CN111518793A - 年轻人血源APPα-分泌酶在阿尔茨海默病中的应用 - Google Patents

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Abstract

年轻人血源APPα‑分泌酶在阿尔茨海默病中的应用，涉及人血液制品生物制药领域，正常年轻人的年龄>18岁、<35岁的血清、血浆淀粉样前体蛋白即amyloid precursor protein简称为APP特异性α‑分泌酶样活性组分即APP419Y™的分离、纯化和制备方法，以及在预防和治疗老年神经退行性疾病，包括阿尔茨海默病即Alzheimer's Disease简称为AD和帕金森病即Parkinson's disease简称为PD的应用；本发明确认了αCBSF是特异性并剂量依赖性地对大脑型fAPP695蛋白的α‑分泌酶切，更重要显示αCBSF不会裂解前体促炎细胞因子，包括IL‑6、TNFα以及与肿瘤生长相关的前体因子，亦不会引起病理性炎症反应以及肿瘤的发生发展，最终证实了αCBSF通过多靶点分子生物学机制减轻和改善AD小鼠AD病理改变和行为障碍。

Description

年轻人血源APPα-分泌酶在阿尔茨海默病中的应用
【技术领域】
本发明涉及人血液制品生物制药领域，尤其是涉及年轻人血源APPα-分泌酶在阿尔茨海默病中的应用。
【背景技术】
公知的，阿尔茨海默病（Alzheimer's Disease， AD）又称老年痴呆病，是一种中枢神经系统渐进性发展的退行性病变，主要表现为患者渐进性的记忆障碍、认知障碍、语言障碍、人格失控等行为症状，俗称“老小孩”、“活死人”，严重影响患者的生活与社交功能，严重影响患者及至亲的生活质量。AD的病因及发病机制尚未明了，特征性病理改变为β-淀粉样蛋白沉积形成的细胞外老年斑和tau蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内神经原纤维缠结，以及小胶质细胞增生性神经炎和神经元丢失。
AD 的具体病因尚不清楚，较为公认的为AD患者中细胞外β-淀粉样蛋白(β-amyloid, Aβ)大量沉积，形成细胞外淀粉样老年斑和细胞内tau 蛋白过度磷酸化，进而形成神经纤维缠结Neurofibrillary tangles, NFT），这些主要的病理改变目前仍然是AD神经病理学诊断的标准， 但相关的发病机制依然不清楚，针对AD 尚无有效的防治手段，Aβ可由细胞膜上I型跨膜淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）经β-分泌酶（BACE）和γ-分泌酶水解产生，Aβ过度产生后形成的细胞外淀粉样老年斑与NFT形成神经元细胞凋亡、炎症及氧化应激反应，进一步引起AD的发生，在正常条件下，90％的淀粉样前体蛋白被α-分泌酶水解，该酶在Aβ序列内进行切割，释放出可溶性APP （sAPPα, secretedAPP alpha）和α-C末端片段（α-CTF，alpha-C-terminal fragment）来避免了Aβ的过度产生，此外，产生的sAPPα可在大脑内发挥许多保护功能，包括神经元保护、神经突触生长及环鸟苷单磷酸酯（guanosine monophosphate, GMP）的激活， 已有研究表明过度APP β-分泌酶裂解导致患者大脑中sAPPα水平明显降低，并且伴随Aβ增多以及相关的病理改变，最终促进AD的发生发展， 因此，增强α-分泌酶活性，抑制APP的β-分泌酶的蛋白裂解 过程，减少Aβ的产生，从而进一步抑制老年斑的形成、tau过度磷酸化及神经炎症，可以作为预防和治疗AD的新策略。
目前，已知的候选α-分泌酶有：TACE (TNFα转化酶) 或ADAM9/10 [金属蛋白酶（adisintegrin and metalloproteinase，ADAM9/10）]，尽管这些酶也具有APP 的α-酶切活性，但是同时它们也切割细胞炎症因子或趋化因子的前体蛋白，并引起炎症反应以及进一步引起肿瘤的发生和发展。因此，过度激活它们的活性作为治疗AD的策略，很可能带来严重的不良反应，因此，寻找以及激活APP特异性α-分泌酶作为治疗AD的新靶点是药物研发的重要方向，具有极高的临床应用价值。
【发明内容】
为了克服背景技术中的不足，本发明公开了年轻人血源APPα-分泌酶在阿尔茨海默病中的应用，本发明通过对年轻人血清、血浆中部分纯化α-分泌酶，确认了αCBSF是特异性并剂量依赖性地对大脑型fAPP695蛋白的α-分泌酶切，αCBSF不会裂解前体促炎细胞因子，包括IL-6、TNFα以及与肿瘤生长相关的前体因子，不会引起病理性炎症反应以及肿瘤的发生发展，最终证实了αCBSF通过多靶点分子生物学机制减轻和改善AD小鼠AD病理改变和行为障碍。
年轻人血源APPα-分泌酶在阿尔茨海默病中的应用，包括正常年轻人的年龄>18岁、<35岁的血清、血浆淀粉样前体蛋白即amyloid precursor protein简称为APP特异性α-分泌酶样活性组分即APP419Y™的分离、纯化和制备方法，以及在预防和治疗老年神经退行性疾病，包括阿尔茨海默病即Alzheimer's Disease简称为AD和帕金森病即Parkinson'sdisease简称为PD的应用；
正常年轻人血清（young blood sera, YBS）可特异性地促进APP695（fAPP695）在α酶切位点的裂解，但不裂解前体促炎细胞与肿瘤生长前体因子，从YBS中分离纯化、鉴定了具有α-分泌酶活性组分(APP419Y™)，并在分子、细胞以及动物水平证实了APP419Y™为APP特异性的α-分泌酶样活性蛋白，对AD模型小鼠的AD样病理损害和行为障碍均有改善作用。
进一步，YBS以时间、剂量和温度依赖性方式促进人野生型APP的 α-酶切；
进一步，YBS直接介导神经元特异性APP695的α-酶切；
进一步，使用Econo-Pack 10DG色谱柱（0.7-0.9 M NaCl）分离到具有APP特异性α-分泌酶裂解活性组分；
进一步，使用制备级Superdex 200色谱柱对蛋白质大小的进行排除；
进一步，应用离子交换色谱进一步分离到具有高活性的APP特异性α-分泌酶活性组分。
进一步，正常年轻人血清（YBS）以时间、剂量和温度依赖性方式促进人野生型APP的 α-酶切- 用0％-10％YBS、成人血清（ABS）或老年血清（AgBS， > 75岁）持续3-5小时，此外，10％热灭活的YBS，在0至5小时之间用5％-15％YBS、ABS或AgBS处理CHO/APPwt细胞3-5小时，收集条件培养基，并进行sAPPα ELISA以及使用sAPPα特异性抗体（2B3）的sAPPα WB分析，用YBS在人类神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）、鼠神经母细胞瘤细胞（N2a）和过度表达人野生型APP的人类成纤维细胞中重复了以上结果。
进一步，YBS直接促进神经元特异性APP695的α-酶切- 在存在或不存在蛋白酶抑制剂混合物（PI，1 X），TACE抑制剂（TAPI-0，1 µM）或ADAM抑制剂 (GM6001，1 µM）的情况下，将标记有C端MYC/DDK的人类重组全长APP695（fAPP，OriGen，100 ng）与5％YBS，失活YBS、或AgBS一起孵育在37ºC下放置4-6 小时，使用sAPPα特异性抗体（2B3）对反应混合物进行sAPPαWB分析，使用6E10（抗Aβ1-17抗体）进行总APP分析，将100 ng fAPP与5％YBS孵育1-7和24小时，5％FBS或失活FBS放置15-24小时，然后分别使用2B3和6E10进行sAPPα和总APP WB分析，sAPP770是指YBS或AgBS的内源性α-分泌酶切产物，而sAPP695是指fAPP的α-分泌酶切产物。
进一步，分离到具有APP特异性α-分泌酶裂解活性的部分- 为了纯化并最终鉴定YBS中APP特异性α-分泌酶的活性，最初使用了Econo-Pack血清IgG纯化试剂盒（Bio-Rad），使用Econo-Pack 10DG色谱柱对YBS（4 mL）进行了脱盐处理，将脱盐的血清上样至DEAEAffi-Gel蓝柱，并根据说明洗脱IgG，然后，用0.1-2.0 M的NaCl缓冲液的离子强度梯度洗脱，再收集15-25个蛋白质馏分，在24孔板（2x106/孔）中培养CHO/APPwt细胞，并用10 μL每种蛋白质组分处理1-3小时，然后收集条件培养基，并进行sAPPα WB和ELISA分析，分别在与阳性和阴性对照相同的细胞培养条件下，加入10 μL YBS，脱盐YBS（dYBS）和磷酸盐缓冲盐水（PBS；Ctrl），还从每种经馏分处理的细胞培养物中制备细胞裂解物，作为评估sAPPα产生水平的其他参考，将CHO/APPwt细胞用来自10个不同CBS批次的0.6至1.0 M NaCl洗脱馏分处理1-3小时，并收集条件培养基并进行sAPPα ELISA，此外，还对每个蛋白质组分进行了SDS PAGE分析，以评估总蛋白质组分。
进一步，制备级Superdex 200色谱柱对蛋白质大小的排除- 通过分析Superdex200柱，将0.8 M NaCl洗脱的YBS蛋白馏分进一步进行大小排除分析，将来自0.8 M NaCl洗脱馏分的约100 mg蛋白质上样至色谱柱，并用PBS洗脱48馏分，每馏分约0.5 mL，在24孔板（2x106/孔）中培养CHO/APPwt细胞，并用40 μL每种蛋白质组分处理1-3小时，收集条件培养基，进行sAPPα WB和ELISA分析，以ng/mL sAPPα表示，同时，在与阳性和阴性对照相同的细胞培养条件下分别包括0.8M NaCl洗脱馏分和PBS，洗脱溜分的蛋白质浓度，将CHO/APPwt细胞用由3个独立实验制备的馏分处理，然后收集条件培养基，并进行sAPPα ELISA，结果表示为平均值（±S.D.）sAPPα（ng/mg蛋白），0.8 M NaCl馏分作为阳性对照，此外，每一大小级分馏都经过SDS PAGE分析，以评估总蛋白分离。
进一步，通过离子交换色谱进一步分离 - 将具有最高APP α-分泌酶活性的分子大小馏分进一步进行离子交换色谱，将分子大小分馏中5-15 mg的蛋白质上样至色谱柱，并用0.5 mM NaCl洗脱82个馏分（约2.5 mL/馏分），CHO/APPwt细胞用40 μL的每一离子交换蛋白组馏分处理1-3小时，收集条件培养基和细胞裂解物，进行sAPPα WB和ELISA分析，此外，离子交换洗脱馏分（αCBSF）的SDS-PAGE显示存在多种蛋白质，将CHO/APPwt细胞用由3次独立实验制备的离子交换洗脱馏分（αCBSF）处理，然后收集条件培养基并进行sAPPα ELISA，结果表示为平均值（±S.D.）sAPPα（ng/mg蛋白），结果表明，αCBSF中α-分泌酶活性与完整未经分离的YBS相比，αCBSF中α-分泌酶活性的纯化高120倍。
进一步，αCBSF（APP419Y™）直接促进神经元特异性APP695的α-酶切，但该活性不受ADAM或TACE的介导 - 将人重组全长APP695（fAPP695，OriGen，100 ng）与0、-0.5和1 µg/mL的αCBSF在37℃孵育1-3小时，使用2B3和完整APP对反应混合物进行sAPPα WB分析，使用pAPP751/770抗体（抗APP C端抗体对反应混合物进行α-CTF分析，将100 ng fAPP695与0.125 μg αCBSF孵育，在有或没有ADAM（GM6001，1 µM）或TACE抑制剂（TAPI-0，1 µM）的情况下放置0.5-1.5 小时，然后使用2B3和pAPP751/770 进行sAPPα、完整APP和α-CTF WB分析，另外，通过特异性抗体针对Aβ17-26的WB进一步证实了APP的α-CTF，此外，将人重组全长APP751（OriGen）与αCBSF一起孵育产生相似的结果，通过TACE裂解活性试剂盒（AnaSpect，Fremont，CA）测量αCBSF的TNFα转化酶 （TACE或ADAM17）活性，包括在有或没有TACE抑制剂（TAPI-0，1 µM）的TACE（25 μg/mL）分泌酶作为阳性对照，同时，通过ADAM10裂解活性试剂盒测定了αCBSF的ADAM10活性，将ADAM10（50μg/mL）分泌酶作为阳性对照，在有或没有ADAM抑制剂 （GM6001，1 μM） 情况下，测定了TACE和ADAM 10的切割活性0.5-1.5小时，并表示为相对荧光单位（RFU）。
进一步，αCBSF (APP419Y™) 介导体内的APP α-分泌酶裂解- 用αCBSF，AgBSF处理4个月大的3XTg-AD小鼠，实验组（0.5 μg/小鼠）或PBS对照（10 μL/小鼠）通过静脉内注射并在72小时后安乐死，从脑的右半部分（非注射侧）制备小鼠脑匀浆，然后进行WB分析以进行APP处理和tau磷酸化，使用Aβ1-17抗体（6E10）进行的WB分析显示总的APP和Aβ，使用sAPPα特异性抗体（2B3）或抗N端APP抗体（22C11）的WB分析分别显示了sAPPα或总APP，使用pAb751/770进行的WB分析显示全长APP（完整APP）和对应于β-CTF和α-CTF的两个谱带，用抗磷酸化-tau（Thr231）[p-tau（Thr231）] 抗体对三组小鼠的大脑切片进行染色，另外，百分比[p-tau（Thr231）阳性面积/总面积；对小鼠大脑皮层区域的抗磷酸化tau蛋白（Thr231）] 阳性的阳性细胞进行了定量图像分析（P <0.005），用PHF1抗体从免疫化学染色也获得了相似的结果，密度分析显示的是Aβ与β-肌动蛋白，sAPPα与总APP的比率以及β-CTF与β-肌动蛋白的比率（P <0.05），WB数据是代表每组五只雌性小鼠获得的结果。
由于采用了上述技术方案，本发明具有如下有益效果：本发明已显示年轻人血血清、血浆在体内体外系统中显著增强APPα-的切割和升高sAPPα水平，并且非依赖于TACE或ADAM9/10酶活性促进大脑型全长APP695的α-酶切，重要的是其发挥分子生物学功能与TACE和ADAM9/10有所不同，不会引起病理性炎症反应，本发明进一步显示从年轻人血清 （YBS）中部分纯化该α-分泌酶 (称αYBSF，a YBS-specific fraction with enhanced α-secretase activity)，并确认了αCBSF是特异性并剂量依赖性地对大脑型fAPP695蛋白的α-分泌酶切，本发明更重要显示αCBSF不会裂解前体促炎细胞因子，包括IL-6、TNFα以及与肿瘤生长相关的前体因子，亦不会引起病理性炎症反应以及肿瘤的发生发展，最终证实了αCBSF通过多靶点分子生物学机制减轻和改善AD小鼠AD病理改变和行为障碍。
【具体实施方式】
通过下面的实施例子可以详细的解释本发明，公开本发明的目的旨在保护本发明范围内的一切技术改进。
实施本发明所述的年轻人血源APPα-分泌酶在阿尔茨海默病中的应用，所述正常年轻人血清（YBS）以时间、剂量和温度依赖性方式促进人野生型APP的 α-酶切 - 用0％、0.25％、0.5％、1、5％和10％YBS、成人血清（ABS）或老年血清（AgBS， > 75岁）或用10％热灭活的YBS处理稳定表达野生型APP的CHO细胞（CHO/APPwt）4小时。收集条件培养基，并进行sAPPα ELISA以及使用sAPPα特异性抗体（2B3）的sAPPα WB分析。 我们已经用YBS在人类神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）、鼠神经母细胞瘤细胞（N2a）和过度表达人野生型APP的人类成纤维细胞中重复了这些结果。
所述YBS直接介导神经元特异性APP695的α-切割 - 在存在或不存在蛋白酶抑制剂混合物（PI，1 X），TACE抑制剂（TAPI-0，1 µM）或ADAM抑制剂 (GM6001，1 µM)的情况下，将标记有C端MYC/DDK的人类重组全长APP695（fAPP，OriGen，100 ng）与5％YBS，失活YBS、或AgBS一起在37ºC孵育5 小时。使用sAPPα特异性抗体（2B3）对反应混合物进行sAPPαWB分析，使用6E10（抗Aβ1-17抗体）进行总APP分析。将100 ng fAPP与5％YBS孵育1、5和24小时，5％FBS或失活FBS孵育24小时，然后分别使用2B3和6E10进行sAPPα和总APP WB分析。 sAPP770是指YBS或AgBS的内源性α-分泌酶裂解产物，而sAPP695是指fAPP的α-分泌酶裂解产物。
所述分离到具有APP特异性α-分泌酶裂解活性的部分 - 为了纯化并最终鉴定YBS中APP特异性α-分泌酶的活性，最初使用了Econo-Pack血清IgG纯化试剂盒（Bio-Rad），使用Econo-Pack 10DG色谱柱对YBS（4 mL）进行脱盐处理，将脱盐的血清上样至DEAE Affi-Gel蓝柱，并根据说明洗脱IgG，然后，用0.1至2.0 M的NaCl缓冲液的离子强度梯度洗脱，再收集20个蛋白质馏分，在24孔板（2x106/孔）中培养CHO/APPwt细胞，并用10 μL每种蛋白质组分处理2小时，然后收集条件培养基，并进行sAPPα WB和ELISA分析，分别在与阳性和阴性对照相同的细胞培养条件下，加入10 μL YBS，脱盐YBS（dYBS）和磷酸盐缓冲盐水（PBS; Ctrl），还从每种经馏分处理的细胞培养物中制备细胞裂解物，作为评估sAPPα产生水平的参考，将CHO/APPwt细胞用来自10个不同CBS批次的0.6至1.0 M NaCl洗脱馏分处理2 小时，并收集条件培养基并进行sAPPα ELISA，此外，还对每个蛋白质组分进行了SDS PAGE分析，以评估总蛋白质组分。
所述制备级Superdex 200色谱柱对蛋白质大小的排除 - 通过分析Superdex 200柱，将0.8 M NaCl洗脱的YBS蛋白馏分进一步进行大小排除分析，将来自0.8 M NaCl洗脱馏分的约100 mg蛋白质上样至色谱柱，并用PBS洗脱48馏分，每馏分约0.5 mL。在24孔板（2x106/孔）中培养CHO/APPwt细胞，并用40 μL每种蛋白质组分处理2小时，收集条件培养基，进行sAPPα WB和ELISA分析，以ng/mL sAPPα表示，同时，在与阳性和阴性对照相同的细胞培养条件下分别包括0.8M NaCl洗脱馏分和PBS。洗脱馏分的蛋白质浓度，将CHO/APPwt细胞用由3个独立实验制备的馏分处理，然后收集条件培养基，并进行sAPPα ELISA，结果表示为平均值（±S.D.）sAPPα（ng/mg蛋白）。0.8 M NaCl馏分作为阳性对照，此外，每一大小馏分过SDS PAGE分析，以评估总蛋白分离。
所述通过离子交换色谱进一步分离 - 将具有最高APP α-分泌酶活性的分子大小馏分进一步进行离子交换色谱，将分子大小分馏中约10 mg的蛋白质上样至色谱柱，并用0.5 mM NaCl洗脱82个馏分（约2.5 mL/馏分），CHO/APPwt细胞用40 μL的每一离子交换蛋白组馏分处理2小时，收集条件培养基和细胞裂解物，进行sAPPα WB和ELISA分析，此外，离子交换洗脱馏分（αCBSF）的SDS-PAGE显示存在多种蛋白质，将CHO/APPwt细胞用由3次独立实验制备的离子交换洗脱馏分（αCBSF）处理，然后收集条件培养基并进行sAPPα ELISA，结果表示为平均值（±S.D.） sAPPα（ng/mg蛋白），结果表明，αCBSF中α-分泌酶活性与完整未经分离的YBS相比，αCBSF中α-分泌酶活性的纯化约高120倍。
所述αCBSF（APP419Y™）直接促进神经元特异性APP695的α-酶切，但该活性不受ADAM或TACE的介导 - 将人重组全长APP695（fAPP695，OriGen，100 ng）与0、0.125、0.25、0.5和1 µg/mL的αCBSF在37℃孵育2小时，使用2B3和完整APP对反应混合物进行sAPPα WB分析，使用pAPP751/770抗体（抗APP C端抗体）反应混合物进行α-CTF分析，将100 ng fAPP695与0.125 μg αCBSF孵育，在有或没有ADAM（GM6001，1 µM）或TACE抑制剂（TAPI-0，1 µM）的情况下放置1 小时，然后使用2B3和pAPP751/770 进行sAPPα、完整APP和α-CTF WB分析，另外，通过特异性抗体针对Aβ17-26的WB进一步证实了APP的α-CTF，此外，将人重组全长APP751（OriGen）与αCBSF一起孵育产生相似的结果，通过TACE裂解活性试剂盒（AnaSpect，Fremont，CA）测量αCBSF的TNFα转化酶 （TACE或ADAM17）活性。包括在有或没有TACE抑制剂（TAPI-0，1 µM）的TACE（25 μg/mL）分泌酶作为阳性对照，同时，通过ADAM10裂解活性试剂盒测定了αCBSF的ADAM10活性，将ADAM10（50μg/mL）分泌酶作为阳性对照，在有或没有ADAM抑制剂（GM6001，1 μM）的情况下，测定了TACE和ADAM 10的切割活性1小时，并表示为相对荧光单位（RFU）。
所述αCBSF (APP419Y™) 介导体内的APP α-分泌酶裂解 - 用αCBSF，AgBSF处理4个月大的3XTg-AD转基因模型小鼠。 实验组（0.5 μg/小鼠）或PBS对照（10 μL/小鼠）通过静脉内注射并在72小时后安乐死。右半脑制备小鼠脑匀浆，用WB方法分析APP酶切和tau磷酸化情况。使用Aβ1-17抗体（6E10）进行的WB分析总APP和Aβ水平。使用sAPPα特异性抗体（2B3）或抗N端APP抗体（22C11）的WB分析sAPPα或总APP。 使用pAb751/770进行WB分析全长APP（完整APP）和β-CTF及α-CTF的表达。 用抗磷酸化-tau（Thr231）[p-tau（Thr231）]抗体对三组小鼠的大脑切片进行染色。 分析[p-tau（Thr231）阳性面积/总面积百分比；对小鼠大脑皮层区域的抗磷酸化tau蛋白（Thr231）] 阳性的阳性细胞进行了定量图像分析（P <0.005）。用PHF1抗体从免疫化学染色也获得了相似的结果。 密度分析显示的是Aβ与β-肌动蛋白，sAPPα与总APP的比率以及β-CTF与β-肌动蛋白的比率（P <0.05），WB数据是代表每组五只雌性小鼠获得的结果。
本发明未详述部分为现有技术，尽管结合优选实施方案具体展示和介绍了本发明，具体实现该技术方案方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，但所属领域的技术人员应该明白，在不脱离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围内，在形式上和细节上可以对本发明做出各种变化，均为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.年轻人血源APPα-分泌酶在阿尔茨海默病中的应用，包括正常年轻人的年龄>18岁、<35岁的血清、血浆淀粉样前体蛋白即amyloid precursor protein简称为APP特异性α-分泌酶样活性组分即APP419Y™的分离、纯化和制备方法，以及在预防和治疗老年神经退行性疾病，包括阿尔茨海默病即Alzheimer's Disease简称为AD和帕金森病即Parkinson'sdisease简称为PD的应用，正常年轻人血清（young blood sera, YBS）可特异性地促进APP695（fAPP695）在α酶切位点的裂解，但不裂解前体促炎细胞与肿瘤生长前体因子，从YBS中分离纯化、鉴定了具有α-分泌酶活性组分(APP419Y™)，并在分子、细胞以及动物水平证实了APP419Y™为APP特异性的α-分泌酶样活性蛋白，对AD模型小鼠的AD样病理损害和行为障碍均有改善作用，具体步骤如下：
进一步，YBS以时间、剂量和温度依赖性方式促进人野生型APP的 α-酶切；
进一步，YBS直接介导神经元特异性APP695的α-酶切；
进一步，使用Econo-Pack 10DG色谱柱（0.7-0.9 M NaCl）分离到具有APP特异性α-分泌酶裂解活性组分；
进一步，使用制备级Superdex 200色谱柱对蛋白质大小的进行排除；
进一步，应用离子交换色谱进一步分离到具有高活性的APP特异性α-分泌酶活性组分。
2.根据权利要求1所述的年轻人血源APPα-分泌酶在阿尔茨海默病中的应用，其特征是：所述的正常年轻人血清（YBS）以时间、剂量和温度依赖性方式促进人野生型APP的 α-酶切- 用0％-10％YBS、成人血清（ABS）或老年血清（AgBS， > 75岁）持续3-5小时，此外，10％热灭活的YBS，在0至5小时之间用5％-15％YBS、ABS或AgBS处理CHO/APPwt细胞3-5小时，收集条件培养基，并进行sAPPα ELISA以及使用sAPPα特异性抗体（2B3）的sAPPα WB分析，用YBS在人类神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）、鼠神经母细胞瘤细胞（N2a）和过度表达人野生型APP的人类成纤维细胞中重复了以上结果。
3.根据权利要求1所述的年轻人血源APPα-分泌酶在阿尔茨海默病中的应用，其特征是：所述的正常年轻人血清（YBS）直接促进神经元特异性APP695的α-酶切- 在存在或不存在蛋白酶抑制剂混合物（PI，1 X），TACE抑制剂（TAPI-0，1 µM）或ADAM抑制剂 (GM6001，1 µM）的情况下，将标记有C端MYC/DDK的人类重组全长APP695（fAPP，OriGen，100 ng）与5％YBS，失活YBS、或AgBS一起孵育在37ºC下放置4-6 小时，使用sAPPα特异性抗体（2B3）对反应混合物进行sAPPαWB分析，使用6E10（抗Aβ1-17抗体）进行总APP分析，将100 ng fAPP与5％YBS孵育1-7和24小时，5％FBS或失活FBS放置15-24小时，然后分别使用2B3和6E10进行sAPPα和总APP WB分析，sAPP770是指YBS或AgBS的内源性α-分泌酶切产物，而sAPP695是指fAPP的α-分泌酶切产物。
4.根据权利要求1所述的年轻人血源APPα-分泌酶在阿尔茨海默病中的应用，其特征是：所述的分离到具有APP特异性α-分泌酶裂解活性的部分- 为了纯化并最终鉴定YBS中APP特异性α-分泌酶的活性，最初使用了Econo-Pack血清IgG纯化试剂盒（Bio-Rad），使用Econo-Pack 10DG色谱柱对YBS（4 mL）进行了脱盐处理，将脱盐的血清上样至DEAE Affi-Gel蓝柱，并根据说明洗脱IgG，然后，用0.1-2.0 M的NaCl缓冲液的离子强度梯度洗脱，再收集15-25个蛋白质馏分，在24孔板（2x106/孔）中培养CHO/APPwt细胞，并用10 μL每种蛋白质组分处理1-3小时，然后收集条件培养基，并进行sAPPα WB和ELISA分析，分别在与阳性和阴性对照相同的细胞培养条件下，加入10 μL YBS，脱盐YBS（dYBS）和磷酸盐缓冲盐水（PBS；Ctrl），还从每种经馏分处理的细胞培养物中制备细胞裂解物，作为评估sAPPα产生水平的其他参考，将CHO/APPwt细胞用来自10个不同CBS批次的0.6至1.0 M NaCl洗脱馏分处理1-3小时，并收集条件培养基并进行sAPPα ELISA，此外，还对每个蛋白质组分进行了SDS PAGE分析，以评估总蛋白质组分。
5.根据权利要求1所述的年轻人血源APPα-分泌酶在阿尔茨海默病中的应用，其特征是：所述的制备级Superdex 200色谱柱对蛋白质大小的排除- 通过分析Superdex 200柱，将0.8 M NaCl洗脱的YBS蛋白馏分进一步进行大小排除分析，将来自0.8 M NaCl洗脱馏分的约100 mg蛋白质上样至色谱柱，并用PBS洗脱48馏分，每馏分约0.5 mL，在24孔板（2x106/孔）中培养CHO/APPwt细胞，并用40 μL每种蛋白质组分处理1-3小时，收集条件培养基，进行sAPPα WB和ELISA分析，以ng/mL sAPPα表示，同时，在与阳性和阴性对照相同的细胞培养条件下分别包括0.8M NaCl洗脱馏分和PBS，洗脱溜分的蛋白质浓度，将CHO/APPwt细胞用由3个独立实验制备的馏分处理，然后收集条件培养基，并进行sAPPα ELISA，结果表示为平均值（±S.D.）sAPPα（ng/mg蛋白），0.8 M NaCl馏分作为阳性对照，此外，每一大小级分馏都经过SDS PAGE分析，以评估总蛋白分离。
6.根据权利要求1所述的年轻人血源APPα-分泌酶在阿尔茨海默病中的应用，其特征是：所述的通过离子交换色谱进一步分离 - 将具有最高APP α-分泌酶活性的分子大小馏分进一步进行离子交换色谱，将分子大小分馏中5-15 mg的蛋白质上样至色谱柱，并用0.5mM NaCl洗脱82个馏分（约2.5 mL/馏分），CHO/APPwt细胞用40 μL的每一离子交换蛋白组馏分处理1-3小时，收集条件培养基和细胞裂解物，进行sAPPα WB和ELISA分析，此外，离子交换洗脱馏分（αCBSF）的SDS-PAGE显示存在多种蛋白质，将CHO/APPwt细胞用由3次独立实验制备的离子交换洗脱馏分（αCBSF）处理，然后收集条件培养基并进行sAPPα ELISA，结果表示为平均值（±S.D.）sAPPα（ng/mg蛋白），结果表明，αCBSF中α-分泌酶活性与完整未经分离的YBS相比，αCBSF中α-分泌酶活性的纯化高120倍。
7.根据权利要求1所述的年轻人血源APPα-分泌酶在阿尔茨海默病中的应用，其特征是：所述的αCBSF（APP419Y™）直接促进神经元特异性APP695的α-酶切，但该活性不受ADAM或TACE的介导 - 将人重组全长APP695（fAPP695，OriGen，100 ng）与0、-0.5和1 µg/mL的αCBSF在37℃孵育1-3小时，使用2B3和完整APP对反应混合物进行sAPPα WB分析，使用pAPP751/770抗体（抗APP C端抗体对反应混合物进行α-CTF分析，将100 ng fAPP695与0.125 μg αCBSF孵育，在有或没有ADAM（GM6001，1 µM）或TACE抑制剂（TAPI-0，1 µM）的情况下放置0.5-1.5 小时，然后使用2B3和pAPP751/770 进行sAPPα、完整APP和α-CTF WB分析，另外，通过特异性抗体针对Aβ17-26的WB进一步证实了APP的α-CTF，此外，将人重组全长APP751（OriGen）与αCBSF一起孵育产生相似的结果，通过TACE裂解活性试剂盒（AnaSpect，Fremont，CA）测量αCBSF的TNFα转化酶 （TACE或ADAM17）活性，包括在有或没有TACE抑制剂（TAPI-0，1 µM）的TACE（25 μg/mL）分泌酶作为阳性对照，同时，通过ADAM10裂解活性试剂盒测定了αCBSF的ADAM10活性，将ADAM10（50μg/mL）分泌酶作为阳性对照，在有或没有ADAM抑制剂 （GM6001，1 μM） 情况下，测定了TACE和ADAM 10的切割活性0.5-1.5小时，并表示为相对荧光单位（RFU）。
8.根据权利要求1或7所述的年轻人血源APPα-分泌酶在阿尔茨海默病中的应用，其特征是：所述的αCBSF (APP419Y™) 介导体内的APP α-分泌酶裂解- 用αCBSF，AgBSF处理4个月大的3XTg-AD小鼠，实验组（0.5 μg/小鼠）或PBS对照（10 μL/小鼠）通过静脉内注射并在72小时后安乐死，从脑的右半部分（非注射侧）制备小鼠脑匀浆，然后进行WB分析以进行APP处理和tau磷酸化，使用Aβ1-17抗体（6E10）进行的WB分析显示总的APP和Aβ，使用sAPPα特异性抗体（2B3）或抗N端APP抗体（22C11）的WB分析分别显示了sAPPα或总APP，使用pAb751/770进行的WB分析显示全长APP（完整APP）和对应于β-CTF和α-CTF的两个谱带，用抗磷酸化-tau（Thr231）[p-tau（Thr231）] 抗体对三组小鼠的大脑切片进行染色，另外，百分比 [p-tau（Thr231）阳性面积/总面积；对小鼠大脑皮层区域的抗磷酸化tau蛋白（Thr231）] 阳性的阳性细胞进行了定量图像分析（P <0.005），用PHF1抗体从免疫化学染色也获得了相似的结果，密度分析显示的是Aβ与β-肌动蛋白，sAPPα与总APP的比率以及β-CTF与β-肌动蛋白的比率（P <0.05），WB数据是代表每组五只雌性小鼠获得的结果。
9.根据权利要求1或2所述的年轻人血源APPα-分泌酶在阿尔茨海默病中的应用，其特征是：所述的正常年轻人血清（YBS）以时间、剂量和温度依赖性方式促进人野生型APP的 α-酶切 - 用0％、0.25％、0.5％、1、5％和10％YBS、成人血清（ABS）或老年血清（AgBS， > 75岁）或用10％热灭活的YBS处理稳定表达野生型APP的CHO细胞（CHO/APPwt）4小时，收集条件培养基，并进行sAPPα ELISA以及使用sAPPα特异性抗体（2B3）的sAPPα WB分析，用YBS在人类神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）、鼠神经母细胞瘤细胞（N2a）和过度表达人野生型APP的人类成纤维细胞中重复了这些结果。
10.根据权利要求1或3所述的年轻人血源APPα-分泌酶在阿尔茨海默病中的应用，其特征是：所述的正常年轻人血清（YBS）直接介导神经元特异性APP695的α-切割- 在存在或不存在蛋白酶抑制剂混合物（PI，1 X），TACE抑制剂（TAPI-0，1 µM）或ADAM抑制剂 (GM6001，1µM)的情况下，将标记有C端MYC/DDK的人类重组全长APP695（fAPP，OriGen，100 ng）与5％YBS，失活YBS、或AgBS一起在37ºC孵育5 小时，使用sAPPα特异性抗体（2B3）对反应混合物进行sAPPαWB分析，使用6E10（抗Aβ1-17抗体）进行总APP分析，将100 ng fAPP与5％YBS孵育1、5和24小时，5％FBS或失活FBS孵育24小时，然后分别使用2B3和6E10进行sAPPα和总APP WB分析，sAPP770是指YBS或AgBS的内源性α-分泌酶裂解产物，而sAPP695是指fAPP的α-分泌酶裂解产物。
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