó a partir de medio CHO E1a mediante cromatografía de
afinidad con Proteína A (resina ProSepA de BioProcessing Ltd). La
proteína de fusión se eluyó de la columna con 0,1 M
glicina-HCl, pH 3,0, se neutralizó con 1 M
Tris-HCl, pH 8,0, y se dializó frente a 25 mM HEPES
pH 7,4 que contiene 0,25 M NaCl. La secuenciación
N-terminal y el análisis mediante SDS PAGE en
presencia y ausencia de DTT mostraron que la proteína era un
heterodímero unido por puentes disulfuro de Asp2/Fc - Fc. La
secuenciación N-terminal mostró que toda la
secuencia señal se había procesado, consistiendo la proteína en
37,5% proforma (empezando en Thr22) y 62,5% forma madura (empezando
en Glu46).
Un péptido (X) basado en la secuencia de la
secuencia del sitio beta de APP de la variante Sueca se marcó
doblemente para utilizarse en el ensayo FRET.
Este péptido incluye los 11 restos que abarcan el
sitio de degradación beta de la variante Sueca
(Ile-Ser-Glu-Val-Asn-Leu*Asp-Ala-Glu-Phe-Arg)
con un grupo rodamina verde en el extremo
N-terminal y un grupo tetrametilrodamina en el
extremo C-terminal. Esto permite la evaluación de
la degradación de la secuencia peptídica por Asp 2 mediante
transferencia de energía entre los dos grupos fluorescentes.
En la práctica los ensayos se realizaron como
sigue:
El sustrato peptídico fluorescente (0,5 \muM)
se incubó con enzima Asp2-Fc, preparada como se ha
descrito más arriba, en un tampón que contiene 50 mM acetato sódico,
20 mM cloruro sódico, 5% glicerol, 0,1% CHAPS
(3-[(3-Cloroamidopropil)dimetilamonio]-1-propano-sulfonato),
pH 3,8). Los ensayos se iniciaron mediante la adición de la enzima
(25 nM concentración final) y la degradación se evaluó en una
lector de placas de fluorescencia con 485 nm excitación, 538 nm
emisión. El grupo TAMRA del extremo C-terminal del
péptido actuó como un apantallador eficaz, por lo que se observó un
incremento en la intensidad de la rodamina verde después de la
degradación.
Este ensayo se utilizó para determinar los
valores CI50 y K_{i} de los compuestos de interés. Se encontró
que diferentes compuestos de hidroxietileno eran inhibidores en este
ensayo, incluyendo:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
se determinaron valores K_{i} de
7,7 nM y 7,3 nM para (I) y (II),
respectivamente.
También se diseño un ensayo de competición para
identificar compuestos que actúan en el sitio activo de Asp 2. El
inhibidor hidroxietileno (I), se modificó mediante la adición de
5-, 6-rodamina verde a la amina libre del extremo
N-terminal del compuesto para crear un ligando
marcado (III).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El compuesto resultante se ensayó
experimentalmente como sigue para determinar la K_{d} con la
enzima Asp2-Fc, preparada como se indica más
arriba.
Se llevó a cabo un análisis en tres dimensiones
variando la enzima y el compuesto (III). El intervalo de la
concentración del ligando fue 1, 3, 10, 30 y 100 nM. El intervalo
de la concentración de la enzima fue de 100 nm disminuyendo en
diluciones seriadas de dos veces (11 diluciones + control sin
enzima). Se preparó el ligando con la concentración apropiada en 5%
DMSO. Las disoluciones de la enzima se prepararon en tampón de
ensayo concentrado 2 veces (x2) (en el que x1 = 50 mM acetato
sódico, 20 mM cloruro sódico, 5% glicerol, 0,1% CHAPS, pH 4,0). Se
mezclaron 5 \mul de disolución enzimática (de distintas
concentraciones) con 5 \mul de ligando (de diferentes
concentraciones) en una placa de microtitulación 384 de volumen
pequeño. Se dejó que las muestras se equilibraran durante 15 min
antes de leer la polarización de la fluorescencia en un lector de
placas LJL Acquest.
Los valores de Anisotropía se representaron y se
obtuvo la K_{d} para la interacción de unión fuerte. Se obtuvo un
valor de K_{d} de 1,22 nM para la interacción.
\newpage
El compuesto (IV) se ensayó en el mismo ensayo
para demostrar competición frente al compuesto (III):
La enzima (a una concentración fija de 25 nM), el
ligando (III) (a una concentración fija de 2,5 nM) y el compuesto
de ensayo (10 \muM disminuyendo en diluciones seriadas de dos
veces) se mezclaron en tampón de ensayo x1 (50 mM acetato sódico, 20
mM cloruro sódico, 5% glicerol, 0,1% CHAPS, pH 3,8) en un volumen
de ensayo final de 10 \mul y se dejó que se equilibraran durante
3 h. Después se leyó la polarización de la fluorescencia. El
experimento se llevó a cabo en duplicado.
En el ensayo, se observó claramente un
desplazamiento completo del ligando fluorescente (III) con las
concentraciones más altas del compuesto de ensayo. Se obtuvo una
K_{i} media de 67,5 nM.
Claims (10)
1. Un método para rastrear compuestos para
identificar aquellos compuestos que inhiben la degradación mediada
por Asp 2 de un sustrato polipeptídico, método que comprende:
proporcionar en un ensayo libre de células un sistema de reacción
que comprende Asp 2 recombinante purificada, opcionalmente como una
fusión Fc, y sustrato en un tampón de reacción adecuado; y
determinar la magnitud de la degradación del sustrato en presencia
del compuesto de ensayo comparada con la magnitud de la degradación
en ausencia del compuesto de ensayo, en el que el sustrato
peptídico contiene un par de grupos marcadores colocados a ambos
lados del sitio de degradación, de manera que la degradación del
sustrato resulta directamente en la modulación de una señal
fluorescente, un grupo marcador porta el generador de la señal y el
otro grupo marcador lleva a cabo la función de modulador, y en el
que los grupos marcadores son xantenos seleccionados de rodaminas,
rodoles y fluoresceínas, por lo que el espectro de absorción del
modulador (aceptor) sobrelapa el espectro de emisión del generador
(donante) de manera que se observan cambios en la transferencia de
energía después de la degradación del péptido.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que el par generador/modulador se selecciona de
rodamina/rodamina y fluoresceína/rodamina.
3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2,
en el que el par generador/modulador es rodamina
verde/tetrame-
tilrodamina.
tilrodamina.
4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3,
en el que el sustrato es de fórmula (X):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
5. Un método de acuerdo con la reivindicación 2,
en el que el par generador/modulador es 5-(y/o
6)-carboxifluoresceína y 5-(y/o
6)-tetrametilrodamina (TAMRA).
6. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que el sustrato es un péptido que abarca el sitio de
degradación de la beta-secretasa de la secuencia de
la variante Sueca de APP (de P6 a P5').
7. Un método de acuerdo con la reivindicación 2,
en el que el sustrato es:
Ile-Ser-Glu-Val-Asn-Leu-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg
8. Un método para rastrear compuestos para
identificar aquellos compuestos que inhiben la degradación mediada
por Asp 2 de un sustrato polipeptídico o proteico, método que
comprende: proporcionar un sistema de reacción que comprende Asp 2 y
ligando del sitio activo marcado; y determinar la magnitud de la
unión del ligando marcado en presencia del compuesto de ensayo
comparada con la magnitud de la unión del ligando marcado en
ausencia del compuesto de ensayo con el fin de determinar la
afinidad de la unión, en el que el método de ensayo para el ligando
está basado en difusión traslacional o rotacional.
\newpage
9. Un método de acuerdo con la reivindicación 8,
en el que el método de ensayo está basado en polarización de la
fluorescencia (FP).
10. Un método de acuerdo con la reivindicación 9,
en el que el ligando marcado es un compuesto de fórmula (III):
\vskip1.000000\baselineskip
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GB9924957 | 1999-10-21 | ||
GBGB9924957.5A GB9924957D0 (en) | 1999-10-21 | 1999-10-21 | Novel treatment |
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