CN103343160B - microRNA-30家族的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供microRNA-30家族的新用途，具体为作为局灶节段性肾小球硬化（FSGS）患者足细胞损伤标志物的应用，此外，本发明还提供了microRNA-30家族在制备治疗足细胞损伤药物中的应用。本发明利用microRNA-30家族可有利地进行局灶节段性肾小球硬化（FSGS）患者的诊断以及制备足细胞损伤药物，对慢性肾脏疾病的诊治具有极其重要的意义。

Description

microRNA-30家族的新用途

技术领域

本发明涉及基因生物制剂领域，具体涉及microRNA-30家族的新用途。

背景技术

慢性肾脏疾病（Chronic kidney disease,CKD）已成为威胁我国人口健康的重要疾病之一。随着我国糖尿病、肥胖、高血压发病率的增加及人口老龄化，CKD的发病率将持续增加。因此，阐明慢性肾脏疾病发生发展机制及其干预措施是提高CKD早期预警、早期诊断和早期治疗水平的关键。

足细胞损伤是肾脏疾病发生发展的中心环节。足细胞即肾小球脏层上皮细胞,是肾小球中体积最大、功能最复杂的固有细胞，也是肾小球中唯一一种高度终末分化细胞，它附着于肾小球基底膜(GBM)的外侧,与GBM和毛细血管内皮一起构成肾小球滤过屏障。其中位于最外层的足细胞及其裂孔膜是肾小球滤过的最主要的屏障及最后屏障，一旦足细胞受损蛋白等大分子物质将透过滤过膜形成蛋白尿，继而导致肾小球硬化等病变发生。由于足细胞的特殊结构与特征，使它在多种肾小球疾病的发生与发展中起到关键的作用。目前研究已证明，肾小球微小病变(MCD)、膜性肾病(MN)、局灶节段性肾小球硬化(FSGS)、IgA肾病(IgAN)及糖尿病肾病(DN)等均与足细胞损伤密切相关。

近年来，有大量研究致力于探讨足细胞修复机制，研究发现糖皮质激素、雷公藤甲素、环孢素等药物能够有效地保护足细胞，从而改善蛋白尿、延缓肾脏疾病的进展，但其机制尚未阐述清楚，并且存在个体间疗效差异大、药物副作用明显等缺点。

近年来microRNA的深入研究揭示了microRNA对维持足细胞正常功能不可或缺。microRNA是一类由长度约为22个核苷酸的非编码RNA，通过对基因表达的负向调节，调控细胞增殖、分化、凋亡、代谢等一系列生理病理过程，并与多种人类疾病的发生密切相关，包括肿瘤、肾脏、心血管疾病等。目前已有大量试验证明多种microRNA参与了肾小球的发育、肾小球疾病形成。而足细胞特异性Dicer/Drosha敲除小鼠模型也非常有力的证明了microRNA对维持足细胞正常功能不可或缺，但是具体是哪些足细胞microRNA的丢失导致蛋白尿的产生目前仍不明确。

发明内容

本发明的目的在于提供一种microRNA-30家族的新用途。

前述新用途是指microRNA-30家族在局灶节段性肾小球硬化（FSGS）患者的足细胞损伤标志物以及制备足细胞损伤药物中的新用途。

前述microRNA-30家族包括microRNA-30a、microRNA-30b、microRNA-30c、microRNA-30d和microRNA-30e。

制备足细胞损伤药物中的新用途：由microRNA-30质粒注射治疗或通过microRNA-30质粒转染细胞或microRNA-30前体转染细胞。

hsa-mir-30a

GCGACUGUAAACAUCCUCGACUGGAAGCUGUGAAGCCACAGAUGGGCUUUCAGUCGGAUGUUUGCAGCUGC

hsa-mir-30b

ACCAAGUUUCAGUUCAUGUAAACAUCCUACACUCAGCUGUAAUACAUGGAUUGGCUGGGAGGUGGAUGUUUACUUCAGCUGACUUGGA

hsa-mir-30c

ACCAUGCUGUAGUGUGUGUAAACAUCCUACACUCUCAGCUGUGAGCUCAAGGUGGCUGGGAGAGGGUUGUUUACUCCUUCUGCCAUGGA

hsa-mir-30d

GUUGUUGUAAACAUCCCCGACUGGAAGCUGUAAGACACAGCUAAGCUUUCAGUCAGAUGUUUGCUGCUAC

hsa-mir-30e

GGGCAGUCUUUGCUACUGUAAACAUCCUUGACUGGAAGCUGUAAGGUGUUCAGAGGAGCUUUCAGUCGGAUGUUUACAGCGGCAGGCUGCCA

本发明发明人的研究证实：microRNA-30家族在FSGS患者损伤的足细胞中表达下降，经体外研究证实，损伤的足细胞中microRNA-30家族表达下降，并参与了足细胞损伤。microRNA-30家族是microRNA的重要组成部分之一，microRNA-30家族高度保守，在肾脏中含量丰富，并且在肾小球中特异地表达于足细胞中。

上述特征可以在作为局灶节段性肾小球硬化（FSGS）患者的足细胞损伤标志物中得到应用。microRNA-30家族通过质粒转染或通过microRNA前体进行转染的足细胞可以逆转肾小球损伤，用于慢性肾脏疾病的治疗，有效抵御损伤因素所引起的足细胞损伤。

本发明人通过实验进一步发现，microRNA-30可以通过抑制Notch1及P53表达从而起到保护足细胞的作用，此特征可在制备足细胞损伤药物中得到应用。

在一个实施例中，前述microRNA-30家族在制备足细胞损伤药物中的应用是通过构建质粒进行转染或通过microRNA前体进行转染。

本发明人通过体内体外实验证实，microRNA-30家族在人体及大鼠肾小球中特异性地表达于足细胞中，FSGS患者及PAN大鼠肾小球中microRNA-30家族成员表达显著下降，microRNA-30治疗可以显著降低PAN大鼠蛋白尿，逆转肾小球损伤。体外培养的足细胞在损伤因素如TGF-β/LPS/PAN刺激下，microRNA-30家族表达下调。经microRNA-30a质粒转染的足细胞可以有效抵御损伤因素所引起的足细胞损伤，如足细胞骨架紊乱、足细胞凋亡等。

可见，基于本发明的技术方案，利用microRNA-30家族可有利地进行局灶节段性肾小球硬化（FSGS）患者的诊断以及制备足细胞损伤药物，对慢性肾脏疾病的诊治具有极其重要的意义。

附图说明

图1为原位杂交法检测microRNA-30家族在肾小球中特异性的表达的结果。

图2为qPCR法检测microRNA-30家族在肾小球中特异性的表达的结果。

图3为经microRNA-30a质粒转染的足细胞F-actin染色结果。

图4为经microRNA-30a质粒治疗的大鼠的尿蛋白结果。

具体实施方式

为了更了解本发明的技术内容，特举具体实施例并配合所附图式说明如下。

实施例一microRNA30家族作为局灶节段性肾小球硬化（FSGS）患者足细胞损伤标志物的应用

microRNA-30家族是microRNAs的重要组成部分之一，人类和鼠类的microRNA-30家族包括microRNA-30a、microRNA-30b、microRNA-30c、microRNA-30d、microRNA-30e共计5个成员。microRNA-30家族5个成员都在足细胞表达(人类、大鼠、小鼠)且含量丰富。在microRNA30家族作为局灶节段性肾小球硬化（FSGS）患者足细胞损伤标志物的应用中，具体的检测方法为：

（1）原位杂交

肾组织石蜡标本新鲜配制二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水后，用新鲜配制的0.5%H₂O₂室温处理30min，以灭活内源性过氧化物酶；用3%柠檬酸新鲜配制蛋白酶(0.01g/L)，在37℃下处理10min，以消化标本DNA结合蛋白；每张玻片上滴加20μL不含探针的预杂交液(42℃)，预杂交4h；加含探针(1ng/L)的杂交液，42℃湿盒内杂交12h；以0.1×标准柠檬酸盐(SSC)42℃洗后，加SA-Bio-AP（37℃）处理10min；漂洗后加BCIP/NBT，避光显色2～4h，以不含探针的标本作阴性对照。

（2）RT-PCR

实时荧光定量PCR足细胞mRNA表达，用Trizol试剂提取足细胞总RNA，使用两步法测定RNA纯度和浓度：第1步反转录，按试剂盒说明书利用随机引物将mRNA反转录合成cDNA，反应条件为：25℃、1min，42℃、60min，85℃、5min；第2步：real-time PCR反应，以microRNA-30家族和β-actin为引物，在实时荧光定量PCR仪上进行反应条件：94℃、4min，94℃、20s，60℃、30s，72℃、30s，循环35次，每个样本重复6次，记录观察扩增曲线和溶解曲线，确定各扩增产物为特异性目的基因，在曲线上读出CT值，以β-actin为内参照，计算microRNA-30家族mRNA的相对表达量。

本实施例发现，microRNA-30家族在肾小球中特异性地表达于足细胞，如图1及图2所示的FSGS患者肾小球中microRNA-30家族成员表达结果，其表达显著下降。参考图1所示，原位杂交试验提示，microRNA-30家族在肾小球中特异地表达于足细胞中，FSGS患者于正常对照相比，microRNA-30表达下降，黑色箭头所指为microRNA-30在足细胞中的表达。体外试验进一步发现一些常见的足细胞损伤因素如转化生长因子β（TGF-β）、脂多糖（LPS）、嘌呤霉素核苷酸（PAN）均可下调足细胞microRNA-30家族表达，如图2所示：RT-RCR显示足细胞损伤因素TGF-β、LPS、PAN均可下调足细胞microRNA-30家族表达。图1所示结果图中：（A）体外培养的足细胞在TGF-β（5mg/ml）刺激1小时、6小时、12小时、24小时后microRNA-30家族表达出现显著的下降；（B）体外培养的足细胞在嘌呤霉素（PAN）（50μg/ml）刺激12小时、24小时后，microRNA-30家族表达出现显著的下降。（C）体外培养的足细胞在脂多糖（LPS）（10μg/ml）刺激12小时、24小时后microRNA-30家族表达出现显著的下降。*P<0.05。

实施例二microRNA-30家族在制备足细胞治疗药物中的新用途

(1)质粒转染法

1)microRNA-30a质粒构建：①基因序列合成：使用pSilencer2.0U6质粒为载体，通过PCR法合成microRNA-30a序列，同时5’端添加BamHⅠ酶切位点（GATCC），3’端添加HindⅢ（A）酶切位点，并加5个T作为RNA聚合酶Ⅲ的终止子，最终合成的序列为

gatccgcgactgtaaacatcctcgactggaagctgtgaagccacagatgggctttcagtcggatgtttgcagctgcttttta，同时合成microRNA30a反向互补配对序列，序列为gtaaaaagcagctgcaaacatccgactgaaagcccatctgtggcttcacagcttccagtcgaggatgtttacagtcgcggatcttcga。②利用PCR仪对上述合成的单链寡核苷酸片段进行退火连接；③载体pSilencer2.0U6质粒线型化及回收：在20μl反应体系中分别加入载体pSilencer2.0U6质粒（10μl）、BamHⅠ酶（2μl）、HindⅢ酶（2μl）、K buffer（2μl）以及H2O，在37℃条件下反应4h后，用0.8%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统的长波紫外灯下切下合成的线性质粒的凝胶，再用凝胶回收试剂盒回收。④退火片段与线性化质粒表达载体的连接及重组质粒的转化：在10μl反应体系中分别加入退火片段（6μl）、线性化pSilencer2.0U6质粒（2μl）、T4DNA连接酶（1μl）、T4DNA连接酶缓冲液（1μl），16℃水浴反应12h。再将反应后的10μl连接产物加入至100μlDH5α感受态细菌中，冰浴30min；42℃热休克90s；冰浴2min；加入到800μl的LB培养液中，37℃振荡培养60min；取菌液涂于含氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，37℃倒置培养12-16h，形成单个菌落；挑单个菌落于5ml含氨苄青霉素的LB培养基上，37℃振荡培养12h；用质粒提取试剂盒提取质粒。

2）质粒转染细胞：采用脂质体转染法，使用上海英骏生物技术有限公司的lipofectamine2000作为转染剂，使用6孔板培养贴壁的足细胞，将细胞培养至密度约为90%。将4μg DNA加入250μl无血清培养基中，将10μllipofectamine2000加入至250μl无血清培养基中，将两者混匀后静置20min，将混合液加入培养细胞中，4-6小时后更换培养基。

（2）microRNA前体转染法

microRNA-30家族前体购自Ambion公司，采用脂质体转染法，使用上海英骏生物技术有限公司的lipofectamine2000作为转染剂，使用6孔板培养贴壁的足细胞，将细胞培养至密度约为90%。将100nmol microRNA30家族前体加入250μl无血清培养基中，将10μl lipofectamine2000加入至250μl无血清培养基中，将两者混匀后静置20min，将混合液加入培养细胞中，4-6小时后更换培养基。

实施例二中利用质粒转染和microRNA前体转染法的结果检测方法：

F-actin染色检测足细胞骨架：共聚焦显微镜观察足细胞骨架蛋白F-actin，接种于chamber slides(Nunc)中的各组足细胞,接受干预后,37℃PBS洗3次,用4%多聚甲醛固定10min后,洗去固定液,加入0.15%Triton X-100透膜处理5min,洗涤后,室温避光条件下用罗丹明-鬼笔环肽孵育30min以上,PBS洗涤,吹干,甘油封片,共聚焦显微镜(型号为LS M510,Carl Zeiss)观察结果,扫描采集图像。

Annexin V检测足细胞凋亡：采用AnnexinV-PI双染色法,使用胰酶-EDTA消化分离细胞,制成单细胞悬液,将待测细胞的密度调整为5×10⁵～1×10⁶/mL,按Annexin V-PI双染凋亡试剂盒操作说明书进行测定。PI用氩离子激发光,激发光波长为488nm，发射光波长大于630nm，产生红色荧光，待用CELLQuest软件采集样本后，用ModFitLT软件进行分析。

实施例二的检测结果证实，经microRNA-30a质粒转染的足细胞可以有效抵御TGF-β所引起的足细胞损伤，如图3所示，如足细胞骨架紊乱（图3A）、足细胞凋亡（图3B）等，其中：(A).F-actin染色提示microRNA-30a可以保护TGF-β引起的足细胞骨架损伤；(B).Annexin V提示microRNA-30a可以保护TGF-β引起的足细胞凋亡。正常足细胞经TGF-β刺激0小时、12小时、24小时后，足细胞的凋亡比例分别为1.9±0.78%、5.9±1.27%、10.7±3.37%,经microRNA-30a质粒转染后相应的足细胞凋亡比例分别为2.13±0.95%、3.4±1.62%、4.8±2.0%。试验表明，microRNA-30其他家族成员的治疗效果相似，microRNA-30起到保护足细胞的作用。

实施例三质粒动物实验

大鼠尾静脉microRNA-30a质粒注射方法：

（1）microRNA-30a质粒制备（方法同实施例二中的质粒转染法）。

（2）microRNA-30a质粒尾静脉注射：具体操作如下，wistar大鼠在无麻醉或10％水合氯醛(剂量为3ml/Kg)麻醉下，用24G的静脉套管针尾静脉注射80ml/kg的林格液(内含100μg编码microRNA-30a基因的质粒)，在10s以内完成注射。

结果如图4所示，microRNA-30a质粒治疗可以显著减轻PAN大鼠24小时蛋白尿，大鼠在PAN（5mg/100g）注射后，在第5天、7天、9天蛋白尿显著增加分别为117±53mg/24h、182±75、235±60，经过microRNA-30a质粒尾静脉注射治疗后第5天、7天、9天蛋白尿减轻，分别为99±24、140±33、157±53。本实施例结果显示microRNA-30a质粒治疗可以显著减轻PAN大鼠肾脏损伤，这些实验说明microRNA-30家族在足细胞中起着明显的保护作用。

综上所述，本发明的上述实施例表明，microRNA-30家族在局灶节段性肾小球硬化（FSGS）患者的诊断以及制备足细胞损伤药物的应用上，具有显著的效果，对慢性肾脏疾病的诊治具有极其重要的意义。

虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明。本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰。因此，本发明的保护范围当视权利要求书所界定者为准。

microRNA-30

hsa-mir-30a

GCGACUGUAAACAUCCUCGACUGGAAGCUGUGAAGCCACAGAUGGGCUUUCAGUCGGAUGUUUGCAGCUGC

 

hsa-mir-30b

ACCAAGUUUCAGUUCAUGUAAACAUCCUACACUCAGCUGUAAUACAUGGAUUGGCUGGGAGGUGGAUGUUUACUUCAGCUGACUUGGA

 

hsa-mir-30c

ACCAUGCUGUAGUGUGUGUAAACAUCCUACACUCUCAGCUGUGAGCUCAAGGUGGCUGGGAGAGGGUUGUUUACUCCUUCUGCCAUGGA

 

hsa-mir-30d

GUUGUUGUAAACAUCCCCGACUGGAAGCUGUAAGACACAGCUAAGCUUUCAGUCAGAUGUUUGCUGCUAC

 

hsa-mir-30e

GGGCAGUCUUUGCUACUGUAAACAUCCUUGACUGGAAGCUGUAAGGUGUUCAGAGGAGCUUUCAGUCGGAUGUUUACAGCGGCAGGCUGCCA

Claims (1)

1.microRNA-30家族在制备足细胞损伤药物中的应用，其特征在于，所述microRNA-30家族包括microRNA-30a、microRNA-30b、microRNA-30c、microRNA-30d和microRNA-30e；所述应用是通过构建质粒进行转染或通过microRNA前体进行转染；所述microRNA-30通过抑制Notch1及P53表达从而起到保护足细胞的作用。