CN112899280B - 基于CRISPR/Cas9基因编辑技术建立的AD细胞模型及其构建方法和应用 - Google Patents

基于CRISPR/Cas9基因编辑技术建立的AD细胞模型及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于CRISPR/Cas 9基因编辑技术建立的AD细胞模型及其构建方法和应用。一种阿尔茨海默病细胞模型，是将靶向ADAM10基因的crRNA、TracrRNA和Cas9蛋白组成的RNP复合物电转入SH‑SY5Y细胞，在SH‑SY5Y细胞株中成功敲除目的基因ADAM10。本发明细胞模型较之正常细胞，Aβ42，Aβ42/Aβ40与pTau/Tau的表达显著升高，炎症小体NLRP3蛋白显著上调，促炎因子TNF‑α的表达显著升高。同时细胞的神经分化功能减弱，神经元长度皱缩，细胞生长速度显著性减慢，神经元的连接显著性减少，可模拟AD患者脑内神经元坏死病症。

Description

基于CRISPR/Cas9基因编辑技术建立的AD细胞模型及其构建 方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及基于CRISPR/Cas 9基因编辑技术建立的AD细胞模型及其构建方法和应用，特别涉及在SH-SY5Y细胞中使用CRISPR/Cas 9基因编辑技术敲除ADAM10基因建立针对神经元坏死的更全面的AD细胞模型。
背景技术
目前全球范围内AD患病人数超过5000万人，其对人们的生活质量与健康产生了巨大的影响。由于AD患者在护理和管理上产生高昂的费用，它被评为最具有破坏性的疾病之一[1-3]。尽管科学家们对该病进行了几十年的研究和药物开发工作，目前为止仍没有一种药物可以减缓AD的进展[4]。
AD是一种具有复杂病理生物学特性的遗传异质性疾病。Aβ和细胞内高磷酸化Tau蛋白的累积如今仍然是诊断AD的主要神经病理学标准[4-7]。且在临床上许多针对降低Aβ的抗AD候选化合物未能实质性的改变AD患者的临床症状。研究者们对正常衰老死亡的老年人与老年AD患者进行尸检发现，脑内均有老年斑的形成。这些证据表明，去除斑块不足以改善脑功能受损和增强认知记忆功能，也不足以减慢AD进展或治愈AD。即淀粉样蛋白斑块已从患者的大脑中去除，依然存在AD的症状[6]。AD患者的病症不仅是脑内存在斑块，亦有神经缠结以及大量的神经元坏死[1,7,8]。
大部分AD转基因动物模型主要是模拟Aβ和细胞内高磷酸化Tau蛋白的累积，其主要的局限性是无法准确的模拟AD患者脑内的神经元坏死。近百年来，临床前AD动物模型从未令人信服地证明了AD进程中的关键点，即从未直接聚焦于神经元本身[1,9-21]。使用最多的AD细胞模型为iPSC，但多功能干细胞的培养耗时久，导致培养的过程中污染几率增大，极大的减缓了大规模筛选抗AD候选化合物的进程[22-25]。
现阶段AD药物在临床试验中全军覆没式的失败提示我们，其可能与临床前AD模型不成熟、不够全面以及不能很好地模拟AD病人脑内病征有关。所以开发全面的、更准确的新型AD模型至关重要。因而临床前AD模型的成功建立有望成为研发AD新药以及探讨AD病理的前提。
CRISPR/CAS 9基因编辑技术几乎可以在任何类型细胞和生物体中完成基因组修饰[26-28]，其彻底改变了生物医学等多个学科领域。且实用性高、操作简单及编辑效率高。CRISPR/CAS 9基因编辑技术现已成为一个多功能平台，其不仅可以对单个基因进行编辑，还可执行多基因编辑操作。这个全新的生物学方法的发展更加有利于科学家研究基因功能以及构建临床前疾病模型。在建立疾病模型中，该技术在癌症领域应用最多[29]，其在AD的研究中的应用尚不够广泛。
ADAM10基因(Genbank登录号为NC_000015.10)存在于脑组织中，其可编码α分泌酶，参与APP蛋白的生成。有研究表明，ADAM10的过表达可抑制Aβ蛋白的产生和聚集。但现阶段并未见ADAM10基因与神经元关系的相关报道。
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发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种较之现有的临床前AD模型更全面模拟AD病变的细胞模型。
本发明的另一目的是提供该模拟AD病变的细胞模型的构建方法。
本发明的又一目的是提供构建该模型时使用的RNP复合物及其应用。
一种RNP复合物，包括靶向ADAM10基因的crRNA、TracrRNA和Cas9蛋白。
作为本发明的一种优选，所述的靶向ADAM10基因的crRNA选自crRNA1、crRNA2或crRNA3中的任意一种或多种；所述的crRNA1序列如SEQ ID NO.1所示，所述的crRNA2序列如SEQ ID NO.2所示，所述的crRNA3序列如SEQ ID NO.3所示。
作为本发明的进一步优选，所述的靶向ADAM10基因的crRNA选自crRNA1、crRNA2和crRNA3的组合。
本发明所述的RNP复合物在构建ADAM10基因敲除的阿尔茨海默病细胞模型中的应用。
本发明所述的RNP复合物在构建模拟脑内神经元坏死细胞模型中的应用。
一种构建阿尔茨海默病细胞模型的方法，包括将本发明所述的RNP复合物按照CRISPR/Cas9基因编辑技术方法，电转入SH-SY5Y细胞，在SH-SY5Y细胞株中成功敲除目的基因ADAM10。
作为本发明的一种优选，所述的方法，包括混合所述的CrRNA1、CrRNA2与CrRNA3后，将CrRNA混合物与TracrRNA混合退火形成gRNA,gRNA与Cas9蛋白混合形成RNP复合物，按照CRISPR/Cas 9基因编辑技术方法，使用Lonza-4D将RNP复合物电转导入SH-SY5Y细胞，在SH-SY5Y细胞株中成功敲除目的基因ADAM10，通过单克隆细胞培养单细胞株后，通过Sanger测序筛选到完全敲除ADAM10基因的单细胞株即为所述的阿尔茨海默病细胞模型。
一种临床前阿尔茨海默病细胞模型，为按照本发明所述的方法构建的ADAM10基因被敲除的SH-SY5Y细胞。
本发明所述的临床前阿尔茨海默病细胞模型在筛选阿尔茨海默病治疗药物中的应用。通过于AD模型细胞中孵育不同浓度的MK-8931后，按照实施例6对Aβ，Tau，NLRP3蛋白进行验证，结果表明，给予MK-8931后，能够显著回调Aβ，Tau与NLRP3蛋白的水平。按照实施例5的方法对给予MK-8931后的神经元进行观察，结果发现，MK-8931无法改善神经元的状态。以上结果与MK-8931进入临床三期试验的失败提示我们，有可能是现有的模型无法准确的模拟AD患者脑内神经元的变化有关，进一步表明，本发明所建立的新型AD细胞模型有潜力为研究者们提供筛选药物的模型工具。
所述的临床前阿尔茨海默病细胞模型在筛选脑内神经元坏死治疗药物中的应用。
有益效果：
利用CRISPR/Cas 9基因编辑技术，将CrRNA混合物与TracrRNA混合退火形成gRNA,gRNA与Cas9蛋白混合形成RNP复合物，按照下述CRISPR/Cas 9基因编辑技术方法，使用Lonza-4D在SH-SY5Y细胞株中成功敲除目的基因ADAM10。通过单克隆细胞培养单细胞株后，通过Sanger测序筛选到完全敲除ADAM10基因的单细胞株。研究结果发现敲除ADAM10后，Aβ42，Aβ42/Aβ40与pTau/Tau的表达显著升高。炎症小体NLRP3蛋白显著上调，促炎因子TNF-α的表达显著升高。同时细胞的神经分化功能减弱，神经元长度皱缩，细胞生长速度显著性减慢，神经元的连接显著性减少，可模拟AD患者脑内神经元坏死病症。
此外，本发明所建立的AD细胞模型具有较好的应用前景，冻存的细胞株可永久性传代作为AD模型细胞供研究使用。且细胞培养周期短，操作简便，可作为临床前细胞模型大规模筛选抗AD候选化合物以及筛选有潜力的中药活性成分。
附图说明
图1 ADAM10的结构区域
其中CrRNA1、CrRNA2、CrRNA3分别为敲除ADAM10基因的CrRNA序列
图2 CrRNA1的示意图
其中CrRNA1：UUUUUUUUUAUAGGUCAGUA(SEQ ID ON.1).Cutsite:58,717,724；Exon:Exon 2；On Target Score：0.431.
图3 CrRNA2的示意图
CrRNA2：UUUUUUUUAUAGGUCAGUAU(SEQ ID ON.2).Cutsite:58,717,723；Exon:Exon2；On Target Score：0.523.
图4 CrRNA3的示意图
CrRNA3：AAAUAUAUCAGACAUUAUGA(SEQ ID ON.3).Cutsite:58,717,688；Exon:Exon2；On Target Score：0.581.
图5 Sanger测序验证基因敲除
图A为CrRNA1,CrRNA2,CrRNA3在ADAM10基因基因序列中的位置示意图；图B为基因突变点测序图谱。与空白组Control KO相比，ADAM10敲除细胞株发生点突变。测序结果显示，已初步筛选到敲除ADAM10基因的细胞扩增株。对这些细胞株进行培养扩增，冻存做后续实验研究。
图6敲除ADAM10基因后靶标蛋白的变化
对敲除组的ADAM10在蛋白水平进行验证，如图A所示，与空白组control KO相比，ADAM10KO组ADAM10蛋白的表达极显著性降低，与Sanger测序结果相吻合。数据进一步表明运用CRISPR/Cas 9基因编辑技术在SH-SY5Y细胞中敲除ADAM10基因成功。可进行后续实验研究。
Aβ和细胞内高磷酸化Tau蛋白的累积是如今诊断AD的主要神经病理学标准，同时在临床上AD患者血浆中Aβ42/Aβ40比率可作为AD的预筛查指标。
因此我们对Aβ；Tau；S-199Tau；S-214Tau进行验证，如图B-E所示，与空白组control KO相比，ADAM10 KO组Aβ蛋白的表达显著性升高，Tau蛋白，S-199Tau蛋白，S-214Tau蛋白的表达均显著性上调。如图F-I所示，取细胞上清对Aβ42，Aβ40，p-Tau和Tau进行检测。数据表明，与空白组control KO相比，ADAM10 KO组Aβ40蛋白水平无显著性变化，而Aβ42蛋白水平的表达显著性上调，同时Aβ42/Aβ40，pTau/Tau的比值显著性升高。
以上数据表明Aβ与高磷酸化Tau蛋白在ADAM10基因敲除组均显著性高表达。目前数据初步表明，敲除ADAM10基因的细胞可作为AD细胞模型。
图7敲除ADAM10基因后炎症因子TNF-α的变化
与AD的发病机理有关的炎症细胞因子中，TNF-α在脑部炎症状态中起着核心作用，并且是唯一一个被认为对AD有关的细胞因子。因此我们对敲除ADAM10的细胞进行TNF-α的检测。与空白组相比，敲除ADAM10的细胞中上清的炎症因子水平显著性上调。结果表明，敲除的细胞中炎症因子水平显著性上调。
图8敲除ADAM10基因后炎症炎症小体NLRP3的变化
NLRP3炎性小体的失调与多种神经退行性疾病的进展有关。有研究表明NLRP3蛋白抑制剂可能会作为未来治疗AD的靶标。与Control KO组比，ADAM10 KO组NLRP3显著性增加，激活了炎症小体的表达。
图9敲除ADAM10基因后神经元状态的变化
观察在SH-SY5Y细胞中敲除ADAM10基因后神经元细胞的生长速度，分化以及细胞密度的变化。与未进行分化处理的正常SH-SY5Y细胞相比，在经过神经细胞分化处理后，正常SH-SY5Y细胞神经元长度显著性变长，细胞间的连接更紧密。而敲除ADAM10基因后再经过相同的细胞分化处理，神经元长度显著性变短，细胞有皱缩趋势，细胞间的连接显著性变少，神经细胞间传递信息能力显著性减弱。
图10验证新型AD细胞模型的应用价值
如图A所示，与Control KO组比，ADAM10 KO组Aβ蛋白表达显著升高。给予1μM的MK-8931后，MK-8931可显著降低Aβ蛋白的表达。如图B所示，与Control KO组比，ADAM10 KO组Tau蛋白表达显著升高。给予0.1μM的MK-8931后，MK-8931可显著降低Tau蛋白的表达。如图C所示，与Control KO组比，ADAM10 KO组炎症小体NLRP3的表达显著升高，给予100nM的MK-8931后，炎症小体NLRP3的表达显著下调。如图D所示，与ADAM10 KO组相比，给予1μM的MK-8931后，神经元的状态未被改善。
具体实施方式
本发明通过下面的实施例进行详细的解释，但并不意味着本发明仅限于此。
实施例1
(1)构建CRISPR/CAS9基因编辑方法
以下过程均在无菌操作台中全程无菌的条件下操作：
①构建RNP复合物：分别取0.33μl的crRNA1(100μM)，0.33μl的crRNA2(100μM)，0.33μl的crRNA3(100μM)与1μl Alt-R.CRISPR-Cas9 tracrRNA(100μM)充分混合均匀后使用无核酸酶的缓冲液稀释到浓度为20-80μM，得到RNA混合物。将RNA混合物在95℃下加热5min，在室温中冷却10min，得到退火RNA混合物。取退火RNA混合物2.9μl与Cas 9蛋白1μl按照1.2：1-2:1的比例充分混合后放置室温10min。加入0.6μl电转加强液后在室温中反应5min，得到RNP复合物。
②将RNP复合物电转导入待敲除基因的SH-SY5Y细胞中：预热含15％FBS培养基，取密度为80％的细胞，弃去培养基。使用适量的PBS溶液清缓的清洗细胞，弃去溶液后，加入适量的胰蛋白酶于37℃下消化细胞，等数分钟80％细胞脱壁后，使用含15％FBS的培养基终止消化，1100rpm离心10min弃去上清。用10ml PBS溶液重悬细胞，充分混匀细胞后在取10μl细胞溶液计数。取250,000个细胞在1100rpm离心10min，弃去PBS上清，使用15.5μl的P3溶液重悬细胞。加入4.5μl的RNP复合物，得到20μl体系的细胞溶液。将20μl体系的细胞溶液加入16孔的电转孔板中，将孔板放入Lonza-4D电转仪中，选择SH-SY5Y程序进行电转。
(2)构建单细胞克隆技术方法
将电转好的细胞逐级稀释到1个细胞/10μl，加入96孔板中，补足200μl含15％FBS的培养基。稳定12小时等待细胞贴壁后，在显微镜下观察并筛选记录出96孔板中含一个细胞的孔。筛选后，继续等待这些单细胞生长扩增，待单细胞在96孔板中扩增到细胞密度为80％后将细胞转移至12孔板中，待单细胞在12孔板中扩增到细胞密度为80％后将细胞转移至6孔板中，待细胞密度为80％后，取一部分细胞进行Sanger测序，筛选敲除成功的单细胞系，剩下的细胞继续培养，每隔48小时换细胞培养液一次。
(3)Sanger测序
①细胞DNA样本的提取
取细胞弃去培养基，加入适量的PBS溶液润洗细胞后弃去溶液，加入适量的Trpsin消化细胞数分钟后加入含15％FBS培养基终止消化，1100rpm离心10minPBS溶液充分重悬后取少量细胞计数，取500，000个细胞严格按照。基因组DNA小量抽提试剂盒(离心柱式；D00D0063)的说明书操作提取细胞DNA。
②聚合酶链式反应(PCR)
如表1所示，目的基因ADAM10的引物设计如下：
表1目的基因ADAM10的引物
③反应体系如下
表2 PCR反应体系
④PCR反应条件
表3 PCR反应程序
⑤PCR产物纯化
根据PCR产物电泳结果切割所需的DNA目的条带，纯化步骤严格按照说明书SK8131胶回收操作。
⑥Sanger测序阶段
测序反应体系如下表所示：
表4 Sanger测序反应体系
反应条件:
表5 Sanger测序反应条件
将PCR反应板从PCR仪上取下后每孔加4μl EDTA Mix(0.5mol/L)EDTA，3mol/L醋酸钠，灭菌去离子水比例混合和60μl 95％乙醇，在冰水浴中反应30min。
将溶液于4000g离心20min，轻轻将板倒置，600rmp/min甩干后每孔加150μl 70％乙醇，4000g离心5min。将板倒置600rmp/min甩干，于超净台上晾5min，加10μl HidiFormamide，漩涡器上振荡1min。
将反应板放在PCR仪上96℃，3min迅速将反应板取下放入冰浴冷却，等待上样。
将96孔板置于ABI 3730XL测序仪电泳分析。测序电泳仪操作按照ABI Prism 3730使用手册严格执行操作。
与空白组Control KO相比，ADAM10敲除细胞株发生点突变。测序结果(图5)显示，已初步筛选到敲除ADAM10基因的细胞扩增株。对这些细胞株进行培养扩增，冻存做后续实验研究。
实施例2 AD细胞模型中ADAM10靶标蛋白的测定
通过Western对敲除组的ADAM10在蛋白水平进行验证。如图6A所示，与空白组control KO相比，ADAM10 KO组ADAM10蛋白的表达极显著性降低，与Sanger测序结果相吻合。数据进一步表明运用CRISPR/Cas 9基因编辑技术在SH-SY5Y细胞中敲除ADAM10基因成功。可进行后续实验研究。
实施例3 AD细胞模型中Aβ与Tau蛋白的测定
Aβ和细胞内高磷酸化Tau蛋白的累积是如今诊断AD的主要神经病理学标准，同时在临床上AD患者血浆中Aβ42/Aβ40比率可作为AD的预筛查指标。因此我们对Aβ；Tau；S-199Tau；S-214Tau进行验证：
取细胞弃去培养基，加入适量的PBS溶液润洗细胞后弃去溶液，加入适量的Trpsin消化细胞数分钟后加入含15％FBS培养基终止消化，1100rpm离心10min。PBS溶液充分重悬后取少量细胞计数，取2，000，000个细胞严格按照ELISA试剂盒说明书操作步骤严格进行，每个样本的总蛋白由BCA试剂盒测定，矫正总蛋白后，测定Aβ40；Aβ42；p-Tau及Tau的含量后进行数据统计。如图6B-E所示，与空白组control KO相比，ADAM10 KO组Aβ蛋白的表达显著性升高，Tau蛋白，S-199Tau蛋白，S-214Tau蛋白的表达均显著性上调。如图6F-I所示，取细胞上清对Aβ42，Aβ40，p-Tau和Tau进行检测。数据表明，与空白组control KO相比，ADAM10KO组Aβ40蛋白水平无显著性变化，而Aβ42蛋白水平的表达显著性上调，同时Aβ42/Aβ40，pTau/Tau的比值显著性升高。
以上数据表明Aβ与高磷酸化Tau蛋白在ADAM10基因敲除组均显著性高表达。目前数据初步表明，敲除ADAM10基因的细胞可作为AD细胞模型。
实施例4 AD细胞模型中炎症因子的测定
与AD的发病机理有关的炎症细胞因子中，TNF-α在脑部炎症状态中起着核心作用，并且是唯一一个被认为对AD有关的细胞因子。因此我们对敲除ADAM10的细胞进行TNF-α的检测。取ADAM10敲除细胞弃去培养基，加入适量的PBS溶液润洗细胞后弃去溶液，加入适量的Trpsin消化细胞数分钟后加入含15％FBS培养基终止消化，1100rpm离心10min。PBS溶液充分重悬后取少量细胞计数，取2，000，000个细胞严格按照ELISA试剂盒说明书操作步骤严格进行，每个样本的总蛋白由BCA试剂盒测定，矫正总蛋白后，测定TNF-α炎症因子含量后进行数据统计。结果见图7，与空白组相比，敲除ADAM10的细胞中上清的炎症因子水平显著性上调。结果表明，敲除的细胞中炎症因子水平显著性上调。
实施例5
(1)细胞神经元分化培养
将SH-SY5Y细胞依次培养在如下表6所示的不同类型的培养基中，首先将细胞在Growth Media培养基中培养使其细胞密度达到70％。随后将培养基配方更换为Differentiation media 1培养7-10天，在此期间，每48小时更换培养液一次。将细胞按照1：1的比例传代于新鲜的培养基Differentiation media 2中培养4-7天，在此期间，每48小时更换培养液一次。将培养基换成Differentiation media 3培养7-10天，在此期间，每48小时更换培养液一次。此阶段细胞分化为神经元用于后续的检测与分析。
表6 SH-SY5Y细胞神经分化的培养基组成成分
(2)共聚焦显微镜观察神经元的生长
将分化的SH-SY5Y神经细胞使用4％PFA在室温下固定20min。弃去溶液后使用0.1％PBS-T溶液轻缓的润洗细胞3次，每次2min。固定后，将细胞放置在5％NGS-T封闭溶液中于室温孵育2小时。在4℃下加入一抗anti-tubulin III primary antibody(#ab179513,Abcam plc.)，一抗稀释浓度为1：1000，孵育过夜。去除一抗后使用0.1％PBS-T溶液轻缓的润洗细胞3次。在室温下加入二抗Alexa Fluor 488(ab150113,Abcam)，二抗稀释浓度为1：2000，于室温下孵育1h。去除二抗后，将细胞固定在载玻片中，在24h内用过共聚焦显微镜对样品进行成像检测。
使用Zeiss880共聚焦显微镜采集所有神经元分化图片。Laser power设置为4％；gain设置为650；Digital offset设置为350；Acquiring speed设置1.03s；Z-stack images设置为5μm；平均每张片子拍2次。
共聚焦显微镜采集的图像使用Image J插件Neuron J进行分析。选定每张图片中大于3个区域进行分析，随后测量轴突长度，并用Neuron J测量坐标之间的距离。
如图9所示，与未经过神经细胞分化的正常的SH-SY5Y细胞相比，在经过神经细胞分化处理后，正常的SH-SY5Y细胞神经元长度显著性变长，细胞间的连接更紧密。而敲除ADAM10基因后再经过相同的细胞分化处理，神经元长度显著性变短，细胞有皱缩趋势，细胞间的连接显著性变少，神经细胞间传递信息能力显著性减弱。
实施例6
①细胞总蛋白的提取:
弃去培养液后加入2ml预冷PBS进行润洗细胞，弃去PBS洗液。此操作重复2次。将培养瓶置于冰上，细胞计数后取1000,000个细胞，加入100μl含PMSF的裂解液，充分混合后于冰上裂解30min，隔段时间要摇动细胞瓶使细胞充分裂解。裂解后的细胞快速使用刮棒将细胞刮下，使用移液枪吸取细胞碎片和裂解液转移至1.5ml离心管中。于4℃下13000g离心20min。取上清，留取5μl对蛋白含量进行测定。取适量的上清以4：1体积加入上样缓冲液，于沸水煮沸10min。样品放于-20℃保存。
②制备分离胶与浓缩胶
分离胶(15％)：超纯水2.3mL；30％丙烯酰胺5.0mL；1.5M Tris-HCl(pH 8.8)2.5mL；10％SDS 0.1mL；10％APS(过硫酸铵)0.1mL；TEMED 4μl。
分离胶(8％)：超纯水4.6mL；30％丙烯酰胺2.7mL；1.5M Tris-HCl(pH 8.8)2.5mL；10％SDS 0.1mL；10％APS(过硫酸铵)0.1mL；TEMED 8μl。
分离胶(6％)：超纯水5.3mL；30％丙烯酰胺2.0mL；1.5M Tris-HCl(pH 8.8)2.5mL；10％SDS 0.1mL；10％APS(过硫酸铵)0.1mL；TEMED 8μl。
浓缩胶(5％)：超纯水2.7mL；30％丙烯酰胺0.4mL；1M Tris-HCl溶液(pH 6.8)0.5mL；10％SDS 40μl；10％APS 40μl；TEMED 4μl。
过硫酸铵与TEMED为促凝剂，加入溶液后要立即混匀后灌胶。灌好分离胶后，轻缓的加入超纯水，加超纯水时移动移液枪，保证水在同一水平线上。静置直到看到分离胶与水之间出现较明显的界限。等待分离胶凝固后，倾斜倒掉水，沥干水后，再灌入浓缩胶，插上梳齿，等待浓缩胶凝固后上样。
③蛋白样品上样
沿着垂直方向缓慢的拔出梳齿。使用50μl微量上样器取适量的样本，上样总蛋白一般为20μg，将上样器缓慢插入梳齿最底部，以适当的速度打入蛋白样品。
④电泳
第一阶段：75V，40～60min直至看到目的蛋白在分离胶与浓缩胶分界处出现一条线。
第二阶段：115V，60～90min直至目的蛋白迁移于距分离胶底部约1/3处。
⑤转膜
提前剪裁好与胶条大小匹配的PVDF膜，放入甲醇中浸泡活化15-20s后转移到超纯水中放置2min，将PVDF膜放入转膜缓冲液中浸泡10min。取出转膜滤纸放入转膜缓冲液中浸泡10min。等待电泳结束后切割所需分子量范围内的胶条。转膜装置从上至下的顺序依次为阴极碳板，转膜滤纸，胶，PVDF膜，滤纸。按照顺利放好，精确对齐，每一步均要保证无气泡存在。接通电源，1.5mm的胶恒流0.3A转膜时间2h，1mm的胶恒流0.18A转膜时间1.5h。将转膜槽放置在冰浴中防止转膜过热。
⑥封闭
转膜阶段结束后，断开电源取出PVDF膜。于5％的脱脂奶粉中4℃封闭过夜，或37℃封闭1h。
⑦孵育抗体
a.使用5％脱脂牛奶或者5％BSA溶液按照抗体说明书以适当的比例稀释一抗，孵育4℃过夜后于37℃条件下孵育1h。
b.弃去一抗，使用TBST溶液洗膜30min，每5min换一次液。
c.使用5％脱脂牛奶或者5％BSA溶液按照抗体说明书以适当的比例稀释二抗，于37℃条件下孵育1h。
d.弃去二抗，使用TBST溶液洗膜30min，每5min换一次液。
⑧凝胶图像分析
依据膜的面积将每条膜均匀的加入100～200ul的显影液，将条带放入凝胶成像仪中避光显色。对条带进行扫描，拍照。凝胶图象处理系统处理并分析条带的分子量与净光密度值。曝光时间依据条带的曝光难易程度做适当的调整，最起始的曝光时间为5～20s，总曝光时间根据每个条带做适当调整。
如图8所示，与Control KO组比，ADAM10 KO组NLRP3显著性增加，激活了炎症小体的表达。
实施例7
称取适量化合物AP1溶于DMSO溶液，配制终浓度分别为100nM、1μM、10μM的均匀溶液。分别于敲除ADAM10的细胞株中孵育24小时，按照实施例6提取蛋白使用Western blot对Aβ，Tau以及NLRP3蛋白进行验证。按照实施例5进行神经元的观察。如图10A-C所示，与ADAM10 KO组比，MK-8931可显著降低Aβ，Tau与炎症小体NLRP3蛋白的表达，如图10D所示，但MK-8931并不能改善神经元的状态。结果表明，MK-8931在临床三期实验的失败有可能与其临床前AD模型不能模拟神经元损伤有关，进一步表明所建立的AD细胞模型比较全面。
序列表
<110> 中国药科大学
<120> 基于CRISPR/Cas9基因编辑技术建立的AD细胞模型及其构建方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
uuuuuuuuua uaggucagua 20
<210> 2
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
uuuuuuuuau aggucaguau 20
<210> 3
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaauauauca gacauuauga 20

Claims (8)

1.一种RNP复合物，其特征在于，包括靶向ADAM10基因的crRNA、TracrRNA和Cas9蛋白；所述的靶向ADAM10基因的crRNA为crRNA1、crRNA2和crRNA3的组合；所述的crRNA1序列如SEQ ID NO.1所示，所述的crRNA2序列如SEQ ID NO.2所示，所述的crRNA3序列如SEQ IDNO.3所示。
2.权利要求1所述的RNP复合物在构建ADAM10基因敲除的阿尔茨海默病细胞模型中的应用。
3.权利要求1所述的RNP复合物在构建模拟脑内神经元坏死细胞模型中的应用。
4.一种构建阿尔茨海默病细胞模型的方法，其特征在于，包括将权利要求1所述的RNP复合物按照CRISPR/Cas 9基因编辑技术方法，电转入SH-SY5Y细胞，在SH-SY5Y细胞株中成功敲除目的基因ADAM10。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括混合所述的CrRNA1、 CrRNA2与CrRNA3后，将CrRNA混合物与TracrRNA混合退火形成gRNA, gRNA与Cas 9 蛋白混合形成RNP复合物，按照CRISPR/Cas 9基因编辑技术方法，使用Lonza-4D将RNP复合物电转导入SH-SY5Y细胞，在SH-SY5Y细胞株中成功敲除目的基因ADAM10，通过单克隆细胞培养单细胞株后，通过Sanger测序筛选到完全敲除ADAM10基因的单细胞株即为所述的阿尔茨海默病细胞模型。
6.一种临床前阿尔茨海默病细胞模型，其特征在于，为按照权利要求4或5所述的方法构建的ADAM10基因被敲除的SH-SY5Y细胞。
7.权利要求6所述的临床前阿尔茨海默病细胞模型在筛选阿尔茨海默病治疗药物中的应用。
8.权利要求6所述的临床前阿尔茨海默病细胞模型在筛选脑内神经元坏死治疗药物中的应用。
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