KR20070013361A - 알츠하이머병 세크레타제 - Google Patents

알츠하이머병 세크레타제 Download PDF

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KR20070013361A
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마크 이. 거니
미하엘 예로메 비엔코브스키
로버트 레로이 하인릭슨
루이스 에이. 파로디
리퀴앙 얀
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파마시아 앤드 업존 캄파니 엘엘씨
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Abstract

본 발명은 APP 단백질의 β 세크레타제 절단 부위를 절단하는 효소 및 효소적 절차, 및 관련 핵산, 펩티드, 벡터, 세포 및 세포 단리물, 및 분석을 제공한다.
알츠하이머병, β 세크레타제, APP, 아밀로이드 베타 펩티드, 인간 아스파르틸 프로테아제.

Description

알츠하이머병 세크레타제 {Alzheimer's Disease Secretase}
도 1은 인간 Asp1의 뉴클레오티드(서열 1) 및 예상된 아미노산 서열(서열 2)을 나타낸다.
도 2는 인간 Asp2(b)의 뉴클레오티드(서열 5) 및 예상된 아미노산 서열(서열 6)을 나타낸다.
도 3은 인간 Asp2(a)의 뉴클레오티드(서열 3) 및 예상된 아미노산 서열(서열 4)을 나타낸다.
도 4는 쥐 Asp2(a)의 뉴클레오티드(서열 7) 및 예상된 아미노산 서열(서열 8)을 나타낸다.
도 5는 Hu-Asp2(a)의 예상된 아미노산 서열(서열 4) 및 쥐 Asp2(a)의 예상된 아미노산 서열(서열 8)의 가장 꼭 맞는 배열을 나타낸다.
도 6은 T7-인간-pro-Asp-2(a)ΔTM의 뉴클레오티드(서열 21) 및 예상된 아미노산 서열(서열 22)을 나타낸다.
도 7은 T7-카스파제-인간-pro-Asp-2(a)ΔTM의 뉴클레오티드(서열 23) 및 예상된 아미노산 서열(서열 24)을 나타낸다.
도 8은 인간-pro-Asp-2(a)ΔTM(저 GC)의 뉴클레오티드(서열 25) 및 예상된 아미노산 서열(서열 26)을 나타낸다.
도 9는 Hu-Asp2 mRNA를 표적으로 하는 안티센스 올리고머로 트랜스펙션된 HEK125.3 세포에 의한 CTF99 생성의 감소를 나타내는 웨스턴 블롯(Western blot)이다.
도 10은 Hu-Asp2로 공동트랜스펙션된 세포에서만 Hu-Asp2의 존재 및 부재하에 APP-KK로 공동트랜스펙션된 쥐 Neuro-2a 세포의 CTF99 생성의 증가를 나타내는 웨스턴 블롯이다. CTF99 생성의 추가의 증가는 Hu-Asp2로 공동트랜스펙션된 세포에서만 Hu-Asp2의 존재 및 부재하에 APP-Sw-KK로 공동트랜스펙션된 세포에서 나타난다.
도 11은 인간-Asp2(a)ΔTM의 예상된 아미노산 서열(서열 30)을 나타낸다.
도 12는 인간-Asp2(a)ΔTM(His)6의 예상된 아미노산 서열(서열 30)을 나타낸다.
미국 특허 제5,766,846호
유럽 특허출원 EP 제0 848 062호
국제 특허 공개공보 WO98/22597호
본 발명은 알츠하이머병에 관련한 APP, 아밀로이드 베타 펩티드 및 인간 아 스파르틸 프로테아제뿐만 아니라 이들 폴리펩티드의 활성을 조절하는 물질의 확인 방법에 관한 것이다.
알츠하이머병(AD)은 아밀로이드 플라크 형성, 신경섬유 덩어리 형성, 신경교증 및 신경세포 손실을 수반하는 진행성 치매를 초래한다. 이 질병은 유전적 및 산발적 형태 둘다로 일어나며 그 임상 경로 및 병적 특징은 꽤 유사하다. 지금까지 돌연변이되어 알츠하이머병의 상염색체 우성 형태를 초래하는 세 유전자가 발견되었다. 이들은 아밀로이드 단백질 전구체(APP) 및 두 관련 단백질인 프레세닐린-1(PS1) 및 프레세닐린-2(PS2)를 코딩하며, 이들은 이름에서 알 수 있듯이 구조적으로 또한 기능적으로 관련되어 있다. 이들중 어느 것이 돌연변이되면 AD에서 아밀로이드 플라크의 주요 성분인 40 내지 42개 아미노산의 긴 펩티드인 아밀로이드 베타 펩티드 또는 Aβ 펩티드(또는 때때로 본원에서 A베타)를 생성하는 세포내 경로를 거쳐 APP의 단백질 분해 과정을 증진시킨다. 단백질 분해 과정의 세포내 경로가 조절되지 않는 것이 AD의 병리생리학의 주요인이 될 수 있다. 플라크 형성의 경우, APP, PS1 또는 PS2의 돌연변이는 항상 APP의 단백질 분해 과정을 바꿔서 특히 아밀로이드원성이며 따라서 AD에서 매우 중요한 것으로 보이는 Aβ 펩티드의 형태인 Aβ 1-42의 형성을 증진시킨다. 상이한 형태의 APP는 크기가 695 내지 770개 아미노산이고, 세포 표면에 위치하며, 하나의 C-말단 막횡단 도메인을 갖는다. A베타 펩티드는 막횡단 도메인의 일부에 인접하여 그를 함유하는 APP의 영역으로부터 유도된다. 정상적으로, α-세크레타제 부위에서 APP의 프로세싱은 막에 인접한 Aβ 서열의 중간 영역을 절단하고, 세포 표면으로부터 APP의 가용성의 세포외 도메인을 방출한다. 이 α-세크레타제 APP 프로세싱은 가용성 APP-α를 생성하며, 이는 정상적인 것으로 AD의 원인으로 생각되지 않는다.
β- 및 γ-세크레타제 부위에서의 APP의 병적 프로세싱은 α 부위에서의 프로세싱과는 매우 상이한 결과를 가져온다. β- 및 γ-세크레타제 부위에서의 순차적인 프로세싱은 AD 병인론에서 아마도 매우 중요한 펩티드인 Aβ 펩티드를 방출한다. β- 및 γ-세크레타제 부위에서의 프로세싱은 세포 표면 APP(모든 세포에서)에 다시 내재화된 후 소포체(신경세포내) 및 엔도솜/리소솜 경로에서 일어날 수 있다. 10여년 동안 β 및 γ부위에서 APP를 프로세싱하는 책임이 있는 효소를 확인하여 Aβ 펩티드를 생성하고자 하는 집중적인 노력에도 불구하고, 이들 프로테아제는 본원 이전까지는 알려지지 않은 채로 있었다. 본원에서 처음으로 본 발명자들은 β 세크레타제 효소의 확인 및 특징화를 보고한다. 본 발명자들은 β-세크레타제 프로테아제로서 작용할 수 있는 일부 공지되고 일부 신규한 인간 아스파라긴 프로테아제를 개시하며, 처음으로 본 발명자들은 이들 프로테아제가 AD에서 갖는 역할을 설명한다. 본 발명자들은 이들의 독특한 기능에 중요한 프로테아제의 영역을 기술하고 처음으로 이들의 기질을 특징화한다. 이는 이 유형의 발현되고 단리된 정제된 활성 단백질, 이 단백질을 사용하는 분석, 유용한 세포주 및 저해제의 확인 및 생성에 대한 최초의 기술이다.
발명의 요약
본원에서 본 발명자들은 asp2 유전자 및 펩티드의 다수의 변이체를 개시한다.
본 발명은 2세트 이상의 특정 핵산을 함유하는, APP의 베타(β) 세크레타제 절단 부위를 절단할 수 있는 프로테아제를 코딩하는 단리된 또는 정제된 핵산 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 이때 특정 핵산은 약 100 내지 300 아미노산 위치를 코딩하는 핵산에 의해 분리되고, 이들 위치의 아미노산은 임의의 아미노산일 수 있으며, 제1 세트의 특정 핵산은 펩티드 DTG를 코딩하는 핵산으로 구성되고, 제1 특정 세트의 핵산의 첫번째 핵산은 제1 특정 핵산이며, 제2 세트의 핵산은 펩티드 DSG 또는 DTG를 코딩하고, 제2 세트의 핵산의 마지막 핵산은 마지막 특정 핵산이며, 단 서열 1 및 서열 5에 개시된 핵산은 포함되지 않는다. 한 실시양태에서, 2세트의 핵산은 임의의 아미노산일 수 있는 약 125 내지 222 아미노산 위치를 코딩하는 핵산에 의해 분리된다. 구체적인 실시양태에서, 2세트의 특정 핵산은 임의의 아미노산일 수 있는 약 150 내지 172 아미노산 위치를 코딩하는 핵산에 의해 분리된다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 2세트는 임의의 아미노산일 수 있는 약 172 아미노산 위치를 코딩하는 핵산에 의해 분리된다. 예시적인 폴리뉴클레오티드는 서열 3에 기술된 핵산을 포함한다. 다른 실시양태에서, 2세트의 핵산은 약 150 내지 196 아미노산 위치를 코딩하는 핵산에 의해 분리된다. 다른 실시양태에서, 2세트의 뉴클레오티드는 약 196 아미노산을 코딩하는 핵산에 의해 분리된다. 예시적인 폴리뉴클레오티드는 서열 5의 동일 세트의 특정 핵산을 분리하는 동일 핵산 서열에 의해 분리된 2세트의 핵산을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 2세트의 핵산은 약 150 내지 190 아미노산을 코딩하는 핵산에 의해 분리된다. 다른 실시양태에서, 2세트의 핵산 뉴클레오티드는 약 190 아미노산을 코딩하는 핵산에 의해 분리된다. 보다 구체적인 실시양태에서, 2세트의 뉴클레오티드는 서열 1의 동일 세트의 특정 뉴클레오티드를 분리하는 동일 핵산 서열에 의해 분리된다. 한 실시양태에서, 제1 특정 세트의 아미노산의 첫번째 핵산, 즉 제1 특정 핵산은 임의의 코돈에 작동가능하게 연결되는데, 이 코돈의 핵산은 1 내지 10,000 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드를 코딩한다. 한 변형법에서, 제1 특정 핵산은 임의의 리포터(reporter) 단백질 및 정제를 용이하게 하는 단백질로 이루어진 군에서 선택된 임의의 펩티드를 코딩하는 핵산 중합체에 작동가능하게 연결된다. 다른 변형법에서, 제1 특정 핵산은 면역글로빈-H쇄, 말토즈 결합 단백질, 글루타티온 S 트랜스펙션, 녹색 형광 단백질 및 유비퀴틴으로 이루어진 군에서 선택된 임의의 펩티드를 코딩하는 핵산 중합체에 작동가능하게 연결된다. 다른 실시양태에서, 제2 세트의 특정 아미노산의 마지막 핵산, 즉 마지막 특정 핵산은 1 내지 10,000 아미노산중 임의의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드를 코딩하는 핵산 중합체에 작동가능하게 연결된다. 한 변형법에서, 마지막 특정 핵산은 임의의 리포터 단백질 및 정제를 용이하게 하는 단백질로 이루어진 군에서 선택된 임의의 펩티드를 코딩하는 핵산 중합체에 연결된 임의의 코돈에 작동가능하게 연결된다. 다른 실시양태에서, 제1 특정 핵산은 면역글로빈-H쇄, 말토즈 결합 단백질, 글루타티온 S 트랜스펙션, 녹색 형광 단백질 및 유비퀴틴으로 이루어진 군에서 선택된 임의의 펩티드를 코딩하는 핵산 중합체에 작동가능하게 연결된다.
본 발명은 2세트 이상의 특정 핵산을 함유하는, APP의 베타 세크레타제 절단 부위를 절단할 수 있는 프로테아제를 코딩하는 단리된 또는 정제된 핵산 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 이때 특정 핵산은 약 100 내지 300 아미노산 위치를 코딩하는 핵산에 의해 분리되고, 이들 위치의 아미노산은 임의의 아미노산일 수 있으며, 제1 세트의 특정 핵산은 DTG를 코딩하는 핵산으로 구성되고, 제1 특정 세트의 핵산의 첫번째 핵산은 제1 특정 핵산이며, 제2 세트의 핵산은 DSG 또는 DTG를 코딩하고, 제2 세트의 특정 핵산의 마지막 핵산은 마지막 특정 핵산이며, 제1 특정 핵산은 0 내지 81 아미노산중 임의의 수의 아미노산을 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되고, 이들 코돈은 각각 임의의 아미노산을 코딩할 수 있다. 한 실시양태에서, 제1 특정 핵산은 64 내지 77 아미노산중 임의의 수의 아미노산을 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되며, 각 코돈은 임의의 아미노산을 코딩할 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 제1 특정 핵산은 71 아미노산을 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된다. 예를 들면, 제1 특정 핵산은 71 아미노산에 작동가능하게 연결되고, 이들 71 아미노산의 첫번째는 아미노산 T이다. 다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 본원에서 교시된 바와 같은 인간 Asp1 또는 Asp2 서열과 95% 이상 동일한 서열을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 제1 특정 핵산은 40 내지 54 중 임의의 수의 아미노산을 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되며, 각 코돈은 임의의 아미노산을 코딩할 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 제1 특정 핵산은 47 아미노산을 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된다. 예를 들면, 실시예 10에 기술된 서열 29와 95% 이상 동일한 서열 또는 실시예 10에 기술된 서열 29의 완전 폴리뉴클레오티드 서열에서와 같이, 제1 특정 핵산은 47 아미노산의 첫번째가 아미노산 E인 47 코돈에 작동가능하게 연결된다.
다른 관련 측면에서, 본 발명은 2세트 이상의 특정 핵산을 함유하는, APP의 베타(β) 세크레타제 절단 부위를 절단할 수 있는 프로테아제를 코딩하는 단리된 또는 정제된 핵산 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 이때 특정 핵산은 약 100 내지 300 아미노산 위치를 코딩하는 핵산에 의해 분리되고, 이들 위치의 아미노산은 임의의 아미노산일 수 있으며, 제1 세트의 특정 핵산은 펩티드 DTG를 코딩하는 핵산으로 구성되고, 제1 특정 세트의 아미노산의 첫번째 핵산은 제1 특정 핵산이며, 제2 세트의 특정 핵산은 펩티드 DSG 또는 DTG를 코딩하고, 제2 세트의 특정 핵산의 마지막 핵산인 마지막 특정 핵산은 50 내지 170 코돈중 임의의 수의 코돈을 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된다. 한 실시양태에서, 마지막 특정 핵산은 100 내지 170 코돈을 포함하는 핵산에 작동가능하게 연결된다. 구체적인 실시양태에서, 마지막 특정 핵산은 142 내지 163 코돈을 포함하는 핵산에 작동가능하게 연결된다. 다른 실시양태에서, 마지막 특정 핵산은 약 142 코돈을 포함하는 핵산에 작동가능하게 연결된다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드는 실시예 9에 기술된 서열 21 또는 실시예 10에 기술된 서열 29와 95% 이상 동일한 서열 또는 실시예 9에 기술된 서열 21 또는 실시예 10에 기술된 서열 29의 완전 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 변형법에서, 마지막 특정 핵산은 약 163 코돈을 포함하는 핵산에 작동가능하게 연결된다. 다른 변형법에서, 마지막 특정 핵산은 약 170 코돈을 포함하는 핵산에 작동가능하게 연결된다. 다른 실시양태에서, 제2 세트의 특정 핵산은 펩티드 DSG 를 코딩하고, 임의로 제1 세트의 핵산 폴리뉴클레오티드는 펩티드 정제 표지에 작동가능하게 연결된다. 예를 들면, 핵산 폴리뉴클레오티드는 6 히스티딘인 펩티드 정제 표지에 작동가능하게 연결된다. 또다른 실시양태에서, 제1 세트의 특정 핵산은 하나의 폴리뉴클레오티드에 있고, 제2 세트의 특정 핵산은 다른 폴리뉴클레오티드에 있으며, 이때 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드는 둘다 50개 이상의 코돈을 갖는다. 상기 유형의 한 실시양태에서, 제1 세트의 특정 핵산은 하나의 폴리뉴클레오티드에 있고, 제2 세트의 특정 핵산은 다른 폴리뉴클레오티드에 있으며, 이때 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드는 둘다 50개 이상의 코돈을 가지고, 두 폴리뉴클레오티드는 같은 용액내에 있다. 한 관련 측면에서, 본 발명은 상기 기술된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터 및 상기 기술된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 세포 또는 세포주를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 2세트 이상의 특정 아미노산을 함유하는 APP의 베타(β) 세크레타제 절단 부위를 절단할 수 있는 프로테아제인 아미노산 중합체를 포함하는 단리된 또는 정제된 펩티드 또는 단백질을 제공하며, 이때 특정 아미노산은 약 100 내지 300 아미노산 위치에 의해 분리되고, 각 아미노산 위치는 임의의 아미노산일 수 있으며, 제1 세트의 특정 아미노산은 펩티드 DTG로 이루어지고, 제1 특정 세트의 아미노산의 첫번째 아미노산은 제1 특정 아미노산이며, 제2 세트의 아미노산은 DSG 또는 DTG를 포함하는 펩티드중에서 선택되고, 제2 세트의 특정 아미노산의 마지막 아미노산은 마지막 특정 아미노산이며, 단 서열 2 및 서열 6에 개시된 프로테아제는 포함되지 않는다. 한 실시양태에서, 2세트의 아미노산은 약 125 내지 222 아미노산 위치에 의해 분리되고, 각 위치에서 아미노산은 임의의 아미노산일 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 2세트의 아미노산은 약 150 내지 172 아미노산에 의해 분리된다. 다른 구체적인 실시양태에서, 2세트의 아미노산은 약 172 아미노산에 의해 분리된다. 예를 들면, 폴리펩티드는 서열 4에 기술된 프로테아제이다. 다른 구체적인 실시양태에서, 2세트의 아미노산은 약 150 내지 196 아미노산에 의해 분리된다. 한 변형법에서, 2세트의 아미노산은 약 196 아미노산에 의해 분리된다. 한 실시양태에서, 2세트의 아미노산은 서열 6에서 동일 세트의 특정 아미노산을 분리하는 동일 아미노산 서열에 의해 분리된다. 구체적인 실시양태에서, 2세트의 아미노산은 약 150 내지 190 아미노산에 의해 분리된다. 다른 구체적인 실시양태에서, 2세트의 뉴클레오티드는 약 190 아미노산에 의해 분리된다. 예를 들면, 2세트의 뉴클레오티드는 서열 2에서 동일 세트의 특정 아미노산을 분리하는 동일 아미노산 서열에 의해 분리된다. 한 실시양태에서, 제1 특정 세트의 아미노산의 첫번째 아미노산, 즉 제1 특정 아미노산은 1 내지 10,000 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드에 작동가능하게 연결된다. 다른 실시양태에서, 제1 특정 아미노산은 임의의 리포터 단백질 및 정제를 용이하게 하는 단백질로 이루어진 군에서 선택된 임의의 펩티드에 작동가능하게 연결된다. 구체적인 실시양태에서, 제1 특정 아미노산은 면역글로빈-H쇄, 말토즈 결합 단백질, 글루타티온 C 트랜스펙션, 녹색 형광 단백질 및 유비퀴틴으로 이루어진 군에서 선택된 임의의 펩티드에 작동가능하게 연결된다. 또다른 변형법에서, 제2 세트의 특정 아미노산의 마지막 아미노산, 즉 마지막 특정 아미노산은 1 내지 10,000 아미노산중 임의의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드에 작동가능하게 연결된다. 비제한적인 예를 들면, 마지막 특정 아미노산은 임의의 리포터 단백질 및 정제를 용이하게 하는 단백질로 이루어진 군에서 선택된 임의의 펩티드에 작동가능하게 연결된다. 구체적인 실시양태에서, 제1 특정 아미노산은 면역글로빈-H쇄, 말토즈 결합 단백질, 글루타티온 S 트랜스펙션, 녹색 형광 단백질 및 유비퀴틴으로 이루어진 군에서 선택된 임의의 펩티드에 작동가능하게 연결된다.
본 발명은 또한 2세트 이상의 특정 아미노산을 함유하는 APP의 베타 세크레타제 절단 부위를 절단할 수 있는 프로테아제를 코딩하는 아미노산 폴리펩티드를 포함하는 단리된 또는 정제된 펩티드 또는 단백질을 제공하며, 이때 특정 아미노산은 약 100 내지 300 아미노산 위치에 의해 분리되고, 각 위치의 각 아미노산은 임의의 아미노산일 수 있으며, 제1 세트의 특정 아미노산은 아미노산 DTG로 이루어지고, 제1 특정 세트의 아미노산의 첫번째 아미노산은 제1 특정 아미노산 D이며, 제2 세트의 아미노산은 DSG 또는 DTG이고, 제2 세트의 특정 아미노산의 마지막 아미노산은 마지막 특정 아미노산 G이며, 제1 특정 아미노산은 0 내지 81 아미노산 위치중 임의의 수의 아미노산을 코딩하는 아미노산에 작동가능하게 연결되고, 이때 각 위치에서 아미노산은 임의의 아미노산일 수 있다. 한 실시양태에서, 제1 특정 아미노산은 약 64 내지 77 아미노산 위치의 펩티드에 작동가능하게 연결되고, 각 아미노산 위치는 임의의 아미노산일 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 제1 특정 아미노산은 71 아미노산의 펩티드에 작동가능하게 연결된다. 보다 구체적인 실시양태에서, 제1 특정 아미노산은 71 아미노산에 작동가능하게 연결되고, 이들 71 아미 노산의 첫번째는 아미노산 T이다. 예를 들면, 폴리펩티드는 본원에 기술된 바와 같은 아스파르틸 프로테아제 서열과 95% 이상 동일한 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 제1 특정 아미노산은 40 내지 54 중 임의의 수의 아미노산에 작동가능하게 연결되고, 각 아미노산 위치는 임의의 아미노산일 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 제1 특정 아미노산은 47 아미노산의 펩티드를 코딩하는 아미노산에 작동가능하게 연결된다. 매우 구체적인 실시양태에서, 제1 특정 아미노산은 47 아미노산 펩티드에 작동가능하게 연결되고, 이들 47 아미노산의 첫번째는 아미노산 E이다. 예를 들면, 폴리펩티드는 실시예 10에 기술된 서열 30과 95% 이상 동일한 서열 또는 실시예 10에 기술된 서열 30의 완전 폴리펩티드 서열을 포함한다.
또다른 관련 측면에서, 2세트 이상의 특정 아미노산을 함유하는 APP의 베타(β) 세크레타제 절단 부위를 절단할 수 있는 프로테아제인 단리된 또는 정제된 아미노산 폴리펩티드가 개시되며, 이때 특정 아미노산은 약 100 내지 300 아미노산 위치에 의해 분리되고, 각 위치의 각 아미노산은 임의의 아미노산일 수 있으며, 제1 세트의 특정 아미노산은 DTG를 코딩하는 아미노산으로 이루어지고, 제1 특정 세트의 아미노산의 첫번째 아미노산은 제1 특정 아미노산 D이며, 제2 세트의 아미노산은 DSG 또는 DTG이고, 제2 세트의 특정 아미노산의 마지막 아미노산은 마지막 특정 아미노산 G이며, 이것은 50 내지 170 아미노산중 임의의 아미노산일 수 있는 임의의 수의 아미노산에 작동가능하게 연결된다. 한 실시양태에서, 마지막 특정 아미노산은 약 100 내지 170 아미노산의 펩티드에 작동가능하게 연결된다. 구체적인 실시양태에서, 마지막 특정 아미노산은 약 142 내지 163 아미노산의 펩티드에 작동 가능하게 연결된다. 다른 구체적인 실시양태에서, 마지막 특정 아미노산은 약 142 아미노산의 펩티드에 작동가능하게 연결된다. 예를 들면, 폴리펩티드는 실시예 9에 기술된 서열 22 또는 실시예 10에 기술된 서열 30과 95% 이상 동일한 서열을 포함한다. 한 구체적인 실시양태에서, 마지막 특정 아미노산은 약 163 아미노산의 펩티드에 작동가능하게 연결된다. 예를 들면, 폴리펩티드는 실시예 9에 기술된 서열 22 또는 실시예 10에 기술된 서열 30과 95% 이상 동일한 서열 또는 실시예 9에 기술된 서열 22 또는 실시예 10에 기술된 서열 30의 완전 폴리펩티드 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 마지막 특정 아미노산은 약 170 아미노산의 펩티드에 작동가능하게 연결된다. 구체적인 실시양태에서, 제2 세트의 특정 아미노산은 아미노산 서열 DSG를 갖는 펩티드로 이루어진다. 임의로, 아미노산 폴리펩티드는 펩티드 정제 표지, 예를 들어 6 히스티딘인 펩티드 정제 표지에 작동가능하게 연결된다. 한 변형법에서, 제1 세트의 특정 아미노산은 하나의 폴리펩티드에 있고, 제2 세트의 특정 아미노산은 다른 폴리펩티드에 있으며, 이때 제1 및 제2 폴리펩티드는 둘다 임의의 아미노산일 수 있는 50개 이상의 아미노산을 갖는다. 다른 변형법에서, 제1 세트의 특정 아미노산은 하나의 폴리펩티드에 있고, 제2 세트의특정 아미노산은 다른 폴리펩티드에 있고, 이때 제1 및 제2 폴리펩티드는 50개 이상의 아미노산을 가지며, 이들 폴리펩티드는 둘다 동일 용기내에 있다. 본 발명은 또한 본원에 기술된 바와 같은 폴리펩티드를 함유하는 벡터를 제공한다. 본 발명은 추가로 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 세포 또는 세포주를 제공한다. 본 발명은 또한 본원에 기술된 임의의 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포를 제조하는 방법 및 본원에 기술된 임의의 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공한다.
2세트 이상의 특정 아미노산을 함유하는 APP의 베타 세크레타제 절단 부위를 절단할 수 있는 프로테아제를 코딩하는 아미노산 폴리펩티드를 포함하는 임의의 단리된 또는 정제된 펩티드 또는 단백질이 개시되며, 이때 특정 아미노산은 약 100 내지 300 아미노산 위치에 의해 분리되고, 각 위치의 각 아미노산은 임의의 아미노산일 수 있으며, 제1 세트의 특정 아미노산은 아미노산 DTG로 이루어지고, 제1 특정 세트의 아미노산의 첫번째 아미노산은 제1 특정 아미노산 D이며, 제2 세트의 아미노산은 DSG 또는 DTG이고, 제2 세트의 특정 아미노산의 마지막 아미노산은 마지막 특정 아미노산 G이며, 제1 특정 아미노산은 0 내지 81 아미노산 위치중 임의의 수의 아미노산을 코딩하는 아미노산에 작동가능하게 연결되고, 이때 각 위치의 아미노산은 임의의 아미노산일 수 있다.
본 발명은 제1 특정 아미노산이 약 30 내지 77 아미노산 위치의 펩티드에 작동가능하게 연결되고, 각 아미노산 위치가 임의의 아미노산일 수 있는 본원에 기술된 아미노산 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명은 또한 제1 특정 아미노산이 35, 47, 71 또는 77 아미노산의 펩티드에 작동가능하게 연결된 본원에 기술된 아미노산 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명은 제1 특정 아미노산이 첫번째 특정 서열 DTG의 아미노산부터 시작해서 서열 3의 N-말단을 향해 계수하여 길이로 35, 47, 71 또는 77 펩티드인 서열 3의 동일한 대응하는 펩티드에 작동가능하게 연결된 본원에 기술된 아미노산 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명은 폴리펩티드가 서열 4의 동일한 대응하는 아미노산에 95% 이상 동일한, 즉 N-말단을 향해 제1 특정 아미노산 앞의 71, 47, 35 아미노산을 지나는(이들을 포함) 제1 및(또는) 제2 특정 핵산중의 모든 서열을 포함하는 서열 4의 서열의 일부와 동일한 서열을 포함하는 본원에 기술된 아미노산 폴리펩티드를 제공한다 (실시예 10 및 11).
본 발명은 완전 폴리펩티드가 71 아미노산의 펩티드를 포함하며 첫번째 아미노산은 T이고 두번째는 Q인 본원에 기술된 아미노산 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명은 또한 폴리뉴클레오티드가 서열 3의 동일한 대응하는 아미노산과 95% 이상 동일한, 즉 N-말단을 향해 71 아미노산(실시예 10 참조)을 지나(이들을 포함) DTG 부위에서 시작하고 71 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하여, 제1 및(또는) 제2 특정 핵산의 서열을 포함하는 서열 3의 서열과 동일한 서열을 포함하는 본원에 기술된 핵산 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 완전 폴리뉴클레오티드가 서열 3의 동일한 대응하는 아미노산과 동일한, 즉 N-말단을 향해 71 아미노산(실시예 10 참조)을 지나(이들을 포함) DTG 부위에서 시작하여 71 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 제1 및(또는) 제2 특정 핵산의 서열을 포함하는 서열 3의 서열과 동일한 서열을 포함하는 본원에 기술된 핵산 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 제1 특정 핵산이 약 30 내지 54 중 임의의 수의 아미노산을 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되며 각 코돈은 임의의 아미노산을 코딩할 수 있는 본원에 기술된 핵산 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 제1 특정 핵산이 47 코돈에 작동가능하게 연결되고, 이들 35 또는 47 아미노산의 첫번째가 아미노산 E 또는 G인 본원에 기술된 핵산 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 폴리뉴클레오티드가 서열 3의 동일한 대응하는 아미노산과 95% 이상 동일한, 즉 N-말단을 향해 35 또는 47 아미노산(47개의 예로 실시예 11 참조)을 지나(이들을 포함) DTG 부위에서 시작하여 DTG 부위 앞의 선행 35 또는 47 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 제1 및(또는) 제2 특정 핵산의 서열을 포함하는 서열 3의 서열의 일부와 동일한 서열을 포함하는 본원에 기술된 핵산 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 핵산 폴리뉴클레오티드에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 서열 3의 동일한 대응하는 아미노산과 동일한, 즉 N-말단을 향해 35 또는 47 아미노산(47개의 예로 실시예 11 참조)을 지나(이들을 포함) DTG 부위에서 시작하여 DTG 부위 앞의 선행 35 또는 47 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 제1 및(또는) 제2 특정 핵산의 서열을 포함하는 서열 3의 서열과 동일한 서열을 포함한다.
Hu-Asp 폴리펩티드를 코딩하고, (a) Hu-Asp1, Hu-Asp2(a) 및 Hu-Asp2(b)로 이루어진 군에서 선택된 Hu-Asp 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(이때, Hu-Asp1, Hu-Asp2(a) 및 Hu-Asp2(b) 폴리펩티드는 각각 서열 2, 서열 4 및 서열 6의 완전 아미노산 서열을 가짐); 및 (b) 뉴클레오티드 서열 (a)에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군에서 선택된 서열과 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산 분자가 개시된다.
본 발명은 Hu-Asp 폴리펩티드가 Hu-Asp1이고 폴리뉴클레오티드 분자가 서열 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자; Hu-Asp 폴리펩티드가 Hu-Asp2(a)이고 폴리뉴클레오티드 분자가 서열 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자; Hu-Asp2(b)인 Hu-Asp 폴리펩티드를 코딩하고 폴리뉴클레오티드 분자가 서열 5의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 본 발명은 엄격 조건하에 상기 기술된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드와 혼성화(hybridization)되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 본 발명은 상기 기술된 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 임의로, 벡터는 Hu-Asp1, Hu-Asp2(a) 또는 Hu-Asp2(b)와 같은 Hu-Asp 폴리펩티드의 발현을 위한 프로모터에 작동가능하게 연결된 핵산 분자를 함유한다. 본 발명은 상기 기술된 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 상기 기술된 숙주 세포를 배양하고, Hu-Asp 폴리펩티드를 단리함을 포함하는 Hu-Asp 폴리펩티드를 얻는 방법을 제공한다. 본 발명은 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단리된 Hu-Asp1 폴리펩티드, 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단리된 Hu-Asp2(a) 폴리펩티드 및 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단리된 Hu-Asp2(a) 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명은 또한 본원에 기술된 Hu-Asp 폴리펩티드에 특이하게 결합하는 단리된 항체를 제공한다.
본원에서, 본 발명자들은 효소를 분석하는 다수의 방법을 개시한다.
본 발명은 (a) i) 확인할 세포 또는 세포로부터 상청액을 수획하고, (ii) APP C-말단 펩티드 및 가용성 APP로 이루어진 군에서 선택되는 중요 펩티드의 생성을 측정하고, iii) 중요 펩티드를 생성하는 세포를 선택함을 포함하는, β 세크레타제 부위에서 APP를 절단할 수 있는 프로테아제를 발현하는 세포를 확인함을 포함하는, β 세크레타제 활성의 저해제를 선별하는데 사용될 수 있는 세포를 확인하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 세포가 수획되고, 중요 펩티드는 β 세크레타제 절단의 결과로서 생성된 APP C-말단 펩티드이다. 다른 실시양태에서, 상청액이 수획되고, 중요 펩티드는 β 세크레타제 절단에 의해 생성된 C-말단을 갖는 가용성 APP이다. 한 변형법에서, 세포는 상기 기술된 임의의 핵산 또는 폴리펩티드를 함유하고, 세포는 P2, P1, P1', P2'(이때, P2는 K 또는 N이고, P1은 M 또는 L이고, P1'은 D이고, P2'은 A임)의 펩티드 구조를 갖는 임의의 펩티드의 β 세크레타제 부위를 절단하는 것으로 나타난다. 다른 변형법에서, P2는 K이고 P1은 M이거나, P2는 N이고 P1은 L이다.
본 발명은 상기 기술된 임의의 핵산 또는 펩티드를 포함하는 임의의 박테리아 세포를 제공한다. 예를 들면, 박테리아는 이 콜리(E. coli)이다. 본 발명은 또한 상기 기술된 임의의 핵산 또는 폴리펩티드를 포함하는 임의의 진균 세포를 제공한다.
본 발명은 상기 기술된 임의의 핵산 또는 폴리펩티드를 포함하는 곤충 세포를 제공한다. 고려되는 이들 곤충 세포는 sf9 또는 High 5를 포함한다. 본 발명은 또한 상기 기술된 임의의 핵산 또는 폴리펩티드를 포함하는 포유동물 세포를 제 공한다. 예시적인 포유동물 세포는 인간, 설치류, 토끼류 및 영장류로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 예시적인 인간 세포는 HEK293 및 IMR-32로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 예시적인 영장류 세포는 COS-7 세포일 수 있다. 설치류 세포는 CHO-K1, Neuro-2A 및 3T3 세포중에서 선택될 수 있다. 본 발명은 또한 상기 기술된 임의의 핵산 또는 폴리펩티드를 포함하는 효모 세포 또는 조류 세포를 제공한다.
본 발명은 이소폼의 마지막 두 카르복시 말단 아미노산이 모두 리신 잔기인 APP의 임의의 이소폼을 제공한다. 이소폼은 APP 변이체(돌연변이 포함) 및 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제5,766,846호 제7 칼럼 45-67줄에 기술된 것과 같은 인간에 존재하는 APP 단편을 포함한 임의의 APP 폴리펩티드이다. 한 실시양태는 마지막 두 아미노산이 마지막 두 카르복시 말단 아미노산으로서 두 리신 잔기를 갖도록 변형된 APP695로서 알려진 이소폼을 포함하는 APP의 이소폼이다. 예를 들면, 서열 16을 포함하는 APP의 이소폼 또는 서열 18 또는 서열 20을 포함하는 APP 이소폼 변이체가 개시된다. 본 발명은 또한 변형된 APP 이소폼을 코딩하는 핵산 또는 변형된 APP 이소폼을 코딩하는 폴리펩티드를 포함하는 임의의 진핵 세포주를 제공한다. 세포주는 포유동물 세포주(HEK293, Neuro2a, 바람직하게는 기타)일 수 있다. 본 발명은 또한 a) 효소가 APP의 프로세싱 및 배지내로의 아밀로이드 베타-펩티드의 방출을 일으키고, 세포 용해물내 APP의 CTF99 단편의 축적을 일으키는 조건하에 배양 배지에서 세포를 배양하고, b) 배양된 세포를 시험 화합물에 노출시키고; 배지내로 방출된 아밀로이드 베타-펩티드의 양 및(또는) 세포 용해물내의 APP 의 CTF99 단편의 양을 측정함으로써 시험 화합물이 효소의 작용을 저해하는지를 특별히 결정하고; c) 배양 배지내에 존재하는 가용성 아밀로이드 베타 펩티드의 양을 줄이는 시험 화합물 및 Asp2 저해제로서 세포 용해물내 APP의 CTF99 단편의 감소를 확인함을 포함하는, APP의 베타 세크레타제 절단 부위를 절단하는 효소의 저해제를 확인하는 방법을 제공한다.
예시적인 실시양태에서, 배양된 세포는 인간, 설치류 또는 곤충 세포주이다. 또한, 인간 또는 설치류 세포주가 APP의 프로세싱이 배양 배지내로의 아밀로이드 베타-펩티드의 방출 및 세포 용해물내 CTF99의 축적과 함께 일어나는 β 세크레타제 활성을 나타내는 것도 고려된다. 고려된 시험 화합물 중에는 β 세크레타제 활성을 나타내어 배양 배지내로의 가용성 아밀로이드 베타-펩티드의 방출 및 세포 용해물내 CTF99의 축적을 감소시키는 효소에 대향하는 안티센스 올리고머가 포함된다. a) 시험 물질의 존재하에 및 시험 물질의 부재하에 Hu-Asp 폴리펩티드의 활성을 결정하고; b) 시험 물질의 존재하에 결정된 Hu-Asp 폴리펩티드의 활성을 시험 물질의 부재하에 결정된 Hu-Asp 폴리펩티드의 활성과 비교함을 포함하는, Hu-Asp1, Hu-Asp2(a) 및 Hu-Asp2(b)로 이루어진 군에서 선택된 Hu-Asp 폴리펩티드의 활성을 줄이는 물질의 확인 방법이 개시되는데, 시험 물질의 부재하에서 보다 시험 물질의 존재하에서의 더 낮은 수준의 활성은 시험 물질이 Hu-Asp 폴리펩티드의 활성을 줄였음을 나타낸다. 본원에 기술된 핵산, 펩티드, 단백질, 벡터, 세포 및 세포주, 및 분석이 개시된다.
본 발명은 인간 아스파르틸 프로테아제로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티 드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 특히, 인간 아스파르틸 프로테아제 1(Hu-Asp1) 및 본원에서 Hu-Asp2(a) 및 Hu-Asp2(b)로서 명명된, 인간 아스파르틸 프로테아제 2(Hu-Asp2)의 또 다른 두 접합 변이체가 개시된다. 본원에 사용된 바와 같이, "Hu-Asp"에 대한 모든 언급은 Hu-Asp1, Hu-Asp2(a) 및 Hu-Asp2(b) 모두를 가리키는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본원에 사용된 바와 같이, "Hu-Asp2"에 대한 모든 언급은 Hu-Asp2(a) 및 Hu-Asp2(b) 둘다를 가리키는 것으로 이해되어야 한다. Hu-Asp1은 췌장 및 전립선 조직에 가장 풍부하게 발현되는 반면에, Hu-Asp2(a) 및 Hu-Asp2(b)는 췌장 및 뇌 조직에 가장 풍부하게 발현된다. 본 발명은 또한 단리된 Hu-Asp1, Hu-Asp2(a) 및 Hu-Asp2(b) 폴리펩티드, 및 아스파르틸 프로테아제 활성을 나타내는 그의 단편을 제공한다.
바람직한 실시양태로, 핵산 분자는 Hu-Asp1을 코딩하는 서열 1의 1 내지 1554 잔기, Hu-Asp2(a)를 코딩하는 서열 3의 1 내지 1503 잔기 및 Hu-Asp2(b)를 코딩하는 서열 5의 1 내지 1428 잔기로 이루어진 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 다른 양상으로, 본 발명은 엄격 조건하에 Hu-Asp1, Hu-Asp2(a), Hu-Asp-2(b) 또는 이들의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 유럽 특허출원 EP 제0 848 062호에는 Hu-Asp1에 상당한 상동성을 지니는 "Asp 1"로서 불리는 폴리펩티드가 개시되는 한편, 국제 특허 공개공보 WO98/22597호에는 Hu-Asp2(a)에 상당한 상동성을 지니는 "ASP 2"로서 불리는 폴리펩티드가 개시된다.
본 발명은 또한 본 발명의 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터, 이러한 벡터 가 도입된 숙주 세포, 및 전술한 숙주 세포를 배양하고 관련 폴리펩티드를 단리함을 포함하는, Hu-Asp1, Hu-Asp2(a) 또는 Hu-Asp2(b) 폴리펩티드를 얻는 재조합 방법을 제공한다.
다른 양상으로, 본 발명은 단리된 Hu-Asp1, Hu-Asp2(a) 및 Hu-Asp2(b) 폴리펩티드, 및 이들의 단편을 제공한다. 바람직한 실시양태로, Hu-Asp1, Hu-Asp2(a) 및 Hu-Asp2(b) 폴리펩티드는 각각 서열 2, 서열 4 또는 서열 6에 제공된 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명은 또한 Hu-ASp2의 활성 형태, 이러한 활성 형태를 제조하는 방법, 가용성 형태를 제조하는 방법, Hu-Asp2 활성을 측정하는 방법 및 Hu-Asp2 절단을 위한 기질을 기술한다. 본 발명은 또한 Hu-Asp1, Hu-Asp2(a) 및 Hu-Asp2(b) mRNA 전사를 표적으로 하는 안티센스 올리고머 및 이러한 mRNA를 줄여서 결과적으로 대응하는 폴리펩티드의 생성을 줄이는 안티센스 제제의 용도를 기술한다. 본 발명의 Hu-Asp1, Hu-Asp2(a) 및 Hu-Asp2(b) 폴리펩티드중 임의의 것에 특이적으로 결합하는 단리된 항체(다클론성 및 단클론성 둘다)가 또한 제공된다. 본 발명은 또한 Hu-Asp1, Hu-Asp2(a) 및 Hu-Asp2(b)중 임의의 것의 활성을 조절하는 물질의 확인 방법을 제공한다. 본 발명은 Hu-Asp2 폴리펩티드가 첨가되는 무세포 분석으로 상기 물질을 시험하는 방법, 및 Hu-Asp2가 존재하는 인간 또는 다른 포유동물 세포에서 상기 물질을 시험하는 방법을 기술한다.
서열 목록의 간단한 설명
서열 1은 인간 Asp-1, 뉴클레오티드 서열이다.
서열 2는 인간 Asp-1, 예상된 아미노산 서열이다.
서열 3은 인간 Asp-2(a), 뉴클레오티드 서열이다.
서열 4는 인간 Asp-2(a), 예상된 아미노산 서열이다.
서열 5는 인간 Asp-2(b), 뉴클레오티드 서열이다.
서열 6은 인간 Asp-2(b), 예상된 아미노산 서열이다.
서열 7은 쥐 Asp-2(a), 뉴클레오티드 서열이다.
서열 8은 쥐 Asp-2(a), 예상된 아미노산 서열이다.
서열 9는 인간 APP695, 뉴클레오티드 서열이다.
서열 10은 인간 APP695, 예상된 아미노산 서열이다.
서열 11은 인간 APP695-Sw, 뉴클레오티드 서열이다.
서열 12는 인간 APP695-Sw, 예상된 아미노산 서열이다.
서열 13은 인간 APP695-VF, 뉴클레오티드 서열이다.
서열 14는 인간 APP695-VF, 예상된 아미노산 서열이다.
서열 15는 인간 APP695-KK, 뉴클레오티드 서열이다.
서열 16은 인간 APP695-KK, 예상된 아미노산 서열이다.
서열 17은 인간 APP695-Sw-KK, 뉴클레오티드 서열이다.
서열 18은 인간 APP695-Sw-KK, 예상된 아미노산 서열이다.
서열 19는 인간 APP695-VF-KK, 뉴클레오티드 서열이다.
서열 20은 인간 APP695-VF-KK, 예상된 아미노산 서열이다.
서열 21은 T7-인간-pro-Asp-2(a)ΔTM, 뉴클레오티드 서열이다.
서열 22는 T7-인간-pro-Asp-2(a)ΔTM, 아미노산 서열이다.
서열 23은 T7-카스파제-인간-pro-Asp-2(a)ΔTM, 뉴클레오티드 서열이다.
서열 24는 T7-카스파제-인간-pro-Asp-2(a)ΔTM, 아미노산 서열이다.
서열 25는 인간-pro-Asp-2(a)ΔTM(저 GC), 뉴클레오티드 서열이다.
서열 26은 인간-pro-Asp-2(a)ΔTM(저 GC), 아미노산 서열이다.
서열 27은 T7-카스파제-카스파제 8 절단-인간-pro-Asp-2(a)ΔTM, 뉴클레오티드 서열이다.
서열 28은 T7-카스파제-카스파제 8 절단-인간-pro-Asp-2(a)ΔTM, 아미노산 서열이다.
서열 29는 인간 Asp-2(a)ΔTM, 뉴클레오티드 서열이다.
서열 30은 인간 Asp-2(a)ΔTM, 아미노산 서열이다.
서열 31은 인간 Asp-2(a)ΔTM(His)6, 뉴클레오티드 서열이다.
서열 32는 인간 Asp-2(a)ΔTM(His)6, 아미노산 서열이다.
서열 33 내지 서열 46은 본 발명의 상세한 설명에서 이후 기술된다.
본 발명에 사용된 몇가지 정의가 다음에 나오며, 사용된 대부분의 정의는 당업자에 의해 사용될 수 있는 것이다.
β아밀로이드 펩티드의 경우, APP의 베타 세크레타제 절단으로부터 생성되는 임의의 펩티드를 뜻한다. 이것은 β-세크레타제 절단 부위로부터 39, 40, 41, 42 및 43 아미노산까지 계속되는 펩티드 39, 40, 41, 42 및 43 아미노산의 펩티드를 포함한다. β아밀로이드 펩티드는 또한 1998년 5월 12일자로 허여된 미국 특허 제 5,750,349호(본원에 참조로 인용됨)의 서열 1 내지 서열 6을 뜻한다. 본원에 개시된 β-세크레타제 절단 단편은 CTF-99라고 하며, 이는 APP의 β-세크레타제 절단 부위로부터 카르복시 말단까지 계속된다.
APP의 이소폼이 논의되는 경우, APP 변이체(돌연변이 포함) 및 미국 특허 제5,766,846호(본원에 참조로 인용됨, 이하 참조) 제7 칼럼, 45-67줄에 기술된 것과 같은 인간에 존재하는 APP 단편을 포함하는 임의의 APP 폴리펩티드를 뜻한다.
본원에 사용된 "β-아밀로이드 전구체 단백질"(APP)은 인간에서 염색체 21의 장축에 있는 동일한 이름의 유전자에 의해 코딩되고, 그의 세번째 카르복실내에 "βAP"(본원에서 "β-아밀로이드 단백질", 상기 참조)를 포함하는 폴리펩티드로서 정의된다. APP는 많은 포유동물 조직내의 광범위한 세포에서 발현되는 글리코실화된 단일막에 걸쳐 있는 단백질이다. 인간에 존재하는 것으로 현재 알려진 APP의 특정 이소폼의 예는 "정상" APP로 불리는, 강(Kang) 등의 문헌[Nature 325:733-736(1987)]에 기술된 695-아미노산 폴리펩티드; 폰트(Ponte) 등의 문헌[Nature 331:525-527(1988)] 및 탄지(Tanzi) 등의 문헌[Nature 331:528-530(1988)]에 기술된 751-아미노산 폴리펩티드; 및 기타구치(Kitaguchi) 등의 문헌[Nature 331:530-532(1988)]에 기술된 770-아미노산 폴리펩티드이다. APP의 특정 변이체의 예로는 위치 및 형질면에서 상이할 수 있는 점 돌연변이가 있다(공지된 변이체 돌연변이의 개관은 하디(Hardy)의 문헌[Nature Genet. 1:233-234(1992)]을 참조함). 본원에서 언급된 모든 참조문헌은 본원에 참조로 인용된다. 본원에 사용된 "APP 단편"이란 용어는 βAP 또는 βAP 단편으로만 이루어진 것이 아닌 APP의 단편을 가리킨다. 즉, APP 단편은 완전 3AP 또는 βAP의 단편을 형성하는 것 외에 APP의 아미노산 서열을 포함할 것이다.
"임의의 아미노산"이란 용어가 사용되는 경우, 언급되는 아미노산은 하기 3글자 및 1글자 약어(사용될 수 있음)중에서 선택될 것이다:
알라닌, Ala, A; 아르기닌, Arg, R; 아스파라긴, Asn, N; 아스파르트산, Asp, D; 시스테인, Cys, C; 글루타민, Gln, Q; lu;E-글루탐산, Glu, E; 글리신, Gly, G; 히스티딘, His, H; 이소류신, Ile, I; 류신, Leu, L; 리신, Lys, K; 메티오닌, Met, M; 페닐알라닌, Phe, F; 프롤린, Pro, P; 세린, Ser, S; 트레오닌, Thr, T; 트립토판, Trp, W; 티로신, Tyr, Y; 발린, Val, V; 아스파르트산 또는 아스파라긴, Asx, B; 글루탐산 또는 글루타민, Glx, Z; 임의의 아미노산, Xaa, X.
본 발명은 아스파르틸 프로테아제의 간단한 활성 부위 모티프(motif)의 유전자 데이터베이스를 조사하는 방법을 기술한다. 펩신 및 레닌과 같은 진핵 아스파르틸 프로테아제는 2개의 아스파르틸 잔기가 활성 부위내에서 근접되도록 포개지는 2-도메인 구조를 갖는다. 이들은 짧은 3펩티드 모티프 DTG, 또는 더 드물게는 DSG에 내재한다. 대부분의 아스파르틸 프로테아제는 N-말단이 활성화를 위해 절단되어야 하는 전효소로서 존재한다. DTG 또는 DSG 활성 부위 모티프는 전효소(프로레닌, 펩시노젠)의 약 65 내지 70 잔기에서 나타나고, N-말단 프로도메인의 절단 후에는 활성 효소의 약 25 내지 30 잔기에서 나타난다. 활성 부위 모티프의 제한된 길이로 인해 신규한 아스파르틸 프로테아제의 짧은 발현 서열 표지(expressed sequence tag, EST)의 집합을 찾기가 어렵다. EST 서열은 전형적으로 평균 250개 이하의 뉴클레오티드이며, 따라서 80 내지 90개 이하의 아미노산 잔기를 코딩할 것이다. 이것은 두 활성 부위 모티프에 걸치기에는 너무 짧은 서열일 것이다. 바람직한 방법은 가정된 또는 조립된 단백질 코딩 서열의 데이터베이스를 조사하는 것이다. 본 발명은 단백질 서열 데이터베이스에서 후보 아스파르틸 프로테아제를 확인하는 컴퓨터 방법을 기술한다. 이 방법은 카에노르합디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans) 게놈에서 7개의 후보 아스파르틸 프로테아제 서열을 확인하는데 사용되었다. 이들 서열은 상동성 검색에 의해 Hu-Asp1 및 Hu-Asp2의 두 선택적인 접합 변이체(본원에서 Hu-Asp2(a) 및 Hu-Asp2(b)라고 부름)를 확인하는데 사용되었다.
본원에 개시된 본 발명의 주된 양상으로, 본 발명자들은 APP 프로세싱에 관한 새로운 정보를 제공한다. Aβ 경로를 거쳐 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 병원성 프로세싱은 β-세크레타제 및 γ-세크레타제로서 불리는 두 프로테아제의 연속 작용을 필요로 한다. β-세크레타제 및 γ-세크레타제에 의한 APP의 절단은 각각 Aβ 펩티드의 N-말단 및 C-말단을 생성한다. Aβ 펩티드의 생성에 걸쳐, 특히 Aβ1-42는 알츠하이머병의 개시에 관련되기 때문에, β-세크레타제 및(또는) γ-세크레타제의 저해제는 알츠하이머병의 치료에 가능성을 갖는다. APP의 병원성 프로세싱에서의 β-세크레타제 및 γ-세크레타제의 중요성에도 불구하고, 이들 효소의 분자 정의는 지금까지 이루어진 바 없다. 즉, β-세크레타제 또는 γ-세크레타제 절단 부위에서 절단하는데 무슨 효소가 필요한지가 알려져 있지 않다. APP가 알려져 있고, Aβ1-42 펩티드가 알려져 있기 때문에, 부위 자체는 알려져 있으며, 미국 특허 제5,766,846호 및 미국 특허 제5,837,672호(본원에 참조로 인용됨, "가용성" 펩티드에 관한 것은 제외)를 참조한다. 그러나, Aβ1-42 펩티드를 생성하는데 무슨 효소가 관련되었는지는 알려지지 않았다.
본 발명은 몇가지 신규한 인간 아스파르틸 프로테아제의 분자 정의를 포함하며, Hu-Asp-2(a) 및 Hu-Asp2(b)로 불리는 이들중 하나는 상세하게 특징화되었다. asp1 및 asp2의 이전 형태는 개시되었고, 스미쓰 클라인 비참 코포레이션(Smith Kline Beecham Corp.)에게 양도된 EP 제0848062 A2호 및 EP 제0855444 A2호(발명자 데이비드 파월(David Powel) 등)를 참조한다. 본원에는 Hu-Asp2의 구형태 및 신형태가 개시된다. 우선, 이들은 활성 형태로 표현되고, 이들의 기질이 개시되고, 이들의 특이성이 개시된다. 이 개시에 앞서, β-세크레타제 부위를 절단하기 위하여 세포 또는 세포 추출물이 필요하였고, 이제 정제된 단백질이 평가에 사용될 수 있고, 또한 본원에 기술된다. (1) 안티센스 녹 아웃(knock out) 실험, (2) 일시 트랜스펙션 녹 인(knock in) 실험 및 (3) 정제된 재조합 Hu-Asp-2를 사용한 생화학 실험의 결과를 근거로, 본 발명자들은 Hu-Asp-2가 APP의 프로세싱에 관련된 β-세크레타제임을 증명한다. Hu-Asp-2(a)의 뉴클레오티드 및 예상된 아미노산 서열은 보고되었지만(상기 참조, EP 제0848062 A2호 및 EP 제0855444 A2호 참조), 효소의 기능적 특징은 개시되지 않았다. 여기에서, 저자들은 Hu-Asp-2 효소를 특징화하고, 이 효소가 Aβ1-42 펩티드의 형성에서 중요하고 필요한 필수 효소인 이유 및 AD 의 진행에서의 가능한 중요한 단계를 설명할 수 있다.
다른 실시양태로, 본 발명은 또한 이전에는 전혀 개시된 바 없는 Hu-Asp2의신규한 접합 변이체(Hu-Asp-2(b)라고 함)를 기술한다.
다른 실시양태로, 본 발명은 인간 아스파르틸 프로테아제 1(Hu-Asp1) 및 인간 아스파르틸 프로테아제 2(Hu-Asp2)의 또 다른 두 접합 변이체(본원에서 Hu-Asp2(a) 및 Hu-Asp2(b)라고 함)로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 본원에 사용된 바와 같이, "Hu-Asp2"에 대한 모든 언급은 Hu-Asp2(a) 및 Hu-Asp2(b) 둘다를 언급하는 것으로 이해되어야 한다. Hu-Asp1은 췌장 및 전립선 조직에서 가장 풍부하게 발현되는 반면에, Hu-Asp2(a) 및 Hu-Asp2(b)는 췌장 및 뇌 조직에서 가장 풍부하게 발현된다. 본 발명은 또한 단리된 Hu-Asp1, Hu-Asp2(a) 및 Hu-Asp2(b) 폴리펩티드뿐만 아니라, 아스파르틸 프로테아제 활성을 나타내는 이들의 단편을 제공한다.
Hu-Asp1, Hu-Asp2(a) 및 Hu-Asp2(b)의 예상된 아미노산 서열은 펩시노젠 A, 펩시노젠 B, 카텝신 D, 카텝신 E 및 레닌과 같은, 이전에 확인된 포유동물 아스파르틸 프로테아제와 중요한 상동성을 공유한다(스젝(P. B. Szecs)의 문헌[Scand . J. Clin. Lab . Invest . 52:(Suppl. 2105-22(1922)]). 이들 효소는 이중 DTG/DSG 서열 모티프의 존재를 특징으로 한다. 본원에 개시된 Hu-Asp1 및 Hu-Asp2 폴리펩티드는 또한 스위스프로트(SwissProt) 데이터베이스로부터 발췌된 아스파르틸 프로테아제를 위한 프로사이트(ProSite) 공통 모티프와 매우 큰 상동성을 나타낸다.
서열 1의 1 내지 1554 잔기로서 제공된 뉴클레오티드 서열은 Hu-Asp1을 코딩 하는 뉴클레오티드 서열에 대응하고, 서열 3의 1 내지 1503 잔기로서 제공된 뉴클레오티드 서열은 Hu-Asp2(a)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대응하고, 서열 5의 1 내지 1428 잔기로서 제공된 뉴클레오티드 서열은 Hu-Asp2(b)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대응한다. Hu-Asp1, Hu-Asp2(a) 및 Hu-Asp2(b)를 코딩하는 DNA의 단리 및 서열결정은 실시예 1 및 2에서 이하 기술한다.
실시예 1 및 2에서 기술된 바와 같이, Hu-Asp1, Hu-Asp2(a) 및 Hu-Asp-2(b)의 뉴클레오티드 서열을 얻기 위하여 자동 서열결정 방법을 사용하였다. 본 발명의 Hu-Asp 뉴클레오티드 서열은 두 DNA 쇄에 대하여 얻었으며, 100% 정확한 것으로 생각된다. 그러나, 당업계에 알려진 바와 같이, 이러한 자동 방법에 의해 얻어진 뉴클레오티드 서열은 약간의 오류를 함유할 수 있다. 자동화에 의해 결정된 뉴클레오티드 서열은 주어진 핵산 분자의 실제 뉴클레오티드 서열과 전형적으로 약 90% 이상, 더 전형적으로 약 95% 내지 약 99.9% 이상 동일하다. 실제 서열은 당업계에 잘 알려진 수동 서열결정 방법을 사용하여 더 상세하게 결정될 수 있다. 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입 또는 결손을 가져오는 서열의 오류는 판독시 프레임 변환을 가져올 수 있어 예상된 아미노산 서열은 돌연변이 지점에서 시작하는 핵산 분자의 실제 뉴클레오티드 서열로부터 예상할 수 있는 것과는 상이할 것이다. 본 발명의 Hu-Asp DNA로는, cDNA, 화학 합성된 DNA, PCR에 의해 단리된 DNA, 게놈 DNA 및 이들의 혼합이 있다. 게놈 Hu-Asp DNA는 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 본원에 기술된 Hu-Asp2 cDNA로 또는 중합효소 연쇄반응(PCR)을 촉진할 Hu-Asp2 서열로부터 선택된 올리고뉴클레오티드로 게놈 라이브러리를 선별함으로써 얻어질 수 있다. Hu-Asp DNA로부터 전사된 RNA도 또한 본 발명에 의해 포함된다.
유전자 암호의 변질로 인하여, 두 DNA 서열은 상이할 수 있으나 동일한 아미노산 서열을 코딩할 수 있다. 따라서 본 발명은 본 발명의 임의의 Hu-Asp 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 단리된 핵산 분자를 제공하는데, 이때 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 2, 서열 4, 서열 6 또는 이들의 단편의 완전 아미노산 서열을 갖는 Hu-Asp 폴리펩티드를 코딩한다.
본원에는 또한 정제된 Hu-Asp 폴리펩티드(재조합 및 비재조합)가 제공된다. 가장 중요하게는, 활성 형태의 Hu-Asp2 폴리펩티드를 생성하는 방법이 제공된다. 이들은 박테리아 세포, 곤충 세포 및 포유동물 세포에서의 Hu-Asp2 폴리펩티드 및 그의 변이체의 생성, 박테리아, 곤충 또는 포유동물 세포로부터 배양 배지로의 Hu-Asp2 폴리펩티드의 분비를 허용하는 형태의 생성, 및 후속 정제를 용이하게 하는 아미노산 표지가 도입된 Hu-Asp2 폴리펩티드의 변이체를 생성하는 방법을 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시양태로, Hu-Asp2 폴리펩티드는 형질전환된 세포에서 또는 무세포 시스템에서 다른 프로테아제에 의해 정제 및 절단된 후에 단백질분해 활성 형태로 전환되며, Hu-Asp2 폴리펩티드의 그러한 활성 형태는 N-말단 서열 TQHGIR(서열 56) 또는 ETDEEP(서열 57)로 시작한다. Hu-Asp의 임의의 생물학적 활성을 보유하는 서열 2, 서열 4 및 서열 6에 제공된 천연 아미노산 서열을 갖는 Hu-Asp 단백질의 변이체 및 유도체(단편 포함)도 또한 본 발명의 범주내에 포함된다. 물론, 당업자라면 변이체, 유도체 또는 단편을 표준의 아스파르틸 프로테아제 평가에 적용함으로써 Hu-Asp 단백질의 변이체, 유도체 또는 단편이 Hu-Asp 활성을 나타 내는지를 쉽게 결정할 수 있을 것이다. 본 발명의 범주내에 포함되는 Hu-Asp의 단편은 아미노산 서열 DTG를 함유하는 활성 부위 도메인을 함유하는 것, 활성 부위 도메인 아미노산 서열 DSG를 함유하는 단편, DTG 및 DSG 활성 부위 서열을 함유하는 단편, DTG 및 DSG 활성 부위 서열의 공간이 늘려진 단편, 공간이 축소된 단편을 포함한다. 또한 가용성 형태의 Hu-Asp2가 생성되도록 막횡단 도메인이 제거된 Hu-Asp의 단편도 본 발명의 범주내에 포함된다. 본 발명의 다른 실시양태로, 각각 하나의 활성 부위 DTG 또는 DSG 서열을 함유하는 Hu-Asp2의 두 절반은 재조합 폴리펩티드로서 독립적으로 생성될 수 있어서, 이들이 활성 프로테아제를 재구성하는 용액에서 혼합된다.
Hu-Asp 변이체는, 예를 들어 천연 Hu-Asp-코딩 뉴클레오티드 서열을 돌연변이함으로써 얻어질 수 있다. 본원에서 언급한 Hu-Asp 변이체는, 아미노산 서열의 하나 이상의 결손, 삽입 또는 치환때문에, 천연 Hu-Asp와는 상이한 아미노산 서열을 갖는 천연 Hu-Asp 폴리펩티드에 실질적으로 상동성인 폴리펩티드이다. 변이체 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 천연 Hu-Asp 서열과 약 80% 이상, 더 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95% 이상 동일하다. 따라서, 예를 들어 천연 Hu-Asp 유전자에 비하여 매 100 뉴클레오티드마다 5 곳의 돌연변이를 함유하는 변이체 뉴클레오티드 서열은 천연 단백질에 95% 동일할 것이다. 상동성으로도 불리는 천연 및 변이체 Hu-Asp 서열간의 서열 동일성의 비율은 또한, 예를 들어 이 목적을 위해 일반적으로 사용되는 임의의 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 스미쓰(Smith) 및 워터맨(Waterman)의 알고리듬(문헌[Adv . Appl . Math . 2:482- 489(1981)])을 사용하는 갭(Gap) 프로그램(미국 위스콘신주 매디슨 유니버시티 리서치 파크 소재의 지네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)의 위스콘신 서열 분석 패키지(Wisconsin Sequence Analysis Package, 유닉스(Unix)용 버젼 8)을 사용하여 두 서열을 비교함으로써 결정될 수 있다.
천연 아미노산 서열의 변경은 임의의 다수의 공지의 기법에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 왈더(Walder) 등의 문헌[Gene 42:133(1986)]; 바우어(Bauer) 등의 문헌[Gene 37:73(1985)]; 크라이크(Craik)의 문헌[BioTechniques, 1985년 1월, pp.12-19]; 스미쓰 등의 문헌[Genetic Engineering : Principles and Mehtods , Plenum Press(1981)]; 및 미국 특허 제4,518,584호 및 제4,737,462호에 기술된, 올리고뉴클레오티드-지향성 돌연변이 발생과 같은 당업자에게 잘 알려진 과정에 의해 특정 위치에서 도입될 수 있다.
본 발명의 범주내에 포함되는 Hu-Asp 변이체은 보존적으로 치환된 서열을 포함할 수 있는데, 이것은 Hu-Asp 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기가 Hu-Asp 폴리펩티드의 2차 및(또는) 3차 구조를 변화시키지 않는 상이한 잔기에 의해 대체됨을 뜻한다. 이러한 치환은 유사한 생화학적 특성을 갖는 잔기에 의한 아미노산의 대체, 예를 들어 하나의 지방족 잔기(Ile, Val, Leu 또는 Ala)를 다른 것으로 치환하거나 또는 염기성 잔기 Lys와 Arg간, 산성 잔기 Glu와 Asp간, 아미드 잔기 Gln과 Asn간, 히드록실 잔기 Ser과 Tyr간, 또는 방향족 잔기 Phe과 Tyr간의 치환을 포함할 수 있다. 형질적으로 잠재성 있는 아미노산 교환에 관한 추가의 정보는 보위(Bowie) 등의 문헌[Science 247:1306-1310(1990)]에서 찾을 수 있다. Hu-Asp의 생물학적 활성을 실질적으로 보유할 수 있는 다른 Hu-Asp 변이체는 아미노산 치환이 단백질의 기능 영역밖의 구역에서 이루어진 것이다.
다른 양상으로, 본 발명은 엄격 조건하에 전술한 핵산 분자중 하나의 전술한 핵산 분자의 일부, 예컨대 약 15개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 20개 이상의 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 약 30개 이상의 뉴클레오티드, 더욱 더 바람직하게는 약 30 내지 약 100개 이상의 뉴클레오티드에 혼성화되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 전술한 길이를 갖는 이러한 일부의 핵산 분자는, 예컨대 기준 핵산 분자의 약 15개 이상의 연속 뉴클레오티드를 가리킨다. 엄격 혼성화 조건이란, 6 X SSC/0.1% SDS에서 약 2.5시간동안 약 42℃에서 밤새 배양하고, 65℃, 0.1% SDS에서 1.0 X SSC에서 여과기를 세척하는 것이다.
본원에 기술된 Hu-Asp-코딩 핵산 분자의 단편, 및 이러한 핵산 분자에 혼성화될 수 있는 폴리뉴클레오티드는 중합효소 연쇄반응(PCR)에서 프로브 또는 프라이머로서 사용될 수 있다. 이러한 프로브는, 예컨대 시험관내 평가는 물론 서던 및 노던 블롯에서 Hu-Asp 핵산의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. Hu-Asp를 발현하는 세포 유형은 또한 이러한 프로브의 사용에 의해 확인될 수 있다. 이러한 절차는 잘 알려져 있으며, 당업자라면 특정 용도에 적합한 길이의 프로브를 선택할 수 있을 것이다. PCR에 있어서, 바람직한 Hu-Asp 핵산 분자의 말단에 대응하는 5' 및 3' 프라이머는 통상의 기법을 사용하여 그 서열을 단리하고 증폭하는데 사용될 수 있다.
Hu-Asp 핵산 분자의 다른 유용한 단편은 표적 Hu-Asp mRNA(센스 쇄를 사용하 여) 또는 Hu-Asp DNA(안티센스 쇄를 사용하여) 서열에 결합할 수 있는 1쇄 핵산 서열을 포함하는 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드이다. 본 발명의 바람직한 실시양태로, 이들 Hu-Asp 안티센스 올리고뉴클레오티드는 Hu-Asp mRNA 및 결과로서 일어나는 Hu-Asp 폴리펩티드의 생성을 감소시킨다.
다른 양상으로, 본 발명은 관련된 천연 패턴의 글리코실화의 존재 또는 부재하의 Hu-Asp 폴리펩티드를 포함한다. Hu-Asp1 및 Hu-Asp2는 둘다 Asn-결합된 당의 표준 수용체 부위를 갖는데, Hu-Asp1은 이러한 부위를 2개 가지고, Hu-Asp2는 4개 갖는다. 효모 또는 포유동물 발현 시스템(이하 논의됨)에서 발현된 Hu-Asp는 분자량 및 글리코실화 패턴에서 천연 Hu-Asp 폴리펩티드와 유사하거나 또는 그와 상당히 상이할 수 있다. 박테리아 발현 시스템에서의 Hu-Asp의 발현은 비글리코실화된 Hu-Asp를 제공할 것이다.
본 발명의 폴리펩티드는 바람직하게는 단리된 형태로 제공되며, 바람직하게는 실질적으로 정제된다. Hu-Asp 폴리펩티드는 조직, 배양 세포 또는 재조합 세포 배양물로부터 회수되어 암모늄 술페이트 또는 에탄올 침전, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로즈 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 렉틴 크로마토그래피 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 포함한 잘 알려진 방법에 의해 정제될 수 있다. 바람직한 실시양태로, 아미노산 표지는 적합한 지지체에 고정화된 니켈, 다클론성 또는 단클론성 항체의 에피토프(비제한적인 예로서 T7 에피토프), myc 에피토프, 및 V5a 에피토프에의 결합 및 Hu-Asp2의 적합한 단백질 상대(비제한 적인 예로서 글루타티온-S-트랜스페라제 또는 말토즈 결합 단백질)에의 융합에 의한 정제를 허용하도록 6 히스티딘 아미노산 잔기를 첨가함을 포함하는, 당업자에게 잘 알려진 유전공학 기법을 사용하여 Hu-Asp 폴리펩티드에 첨가된다. 바람직한 실시양태로, 이들 추가의 아미노산 서열은 Hu-Asp의 C-말단에 첨가되지만, N-말단 또는 Hu-Asp2 폴리펩티드내의 중간 위치에 첨가될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 벡터 및 이러한 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명의 임의의 폴리뉴클레오티드 분자는 숙주에서 증식하기 위한 선택성 표지 유전자(marker) 및 복제 원점을 일반적으로 포함하는 벡터에 연결될 수 있다. 본 발명은 또한 전술한 폴리뉴클레오티드 분자로부터 발현된 Hu-Asp 폴리펩티드를 제공하기 때문에, Hu-Asp의 발현을 위한 벡터가 바람직하다. 벡터는 적합한 전사 또는 판독 조절 서열, 예를 들어 포유동물, 미생물, 비루스 또는 곤충 유전자로부터 유도된 서열에 작동가능하게 연결된, 전술 또는 후술되는 임의의 Hu-Asp 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함한다. 조절 서열의 예로는 전사 프로모터, 작동인자 또는 증진자, mRNA 리보솜 결합 부위, 및 전사 및 판독을 제어하는 적당한 서열이 있다. 뉴클레오티드 서열은 조절 서열이 기능적으로 Hu-Asp를 코딩하는 DNA에 관련될 때 작동가능하게 연결된다. 따라서, 프로모터 뉴클레오티드 서열은 프로모터 뉴클레오티드 서열이 Hu-Asp 서열의 전사를 지시하는 경우 Hu-Asp DNA 서열에 작동가능하게 연결된다.
Hu-Asp를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자의 클로닝 또는 Hu-Asp 폴리펩티드의 발현에 사용되는 적합한 벡터의 선택은 물론 벡터가 형질전환될 숙주 세포 및 적용가능한 경우 Hu-Asp 폴리펩티드가 발현될 숙주 세포에 따라 좌우될 것이다. Hu-Asp 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포로는 원핵생물, 효모 및 고등 진핵생물이 있으며, 이들은 각각 이하에 논의된다.
이러한 숙주 세포에서 발현될 Hu-Asp 폴리펩티드는 또한 이종 단백질로부터의 영역을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 이러한 영역은, 예컨대 폴리펩티드의 분비, 개선된 안정성 또는 용이한 정제를 허용하도록 포함될 수 있다. 예를 들어, 적당한 신호 펩티드를 코딩하는 서열이 발현 벡터에 도입될 수 있다. 신호 펩티드(분비 리더)의 DNA 서열은 Hu-Asp가 신호 펩티드를 포함하는 융합 단백질로서 판독되도록 Hu-Asp 서열에 프레임내 융합될 수 있다. 의도하는 숙주 세포에서 작용성인 신호 펩티드는 Hu-Asp 폴리펩티드의 세포외 분비를 촉진한다. 바람직하게는, 신호 서열은 세포로부터의 Hu-Asp의 분비시 Hu-Asp 폴리펩티드로부터 절단될 것이다. 본 발명의 실시에 사용될 수 있는 신호 서열의 비제한적인 예로는 효모 I-인자 및 sf9 곤충 세포의 꿀벌 멜라틴 리더가 있다.
바람직한 실시양태로, Hu-Asp는 폴리펩티드의 정제를 용이하게 하는데 사용된 이종 영역을 포함하는 융합 단백질일 것이다. 이러한 기능에 사용된 많은 이용가능한 펩티드는 융합 단백질이 결합 상대에 선택적으로 결합하게 한다. 예를 들어, Hu-Asp 폴리펩티드는 결합 상대에 특이적으로 결합하는 융합 단백질을 형성시키는 펩티드, 또는 펩티드 표지를 포함하도록 수식될 수 있다. 이러한 펩티드 표지의 비제한적인 예로는 6-His 표지, 티오레독신 표지, 헤마글루티닌 표지, GST 표지 및 OmpA 신호 서열 표지가 있다. 당업자라면 이해하겠지만, 펩티드를 인식하여 결합하는 결합 상대는 금속 이온(예컨대, 금속 친화성 칼럼), 항체 또는 그의 단편을 포함하는 임의의 분자 또는 화합물, 및 펩티드에 결합하는 임의의 단백질 또는 펩티드(예: FLAG 표지)일 수 있다.
Hu-Asp 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포로는 원핵생물, 효모 및 고등 진핵 세포가 있다. Hu-Asp의 발현에 사용되기에 적합한 원핵 숙주로는 에세리히아(Escherichia), 바실루스(Bacillus) 및 살모넬라(Samonella) 속뿐만 아니라 슈도모나스(Pseudomonas), 스트렙토미세스(Streptomyces) 및 스태필로코쿠스(Staphylococcus) 속의 박테리아가 있다. 예컨대, 이. 콜라이에서의 발현에 있어서, Hu-Asp 폴리펩티드는 원핵 숙주에서의 재조합 폴리펩티드의 발현을 용이하게 하도록 N-말단 메티오닌 잔기를 포함할 수 있다. N-말단 Met는 임의로는 발현된 Hu-Asp 폴리펩티드로부터 절단될 수 있다. T7 리더 서열, T7-카스파제 8 리더 서열 및 정제를 위한 표지(예: 6-His 표지)를 포함하는 다른 리더를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다른 N-말단 아미노산 잔기를 Hu-Asp 폴리펩티드에 첨가하여 에세리히아 콜리에서의 발현을 용이하게 할 수 있다(실시예 9). 이 콜리에서 발현된 Hu-Asp 폴리펩티드는 세포질 꼬리, 막횡단 도메인 또는 막 근접 영역의 제거에 의해 짧아질 수 있다. 이 콜리에서 발현된 Hu-Asp 폴리펩티드는 가용성 형태, 또는 봉입체로서 존재하거나 존재하지 않을 수 있는 불용성 형태로서 얻어질 수 있다. 불용성 폴리펩티드는 구아니딘 HCl, 우레아 또는 다른 단백질 변성제에 의해 가용성으로 될 수 있고, 적합한 수성 완충제로의 희석 또는 투석에 의해 정제 전 또는 후에 가용성 형태로 다시 포개질 수 있다. Hu-Asp의 불활성 후형태가 재조합 방법을 사용하여 생성되면, 인간 면역결핍 비루스 프로테아제와 같은 다른 적합한 프로테아제로 후단편을 절단함으로써 활성으로 될 수 있다.
원핵 숙주에 사용하기 위한 발현 벡터는 일반적으로 하나 이상의 형질 선택성 표지 유전자를 포함한다. 이러한 유전자는 일반적으로, 예컨대 항생물질 내성을 제공하거나 영양요구 요건을 보충하는 단백질을 코딩한다. 이러한 광범위한 벡터는 시중 공급원으로부터 쉽게 입수할 수 있다. 예로는 pSPORT 벡터, pGEM 벡터(프로메가(Promega)), pPROEX 벡터(미국 메릴랜드주 베데스다 소재의 LTI), Bluescript 벡터(스트라타진(Stratagene)), pET 벡터(노바젠(Novagen)) 및 pQE 벡터(퀴아젠(Qiagen))이 있다.
Hu-Asp는 또한 사카로미세스(Saccharomyces), 피키아(Pichia) 및 클루베로미세스(Kluveromyces)를 포함하는 속의 효모 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 바람직한 효모 숙주는 에스 세레비지아에(S. cerevisiae) 및 피 파스토리스(P. pastoris)이다. 효모 벡터는 종종 2T 효모 플라스미드의 복제 서열의 원점, 자율 복제 서열(ARS), 프로모터 영역, 폴리아데닐화를 위한 서열, 전사 종료를 위한 서열 및 선택성 표지 유전자를 함유할 것이다. 효모 및 이 콜리 둘다에서 복제가능한 벡터(셔틀 벡터(shuttle vector)라고 함)도 또한 사용될 수 있다. 효모 벡터의 전술한 특징 이외에, 셔틀 벡터는 또한 이 콜리에서의 복제 및 선택을 위한 서열을 포함할 것이다. 효모 숙주에서 발현된 Hu-Asp 폴리펩티드의 직접 분비는 Hu-Asp 코딩 뉴클레오티드 서열의 5' 말단에서 효모 I-인자 리더 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 포함에 의해 이루어질 수 있다.
Hu-Asp 폴리펩티드의 발현을 위해 곤충 숙주 세포 배양 시스템이 또한 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태로, 본 발명의 Hu-Asp 폴리펩티드는 곤충 세포 시스템을 사용하여 발현된다(실시예 10 참조). 또한, 루코우(Luckow) 및 서머스(Summers)의 문헌[Bio/Technology 6:47(1988)]에 의해 검토된 바와 같이 곤충 세포에서의 발현을 위해 바쿨로비루스(baculovirus) 발현 시스템이 사용될 수 있다.
다른 바람직한 실시양태로, Hu-Asp 폴리펩티드는 포유동물 숙주 세포에서 발현된다. 적합한 포유동물 세포주의 비제한적인 예로는 원숭이 신장 세포의 COS-7 세포주 (글루즈만(Gluzman) 등의 문헌[Cell 23:175(1981)]), 인간 배아 신장 세포주 293 및 챠이니즈 햄스터 난소(Chinese hamster ovary, CHO) 세포가 있다. 바람직하게는, 챠이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포가 Hu-Asp 단백질의 발현을 위해 사용된다(실시예 11).
본 발명의 Hu-Asp 폴리펩티드의 발현에 적합한 발현 벡터의 선택은 물론 사용될 특정 포유동물 숙주 세포에 따라 좌우될 것이며, 당업자의 기술에 포함된다. 적합한 발현 벡터의 예로는 pcDNA3(인비트로젠(Invitrogen)) 및 pSVL(파마시아 바이오테크(Pharmacia Biotech))이 있다. Hu-Asp 폴리펩티드의 발현에 바람직한 벡터는 pcDNA3.1-Hygro(인비트로젠)이다. 포유동물 숙주 세포에 사용하기 위한 발현 벡터는 비루스 게놈으로부터 유도된 전사 및 판독 제어 서열을 포함할 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 일반적으로 사용되는 프로모터 서열 및 증진자 서열의 비제한적인 예로는 인간 사이토메갈로비루스(CMV), 아데노비루스 2, 폴리오마 비루스 및 시미안 비루스 40(SV40)으로부터 유도된 것이 있다. 포유동물 발현 벡터의 구성 방법은, 예를 들어 오카야마(Okayama) 및 베르크(Berg)의 문헌[Mol . Cell . Biol. 3:280(1983)]; 코스만(Cosman) 등의 문헌[Mol . Immunol . 23:935(1986)]; 코스만 등의 문헌[Nature 312:768(1984)]; EP-A-0367566호 및 WO 91/18982호에 개시되어 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 또한 Hu-Asp 폴리펩티드 발현을 검출하기 위한 진단 평가에 유용한 다클론성 및 단클론성 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 이러한 항체는 통상의 기법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Antibodies : A Laboratory Manual, Harlow and Land(eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., (1988)]; 문헌[Monoclonal Antibodies , Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al. (eds), Plenum Press, New York(1980)]을 참조한다. 5 내지 20개 아미노산을 함유하는 Hu-Asp의 일부를 포함하는 합성 펩티드는 카르보디이미드, 글루타르알데히드, 또는 펩티드가 시스테인을 함유하는 경우 N-메틸말레이미드를 포함하는 다양한 가교결합제를 사용하여 적합한 캐리어 단백질(비제한적인 예로서 키홀 림피트 헤마시아닌(keyhole limpet hemacyanin, KLH), 닭 오브알부민 또는 소 혈청 알부민 등)에 연결된 후 다클론성 또는 단클론성 항체의 생성에 사용될 수 있다. KLH에 결합될 때 면역에 바람직한 펩티드는 QRRPRDPEVVNDESSLVRHRWK(서열 50) 또는 LRQQHDDFADDISLLK(서열 51)를 각각 포함하는 Hu-Asp1 또는 Hu-Asp2의 C-말단을 함유한다.
본 발명의 Hu-Asp 핵산 분자는 인간 염색체의 특정 위치와 혼성화될 수 있기 때문에 또한 염색체 확인에 중요하다. Hu-Asp1은 염색체 21에 존재하는 반면에, Hu-Asp2는 염색체 11q23.3-24.1에 존재하였다. 실제 서열 데이터(반복 다형성)를 기본으로 하는 염색체 표지 시약은 염색체 장소를 표지하는데 현재 이용가능한 것이 거의 없기 때문에 현재 염색체의 특정 부위를 확인할 필요가 있다. 일단 서열이 정확한 염색체 위치에 맵핑(mapping)되면, 염색체상의 서열의 물리적 위치는 유전 지도 데이타와 관련될 수 있다. 동일한 염색체 영역에 맵핑된 유전자와 질병 사이의 관계는 연결 분석을 통해 확인될 수 있고, 연결 분석에서 물리적으로 인접한 유전자의 접합성이 결정된다. 특정 질병에 관련된 것으로 보이는 유전자가 사실 그 질병의 원인인지의 여부는 감염 및 비감염 환자 사이의 핵산 서열을 비교함으로써 결정될 수 있다.
다른 실시양태로, 본 발명은 Hu-Asp 기능, 특히 Hu-Asp2 기능을 분석하는 방법에 관한 것으로, Hu-Asp 단백질 분해 활성의 척도로서 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 모니터링되는 펩티드의 절단을 사용하여 APP의 β-세크레타제 절단 부위를 함유하는 합성 펩티드, 바람직하게는 유전된 AD를 갖는 스웨덴 친족에서 발견되는 돌연변이를 함유하는 것(이때 KM은 NL로 변함)(이러한 펩티드는 산성 완충액, 바람직하게는 pH 5.5의 산성 완충액(실시예 12)내에 서열 SEVNLDAEFR(서열 54)을 포함함)을 포함하는(이에 제한되지 않음) 적합한 기질과 함께 Hu-Asp 폴리펩티드를 용액중에서 배양함을 포함한다. 단백질 분해 활성의 바람직한 분석은 내부 반응정지된 펩티드 분석 기질을 사용한다. 이러한 적합한 기질은 짝진 플루오로포어와 반응정지제(비제한적인 예로서 각각 쿠마린 및 디니트로페놀)를 결합시킨 펩디드를 포함하여, Hu-Asp에 의한 펩티드의 절단에 의해 플루오로포어와 반응정지제의 물리적 분리로 인한 증가된 형광이 생긴다. Hu-Asp 단백질 분해 활성의 바람직한 비색 분석은 아미드 연결을 통해 o-니트로페놀에 연결된 절단을 위한 인식 부위를 포함하는 P2 및 P1 아미노산을 포함하는 다른 적합한 기질을 이용하여, 분석 완충제를 알칼리성 pH로 변화시킨 후 Hu-Asp에 의한 절단에 의해 광학 밀도가 증가한다.
다른 실시양태로, 본 발명은 (a) 시험 물질의 존재하에 및 시험 물질의 부재하에 Hu-Asp 폴리펩티드의 활성을 결정하고; (b) 시험 물질의 존재하에 결정된 Hu-Asp 폴리펩티드의 활성을 시험 물질의 부재하에 결정된 Hu-Asp 폴리펩티드의 활성과 비교함을 포함하는, Hu-Asp1, Hu-Asp2(a) 및 Hu-Asp2(b)로 이루어진 군에서 선택된 Hu-Asp 폴리펩티드의 활성을 증가시키는 물질의 확인을 위한 방법에 관한 것으로, 이로써 시험 물질의 부재하에서보다 시험 물질의 존재하에서의 더 큰 활성은 시험 물질이 Hu-Asp 폴리펩티드의 활성을 증가시켰음을 나타낸다. 이러한 시험은 무세포 시스템에서 Hu-Asp 폴리펩티드 및 Hu-Asp 및 그의 변이체 또는 이소폼을 발현하는 배양 세포로 수행될 수 있다.
다른 실시양태로, 본 발명은 (a) 시험 물질의 존재하에 및 시험 물질의 부재하에 Hu-Asp 폴리펩티드의 활성을 결정하고; (b) 시험 물질의 부재하에 결정된 Hu-Asp 폴리펩티드의 활성을 시험 물질의 존재하에 결정된 Hu-Asp 폴리펩티드의 활성과 비교함을 포함하는, Hu-Asp1, Hu-Asp2(a) 및 Hu-Asp2(b)로 이루어진 군에서 선택된 Hu-Asp 폴리펩티드의 활성을 감소시키는 물질의 확인을 위한 방법에 관한 것으로, 이로써 시험 물질의 부재하에서보다 시험 물질의 존재하에서의 더 작은 활성 은 시험 물질이 Hu-Asp 폴리펩티드의 활성을 감소시켰음을 나타낸다. 이러한 시험은 무세포 시스템에서 Hu-Asp 폴리펩티드 및 Hu-Asp 및 그의 변이체 또는 이소폼을 발현하는 배양 세포로 수행될 수 있다.
다른 실시양태로, 본 발명은 아밀로이드 단백질 전구체(APP)로부터 아밀로이드 β 펩티드(Aβ)의 프로세싱을 측정하기 위한 신규 세포주(HEK125.3 세포)에 관한 것이다. 세포는 제2 시스트론에 수식된 인간 APP cDNA, 내부 리보솜 진입 부위 및 증진된 녹색 형광 단백질(EGFP) cDNA를 함유하는 pIRES-EGFP(클론테크(Clontech))로부터 유도된 양시스트론성 벡터에 의한 인간 배아 신장 293 세포(HEK293)의 안정한 형질전환체이다. APP cDNA는 APP 코딩 서열의 카르복실 말단에 2개의 리신 코돈을 첨가함으로써 수식되었다. 이는 인간 APP로부터 Aβ 펩티드의 프로세싱을 2 내지 4배 증가시킨다. Aβ펩티드 프로세싱의 수준은 비형질전환된 HEK293 세포에서 나타나는 것보다 60배 더 높다. HEK125.3 세포는 Aβ 펩티드 프로세싱을 저해하는 화합물의 평가에 유용할 것이다. 본 발명은 또한 751 내지 770 아미노산 이소폼을 포함하는 다른 APP 이소폼의 C-말단, 스웨덴 KM→NL 및 V717→F 돌연변이를 포함하는 인간 AD에서 발견되는 돌연변이를 갖는 APP의 이소폼, APP의 C-말단 단편(예: β-세크레타제 절단 부위로 시작하는 것), 막 삽입 및 분비를 위한 N-말단 신호 펩티드에 작동가능하게 연결된 β-세크레타제 절단 부위를 함유하는 APP의 C-말단 단편, 및 막 삽입 및 분비를 위한 N-말단 신호 펩티드 및 리포터 서열(비제한적인 예로서 녹색 형광 단백질 또는 알칼리성 포스파타제)에 작동가능하게 연결된 APP의 C-말단 단편에 2개의 리신 잔기를 첨가하여, β-세크레타제 절 단에 의해 폴리펩티드를 발현하는 세포의 표면으로부터 리포터 단백질을 유리시킴을 포함한다.
본 발명에 일반적으로 기술되었지만, 동일 내용은 하기의 실시예를 참조로 더쉽게 이해될 것이며, 실시예는 설명의 목적으로 제공되고 제한하려는 것은 아니다.
<실시예>
실시예 1: 아스파르틸 프로테아제의 확인 및 Wormpep 12에서 씨 엘레간스(C. elegans) 아스파르틸 프로테아제 유전자의 확인에 유용한 검색 알고리듬의 개발:
재료 및 방법:
펩신 및 레닌과 같은 전통적인 아스파르틸 프로테아제는 활성 부위내에서 두 아스파르틸 잔기가 근접되게 포개지는 2-도메인 구조를 갖는다. 이들은 짧은 3펩티드 모티프 DTG 또는 더 드물게는 DSG에 내재된다. DTG 또는 DSG 활성 부위 모티프는 효소에서 약 25 내지 30 잔기에서, 전효소(프로레닌, 펩시노젠)에서는 약 65 내지 70 잔기에서 보인다. 이 모티프는 다시 하류 약 150 내지 200 잔기에서 다시 나타난다. 전효소는 N-말단 프로도메인의 절단에 의해 활성화된다. 이러한 패턴은 유전자 복제 및 분기에 의해 분명히 발생하는 오늘날 아스파르틸 효소의 이중 도메인 구조를 예시한다. 따라서, NH2-----------X--------D25TG---------Y-------DY+25TG----------------C(이때, X는 N-말단 프로도메인 뒤에 오는 효소의 시작을 나타내고, Y는 유전자 반복이 다시 시작하는 분자의 중앙을 나타냄).
HIV 프로테아제와 같은 레트로비루스 효소의 경우에서, 이들은 펩신, 카텝신 D, 레닌 등과 같은 잘 알려진 효소의 2-도메인 구조의 절반만을 대표한다. 이들은 전단편을 갖지 않지만, 비루스의 gag 및 pol 단백질을 함유하는 폴리단백질 전구체를 분할한다. 이들은 NH2--------D25TG-----------C100으로 표현될 수 있다. 오직 이 "단량체"만이 약 100aa를 가져서, N-말단 프로도메인은 계수하지 않고 330개 정도의 aa를 갖는 다른 아스파르틸 프로테아제 "이량체"에 비하여 극히 근소하다.
진핵 아스파르틸 프로테아제 활성 부위 모티프의 제한된 길이로 인해 신규 서열의 EST 집합을 검색하기가 어렵다. EST 서열은 전형적으로 평균 250개 뉴클레오티드이고, 따라서 이 경우 두 아스파르틸 프로테아제 활성 부위 모티프에 걸칠 가능성이 없을 것이다. 대신에, 본 발명자들은 씨 엘레간스 게놈으로 주위를 돌렸다. 씨 엘레간스 게놈은 약 13,000개의 유전자를 갖는 것으로 추정된다. 물론, 대개 12,000개는 서열이 밝혀졌으며, 대응하는 가정 오픈 리딩 프레임(ORF)은 데이터베이스 Wormpep12에 있다. 본 발명자들은 이 데이터베이스를 신규 아스파르틸 프로테아제를 위한 고등 진핵생물의 전체 게놈 조사의 토대로서 사용하였는데, 본 발명자들은 이 목적을 위해 특별히 개발한 알고리듬을 사용하였다. 두 DTG 또는 DSG 모티프를 함유하는 단백질을 위치시키기 위한 하기의 AWK 스크립트를 검색에 사용하였는데, 아스파르틸 모티프의 모든 짝지음 결합을 회복하기 위하여 4회 반복하였다.
BEGIN{RS=">"} /*defines ">" as record separator for FASTA format*/
{
pos=index($0, "DTG") /*finds "DTG" in record*/
if(pos>0){
rest=substr($0,pos+3) /*get rest of record after first DTG*/
pos2=index(rest,"DTG") /*find second DTG*/
if(pos2>0) printf("%s%s＼n",">",$0)} /*report hits*/
}
}
상기 나타낸 AWK 스크립트를 사용하여 둘 이상의 DTG 또는 DSG 모티프를 함유하는 서열 입력을 위하여 Wormpep12를 검색하였는데, Wormpep12는 ftp.sanger.ac.uk/pub/databases/wormpep로부터 내려받았다. AWK를 사용하여 각 기록을 3000개 이하의 문자로 제한하였다. 따라서, 35개 이상의 기록은 이들이 아스파르틸 프로테아제를 코딩할 가능성이 없었던 임의의 경우에서와 같이 Wormpep12로부터 수동으로 제거되었다.
결과 및 논의:
Wormpep12 데이타베이스는 12,178개 항목을 함유하지만, 이들중 일부(<10%)는 동일한 유전자로부터 선택적으로 접합된 전사를 대표한다. 씨 엘레간스 게놈에서 코딩된 유전자의 수를 어림하면 13,000개 정도의 유전자이며, 따라서 Wormpep12는 씨 엘레간스 게놈의 90%보다 많이 포함하는 것으로 추정할 수 있다.
진핵 아스파르틸 프로테아제는 아마도 원종 유전자 복제로부터 발생한 2-도메인 구조를 함유한다. 각 도메인은 각 도메인내로 20 내지 25 아미노산 잔기로부터 위치한 활성 부위 모티프 D(S/T)G를 함유한다. 레트로비루스(예컨대, HIV 프로테아제) 또는 레트로트랜스포손 프로테아제는 하나의 진핵 아스파르틸 프로테아제 도메인과 상동성인 하위 단위체의 동형이량체이다. AWK 스크립트를 사용하여 D(S/T)G 모티프가 2번 이상 나타난 단백질에 대하여 Wormpep12 데이터베이스를 검색하였다. 이로써 두 DTG 또는 DSG 모티프를 갖는 >60 단백질을 확인하였다. 시각 검사를 사용하여 아스파르틸 도메인의 위치가 전술한 기준에 맞는 2-도메인 구조를 나타낸 단백질을 선택하였다.
또한, PROSITE 진핵 및 비루스 아스파르틸 프로테아제 활성 부위 패턴 PS00141을 사용하여 아스파르틸 프로테아제 후보에 대하여 Wormpep12를 검색하였다. (바이로치(Bairoch A.), 부커(Bucher P.), 호프만(Hofmann K.)의 문헌[The PROSITE database: its status in 1997, Nucleic Acids Res . 24:217-221(1997)]). 이것은 Wormpep12 서열의 중복 세트를 생성하였다. 이들 중, 7개의 서열은 두 DTG 또는 DSG 모티프 및 PROSITE 아스파르틸 프로테아제 활성 부위 패턴을 함유하였다. 이들 7개 중에, 동일한 코스미드 클론(F21F8.3, F21F8.4 및 F21F8.7)에서 3개가 발견되었고, 이는 이들이 원종 유전자 복제에 의해 발생한 부류의 단백질을 대표함을 나타낸다. F21F8.3, F21F8.4 및 F21F8.7에 넓은 상동성을 갖는 두 다른 ORF가 동일한 유전자 클러스터(F21F8.2 및 F21F8.6)에 존재하지만, 이들은 오직 하나의 DTG 모티프를 함유한다. Wormpep12에 대한 이들 7개 서열로의 전수 BLAST 검색은 DTG 또는 DSG 모티프의 두 반복 단위를 함유하는 씨 엘레간스 게놈에서 추가의 후보 아스파르틸 프로테아제를 밝히는데 실패하였다.
SWISS-PROT, GenPep 및 TREMBL에 대하여 각 씨 엘레간스 서열로의 BLASTX 검색은 R12H7.2가 공지의 포유동물 아스파르틸 프로테아제에 가장 가까운 벌레 상동체이고, T18H9.2는 다소 더 멀리 관련되며, CEASP1, F21F8.3, F21F8.4 및 F21F8.7은 포유동물 서열에 서열 상동성을 가장 적게 갖는 하위 클러스터를 형성하는 것으로 나타났다.
논의:
APP, 프레세닐린 및 p35(cdk5의 활성자)는 모두 HIV 프로테아제의 기질 특이성에 순응하는 부위에서 세포내 단백질 분해 프로세싱을 겪는다. 동일한 기질 특이성을 갖는 세포 아스파르틸 프로테아제의 조절 장애는 AD에서 플라크와 얽힘(tangle) 병리학의 인과관계에 대한 단일화 메카니즘을 제공할 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 신규한 인간 아스파르틸 프로테아제를 확인하고자 하였다. 씨 엘레간스에서의 전체 게놈 조사는 본 발명자들이 확인한 아스파르틸 프로테아제 프로파일에 부착하는 7개의 오픈 리딩 프레임을 확인하였다. 이들 7개의 아스파르틸 프로테아제는 아마도 단순한 다세포 진핵세포에서 이러한 프로테아제의 완전 상보체를 포함한다. 이들은 아마도 원종 유전자의 복제에 의해 발생하는 씨 엘레간스에 독특한 4개의 밀접하게 관련된 아스파르틸 프로테아제를 포함한다. 다른 3개의 아스파르틸 프로테아제 후보(T18H9.2, R12H7.2 및 C11D2.2)는 포유동물 유전자 서열에 상동성을 갖는 것으로 밝혀졌다.
실시예 2: 게놈 가교에 의한 데이터베이스 조사를 사용한 신규 인간 아스파르틸 프로테아제의 확인
재료 및 방법:
EST 데이터베이스, cDNA , 및 예상된 폴리펩티드 서열의 컴퓨터-보조 분석:
CEASP1, F21F8.3, F21F8.4 및 F21F8.7 서열에 의한 EST 데이터베이스의 전수 상동성 검색은 임의의 신규한 포유동물 상동체를 밝히는데 실패하였다. R12H7.2에 의한 TBLASTN 검색은 특히 활성 부위내의 DTG 모티프 근처에서 카텝신 D, 카텝신 E, 펩시노젠 A, 펩시노젠 C 및 레닌에 상동성을 나타내었지만, 임의의 추가의 신규한 포유동물 아스파르틸 프로테아제를 확인하는데는 실패하였다. 이는 씨 엘레간스 게놈이 아마도 포유동물에서 원종 유전자의 복제 및 그후의 수식을 통해 발생한 유전자 부류로 표현되는 하나의 리소좀 아스파르틸 프로테아제만을 함유함을 나타낸다.
나머지 씨 엘레간스 서열인 T18H9.2로 TBLASTN 탐색하여 신규한 인간 아스파르틸 프로테아제(Hu-ASp1)를 코딩하는 콘티그(contig)내로 조립된 몇몇 EST를 확인하였다. 실시예 1에 전술한 바와 같이, SWISS-PROT에 대해 Hu-Asp1 콘티그에 의한 BLASTX 검색은 서열내의 활성 부위 모티프가 다른 아스파르틸 프로테아제의 활성 부위와 정렬됨을 나타내었다. LifeSeq, LifeSeqFL 및 공개 EST 수집물에 대한 BLASTN 검색의 철저한 반복적인 되풀이는 하나의 콘티그내로 조립된 다수의 cDNA 총합체로부터 102 EST를 확인하였다. 공개 EST 수집물에 존재하는 이러한 콘티그의 51개 서열은 또한 더 인스트튜트 포 게놈 러써치(The Institute for Genome Research, TIGR)에 의해 하나의 콘티그(THC213329)로 조립되었다. TIGR 주석은 이들이 콘티그 데이터베이스에서 임의의 적중을 찾는데 실패하였음을 나타낸다. TIGR 콘티그는 본 발명자들이 조립한 LifeSeq 콘티그의 역 상보체임에 주의한다. ZooSeq에서 래트 및 쥐 EST 서열에 대한 Hu-Asp1의 BLASTN 검색은 각 데이터베이스(각각 인사이트 클론 700311523 및 이미지(IMAGE) 클론 313341, 진뱅크(GenBank) 수탁번호 W10530)에서 하나의 상동성 EST를 밝혔다.
LifeSeqFl 및 공개 EST 데이터베이스에 대한 Hu-Asp1의 조립된 DNA 서열에 의한 TBLASTN 검색은 하나의 EST(2696295)로 표현되는 또 다른 관련된 인간 서열(Hu-ASp2)을 확인하였다. 이 부분 cDNA 서열의 판독은 소 아스파르틸 프로테아제의 활성 부위 모티프(NM1)에 상동성을 갖는 하나의 DTG 모티프를 밝혔다.
인사이트의 LifeSeq, LifeSeqFL 및 LifeSeq 조립된 데이터베이스가 제공된 생물정보학 도구를 사용하여 BLAST 검색, 콘티그 집합 및 다수의 서열 정렬을 수행하였다. 예상된 단백질 모티프는 프로사이트(ProSite) 사전(GCG 9내의 모티프) 또는 Pfam 데이터베이스를 사용하여 확인하였다.
Hu - Asp1 의 전장 cDNA 클로닝
씨 엘레간스 유전자 T18H9.2CE의 오픈 리딩 프레임을 사용하여 인사이트 LifeSeq 및 Life-Seq-FL 데이터베이스에 질의하고 1863920CE1로서 불리는 하나의 전자 어셈블리가 검출되었다. 이 콘티그 1863920의 가장 5'의 cDNA 클론이 인사이트로부터 얻어지고 두 쇄에서 완전히 서열결정되었다. 클론 1863920내에 함유된 오픈 리딩 프레임의 판독은 중복된 아스파르틸 프로테아제 활성 부위 모티프 (DTG/DSG)의 존재를 밝혔지만, 5' 말단은 불완전하였다. Hu-Asp1 코딩 서열의 나머지는 인간 태반 마라톤(Marathon) 레디(ready) cDNA 주형(클론테크)을 사용하여 5' 마라톤 레이스(RACE) 분석에 의해 결정되었다. 클론 1863920의 5' 말단에 특이적인 3'-안티센스 올리고뉴클레오티드 프라이머는 PCR에서 마라톤 레디 cDNA 합성 아답터(adaptor)에 특이적인 5'-센스 프라이머와 짝지어졌다. 특정 PCR 생성물은 주기 서열결정에 의해 바로 서열결정되고, 생성된 서열은 클론 1863920의 서열과 조립되어 Hu-Asp-1의 완전한 코딩 서열(서열 1)을 생성하였다.
몇가지의 흥미있는 특징이 Hu-Asp1의 1차 아미노산 서열에 존재한다(도 1, 서열 2). 이 서열은 신호 펩티드(서열 2에서 잔기 1 내지 20), 전단편 및 아스파르틸 프로테아제 활성 부위 모티프(DTG/DSG)의 두 카피를 함유하는 촉매 도메인을 함유한다. 제1 및 제2 활성 부위 모티프 사이의 간격은 약 200 잔기이고, 하나의 진핵 아스파르틸 프로테아제 도메인의 예상된 크기와 일치해야 한다. 가장 흥미롭게는, 서열은 그의 C-말단 근처에 예상된 막횡단 도메인(서열 2에서 잔기 469 내지 492)을 함유하는데, 이는 프로테아제가 막에 고정됨을 나타낸다. 이 특징은 임의의 다른 아스파르틸 프로테아제에서는 발견되지 않는다.
전장 Hu - Asp -2 cDNA 의 클로닝 :
실시예 1에 전술한 바와 같이, 추정 아스파르틸 프로테아제에 대한 카에노합디티스 엘레간스 데이터베이스 Wormpep12의 게놈 광범위 조사 및 이어서 인간 EST 데이터베이스의 탐색은 Hu-Asp1로서 불리는 씨 엘레간스 유전자 T18H9.2에 대한 인간 오르토로그(ortholog)를 밝혔다. Hu-Asp1의 조립된 콘티그를 사용하고 인간 EST 데이터베이스의 BLAST 검색 도구를 사용하여 인간 파라로그(paralog)에 대하여 질의하였고, LifeSeq FL 데이터베이스에서 약 60%의 공유 동일성으로 하나의 중요한 일치(2696295CE1)가 발견되었다. TIGR로부터 입수할 수 있는 gb105PubEST 또는 인간 데이터베이스 종류의 유사한 질의는 유사한 EST 클론을 확인하지 않았다. 인간 자궁 cDNA 총합체로부터 단일 패스 서열 분석에 의해 확인된 cDNA 클론 2696295를 인사이트로부터 얻고 두 쇄에서 완전히 서열결정하였다. 이 클론은 422개의 아미노산 폴리펩티드를 코딩하지만 5' 말단에 개시유전자 ATG가 없는 불완전 1266bp 오픈 리딩 프레임을 함유하였다. 예상된 서열의 검사 결과, 194 아미노산 잔기에 의해 분리되는 중복된 아스파르틸 프로테아제 활성 부위 모티프 DTG/DSG의 존재가 밝혀졌다. LifeSeq EST 데이터베이스의 나중 판의 후속 질의는 클론 2696295에 관련된 추가의 5' 서열을 함유하는 것으로 보이는, 인간 성상세포 cDNA 총합체(4386993)로부터 서열결정된 추가의 EST를 확인하였다. 클론 4386993은 인사이트로부터 구하여 두 쇄에서 완전히 서열결정하였다. 클론 4386993 및 클론 2696295의 비교 분석은 클론 4386993이 오픈 리딩 프레임을 2개의 프레임내 판독 개시 코돈을 포함하여 31개 아미노산 잔기 확장하였음을 확인하였다. 2개의 프레임내 ATG의 존재에도 불구하고, ATG의 상류에서 프레임내 정지 코돈이 관찰되지 않음은 4386993이 전장이지 않을 수 있음을 나타낸다. 또한, 클론 2696295 및 4386993의 서열의 정렬 결과, 클론 4386993에 비해 클론 2696295에 75개의 염기쌍이 삽입되어 2696295에 25개의 추가의 아미노산 잔기가 삽입되는 것으로 나타났다. Hu-Asp2 코딩 서열의 나머지는 인간 해마 마라톤 레디 cDNA 주형(클론테크)을 사용하여 5' 마 라톤 레이스 분석에 의해 결정되었다. 클론 2696295 및 4386993의 공개 5'-영역에 특이적인 3'-안티센스 올리고뉴클레오티드 프라이머는 PCR에서 마라톤 레디 cDNA 합성 아답터에 특이적인 5'센스 프라이머와 짝지어진다. 특정 PCR 생성물은 주기 서열결정에 의해 직접 서열결정되고, 생성된 서열은 클론 2696295 및 4386993의 서열과 조립되어 각각 Hu-Asp2(a)(서열 3) 및 Hu-Asp2(b)(서열 5)의 완전한 코딩 서열을 얻었다.
몇가지의 흥미있는 특징은 Hu-Asp2(a)(도 3 및 서열 4) 및 Hu-Asp-2(b)(도 2, 서열 6)의 1차 아미노산 서열에 존재한다. 두 서열은 신호 펩티드(서열 4 및 서열 6에서 잔기 1 내지 21), 전단편 및 아스파르틸 프로테아제 활성 부위 모티프(DTG/DSG)의 두 카피를 함유하는 촉매 도메인을 함유한다. 제1 및 제2 활성 부위 모티프 사이의 간격은 Hu-Asp-2(b)의 25 아미노산 잔기의 결손으로 인하여 가변적이고, Hu-Asp2(b) 및 Hu-Asp-2(a)에 있어서 각각 168 및 194개 아미노산 잔기로 이루어진다. 더 흥미롭게는, 두 서열은 그들의 C-말단 근처에 예상된 막횡단 도메인(서열 4에서 잔기 455 내지 477 및 서열 6에서 잔기 430 내지 452)을 함유하는데, 이는 프로테아제가 막에 고정됨을 나타낸다. 이 특징은 Hu-Asp1을 제외하고는 임의의 다른 아스파르틸 프로테아제에서 발견되지 않는다.
실시예 3. 쥐 Asp2 cDNA 및 게놈 DNA 의 분자 클로닝 .
쥐 Asp 2 cDNA 의 클로닝 및 특징화-cDNA 총합체 선별, PCR 및 게놈 클로닝의 조합을 사용하여 Hu-Asp2의 쥐 오르토로그를 클로닝하였다. Hu-Asp2로부터 제조된 32P-표지된 코딩 서열 프로브를 사용하여 쥐 뇌 cDNA 총합체로부터 약 500,000개의 독립 클론이 선별되었다. 복제 양성을 DNA 서열 분석하였고 가장 긴 cDNA는 코딩 영역에 전체 3' 비판독 영역 및 47개 아미노산을 함유하였다. 앞서 결정된 5'-가장 cDNA 서열에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 인간 Asp2 서열의 가장 5' 영역에 특이적인 센스 프라이머로 동일한 쥐 뇌 cDNA 총합체를 PCR 증폭하고 DNA 서열 분석하여 980bp의 추가의 코딩 서열을 얻었다. 쥐 Asp-2의 5' 서열의 나머지는 게놈 서열로부터 유도되었다(이하 참조).
쥐 Asp -2 유전자의 단리 및 서열 분석-쥐 Asp2 cDNA의 일부를 코딩하는 쥐 EST 서열은 질의로서 BLAST 검색 도구 및 Hu-Asp2 코딩 서열을 사용하여 진뱅크 EST 데이터베이스에서 확인되었다. 클론 g3160898은 352bp에 걸쳐 인간 서열에 대하여 88% 공유 동일성을 나타내었다. 그다음, 쥐 Asp2의 이 영역에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍을 합성하였고, 쥐 유전자의 영역을 증폭하는데 사용하였다. 129/SvJ 균주로부터 유도된 쥐 게놈 DNA는 쥐 Asp2에 특이적인 다양한 프라이머 세트를 사용하여 PCR(25주기)에서 증폭되었고, 생성물은 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분석되었다. 프라이머 세트 Zoo-1 및 Zoo-4는 공지의 cDNA 서열과의 비교를 근거로 약 600bp의 인트론 서열을 함유한 750bp의 단편을 증폭하였다. 이 프라이머 세트를 사용하여 PCR에 의해 쥐 BAC 총합체를 선별하고, 단일 게놈 클론을 단리하고, 이 클론은 DNA 서열 분석에 의해 쥐 Asp2 유전자를 함유하는 것으로 확인되었다. 이 Asp2 게놈 클론의 샷건(shotgun) DNA 서열결정 및 Hu-Asp2와 부분 쥐 cDNA 서열의 cDNA 서열의 비교는 쥐 Asp2의 전장 서열(서열 7)을 한정하였다. 쥐 Asp2의 예상된 아미노산 서열(서열 8)은 인간 서열(도 4)에 비하여 18/501 아미노산 잔기 치환과 함께 96.4%의 공유 동일성(GCG 최적합 알고리듬)을 나타내었다.
실시예 4: Hu - Asp2 전사의 발현의 조직 분포:
재료 및 방법:
클론테크(미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)로부터 얻은 다수의 조직 노던 블롯(Northern blot)을 사용하여 Hu-Asp-2의 발현의 조직 분포를 결정하였다. 벡터 pINCY내 인사이트 클론 2696295를 분해하여 EcoRI/NotI로 완성하고, 1.8kb cDNA 삽입물을 제조용 아가로즈 겔 전기영동에 의해 정제하였다. 이 단편을 [α-32P-dATP](>3000Ci/m㏖, 미국 일리노이주 알링톤 하이츠 소재의 아머샴(Amersham)) 및 DNA 폴리머라제 I의 클레노우(Klenow) 단편의 존재하에 랜덤 프라이밍(random priming)하여 1×109dpm/㎍보다 큰 비활성으로 방사능표지하였다. 상이한 인간 조직으로부터 단리된 변성된, 크기별로 분획화된 폴리 A+ RNA를 함유하는 나일론 여과기를 ExpressHyb 완충제(미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 클론테크)에서 68℃에서 1시간동안 2×106dpm/㎖ 프로브와 혼성화하고, 제조자가 권하는 대로 세척하였다. 혼성화 신호는 바이오맥스(BioMax) XR 필름(미국 뉴욕주 로체스터 소재의 코닥(Kodak))을 사용하여 -80℃에서 증강 스크린과 함께 오토래디오그래피에 의해 가시화하였다.
결과 및 논의:
Hu-Asp2 전사의 발현의 조직 분포에 대한 제한된 정보는 전술한 방법을 사용하여 검출된 EST의 비교적 작은 수(<5)로 인하여 데이터베이스 분석으로부터 얻었다. Hu-Asp2 유전자의 발현에 대한 추가의 정보를 얻기 위한 노력으로, 노던 분석을 사용하여 Hu-Asp2 전사의 크기 및 존재비를 결정하였다. 일련의 말초 조직 및 뇌 영역으로부터 단리된 PolyA+ RNA는 변성 조건하에 분리 후 고체 지지체에 표시되고, Hu-Asp2 전사는 클론 2696295로부터의 방사능표지된 삽입물에 고 엄격 혼성화에 의해 가시화되었다. 2696295 cDNA 프로브는 3.0kb, 4.4kb 및 8.0kb의 겉보기 크기로 이동된 전사의 배열을 가시화하였는데, 나중 두 전사가 가장 많았다.
조사한 조직에 걸쳐, Hu-Asp2 전사는 췌장 및 뇌에 가장 많았고, 흉선 및 PBL을 제외하고 검사한 모든 다른 조직에서는 더 낮게 그러나 검출가능한 수준으로 관찰되었다. Hu-Asp2 전사가 뇌에 상대적으로 많다는 것으로 볼 때, 뇌 영역에서의 영역 발현도 또한 확인되었다. 검사한 모든 뇌 영역에서 전사 크기의 유사한 배열이 검출되었고[소뇌, 대뇌 피질, 후두극, 전두엽, 측두엽 및 피각] 골수 및 척수에서 가장 많았다.
실시예 5: 인간 세포주에서 Hu - Asp -1 및 Hu - Asp -2 전사의 노던 블롯 검출:
다양한 인간 세포주를 Hu-Asp1 및 Asp2 mRNA를 생성하는 능력에 대하여 시험하였다. 인간 배아 신장(HEK-293) 세포, 아프리카 그린 원숭이(Cos-7) 세포, 챠이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, HELA 세포 및 신경아종 세포주 IMR-32는 모두 ATCC로 부터 구하였다. 세포를 이들이 거의 전면배양될 때까지 10% FCS를 함유하는 DME에서 배양하였고, 단 CHO 세포는 5% CO2, 37℃에서 α-MEM/10% FCS에서 유지하였다. 세포(3×107)의 세척된 단층을 접시에서 용해시키고, 퀴아젠 올리고텍스 디렉트 mRNA 키트(Qiagen Oligotex Direct mRNA kit)를 사용하여 polyA+ RNA를 추출하였다. 각 세포주로부터 PolyA+ RNA 2㎍을 함유하는 샘플을 변성 조건(글리옥살-처리)하에 분획화하고, 모세관 작용에 의해 고체 나일론 막 지지체로 옮기고, Hu-Asp1 또는 Hu-Asp2로부터 유도된 랜덤-프라이밍 표지된(32P) 코딩 서열 프로브와의 혼성화에 의해 전사가 가시화되었다. X-레이 필름에의 노출 및 포스포이미저(PhosphorImager)에 의한 상 분석에 의해 방사능 신호를 검출하였다.
Hu-Asp1 cDNA 프로브는 이전에 검출된 유사한 배열의 전사(2.6kb 및 3.5kb)가 인간 조직임을 가시화하였다. 방사능 신호의 정량화에 의해 결정된 상대적인 존재비는 Cos-7>HEK 292=HELA>IMR32이었다.
Hu-Asp2 cDNA 프로브는 또한 다음과 같은 상대적인 존재비로서 티슈(3.0kb, 4.4kb 및 8.0kb)에 비하여 유사한 배열의 전사를 가시화하였다: HEK 293>Cos 7>IMR32>HELA.
실시예 6: 시험관내 선별을 위해 Aβ 프로세싱을 증가시키는 APP 의 수식
APP로부터 Aβ 펩티드를 프로세싱하는 인간 세포주는 세포 분석에서 β- 및 γ-세크레타제의 저해제를 선별하기 위한 수단을 제공한다. 세포 상청액내로의 A β 펩티드의 생성 및 방출은 효소-연결된 면역흡수 분석(EIA)에 의해 모니터링한다. APP의 발현이 광범위하고 신경원 및 비신경원 세포주가 Aβ 펩티드를 프로세싱하고 방출하지만, 내재 APP 프로세싱의 수준은 낮고 EIA에 의해 검출하기가 어렵다. Aβ 프로세싱은 Aβ 프로세싱을 증진하는 APP의 형질전환된 세포주 돌연변이에서 발현함으로써 증가될 수 있다. 본 발명자들은 APP695의 카르복실 말단에 2개의 리신 잔기를 첨가하면 Aβ 프로세싱을 더욱 더 증가시킨다는 뜻하지 않은 발견을 하였다. 이것은 본 발명자들로 하여금 배양 배지내로 20,000pg/㎖의 현저한 수준으로 Aβ 펩티드를 방출하는 형질전환된 세포를 생성하게 하였다.
재료 및 방법
재료:
인간 배아 신장 세포주 293(HEK293 세포)를 내부적으로 얻었다. 벡터 pIRES-EGFP를 클론테크로부터 구입하였다. 폴리머라제 연쇄반응(PCR)을 사용한 돌연변이를 위한 올리고뉴클레오티드를 제노시스(Genosys)로부터 구입하였다. 인간 APP695(서열 9[뉴클레오티드] 및 서열 10[아미노산])를 함유하는 플라스미드를 노쓰웨스턴 유니버시티 메디칼 스쿨(Northwestern University Medical School)로부터 구하였다. 이것은 Not1 부위에서 pSK(스트라타진)로 서브클로닝되어 플라스미드 pAPP695를 생성하였다.
돌연변이생성 프로토콜:
스웨덴 돌연변이(K670N, M671L)를 스트라타진 퀵 체인지 뮤타제네시스 키트(Stratagene Quick Chnage Mutagenesis Kit)를 사용하여 pAPP695에 도입하여 플라 스미드 pAPP695NL(서열 11[뉴클레오티드] 및 서열 12[아미노산])을 생성하였다. APP695의 C-말단에서 디-리신 모티프를 도입하기 위하여, 하기 서열 47의 정방향 프라이머를 하기 서열 48의 "패치" 프라이머 및 하기 서열 49의 측부 프라이머와 함께 사용하여 APP695 cDNA(서열 15[뉴클레오티드] 및 서열 16[아미노산])의 3' 말단을 수식하였다.
<서열 47>
gactgaccac tcgaccaggt tc
<서열 48>
cgaattaaat tccagcacac tggctacttc ttgttctgca tctcaaagaa c
<서열 49>
cgaattaaat tccagcacac tggcta
이는 또한 pIRES-EGFP의 다중 클로닝 부위에 BstX1 부위와 상용성일 BstX1 제한 부위를 첨가하였다. PCR 증폭은 제조자에 의해 공급된 폴리머라제 혼합물 및 완충제를 사용하여 클론테크 HF 어드밴티지 cDNA PCR 키트로 수행하였다. "패치" PCR에 있어서, 패치 프라이머를 측부 프라이머의 몰 농도의 20분의 1로 사용하였다. PCR 증폭 생성물을 퀴아퀵(QIAquick) PCR 정제 키트(퀴아젠)를 사용하여 정제하였다. 제한 효소로 분해한 후, 생성물을 0.8% 아가로스 겔에서 분리한 다음, 퀴아퀵 겔 추출 키트(퀴아젠)를 사용하여 절단된 DNA 단편을 정제하였다.
수식된 APP695-Sw cDNA를 재조립하기 위하여, PCR에 의해 얻은 APP695-Sw cDNA의 5' Not1-Bgl2 단편 및 3' Bgl2-BstX1 APP695 cDNA 단편을 Not1 및 BstX1 부 위에서 개방된 pIRES-EGFP 플라스미드 DNA에 연결하였다. 연결은 고속 DNA 연결 키트(Rapid DNA Ligation kit, 베링거 만하임(Boehringer Mannheim))를 사용하여 실온에서 5분동안 수행하고, 라이브러리 에피션시 DH5a 적격 세포(Library Efficiency DH5a Competent Cells, 지브코BRL 라이프 테크날러지스(GibcoBRL Life Technologies))에 형질전환하였다. 프라이머 #276 및 #275를 사용하여 PCR 증폭에 의해 삽입물에 대해 박테리아 콜로니를 선별하였다. 퀴아프레프 스핀 미니프레프 키트(QIAprep Spin Miniprop kit, Qiagen)를 사용하여 포유동물 세포 형질전환을 위하여 플라스미드 DNA를 정제하였다. 얻어진 구성물을 pMG125.3(APPSW-KK, 서열 17[뉴클레오티드] 및 서열 18[아미노산])이라고 하였다.
포유동물 세포 트랜스펙션 :
트랜스펙션을 위한 HEK293 세포를 10% 소 태아 혈청을 함유한 둘베코(Dulbecco) 변형 이글(Eagle) 배지(DMEM)에서 80% 전면배양 때까지 증식시켰다. 리포펙트아민(LipofectAmine, 지브코-BRL)을 사용하여 10×106 세포당 pMG125.3 DNA 3㎍ 및 pcDNA3.1 DNA 9㎍을 가지고 공동트랜스펙션을 수행하였다. 3일 트랜스펙션후, G418을 400㎍/㎖의 농도로 함유하는 배지에 세포를 계대배양하였다. 선택 배지에서 3일 증식시킨 후, 세포를 형광에 의해 분류하였다.
FACS 에 의한 125.3 세포의 클론 선택:
공기-냉각 아르곤 레이저에 의해 공급되는 488㎚ 여기 라인이 장착된 EPICS 엘리트 ESP 유동 세포계산기(EPICS Elite ESP flow cytometer, 미국 플로리다주 히 알리아 소재의 쿨터(Coulter))에서 세포 샘플을 분석하였다. 525㎚ 대역통과 필터에 의해 EGFP 방출을 측정하고, 형광 세기는 전방 직각 광 산란기에 의해 결정된 바와 같이 생육 세포를 제거한 후 4-10 로그법으로 표시되었다. 하나의 녹색 세포를 G418이 없는 생육 배지를 함유하는 하나의 96웰 플레이트의 각 웰에 분리하여 넣었다. 4일의 회수 기간 후에, G418을 최종 농도 400㎍/㎖로 배지에 첨가하였다. 선택 후, 웰의 32%는 확장 클론을 함유하였다. 클론을 갖는 웰을 96웰 플레이트로부터 24웰 플레이트로 확장한 다음 6웰 플레이트로 확장하는데, 각 계대배양시 가장 빨리 증식한 콜로니를 확장을 위해 선택하였다. 선택된 최종 세포주는 최종 6회 계대배양된 것중 가장 빨리 증식한 것이었다. 125.3으로 명명된 이 클론을 신선한 배지에서 매 4일마다 계대배양하면서 400㎍/㎖의 G418내에서 유지하였다. 23회 계대배양에 걸쳐 EGFP 형광의 Aβ 생성의 손실은 보이지 않았다.
Aβ EIA 분석( hA β1-40/42를 위한 이중 항체 샌드위치 ELISA ):
트랜스펙션한지 48시간 후 수확한 세포 배양 상층액을 다음과 같이 표준의 Aβ EIA에서 분석하였다. 이중 항체 샌드위치 ELISA에서 단클론성 항체(mAb) 6E10(미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 세네텍(Senetek)) 및 비오티닐화된 토끼 항혈청 162 또는 164(미국 뉴욕주 스타텐 아일랜드 소재의 뉴욕 스테이트 인스티튜트 포 베이직 리써치(New York State Institute for Basic Research))를 사용하여 인간 Aβ 1-40 또는 1-42를 측정하였다. 포획 항체 6E10은 hAβ의 N-말단 아미노산 잔기 1 내지 16에 존재하는 에피토프에 특이적이다. 결합 검출 항체 162 및 164는 각각 hAβ 1-40 및 1-42에 특이적이다. 간단하게, 넝크 맥시소프(Nunc Maxisorp) 96 웰 면역플레이트를 0.1M 탄산염-중탄산염 완충제(pH 9.6)에 희석된 mAb 6E10(5㎍/㎖)의 100㎕/웰로 코팅하고, 4℃에서 밤새 배양하였다. 플레이트를 0.05%의 트윈-20(DPBST)을 함유하는 0.01M DPBS(0.008M 인산 나트륨, 0.002M 인산 칼륨, 0.14M 염화 나트륨, 0.01M 염화 칼륨, pH 7.4)로 3회 세척한 후, 플레이트를 비특이적 결합을 막기 위하여 0.01M DPBS내 10% 정상 양 혈청(시그마) 200㎕로 60분동안 폐색하였다. 플레이트를 세척한 후, 배양 배지에 DMSO내 1㎎/㎖ 모액으로부터 희석된 인간 Aβ 1-40 또는 1-42 표준 100㎕/웰(미국 캘리포니아주 토랜스 소재의 바켐(Bachem))을 첨가하고, 샘플, 예컨대 트랜스펙션된 세포의 조정 배지 100㎕/웰도 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 2시간동안 및 4℃에서 밤새 배양하였다. 다음날, 플레이트를 세척한 후, DPBST+0.5% BSA에 희석된 비오티닐화된 토끼 항혈청 162(1:400) 또는 164(1:50) 100㎕/웰을 첨가하고, 실온에서 1시간 15분동안 배양하였다. 세척한 후, DPBST에 1:10,000으로 희석된 뉴트라비딘-양고추냉이 퍼옥시다제(미국 일리노이주 락포드 소재의 피어스(Pierce)) 100㎕/웰을 적용하고, 실온에서 1시간동안 배양하였다. 마지막 세척후, 50mM 시트르산/100mM 인산 나트륨 완충제(미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마 케미칼스)내 o-페닐렌디아민 디히드로클로라이드(미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마 케미칼스) 100㎕/웰을 기질로서 첨가하고, 소프트 맥스 프로(Soft max Pro) 소프트웨어를 사용하여 20분동안 동역학 미크로플레이트 판독기에서 450㎚에서 색 전개를 모니터링하였다. 모든 기준물질 및 샘플을 3번씩 실험하였다. 검정 곡선에 포함되는 흡광도를 갖는 샘플을 소프트 맥스 프로 소프트웨어를 사용하여 검정 곡선으로부터 외삽하고, pg/ ㎖ 배양 배지로 표현하였다.
결과:
APP695의 카르복실 말단에 2개의 리신 잔기를 첨가하는 것은 일시 발현에 의해 나타난 바와 같이(표 1) HEK293 세포에서 Aβ 프로세싱을 크게 증가시킨다. APP695에 디-리신을 첨가하는 것은 Aβ 프로세싱을 스웨덴 돌연변이를 함유하는 APP695에서 나타난 것으로 증가시킨다. 디-리신 모티프를 스웨덴 돌연변이와 결합하는 것은 또한 프로세싱을 추가로 2.8배 증가시킨다.
pMG125.3 및 pcDNA3.1에 의한 HEK293 세포의 동시형질전환에 의해 G418 내성 및 EGFP의 고도 발현을 위한 형질전환된 세포의 이중 선택이 가능하였다. FACS에 의한 클론 선택 후, 얻어진 세포주를 24웰 플레이트에서 36시간 증식한 후 배양 배지 1㎖당 현저한 Aβ 펩티드 20,000pg을 생성한다. 다양한 증식 조건하의 Aβ 펩티드의 생성은 표 2에 요약되어 있다.
야생형 또는 수식된 APP를 함유하는 지정된 벡터에 의한 HEK293 세포의 일시 형질전환한지 48시간 후 배양 배지내로의 Aβ 펩티드의 방출. 표에 나타낸 값은 똑같지 않은 변이를 가정하여 스튜던츠 t-테스트를 사용하여 쌍 비교한 평균+SD 및 P-값이다.
APP 구성물 Aβ1-40 펩티드 (pg/ml) 증가 배수 P-값
pIRES-EGFP 벡터 147+28 1.0
wt APP695(142.3) 194+15 1.3 0.051
wt APP695-KK(124.1) 424+34 2.8 3×10-5
APP695-Sw(143.3) 457+65 3.1 2×10-3
APP695-SwKK(125.3) 1308+98 8.9 3×10-4
다양한 증식 조건하의 HEK125.3 세포로부터의 Aβ 펩티드의 방출
배양 플레이트의 유형 배지의 체적 배양 기간 Ab1-40 (pg/ml) Ab1-42 (pg/ml)
24웰 플레이트 400 ㎕ 36시간 28,036 1,439
실시예 7: HEK125 .3 세포에서 A베타 프로세싱의 안티센스 올리고머 저해
독점 기술(세퀴투르(Sequitur) Ver. D Pat 계류 #3002)을 사용하여 2세대 키메라 안티센스 올리고머의 표적화된 서열 및 디자인의 선택을 위해 Hu-Asp1 및 Hu-Asp2의 서열이 세퀴투르 인코포레이티드(Sequitur, Inc., 미국 매사츄세츠주 나틱 소재)에 제공되었다. 안티센스 올리고머 로트번호 S644, S645, S646 및 S647은 Asp1에 대하여 표적화되었다. 안티센스 올리고머 로트번호 S648, S649, S650 및 S651은 Asp2에 대하여 표적화되었다. 대조용 안티센스 올리고머 로트번호 S652, S653, S655 및 S674는 상관없는 유전자에 대하여 표적화되었고, 안티센스 올리고머 로트번호 #S656, S657, S658 및 S659는 또 다른 상관없는 유전자에 대하여 표적화되었다.
안티센스 올리고머에 의한 트랜스펙션에 있어서, HEK125.3 세포를 10% 소 태아 혈청이 첨가된 최소 필수 배지(MEM)내 6웰 플레이트에서 약 50% 전면배양 때까지 증식시켰다. 2㎎/㎖의 올리고펙틴 G(미국 매사츄세츠주 나틱 소재의 세퀴투르 인코포레이티드)의 모액을 무혈청 MEM에 50㎍/㎖으로 희석하였다. 별도로, 100μM의 안티센스 올리고머 모액을 Opti-MEM(지브코-BRL, 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재)에 800nM로 희석하였다. 그 다음, 올리고펙틴 G 및 안티센스 올리고머의 희석된 모액을 1:1의 비로 혼합하고 실온에서 배양하였다. 15분 배양한 후, 시약을 10% 소 태아 혈청을 함유하는 MEM에 10배 희석하고, 구 배지를 처음 제거한 후 6웰 플레이트의 각 웰에 2㎖를 첨가하였다. 트랜스펙션 후, 세포를 올리고펙틴 G/안티센스 올리고머의 연속 존재하에 증식시켰다. Ab 펩티드 방출을 모니터링하기 위하여, 조정 배지 400㎕를 배양 웰로부터 주기적으로 제거하고, 트랜스펙션한지 24시간 후에 시작하여 새로운 배지로 대체하였다. 보고된 데이터는 트랜스펙션한지 48시간 후에 수확한 배양 상청액으로부터 얻는다.
결과:
세퀴투르 인코포레이티드로부터 얻은 16개의 상이한 안티센스 올리고머를 별도로 HEK125.3 세포에 트랜스펙션시켜 Aβ 펩티드 프로세싱에 대한 영향을 결정하였다. Asp1 및 Asp2에 대하여 표적화된 안티센스 올리고머만이 HEK125.3 세포에 의한 A베타 프로세싱을 감소시키고, Asp2에 대하여 표적화된 것은 더 큰 저해 효과를 갖는다. Aβ(1-40) 및 Aβ(1-42)는 동일한 정도로 저해되었다. 표 3에서, 저해율은 비트랜스펙션된 세포에 대하여 계산되었다. 50%보다 큰 저해를 제공하는 안티센스 올리고머 시약은 별표로 표시하였다. 시험된 시약중에서, ASP1에 대하여 표적화된 4개 안티센스 올리고머중 3개는 Aβ 1-40 프로세싱의 평균 52% 저해 및 Aβ 1-42 프로세싱의 47% 저해를 제공하였다. ASP2에 있어서, 4개의 안티센스 올리고머중 4개는 50%보다 큰 저해를 제공하면서, Aβ 1-40 프로세싱에 있어서 평균 62%의 저해 및 Aβ 1-42 프로세싱에 있어서 60%의 저해를 나타내었다.
안티센스 올리고머로 처리된 HEK125.3 세포로부터의 Aβ 펩티드 방출의 저해
표적화된 유전자 안티센스 올리고머 A베타(1-40) A베타(1-42)
Asp1-1 S644 62%* 56%*
Asp1-2 S645 41%* 38%*
Asp1-3 S646 52%* 46%*
Asp1-4 S647 6% 25%
Asp2-1 S648 71%* 67%*
Asp2-2 S649 83%* 76%*
Asp2-3 S650 46%* 50%*
Asp2-4 S651 47%* 46%*
Con1-1 S652 13% 18%
Con1-2 S653 35% 30%
Con1-3 S655 9% 18%
Con1-4 S674 29% 18%
Con2-1 S656 12% 18%
Con2-2 S657 16% 19%
Con2-3 S658 8% 35%
Con2-4 S659 3% 18%
실시예 8. 배양된 세포에서의 Hu - Asp2 β- 세크레타제 활성의 입증
초기 발병된 알츠하이머병과 관련된 APP의 몇몇 돌연변이는 Aβ 펩티드 프로세싱을 변하게 하는 것으로 나타났다. 이러한 돌연변이는 APP로부터 Aβ를 방출하는 N- 및 C-말단 절단 부위의 양측에 존재한다. 이들 절단 부위는 각각 β-세크레타제 및 γ-세크레타제 절단 부위로 불린다. β-세크레타제 부위에서의 APP의 절단은 분자량 11,145달톤의 99개 아미노산을 함유하는 APP의 C-말단 단편을 생성한다. β-세크레타제 절단 부위의 바로 상류의 스웨덴 KM→NL 돌연변이는 Aβ 펩티드의 1-40개 및 1-42개 아미노산 형태의 생성을 전체적으로 증가시킨다. 런던 VF 돌연변이(APP770 이소폼에서 V717→F)는 전체 Aβ 펩티드 생성에 거의 영향을 주지 않지만, APP 프로세싱중에 사용된 γ-세크레타제 절단 부위의 선택에 영향을 줌으로써 Aβ 펩티드의 더 긴 1-42개 아미노산 형태의 비율을 우선적으로 증가시키는 것으로 보인다. 따라서, 본 발명자들은 이들 돌연변이가 Hu-Asp2의 발현을 지시하는 구성물로 공동트랜스펙션된 배양된 세포에 의해 생성된 Aβ 펩티드의 양 및 종류를 변화시키는지를 결정할 것이다.
배양된 세포에서 Hu-Asp2 β-세크레타제 활성을 입증하는 2가지 실험을 수행하였다. 첫번째 실험에서, 실시예 7에 기술된 바와 같이 Hu-Asp2를 지시하는 안티센스 올리고머로 HEK125.3 세포를 처리하는 것은 β-세크레타제 절단(CTF99)에 의해 생성되는 APP의 C-말단 단편의 양을 줄이는 것으로 보인다(도 9). 이것은 Hu-Asp2가 직접적 또는 간접적으로 β-세크레타제 절단을 용이하게 하는 작용을 하는 것을 나타낸다. 두번째 실험에서, 트랜스펙션된 쥐 Neuro2A 세포에서의 Hu-Asp2의 증가된 발현은 CTF99 β-세크레타제 절단 단편의 축적을 증가시키는 것으로 보인다(도 10). 이러한 증가는 C-말단 디-리신 모티프를 함유하는 돌연변이주 APP-KK 클론이 트랜스펙션에 사용되는 경우 가장 쉽게 나타난다. 또 하나의 증가는 Hu-Asp2가 스웨덴 돌연변이 KM→NL을 함유하는 APP-Sw-KK로 공동트랜스펙션되는 경우에 나타난다. 스웨덴 돌연변이는 β-세크레타제에 의한 APP의 절단을 증가시키는 것으로 알려져 있다.
두번째 실험은 Hu-Asp2가 인간 배아 신장 HEK293 세포에 의한 공동트랜스펙션 실험에서 γ-세크레타제 활성을 촉진함을 증명한다. APP-KK 클론에 의한 Hu-Asp2의 공동트랜스펙션은 HEK293 세포로부터의 가용성 Aβ1-40 및 Aβ1-42 펩티드의 생성 및 방출을 크게 증가킨다. Aβ1-42의 방출에서 비례적으로 더 큰 증가가 있다. Aβ1-42 생성의 추가의 증가는 Hu-Asp2가 런던 돌연변이 V717→F를 함유하는 APP-VF(서열 13[뉴클레오티드] 및 서열 14[아미노산]) 또는 APP-VF-KK (서열 19[뉴클레오티드] 및 서열 20[아미노산]) 클론으로 공동트랜스펙션될 때 나타난다. V717→F 돌연변이는 Aβ42 부위에서의 절단에 대한 선호가 증가되도록 APP γ-세크레타제의 절단 특이성을 변화시키는 것으로 알려져 있다. 따라서, Asp2는 직접적 또는 간접적으로 β42 절단 부위에서 APP의 γ-세크레타제 프로세싱을 촉진하는 작용을 한다.
재료
항체 6E10 및 4G8은 세네텍(미국 미주리주 세인트 루이스 소재)으로부터 구입하였다. 항체 369는 록펠러 유니버시티(Rockefeller University)의 폴 그린가드(Paul Greengard)의 실험실로부터 구하였다. 항체 C8은 하바드 메디칼 스쿨 앤드 브라이엄 앤드 위민스 호스피탈(Harvard Medical School and Brigham and Women's Hospital)의 데니스 셀코에(Dennis Selkoe)의 실험실로부터 구하였다.
사용된 APP 구성물
트랜스펙션 실험에 사용된 APP 구성물은 다음을 포함한다:
APP: 야생형 APP695(서열 9 및 서열 10)
APP-Sw: 스웨덴 KM→NL 돌연변이를 함유하는 APP695(서열 11 및 서열 12)
APP-VF: 런던 V→F 돌연변이를 함유하는 APP695(서열 13 및 서열 14)
APP-KK: C-말단 KK 모티프를 함유하는 APP695(서열 15 및 서열 16)
APP-Sw-KK: C-말단 KK 모티프를 함유하는 APP695-Sw(서열 17 및 서열 18)
APP-VF-KK: C-말단 KK 모티프를 함유하는 APP695-VF(서열 19 및 서열 20).
이들은 PCR에 의해 도입된 적당한 연결 서열을 사용하여 벡터 pIRES-EGFP(미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 클론테크)에 Not1 및 BstX1 부위 사이에 삽입되었다.
HEK293 세포, HEK125 .3 세포 및 Neuro -2A 세포에서 안티센스 올리고머 또는 플라스미드 DNA 구성물의 트랜스펙션
인간 배아 신장 HEK293 세포 및 쥐 Neuro-2a 세포는 지브코/BRL의 리포펙타민 플러스(Lipofectamine Plus) 시약을 사용하여 발현 구성물로 트랜스펙션되었다. 세포를 24웰 조직 배양 플레이트에 70 내지 80% 전면배양의 밀도로 접종하였다. 플레이트당 4개의 웰을 OptiMEM내 DNA(3:1, APP:공동트랜스펙션체) 2㎍, 플러스 시약 8㎕ 및 리포펙타민 4㎕로 트랜스펙션시켰다. OptiMEM을 첨가하여 전체 체적을 1㎖로 만들고, 웰당 200㎕를 분배하고, 3시간동안 배양하였다. 공동트랜스펙션에 사용된 두 플라스미드의 비 및 트랜스펙션에 사용된 DNA의 전체량을 일정하게 유지하는 것에 주의하였다. 트랜스펙션 배지를 항생물질/항진균물질과 함께 DMEM, 10% FBS, Na 피루베이트로 대체하였고, 세포를 정상 조건(37℃, 5% CO2)하에 48시간동안 배양하였다. 조정 배지를 수거하여 폴리프로필렌 시험관으로 옮기고, 전술한 실시예에 기술된 바와 같이 EIA에 의해 Aβ1-40 및 Aβ1-42의 함량을 분석할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 안티센스 올리고머를 HEK125.3 세포로 트랜스펙션하는 것은 실시예 7에 기술된 바와 같았다.
세포 추출물의 제조, 웨스턴 블롯 프로토콜
플라스미드 DNA로 약 60시간동안 트랜스펙션한 후에 세포를 수확하였다. 우선, 세포를 플레이트로부터 15㎖들이 원뿔형 시험관으로 옮기고, 1,500rpm에서 5분동안 원심분리하여 배지를 제거하였다. 세포 펠렛을 PBS로 1회 세척하였다. 그 다음, 본 발명자들은 세포를 용해 완충제(10mM HEPES, pH 7.9, 150mM NaCl, 10% 글리세롤, 1mM EGTA, 1mM EDTA, 0.1mM 나트륨 바나데이트 및 1% NP-40)로 용해하였다. 용해된 세포 혼합물을 5000rpm에서 원심분리하였고, 상청액을 세포 추출물로서 -20℃에서 보관하였다. Asp2 안티센스 올리고머 및 대조물로 트랜스펙션된 HEK125.3 세포로부터의 동량의 추출물을 APP의 C-말단을 인식하는 항체 369로 침전시킨 다음, 항체 6E10에 의한 면역침전물에서 CTF99를 검출하였다. APP의 C-말단을 또한 인식하는 또 다른 침전 항체인 C8을 사용하여 실험을 반복하였다. Hu-Asp2 및 APP-KK, APP-Sw-KK, APP-VF-KK 또는 APP-VF로 공동트랜스펙션된 쥐 Neuro-2a 세포로부터의 추출물의 웨스턴 블롯에 있어서, 동량의 세포 추출물을 4 내지 10% 또는 10 내지 20% 트리신(Tricine) 구배 겔(미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 노벡스(NOVEX))을 통해 전기영동하였다. 전장 APP 및 CTF99 β-세크레타제 생성물을 항체 6E10으로 검출하였다.
결과
Asp2-1 또는 Asp2-2 안티센스 올리고머에 의한 HEK125.3 세포의 트랜스펙션은 역서열(Asp2-1 역서열 및 Asp2-2 역서열)을 갖는 대조 올리고머로 유사하게 트랜스펙션된 세포에 비하여 CTF β-세크레타제 생성물의 생성을 감소시킨다. 공동트랜스펙션 실험에서, APP-KK 구성물을 갖는 쥐 Neuro-2a 세포로의 Hu-Asp2의 공동트랜스펙션은 CTF99의 형성을 증가시켰다. 이것은 Hu-Asp2가, β-세크레타제 프로세싱을 증가시키는 스웨덴 KM→NL 돌연변이를 함유하는 APP의 돌연변이주 형태인 APP-Sw-KK와 함께 동시발현되는 경우 더 증가하였다.
Hu-Asp2와 APP의 공동트랜스펙션은 Aβ40 생성에 거의 영향을 주지 않지만, Aβ42 생성을 배경값 위로 증가시킨다(표 4). APP의 C-말단으로의 디-리신 모티프의 첨가는 Aβ 펩티드 프로세싱을 약 2배 증가시키지만, Aβ40 및 Aβ42 생성은 매우 낮다(각각 352pg/㎖ 및 21pg/㎖). Asp2와 APP-KK의 공동트랜스펙션은 또한 Aβ40 및 Aβ42 생성을 증가시킨다. Hu-Asp2에 의한 Aβ40 생성의 자극은 3배보다 많은 반면에, Aβ42의 생성은 10배보다 많이 증가한다. 따라서, Hu-Asp2와 APP-KK 구성물의 공동트랜스펙션은 우선적으로 Aβ42 생성을 증가시킨다.
APP V717→F 돌연변이는 Aβ42 절단 부위에서 γ-세크레타제 프로세싱을 증가시키는 것으로 나타났다. Hu-Asp2와 APP-VF 또는 APP-VF-KK 구성물의 공동트랜스펙션은 Aβ42 생성을 증가시켰지만(APP-VF의 경우 2배 및 APP-VF-KK의 경우 4배, 표 4), Aβ40 생성에는 혼합된 영향을 주었다(APP-VF의 경우 약간의 감소, 및 pcDNA 공동트랜스펙션 대조물에 비하여 APP-VF-KK의 경우 2배 증가). 따라서, Aβ42 생성에 대한 Asp2의 영향은 비례적으로 커서 Aβ42/총 Aβ비를 증가시켰다. 사실, Aβ42/총 Aβ의 비는 Hu-Asp2 및 APP-VF-KK로 트랜스펙션된 HEK293 세포에서 42%의 매우 높은 값에 도달한다.
웨스턴 블롯 결과, Hu-Asp2 mRNA를 표적으로 하는 안티센스 올리고머로 트랜스펙션된 HEK125.3 세포에 의해 CTF99 생성이 감소되는 것으로 나타났다(오른쪽). 웨스턴 블롯 결과, Hu-Asp2 및 APP-KK로 공동트랜스펙션된 쥐 Neuro-2a 세포에서 CTF99 생성이 증가하는 것으로 나타났다. CTF99 생성에서의 추가의 증가는 Hu-Asp2 및 APP-Sw-KK로 공동트랜스펙션된 세포에서 나타났다.
γ-세크레타제 프로세싱을 변형하는 V717→F 돌연변이를 함유하는 다양한 APP 구성물로 Hu-Asp2 또는 pcDNA 플라스미드 DNA를 공동트랜스펙션한 결과. Asp2에 의한 공동트랜스펙션은 Aβ42/총 Aβ의 비를 일정하게 증가시킨다. 표로 작성된 값은 Aβ 펩티드 pg/㎖이다.
pcDNA 공동트랜스펙션 Asp2 공동트랜스펙션
Aβ40 Aβ42 Aβ42/전체 Aβ40 Aβ42 Aβ42/전체
APP 192±18 <4 <2% 188±40 8±10 3.9%
APP-VF 118±15 15±19 11.5% 85±7 24±12 22.4%
APP-KK 352±24 21±6 5.5% 1062±101 226±49 17.5%
APP-VF-KK 230±31 88±24 27.7% 491±35 355±36 42%
실시예 9. 인간 Asp2L 의 박테리아 발현
이 콜리에서의 재조합 Hu - Asp2L 의 발현
T7 표지(서열 21 및 서열 22) 또는 T7 표지와 그 뒤의 카스파제 8 리더 서열(서열 23 및 서열 24)과 같은 N-말단 서열의 첨가 후에 Hu-Asp2L을 이 콜리에서 발현할 수 있다. 또 다르게는, 부위 지향성 돌연변이생성에 의해 5' 서열의 GC 함량의 감소를 사용하여 Hu-Asp2(서열 25 및 서열 26)의 수율을 증가시킬 수 있다. 또한, Asp2를 단백질 분해 절단 부위(서열 27 및 서열 28)로 조작할 수 있다. 발현 및 리폴딩후에 가용성 단백질을 생성하기 위하여는, 막횡단 도메인 및 세포질 꼬리의 제거, 또는 막 근위 영역, 막횡단 도메인, 세포질 꼬리의 제거가 바람직하다.
방법
적당한 연결 서열을 함유하는 프라이머에 의한 PCR을 사용하여 T7 표지(서열 21 및 서열 22) 또는 T7-카스파제 8 리더 서열(서열 23 및 서열 24)을 포함하는 N-말단 서열 수식과 Asp2 코딩 서열의 융합을 조립하였다. 이들 구성물을 T7 프로모터가 다중 클로닝 부위의 서열 앞의 T7 표지의 발현을 지시하는 발현 벡터 pet23a(+)[노바젠]로 클로닝하였다. pet23a+의 T7 리더 서열 뒤에 Hu-Asp2 서열을 클로닝하기 위하여, 선택된 Hu-Asp2 서열의 증폭에 하기 서열 35 및 서열 36의 올리고뉴클레오티드를 사용하였다:
<서열 35>
gtggatccac ccagcacggc atccggctg
<서열 36>
gaaagctttc atgactcatc tgtctgtgga atgttg
이들은 삽입물의 5' 및 3' 말단의 양측에 각각 BamHI 및 HindIII 부위를 위치시켰다. Asp2 서열은 2단계 PCR 주기에서 25주기동안 68℃에서 어닐링 및 연장을 사용하여 제조자가 제공한 프로토콜에 따라 어드밴티지-GC cDNA PCR[클론테크]을 사용하여 pcDNA3.1로 클로닝된 전장 Asp2(b) cDNA로부터 증폭되었다. 삽입물 및 벡터를 BamHI 및 HindIII로 절단하고, 아가로즈 겔을 통해 전기영동하여 정제한 다음, 고속 DNA 연결 키트[베링거 만하임]를 사용하여 연결하였다. 연결 반응을 사용하여 이 콜리 균주 JM109(프로메가)를 형질전환하였고, 플라스미드(퀴아젠, 퀴아프레프 미니스핀(Qiaprep minispin))의 정제 및 DNA 서열 분석을 위해 콜로니를 골랐다. 이소프로필 b-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)로의 유도를 사용하는 유도성 발현에 있어서, 발현 벡터를 이 콜리 균주 BL21(스트라타진)로 전이시켰다. 박테리아 배양물을 암피실린 100㎍/㎖의 존재하에 LB 배양액에서 증식시키고, 1mM IPTG의 존재하에 37℃에서 4시간동안 0.6 내지 1.0의 OD600으로 로그상 증식에서 유도하였다. 세포 펠렛을 원심분리에 의해 수확하였다.
T7 표지 및 카스파제 리더 서열(서열 23 및 서열 24) 뒤에 Hu-Asp2를 클로닝하기 위하여, T7-Hu-Asp2 서열(서열 21 및 서열 22)을 함유하는 위에서 생성된 구성물을 BamH1 부위에서 개방한 다음, 하기 서열 37 및 서열 38의 인산화된 카스파제 8 리더 올리고뉴클레오티드를 어닐링하고 벡터 DNA에 연결하였다.
<서열 37>
gatcgatgac tatctctgac tctccgcgtg aacaggacg
<서열 38>
gatccgtcct gttcacgcgg agagtcagag atagtcatc
각 세트의 올리고뉴클레오티드 5' 돌출부를 BamHI 부위에 연결되도록, 그러나 BamHI에 의한 후속 분해는 일어나지 않도록 고안하였다. 연결 반응은 이 콜리 균주 BL21로의 전이후에 단백질 발현의 분석을 위해 상기와 같이 JM109로 형질전환되었다.
asp2의 5' 말단의 GC 함량을 감소시키기 위하여, 15개 아미노산 위치에서 변질 코돈 염기를 G/C로부터 A/T로 변화시킨 한쌍의 역평행 올리고를 고안하였다(서열 25 및 서열 26). asp2의 5' 말단의 새로운 뉴클레오티드 서열은 코딩된 아미노산을 변화시키지 않았고, 이 콜리 발현을 최적화하도록 선택되었다. 센스 링커의 서열은 하기 서열 39 (5'→3')이다.
<서열 39>
cggcatccgg ctgcccctgc gtagcggtct gggtggtgct ccactgggtc tgcgtctgcc
ccgggagacc gacgaag
안티센스 링커의 서열은 서열 40 (5'→3')이다.
<서열 40>
cttcgtcggt ctcccggggc agacgcagac ccagtggagc accacccaga ccgctacgca
ggggcagccg gatgccg
0.1M NaCl-10mM 트리스(pH 7.4)에서 인산화된 링커들을 함께 어닐링한 후, 이들을 벡터 pTAC에서 Hu-ASp2의 독특한 ClaI 및 SmaI 부위로 연결하였다. 이소프로필 b-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)에 의한 유도를 사용한 유도성 발현에 있어서, 박테리아 배양물을 암시실린 100㎍/㎖의 존재하에 LB 배양액에서 증식시키고, 1mM IPTG의 존재하에 37℃에서 4시간동안 0.6 내지 1.0의 OD600으로 로그상 증식에서 유도하였다. 세포 펠렛을 원심분리에 의해 수확하였다.
리더 서열이 N-말단 서열 GSFV(서열 27 및 서열 28)로 시작하는 Hu-Asp2 폴리펩티드를 유리하도록 카스파제 8에 의한 제한된 단백질 분해에 의해 제거될 수 있는 벡터를 생성하기 위하여, 하기의 절차를 따랐다. 카스파제 8 절단 부위 IETD를 함유하는 하기 서열 41 및 서열 42 (5'→3')의 두 인산화된 올리고뉴클레오티드를 어닐링하고, BamHI로 개방된 pET23a+로 연결하였다:
<서열 41>
gatcgatgac tatctctgac tctccgctgg actctggtat cgaaaccgac g
<서열 42>
gatccgtcgg tttcgatacc agagtccagc ggagagtcag agatagtcat c
JM109로의 형질전환 후, 정제된 벡터 DNA를 회수하고 삽입물의 배향을 DNA 서열 분석에 의해 확인하였다. 하기 서열 43 및 서열 44 (5'→3')의 올리고뉴클레오티드를 선택된 Hu-Asp2 서열의 증폭에 사용하였다:
<서열 43>
aaggatcctt tgtggagatg gtggacaacc tg
<서열 44>
gaaagctttc atgactcatc tgtctgtgga atgttg
이들은 각각 삽입물의 5' 및 3' 말단의 양측에 BamHI 및 HindIII 부위를 위치시켰다. Asp2 서열은 2단계 PCR 주기에서 25주기동안 68℃에서 어닐링 및 연장을 사용하여 제조자가 제공한 프로토콜에 따라 어드밴티지-GC cDNA PCR[클론테크]을 사용하여 pcDNA3.1로 클로닝된 전장 Asp2 cDNA로부터 증폭되었다. 삽입물 및 벡터를 BamHI 및 HindIII로 절단하고, 아가로즈 겔을 통해 전기영동하여 정제한 다음, 고속 DNA 연결 키트[베링거 만하임]를 사용하여 연결하였다. 연결 반응을 사용하여 이 콜리 균주 JM109[프로메가]를 형질전환하였고, 플라스미드(퀴아젠, 퀴아프레프 미니스핀)의 정제 및 DNA 서열 분석을 위해 콜로니를 골랐다. 이소프로필 b-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)에 의한 유도를 사용하는 유도성 발현에 있어서, 발현 벡터를 이 콜리 균주 BL21(스트라타진)로 전이시켰다. 박테리아 배양물을 암피실린 100㎍/㎖의 존재하에 LB 배양액에서 증식시키고, 1mM IPTG의 존재하에 37℃에서 4시간동안 0.6 내지 1.0의 OD600로 로그상 증식에서 유도하였다. 세포 펠렛을 원심분리에 의해 수확하였다.
정제를 보조하기 위하여, BamHI 부위에서 구성물을 개방한 다음 6 히스티딘 서열을 함유하는 하기 서열 45 및 서열 46의 어닐링된 인산화된 올리고뉴클레오티드에서 연결함으로써 T7 리더 서열 뒤에 임의의 상기 구성물에 6-His 표지를 도입할 수 있다.
<서열 45>
gatcgcatca tcaccatcac catg
<서열46>
gatccatggt gatggtgatg atgc
각 세트의 올리고뉴클레오티드의 5' 돌출부는 BamHI 부위에의 연결을 허용하지만 BamHI에 의한 후속 분해는 허용하지 않도록 고안되었다.
박테리아 펠렛의 제조:
10.8L의 증식을 나타내는 36.34g의 박테리아 펠렛을 2M KCl, 0.1M 트리스, 0.05M EDTA, 1mM DTT에서 3000 내지 5000rpm으로 20㎜ 조직 균질화기 프로브를 사용하여 전체 체적 200㎖에 분산시켰다. 전도성은 물로 약 193mMhos로 조절하였다.
펠렛이 분산된 후, 추가량의 KCl 용액을 첨가하여 전체 체적이 500㎖가 되게 하였다. 이 현탁액을 동일한 프로브를 사용하여 5000rpm에서 약 3분동안 더 균질화하였다. 그 다음, 혼합물을 10,000psi에서 래니(Rannie) 고압 균질화기를 통과시켰다.
모든 경우에서, 펠렛 물질은 다음으로 운반되었지만, 가용성 분획은 버려졌다. 생성된 용액은 GSA 회전자에서 1시간동안 12,500rpm에서 원심분리되었다. 펠렛은 동일한 조직 균질화기 프로브를 2,000rpm에서 사용하여 동일한 용액(DTT 없이)에 재현탁하였다. 3000rpm에서 5분동안 균질화한 후, 체적을 동일한 용액으로 500㎖으로 조절하고, 12,500rpm에서 1시간동안 돌렸다. 그 다음, 펠렛을 앞서와 같이 재현탁하였지만, 이번에는 최종 체적을 동일한 용액으로 1.5L로 만든 후 5분동안 균질화하였다. 동일한 속도에서 30분동안 원심분리한 후, 이 과정을 반복하였다. 그 다음, 펠렛을 냉수 약 150㎖에 재현탁하고, GSA 회전자에 사용된 6개의 원심분리관으로부터 펠렛을 모았다. 펠렛을 3,000rpm에서 5분동안 균질화하고, 냉수로 250㎖로 체적을 조절한 다음, 30분동안 돌렸다. 생성된 펠렛의 중량은 17.75g이었다.
요약: KCl 용액에서의 박테리아 펠렛의 용해 후, GSA 회전자에서의 원심분리를 사용하여 처음에 펠렛을 제조하였다. 그 다음, 동일한 용액을 재현탁/균질화를 위해 3번 더 사용하였다. 그 다음, 최종 물 세척/균질화를 수행하여 과량의 KCl 및 EDTA를 제거하였다.
rHuAsp2L 의 가용화 :
전술한 펠렛으로부터 rHuAsp2L을 가용화하기 위하여 9 내지 10㎖/g의 펠렛을 사용하였다. 17.75g의 펠렛을 해동하고, 8M 구아니딘 HCl 150㎖, 5mM βME, 0.1% DEA를 첨가하였다. 3M 트리스를 사용하여 pH를 8.6으로 적정하였다. 펠렛을 처음에 1000rpm에서 20㎜ 조직 균질화기 프로브를 사용하여 구아니딘 용액으로 재현탁하였다. 그 다음, 혼합물을 4℃에서 1시간동안 교반한 다음, GSA 회전자에서 12,500rpm에서 1시간동안 원심분리하였다. 그 다음, 생성된 현탁액을 SS-34 회전자에서 30분동안 40,000×g에서 원심분리하였다. 그 다음, 최종 상청액을 50㎖를 제외하고 -20℃에서 보관하였다.
가용화된 rHuAsp2L 의 고정화된 니켈 친화성 크로마토그래피
하기의 용액을 사용하였다:
A) 6M 구아니딘 HCl, 0.1M NaP, pH 8.0, 0.01M 트리스, 5mM βME, 0.5mM 이미다졸
A') 6M 우레아, 20mM NaP, pH 6.80, 50mM NaCl
B') 6M 우레아, 20mM NaP, pH 6.20, 50mM NaCl, 12mM 이미다졸
C') 6M 우레아, 20mM NaP, pH 6.80, 50mM NaCl, 300mM 이미다졸
주의: 완충제 A' 및 C'을 적당한 비로 혼합하여 중간 농도의 이미다졸을 제공하였다.
가용화된 물질 50㎖를 완충제 A 50㎖와 혼합한 후, 5×10㎝ 바이오래드 이코노(Biorad econo) 컬럼내 퀴아젠 Ni-NTA 슈퍼플로(SuperFlow)(완충제 A로 예비평형화시킴) 100 내지 125㎖에 첨가하였다. 이것을 냉실에서 4℃에서 밤새 서서히 섞어 주었다.
크로마토그래피 단계;
1) 통액시켜 배액한다.
2) 완충제 A 50㎖로 세척한다(통액 분획 수집)
3) 완충제 A 250㎖로 세척한다(세척 1)
4) 완충제 A 250㎖로 세척한다(세척 2)
5) 완충제 A' 250㎖로 세척한다.
6) 완충제 B' 250㎖로 세척한다.
7) 완충제 A' 250㎖로 세척한다.
8) 75mM 이미다졸 250㎖로 용출시킨다.
9) 150mM 이미다졸 250㎖로 용출시킨다(150-1).
10) 150mM 이미다졸 250㎖로 용출시킨다(150-2).
11) 300mM 이미다졸 250㎖로 용출시킨다(300-1).
12) 300mM 이미다졸 250㎖로 용출시킨다(300-2).
13) 300mM 이미다졸 250㎖로 용출시킨다(300-3).
크로마토그래피 결과:
rHuAsp는 75mM 이미다졸 내지 300mM 이미다졸에서 용출하였다. 75mM 분획뿐만 아니라 최초 150mM 이미다졸(150-1) 분획은 쿠마시 블루 염색된 겔에서 가시화된 바와 같이 오염 단백질을 함유하였다. 따라서, 분획 150-2 및 300-1은 이들이 최대량의 단백질을 함유하였기 때문에 리폴딩 실험에 사용될 것이다(쿠마시 블루 염색된 겔을 참조).
rHuAsp2L 의 리폴딩 실험:
실험 1:
150-2 40㎖에 1M DTT, 3M 트리스, pH 7.4 및 DEA를 각각 6mM, 50mM 및 0.1%의 최종 농도로 첨가하였다. 이를 찬(4℃) 20mM NaP, pH 6.8, 150mM NaCl 200㎖로 갑자기(교반하면서) 희석하였다. 이 희석으로 인해 최종 우레아 농도는 1M이 되었다. 이 용액은 실온이나 4℃에서 공기에 개방되도록 하더라도 투명하게 남아 있었다.
공기에 4℃에서 4 내지 5시간동안 개방되도록 한 후, 이 용액을 20mM NaP, pH 7.4, 150mM NaCl, 20% 글리세롤에 대하여 밤새 투석하였다. 이 방법은 단백질의침전 없이 용액에서 우레아를 효과적으로 제거한다.
실험 2:
150-2 용출액의 일부는 실험 1에서와 같이 처리된 아미콘 센트리프레프(Amicon Centriprep), 10,000MwCO에서 2배 농축되었다. 이 물질은 또한 용액에 남으며, 침전되지 않았다.
실험 3:
150-2 용출액 89㎖에 1M DTT, 3M 트리스, pH 7.4 및 DEA를 각각 6mM, 50mM 및 0.1%의 최종 농도로 첨가하였다. 이를 찬(4℃) 20mM NaP, pH 6.8, 150mM NaCl 445㎖로 갑자기(교반하면서) 희석하였다. 이 용액은 겉으로 보기에 침전이 없이 투명하게 보였다. 용액을 수거하여 실온으로 만들고 10분동안 교반한 후, MEA를 최종 농도가 0.1mM이 되도록 첨가하였다. 이것을 실온에서 1시간동안 천천히 교반하였다. 그 다음, 시스타민 및 CuSO4를 최종 농도가 각각 1mM 및 10mM이 되도록 첨가하였다. 이 용액을 실온에서 10분동안 천천히 교반한 후 4℃의 냉실로 옮기고 공기에 개방되게 하여 밤새 천천히 교반하였다.
다음날, 용액(겉보기에 침전 없이 여전히 투명함)을 100,000×g에서 1시간동안 원심분리하였다. 다수회 실험에서 얻은 상청액을 모으고, 안정화된 단백질의 대부분을 20mM NaP, pH 7.4, 150mM NaCl, 20% 글리세롤에 대하여 투석하였다. 투석 후, 물질을 -20℃에서 보관하였다.
단백질 용액(1M 우레아내에 있음)의 일부(약 10㎖)를 생화학 분석을 위해 따로 남겨두고, -20℃에서 동결 보관하였다.
실시예 10. 곤충 세포에서 Hu - Asp2 및 유도체의 발현
바쿨로비루스 감염에 의한 발현-Hu-Asp2 및 몇몇 유도체의 코딩 서열을 PCR를 사용하여 곤충 세포에서 발현되도록 프로세싱하였다. 전장 서열의 경우, 코작(Kozak) 공통 서열에 맞도록 번역 개시 부위를 수식한 5'-센스 올리고뉴클레오티드 프라이머를 Hu-Asp2 서열에 천연 판독 종료 코돈을 함유하는 3'-안티센스 프라이머와 짝지었다. pcDNA3.1(hygro)/Hu-Asp2 주형(실시예 12)을 PCR 증폭하였다. C-말단 막횡단 도메인을 삭제하거나(서열 29 및 서열 30) 막횡단 도메인을 삭제하고 C-말단에서 6-히스티딘 표지를 도입하는(서열 31 및 서열 32) Hu-Asp2의 두 유도체를 또한 PCR을 사용하여 프로세싱하였다. 전술한 것과 동일한 5'-센스 올리고뉴클레오티드 프라이머를 (1) 코돈 453 다음에 판독 종료 코돈을 도입하거나(서열 3) (2) 주형으로서 pcDNA3.1(hygro)/Hu-Asp-2L을 사용하여 6-헥사 시스티딘 표지에 이어서 PCR에서 판독 종료 코돈을 도입한 3'-안티센스 프라이머와 짝지었다. 모든 경우에서, PCR 반응은 공급자가 개설한 바와 같이 PwoI DNA 폴리머라제(베링거 만하임)를 사용하여 15주기 동안 증폭되도록 수행되었다. 반응 생성물을 분해하여 BamHI 및 NotI로 완성시키고 BamHI 및 NotI 분해된 바쿨로비루스 전이 벡터 pVL1393(인비트로젠)에 연결시켰다. 연결 부분을 사용하여 적격 이 콜리 DH5α 세포를 형질전환시키고 LB-Amp에서 항생물질 선택하였다. 플라스미드 DNA를 표준의 알칼리성 용해 및 CsCl에서의 밴드 분석에 의해 제조하여 바쿨로비루스 전이 벡터 pVL1393/Asp2, pVL1393/Asp2ΔTM 및 pVL1393/Asp2ΔTM(His)6을 수득하였다. 표준의 방법을 사용하여 재조합 바쿨로비루스의 생성 및 sf9 곤충 세포의 감염을 수행하였다.
트랜스펙션에 의한 발현-곤충 발현 벡터 pIZ/V5-His를 사용하여 High 5 곤충 세포에서의 Hu-Asp2ΔTM 및 Hu-Asp2ΔTM(His)6의 일시적 및 안정한 발현을 수행하였다. 발현 플라스미드 벡터 pVL1393/Asp2, pVL1393/Asp2ΔTM 및 pVL1393/Asp2ΔTM(His)6으로부터의 DNA 삽입물을 BamHI 및 NotI에 의한 이중 분해에 의해 절단하고, 표준의 방법을 사용하여 BamHI 및 NotI 분해된 pIZ/V5-His로 서브클로닝하였다. pIZ/Hu-Asp2ΔTM 및 pIZ/Hu-Asp2ΔTM(His)6으로 불리는 생성된 발현 플라스미드를 전술한 바와 같이 제조하였다.
트랜스펙션에 있어서, High 5 곤충 세포를 밀폐된 플라스크에서 27℃에서 젠타마이신 10㎍/㎖가 첨가된 하이 파이브(High five) 무혈청 배지에서 배양하였다. 표준의 방법을 사용하여 High 5 세포, 젠타마이신 10㎍/㎖가 첨가된 하이 파이브 무혈청 배지 및 인섹틴플러스(InsectinPlus) 리포좀(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로젠)을 사용하여 트랜스펙션을 수행하였다.
대규모의 일시 트랜스펙션에 있어서, 1.2×107개의 High 5 세포를 150㎜의 조직 배양 접시에 도말하고, 실온에서 15 내지 30분동안 부착시켰다. 부착시간동안 DNA/리포좀 혼합물은 무혈청 배지 6㎖, Asp2ΔTM/pIZ(+/- His) DNA 60㎍ 및 인섹틴 플러스 120㎕를 혼합하고 실온에서 15분동안 배양함으로써 DNA/리포좀 혼합물을 제조하였다. 세포의 접시로부터 도말 배지를 제거하고, 2rpm으로 일정하게 흔들면서 실온에서 4시간동안 DNA/리포좀 혼합물로 대체하였다. 추가로 6㎖의 배지를 접시에 첨가한 후, 습한 배양기에서 27℃에서 4일동안 배양하였다. 트랜스펙션된지 4일후, 배지를 수확하고, 500×g에서 원심분리에 의해 투명화하고, 웨스턴 블롯에 의해 Asp2에 대해 분석하였다. 안정한 발현을 위하여, 세포를 50㎍/㎖의 제오신 및 제한 희석에 의해 제조된 클론성 세포에 사용된 잔존 풀로 처리한 다음, 전술한 바와 같이 발현 수준을 분석하였다.
Hu - Asp2 Δ TM 및 Hu - Asp2 Δ TM ( His ) 6 의 정제-Hu-Asp2로부터의 막통과 단편의 제거에 의해 배양 배지로 폴리펩티드의 분비가 일어난다. 바쿨로비루스 감염 또는 트랜스펙션에 의한 단백질 생성 후에, 조정 배지를 수확하고, 원심분리에 의해 투명화하고, 트리스-HCl(pH 8.0)에 대하여 투석하였다. 그 다음, 이 물질을 NaCl구배를 사용하여 음이온 교환(트리스-HCl, pH 8.0) 크로마토그래피 후 양이온 교환 크로마토그래피(아세테이트 완충제, pH4.5)에 의한 연속 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 용출 프로파일을 (1) 웨스턴 블롯 분석 및 (2) 실시예 12에 기술된 펩티드 기질을 사용한 활성 분석에 의해 모니터링하였다. Hu-Asp2ΔTM(His)6의 경우, 조정 배지를 트리스 완충제(pH 8.0)에 대하여 투석하고, IMAC 수지에서 연속 크로마토그래피 후 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
정제된 Hu-Asp2ΔTM(His)6 단백질의 서열 분석 결과, 신호 펩티드가 절단된 것으로 나타났다[TQHGIRLPLR(서열 52)].
실시예 11. CHO 세포에서의 Hu - Asp2 의 발현
CHO - K1 세포에서의 Hu - Asp -2L의 이종 발현-Hu-Asp2의 전체 코딩 서열을, 발현에 걸쳐 유도되도록 CMV 즉시 초기 프로모터 및 bGH 폴리아데닐화 신호를 함유하는 pcNDA3.1(+)Hygro(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로젠)에 클로닝화하였다. 발현 플라스미드 pcNDA3.1(+)Hygro/Hu-Asp2를 알칼리성 용해 및 CsCl에서의 밴드 분석에 의해 제조하고, 두 쇄에서 완전히 서열결정하여 코딩 서열의 완전성을 증명하였다.
야생형 챠이니즈 햄스터 난소 세포(CHO-K1)를 ATCC로부터 구하였다. 세포를 5% CO2중에서 37℃에서 10% FCS를 함유하는 α-MEM내 단층 배양물에서 유지시켰다. CHO-K1 세포(60% 전면배양)의 두 100㎜ 접시를 공급자가 권한 바와 같이 양이온 리포좀 DOTAP를 사용하여 pcDNA3.1(+)/Hygro 단독(모의(Mock)) 또는 pcDNA3.1(+)Hygro/Hu-Asp2로 트랜스펙션시켰다. 세포를 플라스미드 DNA/리포좀 혼합물로 15시간동안 처리한 다음, 배지를 히그로마이신 B 500유니트/㎖를 함유하는 생육 배지로 대체하였다. pcDNA3.1(+)Hygro/Hu-Asp2 트랜스펙션된 CHO-K1 세포의 경우, 개개의 히그로마이신 B-내성 세포를 제한 희석에 의해 클로닝하였다. 개개의 세포주의 클론 확장후, Hu-Asp2 단백질의 발현을 이 콜리에서의 발현에 의해 제조된 재조합 Hu-Asp2에 대하여 생긴 다클론성 토끼 항혈청을 사용하여 웨스턴 블롯 분석에 의해 평가하였다. 거의 전면배양된 접시의 각 세포주를 PBS로 긁음으로써 수확하고, 세포를 원심분리에 의해 회수하였다. 세포 펠렛을 프로테아제 저해제를 함유하는 찬 용해 완충제(25mM 트리스-HCl(8.0)/5mM EDTA)에 재현탁하고, 세포를 초음파 처리에 의해 용해하였다. 가용성 및 막 분획물을 원심분리(105,000×g, 60분)에 의해 분리한 다음, 각 분획물로부터의 정규화된 양의 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분리하였다. 분리된 폴리펩티드의 PVDF 막으로의 전기이동 후, Hu-Asp-2L 단백질을 토끼 항-Hu-Asp2 항혈청(1/1000 희석)을 사용하여 검출하고, 항체-항원 복합체를 알칼리성 포스파타제 결합된 염소 항-토끼 항체(1/2500)를 사용하여 가시화하였다. 65kDa의 겉보기 Mr 값을 갖는 특정 면역반응성 단백질을 pcDNA3.1(+)Hygro/Hu-Asp2 트랜스펙션된 세포 및 모의-트랜스펙션되지 않은 세포에서 검출하였다. 또한, Hu-Asp2 폴리펩티드는 막 분획물에서만 검출되었고, 예상된 서열내에 신호 펩티드 및 하나의 막횡단 도메인의 존재와 일치하였다. 이 분석을 근거로, 클론 #5는 가장 높은 발현 수준의 Hu-Asp2 단백질을 나타내었고, 이 생성 세포주를 확대하여 정제를 위한 물질을 제공하였다.
CHO - K1 / Hu - Asp2 클론 #5로부터의 재조합 Hu - Asp -2L의 정제-전형적인 정제에서, 20개의 150㎜ 접시의 전면배양 세포로부터 유도된 클론 #5 세포 펠렛을 출발물질로서 사용하였다. 세포 펠렛을 전술한 바와 같이 50㎖의 찬 용해 완충제에 재현탁하였다. 세포를 폴리트론 균질화(2×20초)에 의해 용해하고, 용해물을 338,000×g에서 20분동안 원심분리하였다. 그 다음, 막 펠렛을 50mM β-옥틸글루코사이드를 함유하는 찬 용해 완충제 20㎖에 재현탁한 후, 4℃에서 1시간동안 흔들어 주었다. 디터전트 추출물을 338,000×g에서 20분동안 원심분리에 의해 투명화하고, 추가의 분석을 위하여 상청액을 취하였다.
β-옥틸글루코사이드 추출물을 25mM 트리스-HCl(pH 8.0)/50mM β-옥틸글루코사이드로 미리 평형화시킨 모노 Q 음이온 교환 칼럼에 적용하였다. 샘플 적용 후, 칼럼을 증가하는 NaCl 농도(30분에 걸쳐 0 내지 1.0M)의 선형 구배로 용출하고, 개개의 분획물을 웨스턴 블롯에 의해 β-세크레타제 활성에 대하여 분석하였다(이하 참조). Hu-Asp-2L 면역반응성 및 β-세크레타제 활성을 함유하는 분획물을 모으고, 25mM NaOAc(pH 4.5)/50mM β-옥틸글루코사이드에 대하여 투석하였다. 투석 후, 침전된 물질을 원심분리에 의해 제거하고, 25mM NaOAcl(pH 4.5)/50mM β-옥틸글루코사이드로 미리 평형화시킨 모노S 양이온 교환 칼럼에서 가용성 물질을 크로마토그래피하였다. 칼럼을 증가하는 NaCl 농도(30분에 걸쳐 0 내지 1.0M)의 선형 구배를 사용하여 용출하고, 개개의 분획물을 웨스턴 블롯에 의해 β-세크레타제 활성에 대하여 분석하였다. Hu-Asp2 면역반응성 및 β-세크레타제 활성을 둘다 함유하는 분획물을 합하고, SDS-PAGE/쿠마지 블루 염색에 의해 순도가 >90%인 것으로 결정되었다.
실시예 12. 펩티드 기질을 사용한 Hu - Asp2 β 세크레타제 활성의 분석
β- 세크레타제 분석-β-UV 검출기가 달린 RP-HPLC에 의해 APP 스웨덴 돌연변이를 함유하는 합성 펩티드의 가수분해를 정량함으로써 β-세크레타제 활성을 측정하였다. 각 반응물은 50mM Na-MES(pH 5.5), 1% β-옥틸글루코사이드, 펩티드 기질(SEVNLDAEFR, 70μM; 서열 54) 및 효소(1-5㎍ 단백질)를 함유하였다. 반응물을 37℃에서 여러번 배양하고, 반응 생성물을 30분에 걸쳐 0 내지 70B로부터 선형 구배를 사용하여 RP-HPLC에 의해 분할하였다(A=물내 0.1% TFA, B=1% TFA/10% 물/90% AcCN). 용출 프로파일은 214㎚에서의 흡광도에 의해 모니터링하였다. 예비 실험에서, 완전한 펩티드 기질에 앞서 용출된 두 생성물 피크는 에드만(Edman) 서열결정 및 MADLI-TOF 질량 분광법을 사용하여 서열 DAEFR 및 SEVNL을 갖는 것으로 확인되었다. 펩티드 기질의 가수분해율은 214㎚에서의 흡광도로부터 유도된 두 생성물 펩티드 및 출발 물질의 적분된 피크 면적을 비교함으로써 계산하였다. 프로테아제 절단 반응의 특이성은 프로테아제 저해제의 혼합물(8μM 펩스타틴 A, 10μM 류펩틴, 10μM E64 및 5mM EDTA)의 존재하에 β-세크레타제 분석을 수행함으로써 결정하였다.
또 다른 β-세크레타제 분석은 내부적으로 반응정지된 형광 기질을 이용하여 하나의 샘플 또는 다수웰 형태에서 형광 분광법을 사용하여 효소 활성을 모니터링한다. 각 반응물은 50mM Na-MES(pH 5.5), 펩티드 기질 MCA-EVKMDAEF[K-DNP](서열 58)(바이오소스 인터내셔널(BioSource International)(50μM) 및 정제된 Hu-Asp2 효소를 함유하였다. 이들 성분을 여러번 37℃로 평형화하고, 기질의 첨가에 의해 반응을 개시하였다. 330㎚에서 여기를 수행하고, 390㎚에서 형광 방출을 측정함으로써 반응 동력학을 모니터링하였다. Hu-Asp2 활성을 조절하는 화합물을 검출하기 위하여, 반응의 예비반응기 동안 시험 화합물을 첨가하고, 반응의 동력학을 전술한 바와 같이 모니터링하였다. 활성화 인자는 형광의 출현율을 증가시키는 화합물로서 평가되고, 저해제는 형광의 출현율을 감소시키는 것으로 평가된다.
본 발명은 전술한 설명 및 실시예에 특히 기술된 것과는 달리 실시될 수도 있음이 분명할 것이다. 상기 교시로 미루어 보아 본 발명의 다수의 변경 및 변이가 가능하며, 이들은 따라서 본 발명의 범주에 포함된다. 본원에 인용된 모든 공개문헌의 전체 개시내용은 본원에 참조로 인용된다.
본 발명에 의해 β 세크레타제 프로테아제 및 변이체, 이들을 코딩하는 핵산 등을 확인 및 특성화하고 알츠하이머병의 치료 기능에 중요한 프로테아제의 영역을 기술함으로써 알츠하이머병의 치료에 대한 새로운 대안을 제시할 수 있게 되었다.
SEQUENCE LISTING <110> Gurney, Mark E. Bienkowski, Michael J. Heinrikson, Robert L. Parodi, Luis A. Yan, Riqiang Pharmacia & Upjohn Company <120> Alzheimer's Disease Secretase <130> 6177.P CP <140> <141> <150> 60/101,594 <151> 1998-09-24 <160> 49 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1804 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgggcgcac tggcccgggc gctgctgctg cctctgctgg cccagtggct cctgcgcgcc 60 gccccggagc tggcccccgc gcccttcacg ctgcccctcc gggtggccgc ggccacgaac 120 cgcgtagttg cgcccacccc gggacccggg acccctgccg agcgccacgc cgacggcttg 180 gcgctcgccc tggagcctgc cctggcgtcc cccgcgggcg ccgccaactt cttggccatg 240 gtagacaacc tgcaggggga ctctggccgc ggctactacc tggagatgct gatcgggacc 300 cccccgcaga agctacagat tctcgttgac actggaagca gtaactttgc cgtggcagga 360 accccgcact cctacataga cacgtacttt gacacagaga ggtctagcac ataccgctcc 420 aagggctttg acgtcacagt gaagtacaca caaggaagct ggacgggctt cgttggggaa 480 gacctcgtca ccatccccaa aggcttcaat acttcttttc ttgtcaacat tgccactatt 540 tttgaatcag agaatttctt tttgcctggg attaaatgga atggaatact tggcctagct 600 tatgccacac ttgccaagcc atcaagttct ctggagacct tcttcgactc cctggtgaca 660 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335 Trp Thr Gly Ser Gln Leu Ala Cys Trp Thr Asn Ser Glu Thr Pro Trp 340 345 350 Ser Tyr Phe Pro Lys Ile Ser Ile Tyr Leu Arg Asp Glu Asn Ser Ser 355 360 365 Arg Ser Phe Arg Ile Thr Ile Leu Pro Gln Leu Tyr Ile Gln Pro Met 370 375 380 Met Gly Ala Gly Leu Asn Tyr Glu Cys Tyr Arg Phe Gly Ile Ser Pro 385 390 395 400 Ser Thr Asn Ala Leu Val Ile Gly Ala Thr Val Met Glu Gly Phe Tyr 405 410 415 Val Ile Phe Asp Arg Ala Gln Lys Arg Val Gly Phe Ala Ala Ser Pro 420 425 430 Cys Ala Glu Ile Ala Gly Ala Ala Val Ser Glu Ile Ser Gly Pro Phe 435 440 445 Ser Thr Glu Asp Val Ala Ser Asn Cys Val Pro Ala Gln Ser Leu Ser 450 455 460 Glu Pro Ile Leu Trp Ile Val Ser Tyr Ala Leu Met Ser Val Cys Gly 465 470 475 480 Ala Ile Leu Leu Val Leu Ile Val Leu Leu Leu Leu Pro Phe Arg Cys 485 490 495 Gln Arg Arg Pro Arg Asp Pro Glu Val Val Asn Asp Glu Ser Ser Leu 500 505 510 Val Arg His Arg Trp Lys 515 <210> 3 <211> 2070 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atggcccaag ccctgccctg gctcctgctg tggatgggcg cgggagtgct gcctgcccac 60 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taatgggtga ggttaccaac 1080 cagtccttcc gcatcaccat ccttccgcag caatacctgc ggccagtgga agatgtggcc 1140 acgtcccaag acgactgtta caagtttgcc atctcacagt catccacggg cactgttatg 1200 ggagctgtta tcatggaggg cttctacgtt gtctttgatc gggcccgaaa acgaattggc 1260 tttgctgtca gcgcttgcca tgtgcacgat gagttcagga cggcagcggt ggaaggccct 1320 tttgtcacct tggacatgga agactgtggc tacaacattc cacagacaga tgagtcatga 1380 <210> 24 <211> 459 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Met Thr 1 5 10 15 Ile Ser Asp Ser Pro Arg Glu Gln Asp Gly Ser Thr Gln His Gly Ile 20 25 30 Arg Leu Pro Leu Arg Ser Gly Leu Gly Gly Ala Pro Leu Gly Leu Arg 35 40 45 Leu Pro Arg Glu Thr Asp Glu Glu Pro Glu Glu Pro Gly Arg Arg Gly 50 55 60 Ser Phe Val Glu Met Val Asp Asn Leu Arg Gly Lys Ser Gly Gln Gly 65 70 75 80 Tyr Tyr Val Glu Met Thr Val Gly Ser Pro Pro Gln Thr Leu Asn Ile 85 90 95 Leu Val Asp Thr Gly Ser Ser Asn Phe Ala Val Gly Ala Ala Pro His 100 105 110 Pro Phe Leu His Arg Tyr Tyr Gln Arg Gln Leu 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gcagcctcct ccacggagaa gttccctgat 960 ggtttctggc taggagagca gctggtgtgc tggcaagcag gcaccacccc ttggaacatt 1020 ttcccagtca tctcactcta cctaatgggt gaggttacca accagtcctt ccgcatcacc 1080 atccttccgc agcaatacct gcggccagtg gaagatgtgg ccacgtccca agacgactgt 1140 tacaagtttg ccatctcaca gtcatccacg ggcactgtta tgggagctgt tatcatggag 1200 ggcttctacg ttgtctttga tcgggcccga aaacgaattg gctttgctgt cagcgcttgc 1260 catgtgcacg atgagttcag gacggcagcg gtggaaggcc cttttgtcac cttggacatg 1320 gaagactgtg gctacaacat tccacagaca gatgagtcac agcagcagca gcagcagtga 1380 <210> 32 <211> 459 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Met Ala Gln Ala Leu Pro Trp Leu Leu Leu Trp Met Gly Ala Gly Val 1 5 10 15 Leu Pro Ala His Gly Thr Gln His Gly Ile Arg Leu Pro Leu Arg Ser 20 25 30 Gly Leu Gly Gly Ala Pro Leu Gly Leu Arg Leu Pro Arg Glu Thr Asp 35 40 45 Glu Glu Pro Glu Glu Pro Gly Arg Arg Gly Ser Phe Val Glu Met Val 50 55 60 Asp Asn Leu Arg Gly Lys Ser Gly Gln Gly Tyr Tyr Val Glu Met Thr 65 70 75 80 Val Gly Ser Pro Pro Gln Thr Leu Asn Ile Leu Val Asp Thr Gly Ser 85 90 95 Ser Asn Phe Ala Val Gly Ala Ala Pro His Pro Phe Leu His Arg Tyr 100 105 110 Tyr Gln Arg Gln Leu Ser Ser Thr Tyr Arg Asp Leu Arg Lys Gly Val 115 120 125 Tyr Val Pro Tyr Thr Gln Gly Lys Trp Glu Gly Glu Leu Gly Thr Asp 130 135 140 Leu Val Ser Ile Pro His Gly Pro Asn Val Thr Val Arg Ala Asn Ile 145 150 155 160 Ala Ala Ile Thr Glu Ser Asp Lys Phe Phe Ile Asn Gly Ser Asn Trp 165 170 175 Glu Gly Ile Leu Gly Leu Ala Tyr Ala Glu Ile Ala Arg Pro Asp Asp 180 185 190 Ser Leu Glu Pro Phe Phe Asp Ser Leu Val Lys Gln Thr His Val Pro 195 200 205 Asn Leu Phe Ser Leu Gln Leu Cys Gly Ala Gly Phe Pro Leu Asn Gln 210 215 220 Ser Glu Val Leu Ala Ser Val Gly Gly Ser Met Ile Ile Gly Gly Ile 225 230 235 240 Asp His Ser Leu Tyr Thr Gly Ser Leu Trp Tyr Thr Pro Ile Arg Arg 245 250 255 Glu Trp Tyr Tyr Glu Val Ile Ile Val Arg Val Glu Ile Asn Gly Gln 260 265 270 Asp Leu Lys Met Asp Cys Lys Glu Tyr Asn Tyr Asp Lys Ser Ile Val 275 280 285 Asp Ser Gly Thr Thr Asn Leu Arg Leu Pro Lys Lys Val Phe Glu Ala 290 295 300 Ala Val Lys Ser Ile Lys Ala Ala Ser Ser Thr Glu Lys Phe Pro Asp 305 310 315 320 Gly Phe Trp Leu Gly Glu Gln Leu Val Cys Trp Gln Ala Gly Thr Thr 325 330 335 Pro Trp Asn Ile Phe Pro Val Ile Ser Leu Tyr Leu Met Gly Glu Val 340 345 350 Thr Asn Gln Ser Phe Arg Ile Thr Ile Leu Pro Gln Gln Tyr Leu Arg 355 360 365 Pro Val Glu Asp Val Ala Thr Ser Gln Asp Asp Cys Tyr Lys Phe Ala 370 375 380 Ile Ser Gln Ser Ser Thr Gly Thr Val Met Gly Ala Val Ile Met Glu 385 390 395 400 Gly Phe Tyr Val Val Phe Asp Arg Ala Arg Lys Arg Ile Gly Phe Ala 405 410 415 Val Ser Ala Cys His Val His Asp Glu Phe Arg Thr Ala Ala Val Glu 420 425 430 Gly Pro Phe Val Thr Leu Asp Met Glu Asp Cys Gly Tyr Asn Ile Pro 435 440 445 Gln Thr Asp Glu Ser His His His His His His 450 455 <210> 33 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Ser Glu Gln Gln Arg Arg Pro Arg Asp Pro Glu Val Val Asn Asp Glu 1 5 10 15 Ser Ser Leu Val Arg His Arg Trp Lys 20 25 <210> 34 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Ser Glu Gln Leu Arg Gln Gln His Asp Asp Phe Ala Asp Asp Ile Ser 1 5 10 15 Leu Leu Lys <210> 35 <211> 29 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 35 gtggatccac ccagcacggc atccggctg 29 <210> 36 <211> 36 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 36 gaaagctttc atgactcatc tgtctgtgga atgttg 36 <210> 37 <211> 39 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 37 gatcgatgac tatctctgac tctccgcgtg aacaggacg 39 <210> 38 <211> 39 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 38 gatccgtcct gttcacgcgg agagtcagag atagtcatc 39 <210> 39 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Hu-Asp2 <400> 39 cggcatccgg ctgcccctgc gtagcggtct gggtggtgct ccactgggtc tgcgtctgcc 60 ccgggagacc gacgaag 77 <210> 40 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Hu-Asp2 <400> 40 cttcgtcggt ctcccggggc agacgcagac ccagtggagc accacccaga ccgctacgca 60 ggggcagccg gatgccg 77 <210> 41 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Caspase 8 Cleavage Site <400> 41 gatcgatgac tatctctgac tctccgctgg actctggtat cgaaaccgac g 51 <210> 42 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Caspase 8 Cleavage Site <400> 42 gatccgtcgg tttcgatacc agagtccagc ggagagtcag agatagtcat c 51 <210> 43 <211> 32 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 43 aaggatcctt tgtggagatg gtggacaacc tg 32 <210> 44 <211> 36 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 44 gaaagctttc atgactcatc tgtctgtgga atgttg 36 <210> 45 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 6-His tag <400> 45 gatcgcatca tcaccatcac catg 24 <210> 46 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 6-His tag <400> 46 gatccatggt gatggtgatg atgc 24 <210> 47 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Introduce KK motif <400> 47 gactgaccac tcgaccaggt tc 22 <210> 48 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Introduce KK motif <400> 48 cgaattaaat tccagcacac tggctacttc ttgttctgca tctcaaagaa c 51 <210> 49 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Introduce KK motif <400> 49 cgaattaaat tccagcacac tggcta 26

Claims (57)

  1. 아스파르틸 프로테아제 활성을 보유하는 도 1 (서열 2)에 기재된 아미노산 서열의 단편을 포함하는 단리 또는 정제된 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단편이 Asp1 아스파르틸 프로테아제 활성 부위 트리펩티드인 DTG 및 DSG를 포함하며 폴리펩티드는 APP 프로세싱에 관여하는 아스파르틸 프로테아제 활성을 나타내는 것인 단리 또는 정제된 폴리펩티드.
  3. 도 1 (서열 2)에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로 형질전환 또는 트랜스펙션된 숙주 세포를, 상기 세포가 상기 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 발현시키는 조건하에 배양하는 단계, 및
    발현된 폴리펩티드를 단리하는 단계
    를 포함하는 방법에 의해 제조되는 제1항의 단리 또는 정제된 폴리펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 막횡단 도메인이 결여된 단리 또는 정제된 폴리펩티드.
  5. 아스파르틸 프로테아제 활성 부위 트리펩티드인 DTG 및 DSG를 포함하고 APP 프로세싱에 관여하는 아스파르틸 프로테아제 활성을 나타내는 서열 2의 Asp1 단백질 아미노산 서열의 단편을 포함하며, 막횡단 도메인이 결여되고 APP 프로세싱에 관여하는 아스파르틸 프로테아제 활성을 나타내는 단리 또는 정제된 폴리펩티드.
  6. 제5항에 있어서, 서열 2의 아미노산 110 내지 305를 포함하는 단리 또는 정제된 폴리펩티드.
  7. 아스파르틸 프로테아제 활성 부위 트리펩티드인 DTG 및 DSG를 포함하고 APP 프로세싱에 관여하는 아스파르틸 프로테아제 활성을 나타내는 서열 2의 Asp1 단백질 아미노산 서열의 단편과 95％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 막횡단 도메인이 결여되고 APP 프로세싱에 관여하는 아스파르틸 프로테아제 활성을 나타내는 단리 또는 정제된 폴리펩티드.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 신호 펩티드를 추가로 포함하는 단리 또는 정제된 폴리펩티드.
  9. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 펩티드 표지(tag)를 추가로 포함하는 단리 또는 정제된 폴리펩티드.
  10. 제1항 내지 제3항 및 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 코딩 하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리 또는 정제된 폴리뉴클레오티드.
  11. 제10항에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 서열 1의 뉴클레오티드 327 내지 915를 포함하는 것인 단리 또는 정제된 폴리뉴클레오티드.
  12. (1) 42 ℃에서 6×SSC 및 0.1％ SDS를 포함하는 혼성화 완충액 중에서 혼성화 및 (2) 65 ℃에서 1×SSC 및 0.1％ SDS를 포함하는 세척 용액에서 세척하는 엄격 혼성화 조건하에 서열 1의 상보체와 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 막횡단 도메인이 결여되고 APP 프로세싱에 관여하는 아스파르틸 프로테아제 활성을 나타내는 단리 또는 정제된 폴리뉴클레오티드.
  13. 제12항에 있어서, 폴리펩티드가 아스파르틸 프로테아제 활성 부위 트리펩티드인 DTG 및 DSG를 포함하는 것인 단리 또는 정제된 폴리뉴클레오티드.
  14. 제12항에 있어서, 코딩된 폴리펩티드가 이종 펩티드 표지를 추가로 포함하는 것인 단리 또는 정제된 폴리뉴클레오티드.
  15. 제12항에 있어서, 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 프레임내(in-frame) 융합된 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 신호 펩티드는 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션된 숙주 세포에서 세포외 분비를 촉진시키고, 폴리펩티드는 상기 숙주 세포에 의해 분비되고 APP 프로세싱에 관여하는 아스파르틸 프로테아제 활성을 나타내는 것인 단리 또는 정제된 폴리뉴클레오티드.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  17. 이종 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  18. 제17항에 있어서, 포유동물 숙주 세포에서의 발현을 위해 폴리뉴클레오티드를 이종 조절 서열에 작동가능하게 연결시킨 벡터.
  19. 제18항에 있어서, 곤충 숙주 세포에서의 발현을 위해 폴리뉴클레오티드를 이종 조절 서열에 작동가능하게 연결시킨 벡터.
  20. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드로 형질전환 또는 트랜스펙션된 숙주 세포.
  21. 제20항에 있어서, 포유동물 세포인 숙주 세포.
  22. 제21항에 있어서, 인간 세포주로부터 유도된 숙주 세포.
  23. 제20항의 숙주 세포를 이 세포가 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 발현시키는 조건하에 배양하는 것을 포함하는, 아스파르틸 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 제조하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 세포 또는 배양 배지로부터 폴리펩티드를 단리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  25. (a) 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드로 형질전환 또는 트랜스펙션된 숙주 세포를 시험 물질의 존재 및 부재하에 상기 세포가 폴리펩티드를 발현시키는 조건하에 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 세포에 의해 발현되는 폴리펩티드의 단백질분해 활성을 시험 물질의 존재 및 부재하에 비교하는 단계
    를 포함하며, 시험 물질의 존재하에 감소된 단백질분해 활성에 의해 상기 시험 물질을 아스파르틸 프로테아제 폴리펩티드의 프로테아제 활성을 감소시키는 물질로서 확인하는 것인, 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 APP 기질에 대한 아스파르틸 프로테아제 폴리펩티드의 프로테아제 활성을 감소시키는 물질을 확인하는 방법.
  26. (a) 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항의 폴리펩티드의 단백질분해 활성을 시 험 물질의 존재 및 부재하에 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 폴리펩티드의 단백질분해 활성을 시험 물질의 존재 및 부재하에 비교하는 단계
    를 포함하며, 시험 물질의 존재하에 감소된 단백질분해 활성에 의해 상기 시험 물질을 아스파르틸 프로테아제 폴리펩티드의 프로테아제 활성을 감소시키는 물질로서 확인하는 것인, APP 기질에 대한 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항의 폴리펩티드의 프로테아제 활성을 감소시키는 물질을 확인하는 방법.
  27. (a) 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)의 프로세싱에 관여하는 Asp1 아스파르틸 프로테아제 활성을 나타내며, 이 폴리펩티드를 코딩하고 (i) 42 ℃에서 6×SSC 및 0.1％ SDS를 포함하는 혼성화 완충액 중에서 혼성화 및 (ii) 65 ℃에서 1×SSC 및 0.1％ SDS를 포함하는 세척 용액 중에서 세척하는 엄격 혼성화 조건하에 서열 1의 상보체와 혼성화하는 핵산 분자로 형질전환 또는 트렌스펙션된 숙주 세포에 의해 발현되는 재조합 폴리펩티드인 Asp1 아스파르틸 프로테아제를 시험 물질의 존재 및 부재하에 APP와 접촉시키는 단계;
    (b) Asp1 아스파르틸 프로테아제의 APP 프로세싱 활성을 상기 시험 물질의 존재 및 부재하에 결정하는 단계; 및
    (c) 시험 물질의 존재하의 Asp1 아스파르틸 프로테아제의 APP 프로세싱 활성을 시험 물질의 부재하의 활성과 비교하여 Asp1 아스파르틸 프로테아제의 활성을 조절하는 물질을 확인하는 단계
    를 포함하며, Asp1 저해제인 조절자가 APP 프로세싱을 감소시키며 Asp1 아고니스트인 조절자는 APP 프로세싱을 증가시키는 것인, Asp1 아스파르틸 프로테아제의 활성을 조절하는 물질을 확인하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 아밀로이드 전구체 단백질이 APP의 인간 이소폼인 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 단계 (a)의 프로테아제가 정제 및 단리된 프로테아제인 방법.
  30. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 접촉 단계가 시험 물질의 존재 및 부재하에 프로테아제를 발현시키는 형질전환 또는 트랜스펙션된 세포를 배양하는 것을 포함하며, 아밀로이드 전구체 단백질은 세포에 의해 발현되는 것인 방법.
  31. (a) 서열 2에 기재된 Asp1 아미노산 서열 또는 APP 프로세싱에 관여하는 Asp1 아스파르틸 프로테아제 활성을 나타내는 그의 단편과 95％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 상기 프로테아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로 형질전환 또는 트랜스펙션된 세포에 의해 발현되는 재조합 폴리펩티드를 포함하는 프로테아제를, 시험 물질의 존재 및 부재하에 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) 기질과 접촉시키는 단계;
    (b) APP 기질에 대한 상기 프로테아제의 단백질분해 프로세싱 활성을 상기 시험 물질의 존재 및 부재하에 결정하는 단계; 및
    (c) 시험 물질의 존재하의 아스파르틸 프로테아제의 단백질분해 프로세싱 활성을 시험 물질의 부재하의 활성과 비교하여 프로테아제의 APP 프로세싱 활성을 억제하는 물질을 확인하는 단계
    를 포함하며, 시험 물질의 존재하의 감소된 활성에 의해 프로테아제의 APP 프로세싱 활성을 억제하는 물질을 확인하는 것인, 프로테아제의 APP 프로세싱 활성을 억제하는 물질을 확인하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 프로테아제가 서열 2에 기재된 Asp1 아미노산 서열 또는 APP를 아밀로이드 베타로 프로세싱하는데 관여하는 Asp1 프로테아제 활성을 나타내는 서열 2의 단편을 포함하는 것인 방법.
  33. (a) APP 프로세싱에 관여하는 Asp1 아스파르틸 프로테아제 활성을 나타내는 재조합 폴리펩티드를 포함하며, 상기 프로테아제를 코딩하고 (i) 42 ℃에서 6×SSC 및 0.1％ SDS를 포함하는 혼성화 완충액 중에서 혼성화 및 (ii) 65 ℃에서 1×SSC 및 0.1％ SDS를 포함하는 세척 용액 중에서 세척하는 엄격 혼성화 조건하에 서열 1에 기재된 뉴클레오티드 서열의 상보체와 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로 형질전환 또는 트렌스펙션된 세포에 의해 발현되는 프로테아제를 시험 물질의 존재 및 부재하에 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) 기질과 접촉시키는 단계;
    (b) APP 기질에 대한 프로테아제의 단백질분해 프로세싱 활성을 상기 시험 물질의 존재 및 부재하에 결정하는 단계; 및
    (c) 시험 물질의 존재하의 아스파르틸 프로테아제의 단백질분해 프로세싱 활성을 시험 물질의 부재하의 활성과 비교하여 프로테아제의 APP 프로세싱 활성을 억제하는 물질을 확인하는 단계
    를 포함하며, 시험 물질의 존재하의 감소된 활성에 의해 프로테아제의 APP 프로세싱 활성을 억제하는 물질을 확인하는 것인, 프로테아제의 APP 프로세싱 활성을 억제하는 물질을 확인하는 방법.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 프로테아제가 정제 및 단리된 프로테아제인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 프로테아제가 다른 프로테아제를 실질적으로 함유하지 않는 것인 방법.
  36. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 상기 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 것인 방법.
  37. 제34항에 있어서, 상기 접촉 단계가 시험 물질의 존재 및 부재하에 상기 프로테아제를 발현시키는 형질전환 또는 트랜스펙션된 세포를 배양하는 것을 포함하 는 것인 방법.
  38. 제33항에 있어서, APP 기질이 상기 세포에 의해 발현되는 APP 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 숙주 세포가 인간 배아 신장 세포주 293 (HEK293) 세포인 방법.
  40. 제33항 또는 제38항에 있어서, APP 기질이 형광발생 기질 또는 발색 기질인 방법.
  41. 제33항 또는 제38항에 있어서, APP 기질이 세포에 의해 발현되고 카르복시 말단의 디-리신 (KK)을 포함하며, 상기 접촉 단계가 프로테아제를 발현시키는 세포를 시험 물질의 존재 및 부재하에 APP 기질과 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
  42. 뉴클레오티드 15개 내지 100개 길이의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 서열 1의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 또는 그의 상보체와 6×SSC 및 0.1％ SDS를 포함하는 혼성화 용액 중에서 2.5시간 동안 배양 및 65 ℃에서 1.0×SSC 및 0.1％ SDS를 포함하는 세척 용액 중에서 세척하는 혼성화 조건하에 혼성화하며, 트랜스펙션된 HEK293-SwKK 세포에서 아밀로이드 베타 (A베타) 프로세싱을 트랜스펙션되지 않은 HEK293-SwKK 세포에서의 A베타 프로세싱에 비해 감소시키는 단리된 핵산.
  43. 제42항에 있어서, 뉴클레오티드 15개 내지 30개 길이인 단리된 핵산.
  44. 제43항에 있어서, 뉴클레오티드 20개 내지 30개 길이인 단리된 핵산.
  45. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 분자가 서열 1에 상보적인 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산.
  46. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, DNA를 포함하는 단리된 핵산.
  47. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, RNA를 포함하는 단리된 핵산.
  48. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트랜스펙션된 세포에서 A베타(1-40) 프로세싱을 상기 트랜스펙션되지 않은 세포에 비해 50％ 이상 감소시키는 단리된 핵산.
  49. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트랜스펙션된 세포에서 A베타(1-42) 프로세싱을 상기 트랜스펙션되지 않은 세포에 비해 50％ 이상 감소시키는 단리된 핵산.
  50. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 벡터.
  51. 세포에서 Asp1 전사 또는 판독을 감소시킴으로써 Asp1 폴리펩티드 생산을 감소시킬 수 있는 안티센스 시약을 포함하는 조성물로 세포를 시험관내에서 형질전환 또는 트랜스펙션시키는 단계를 포함하며, 상기 세포에서 감소된 Asp1 폴리펩티드 생산은 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)의 아밀로이드 베타 (A베타)로의 세포내 프로세싱 감소와 상관관계가 있는 것인, APP로부터 A베타의 세포내 생산을 감소시키는 방법.
  52. 세포에서 Asp1 전사 또는 판독을 감소시킴으로써 Asp1 폴리펩티드 생산을 감소시키는데 효과적인 양의 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 조성물로 세포를 시험관내에서 형질전환 또는 트랜스펙션시키는 단계를 포함하며, 상기 세포에서 감소된 Asp1 폴리펩티드 생산은 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)의 아밀로이드 베타 (A베타)로의 세포내 프로세싱 감소와 상관관계가 있는 것인, APP로부터 A베타의 세포내 생산을 감소시키는 방법.
  53. 제51항에 있어서, 상기 형질전환 또는 트랜스펙션 단계에 앞서 A베타를 생산하는 포유동물 세포를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  54. 제51항에 있어서, 상기 세포가 신경 세포인 방법.
  55. 제51항에 있어서, 안티센스 시약이 Hu-Asp mRNA에 결합할 수 있는 단쇄 핵산 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
  56. 제51항에 있어서, 안티센스 시약이 Hu-Asp DNA에 결합할 수 있는 단쇄 핵산 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
  57. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항의 단리된 핵산을 포함하는, 알츠하이머병 치료용 제약 조성물.
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