ES2240183T3 - Metodo de rastreo para identificar inhibidores de asp2. - Google Patents

Metodo de rastreo para identificar inhibidores de asp2.

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ES2240183T3
ES2240183T3 ES00969693T ES00969693T ES2240183T3 ES 2240183 T3 ES2240183 T3 ES 2240183T3 ES 00969693 T ES00969693 T ES 00969693T ES 00969693 T ES00969693 T ES 00969693T ES 2240183 T3 ES2240183 T3 ES 2240183T3
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Abstract

Un método para rastrear compuestos para identificar aquellos compuestos que inhiben la degradación mediada por Asp 2 de un sustrato polipeptídico, método que comprende: proporcionar en un ensayo libre de células un sistema de reacción que comprende Asp 2 recombinante purificada, opcionalmente como una fusión Fc, y sustrato en un tampón de reacción adecuado; y determinar la magnitud de la degradación del sustrato en presencia del compuesto de ensayo comparada con la magnitud de la degradación en ausencia del compuesto de ensayo, en el que el sustrato peptídico contiene un par de grupos marcadores colocados a ambos lados del sitio de degradación, de manera que la degradación del sustrato resulta directamente en la modulación de una señal fluorescente, un grupo marcador porta el generador de la señal y el otro grupo marcador lleva a cabo la función de modulador, y en el que los grupos marcadores son xantenos seleccionados de rodaminas, rodoles y fluoresceínas, por lo que el espectro de absorción del modulador (aceptor) sobrelapa el espectro de emisión del generador (donante) de manera que se observan cambios en la transferencia de energía después de la degradación del péptido.

Description

Método de rastreo para identificar inhibidores de Asp2.
La presente invención se refiere a un ensayo utilizado para identificar compuestos que son potencialmente útiles en terapia. La presente invención también se refiere a la utilización de moduladores de la degradación polipeptídica en terapia.
Las enfermedades relacionadas con la proteína \beta amiloide (A\beta) son una clase heterogénea de trastornos caracterizada por la deposición en el cerebro de depósitos insolubles de la proteína A\beta (Roberts G W, Leigh P N y Weinberger D. Neuropsychiatric Disorders. Gower Medical press. Londres 1993). La consecuencia final de un número sustancial de depósitos de A\beta es la aparición de un síndrome clínico de disminución cognitiva y demencia incrementada. Se ha visto que dichos depósitos están presentes en varios síndromes de demencia y que éstos incluyen enfermedad de Alzheimer, enfermedad de cuerpos de Lewy corticales, enfermedad de Parkinson y la enfermedad semejante a Alzheimer en pacientes con síndrome de Down. Además los depósitos A\beta están presentes en los cerebros de pacientes con enfermedad vascular y cerebrovascular (Adams J H y Dunchen L W (eds) Greenfields Neuropathology 5ª Ed. Edward Arnold, Londres 1992) y estas últimas condiciones pueden predisponer o contribuir a las enfermedades anteriores.
La enfermedad de Alzheimer (AD) es una enfermedad degenerativa progresiva del sistema nervioso central caracterizada clínicamente por demencia y neuropatológicamente por la presencia de numerosas placas seniles y ovillos neurofibrilares. Típicamente, AD es una enfermedad de aparición tardía de las personas mayores. Sin embargo, se ha descrito un pequeño número de linajes en los que se hereda una forma temprana de la enfermedad como un dominante autosómico con penetrabilidad dependiente de la edad. Más comúnmente, la edad de la aparición de la enfermedad es por debajo de 60 años. Tanto en la aparición temprana como tardía de AD se han implicado factores genéticos.
La producción y deposición de la proteína \beta amiloide con los restos 39-43 (A\beta, Gienner, G.G. y Wong, C.W. Biochem. Biophys. Res. Commun. 120, 885-890 (1984)) en el cerebro es una característica neuropatológica que no varía de AD. A\beta se produce por excisión de la glicoproteína integral de membrana tipo 1, Proteína Precursora Amiloide (APP), mediante las acciones secuenciales de en primer lugar \beta-secretasas y después \gamma-secretasas (Selkoe, D.J. Annu. Rev. Cell. Biol. 10, 373-403 (1994)).
APP puede degradarse en las células por las \alpha o \beta secretasas, lo que resulta en la liberación de fragmentos solubles del extremo N-terminal de la proteína (sAPP\alpha y sAPP\beta). Los fragmentos del extremo C-terminal unidos a la membrana resultantes (CTF\alpha y CTF\beta) son sustratos de la \gamma-secretasa; dando lugar la degradación de CTF\alpha al péptido p3 de 3kDa y la de CTF\beta al péptido A\beta. Se ha visto que el evento de degradación de la \beta-secretasa se produce en diferentes orgánulos intracelulares, incluyendo el retículo endoplásmico rugoso y la red trans-Golgi (Hartmann. et al., Nature Medicine. 3, 1016-1020 (1997), Cook, D.G. et al., Nature Medicine. 3, 1021-1023 (1997), Wild-Bode, C. et al., J. Biol. Chem. 272, 16085-16088 (1997)). A\beta se genera a una velocidad baja intracelularmente antes de su secreción y se ha publicado que un depósito intraneuronal de A\beta se acumula con el tiempo en las células en cultivo (Skovronsky, D.M., Doms, R.W. y Lee, V.M.-Y. J. Biol. Chem. 141, 1031-1039 (1998)).
Las secretasas implicadas en el procesamiento de APP no se han identificado, sin embargo, estudios con inhibidores han sugerido que la \alpha-secretasa es una metaloproteinasa (Parvathy, S., Hussain, I., Karran, E.H., Turner, A.J. y Hooper, N.M. Biochemistry 37, 1680-1685 (1998)). Se han propuesto y descartado diferentes \beta-secretasas candidatas tales como la proteasoma (Ishiura, S., Tsukahara, T., Tabira, T. y Sugita, H. FEBS Lett. 257, 388-392 (1989)), la metaloproteinasa thimet (McDermott, J.R., Biggins, J.A. y Gibson, A.M. Biochem. Biophys. Res. Commun. 185, 746-752 (1992)), diferentes proteinasas de serina semejantes a la quimiotripsina (Nelson, R.B., Siman, R., Iqbal, M.A. y Potter, H. J. Neurochem. 61, 567-577 (1993), Sahasrabudhe, S.R. et al., J. Biol. Chem. 268, 16699-16705 (1993), Savage, M.J. et al., Neuroscience 60, 607-619 (1994)), las metaloproteinasas MP78 (Thompson, A., Grueninger-Leitch, F., Huber, G. y Malherde P. Brain Res. 48, 206-214 (1997)) y MP100 (Huber, G. et al., J. Neurochem. 72, 1215-1223 (1999) y catepsina D (Ladror, U.S., Snyder, S.W., Wang, G.T., Holzman, T.F. y Krafft, G.A. J. Biol. Chem. 269, 18422-18428 (1994)). Recientemente, se ha publicado que presenilina-1 es bien un único cofactor diaspartilo para la \gamma-secretasa o es la \gamma-secretasa (Wolfe, M.S. et al., Nature 398, 513-517 (1999)). La Patente Internacional WO96/40085 propone una \beta-secretasa candidata aislada a partir de tejido cerebral humano y células humanas 293 que tiene un peso molecular aparente en el intervalo de 260 kDa a 300 kDa cuando se determina mediante cromatografía de exclusión en gel.
Asp 2 (también conocida como endocrepsina 2) es una aspartil proteinasa transmembrana que presenta unos niveles de expresión altos en cerebro y páncreas (Patente Europea EP 0855444). Posteriormente, se ha visto que el resto de la posición 130 es Valina, y no ácido Glutámico como se había descrito previamente en la Patente Europea EP0855444 (Hussain, I. et al., Molec. Cell. Neurosci. 14, 419-427, 1999). La proteinasa tiene un peso molecular de 60-65 kDa cuando se determina mediante electroforesis en gel después de una transfección transitoria en células. La forma madura de Asp 2 empieza en el resto Glu 46 (Sinha, S. et al., Nature 402, 537-540, 1999). También se ha encontrado una variante de corte y empalme (Patente Internacional WO00/17369).
Ghosh et al., J. Amer. Chem. Soc. 2000 122, 3522-3523 describen inhibidores de la memapsina 2 (Asp 2) incluyendo OM99-2 (Glu-Val-Asn-Leu*Ala-Ala-Glu-Phe en el que * designa el isóstero del estado de transición de hidroxietileno.
La presente invención se basa en el descubrimiento de que Asp 2 puede funcionar en la ruta de degradación de APP de la \beta-secretasa. La proteinasa tiene muchas de las características esperadas de la \beta-secretasa, en el sentido de que está presente en el cerebro, incluyendo el cerebro AD, y que también se encuentra en líneas celulares que se sabe que producen A\beta y se co-localiza con APP en Golgi/retículo endoplásmico de células que expresan de manera estable la isoforma de APP de 751 aminoácidos. De manera adicional, se ha visto que Asp 2 es una proteína integral de membrana tipo I con el dominio catalítico en el interior de orgánulos membranosos. La transfección de Asp 2 en células que expresan APP resulta en un incremento de la actividad \beta-secretasa en las células, de manera que se secreta más sAPP\beta en el medio y existe una acumulación del fragmento del extremo C-terminal derivado de la acción de la \beta-secretasa. La mutación de cualquiera de los restos aspartilo catalíticos propuestos de Asp 2 elimina la producción de estos fragmentos que son característicos de la degradación de APP por la \beta-secretasa. Estos descubrimientos sugieren que la inhibición de la actividad proteolítica de Asp 2 tiene un valor potencial como una terapia para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la proteína \beta amiloide incluyendo la Enfermedad de Alzheimer.
Por lo tanto, la presente invención proporciona un método para rastrear compuestos con el fin de identificar aquellos compuestos que inhiben la degradación mediada por Asp 2 de un sustrato polipeptídico o proteico, método que comprende: proporcionar un sistema de reacción que comprende Asp 2 y sustrato; y determinar la magnitud de la degradación del sustrato en presencia del compuesto de ensayo comparada con la magnitud de la degradación en ausencia del compuesto de ensayo. La invención también se refiere a compuestos identificados de esta manera y a su utilización en terapia incluyendo el tratamiento o profilaxis de enfermedades relacionadas con la proteína \beta amiloide incluyendo AD.
El sustrato es una proteína o péptido que puede ser hidrolizado por la enzima Asp 2. Éste puede ser un sustrato proteico no específico, por ejemplo, caseína, hemoglobina, cadena B de la insulina, citocromo C, etc. También puede ser la proteína amiloide precursora recombinante de longitud completa o truncada. Los sustratos también pueden ser péptidos, que habitualmente son fragmentos sintéticos de proteínas mayores. Por ejemplo, un péptido que abarca el sitio de degradación de APP de la \beta-secretasa puede servir como un sustrato conveniente, incluyendo este péptido posiblemente la secuencia del sitio beta del tipo salvaje (de P6 a P5', terminología como describe Berger, A. y Schecter, I. Philos. Trans. R. Soc. Lond. [Biol.] 257, 249-264 (1970)).
Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg (SEQ ID NO.1)
o la secuencia de la variante Sueca (de P6 a P5')
Ile-Ser-Glu-Val-Asn-Leu-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg (SEQ ID NO.2)
También pueden utilizarse péptidos más pequeños o más largos del tipo salvaje o de las secuencias de la variante Sueca, y otras variantes basadas en estas secuencias.
Las proteínas más grandes modificadas para codificar secuencias de sustrato de Asp 2 también pueden servir como sustratos útiles para el rastreo. Por ejemplo, la proteína de unión a maltosa (MBP) puede modificarse para codificar las secuencias del sitio beta del tipo salvaje o de la variante Sueca en su extremo C-terminal para generar
Proteína de Unión a Maltosa-Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg (sitio beta del tipo salvaje) (SEQ ID NO.3)
o
Proteína de Unión a Maltosa-Ile-Ser-Glu-Val-Asn-Leu-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg (sitio beta de la Variante Sueca) (SEQ ID NO.4)
Éstos pueden modificarse adicionalmente para codificar una etiqueta Q en el extremo C-terminal (Leu-Ser-Leu-Ser-Gln-Ser-Lys-Val-Leu-Pro-Gly-Pro (SEQ ID NO.5) para generar
Proteína de Unión a Maltosa-Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-Leu- Ser-Leu-Ser-Gln-Ser-Lys-Val-Leu-Pro-Gly-Pro (sitio beta del tipo salvaje) (SEQ ID NO.6)
Proteína de Unión a Maltosa-Ile-Ser-Glu-Val-Asn-Leu-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-Leu- Ser-Leu-Ser-Gln-Ser-Lys-Val-Leu-Pro-Gly-Pro (sitio beta de la Variante Sueca) (SEQ ID NO.7)
Estas proteínas pueden marcarse con fluorescencia a través de la etiqueta Q para generar sustratos adecuados para utilizarse en diferentes formatos fluorescentes.
El ensayo puede llevarse a cabo en un sistema de reacción libre de células o basado en células utilizando formatos de ensayo convencionales tales como los descritos en la Patente Internacional WO96/40885.
La enzima Asp 2 utilizada en la presente invención incluye isoformas que incluyen variantes de corte y empalme.
Un ensayo basado en células comprenderá una célula anfitriona cotransfectada con vectores de expresión que contienen ADN que codifica Asp 2 y el sustrato.
La presencia de los productos de degradación puede detectarse ensayando el contenido en proteína de la célula anfitriona utilizando anticuerpos policlonales o monoclonales frente a los fragmentos del sustrato. Puede utilizarse cualquier configuración adecuada de inmunoensayo, por ejemplo, ensayo de transferencia Western o un ELISA.
Un ensayo libre de células comprenderá Asp 2 recombinante purificada, opcionalmente como una fusión Fc, y sustrato en un tampón de reacción adecuado. Preferiblemente, la enzima está de manera predominante en la forma madura.
La enzima puede presentarse como una fusión Fc con el fin de facilitar la purificación utilizando cromatografía de afinidad con proteína A. De manera adecuada, la región Fc se obtiene a partir de IgG humana.
En un ensayo libre de células, los productos de la degradación pueden detectarse mediante inmunoensayo como se ha descrito más arriba. De manera alternativa, el sustrato peptídico puede contener un par de grupos marcadores, que se colocan a ambos lados del sitio de degradación. La degradación separa los marcadores y este cambio puede detectarse utilizando técnicas que reflejan la co-localización de estos marcadores. La detección puede depender de una interacción óptica entre los dos marcadores o, de manera más general, la generación de la señal puede depender de su co-localización en el sustrato. La técnicas basadas en interacciones ópticas incluyen transferencia de energía fluorescente (FQ), como describe la teoría de Forster, y transferencia de energía luminiscente (Selvin y Hearst, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 10024). Los ensayos basados en difusión traslacional o rotacional incluyen espectroscopía de correlación de fluorescencia (FCS) (Eigen y Rigler, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 5740) y polarización de la fluorescencia (FP) (Levine et al., Anal. Biochem., 1997, 247, 83). Los ensayos basados en radiactividad incluyen ensayos de centelleo por proximidad y técnicas de filtración en nitrocelulosa. Las técnicas de adsorción a superficie incluyen inmunoensayos con detección de absorbancia, fluorescencia, quimioluminiscencia o fluorescencia en tiempo resuelto (TRF) (Wallac OY, Finlandia).
Por lo tanto, la degradación del sustrato resulta directamente o indirectamente en la modulación de una señal, por ejemplo, una señal radiactiva, luminiscente o fluorescente.
Un grupo marcador porta el generador de la señal o es capaz de unirse a un sistema informador diferente. El sistema informador puede portar el generador de la señal o puede unirse a un resto señalizador adicional. El otro grupo marcador lleva a cabo la función de modulador o es capaz de unirse a una molécula de manera que el complejo de unión lleva a cabo por sí mismo la función de modulador.
Los ejemplos de grupos generadores de la señal incluyen marcadores radiactivos, luminiscentes (emisión de estado de triplete) y fluorescentes (emisión de estado singlete).
Los ejemplos de grupos marcadores capaces de unirse a un sistema informador diferente incluyen ligandos de anticuerpos, enzimas y receptores. El sistema informador de anticuerpo, enzima o receptor está marcado o es capaz de participar en un inmunoensayo. Un ejemplo adecuado de un ligando de este tipo es dinitrofenol que puede capturarse con anticuerpo anti-dinitrofenol seguido de un inmunoensayo adecuado.
Los ejemplos de grupos moduladores incluyen restos que modulan las propiedades ópticas de los marcadores fluorescentes o luminiscentes o del sustrato como un todo cuando dicho marcador y resto están unidos de manera covalente o no covalente al sustrato. Después de la degradación proteolítica del sustrato, las propiedades ópticas del marcador, o de la entidad molecular como un todo, están moduladas de manera que la actividad proteolítica puede evaluarse espectroscópicamente.
Los ejemplos de grupos capaces de llevar a cabo la función de modulador o de unión a una molécula para formar un complejo modulador incluyen ligandos de proteínas, tales como ligandos de biotina capaces de unirse a estreptavidina o avidina, o haptenos de anticuerpos bien en disolución o inmovilizados. Los ligandos de biotina incluyen biotinas derivatizadas opcionalmente con grupos espaciadores adecuados como aminohexanoilo.
Los ejemplos de grupos generadores de la señal y otros grupos moduladores que modulan las propiedades ópticas de un generador de señal fluorescente incluyen fluoróforos (familias de moléculas que presentan intervalos espectrales de absorción y fluorescencia), tales como cumarinas, xantenos (incluyendo rodaminas, rodoles y fluoresceínas), derivados de fluorescamina, naftalenos, pirenos, quinolinas, resorufinas, difluoroboradiazaindacenos, acridinas, piridiloxazoles, isoindoles, dansilos, dabcilos, dabsilos, benzofuranilos, ftalimidas, naftalimidas, e hidrazidas ftálicas (incluyendo luminol e isoluminol).
Los ejemplos de pares marcador/modulador adecuados incluyen sistemas donante/aceptor de transferencia de energía fluorescente o de fluorescencia apantallada (FQ) convencionales tales como rodamina/rodamina, en particular rodamina verde/tetrametilrodamina, fluoresceínas/rodaminas, fluoresceínas/cumarinas, 5-dimetilamino-1-naftalensulfonilo (DANSILO)/ácido 4-(4'-dimetilaminofenilazo)benzoico (DABCILO) o ácido 5-(2-aminoetil)aminonaftalen-1-sulfónico (EDANS)/DABCILO donde el espectro de absorción del aceptor se sobrelapa con el espectro de emisión del donante de manera que los cambios en la transferencia de energía se observan después de la degradación del péptido de acuerdo con la teoría de Forster (1948).
Para la detección utilizando FQ, el par de grupos marcadores se elige preferiblemente de aminoácidos que presentan las combinaciones EDANS/DABCILO y fluoresceínas/rodaminas. Más preferiblemente, el par es 5-(y/o 6)-carboxifluoresceína con 5-(y/o 6)-tetrametilrodamina (TAMRA).
Otros ejemplos de marcadores incluyen iones lantánido (típicamente terbio y europio) como donantes luminiscentes para transferencia de energía de resonancia de lantánidos a aceptores fluorescentes o cromofóricos (por ejemplo, ejemplificado por tecnología de fluorescencia en tiempo resuelto homogénea (HTRF) o tecnología de excitación de quelatos de lantánidos (LANCE)). El apantallamiento acoplado a spin de un donante lantánido también es posible con un aceptor radical nitróxido, típicamente un radical piperidiniloxi o pirrolidiniloxi (Véase M.V. Rogers (1997) DDT 2(4) 156).
Cuando el grupo modulador es un resto que modula las propiedades ópticas del sustrato como un todo después de la degradación proteolítica del sustrato, los ejemplos de pares marcador/modulador adecuados incluyen un marcador fluorescente y un ligando de una proteína, como un ligando de biotina capaz de unir estreptavidina o avidina. Los cambios en la difusión rotacional del péptido que resultan de la degradación pueden evaluarse observando los cambios en la polarización de la fluorescencia (FP). De manera alternativa, puede utilizarse espectroscopía de correlación de fluorescencia (FCS) para evaluar cambios en la difusión traslacional.
Por lo tanto, para la detección utilizando FP o FCS, los grupos marcadores se eligen de aminoácidos que portan un fluoróforo, como se ha definido más arriba, combinados con un aminoácido que porta un ligando de proteínas como derivados de biotina, o haptenos tales como difluoroboradiazaindacenos, dansilos, dinitrofenoles, fluoresceínas, rodaminas y naftalimidas. El par del grupo marcador es preferiblemente una combinación fluoróforo/ligando de biotina. Más preferiblemente, el par es 5-(y/o 6)-carboxifluoresceína con biotina ligada a aminohexanoato (biotina-X).
En un aspecto preferido el par del grupo marcador proporciona un ensayo de fluorescencia apantallada (FQ), de polarización de la fluorescencia (FP) o de espectroscopía de correlación de fluorescencia (FCS).
Los grupos marcadores son preferiblemente fluoróforos y derivados de ligandos de proteínas de aminoácidos con cadenas laterales que se pueden modificar químicamente de una manera fácil tales como lisina, ornitina, cisteína, homocisteína, serina, homoserina y tirosina.
En un aspecto preferido los grupos marcadores son o comprenden grupos de lisina modificados de la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
1
en la que R^{1} se selecciona de grupos marcadores adecuados que están unidos directa o indirectamente a través de un resto espaciador, a la lisina, de manera que los grupos marcadores unidos forman un par de grupos marcadores como se ha descrito más arriba.
Los sustratos pueden prepararse mediante cualquier método convencional apropiado de síntesis de péptidos. Esto incluye estrategias basadas en, por ejemplo, las versiones Fmoc y Boc de la síntesis en fase sólida e incluye variaciones de secuencias y de fragmentos, o combinaciones de éstos, para el ensamblaje de la cadena. También se incluyen los diferentes métodos para la síntesis química de péptidos mediante el método de disolución, que utiliza de nuevo ensamblajes de secuencias o fragmentos, o combinaciones de éstos. También pueden considerarse otros métodos sintéticos, tales como los basados en acoplamiento enzimático, etc. Los expertos en la técnica se darán cuenta que para la síntesis de péptidos existen muchas variaciones posibles, por ejemplo, comenzar con diferentes grupos protectores, resinas y espaciadores, reactivos de acoplamiento, disolventes, reactivos de desbloqueo, etc. Los ejemplos de dichos procesos pueden encontrarse en libros de texto, incluyendo, por ejemplo, "Solid Phase Synthesis por J M Stewart y J D Young", San Francisco, Freeman, 1969; "The Chemical Synthesis of Peptides", J Jones, Clarendon Press, Oxford, 1991; "Principles of Peptide Synthesis", M Bodanszky, Springer-Verlag, NY, NY, 1984; "Solid Phase Peptide Synthesis", E Atherton y RC Sheppard, IRL Press, Oxford University Press, Oxford, 1989. En la conocida serie de Proceedings de congresos recientes se presentan unos métodos más modernos, incluyendo, "Innovations and Perspectives in Solid Phase Synthesis", Ed R Epton, y las conferencias organizadas por las Sociedades de Péptidos Europea y Americana y publicadas bajo el título, "Peptides".
La introducción de los grupos marcadores se consigue mediante métodos convencionales, por ejemplo, mediante la adición bajo condiciones básicas, de un éster activado (por ejemplo, succinimidil), un anhídrido mixto (por ejemplo etoxicarbonil), un cloruro de ácido, una maleimida, un isocianuro o un derivado isotiocianuro del grupo marcador al sustrato base (unido a resina o en disolución) en el que un único resto de lisina, ornitina, serina u homoserina porta en la cadena lateral una amina primaria o hidroxilo desprotegido. De manera alternativa, el sustrato base (unido a resina o en disolución) en el que un único resto de cisteína u homocisteína permanece desprotegido se hace reaccionar con un haluro de alquilo primario o con un derivado maleimida del grupo marcador/informador bajo condiciones básicas.
Generalmente, se conocerá la velocidad de degradación en ausencia del compuesto de ensayo, así como la magnitud de la degradación en puntos de tiempo determinados. El ensayo puede evaluar la inhibición de la degradación en puntos de tiempo específicos o la velocidad de la degradación.
La degradación del sustrato puede llevarse a cabo en disolución o utilizando un soporte sólido.
El compuesto de ensayo puede preincubarse con la proteasa antes de la adición del sustrato o, de manera alternativa, el sustrato puede añadirse directamente. Las concentraciones finales de la proteasa y del sustrato se calculan de manera que se consiga una velocidad de procesamiento adecuada para llevarse a cabo el ensayo. La reacción puede detenerse, por ejemplo, mediante la adición de metanol o ácido trifluoroacético, y los productos se analizan utilizando cualquier sistema convencional.
Por ejemplo, puede utilizarse HPLC de fase reversa con detección UV (véanse, por ejemplo, Kuo, D, et al., Biochemistry, 8347 (1994) y Allsop et al., Bioorganic and Med. Chem. Lett., 443 (1995)). La actividad de los compuestos de ensayo puede expresarse como el % de reducción de la actividad enzimática a concentraciones determinadas. En el ensayo de HPLC esto se calcula como la reducción del área del producto comparado con el control. Cuando el sustrato contiene un par marcador, puede utilizarse, de manera alternativa, metanol o una proteína de unión exógena para detener la reacción y los productos se analizan utilizando cualquier sistema convencional apropiado para los grupos marcadores utilizados.
Los métodos radiactivos incluyen la utilización de un par biotina/marcador radiactivo. El sustrato es capturado en las placas flash recubiertas con estreptavidina, lechos de ensayo de centelleo por proximidad recubiertas con estreptavidina o mediante técnicas de filtración convencionales (por ejemplo, nitrocelulosa). La detección del marcador puede llevarse a cabo mediante contaje de centelleo.
Los métodos de detección de péptidos basados en anticuerpos incluyen la utilización de un par ligando/ligando, por ejemplo, marcador biotina/dinitrofenol. Después de la captura mediante un ligando, por ejemplo en placas recubiertas con estreptavidina, la detección del sustrato inmovilizado se lleva a cabo utilizando anticuerpos frente al otro ligando, por ejemplo, anticuerpos anti-DNP seguido de un inmunoensayo como un inmunoensayo ligado a enzima (ELISA), fluorescencia en tiempo resuelto por incremento de la disociación (tecnología DELFIA, Wallac OY), detección inmunosorbente de luminiscencia, quimioluminiscencia o fluorescencia.
Los métodos ópticos que evalúan cambios en la transferencia de energía pueden llevarse a cabo macroscópicamente mediante la intensidad de fluorescencia total utilizando un fluorímetro o mediante el procesamiento de la señal de las emisiones de fotones de moléculas fluorescentes individuales mediante espectroscopía de correlación de fluorescencia (FCS) utilizando algoritmos desarrollados, por ejemplo, por Evotec Biosystems GmbH. Se pueden aplicar algoritmos similares para la determinación de velocidades de proteolisis utilizando FCS mediante cambios en el brillo molecular y en el número de partículas de los sustratos peptídicos marcados doblemente y/o indirectamente.
Cuando el grupo modulador es un resto que modula las propiedades ópticas del sustrato como un todo después de la degradación proteolítica del sustrato, los cambios en la polarización de la fluorescencia (FP) como resultado de la degradación de, por ejemplo, un péptido marcado doblemente biotinilado y fluorescente, sin o más preferiblemente con la adición de, por ejemplo, estreptavidina o avidina, pueden utilizarse para evaluar la actividad de la proteasa. Los cambios en el tiempo de difusión de este sustrato peptídico marcado con fluorescencia como resultado de la proteolisis, sin o con la adición de estreptavidina o avidina, también pueden evaluarse mediante FCS traslacional. La polarización de la fluorescencia puede determinarse, por ejemplo, en un lector de placas de polarización de la fluorescencia.
Los inhibidores que se pueden identificar con el método de la invención son ligandos del sitio activo que pueden marcarse para crear reactivos para utilizarse en ensayos de unión competitiva.
Por lo tanto, la presente invención también proporciona un método para rastrear compuestos con el fin de identificar aquellos compuestos que inhiben la degradación mediada por Asp 2 de un sustrato polipeptídico o proteico, método que comprende: proporcionar un sistema de reacción que comprende Asp 2 y el ligando del sitio activo marcado; y determinar la magnitud de la unión del ligando marcado en presencia de un compuesto de ensayo comparada con la magnitud de unión del ligando marcado en ausencia del compuesto de ensayo con el fin de determinar la afinidad de la unión.
La invención también se refiere a compuestos identificados mediante ésta y a su utilización en terapia incluyendo el tratamiento o profilaxis de enfermedades relacionadas con la proteína \beta amiloide incluyendo AD.
Los métodos de ensayo para el ligando son convencionales e incluyen los basados en difusión traslacional o rotacional como se ha descrito más arriba para los ensayos de degradación. En un aspecto preferido el método de rastreo se basa en polarización de la fluorescencia (FP). Un marcador preferido es un fluoróforo como se especifica más arriba, preferiblemente rodamina verde.
El ensayo puede llevarse a cabo en un sistema de reacción libre de células o basado en células utilizando formatos de ensayo convencionales tales como los descritos más arriba para el ensayo de degradación.
Las células anfitrionas se han sometido a ingeniería genética (transducidas o transformadas o transfectadas) con vectores que pueden ser, por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión. El vector puede estar, por ejemplo, en la forma de un plásmido, cósmido, fago, etc. Las células anfitrionas sometidas a ingeniería pueden cultivarse en medios nutritivos convencionales modificados, según resulte apropiado, para activar promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y semejantes, son las utilizadas previamente con la célula anfitriona seleccionada para la expresión, y serán aparentes para los expertos en la técnica.
Los vectores de expresión adecuados incluyen secuencias de ADN cromosómicas, no cromosómicas y sintéticas, por ejemplo, derivados de SV40; plásmidos bacterianos; ADN de fagos; baculovirus; plásmidos de levaduras; vectores obtenidos a partir de combinaciones de plásmidos y ADN de fagos, ADN vírico como vaccinia, adenovirus, virus de viruela aviar, y pseudorabia. Sin embargo, puede utilizarse cualquier otro vector siempre que se pueda replicar y sea viable en el anfitrión.
La secuencia de ADN apropiada puede insertarse en el vector mediante diferentes procedimientos. En general, la secuencia de ADN se inserta en un sitio de restricción de endonucleasa apropiado mediante procedimientos conocidos en la técnica. Dichos procedimientos y otros están en el alcance de los expertos en la técnica.
La secuencia de ADN en el vector de expresión se une de manera operativa a una secuencia de control de la expresión apropiada (promotor) para dirigir la síntesis de ARNm. Como ejemplos representativos de dichos promotores, pueden mencionarse: promotor LTR o SV40, lac o trp de E. coli, el promotor P_{L} del fago lambda y otros promotores conocidos para controlar la expresión de genes en células procariotas o eucariotas o sus virus. El vector de expresión también contiene un sitio de unión a ribosomas para la iniciación de la traslación y un terminador de la transcripción. El vector también puede incluir secuencias apropiadas para amplificar la expresión.
Además, los vectores de expresión contienen, preferiblemente, uno o más genes marcadores que se pueden seleccionar para proporcionar una marca fenotípica para la selección de las células anfitrionas transformadas como dihidrofolato reductasa o resistencia a neomicina en el caso de un cultivo celular eucariota, o como resistencia a tetraciclina o ampicilina en E. coli.
El gen puede situarse bajo el control de un promotor, sitio de unión a ribosomas (para la expresión bacteriana) y, opcionalmente, un operador (referidos de manera colectiva en la presente memoria como elementos de "control"), de manera que la secuencia de ADN que codifica la proteína deseada se transcribe en ARN en la célula anfitriona transformada con un vector que contiene esta construcción de expresión. La secuencia codificadora puede contener o no un péptido señal o una secuencia líder. Las secuencias de proteínas de la presente invención pueden expresarse utilizando, por ejemplo, el promotor tac de E. coli o el promotor del gen de la proteína A (spa) y una secuencia señal. Las secuencias líder pueden eliminarse en el anfitrión bacteriano mediante procesamiento postraslacional. Las regiones promotoras pueden seleccionarse de cualquier gen deseado utilizando vectores CAT (cloroanfenicol transferasa) u otros vectores con marcadores que se pueden seleccionar. Dos vectores apropiados son PKK232-8 y PCM7. Los promotores bacterianos particulares incluyen lacI, lacZ, T3, T7, gpt, P_{R}, P_{L} de lambda y trp. Los promotores eucariotas incluyen inmediato temprano de CMV, timidina quinasa de HSV, SV40 temprano y tardío, LTR de retrovirus, y metalotioneína-I de ratón. La selección del vector y promotor adecuados se encuentra dentro de la capacidad del experto en la técnica.
Además de las secuencias control, puede ser deseable añadir secuencias reguladoras que permitan la regulación de la expresión de las secuencias de proteína relacionadas con el crecimiento de la célula anfitriona. Las secuencias reguladoras son conocidas para los expertos en la técnica, y los ejemplos incluyen aquellas que producen la activación o inactivación de la expresión de un gen en respuesta a un estímulo químico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. Otros tipos de elementos reguladores también pueden estar presentes en el vector, por ejemplo, secuencias amplificadoras.
Un vector de expresión se construye de manera que la secuencia codificadora particular está localizada en el vector con las secuencias reguladoras apropiadas, siendo la posición y orientación de la secuencia codificadora respecto a las secuencias de control tal que la secuencia codificadora se transcribe bajo el "control" de las secuencias de control (es decir, la ARN polimerasa que se une a la molécula de ADN en las secuencias de control transcribe la secuencia codificadora). La modificación de las secuencias codificadoras puede ser deseable para lograr este propósito. Por ejemplo, en algunos casos puede ser necesario modificar la secuencia de manera que pueda estar unida a las secuencias de control con la orientación apropiada; es decir, para mantener el marco de lectura. Las secuencias de control y otras secuencias reguladoras pueden ligarse a la secuencia codificadora antes de su inserción en un vector, como los vectores de clonación descritos más arriba. De manera alternativa, la secuencia codificadora puede clonarse directamente en un vector de expresión que contiene las secuencias control y un sitio de restricción apropiado. La modificación de las secuencias codificadoras también puede llevarse a cabo para alterar la utilización de codones para ajustarse a la célula anfitriona elegida, para una expresión amplificada.
Generalmente, los vectores de expresión recombinantes incluirán orígenes de replicación y marcadores que se pueden seleccionar que permiten la transformación de la célula anfitriona, por ejemplo, gen de resistencia a ampicilina de E. coli y gen TRP1 de S. cerevisiae, y un promotor obtenido de un gen con una expresión elevada para dirigir la transcripción de una secuencia estructural situada más abajo. La secuencia estructural heteróloga se ensambla en la fase apropiada con las secuencias de iniciación y terminación de la traslación y, preferiblemente, con una secuencia líder capaz de dirigir la secreción de la proteína sometida a traslación al espacio periplásmico o al medio extracelular. Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar una proteína de fusión incluyendo un péptido de identificación en el extremo N-terminal que tenga las características deseadas, por ejemplo, estabilización o simplificación de la purificación del producto recombinante expresado.
El vector que contiene la secuencia de ADN apropiada como se ha descrito más arriba en la presente memoria, así como un promotor o secuencia de control apropiado, puede utilizarse para transformar un anfitrión apropiado para permitir al anfitrión expresar la proteína.
Los ejemplos de vectores de ADN recombinante para la clonación y de células anfitrionas que éstos pueden transformar incluyen el bacteriofago \lambda (E. coli), pBR322 (E. coli), pACYC177 (E. coli) pKT230 (bacterias gram-negativas), pGV1106 (bacterias gram-negativas), pLAFR1 (bacterias gram-negativas), pME290 (bacterias gram-negativas distintas de E. coli), pHV14 (E. coli y Bacillus subtilis), pBD9 (Bacillus), pIJ61 (Streptomyces), pUC6 (Streptomyces), YIp5 (Saccharomyces), un sistema de células de insecto de baculovirus, YCp19 (Saccharomyces). Véanse, de manera general, "DNA Cloning": Vols. I y II, Glover et al., ed., IRL Press Oxford (1985) (1987) y; T. Maniatis et al., "Molecular Cloning" Cold Spring Harbor Laboratory (1982).
En algunos casos, puede ser deseable añadir secuencias que producen la secreción del polipéptido del organismo anfitrión, con la degradación posterior de la señal de secreción.
Los vectores de expresión de levaduras también son conocidos en la técnica, Véanse, por ejemplo, las Patentes de EEUU nos. 4.446.235; 4.443.539; 4.430.428; véanse también las Solicitudes de Patente Europeas 103.409; 100.561; 96.491. pSV2neo (descrito en Southern, PJ y Berg, PJ, Mol. Appl. Genet. 1:327-341 (1982)) que utiliza el promotor tardío de SV40 para dirigir la expresión en células de mamífero o pCDNAIneo, un vector obtenido a partir de pCDNAI (Nelson, J et al., Mol. Cell. Biol. 7:4125-29 (1987)) que utiliza el promotor CMV para dirigir la expresión. Estos dos últimos vectores pueden utilizarse para la expresión transitoria o estable (utilizando resistencia G418) en células de mamífero. Los sistemas de expresión en células de insectos, por ejemplo, Drosophila, también son útiles, véanse por ejemplo, solicitudes PCT WO 90/06358 y WO 92/06212 así como EP 290.261 B1.
La transcripción de ADN por eucariotas superiores se incrementa mediante la inserción de una secuencia amplificadora en el vector. Los amplificadores son elementos de ADN que actúan en cis, habitualmente de aproximadamente 10 a 300 bp que actúan sobre un promotor para incrementar su transcripción. Los ejemplos incluyen amplificador de SV40 en la parte tardía del origen de replicación 100 a 270 pb, un amplificador del promotor temprano de citomegalovirus, el amplificador de polioma en la parte tardía del origen de replicación, y amplificadores de adenovirus.
La célula anfitriona que contiene los vectores anteriores puede ser una célula eucariota superior, como una célula de mamífero, o una célula eucariota inferior, como una célula de levadura, o la célula anfitriona puede ser una célula procariota, como una célula bacteriana. Como ejemplos representativos de anfitriones apropiados, pueden mencionarse: procariotas por ejemplo células bacterianas, tales como E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium y eucariotas por ejemplo células fúngicas, como levaduras, células de insecto, tales como Drosophila y Spodoptera frugiperda, células de mamífero tales como CHO, COS o melanoma de Bowes, células de plantas, etc. La selección de un anfitrión apropiado está en el alcance de los expertos en la técnica a partir de lo descrito en la presente memoria.
La introducción de la construcción en la célula anfitriona puede realizarse mediante transfección con fosfato cálcico, transfección mediada por DEAE-Dextrano, o electroporación. (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)).
Después de la transformación de una cepa de anfitrión adecuada y del crecimiento de la cepa de anfitrión hasta una densidad celular apropiada, el promotor seleccionado se induce mediante medios apropiados (por ejemplo, cambio en la temperatura o inducción química) y las células se cultivan durante un periodo adicional.
Las células se recogen típicamente por centrifugación, se rompen mediante medios físicos o mecánicos, y el extracto crudo resultante se guarda para una purificación adicional.
Las células microbianas utilizadas en la expresión de proteínas pueden romperse mediante cualquier método conveniente, incluyendo ciclos de congelación-descongelación, sonicación, rotura mecánica, o mediante la utilización de agentes lisantes celulares, siendo dichos métodos muy conocidos por los expertos en la técnica.
También pueden utilizarse diferentes sistemas de cultivo de células de mamífero para expresar la proteína recombinante. Los ejemplos de sistemas de expresión de mamíferos incluyen las líneas celulares COS-7 de fibroblastos de riñón de mono, descritas por Gluzman, Cell, 23:175 (1981), y otras líneas celulares capaces de expresar un vector compatible, por ejemplo, las líneas celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamíferos comprenderán un origen de replicación, un promotor y amplificador adecuados, y también cualquier sitio de unión a ribosomas necesario, sitio de poliadenilación, sitios de corte y empalme del donante y aceptor, secuencias de terminación de la transcripción, y secuencias 5' flanqueantes que no se transcriben. Las secuencias de ADN obtenidas del corte y empalme de SV40 y los sitios de poliadenilación pueden utilizarse para proporcionar los elementos genéticos requeridos que no se transcriben.
Como anfitriones también pueden utilizarse animales no humanos transgénicos.
Cuando el ensayo de la invención es libre de células, el método de recuperación del polipéptido expresado depende del sistema de expresión y del anfitrión seleccionados. Si el sistema de expresión secreta el polipéptido en el medio de crecimiento, el polipéptido puede purificarse directamente a partir del medio. Si el polipéptido no se secreta, se aisla a partir de lisados celulares o se recupera a partir de la fracción celular de membrana. Cuando el polipéptido está localizado en la superficie celular, pueden utilizarse células completas o membranas aisladas como una fuente de ensayo del producto génico deseado. El polipéptido expresado en anfitriones bacterianos como E. coli puede requerir un aislamiento a partir de cuerpos de inclusión y un replegamiento. La selección de las condiciones de crecimiento y de los métodos de recuperación adecuados puede hacerse por los expertos en la técnica.
El polipéptido puede recuperarse y purificarse a partir de cultivos de células recombinantes mediante métodos que incluyen precipitación con sulfato amónico o etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatito y cromatografía de lectina. Pueden utilizarse etapas de replegamiento de proteínas, si es necesario, para completar la configuración de la proteína madura. Finalmente, puede utilizarse cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para las etapas finales de la purificación.
Dependiendo del anfitrión empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos pueden estar glicosilados o pueden no estar glicosilados. Los polipéptidos también pueden incluir un resto del aminoácido metionina inicial.
Polipéptidos "recombinantes" se refiere a polipéptidos producidos mediante técnicas de ADN recombinante; es decir, producidos a partir de células transformadas con una construcción de ADN exógena que codifica el polipéptido deseado. Polipéptidos "sintéticos" son aquellos preparados mediante síntesis química.
Un "replicón" es cualquier elemento genético (por ejemplo, plásmido, cromosoma, virus) que funciona como una unidad autónoma de replicación de ADN in vivo; es decir, es capaz de replicarse bajo su propio control.
Un "vector" es un replicón, como un plásmido, fago, o cósmido, al que puede unirse otro segmento de ADN con el fin de que se produzca la replicación del segmento unido.
Una "molécula de ADN de doble cadena" se refiere a la forma polimérica de desoxirribonucleótidos (bases adenina, guanina, timina, o citosina) en una hélice de doble cadena, tanto relajada como superenrrollada. Este término se refiere sólo a las estructuras primaria y secundaria de la molécula, y no la limita a ninguna forma terciaria. Por lo tanto, este término incluye el ADN de cadena doble que se encuentra, entre otros, en las moléculas de ADN lineales (por ejemplo, fragmentos de restricción), virus, plásmidos, y cromosomas. En la discusión sobre la estructura de moléculas particulares de ADN de cadena doble, en la presente memoria se pueden describir secuencias de acuerdo con la convención normal de proporcionar sólo la secuencia en la dirección 5' a 3' a lo largo de la cadena con sentido del ADN.
Una "secuencia de ADN codificadora de" o una "secuencia de nucleótidos que codifica" una proteína particular, es una secuencia de ADN que se transcribe y se somete a traslación para dar lugar a un polipéptido cuando se sitúa bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas.
Una "secuencia de promotor" es una región de ADN reguladora capaz de unirse a la ARN polimerasa en una célula y de iniciar la transcripción de una secuencia codificadora situada más abajo (dirección 3'). Dentro de la secuencia del promotor se encuentra un sitio de iniciación de la transcripción (definido convenientemente mediante mapeo con la nucleasa S1), así como dominios de unión de proteínas (secuencias consenso) responsables de la unión de la ARN polimerasa. Los promotores eucariotas contienen habitualmente, pero no siempre, cajas "TATA" y cajas "CAT".
Las "secuencias de control" de ADN se refieren de manera colectiva a secuencias de promotor, sitios de unión a ribosomas, señales de poliadenilación, secuencias de terminación de la transcripción, dominios reguladores superiores, amplificadores, y semejantes, que de manera colectiva proporcionan la expresión (es decir, la transcripción y traslación) de una secuencia codificadora en una célula anfitriona.
Una secuencia de control "dirige la expresión" de una secuencia codificadora en una célula cuando la ARN polimerasa se une a la secuencia del promotor y transcribe la secuencia codificadora en ARNm, que después se somete a traslación para dar lugar al polipéptido codificado por la secuencia codificadora.
Una "célula anfitriona" es una célula que ha sido transformada o transfectada, o que es capaz de transformación o transfección mediante una secuencia de ADN exógena.
Una célula ha sido "transformada" mediante ADN exógeno cuando dicho ADN exógeno ha sido introducido dentro de la membrana celular. El ADN exógeno puede estar o no integrado (unido covalentemente) en el ADN cromosómico que forma el genoma de la célula. En procariotas y levaduras, por ejemplo, el ADN exógeno puede mantenerse en un elemento episomal, como un plásmido. Respecto a las células eucariotas, una célula transformada o transfectada de manera estable es una en la que el ADN exógeno se ha integrado en el cromosoma de manera que se hereda por las células hijas a través de la replicación cromosómica. Esta estabilidad se demuestra por la capacidad de la célula eucariota de establecer líneas celulares o clones comprendidos de una población de células hijas que contiene el ADN exógeno.
Un "clon" es una población de células obtenida a partir de una única célula o un ancestro común por mitosis. Una "línea celular" es un clon de una célula primaria que es capaz de crecer de manera estable in vitro durante muchas generaciones.
La presente invención también está dirigida a compuestos que son inhibidores de la degradación de APP modulada por Asp 2, y a su utilización en el tratamiento de enfermedades relacionadas con la proteína \beta amiloide incluyendo la Enfermedad de Alzheimer.
La invención proporciona además la utilización de un compuesto de acuerdo con la invención para la preparación de un medicamento para inhibir la degradación de APP modulada por Asp 2, en particular, para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la proteína \beta amiloide incluyendo la Enfermedad de Alzheimer.
La invención proporciona además un método para inhibir la degradación de APP modulada por Asp 2, en particular, el tratamiento o profilaxis de enfermedades relacionadas con la proteína \beta amiloide incluyendo la Enfermedad de Alzheimer, método que comprende administrar a un paciente una cantidad eficaz de un compuesto de la invención.
Cuando se utilizan en terapia, los compuestos de la invención se formulan de acuerdo con prácticas farmacéuticas estándar.
Por lo tanto, la presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la invención y un vehículo aceptable desde un punto de vista farmacéutico.
Los compuestos que son activos cuando se administran oralmente pueden formularse como líquidos, por ejemplo, jarabes, suspensiones o emulsiones, comprimidos, cápsulas y pastillas.
Una formulación líquida consistirá generalmente de una suspensión o disolución del compuesto o sal aceptable desde un punto de vista farmacéutico en un vehículo líquido adecuado, por ejemplo, etanol, glicerina, disolvente no acuoso, por ejemplo, polietilenglicol, aceites, o agua, con una agente de suspensión, conservante, saporífero o colorante.
Una composición en la forma de un comprimido puede prepararse utilizando cualquier vehículo farmacéutico adecuado utilizado de manera rutinaria para preparar formulaciones sólidas. Los ejemplos de dichos vehículos incluyen estearato de magnesio, almidón, lactosa, sacarosa y celulosa.
Una composición en la forma de una cápsula puede preparase utilizando procedimientos de encapsulación rutinarios. Por ejemplo, los sedimentos que contienen el ingrediente activo pueden prepararse utilizando vehículos estándar y después utilizarse para rellenar una cápsula de gelatina dura; de manera alternativa, puede prepararse una dispersión o suspensión utilizando cualquier vehículo farmacéutico adecuado, por ejemplo, gomas acuosas, celulosas, silicatos o aceites y la dispersión o suspensión puede utilizarse para rellenar una cápsula de gelatina blanda.
Las composiciones parenterales típicas consisten en una disolución o suspensión del compuesto o sal aceptable desde un punto de vista farmacéutico en un vehículo acuoso estéril o aceite aceptable para administración parenteral, por ejemplo plietilenglicol, polivinil pirrolidona, lecitina, aceite de cacahuete o aceite de sésamo. De manera alternativa, la disolución puede liofilizarse y después reconstituirse con un disolvente adecuado justo antes de la administración.
Una formulación en supositorio típica comprende un compuesto de fórmula (I) o una sal de éste aceptable desde un punto de vista farmacéutico que es activo cuando se administra de esta forma, con un agente de unión y/o lubricante como glicoles poliméricos, gelatinas o mantequilla de cacao u otras ceras o grasas vegetales o sintéticas con punto de fusión bajo.
Preferiblemente, la composición está en forma de dosis unitaria como un comprimido o cápsula.
Cada dosis unitaria para la administración oral contiene preferiblemente de 1 a 250 mg (y para la administración parenteral contiene preferiblemente de 0,1 a 25 mg) de un inhibidor de la invención.
El régimen diario de dosificación para un paciente adulto puede ser, por ejemplo, una dosis oral de entre 1 mg y 500 mg, preferiblemente entre 1 mg y 250 mg, o una dosis intravenosa, subcutánea, o intramuscular de entre 0,1 mg a 100 mg, preferiblemente entre 0,1 mg y 25 mg, del compuesto de la fórmula (I) o de una sal de éste aceptable desde un punto de vista farmacéutico calculado como la base libre, siendo administrado el compuesto de 1 a 4 veces por día. Los compuestos se administrarán durante un periodo de terapia continua.
La presente invención se describirá adicionalmente con referencia a los ejemplos siguientes; sin embargo, debe entenderse que la presente invención no está limitada a dichos ejemplos. Todas las partes o cantidades, a no ser que se especifique otra cosa, son por peso.
Métodos Expresión transitoria de Asp 2 en células de mamífero
El ADN que codifica Asp 2 se clonó en un vector de expresión para la expresión transitoria en células de mamífero. El gen de Asp 2 se amplificó con los cebadores
5' TATTATCTACTCGAGCCACCATGGCCCAAGCCCTGCC 3' (SEQ ID NO.8) y
5' GTTAATATAAAGCTTCAGCAGGGAGATGTCATCAGC 3' (SEQ ID NO.9)
y se clonó en pCR2.1 (Invitrogen). Después el gen de Asp 2 se ligó a pcDNA3.1aMycHis (Invitrogen) digerido con Eco R I/Hind III.
Se cultivaron células de neuroblastoma humano SH-SY5Y que sobreexpresan la isoforma de APP humana 695, (SH-SY5Y APP695) en medio esencial Dulbecco Modificado:F12 suplementado con 10% suero fetal bovino (v/v), penicilina (50 unidades/ml), estreptomicina (50 \mug/ml), 2 mM glutamina y 260 \mug/ml higromicina B a 37ºC en una atmósfera humidificada de 10% CO_{2}/90% aire. Se cultivaron células COS-7 APP751, tipo salvaje y con la mutación Sueca APP (Haass, C. et al., Nature Med. 1:1291-1296 (1995)), Lys 595\rightarrowAsn y Met 596\rightarrowLeu (numeración APP 695), en el medio anterior pero con 300 \mug/ml higromicina B. Para la transfección transitoria, las células se sembraron a una confluencia de \sim60% en frascos de cultivo de 75 cm^{2} y se transfectaron utilizando Reactivo LipofectAMINE PLUS (Life Technologies) como describe el fabricante. 24 h después de la transfección el medio se cambió a OptiMEM-1 (10 ml). El medio se recogió 24 h después, se centrifugó brevemente (500 x g durante 10 min) para eliminar cualquier célula y después se concentró utilizando concentradores Centriprep 10 (Amicon). Las células se recogieron mediante disociación a partir de los frascos utilizando un tampón de disociación celular libre de enzimas (Life Technologies) y se lisaron mediante incubación durante 30 min a 4ºC en 50 mM Tris/HCl pH 7,4, 1% Triton X-100 que contiene un conjunto de inhibidores de proteasas (Boehringer Mannheim). Después de centrifugar (3.000 x g durante 5 min) el sobrenadante se aspiró y se almacenó a -20ºC hasta el ensayo.
Localización subcelular de Asp 2
Un ADNc que codifica Asp 2 con una etiqueta de epítopo Myc se transfectó en células COS-7 APP-751. Las células se fijaron y procesaron para inmunofluorescencia indirecta como se describe en Spector, D.L., Goldman, R.D. y Leinwald, L.A. Cells, in a laboratory Manual, 3, 105.3, Cold Spring Harbor Lab Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1998). APP se visualizó utilizando el anticuerpo anti-extremo C-terminal Ab54. Los anticuerpos control fueron, Anti-proteína 58 K de golgi monoclonal de Sigma, Antígeno 1 Endosómico Temprano monoclonal (EEA1) de Transduction Labs, Anti-KDEL monoclonal de Stressgen, anti-Myc monoclonal de SantaCruz Biotechnology. La detección fue con los anticuerpos Alexa 488 marcado anti-ratón o Alexa 568 marcado anti-conejo de Molecular Probes. La microscopía se llevó a cabo utilizando un microscopio confocal Leica.
Inmunohistoquímica
Inmunohistoquímica de Asp 2: secciones de 10 \mum de hipocampo y cortex frontal y temporal fijadas con paraformaldehido de dos pacientes con la enfermedad de Alzheimer (mujeres, edades 62 y 89) y de dos controles mayores (mujeres, edades 80 y 86) se rehidrataron y marcaron con un anticuerpo frente a Asp 2 mediante incubación durante toda la noche a 4ºC. Para el procesamiento posterior se utilizó el sistema biotina-avidina (con anticuerpo de cabra anti-conejo biotinilado) y el cromógeno, diaminobencidina (Laboratorios Vector).
Mutagénesis
Los mutantes del sitio activo de Asp 2 se construyeron con el kit de mutagénesis Stratagene QuickChange. Se diseñaron dos oligonucleótidos para introducir cada Asp en Asn,
\newpage
D93N1:
5' CTCAACATCCTGGTGAATACAGGCAGCAGTAAC 3' (SEQ ID NO.10)
D93N2:
5' GTTACTGCTGCCTGTATTCACCAGGATGTTGAG 3' (SEQ ID NO.11)
D289N1:
5' GACAAGAGCATTGTGAACAGTGGCACCACCAAC 3' (SEQ ID NO.12)
D289N2:
5' GTTGGTGGTGCCACTGTTCACAATGCTCTTGTC 3' (SEQ ID NO.13)
(las posiciones D93 y D289 referidas arriba corresponden a las posiciones D48 y D244 de la proteína madura).
Las mutaciones se introdujeron en la construcción pcDNA3.1a Asp 2, siguiendo el protocolo QuickChange. Los mutantes se secuenciaron para asegurar la presencia de la mutación del sitio activo deseada y la ausencia de mutaciones PCR.
SDS PAGE y transferencia Western
Se mezclaron muestras de lisados celulares (20 \mug) o medio (15 \mul de medio concentrado 20 veces) con un volumen igual de tampón de muestra Laemmli (0,5 M Tris/HCl, pH 6,8, 10% (p/v) SDS, 0,1% azul de bromofenol, 20% (v/v) glicerol y 5% \beta-mercaptoetanol) y se sometieron a electroforesis utilizando geles de 10% Tris glicina SDS poliacrilamida pre-cargados (Novex). Después de la electroforesis, los geles se electrotransfirieron a PVDF a 100V durante 60 min utilizando el aparato de transferencia húmeda (Novex), el tampón de transferencia consistió en 35 mM Tris HCl, 193 mM glicina y 20% metanol (v/v). Después de la transferencia, las membranas se bloquearon en 5% Marvel, disolución salina tamponada con fosfato (PBS), 0,1% Tween-20 durante 3 h a temperatura ambiente. Después las membranas se incubaron con anticuerpo primario en 2% de albúmina de suero bovino, PBS, 0,1% Tween-20 durante toda la noche a 4ºC. Se utilizó el anticuerpo anti-His_{6} (Boehringer Mannheim) a una dilución de 1:1.000; el anticuerpo producido frente al extremo C-terminal de APP (secuencia de aminoácidos 676-695), Ab54 (Allsop, D. et al., en Alzheimer's Disease: Biology, Diagnostics and Therapeutics, eds Iqbal, K., Winblad, B., Nishimura, T., Takeda, M. y Wisneski, H.M., 717-727, John Wiley, Nueva York (1997)), se utilizó a una dilución de 1:25.000, anticuerpo WO2 (Ida, N. et al., J. Biol. Chem. 271:22908-22914 (1996)) que se produjo frente a los aminoácidos 1-16 del dominio A\beta de APP se utilizó a una dilución de 1:3.000 y el anticuerpo 1A9 producido frente a la región del neoepítopo de APP soluble generado después de la degradación por la \beta-secretasa (Le Brocque, D. et al., Biochem. 37:14558-14565 (1998)) se utilizó a una dilución de 1:3.000. El anticuerpo unido se detectó utilizando un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa (Sigma) y con un anticuerpo adicional anti-peroxidasa para las membranas ensayadas con el anticuerpo 1A9 y anticuerpo WO2, junto con el método de detección de quimioluminiscencia amplificada (ECL) (Amersham).
En el caso de los fragmentos del extremo C-terminal de APP, se mezclaron lisados celulares (20 \mug) con un volumen igual de tampón de muestra Laemmli (0,5 M Tris/HCl, pH 6,8, 10% (p/v) SDS, 0,1% azul de bromofenol, 20% (v/v) glicerol y 5% \beta-mercaptoetanol) y se sometieron a electroforesis utilizando geles de 10-20% Tris tricina SDS poliacrilamida pre-cargados (Novex). Después de la electroforesis, los geles se electrotransfirieron a nitrocelulosa 0,45 \mum a 0,38A durante 35 min utilizando el aparato de transferencia húmeda (Novex), el tampón de transferencia consistió en 35 mM Tris HCl, 193 mM glicina, 0,01% SDS y 20% metanol (v/v). Después de la transferencia, el blot se sometió a microondas en PBS hirviendo durante 10 min. Después de la transferencia, en el caso de la detección con Ab54 las membranas se bloquearon en 5% leche en polvo, disolución salina tamponada con fosfato (PBS), 0,1% Tween-20 durante 1 h a temperatura ambiente. Después las membranas se incubaron con Ab54 (utilizado a una dilución de 1:25.000) en 2% albúmina de suero bovino, PBS, 0,1% Tween-20 durante toda la noche a 4ºC. En el caso de WO2, las membranas se bloquearon en 10% leche en polvo, PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Después, las membranas se incubaron con WO2 a 1 \mug/ml en PBS toda la noche a 4ºC. El anticuerpo unido se detectó utilizando un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa (Sigma) junto con el método de detección de quimioluminiscencia amplificada (ECL) (Amersham).
Resultados Demostración de inmunoreactividad frente a Asp 2 en seres humanos
El hipocampo AD y control se tiñeron inmunológicamente para Asp 2 con un antisuero policlonal purificado de proteína A frente a una secuencia peptídica obtenida a partir de Asp 2. Se vio una clara tinción neuronal, pero no se vio tinción asociada con astrocitos, microglia u oligodendrocitos. Aunque algunas neuronas parecía que estaban marcadas más intensamente que otras, todas mostraron un patrón de tinción similar con la inmunoreactividad localizada sólo en el citoplasma del pericarion y dendritas. La tinción de dendritas raramente se extendía más de 10-15 \mum y no se observó marcaje axonal. Dentro de los cuerpos celulares positivos, la tinción no era uniforme y mostraba una granulación leve. La tinción intraneuronal también fue evidente en el cortex frontal y temporal y en el cerebro de los sujetos control.
Se vio que Asp 2 estaba presente en células SH-SY5Y sin transfectar que expresaban de manera estable la isoforma 695 de APP (SH-SY5Y APP-695) y en células COS-7 que expresaban la isoforma 751 de APP (COS-7 APP-751). El nivel de Asp se incrementó después de la transfección transitoria con el vector pcDNA3.1 que portaba el gen Asp 2. Después de la transfección transitoria con la proteína, Asp 2 estaba presente como una banda principal de 65kDa. Después de una exposición prolongada del blot ECL se evidenció una banda débil a 60 kDa. Los experimentos de desglicosilación mostraron que estas dos bandas eran formas glicosiladas de manera diferente de la misma
proteína.
Localización subcelular de Asp 2 y APP
El vector pcDNA3.1 que porta Asp 2 etiquetada con el epítopo Myc se transfectó en células COS-7 APP-751. De manera consistente con otros trabajos (Kuentzel, S.L., Ali, S.M., Altman, R.A., Greenberg, B.D y Raub, T.J. J. Biochem. 295, 367-378 (1993), Walter, J. et al., Mol. Med. 2, 673-691 (1996)), APP se localizaba claramente en la región de Golgi/retículo endoplásmico como reveló la tinción específica yuxtanuclear y una tinción reticular más general de la célula. Asp 2 mostró esencialmente la misma distribución subcelular y una co-localización clara con APP en células COS-7 APP-751. De manera interesante, la co-localización no es absoluta; APP se detectó más fácilmente hacia la periferia celular que Asp 2. Esto sugiere que estas dos proteínas pueden segregarse al procesarse y transportarse en el interior celular. La distribución de estas dos proteínas es bastante distinta de la distribución de marcadores que definen el endosoma temprano y el retículo endoplásmico.
Efecto de la expresión de Asp 2 y mutantes del sitio activo de Asp 2 en la secreción de sAPP\beta
Tanto los mutantes del sitio activo como Asp 2 se expresaron en niveles similares en las células SH-SY5Y APP-695. Se observó un incrementó de sAPP\beta (110 kDa) en el medio de células transfectadas con Asp 2 comparado con las células control transfectadas con el vector vacío pcDNA3.1MycHis. No se observó incrementó de sAPP\beta secretada de células transfectadas con los mutantes Asp-Asn D93N o D289N. En contra de lo observado con sAPP\beta, Asp 2 no tuvo efecto en la secreción de APP\alpha soluble o de APP de longitud completa en la célula.
Efecto de la expresión de Asp 2 y mutantes del sitio activo de Asp 2 en los fragmentos del extremo C-terminal de APP
Los fragmentos del extremo C-terminal de APP se detectaron en células COS-7 que expresan de manera estable APP-751 con y sin mutación Sueca. Se detectaron bandas de 12 kDa y 10 kDa con Ab54 producido frente a la región C-terminal de APP. El fragmento de 12 kDa fue inmunoreactivo con el anticuerpo WO2 que es específico de los restos 5-9 de A\beta humana y es, por lo tanto, el fragmento del extremo C-terminal producido por la acción de la \beta-secretasa (CTF\beta). La banda del fragmento de 10 kDa no fue inmunoreactiva con este anticuerpo y, en base a esto y a su peso molecular es, por lo tanto, CTF\alpha, el fragmento del extremo C-terminal producido por la acción de la \alpha-secretasa. El fragmento del extremo C-terminal producido por la acción de la \gamma-secretasa no se detectó; esto puede deberse a los bajos niveles de este fragmento o a su rápida desaparición en la célula.
La transfección con Asp 2 resultó en una acumulación del CTF de 12 kDa en células COS-7 APP-751 como se detectó con los anticuerpos Ab54 y WO2. La transfección transitoria con Asp 2 también produjo una acumulación de este CTF de 12 kDa obtenido por la acción de la \beta-secretasa en células COS-7 que expresan APP-751 con la mutación Sueca.
No hubo un incremento de CTF\beta con los mutantes del sitio activo D93N y D289N, confirmando, por lo tanto, que la expresión de endocrepsina-2 codifica una proteinasa funcional que requiere la presencia de los dos residuos aspárticos catalíticos.
Preparación de la proteína de fusión Asp 2 - Fc (Asp 2(1-460)-Fc)
Un fragmento de ADNc que codifica Asp 2, aminoácidos 1 a 460 (EP855444 pero con 130 Glu->Val), se subclonó para crear una proteína de fusión con inmunoglobulina humana, restos 99-330 de IgG1, y se clonó en un vector de expresión de mamíferos pCDN (Aiyar et al). El plásmido se linealizó mediante digestión con Not 1 (15 \mug ADN, 37ºC, toda la noche), se precipitó y se resuspendió en 50 \mul tampón 1X TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,5). El ADN se sometió a electroporación, utilizando un Bio-Rad Gene Pulser (Laboratorios Bio-Rad) en una línea celular de ovario de hamster chino (CHO E1A) (obtenida a partir de DG-44 (Urlaub et al) adaptada para crecer en suspensión en medio de mantenimiento) utilizando la técnica de Hensley et al. Las células se plaquearon en placas de cultivo de 96 pocillos a 5 x 10^{5} células/placa en medio de mantenimiento durante 24 h antes de la selección. Las células se seleccionaron en medio de mantenimiento sin nucleósidos (medio de selección). El medio condicionado de colonias individuales se ensayó utilizando un método de detección por electroquimioluminiscencia en un analizador Origen (IGEN); la tecnología está revisada en Yang et al 1994. Una colonia con una expresión alta se aumento de escala en frascos de agitación de 250 ml que contienen 30 litros de medio de selección para generar el medio condicionado para la purificación.
Aiyar, N., Baker, E., Wu, H-L, E., Nambi, P., Edwards, R.M., Trill, J.J., Ellis, C., Bergsma, D. Human AT1 receptor is a single copy gene: characterization in a stable cell line. Molecular and Cellular Biochemistry 131: 75-86, 1994.
Urlaub, G., Kas, E., Carothers, A.M. y Chasin, L.A. (1983) Cell 33, 405-412.
Hensley, P., McDevitt, P.J., Brooks, I., Trill, J.J., Feild, J.A., McNulty, D.E., Connor, J.R., Griswold, D.E., Kumar, V., Kopple, K.D., Carr, S.A., Dalton, B.J., Johanson, K. The soluble form of E-selectin is an asymmetric monomer: Expression, purification and characterization of the recombinant protein. J. Biol. Chem. 269: 23949-23958, 1994.
Yang, H., Leland, J.K., Yost, D., Massey, R.J. Electrochemiluminescence: A new diagnostic and reasearch tool. Biotechnology, 12: 193-194, 1994.
Purificación de Asp 2 - Fc
Asp 2 - Fc preparada como se indica más arriba se capturó a partir de medio CHO E1a mediante cromatografía de afinidad con Proteína A (resina ProSepA de BioProcessing Ltd). La proteína de fusión se eluyó de la columna con 0,1 M glicina-HCl, pH 3,0, se neutralizó con 1 M Tris-HCl, pH 8,0, y se dializó frente a 25 mM HEPES pH 7,4 que contiene 0,25 M NaCl. La secuenciación N-terminal y el análisis mediante SDS PAGE en presencia y ausencia de DTT mostraron que la proteína era un heterodímero unido por puentes disulfuro de Asp2/Fc - Fc. La secuenciación N-terminal mostró que toda la secuencia señal se había procesado, consistiendo la proteína en 37,5% proforma (empezando en Thr22) y 62,5% forma madura (empezando en Glu46).
Ensayo de Degradación por Transferencia de Energía Resonante de Fluorescencia (FRET) para Asp 2
Un péptido (X) basado en la secuencia de la secuencia del sitio beta de APP de la variante Sueca se marcó doblemente para utilizarse en el ensayo FRET.
2
Este péptido incluye los 11 restos que abarcan el sitio de degradación beta de la variante Sueca (Ile-Ser-Glu-Val-Asn-Leu*Asp-Ala-Glu-Phe-Arg) con un grupo rodamina verde en el extremo N-terminal y un grupo tetrametilrodamina en el extremo C-terminal. Esto permite la evaluación de la degradación de la secuencia peptídica por Asp 2 mediante transferencia de energía entre los dos grupos fluorescentes.
En la práctica los ensayos se realizaron como sigue:
El sustrato peptídico fluorescente (0,5 \muM) se incubó con enzima Asp2-Fc, preparada como se ha descrito más arriba, en un tampón que contiene 50 mM acetato sódico, 20 mM cloruro sódico, 5% glicerol, 0,1% CHAPS (3-[(3-Cloroamidopropil)dimetilamonio]-1-propano-sulfonato), pH 3,8). Los ensayos se iniciaron mediante la adición de la enzima (25 nM concentración final) y la degradación se evaluó en una lector de placas de fluorescencia con 485 nm excitación, 538 nm emisión. El grupo TAMRA del extremo C-terminal del péptido actuó como un apantallador eficaz, por lo que se observó un incremento en la intensidad de la rodamina verde después de la degradación.
Este ensayo se utilizó para determinar los valores CI50 y K_{i} de los compuestos de interés. Se encontró que diferentes compuestos de hidroxietileno eran inhibidores en este ensayo, incluyendo:
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3 
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4 
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se determinaron valores K_{i} de 7,7 nM y 7,3 nM para (I) y (II), respectivamente.
Ensayo de Polarización de la Fluorescencia de Asp 2
También se diseño un ensayo de competición para identificar compuestos que actúan en el sitio activo de Asp 2. El inhibidor hidroxietileno (I), se modificó mediante la adición de 5-, 6-rodamina verde a la amina libre del extremo N-terminal del compuesto para crear un ligando marcado (III).
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5 
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El compuesto resultante se ensayó experimentalmente como sigue para determinar la K_{d} con la enzima Asp2-Fc, preparada como se indica más arriba.
Se llevó a cabo un análisis en tres dimensiones variando la enzima y el compuesto (III). El intervalo de la concentración del ligando fue 1, 3, 10, 30 y 100 nM. El intervalo de la concentración de la enzima fue de 100 nm disminuyendo en diluciones seriadas de dos veces (11 diluciones + control sin enzima). Se preparó el ligando con la concentración apropiada en 5% DMSO. Las disoluciones de la enzima se prepararon en tampón de ensayo concentrado 2 veces (x2) (en el que x1 = 50 mM acetato sódico, 20 mM cloruro sódico, 5% glicerol, 0,1% CHAPS, pH 4,0). Se mezclaron 5 \mul de disolución enzimática (de distintas concentraciones) con 5 \mul de ligando (de diferentes concentraciones) en una placa de microtitulación 384 de volumen pequeño. Se dejó que las muestras se equilibraran durante 15 min antes de leer la polarización de la fluorescencia en un lector de placas LJL Acquest.
Los valores de Anisotropía se representaron y se obtuvo la K_{d} para la interacción de unión fuerte. Se obtuvo un valor de K_{d} de 1,22 nM para la interacción.
\newpage
El compuesto (IV) se ensayó en el mismo ensayo para demostrar competición frente al compuesto (III):
6
La enzima (a una concentración fija de 25 nM), el ligando (III) (a una concentración fija de 2,5 nM) y el compuesto de ensayo (10 \muM disminuyendo en diluciones seriadas de dos veces) se mezclaron en tampón de ensayo x1 (50 mM acetato sódico, 20 mM cloruro sódico, 5% glicerol, 0,1% CHAPS, pH 3,8) en un volumen de ensayo final de 10 \mul y se dejó que se equilibraran durante 3 h. Después se leyó la polarización de la fluorescencia. El experimento se llevó a cabo en duplicado.
En el ensayo, se observó claramente un desplazamiento completo del ligando fluorescente (III) con las concentraciones más altas del compuesto de ensayo. Se obtuvo una K_{i} media de 67,5 nM.

Claims (10)

1. Un método para rastrear compuestos para identificar aquellos compuestos que inhiben la degradación mediada por Asp 2 de un sustrato polipeptídico, método que comprende: proporcionar en un ensayo libre de células un sistema de reacción que comprende Asp 2 recombinante purificada, opcionalmente como una fusión Fc, y sustrato en un tampón de reacción adecuado; y determinar la magnitud de la degradación del sustrato en presencia del compuesto de ensayo comparada con la magnitud de la degradación en ausencia del compuesto de ensayo, en el que el sustrato peptídico contiene un par de grupos marcadores colocados a ambos lados del sitio de degradación, de manera que la degradación del sustrato resulta directamente en la modulación de una señal fluorescente, un grupo marcador porta el generador de la señal y el otro grupo marcador lleva a cabo la función de modulador, y en el que los grupos marcadores son xantenos seleccionados de rodaminas, rodoles y fluoresceínas, por lo que el espectro de absorción del modulador (aceptor) sobrelapa el espectro de emisión del generador (donante) de manera que se observan cambios en la transferencia de energía después de la degradación del péptido.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el par generador/modulador se selecciona de rodamina/rodamina y fluoresceína/rodamina.
3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el par generador/modulador es rodamina verde/tetrame-
tilrodamina.
4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el sustrato es de fórmula (X):
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7 
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5. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el par generador/modulador es 5-(y/o 6)-carboxifluoresceína y 5-(y/o 6)-tetrametilrodamina (TAMRA).
6. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el sustrato es un péptido que abarca el sitio de degradación de la beta-secretasa de la secuencia de la variante Sueca de APP (de P6 a P5').
7. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el sustrato es:
Ile-Ser-Glu-Val-Asn-Leu-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg
8. Un método para rastrear compuestos para identificar aquellos compuestos que inhiben la degradación mediada por Asp 2 de un sustrato polipeptídico o proteico, método que comprende: proporcionar un sistema de reacción que comprende Asp 2 y ligando del sitio activo marcado; y determinar la magnitud de la unión del ligando marcado en presencia del compuesto de ensayo comparada con la magnitud de la unión del ligando marcado en ausencia del compuesto de ensayo con el fin de determinar la afinidad de la unión, en el que el método de ensayo para el ligando está basado en difusión traslacional o rotacional.
\newpage
9. Un método de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el método de ensayo está basado en polarización de la fluorescencia (FP).
10. Un método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el ligando marcado es un compuesto de fórmula (III):
\vskip1.000000\baselineskip
8
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