CN107586836B

CN107586836B - 检测LRRC55 mRNA的试剂盒及其在局灶节段肾小球硬化症诊断中的应用

Info

Publication number: CN107586836B
Application number: CN201710866665.4A
Authority: CN
Inventors: 鲍浩; 刘志红; 胡帅; 秦卫松
Original assignee: Nanjing General Hospital of Nanjing Command PLA
Current assignee: Nanjing General Hospital of Nanjing Command PLA
Priority date: 2017-09-22
Filing date: 2017-09-22
Publication date: 2020-04-07
Anticipated expiration: 2037-09-22
Also published as: CN107586836A

Abstract

本发明属于医学检测领域，特别涉及检测LRRC55 mRNA的试剂盒及其在局灶节段肾小球硬化症(FSGS)诊断中的应用；本发明验证了LRRC55 mRNA在FSGS患者肾小球组织和尿液足细胞中表达水平显著增高，在微小病变肾病(MCD)患者肾小球组织和尿液足细胞中无变化；肾小球组织和尿液足细胞LRRC55 mRNA水平用于鉴别诊断FSGS和MCD的ROC曲线下面积均大于0.8；因此LRRC55 mRNA表达量可用于诊断局灶节段肾小球硬化症，为局灶节段肾小球硬化症的临床诊断提供了新方法。

Description

检测LRRC55 mRNA的试剂盒及其在局灶节段肾小球硬化症诊断中的应用

技术领域

本发明属于医学检测领域，特别涉及检测LRRC55 mRNA的试剂盒及其在局灶节段肾小球硬化症诊断中的应用。

背景技术

局灶节段肾小球硬化症(FSGS)是一种典型的足细胞病。患者多为非选择性蛋白尿，起病时高血压和肾功能损害较多见，常伴有肾小管功能的损伤。病理上，FSGS患者可见肾小球局灶节段样病变和小管间质急慢性病变。FSGS虽与微小病变肾病(MCD)同属于足细胞病，但临床病理损伤重于MCD，远期预后差于MCD。因此，找到FSGS特异性诊断标志物，具有重要的现实意义。

LRRC55是BK通道的一种γ辅助亚基。BK通道由α和辅助亚基(β或γ)组成，具有电压敏感和Ca²⁺敏感两种特性。辅助亚基γ通过增强BKα电压敏感激活和通道开放状态的变构耦合，使BK通道在生理Ca²⁺浓度条件下，被较低电压激活。LRRC55在HEK-293细胞中可将BK通道半数开放电压左移50mV(参考文献Yan J,Aldrich RW.BK potassium channelmodulation by leucine-rich repeat-containing proteins.Proc Natl Acad Sci U SA.2012.109(20):7917-22.)。另一方面，Kim EY等研究发现，足细胞中表达BK通道，且BK通道与TRPC6共定位(参考文献Kim EY,Alvarez-Baron CP,Dryer SE.Canonical transientreceptor potential channel(TRPC)3 and TRPC6 associate with large-conductanceCa²⁺-activated K⁺(BKCa)channels:role in BKCa trafficking to the surface ofcultured podocytes.Mol Pharmacol.2009.75(3):466-77.)。Ma YG等报道，BK通道特异性激活剂NS1619引起MDA-MB-231乳腺癌细胞胞内Ca²⁺浓度增加和线粒体膜电位去极化，导致细胞凋亡(参考文献Ma YG,Liu WC,Dong S,et al.Activation of BK(Ca)channels inzoledronic acid-induced apoptosis of MDA-MB-231 breast cancer cells.PLoSOne.2012.7(5):e37451.)。目前尚没有对LRRC55在FSGS中研究的报道。

发明内容

本发明解决现有技术中存在的上述技术问题，提供一种检测LRRC55 mRNA的试剂盒及其在局灶节段肾小球硬化症诊断中的应用。

为解决上述问题，本发明的技术方案如下：

通过独立样本验证了LRRC55 mRNA在FSGS患者肾小球组织中显著增高，在MCD患者肾小球组织中无变化；进一步通过磁珠法分选尿液足细胞，测定尿液足细胞中LRRC55 mRNA水平，结果显示FSGS患者尿液足细胞LRRC55 mRNA水平显著增高，而MCD患者尿液足细胞LRRC55 mRNA水平无变化；肾小球组织和尿液足细胞LRRC55 mRNA水平用于鉴别诊断FSGS和MCD的ROC曲线下面积均大于0.8；因此检测LRRC55 mRNA表达量的试剂可用于制备诊断局灶节段肾小球硬化症检测试剂或检测试剂盒。

优选地，所述LRRC55 mRNA表达量为肾小球组织或尿液足细胞中的表达量。

优选地，所述的检测LRRC55 mRNA表达量的试剂包括：对LRRC55 mRNA具有检测特异性的探针、基因芯片或PCR引物。

优选地，所述对LRRC55 mRNA具有检测特异性的PCR引物包括

LRRC55 mRNA的特异性引物：

正向引物：5’-TCCTTTGCACATGCCGTAAC-3’(SEQ ID NO.1)；

反向引物：5’-CTGAGGTTTCGGGTGTCCATT-3’(SEQ ID NO.2)。

优选地，所述对LRRC55 mRNA具有检测特异性的PCR引物还包括

内源对照ACTB mRNA的特异性引物：

正向引物：5’-CTTGACAAAACCTAACTTGCG-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物：5’-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3’(SEQ ID NO.4)。

用于诊断局灶节段肾小球硬化症的试剂盒，包括：

A、逆转录系统，由逆转录酶混合物、2×反应液混合物和无RNA酶水组成；

B、PCR分析系统，由LRRC55 mRNA特异性引物、ACTB mRNA特异性引物、2×qPCR反应混合物、荧光校正染料和双蒸水组成。

相对于现有技术，本发明的优点如下，

本发明验证了LRRC55 mRNA在FSGS患者肾小球组织和尿液足细胞中表达水平显著增高，在MCD患者肾小球组织和尿液足细胞中无变化；肾小球组织和尿液足细胞LRRC55mRNA水平用于鉴别诊断FSGS和MCD的ROC曲线下面积均大于0.8；因此LRRC55 mRNA表达量可用于诊断局灶节段肾小球硬化症，为局灶节段肾小球硬化症的临床诊断提供了新方法。

用于诊断局灶节段肾小球硬化症的试剂盒，可快速、准确检测肾小球组织和尿液足细胞中LRRC55 mRNA的表达量。

附图说明

图1为FSGS、MCD以及正常对照肾小球组织LRRC55 mRNA表达量比较*，P<0.05；

图2为ROC分析肾小球组织LRRC55 mRNA鉴别诊断FSGS和MCD的敏感性和特异性；

图3为FSGS、MCD以及正常对照尿液足细胞LRRC55 mRNA表达量比较*，P<0.05；

图4为ROC分析尿液足细胞LRRC55 mRNA鉴别诊断FSGS和MCD的敏感性和特异性。

具体实施方式

实施例1：

1、激光微分离肾小球组织

在Leica AS LMD系统(Leica Microsystems AG，Wetzlar，Germany)上进行肾组织激光微分离。将组织OCT包被，立即在液氮中冷冻。8μm厚切片并贴附在载玻片上。将切片用乙醇：乙酸(19：1)固定，用无RNase的水冲洗，用0.01％甲苯胺蓝染色，用无RNase的水冲洗，并完全干燥。通过激光微分离收集每个样本约50个肾小球切片。

2、尿液中足细胞的分离

500ml尿液，700g离心15min，获取尿沉渣。用PBS 10ml洗涤尿沉渣3次，再将尿沉渣悬浮于5ml PBS中。加入抗Podocalyxin抗体包被的磁珠，孵育2小时，磁座分离获得磁珠吸附的足细胞，并采用PBS洗涤分选细胞3次。分选细胞，通过nephrin抗体染色阳性率达到95％以上，证实获得细胞为足细胞。

3、RT-PCR分析

使用Trizol法提取总RNA。具体方法为：在样品中加入1ml的Trizol，室温静置5分钟，充分裂解。加入Trizol体积的1/5的氯仿，颠倒震荡15秒，室温静置5分钟，离心(12000g，15分钟，4℃)。将上层水相转移到另一干净的EP管中，加入等体积的异丙醇，室温静置5分钟，离心(12000g，10分钟，4℃)。去上清，加入1ml 75％乙醇洗涤RNA沉淀，振荡器混匀，离心(12000g，5分钟，4℃)；重复洗涤1次；去上清，空管离心(12000g，1分钟，4℃)。去上清，用30ul的ddH2O(RNase free)重悬溶解RNA沉淀。

使用逆转录酶制备模板cDNA，逆转录条件如下：

以ACTB mRNA作为内源对照，进行LRRC55 mRNA的RT-PCR分析，PCR分析条件如下：

PCR分析LRRC55 mRNA和ACTB mRNA特异性引物为：

通过激光微分离肾小球，RT-PCR分析LRRC55 mRNA表达量，显示LRRC55 mRNA在FSGS患者肾小球组织中显著增高，在MCD患者肾小球组织中无变化(如图1)。

以肾小球组织LRRC55 mRNA水平来鉴别诊断FSGS和MCD，ROC曲线下面积AUC达到0.989。以肾小球组织LRRC55相对定量值2.443为界值，鉴别诊断FSGS和MCD，敏感性和特异性分别达到90％和100％(如图2)。

磁珠法分选尿液足细胞，RT-PCR分析尿液足细胞LRRC55 mRNA表达量，显示LRRC55mRNA在FSGS患者尿液足细胞中显著增高，在MCD患者尿液足细胞中无变化(如图3)。

以尿液足细胞LRRC55 mRNA水平来鉴别诊断FSGS和MCD，ROC曲线下面积AUC达到1.000。以尿液足细胞LRRC55相对定量值1.745为界值，鉴别诊断FSGS和MCD，敏感性和特异性均达到100％(如图4)。

需要说明的是上述实施例仅仅是本发明的较佳实施例，并没有用来限定本发明的保护范围，在上述基础上做出的等同替换或者替代均属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国人民解放军南京军区南京总医院

<120> 检测LRRC55 mRNA的试剂盒及其在局灶节段肾小球硬化症诊断中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcctttgcac atgccgtaac 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctgaggtttc gggtgtccat t 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cttgacaaaa cctaacttgc g 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgctgtcacc ttcaccgttc 20

Claims

1.检测LRRC55 mRNA表达量的试剂在制备诊断局灶节段肾小球硬化症检测试剂或在制备诊断局灶节段肾小球硬化症检测试剂盒中的应用；

所述LRRC55 mRNA表达量为肾小球组织或尿液足细胞中的表达量。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的检测LRRC55 mRNA表达量的试剂包括：对LRRC55 mRNA具有检测特异性的探针、基因芯片或PCR引物。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述对LRRC55 mRNA具有检测特异性的PCR引物包括

LRRC55 mRNA的特异性引物：

正向引物：5’-TCCTTTGCACATGCCGTAAC-3’（SEQ ID NO.1）；

反向引物：5’-CTGAGGTTTCGGGTGTCCATT-3’（SEQ ID NO.2）。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述对LRRC55 mRNA具有检测特异性的PCR引物还包括

内源对照ACTB mRNA的特异性引物：

正向引物：5’-CTTGACAAAACCTAACTTGCG-3’（SEQ ID NO.3）；

反向引物：5’-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3’（SEQ ID NO.4）。