KR102213084B1 - 소변 유래 나노 소포체의 안드로겐 수용체 변이 유전자 검출 방법 및 이를 이용한 체외진단방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 개체의 소변 유래 나노 소포체에 존재하는 AR-FL(androgen receptor full-length), AR-V7(androgen receptor splice variant 7) 또는 이의 조합을 검출하는 단계를 포함하는, 전립선암 발병 여부를 확인하거나 또는 예후를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법 및 이를 위한 키트에 관한 것이다.

Description

소변 유래 나노 소포체의 안드로겐 수용체 변이 유전자 검출 방법 및 이를 이용한 체외진단방법 {URINE-DERIVED EXTRACELLULAR VESICLE BASED ANDROGEN RECEPTOR SPLICE VARIANTS DETECTION METHOD AND THEIR MOLECULAR DIAGNOSTICS}

본 발명은, 소변 유래 나노 소포체의 안드로겐 수용체 변이 유전자 검출을 통한 체외 진단 방법에 관한 것이다.

전립선암은 전세계적으로 발병하는 암 종 중 8%로 4번째로 가장 많이 발견되는 암으로, 남성에게서는 15%로 두 번째로 가장 많이 발견되는 암종이다. 초기 전립선암 세포의 성장에는 안드로겐이 필수적인 요소로 작용하는 것이 알려져 있다. 따라서 안드로겐 합성을 차단하거나 안드로겐 수용체를 억제하는 호르몬 요법을 통하여 초기 전립선암을 치료하고 있다. 하지만 거세저항성 전립선암 (castration-resistant prostate cancer; CRPC) 환자는 기존 호르몬 요법에 더 이상 반응하지 않으며, 최근 연구에 따르면 안드로겐 수용체 변이 RNA가 검출되는 환자는 초기 전립선암 치료에 사용되는 안드로겐 관련 호르몬 용법이 통하지 않는 것으로 보여진다. 전립선암 환자의 안드로겐 수용체 변이 RNA를 검출하는 것이 중요하지만, 진단의 표준 방법인 조직검사는 샘플 채취가 용이하지 않아 조기 진단이나 치료 후 예후에 활용하기 어려운 경우가 많다. 이를 보완하기 위한 방법으로 액체 생검과 같은 환자의 체액을 활용한 체외진단이 세계적으로 큰 주목을 받고 있으며, 액체 생검에 사용되는 바이오마커로는 혈액순환종양세포 (circulating tumor cells, CTCs), 나노 소포체, cfDNA (cell free DNA) 등이 있다.

나노 소포체는 세포 활동에서 발생되는 40-1000 nm 사이즈의 작은 소포체로, 발생지와 크기로 다른 소포체들과 구분된다. 발견 당시에는 세포 부산물로 여겨졌으나 종양의 진행 및 전이, 세포 신호 전달 등의 세포 활동에 기여하는 것으로 그 중요성이 밝혀졌다. 나노 소포체는 신체의 거의 모든 체액에 존재하며 유래된 세포의 유전정보를 포함하기 때문에 암을 포함한 각종 질병의 새로운 마커로 주목받고 있다. 뿐만 아니라 최근에는 나노 소포체를 통해서 세포 핵으로의 안드로겐 수용체 유전자의 수송 및 전사조절 활성화가 가능한 것이 밝혀졌으며, 이는 나노 소포체가 안드로겐 수용체 유전자를 포함할 수 있으며 이를 운반 및 전사조절하는 역할을 할 수 있는 것을 나타낸다.

일 양상은 개체의 소변으로부터 나노 소포체를 단리하는 단계; 상기 나노 소포체로부터 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 추출하는 단계; 및 AR-FL(androgen receptor full-length), AR-V7(androgen receptor splice variant 7) 또는 이의 조합을 검출하는 단계를 포함하는, 개체의 전립선암 발병 여부를 확인하거나 또는 예후를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

다른 양상은, 개체의 소변으로부터 단리된 나노 소포체로부터 AR-FL, AR-V7 또는 이의 조합을 검출하기 위한 시약을 포함하는, 개체의 전립선암 발병 여부를 확인하거나 또는 예후를 예측하기 위한 키트를 제공한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 또한, 본 명세서에 기재된 수치는 명시하지 않아도 "약"의 의미를 포함하는 것으로 간주한다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 전체가 본 명세서에 참고로 통합된다.

일 양상은, 개체의 소변으로부터 나노 소포체를 단리하는 단계; 상기 나노 소포체로부터 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 추출하는 단계; 및 AR-FL(androgen receptor full-length), AR-V7(androgen receptor splice variant 7) 또는 이의 조합을 검출하는 단계를 포함하는, 개체의 전립선암 발병 여부를 확인 또는 진단하거나 또는 예후를 예측하는 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 방법은 전립선암 발병 여부를 확인하거나 또는 예후를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 AR-FL 또는 AR-V7은 각각 AR-FL 또는 AR-V7로 정의될 수 있는 폴리뉴클레오티드, 구체적으로 RNA일 수 있다.

용어 "나노 소포체"는 기원이 되는 세포로부터 유래된 내부와 외부를 구분하는 지질 이중막을 갖는 입자를 의미하는 것으로, 구체적으로 "엑소좀(exosome)"일 수 있다.

용어 "발현"은 AR-FL 또는 AR-V7로 정의할 수 있는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 존재를 의미하는 것으로, 예를 들어, 나노 소포체로부터 단리된 RNA 중 AR-FL 또는 AR-V7로 정의될 수 있는 CDS에 상응하는 mRNA가 존재하는 경우, AR-FL 또는 AR-V7가 발현한 것으로 판단할 수 있다.

상기 소변으로부터 나노 소포체를 단리하는 단계는 통상적으로 알려져 있고 용이하게 구매가능한 시약에 의해 이루어질 수 있고, 초원심분리(ultracentrifugation; UC) 장치 또는 디스크 모양 칩(disc)을 활용한 크기 기반 나노 소포체 분리 장치를 이용할 수 있다. 상기 시약 또는 장치는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 디스크 모양 칩을 활용한 크기 기반 나노 소포체 분리 장치는, KR 10-2018-0039005 및 KR 10-2017-0048188에 구체적으로 개시되어 있다. 이러한 장치는 도 1A 내지 1C에 개략적으로 도시된 바와 같고, 개략적으로 회전 가능한 디스크 형상의 하우징부; 유체 샘플을 주입하여 담지되는 공간을 제공하는 샘플수용부; 시료를 여과할 수 있는 하나 이상의 여과막을 수용하는 여과챔버부; 여과된 샘플 용액을 보관하기 위한 폐액수용부; 및 상기 유체 샘플의 유동을 위한 통로를 제공하는 미세유로부를 포함할 수 있다. 또한, 선택적으로, 미세 유로 내에서 선택적으로 유체의 흐름을 조절할 수 있는 밸브; 및/또는 여과된 특정 크기 범위의 나노입자를 회수할 수 있는 입자포집부를 포함하여 시료로부터 특정 크기 범위의 나노 입자(구체적으로, 나노 소포체)를 여과 및 회수할 수 있는 것일 수 있다. 상기 디스크 모양 칩을 활용한 크기 기반 나노 소포체 분리 장치를 이용하는 경우, 일반적으로 사용되는 방법인 초원심분리 장치보다 단시간의 적은 rpm으로 나노 소포체를 단리할 수 있으며, 나노 소포체의 순도 및 농도가 높아 더 높은 순도 및 농도의 나노 소포체 유래 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드를 수득할 수 있다. 그러나, 나노 소포체는 종래에 사용되는 분리 방식에 의해서도 어느 정도의 농도로 단리되므로, 나노 소포체를 방법은 장치에 제한되지 않는다.

일 구체예에서, 상기 분리 장치는 1 nm 내지 1 ㎛의 기공을 갖는 여과막을 포함하는 여과 챔버부를 포함할 수 있고, 상기 여과막의 상면에는 나노입자를 포함하는 회수하고자 하는 용액 및 하면은 폐액에 인접해 있을 때, 상기 여과막에 존재하는 기공 내부의 모세관압력 보다 작은 최대 3000 rpm 이하의 회전속도를 사용하여 상기 하면에 인접한 폐액을 상기 폐액수용부로 버린 후, 여과막의 상면에 위치한 나노입자를 포함하는 용액을 선택적으로 회수하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 장치는 낮은 원심력과 크기를 기반으로 하기 때문에 항체 특이성과 무관한 나노 소포체를 단시간 안에 분리할 수 있으며, tangential flow를 이용하여 낮은 유속 변화율로 고농도의 나노 소포체를 농축할 수 있다.

상기 나노 소포체는 개체의 소변으로부터 유래한 것일 수 있다. 체액 중 소변을 이용하는 경우, 비침습적으로 진단이 가능하고, 전립선암 진단을 위한 표적 유전자 (예를 들어, AR-FL 또는 AR-V7)가 혈장 유래 나노 소포체에 비해 고농도 및 질병 진단률과 관련하여 더 높은 유의성으로 수득됨이 입증되었다 (도 5A 및 5B 참조). 상기 개체는 포유동물일 수 있다. 상기 포유동물은 인간을 포함해 원숭이, 소, 말, 돼지 등 다양할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 개체는 인간일 수 있다.

상기 나노 소포체로부터 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 필요에 따라 각각 또는 혼합물의 형태로 추출될 수 있다. 용어 "추출"은 혼합물로부터 표적하는 물질만을 얻는 과정을 의미하는 것으로, "단리" 또는 "정제"와 동일한 의미로 사용될 수 있다. 용어 "폴리펩티드"는 "단백질"과 동일한 의미로 사용될 수 있고, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 DNA, RNA 또는 이들의 조합을 의미할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 방법은 GAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase), ACTB(human beta-actin), CD9, CD63, CD81, FLOT (flotillin), Annexin, Alix, TSG101, Integrin β1, 또는 이들의 조합을 검출하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 마커들은 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합으로 검출될 수 있다. 상기 마커들은 나노 소포체 갯수를 정량하기 위해 사용될 수 있다.

일 구체예에서, 상기 방법은 MUC1/2, c-kit, EGFR(epidermal growth factor receptor), TWIST-1(twist-related protein1), ER(estrogen receptor), FAM3C (family with sequence similarity 3 member c), TERT(telomerase reverse transcriptase), FCGR3A/3B(Fc gamma receptor), TMPRSS2:ERG fusion(transmembrane protease-ETS-related gene), nanog, p53(tumor protein p53), CD24, CCNB1 (G2/mitotic-specific cyclin B1), CD44, CCND1(cyclin D1), CD40L(CD40 ligand), CD34, FOXA1(forkhead box protein A1), FGFR1(Fibroblast growth factor receptor), TGFβ1 (transforming growth factor beta 1), CD133(prominin-1), uPA(urokinase-type plasminogen activator), PSA(prostate-specific antigen) (gamma-seminoprotein 또는 kallikrein-3(KLK3)로도 알려짐), PSMA(prostate-specific membrane antigen) (글루타메이트 카르복시펩티다아제 ?carboxypeptidase II; GCPII)로도 알려짐), KLK2(kallikrein-2), PLAU (Urokinase-type plasminogen activator), FAM3C(family with sequence similarity 3 member C), UAP1(UDP-N-acetylhexosamine pyrophosphorylase), Axl(AXL receptor tyrpsine kinase aptamer), CD274, TGFB1(transforming growth factor beta 1), PDCD1(programmed cell death protein 1), CDH1(cadherin-1), PCA3(prostate cancer antigen 3), EpCAM(epithelial cell adhesion molecule), CDH2(cadherin-2), TMPR(transmembrane protease serine), CD151, PTEN(phosphatase and tensin homolog), PD1 (programmed cell death protein 1), PD-L1(programmed death-ligand 1) 또는 이들의 조합을 검출하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 마커들은 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합으로 검출될 수 있다. 상기 암 관련 마커, 구체적으로 전립선암 마커로서 사용되어, 전립선암 환자를 진단하는데 유의성을 높이기 위해 사용될 수 있다.

상기 AR-FL의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 (GenBank ID: AH002607.2) 또는 서열번호 2 (GenBank ID: AH002624.2)의 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 3 (GenBank ID: AAA51780.1)의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 정의될 수 있다. 상기 AR-V7의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4 (GenBank: HK145805.1) 또는 서열번호 5 (GeneBank: FJ235916.1)의 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 6 (GenBank: AJN14039.1v)의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 정의될 수 있다.

상기 AR-FL 및 AR-V7 각각의 폴리뉴클레오티드는 상기 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 서열과 60% 이상, 예를 들면, 70%이상, 80%이상, 90%이상, 95%이상, 99%이상, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 것일 수 있다. 또한, 상기 AR-FL 및 AR-V7 각각의 폴리뉴클레오티드는 상기 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 서열에서 1개 이상의 1개 이상의 뉴클레오티드, 2개 이상의 뉴클레오티드, 3개 이상의 뉴클레오티드, 4개 이상의 뉴클레오티드, 5개 이상의 뉴클레오티드, 6개 이상의 뉴클레오티드 또는 7개 이상의 뉴클레오티드가 상이한 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

일 구체예에서, 본 발명의 일 양상에 따른 진단 방법은 거세저항성 전립선암, 즉 CRPC형 전립선암의 발병 여부 또는 이의 예후를 예측하기 위한 것일 수 있다. CRPC형 전립선암 환자는 초기 전립선암 치료에 사용되는 안드로겐 관련 호르몬 용법으로 증상이 개선되지 않는 경향을 갖는다. 본 발명자들은 이러한 CRPC형 전립선암 환자로부터 수득된 소변 유래 나노 소포체에서 호르몬 치료에 반응하는 HSPC (hormone-sensitive prostate cancer)형 환자에 비해 더 높은 AR-FL 및/또는 AR-V7이 검출됨 (구체적으로는 AR-V7)을 확인하였다 (도 5 및 6A 참조). 따라서, 소변 유래 나노 소포체로부터 AR-FL 및/또는 AR-V7의 발현이 확인되거나, 그 발현량이 HSPC형 환자 또는 정상인에 비해 높은 것으로 확인되는 경우, CRPC형 전립선암 환자로 판단할 수 있다.

일 구체예에서, 본 발명의 일 양상에 따른 진단 방법으로 확인된 전립선암 은 호르몬 치료에 내성을 갖거나 갖게 될 가능성이 있는 것으로 분류될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 호르몬 치료는 안드로겐 관련 호르몬 치료로서, 안드로겐 관련 호르몬 치료는 안드로겐 교체 치료 (Androgen replacement therapy; ART), 안드로겐 결핍화 치료 (Androgen deprivation therapy; ADT) 또는 이의 조합을 의미하는 것일 수 있다. CRPC형 전립선암 환자는 상기와 같은 호르몬 치료에 내성을 갖는 것으로 알려져 있다. 본 발명자들은 소변 유래 나노 소포체로부터 AR-FL 및/또는 AR-V7의 발현이 높은 것으로 확인되었지만, CRPC형이 아닌 환자 (예를 들어, HSPC형 환자)라도 시간이 지남에 따라 CRPC형으로 변할 수 있음을 확인하였다 (도 6A). 따라서, 소변 유래 나노 소포체로부터 AR-FL 및/또는 AR-V7, 구체적으로는 AR-V7의 발현이 높은 것으로 확인된 경우, 상기 환자는 호르몬 치료에 내성을 갖게 될 가능성이 있는 환자로 분류할 수 있다. 이 경우, 보다 면밀한 모니터링 (즉, follow-up)을 통해 환자의 적절한 치료 방법을 선택하는데 크게 기여할 수 있을 것이다.

일 구체예에서, 상기 AR-FL 및/또는 AR-V7을 검출하는 단계는 RT-PCR(Real time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay: RPA), 중합효소증폭법 (Recombinase polymerase amplification: RPA), ddPCR(droplet digital PCR), 노던 블롯팅, 시퀀싱 (sequencing) 및 DNA 칩으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의한 것일 수 있다. 이러한 분석방법은 당해 기술분야에 통상의 지식을 가진 자가 공지된 기술을 이용하여 적절히 수행할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 방법은 AR-FL 및 AR-V7의 발현량을 정량하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 방법은 개체 (즉, 환자)의 시료 및 정상 대조군 (또는 HSPC형 환자)의 AR-FL 및/또는 AR-V7 발현량을 정량하여 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 방법은 정량화된 AR-FL 및 AR-V7의 발현량을 AR-FL 발현량 대비 AR-V7 발현량 (즉, [AR-V7 발현량]/[AR-FL 발현량])을 산출하는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 발명자들은 단순히 AR-V7 발현량을 비교하는 것보다, "[AR-V7 발현량]/[AR-FL 발현량]"을 비교하는 경우, 더 유의성 있게 CRPC형 환자 또는 CRPC형으로 발전될 환자를 진단할 수 있음을 확인하였다 (도 6B).

다른 양상은, 개체의 소변으로부터 단리된 나노 소포체로부터 AR-FL, AR-V7 또는 이의 조합을 검출하기 위한 시약을 포함하는, 상기 개체의 전립선암 발병 여부를 확인하거나 또는 예후를 예측하기 위한 키트를 제공한다.

상기 키트는 소변으로부터 나노 소포체를 단리하기 위해 필요한 시약을 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 단리된 소변 유래 나노 소포체로부터 AR-FL, AR-V7 또는 이의 조합을 검출하기 위한, AR-FL 및/또는 AR-V7에 특이적인 프라이머, 항체, 항원 결합 단편, 폴리펩티드, 프로브, 합성 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 상기 키트가 이용하는 AR-FL 및/또는 AR-V7의 발현량을 측정하는 분석방법에 적합한 하나 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 키트가 RNA 혼합물로부터 AR-FL 및/또는 AR-V7을 검출하는데 사용되는 경우, 상기 키트는 AR-FL 및/또는 AR-V7의 RNA에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 이외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시리보뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(dEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 키트는 인간에 사용하기 위한 것일 수 있다.

상기 키트에서 언급된 용어 또는 요소 중 청구된 방법에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 청구된 방법에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.

발명의 일 양상에 따른 개체의 전립선암 발병 여부를 확인하거나 또는 예후를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법을 이용하여, 개체에 비침습적인 방법으로 안드로겐 수용체 변이 유전자인 AR-V7을 검출할 수 있다. 상기 일 양상에 따른 방법에 의하여 호르몬 치료 내성이 발생하였거나 발생할 가능성이 있는 전립선암인지 여부를 진단함으로써 사전에 치료 전략을 수립할 수 있고, 조기 진단이 가능하다.

본 발명의 다른 양상에 따른 전립선암 발병 여부를 확인하거나 또는 예후를 예측하기 위한 키트에 의하여, 범용적이고 용이하게 개체로부터 전립선암 여부를 진단하고 예후를 예측할 수 있다.

도 1A는 나노 소포체 분리 및 농축이 가능한 디스크 모양 칩을 도식화한 것이고, 도 1B는 목적 물질의 정제에 사용되는 막을 확대한 것이고, 및 도 1C는 목적 물질이 정제되는 과정을 도식화한 것이다.
도 2는 나노 소포체 분리의 재현성 결과를 그래프로 나타낸 것이다. 도 2A는 총 6개 유닛(3개의 디스크, 각 디스크마다 2개 유닛 사용)에서 분리된 나노 소포체의 갯수를 그래프로 나타낸 것이고, 도 2B는 분리된 나노 소포체의 단백질 농도를 나타낸 것이고, 도 2C는 6개 유닛에서 나노 소포체 분리 후 나노 소포체 마커의 ELISA 검출결과를 나타낸 것이고, 도 2D는 분리된 나노 소포체의 생물분석기(bioanalyzer)를 이용한 RNA 전기영동 결과를 나타낸 것이고, 및 도 2E는 나노 소포체 마커 및 전립선암 마커의 RT-PCR 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 3A는 소변 유래 나노 소포체의 분리과정을 도식화한 것이고, 도 3B는 소변 부피에 따른 정제된 나노 소포체의 농도를 그래프로 나타낸 것이고, 도 3C는 각 환자로부터 수득된 소변 유래 나노 소포체의 농도를 그래프로 나타낸 것이고, 도 3D는 각 환자로부터 수득된 소변 유래 나노 소포체 중 나노 소포체 마커의 농도를 그래프로 나타낸 것이고, 및 도 3E는 각 환자의 소변 유래 나노 소포체 중 나노 소포체 마커의 농도 및 전립선암 마커의 RT-PCR 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4A는 AR-FL 및 AR-V7을 형질전환한 전립선암 세포로부터 유래된 나노 소포체로부터 ddPCR로 분석한 후 Cluster Plot한 결과를 나타낸 것이고, 도 4B는 전립선암 환자로부터 수득된 소변 유래 나노 소포체에 존재하는 AR-V7를 ddPCR로 정량한 것을 나타낸 것이고, 및 도 4C는 전립선암 환자로부터 수득된 소변 유래 나노 소포체에 존재하는 AR-FL을 ddPCR로 정량한 것을 나타낸 것이다.
도 5A는 HSPC형 환자 및 CRPC형 환자로부터 수득된 혈장 및 소변 유래 나노 소포체에 존재하는 나노 소포체당 총 RNA를 그래프로 나타낸 것이고, 도 5B는 HSPC 및 CRPC 환자로부터 수득된 혈장 및 소변 유래 나노 소포체에 존재하는 AR-FL 및 AR-V7의 발현량을 그래프로 나타낸 것이다.
도 6A는 HSPC 및 CRPC 환자로부터 수득된 소변 유래 나노 소포체에 존재하는 AR-FL 및 AR-V7의 발현량 및 AR-V7/ AR-FL 값을 그래프로 나타낸 것이고, 도 6B는 상기 도 6A로부터 분석된 CRPC 환자와 HSPC 환자로부터 수득된 소변 유래 나노 소포체에 존재하는 AR-V7, AR-FL 및 AR-V7/AR-FL 비율을 분석한 결과를 나타낸다.
도 7A은 CRPC형 전립선암 환자로부터 수득된 혈장 및 소변으로부터 입자를 분리하는 과정를 개략적으로 나타낸 것이고, 도 7B는 CRPC형 전립선암 환자로부터 수득된 혈장 및 소변으로부터 분리한 입자의 개수를 나타낸 것이며, 도 7C는 나노 소포체 마커인 CD9의 발현 수준을 나타낸 것이고, 도 7D는 나노 소포체 마커인 Alix의 발현 수준을 나타낸 것이다.
도 8A는 CRPC형 전립선암 환자로부터 수득된 혈장 및 소변 유래 나노 소포체 분리한 후, 총 단백질의 수준을 나타낸 것이고, 도 8B는 상기 혈장 나노 소포체에서 불순물과 관련된 마커인 Albumin, ApoA, ApoB의 ELISA 검출 결과를 나타낸 것이고, 도 8C는 소변 유래 나노 소포체 불순물과 관련된 마커인 Uromodulin의 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 9A는 CRPC형 환자로부터 수득된 혈장 및 소변 유래 나노 소포체에 존재하는 AR-FL 및 AR-V7의 발현량 및 AR-V7/AR-FL 값을 그래프로 나타낸 것이고, 도 9B 내지 9D는 상기 도 9A로부터 분석된 CRPC환자로부터 수득된 혈장 및 소변 유래 나노 소포체에 존재하는 AR-V7, AR-FL 및 AR-V7/AR-FL 비율을 분석한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 소변으로부터 나노 소포체의 단리 및 RNA 추출

소변으로부터 진단에 사용될 나노 소포체를 단리하기 위해 환자를 모집하였다. HSPC환자는 ADT(androgen deprivation therapy) 치료를 받지 않은 전립선암 환자로 모집하였고, CRPC 환자는 낮은 혈중 테스토스테론 수치(< 50 ng/dl 혹은 1.7 nmol/l)를 가지면서 암의 생물학적 진행 (일주 간격으로 3번의 연속적인 PSA 증가; 최저치에 대해 두 번의 50% 증가, 및 PSA > 2 ng/mL) 혹은 방사선학적 진행(radiological progression) (RECIST (response evaluation criteria in solid tumours)에 따른 새로운 병변의 발견 혹은 두 개 이상의 새로운 골 병변 또는 연조직 병변)을 보이는 환자로 모집하였다. 상기 모집된 CRPC 환자는 도세탁셀 약물의 치료를 받았으며, 국내의 보험 적용 범위가 아닌 아비라테론 아세테이트 혹은 엔잘루타미드와 같은 2차 치료는 받지 않은 환자였다.

상기 환자로부터 수집된 소변 샘플로부터 세포 잔해물을 제거하기 위해 상기 소변 샘플을 500 xg 에서 10분동안 원심 분리한 후, 상층액을 2,500 xg에서 15분동안 다시 원심 분리하였다. 펠렛을 제거한 후, 다시 상층액을 0.45 ㎛의 기공 크기를 갖는 필터를 이용하여 여과하고, KR 10-2017-0048188에 개시된 바와 같은 장치 (이하, 일 실시예에 따른 키트로 명명함.)를 이용하여 나노 소포체를 분리하였다. 상기 나노 소포체는 3000 rpm (~500 xg)에서 작동하는 장치를 이용하여 분리되고, 이후 주입된 PBS 용액으로 3000 rpm (~500 xg) 조건 하에 세척하였다. 이후 상기 나노 소포체를 200 ㎕ PBS로 용리시켰다.

나노 소포체는 초원심분리를 이용하여 소변으로부터 분리될 수 있었다. 이 경우, 상기 수집된 소변 샘플을 500 xg 에서 10분동안 원심 분리하여 세포 잔해물을 제거하고, 상층액을 2,500 xg에서 15분동안 다시 원심 분리 하였다. 그 후 펠렛을 제거한 상층액을 0.45 ㎛의 기공 크기를 갖는 필터로 여과하고, 초원심분리용 튜브로 옮겨 담아 150,000 xg에서 2시간동안 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후, 펠렛에 1 mL의 PBS 용액을 가한 후 현탁하여 150,000 xg에서 2시간동안 원심분리함으로써 불순물을 세척하였다. 다시 상층액을 제거한 후, 펠렛을 200 ㎕ PBS로 용리시켰다.

분리된 나노 소포체는 ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay), RT-PCR 및 ddPCR 으로 정량화 되었다.

ELISA를 수행하기 위해, 분리된 나노 소포체를 1XRIPA 및 프로테아제 저해제로 용해시키고, 플레이트 상에 PBS 용액과 함께 상온에서 2 시간 동안 인큐베이션 하였다. 용액을 제거하고, 상기 플레이트를 세척 용액 (예를 들어, 0.1% BSA-PBS 완충액)으로 세척하고, 블로킹 용액 (예를 들어, 1% BSA-PBS 완충액)으로 상온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 용액으로 두 번 세척한 후, 상기 플레이트를 검출용 항체 (예를 들어, 항-CD9, 항-Alix 등)와 4 ℃에서 밤새 인큐베이션 하였다. 인큐베이션이 끝난 후, 플레이트를 두 번 세척하고 2차 항체 (예를 들어, 항-래빗-HRP, 항-마우스-HRP)와 상온에서 2 시간 인큐베이션 하였다. 두 번 세척한 후, 플레이트를 100 ㎕의 TMB 용액과 함께 상온에서 15 분간 인큐베이션 한 후, 50 ㎕의 정지 용액을 가하여 반응을 정지시켰다. 반응물을 450 nm에서 플레이터 판독기를 이용하여 흡광도를 측정함으로써 정량 분석하였다.

RT-PCR을 수행하기 위해, 분리된 나노 소포체로부터 miRNeasy 키트 (Qiagen)를 이용하여 RNA를 추출하고, superscript vilo cDNA 합성 키트로 cDNA를 합성하였다. cDNA의 합성에 사용된 프라이머 중 AR-FL 및 AR-V7에 대한 프라이머는 하기의 표 1과 같다. Taqman gene expression master 키트를 이용하여 그 프로토콜에 따라 RT-PCR을 수행하였다.

프라이머	서열번호
AR forward	5'- AATCCCACATCCTGCTCAAG-3'
AR reverse	5'-AGTGAACTGATGCAGCTCTC-3'
AR-V7 forward	5'-TTGTCCATCTTG-3'
AR-V7 reverse	5'-CAATTGCCAACCCGGAATTT-3'

ddPCR을 수행하기 위해, 상기 cDNA를 이용하여 반응 혼합물 (10 ㎕ ddPCR super master mix, 8 ㎕ cDNA template, 각각의 1 ㎕ forward primer 및 reverse primer, 및 프로브(FAM과 HEX))로 준비하였다. PCR 증폭을 수행한 후, 드로플렛 판독기(droplet reader)를 이용하여 형광신호를 측정하고 표적 DNA의 카피 농도를 정량화하였다. QuantaSoft 소프트웨어를 이용하여 필요에 따라 각 표적 DNA에 대한 분석을 수행하였다 (예를 들어, 도 4A).

그 결과, 소변의 부피에 따라 나노 소포체의 농도가 선형 관계를 이루며 비례하여 추출될 수 있음을 확인하였다 (도 3B). 상기 환자 10명을 상대로 소변 유래 나노 소포체의 갯수를 정량한 결과 9명의 환자로부터 진단에 적용 가능한 수준의 높은 농도로 나노 소포체가 단리되었으며 (도 3C), 단리된 나노 소포체에 대해 CD9 및 Alix와 같은 나노 소포체 마커를 대상으로 ELISA를 수행하여 단리된 물질이 나노 소포체임을 재확인하였다 (도 3D). 또한 7명의 환자를 상대로 소변 유래 나노 소포체를 단리하고 RNA를 추출하여 RT-PCR함으로써 나노 소포체의 존재 (GAPDH, CD9 및 FLOT1) 및 전립선암 (PS 및 PSMA) 발병 상태를 확인하였다 (도 3E).

전립선암 환자의 소변으로부터 수득된 나노 소포체에 AR-FL 및 AR-V7이 존재하는지 여부를 확인하였다. AR-FL 및 AR-V7은 ddPCR(droplet digital PCR) 방법을 이용하여 군집 도표 (cluster plot)를 작성하면 서로 겹침 현상 없이 분명하게 구분된다 (도 4A).

실시예 2: 체액에 따른 진단 유의성 비교

소변 유래 나노 소포체로부터 전립선암을 진단하는 경우 혈장으로부터 유래된 나노 소포체로부터 진단하는 경우에 비해 질병과의 유의성이 더 높음을 확인하였다.

혈장 유래 나노 소포체는 exoRNeasy Serum/Plasma 키트 (Qiagen)를 이용하여, 제조사의 지침에 따라 소변 유래 나노 소포체를 분리할 동일한 환자의 혈장으로부터 분리하였다. 상기 혈장 유래 나노 소포체로부터 총 RNA 및 AR-FL 및 AR-V7의 발현량을 실시예 1과 같이 수득하였으며, 그 값을 각 환자 분류에 따라 "총 RNA/나노소포체 갯수" 및 "AR-FL 및 AR-V7의 발현량"으로 도시하였다.

그 결과, 소변 유래 나노 소포체의 경우 나노 소포체당 더 많은 RNA를 추출할 수 있었으며 (도 5A), 혈장 유래 나노 소포체로부터 분석된 값에 비해 소변 유래 나노 소포체로부터 분석된 AR-FL 및 AR-V7의 발현량이 모든 환자에서 높게 관찰될 뿐 아니라, CRPC형 전립선암 환자에서 보다 높은 유의성으로 발현됨을 알 수 있다 (도 5B).

실시예 3: AR-FL 및 AR-V7의 발현량에 따른 HSPC형 및 CRPC형 진단

AR-FL 및 AR-V7의 발현량이 전립선암 환자에서 CRPC형 발병과 관련성이 있음을 상기 실시예 2에서 확인하였다.

22명의 HSPC환자와 14명의 CRPC환자의 소변에서 나노 소포체를 분리하여 AR-FL와 AR-V7 유전자를 실시예 1과 같이 ddPCR 방법으로 정량화하여 도 6A 및 6B와 같이 도시하였다. 그 결과, 소변 유래 나노 소포체로부터 수득된 AR-V7의 발현량은 CRPC형 환자에서 전반적으로 높게 나타났고, AR-V7/AR-FL로 도시하는 경우 CRPC형 환자에서 그 값이 HSPC형과 비교하여 전반적으로 현저하게 높게 관찰되었다. HSPC환자 중 높은 AR-V7을 보였던 환자는 (검정 별표 표기) 4개월 뒤에 CRPC로 진단되었다.

실시예 4: 체액의 종류 및 키트에 따른 진단 유의성 검증

본 실시예에서는 전립선 암 진단과 관련하여, 소변 유래 나노 소포체를 대상로 하는 경우, 동일한 볼륨의 혈장으로부터 유래된 나노 소포체를 대상으로 한 경우에 비해 진단의 유의성이 더 높음을 재차 확인하였다. 또한, 일 실시예에 따른 키트를 사용하여 소변 유래 나노 소포체로부터 전립선암을 진단하는 경우, 상용화된 타 키트를 사용하여 소변 유래 나노 소포체로부터 진단하는 경우에 비해 진단의 유의성이 더 높음을 확인하였다.

혈장 유래 나노 소포체는 exoRNeasy Serum/Plasma 키트 (Qiagen)를 이용하여, 제조사의 지침에 따라 소변 유래 나노 소포체를 분리할 동일한 환자 (CRPC 환자)의 혈장으로부터 분리하였다(도 7A). 또한, 소변 유래 나노 소포체는 일 실시예에 따른 키트 혹은 exoRNeasy Serum/Plasma 키트 (Qiagen)를 이용하여, 제조사의 지침에 따라 혈장 유래 나노 소포체를 분리한 동일한 환자의 소변으로부터 분리하였다 (도 7A).

그 결과, CRPC형 전립선암 환자로부터 수득된 혈장 또는 소변으로부터 적정 농도의 입자 (particle)를 확인할 수 있었으며 (도 7B). CD9, 및 Alix와 같은 마커의 검출을 통해 상기 입자가 각각 혈장 또는 소변 유래 나노 소포체임을 확인하였다 (도 7C,및 7B). 또한, 소변 유래 나노 소포체는, 혈장 유래 나노 소포체에 비해 불순물의 발현량이 낮게 검출되었으며, 동일한 소변 샘플을 사용하였다 할지라도, 일 실시예 따른 키트를 이용한 경우 이러한 효과는 보다 우수하였다 (도 8A, 8B, 및 8C). 아울러, 일 실시예에 따른 소변 유래 소포체는, 혈장 유래 나노 소포체 또는 exoRNeasy Serum/Plasma 키트 (Qiagen)을 이용하여 수득한 소변 유래 나노 소포체를 대상으로 분석된 값에 비해, AR-V7 또는 AR-FL의 발현량 및 AR-V7/AR-FL 비율이 전립선 암의 진단과 관련하여 유의적으로 높게 관찰되었다 (도 9A 내지 9D).

<110> UNIST Academy-Industry Research Corporation <120> URINE-DERIVED EXTRACELLULAR VESICLE BASED ANDROGEN RECEPTOR SPLICE VARIANTS DETECTION METHOD AND THEIR MOLECULAR DIAGNOSTICS <130> PN128456KR <150> KR 10-2018-0094007 <151> 2018-08-10 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 4509 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tttttgcgtg gttgctcccg aagtttcctt ctctggagct tcccgcacgt gggcagctag 60 ctgcagcgac taccgcatca tcacagcctg ttgaactctt ctgagcaaga gaaggggagg 120 cggggtaagg gaagtaggtg gaagattcag ccaagctcaa ggatggaagt gcagttaggg 180 ctgggaaggg tctaccctcg gccgccgtcc aagacctacc gaggagcttt ccagaatctg 240 ttccagagcg tgcgcgaagt gatccagaac ccgggcccca ggcacccaga ggccgcgagc 300 gcagcacctc ccggcgccag tttgctgctg ctgcagcagc agcagcagca gcagcagcag 360 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag caagagacta gccccaggca gcagcagcag 420 cagcagggtg aggatggttc tccccaagcc catcgtagag gccccacagg ctacctggtc 480 ctggatgagg aacagcaacc ttcacagccg cagtcggccc tggagtgcca ccccgagaga 540 ggttgcgtcc cagagcctgg agccgccgtg gccgccagca 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accctcagcc 1440 gccgcttcct catcctggca cactctcttc acagccgaag aaggccagtt gtatggaccg 1500 tgtggtggtg gtgggggtgg tggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc 1560 ggcggcggcg gcgaggcggg agctgtagcc ccctacggct acactcggcc ccctcagggg 1620 ctggcgggcc aggaaagcga cttcaccgca cctgatgtgt ggtaccctgg cggcatggtg 1680 agcagagtgc cctatcccag tcccacttgt gtcaaaagcg aaatgggccc ctggatggat 1740 agctactccg gaccttacgg ggacatgcgg taagtttttc cttccagaaa tgtcgctttc 1800 ggcccaggga nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1860 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn cattcagtga 1920 catgtgttgc attggttttt tgtgtctttt ccagtttgga gactgccagg gaccatgttt 1980 tgcccattga ctattacttt ccaccccaga agacctgcct gatctgtgga gatgaagctt 2040 ctgggtgtca ctatggagct ctcacatgtg gaagctgcaa ggtcttcttc aaaagagccg 2100 ctgaaggtaa agggtcttgc acatgcagct tctctttccc tttctcgttt accttccaga 2160 gagagacact aacctttcan nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 2220 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnna 2280 acttattatc aggtcaatca actcttgttt gtgttctccc agggaaacag aagtacctgt 2340 gcgccagcag aaatgattgc actattgata aattccgaag gaaaaattgt ccatcttgtc 2400 gtcttcggaa atgttatgaa gcagggatga ctctgggagg taagatactt ttctttctct 2460 tcctcctcct tcctctctcn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 2520 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnc 2580 cactgatgat aaattcaagt ctctcttcct tcccaatagc ccggaagctg aagaaacttg 2640 gtaatctgaa actacaggag gaaggagagg cttccagcac caccagcccc actgaggaga 2700 caacccagaa gctgacagtg tcacacattg aaggctatga atgtcagccc atctttctga 2760 atgtcctgga agccattgag ccaggtgtag tgtgtgctgg acacgacaac aaccagcccg 2820 actcctttgc agccttgctc tctagcctca atgaactggg agagagacag cttgtacacg 2880 tggtcaagtg ggccaaggcc ttgcctggta aggaaaaggg aagtgggagc atgagataag 2940 ggggatcata tttagtgnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 3000 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnntgc 3060 ccaacaggga gtcagactta gctcaacccg tcagtagtac ccagactgac cactgcctct 3120 gcctcttctt ctccaggctt ccgcaactta cacgtggacg accagatggc tgtcattcag 3180 tactcctgga tggggctcat ggtgtttgcc atgggctggc gatccttcac caatgtcaac 3240 tccaggatgc tctacttcgc ccctgatctg gttttcaatg agtaagtgct cctggggccc 3300 agagacctca ctaaaataca gcagcttggc cagacctggt tggnnnnnnn nnnnnnnnnn 3360 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 3420 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnntattgta aacttcccct cattcctttt tcctctgtgt 3480 atctcttccc aggtaccgca tgcacaagtc ccggatgtac agccagtgtg tccgaatgag 3540 gcacctctct caagagtttg gatggctcca aatcaccccc caggaattcc tgtgcatgaa 3600 agcactgcta ctcttcagca ttagtaagtg cctagaagtg cagggaatgc ccctgacgag 3660 agattcagag aggaccactt ttgccattnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 3720 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 3780 nnnnnnnntc taatgctcct tcgtgggcat gcttcccctc cccattctgt cttcatccca 3840 catcagttcc agtggatggg ctgaaaaatc aaaaattctt tgatgaactt cgaatgaact 3900 acatcaagga actcgatcgt atcattgcat gcaaaagaaa aaatcccaca tcctgctcaa 3960 gacgcttcta ccagctcacc aagctcctgg actccgtgca gcctgtaagc aaacgatgga 4020 gggtgcttta tcagggagaa cagcctgata gagcnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4080 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4140 nnnnnnnnnn nnnncagagg ccacctcctt gtcaaccctg tttttctccc tcttattgtt 4200 ccctacagat tgcgagagag ctgcatcagt tcacttttga cctgctaatc aagtcacaca 4260 tggtgagcgt ggactttccg gaaatgatgg cagagatcat ctctgtgcaa gtgcccaaga 4320 tcctttctgg gaaagtcaag cccatctatt tccacaccca gtgaagcatt ggaaacccta 4380 tttccccacc ccagctcatg ccccctttca gatgtcttct gcctgttata actctgcact 4440 actcctctga gtgccttggg gaatttcctc tattgatgta cagtctgtca tgaacatgtt 4500 cctgaattc 4509 <210> 2 <211> 5043 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 agcctgttga actcttctga gcaagagaag gggaggcggg gtaagggaag taggtggaag 60 attcagccaa gctcaaggat ggaagtgcag ttagggctgg gaagggtcta ccctcggccg 120 ccgtccaaga cctaccgagg agctttccag aatctgttcc agagcgtgcg cgaagtgatc 180 cagaacccgg gccccaggca cccagaggcc gcgagcgcag cacctcccgg cgccagtttg 240 ctgctgctgc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 300 cagcagcagc aagagactag ccccaggcag cagcagcagc agcagggtga ggatggttct 360 ccccaagccc atcgtagagg ccccacaggc tacctggtcc tggatgagga acagcaacct 420 tcacagccgc agtcggccct ggagtgccac cccgagagag gttgcgtccc agagcctgga 480 gccgccgtgg ccgccagcaa ggggctgccg cagcagctgc cagcacctcc ggacgaggat 540 gactcagctg ccccatccac gttgtccctg ctgggcccca ctttccccgg cttaagcagc 600 tgctccgctg accttaaaga catcctgagc gaggccagca ccatgcaact ccttcagcaa 660 cagcagcagg aagcagtatc cgaaggcagc agcagcggga gagcgaggga ggcctcgggg 720 gctcccactt cctccaagga caattactta gggggcactt cgaccatttc tgacaacgcc 780 aaggagttgt gtaaggcagt gtcggtgtcc atgggcctgg gtgtggaggc gttggagcat 840 ctgagtccag gggaacagct tcggggggat tgcatgtacg ccccactttt gggagttcca 900 cccgctgtgc gtcccactcc ttgtgcccca ttggccgaat gcaaaggttc tctgctagac 960 gacagcgcag gcaagagcac tgaagatact gctgagtatt cccctttcaa gggaggttac 1020 accaaagggc tagaaggcga gagcctaggc tgctctggca gcgctgcagc agggagctcc 1080 gggacacttg 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nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 2820 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnggagt ttagagtctg tgaccaggga gaatggtgat 2880 tttcttagct agggcagttt ttctaaaaag gtagttgcat tgtgtgtttt tgaccactga 2940 tgataaattc aagtctctct tccttcccaa tagcccggaa gctgaagaaa cttggtaatc 3000 tgaaactaca ggaggaagga gaggcttcca gcaccaccag ccccactgag gagacaaccc 3060 agaagctgac agtgtcacac attgaaggct atgaatgtca gcccatcttt ctgaatgtcc 3120 tggaagccat tgagccaggt gtagtgtgtg ctggacacga caacaaccag cccgactcct 3180 ttgcagcctt gctctctagc ctcaatgaac tgggagagag acagcttgta cacgtggtca 3240 agtgggccaa ggccttgcct ggtaaggaaa agggaagtgg gagcatgaga taagggggat 3300 cnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 3360 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ncaacccgtc agtacccaga 3420 ctgaccactg cctctgcctc ttcttctcca ggcttccgca acttacacgt ggacgaccag 3480 atggctgtca ttcagtactc ctggatgggg ctcatggtgt ttgccatggg ctggcgatcc 3540 ttcaccaatg tcaactccag gatgctctac ttcgcccctg atctggtttt caatgagtaa 3600 gtgctcctgg ggcccagacc tcactaaaat acagcagctt ggccagacct ggttggtggt 3660 gatggtgatg gggtgacagt gaagctnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 3720 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 3780 nnnnnnctct gggcttattg gtaaacttcc cctcattcct ttttcctctg tgtatctcct 3840 tcccaggtac cgcatgcaca agtcccggat gtacagccag tgtgtccgaa tgaggcacct 3900 ctctcaagag tttggatggc tccaaatcac cccccaggaa ttcctgtgca tgaaagcact 3960 gctactcttc agcattagta agtgcctaga agtgcaggga atgccccctg agggcacaga 4020 gattcagaga ggaccacttt tgccattaaa acattattag ggaaaagcca gctcctggac 4080 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4140 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ctttcagatc ggatccagct 4200 atcctttccc ctgagatctc cctgacagac tgaaggcccc aagcacacag acttcaacta 4260 acaggaagcc aagtagatgg ttccctgtgg gggtgggggt caagtctgtg gtcagaaaac 4320 ttggtgcttt gtctaatgct ccttcgtggg catgcttccc ctccccattc tgtcttcatc 4380 ccacatcagt tccagtggat gggctgaaaa atcaaaaatt ctttgatgaa cttcgaatga 4440 actacatcaa ggaactcgat cgtatcattg catgcaaaag aaaaaatccc acatcctgct 4500 caagacgctt ctaccagctc accaagctcc tggactccgt gcagcctgta agcaaacgat 4560 ggagggtgct ttatcaggga gaacagcctg atagagnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4620 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4680 nnnnnnnnnn nnnnnngagg ccacctcctt gtcaaccctg tttttctccc tcttattgtt 4740 ccctacagat tgcgagagag ctgcatcagt tcacttttga cctgctaatc aagtcacaca 4800 tggtgagcgt ggactttccg gaaatgatgg cagagatcat ctctgtgcaa gtgcccaaga 4860 tcctttctgg gaaagtcaag cccatctatt tccacaccca gtgaagcatt ggaaacccta 4920 tttccccacc ccagctcatg ccccctttca gatgtcttct gcctgttata actctgcact 4980 actcctctgc agtgccttgg ggaatttcct ctattgatgt acagtctgtc atgaacatgt 5040 tcc 5043 <210> 3 <211> 906 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Glu Val Gln Leu Gly Leu Gly Arg Val Tyr Pro Arg Pro Pro Ser 1 5 10 15 Lys Thr Tyr Arg Gly Ala Phe Gln Asn Leu Phe Gln Ser Val Arg Glu 20 25 30 Val Ile Gln Asn Pro Gly Pro Arg His Pro Glu Ala Ala Ser Ala Ala 35 40 45 Pro Pro Gly Ala Ser Leu Leu Leu Leu Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln 50 55 60 Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Glu Thr Ser Pro Arg Gln Gln 65 70 75 80 Gln Gln Gln Gln Gly Glu Asp Gly Ser Pro Gln Ala His Arg Arg Gly 85 90 95 Pro Thr Gly Tyr Leu Val Leu Asp Glu Glu Gln Gln Pro Ser Gln Pro 100 105 110 Gln Ser Ala Leu Glu Cys His Pro Glu Arg Gly Cys Val Pro Glu Pro 115 120 125 Gly Ala Ala Val Ala Ala Ser Lys Gly Leu Pro Gln Gln Leu Pro Ala 130 135 140 Pro Pro Asp Glu Asp Asp Ser Ala Ala Pro Ser Thr Leu Ser Leu Leu 145 150 155 160 Ala Pro Thr Phe Pro Gly Leu Ser Ser Cys Ser Ala Asp Leu Lys Asp 165 170 175 Ile Leu Ser Glu Ala Ser Thr Met Gln Leu Leu Gln Gln Gln Gln Gln 180 185 190 Glu Ala Val Ser Glu Gly Ser Ser Ser Gly Arg Ala Arg Glu Ala Ser 195 200 205 Gly Ala Pro Thr Ser Ser Lys Asp Asn Tyr Leu Gly Gly Thr Ser Thr 210 215 220 Ile Ser Asp Asn Ala Lys Glu Leu Cys Lys Ala Val Ser Val Ser Met 225 230 235 240 Gly Leu Gly Val Glu Ala Leu Glu His Leu Ser Pro Gly Glu Gln Leu 245 250 255 Arg Gly Asp Cys Met Tyr Ala Pro Leu Leu Gly Val Pro Pro Ala Val 260 265 270 Arg Pro Thr Pro Cys Ala Pro Leu Ala Glu Cys Lys Gly Ser Leu Leu 275 280 285 Asp Asp Ser Ala Gly Lys Ser Thr Glu Asp Thr Ala Glu Tyr Ser Pro 290 295 300 Phe Lys Gly Gly Tyr Thr Lys Gly Leu Glu Gly Glu Ser Leu Gly Cys 305 310 315 320 Ser Gly Ser Ala Ala Ala Gly Ser Ser Gly Thr Leu Glu Leu Pro Ser 325 330 335 Thr Leu Ser Leu Tyr Lys Ser Gly Ala Leu Asp Glu Ala Ala Ala Tyr 340 345 350 Gln Ser Arg Asp Tyr Tyr Asn Phe Pro Leu Ala Leu Ala Gly Pro Pro 355 360 365 Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Pro His Ala Arg Ile Lys Leu Glu Asn 370 375 380 Pro Leu Asp Tyr Gly Ser Ala Trp Ala Ala Ala Ala Ala Gln Cys Arg 385 390 395 400 Tyr Gly Asp Leu Ala Ser Leu His Gly Ala Gly Ala Ala Gly Pro Gly 405 410 415 Ser Gly Ser Pro Ser Ala Ala Ala Ser Ser Ser Trp His Thr Leu Phe 420 425 430 Thr Ala Glu Glu Gly Gln Leu Tyr Gly Pro Cys Gly Gly Gly Gly Gly 435 440 445 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Ala Gly Ala Val 450 455 460 Ala Pro Tyr Gly Tyr Thr Arg Pro Pro Gln Gly Leu Ala Gly Gln Glu 465 470 475 480 Ser Asp Phe Thr Ala Pro Asp Val Trp Tyr Pro Gly Gly Met Val Ser 485 490 495 Arg Val Pro Tyr Pro Ser Pro Thr Cys Val Lys Ser Glu Met Gly Pro 500 505 510 Trp Met Asp Ser Tyr Ser Gly Pro Tyr Gly Asp Met Arg Leu Glu Thr 515 520 525 Ala Arg Asp His Val Leu Pro Ile Asp Tyr Tyr Phe Pro Pro Gln Lys 530 535 540 Thr Cys Leu Ile Cys Gly Asp Glu Ala Ser Gly Cys His Tyr Gly Ala 545 550 555 560 Leu Thr Cys Gly Ser Cys Lys Val Phe Phe Lys Arg Ala Ala Glu Gly 565 570 575 Lys Gln Lys Tyr Leu Cys Ala Ser Arg Asn Asp Cys Thr Ile Asp Lys 580 585 590 Phe Arg Arg Lys Asn Cys Pro Ser Cys Arg Leu Arg Lys Cys Tyr Glu 595 600 605 Ala Gly Met Thr Leu Gly Ala Arg Lys Leu Lys Lys Leu Gly Asn Leu 610 615 620 Lys Leu Gln Glu Glu Gly Glu Ala Ser Ser Thr Thr Ser Pro Thr Glu 625 630 635 640 Glu Thr Thr Gln Lys Leu Thr Val Ser His Ile Glu Gly Tyr Glu Cys 645 650 655 Gln Pro Ile Phe Leu Asn Val Leu Glu Ala Ile Glu Pro Gly Val Val 660 665 670 Cys Ala Gly His Asp Asn Asn Gln Pro Asp Ser Phe Ala Ala Leu Leu 675 680 685 Ser Ser Leu Asn Glu Leu Gly Glu Arg Gln Leu Val His Val Val Lys 690 695 700 Trp Ala Lys Ala Leu Pro Gly Leu Arg Asn Leu His Val Asp Asp Gln 705 710 715 720 Met Ala Val Ile Gln Tyr Ser Trp Met Gly Leu Met Val Phe Ala Met 725 730 735 Gly Trp Arg Ser Phe Thr Asn Val Asn Ser Arg Met Leu Tyr Phe Ala 740 745 750 Pro Asp Leu Val Phe Asn Glu Tyr Arg Met His Lys Ser Arg Met Tyr 755 760 765 Ser Gln Cys Val Arg Met Arg His Leu Ser Gln Glu Phe Gly Trp Leu 770 775 780 Gln Ile Thr Pro Gln Glu Phe Leu Cys Met Lys Ala Met Leu Leu Phe 785 790 795 800 Ser Ile Ile Pro Val Asp Gly Leu Lys Asn Gln Lys Phe Phe Asp Glu 805 810 815 Leu Arg Met Asn Tyr Ile Lys Glu Leu Asp Arg Ile Ile Ala Cys Lys 820 825 830 Arg Lys Asn Pro Thr Ser Cys Ser Arg Arg Phe Tyr Gln Leu Thr Lys 835 840 845 Leu Leu Asp Ser Val Gln Pro Ile Ala Arg Glu Leu His Gln Phe Thr 850 855 860 Phe Asp Leu Leu Ile Lys Ser His Met Val Ser Val Asp Phe Pro Glu 865 870 875 880 Met Met Ala Glu Ile Ile Ser Val Gln Val Pro Lys Ile Leu Ser Gly 885 890 895 Lys Val Lys Pro Ile Tyr Phe His Thr Gln 900 905 <210> 4 <211> 3641 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 gacactgaat ttggaaggtg gaggattttg tttttttctt ttaagatctg ggcatctttt 60 gaatctaccc ttcaagtatt aagagacaga ctgtgagcct agcagggcag atcttgtcca 120 ccgtgtgtct tcttctgcac gagactttga ggctgtcaga gcgctttttg cgtggttgct 180 cccgcaagtt tccttctctg gagcttcccg caggtgggca gctagctgca gcgactaccg 240 catcatcaca gcctgttgaa ctcttctgag caagagaagg ggaggcgggg taagggaagt 300 aggtggaaga ttcagccaag ctcaaggatg gaagtgcagt tagggctggg aagggtctac 360 cctcggccgc cgtccaagac ctaccgagga gctttccaga atctgttcca gagcgtgcgc 420 gaagtgatcc agaacccggg ccccaggcac ccagaggccg cgagcgcagc acctcccggc 480 gccagtttgc tgctgcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 540 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc aagagactag ccccaggcag 600 cagcagcagc agcagggtga ggatggttct ccccaagccc atcgtagagg ccccacaggc 660 tacctggtcc tggatgagga acagcaacct tcacagccgc agtcggccct ggagtgccac 720 cccgagagag gttgcgtccc agagcctgga gccgccgtgg ccgccagcaa ggggctgccg 780 cagcagctgc cagcacctcc ggacgaggat gactcagctg ccccatccac gttgtccctg 840 ctgggcccca ctttccccgg cttaagcagc tgctccgctg accttaaaga catcctgagc 900 gaggccagca ccatgcaact ccttcagcaa cagcagcagg aagcagtatc cgaaggcagc 960 agcagcggga gagcgaggga ggcctcgggg gctcccactt cctccaagga caattactta 1020 gggggcactt cgaccatttc tgacaacgcc aaggagttgt gtaaggcagt gtcggtgtcc 1080 atgggcctgg gtgtggaggc gttggagcat ctgagtccag gggaacagct tcggggggat 1140 tgcatgtacg ccccactttt gggagttcca cccgctgtgc gtcccactcc ttgtgcccca 1200 ttggccgaat gcaaaggttc tctgctagac gacagcgcag gcaagagcac tgaagatact 1260 gctgagtatt cccctttcaa gggaggttac accaaagggc tagaaggcga gagcctaggc 1320 tgctctggca gcgctgcagc agggagctcc gggacacttg aactgccgtc taccctgtct 1380 ctctacaagt ccggagcact ggacgaggca gctgcgtacc agagtcgcga ctactacaac 1440 tttccactgg ctctggccgg accgccgccc cctccgccgc ctccccatcc ccacgctcgc 1500 atcaagctgg agaacccgct ggactacggc agcgcctggg cggctgcggc ggcgcagtgc 1560 cgctatgggg acctggcgag cctgcatggc gcgggtgcag cgggacccgg ttctgggtca 1620 ccctcagccg ccgcttcctc atcctggcac actctcttca cagccgaaga aggccagttg 1680 tatggaccgt gtggtggtgg tgggggtggt ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc 1740 ggcggcggcg aggcgggagc tgtagccccc tacggctaca ctcggccccc tcaggggctg 1800 gcgggccagg aaagcgactt caccgcacct gatgtgtggt accctggcgg catggtgagc 1860 agagtgccct atcccagtcc cacttgtgtc aaaagcgaaa tgggcccctg gatggatagc 1920 tactccggac cttacgggga catgcgtttg gagactgcca gggaccatgt tttgcccatt 1980 gactattact ttccacccca gaagacctgc ctgatctgtg gagatgaagc ttctgggtgt 2040 cactatggag ctctcacatg tggaagctgc aaggtcttct tcaaaagagc cgctgaaggg 2100 aaacagaagt acctgtgcgc cagcagaaat gattgcacta ttgataaatt ccgaaggaaa 2160 aattgtccat cttgtcgtct tcggaaatgt tatgaagcag ggatgactct gggagaaaaa 2220 ttccgggttg gcaattgcaa gcatctcaaa atgaccagac cctgaagaaa ggctgacttg 2280 cctcattcaa aatgagggct ctagagggct ctagtggata gtctggagaa acctggcgtc 2340 tgaggcttag gagcttaggt ttttgctcct caacacagac tttgacgttg gggttggggg 2400 ctactctctt gattgctgac tccctccagc gggaccaata gtgttttcct acctcacagg 2460 gatgttgtga ggacgggctg tagaagtaat agtggttacc actcatgtag ttgtgagtat 2520 catgattatt gtttcctgta atgtggcttg gcattggcaa agtgcttttt gattgttctt 2580 gatcacatat gatgggggcc aggcactgac tcaggcggat gcagtgaagc tctggctcag 2640 tcgcttgctt ttcgtggtgt gctgccagga agaaactttg ctgatgggac tcaaggtgtc 2700 accttggaca agaagcaact gtgtctgtct gaggttcctg tggccatctt tatttgtgta 2760 ttaggcaatt cgtatttccc ccttaggttc tagccttctg gatcccagcc agtgacctag 2820 atcttagcct caggccctgt cactgagctg aaggtagtag ctgatccaca gaagttcagt 2880 aaacaaggac cagatttctg cttctccagg agaagaagcc agccaacccc tctcttcaaa 2940 cacactgaga gactacagtc cgactttccc tcttacatct agccttactg tagccacact 3000 ccttgattgc tctctcacat cacatgcttc tcttcatcag ttgtaagcct ctcattcttc 3060 tcccaagcca gactcaaata ttgtattgat gtcaaagaag aatcacttag agtttggaat 3120 atcttgttct ctctctgctc catagcttcc atattgacac cagtttcttt ctagtggaga 3180 agtggagtct gtgaagccag ggaaacacac atgtgagagt cagaaggact ctccctgact 3240 tgcctggggc ctgtctttcc caccttctcc agtctgtcta aacacacaca cacacacaca 3300 cacacacaca cacacacaca cacacgctct ctctctctct ccccccccaa cacacacaca 3360 ctctctctct cacacacaca cacatacaca cacacttctt tctctttccc ctgactcagc 3420 aacattctgg agaaaagcca aggaaggact tcaggagggg agtttccccc ttctcagggc 3480 agaattttaa tctccagacc aacaagaagt tccctaatgt ggattgaaag gctaatgagg 3540 tttattttta actactttct atttgtttga atgttgcata tttctactag tgaaattttc 3600 ccttaataaa gccattaata cacccaaaaa aaaaaaaaaa a 3641 <210> 5 <211> 3641 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 gacactgaat ttggaaggtg gaggattttg tttttttctt ttaagatctg ggcatctttt 60 gaatctaccc ttcaagtatt aagagacaga ctgtgagcct agcagggcag atcttgtcca 120 ccgtgtgtct tcttctgcac gagactttga ggctgtcaga gcgctttttg cgtggttgct 180 cccgcaagtt tccttctctg gagcttcccg caggtgggca gctagctgca gcgactaccg 240 catcatcaca gcctgttgaa ctcttctgag caagagaagg ggaggcgggg taagggaagt 300 aggtggaaga ttcagccaag ctcaaggatg gaagtgcagt tagggctggg aagggtctac 360 cctcggccgc cgtccaagac ctaccgagga gctttccaga atctgttcca gagcgtgcgc 420 gaagtgatcc agaacccggg ccccaggcac ccagaggccg cgagcgcagc acctcccggc 480 gccagtttgc tgctgcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 540 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc aagagactag ccccaggcag 600 cagcagcagc agcagggtga ggatggttct ccccaagccc atcgtagagg ccccacaggc 660 tacctggtcc tggatgagga acagcaacct tcacagccgc agtcggccct ggagtgccac 720 cccgagagag gttgcgtccc agagcctgga gccgccgtgg ccgccagcaa ggggctgccg 780 cagcagctgc cagcacctcc ggacgaggat gactcagctg ccccatccac gttgtccctg 840 ctgggcccca ctttccccgg cttaagcagc tgctccgctg accttaaaga catcctgagc 900 gaggccagca ccatgcaact ccttcagcaa cagcagcagg aagcagtatc cgaaggcagc 960 agcagcggga gagcgaggga ggcctcgggg gctcccactt cctccaagga caattactta 1020 gggggcactt cgaccatttc tgacaacgcc aaggagttgt gtaaggcagt gtcggtgtcc 1080 atgggcctgg gtgtggaggc gttggagcat ctgagtccag gggaacagct tcggggggat 1140 tgcatgtacg ccccactttt gggagttcca cccgctgtgc gtcccactcc ttgtgcccca 1200 ttggccgaat gcaaaggttc tctgctagac gacagcgcag gcaagagcac tgaagatact 1260 gctgagtatt cccctttcaa gggaggttac accaaagggc tagaaggcga gagcctaggc 1320 tgctctggca gcgctgcagc agggagctcc gggacacttg aactgccgtc taccctgtct 1380 ctctacaagt ccggagcact ggacgaggca gctgcgtacc agagtcgcga ctactacaac 1440 tttccactgg ctctggccgg accgccgccc cctccgccgc ctccccatcc ccacgctcgc 1500 atcaagctgg agaacccgct ggactacggc agcgcctggg cggctgcggc ggcgcagtgc 1560 cgctatgggg acctggcgag cctgcatggc gcgggtgcag cgggacccgg ttctgggtca 1620 ccctcagccg ccgcttcctc atcctggcac actctcttca cagccgaaga aggccagttg 1680 tatggaccgt gtggtggtgg tgggggtggt ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc 1740 ggcggcggcg aggcgggagc tgtagccccc tacggctaca ctcggccccc tcaggggctg 1800 gcgggccagg aaagcgactt caccgcacct gatgtgtggt accctggcgg catggtgagc 1860 agagtgccct atcccagtcc cacttgtgtc aaaagcgaaa tgggcccctg gatggatagc 1920 tactccggac cttacgggga catgcgtttg gagactgcca gggaccatgt tttgcccatt 1980 gactattact ttccacccca gaagacctgc ctgatctgtg gagatgaagc ttctgggtgt 2040 cactatggag ctctcacatg tggaagctgc aaggtcttct tcaaaagagc cgctgaaggg 2100 aaacagaagt acctgtgcgc cagcagaaat gattgcacta ttgataaatt ccgaaggaaa 2160 aattgtccat cttgtcgtct tcggaaatgt tatgaagcag ggatgactct gggagaaaaa 2220 ttccgggttg gcaattgcaa gcatctcaaa atgaccagac cctgaagaaa ggctgacttg 2280 cctcattcaa aatgagggct ctagagggct ctagtggata gtctggagaa acctggcgtc 2340 tgaggcttag gagcttaggt ttttgctcct caacacagac tttgacgttg gggttggggg 2400 ctactctctt gattgctgac tccctccagc gggaccaata gtgttttcct acctcacagg 2460 gatgttgtga ggacgggctg tagaagtaat agtggttacc actcatgtag ttgtgagtat 2520 catgattatt gtttcctgta atgtggcttg gcattggcaa agtgcttttt gattgttctt 2580 gatcacatat gatgggggcc aggcactgac tcaggcggat gcagtgaagc tctggctcag 2640 tcgcttgctt ttcgtggtgt gctgccagga agaaactttg ctgatgggac tcaaggtgtc 2700 accttggaca agaagcaact gtgtctgtct gaggttcctg tggccatctt tatttgtgta 2760 ttaggcaatt cgtatttccc ccttaggttc tagccttctg gatcccagcc agtgacctag 2820 atcttagcct caggccctgt cactgagctg aaggtagtag ctgatccaca gaagttcagt 2880 aaacaaggac cagatttctg cttctccagg agaagaagcc agccaacccc tctcttcaaa 2940 cacactgaga gactacagtc cgactttccc tcttacatct agccttactg tagccacact 3000 ccttgattgc tctctcacat cacatgcttc tcttcatcag ttgtaagcct ctcattcttc 3060 tcccaagcca gactcaaata ttgtattgat gtcaaagaag aatcacttag agtttggaat 3120 atcttgttct ctctctgctc catagcttcc atattgacac cagtttcttt ctagtggaga 3180 agtggagtct gtgaagccag ggaaacacac atgtgagagt cagaaggact ctccctgact 3240 tgcctggggc ctgtctttcc caccttctcc agtctgtcta aacacacaca cacacacaca 3300 cacacacaca cacacacaca cacacgctct ctctctctct ccccccccaa cacacacaca 3360 ctctctctct cacacacaca cacatacaca cacacttctt tctctttccc ctgactcagc 3420 aacattctgg agaaaagcca aggaaggact tcaggagggg agtttccccc ttctcagggc 3480 agaattttaa tctccagacc aacaagaagt tccctaatgt ggattgaaag gctaatgagg 3540 tttattttta actactttct atttgtttga atgttgcata tttctactag tgaaattttc 3600 ccttaataaa gccattaata cacccaaaaa aaaaaaaaaa a 3641 <210> 6 <211> 645 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Glu Val Gln Leu Gly Leu Gly Arg Val Tyr Pro Arg Pro Pro Ser 1 5 10 15 Lys Thr Tyr Arg Gly Ala Phe Gln Asn Leu Phe Gln Ser Val Arg Glu 20 25 30 Val Ile Gln Asn Pro Gly Pro Arg His Pro Glu Ala Ala Ser Ala Ala 35 40 45 Pro Pro Gly Ala Ser Leu Leu Leu Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln 50 55 60 Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln 65 70 75 80 Gln Gln Gln Gln Gln Glu Thr Ser Pro Arg Gln Gln Gln Gln Gln Gln 85 90 95 Gly Glu Asp Gly Ser Pro Gln Ala His Arg Arg Gly Pro Thr Gly Tyr 100 105 110 Leu Val Leu Asp Glu Glu Gln Gln Pro Ser Gln Pro Gln Ser Ala Leu 115 120 125 Glu Cys His Pro Glu Arg Gly Cys Val Pro Glu Pro Gly Ala Ala Val 130 135 140 Ala Ala Ser Lys Gly Leu Pro Gln Gln Leu Pro Ala Pro Pro Asp Glu 145 150 155 160 Asp Asp Ser Ala Ala Pro Ser Thr Leu Ser Leu Leu Gly Pro Thr Phe 165 170 175 Pro Gly Leu Ser Ser Cys Ser Ala Asp Leu Lys Asp Ile Leu Ser Glu 180 185 190 Ala Ser Thr Met Gln Leu Leu Gln Gln Gln Gln Gln Glu Ala Val Ser 195 200 205 Glu Gly Ser Ser Ser Gly Arg Ala Arg Glu Ala Ser Gly Ala Pro Thr 210 215 220 Ser Ser Lys Asp Asn Tyr Leu Gly Gly Thr Ser Thr Ile Ser Asp Asn 225 230 235 240 Ala Lys Glu Leu Cys Lys Ala Val Ser Val Ser Met Gly Leu Gly Val 245 250 255 Glu Ala Leu Glu His Leu Ser Pro Gly Glu Gln Leu Arg Gly Asp Cys 260 265 270 Met Tyr Ala Pro Leu Leu Gly Val Pro Pro Ala Val Arg Pro Thr Pro 275 280 285 Cys Ala Pro Leu Ala Glu Cys Lys Gly Ser Leu Leu Asp Asp Ser Ala 290 295 300 Gly Lys Ser Thr Glu Asp Thr Ala Glu Tyr Ser Pro Phe Lys Gly Gly 305 310 315 320 Tyr Thr Lys Gly Leu Glu Gly Glu Ser Leu Gly Cys Ser Gly Ser Ala 325 330 335 Ala Ala Gly Ser Ser Gly Thr Leu Glu Leu Pro Ser Thr Leu Ser Leu 340 345 350 Tyr Lys Ser Gly Ala Leu Asp Glu Ala Ala Ala Tyr Gln Ser Arg Asp 355 360 365 Tyr Tyr Asn Phe Pro Leu Ala Leu Ala Gly Pro Pro Pro Pro Pro Pro 370 375 380 Pro Pro His Pro His Ala Arg Ile Lys Leu Glu Asn Pro Leu Asp Tyr 385 390 395 400 Gly Ser Ala Trp Ala Ala Ala Ala Ala Gln Cys Arg Tyr Gly Asp Leu 405 410 415 Ala Ser Leu His Gly Ala Gly Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly Ser Pro 420 425 430 Ser Ala Ala Ala Ser Ser Ser Trp His Thr Leu Phe Thr Ala Glu Glu 435 440 445 Gly Gln Leu Tyr Gly Pro Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 450 455 460 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Ala Gly Ala Val Ala 465 470 475 480 Pro Tyr Gly Tyr Thr Arg Pro Pro Gln Gly Leu Ala Gly Gln Glu Ser 485 490 495 Asp Phe Thr Ala Pro Asp Val Trp Tyr Pro Gly Gly Met Val Ser Arg 500 505 510 Val Pro Tyr Pro Ser Pro Thr Cys Val Lys Ser Glu Met Gly Pro Trp 515 520 525 Met Asp Ser Tyr Ser Gly Pro Tyr Gly Asp Met Arg Leu Glu Thr Ala 530 535 540 Arg Asp His Val Leu Pro Ile Asp Tyr Tyr Phe Pro Pro Gln Lys Thr 545 550 555 560 Cys Leu Ile Cys Gly Asp Glu Ala Ser Gly Cys His Tyr Gly Ala Leu 565 570 575 Thr Cys Gly Ser Cys Lys Val Phe Phe Lys Arg Ala Ala Glu Gly Lys 580 585 590 Gln Lys Tyr Leu Cys Ala Ser Arg Asn Asp Cys Thr Ile Asp Lys Phe 595 600 605 Arg Arg Lys Asn Cys Pro Ser Cys Arg Leu Arg Lys Cys Tyr Glu Ala 610 615 620 Gly Met Thr Leu Gly Glu Lys Phe Arg Val Gly Asn Cys Lys His Leu 625 630 635 640 Lys Met Thr Arg Pro 645

Claims (12)

1. 개체의 소변으로부터 나노 소포체를 단리하는 단계;
   상기 나노 소포체로부터 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 추출하는 단계; 및
   AR-FL(androgen receptor full-length), AR-V7(androgen receptor splice variant 7) 또는 이의 조합을 검출하는 단계를 포함하는, 상기 개체의 전립선암 발병 여부를 확인하기 위한 정보를 제공하는 방법.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 AR-FL은 서열번호 1 또는 2의 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 3의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이고, AR-V7은 서열번호 4 또는 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 6의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 전립선암은 거세저항성 전립선암 (castration-resistant prostate cancer; CRPC)이거나 또는 CRPC로 진행될 가능성이 있는 것인 방법.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 전립선암은 호르몬 치료에 내성을 갖거나 갖게 될 가능성이 있는 것인 방법.
5. 청구항 1에 있어서, 상기 방법은 GAPDH, ACTB, CD9, CD63, CD81, FLOT, Annexin, Alix, TSG101, Integrin β1, 또는 이들의 조합을 검출하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
6. 청구항 1에 있어서, 상기 방법은 MUC1/2, c-kit, EGFR, TWIST-1, ER, FAM3C, TERT, FCGR3A/3B, TMPRSS2:ERG fusion, nanog, p53, CD24, CCNB1, CD44, CCND1, CD40L, CD34, FOXA1, FGFR1, TGFβ1, CD133, uPA, PSA, PSMA, KLK2, FAM3C, UAP1, Axl, CD274, PDCD1, CDH1/2, PCA3, EpCAM, TMPR, CD151, PTEN, PD1, PD-L1, 또는 이들의 조합을 검출하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
7. 청구항 1에 있어서, 상기 검출은 RT-PCR(Real time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay: RPA), 중합효소증폭법 (Recombinase polymerase amplification: RPA), ddPCR(droplet digital PCR), 노던 블롯팅, 시퀀싱 (sequencing) 및 DNA 칩으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의한 것인 방법.
8. 청구항 1에 있어서, 상기 방법은 AR-FL 및 AR-V7의 발현량을 정량하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
9. 청구항 8에 있어서, 상기 방법은 AR-FL 발현량 대비 AR-V7 발현량을 산출하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
10. 청구항 1에 있어서, 상기 개체는 인간인 것인 방법.
11. 개체의 소변으로부터 단리된 나노 소포체로부터 AR-FL, AR-V7 또는 이의 조합을 검출하기 위한 시약을 포함하는, 상기 개체의 전립선암 발병 여부를 확인하기 위한 키트.
12. 청구항 11에 있어서, 상기 개체는 인간인 것인 키트.

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