CN103432593B - 一种用于预防或治疗食管癌的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于预防或治疗食管癌的药物组合物，其含有 SLC22A3 基因和/或其编码的蛋白。本发明通过大量实验数据证明，提高 SLC22A3 基因在癌细胞、组织中的表达水平，可以有效抑制人食管鳞癌细胞的迁移和成瘤，进一步通过裸鼠食管癌模型实验验证了提高 SLC22A3 基因在发病动物体内的表达水平可以有效清除动物体内的癌组织，具有明显的食管癌治疗效果。此外还通过实验验证了野生型 SLC22A3 可以通过清除热休克诱导的正常食管上皮细胞内ROS以利保护细胞不产生DNA损伤（DNA Damage）。 SLC22A3 作为抑癌基因或抑癌蛋白在制备具有食管癌预防和治疗功能的药物组合物上极具临床应用价值，为食管癌的有效治疗提供了新的药物和方法。

Description

一种用于预防或治疗食管癌的药物组合物

技术领域

本发明涉及一个潜在的抑癌基因及其编码蛋白的新应用，具体涉及SLC22A3基因及其编码蛋白的新应用。

背景技术

食管癌（Esophageal Carcinoma，EC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一，死亡率占第六位。我国食管癌95%左右为鳞状细胞癌，而欧美国家70%左右为腺癌，所以食管鳞癌是中国特色的恶性肿瘤，它的发生具有显着的地域性分布差异，高低发区发病率相差高达500倍。流行病学研究显示，某些环境因素，比如烟酒史、营养缺乏、热食、摄入致癌物都可能与食管鳞状细胞癌（esophagealsquamous cell carcinoma ESCC）相关。在中国食管癌高发区，食管癌的发生具有明显的家族聚集性，说明遗传易感性和潜在环境暴露可能与食管癌的发生发展相关^[10-13]。近年来，在中国和日本人群中，通过全基因组关联研究(genome-wideassociation studies，GWASs)，发现了一些食管癌易感基因位点。Wang et al.的研究结果显示在中国人群中PLCE1和C20orf54可以作为食管癌的易感基因。深入了解高发区食管癌相关易感基因，对于我们更好地理解食管癌的发生机理，制定食管癌风险评估和早期检测的有效措施具有重要的预防肿瘤学和肿瘤诊断学意义，并且可以为肿瘤治疗提供新的靶点。

SLC22A3基因：（solute carrier family22，member3或者OCT3，GenBank登录号：NM_021977.3）主要功能为调节不同结构有机阳离子的转运，其中包括某些药物，内生性化合物，以及有毒物质。对该基因的结构研究表明，SLC22A3的启动子区域位于CpG岛，提示表观遗传学改变可能调控该基因表达水平。更新的研究表明，SLC22A3在前列腺癌患者的非肿瘤及肿瘤组织中出现的低表达与位于人类染色体6q22.3上的高风险位点rs9364554有密切相关性。更有趣的是，SLC22A3的这种基因-表达关联性只在祖籍欧洲人群中出现，祖籍日本及非洲的人群中都观察不到该种现象，提示基因-基因之间、基因-环境之间的潜在相互作用。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种抑制食管癌细胞迁移、抑制食管癌细胞成瘤的药物组合物。

本发明的另一个目的在于提供一种用于预防或治疗食管癌的药物组合物。

本发明所采取的技术方案是：

一种抑制食管癌细胞迁移或抑制食管癌细胞成瘤的药物组合物，其含有SLC22A3基因和/或其编码的蛋白。

所述SLC22A3基因包含于载体中，所述载体优选为真核表达载体或病毒表达载体。

优选的，所述病毒表达载体为pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro慢病毒真核表达载体。

优选的，所述药物组合物中还含有一种或多种药物赋形剂和/或药用载体。

以上所述食管癌细胞为食管鳞状上皮癌细胞。

一种用于预防或治疗食管癌的药物组合物，其含有SLC22A3基因和/或其编码的蛋白。

所述SLC22A3基因包含于载体中，所述载体优选为真核表达载体或病毒表达载体。

优选的，所述病毒表达载体为pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro慢病毒真核表达载体。

优选的，所述药物组合物中还含有一种或多种药物赋形剂和/或药用载体。

以上所述食管癌为食管鳞状细胞癌。

本发明通过通过一系列的体内、外功能实验发现：提高SLC22A3基因在癌细胞、组织中的表达水平，可以有效抑制人食管鳞癌细胞的迁移和成瘤，进一步通过裸鼠食管癌模型实验验证了提高SLC22A3基因在发病动物体内的表达水平可以有效清除动物体内的癌组织，具有明显的食管癌治疗效果。此外还通过实验验证了野生型SLC22A3可以通过清除热休克诱导的细胞内ROS以利保护细胞不产生DNA损伤（DNA Damage）。以上实验数据均足以证明SLC22A3基因或其编码的蛋白具有抑制食管癌细胞的迁移或成瘤、预防或治疗食管癌的功能。其作为抑癌基因或抑癌蛋白在制备具有食管癌预防和治疗功能的药物组合物上极具临床应用价值，为食管癌的有效治疗提供了新的药物和方法。

附图说明

图1为SLC22A3基因PCR产物电泳图（1：PCR产物；2：DNA Maker）；

图2为各重组细胞株的迁移能力检测图；

图3为各重组正常食管上皮细胞中线粒体ROS的检测；

图4为为各重组正常食管上皮细胞受到热刺激后产生DNA损伤的检测。

具体实施方式

为了探讨基因在食管鳞状细胞癌的发生发展中的作用并且找出潜在的易感基因，本发明利用高通量基因芯片表达技术(Affymetrix human genomeU133Plus2.0GeneChip covering47,000transcripts and variants)检测了来源于中国食管癌高发地区有家族史食管癌肿瘤组织(FH+；n﹦5)及无家族史食管癌肿瘤组织(FH-；n=10)的基因表达谱，并且与周围非肿瘤组织相比较。结果显示：与周围非肿瘤组织及FH-的ESCC患者相比，在FH+的ESCC患者中检测到234个差异表达基因（155个上调，79个下调）。

在79个于FH+的ESCC患者中显著下调的基因中，SLC22A3基因引起了我们的注意，其有可能成为一个全新的、与我国食管癌高发区有家族史食管癌患者发病密切相关的候选肿瘤易感基因。因此本发明集中研究了SLC22A3基因的表达水平对食管癌肿瘤细胞的影响，据此研发一种抑癌药物组合物。

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、质粒转化、DNA片段连接、酶切、凝胶电泳等，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(Sambrook J,Russell DW，Janssen K,Argentine J.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社)，或按照制造厂商所建议的条件。以下实施例中所用到的原始试剂和材料均可商购得到。其中：实验用到以下动物：免疫缺陷BALB/C4-5周龄裸鼠（购自中山大学实验动物中心）。

实验用到以下载体：pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro载体(美国System Biosciences公司)；SLC22A3shRNA载体(美国sigma公司)。

实验用到以下细胞系：KYSE30及KYSE180（德国DSMZ公司）；NE1、NE3及EC109（香港大学医学院解剖系George Tsao教授慷慨赠与）。

实施例1SLC22A3基因在ESCC肿瘤细胞中的功能研究

1、人源野生型SLC22A3基因的获得

本发明通过从正常食管上皮细胞NE1中抽取总RNA，逆转录成cDNA。再以cDNA为模板，进行PCR扩增来获得人源野生型SLC22A3基因（GenBank登录号：NM_021977.3）的蛋白编码区域。

首先，通过Trizol方法（见Invitrogen公司相关操作手册）从正常食管上皮细胞NE1（由香港大学医学院解剖系George Tsao教授慷慨赠与）提取总RNA，然后采用逆转录酶聚合反应从该提取的总RNA中获得cDNA。设计如下PCR引物：

Flag-OCT3-EcoR1-F：GGAATTCGCCACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGATGCCCTCCTTCGACGAGGCG（SEQ ID NO.1）；

OCT3-BamH1-R：CGGGATCCTCAAAGGTGAGAGCGGGAAAC（SEQ IDNO.2）。

按如下反应体系：cDNA模板2μl、Flag-OCT3-EcoR1-F(10pmol/μl)0.6μl、OCT3-BamH1-R(10pmol/μl)0.6μl、dNTP(2mM)2μl、10x缓冲液2μl、高保真酶(5IU/μl)0.5μl和双蒸水12.3μl；PCR反应参数为95℃10min；95℃45s、65℃45s、72℃2min共循环35次；72℃10min。最后获得约1700bp的人源野生型SLC22A3基因，如图1所示。

2、构建含人源野生型SLC22A3基因的重组表达载体

将上述PCR产物切胶回收，和pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro慢病毒真核表达载体（购自美国SBI公司）分别进行EcoRI、BamH1双酶切，T4连接酶（见TAKARA公司相关操作手册）连接后转化Stbl2菌，涂布LB-Amp+平板培养，挑取单克隆于5ml LB-Amp+扩增培养，抽取质粒，进行PCR鉴定和EcoRI、BamH1双酶切鉴定，将鉴定得到的重组质粒交测序公司测序，测序正确的重组子命名为pCDHOCT3。

3、含有人源野生型SLC22A3基因的重组慢病毒颗粒的药物组合物的制备通过脂质体转染法将pCDHOCT3和Packaging Mix、Lipofectmine2000和293FT细胞混合于opti-MEMI培养基培养24h后，更换DMEM完全培养基以便于慢病毒颗粒包装，转染48～72h后，在显微镜下可观察到成功转染的293FT细胞出现病变现象后，0.45μm滤膜过滤收集病毒颗粒。将病毒颗粒上清液按10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6稀释度依次加入到6孔板中感染相应食管癌细胞，共培养24h后，更换含嘌呤霉素的新鲜培养基，筛选2～4周左右，根据每孔所形成的克隆数计算滴度；所获得的重组病毒颗粒溶液于－70℃保存备用。

4、表达SLC22A3基因之各重组细胞株的筛选及鉴定

以食管癌细胞株KYSE30为例，于6cm²的细胞培养皿中培养至细胞铺板率为70-90%，加入含SLC22A3重组慢病毒颗粒上清感染24h后，去上清，加入含嘌呤霉素的新鲜培养基培养筛选。于培养皿中目测到有单克隆细胞群落形成，用单克隆环挑取至96孔板中培养，再放大至24孔板、6孔板和25cm²的细胞培养瓶中培养，然后取适量的细胞提取RNA，逆转录为cDNA，PCR扩增检测SLC22A3基因表达。将获得的KYSE30重组细胞株命名为30-OCT3。将获得的KYSE180重组细胞株命名为180-OCT3。

5、对各重组细胞株的集落形成法检测

方法：分别将2×10³个重组细胞株和其对照细胞株（含有空载pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro慢病毒真核表达载体的KYSE30或KYSE180细胞株）接种于在6孔培养板中。经过1-2周的细胞培养，Giemsa染色计数残存克隆（>50个细胞/克隆）数。各重组细胞株的集落形成数据如表1-2所示。

表1SLC22A3基因抑制KYSE30的集落形成（n=3）

表2SLC22A3基因抑制KYSE180的集落形成（n=3）

6、对各重组细胞株的迁移能力检测

方法：先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔0.5～1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过3条线。在空中加入约5×10⁵个细胞，具体数量因细胞不同而不同，掌握为过夜能铺满。第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。用PBS洗细胞3次，去处划下的细胞，加入无血清培养基。放入37度5%CO₂培养箱，培养。按0，24，48小时取样，拍照。结果如图2所示：和空载体对照细胞相比，SLC22A3对于食管癌细胞的迁移有显著的抑制作用。

7、食管癌重组细胞株在体肿瘤形成效果检测

实验动物选择免疫缺陷BALB/C四-五周龄裸鼠（由中山医科大学动物中心提供），雌雄不拘，在无特殊致病菌环境中饲养。随机分为对照组与实验组（每组10只裸小鼠）。食管癌重组细胞株（30-OCT3）及对照组细胞株(含有空载慢病毒真核表达载体的KYSE30细胞)经含10%胎牛血清的DMEM培养液培养后，将新鲜消化的1×10⁶细胞悬液0.2ml分别接种于裸鼠左或右后腿皮下。每隔3天检测一次，用游标卡尺测量肿瘤的短径（W）和最大长径（L）观察肿瘤生长情况，计算公式：肿瘤体积=LxW²/Z。数据进行统计后按均差加标准差方法表示。比较两组的生长生存情况，进行观察和记录。数据如表3所示。

表3食管癌重组细胞株在裸鼠体内形成肿瘤瘤体积和生存时间统计结果（n=10）

结果说明：生存时间越长，表明肿瘤生长被抑制的效果越好。反之越差。瘤体积越小，说明肿瘤生长速度越慢，抑癌效果越好。

实施例2裸鼠食管癌模型的建立和食管癌基因治疗效果检测

BALB/C四-五周龄裸鼠（由中山医科大学动物中心提供），雌雄不拘，在无特殊致病菌环境中饲养。未处理的肿瘤细胞株KYSE30经含10%胎牛血清的DMEM培养液培养后，将新鲜消化的1×10⁶细胞悬液分别接种于3只裸鼠皮下。裸鼠荷瘤生长时间总体为21-23d。

处死这3只裸鼠，取形成的瘤组织进一步分离食管癌细胞，再分别接种于裸鼠皮下。接种7d后，取建好的裸鼠模型，随机分成2组，每组10只，开始每3天在裸鼠腹腔注射一次本发明实施例1制备得到的含有人源野生型SLC22A3基因的重组慢病毒颗粒的药物组合物，注射量为5mg/kg。用游标卡尺测量肿瘤的短径（W）和最大长径（L）观察肿瘤生长情况，计算公式：肿瘤体积=LxW²/Z。数据进行统计后按均差加标准差方法表示。比较两组的生长生存情况，进行观察和记录。数据如表4所示。

表4裸鼠食管癌基因治疗后形成肿瘤瘤体积统计结果（n=10）

说明：空白对照组注射生理盐水；SLC22A3组注射含野生型SLC22A3基因的重组慢病毒颗粒的药物组合物。

结果说明：在统计天数内瘤体积相对越小，肿瘤生长速度越慢，说明注射的药物组合物的基因治疗效果越好。

实施例3人源野生型SLC22A3基因预防正常食管细胞受到热刺激后产生活性氧化物(reactive oxygen species ROS)的检测

1、建立沉默人源野生型SLC22A3的重组正常食管细胞株

通过脂质体转染法将shSLC22A3(用于沉默SLC22A3基因的载体，购自美国Sigma公司)和Packaging Mix、Lipofectmine2000和293FT细胞混合于opti-MEMI培养基培养24h后，更换DMEM完全培养基以便于慢病毒颗粒包装，转染48～72h后，在显微镜下可观察到成功转染的293FT细胞出现病变现象后，0.45μm滤膜过滤收集病毒颗粒。将病毒颗粒上清液按10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6稀释度依次加入到6孔板中感染相应正常食管细胞，共培养24h后，更换含嘌呤霉素的新鲜培养基，筛选2～4周左右，根据每孔所形成的克隆数计算滴度；所获得的重组病毒颗粒溶液于－70℃保存备用。以正常食管细胞株NE1为例，于6cm²的细胞培养皿中培养至细胞铺板率为70-90%，加入含Sh-SLC22A3重组慢病毒颗粒上清感染24h后，去上清，加入含嘌呤霉素的新鲜培养基培养筛选。于培养皿中目测到有单克隆细胞群落形成，用单克隆环挑取至96孔板中培养，再放大至24孔板、6孔板和25cm²的细胞培养瓶中培养，然后取适量的细胞提取RNA，逆转录为cDNA，PCR扩增检测SLC22A3基因表达。将获得的NE1重组细胞株命名为NE1-shOCT3。将获得的NE3重组细胞株命名为NE3-shOCT3。

2、各重组正常食管上皮细胞中线粒体ROS的检测

方法：首先将孔板中盖玻片上的细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)快速清洗2次，用3.7%的多聚甲酸/PBS室温下固定20min，置摇床上用PBS洗3次，每次5min；装载相应浓度的萤光探针(MitoSOX，购自美国Invitrogen)，37℃避光孵育15min；加入稀释的DAPI染核，PBS洗3次，每次5min。盖玻片取出，在干净的载玻片上滴一滴50%的甘油，然后将盖玻片取出来倒扣在载玻片上，碳酸缓冲液封片，激光共聚焦显微镜下观察并照相(MitoSOX:510/580nm)。结果如图3所示：在热休克（heat-shock）刺激下，野生型SLC22A3可以清除热休克诱导的正常食管细胞内的活性氧化物（ROS)以利保护细胞。而当沉默细胞内源性SLC22A3基因后，细胞表达低水平的SLC22A3，从而导致清除ROS能力降低，细胞内ROS染色呈阳性。

实施例4人源野生型SLC22A3基因预防正常食管细胞受到热刺激后产生DNA损伤的检测

方法：应用单细胞凝胶电泳（彗星实验）试剂盒（购自美国Cell Biolabs）检测各重组正常细胞株受热刺激后的DNA损害程度。各种细胞用冰冷的PBS洗1～2次，离心收集，用PBS0.3ml重悬，密度为1×10^5-6个/ml。将20μl细胞悬液和75μl的低熔点琼脂糖LMA混合均匀,然后迅速将适量含细胞的LMA滴到第1层琼脂糖上，立即盖上干净盖玻片，置4℃30min使第2层LMA凝固；细胞裂解：移去盖玻片，将载玻片置于平皿中，轻轻加入预冷的新鲜配置的细胞裂解混合液(pH10.0)，4℃下裂解1～3h。取出载玻片用蒸馏水漂洗2次；DNA碱解旋：将载玻片置于水平电泳槽正极端，并列放置，不留空隙。倒入新配制的电泳缓冲液约覆过载玻片胶面0.25cm左右，室温放置20～40min；细胞电泳：稳压25V，稳流300mA，电泳时间为20～30min；电泳后将载玻片置于平皿内，加入0.4mmol/L Tris-HCl(pH7.5)缓冲液或双蒸水，漂洗2次，每次5～15min，弃去Tris-HCl或双蒸水，使用PBS洗干净，并用滤纸吸干水分；缓缓加入无水乙醇将凝胶浸埋脱水10min～1h之后，吸去乙醇，自然凉干；染色：每张载玻片加2～3滴染色剂（30mg/ml溴化乙锭溶液染色），避光染色20min；观察、拍照和分析：荧光显微镜515～560nm（绿光）波长的激发光，可清楚地观察到核DNA和迁移的DNA(即慧星尾)。每个样本随机选择20～100个细胞，图片保存后，用相应的软件分析结果如图4所示：在热休克（heat-shock）刺激下，野生型SLC22A3可以清除热休克诱导的正常食管细胞内的DNA损伤以利保护细胞。而当沉默细胞内源性SLC22A3基因后，细胞表达低水平的SLC22A3，从而增加ROS诱导的DNA损伤。

以上实验数据均证明：SLC22A3基因或其编码的蛋白具有抑制食管癌细胞的迁移或成瘤、预防或治疗食管癌的功能。野生型SLC22A3可以通过清除热休克诱导的正常食管上皮细胞内ROS以利保护细胞不产生DNA损伤（DNADamage）。SLC22A3作为抑癌基因或抑癌蛋白在制备具有食管癌预防和治疗功能的药物组合物上极具临床应用价值，为食管癌的有效治疗提供了新的药物和方法。

以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。

<110>  中山大学附属肿瘤医院

 

<120>  一种用于预防或治疗食管癌的药物组合物

 

<130> 

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  61

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

ggaattcgcc accatggact acaaggacga cgatgacaag atgccctcct tcgacgaggc       60

 

g                                                                       61

 

 

<210>  2

<211>  29

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

cgggatcctc aaaggtgaga gcgggaaac                                         29

Claims (8)

1.SLC22A3基因和/或其编码的蛋白在制备抑制食管癌细胞迁移或抑制食管癌细胞成瘤的药物组合物中的应用，所述食管癌细胞为食管鳞状上皮癌细胞。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物组合物中还含有一种或多种药物赋形剂和/或药用载体。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述SLC22A3基因包含于载体中，所述载体为真核表达载体或病毒表达载体。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述病毒表达载体为pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro慢病毒真核表达载体。

5.SLC22A3基因和/或其编码的蛋白在制备用于预防或治疗食管癌的药物组合物中的应用，所述食管癌为食管鳞状细胞癌。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物组合物中还含有一种或多种药物赋形剂和/或药用载体。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述SLC22A3基因包含于载体中，所述载体为真核表达载体或病毒表达载体。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述病毒表达载体为pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro慢病毒真核表达载体。