CN110904214A

CN110904214A - 用于诊断或辅助诊断肾功能不全或肾损伤的诊断剂、试剂盒和应用

Info

Publication number: CN110904214A
Application number: CN201911285141.1A
Authority: CN
Inventors: 李怡
Original assignee: Sichuan Provincial Peoples Hospital
Current assignee: Sichuan Provincial Peoples Hospital
Priority date: 2019-12-13
Filing date: 2019-12-13
Publication date: 2020-03-24
Anticipated expiration: 2039-12-13
Also published as: CN110904214B; CN112592974A

Abstract

本发明公开了用于诊断或辅助诊断肾功能不全或肾损伤的诊断剂、试剂盒和应用，涉及肾功能不全或肾损伤诊断技术领域。本发明公开的诊断剂包括用于检测RPS7基因和/或SRP14基因表达水平的检测试剂。本发明的研究发现RPS7基因和SRP14基因在肾功能不全或肾损伤群体中具有高表达的特点，可以作为肾功能不全或肾损伤诊断或辅助诊断的标志物，为肾功能不全或肾损伤诊断或辅助诊断提供了一种新的思路和方法。

Description

用于诊断或辅助诊断肾功能不全或肾损伤的诊断剂、试剂盒和应用

技术领域

本发明涉及肾功能不全或肾损伤诊断技术领域，具体而言，涉及一种用于诊断或辅助诊断肾功能不全或肾损伤的诊断剂、试剂盒和应用。

背景技术

肾功能不全或肾损伤(acute kidney injury，AKI)极易进展为慢性肾脏病(chronic kidney diseases，CKD)及终末期肾病(end stage renal diseases，ESRD)，死亡率高达50％。近年来该病发病率和病死率不断提高，给家庭和社会造成巨大伤害。肾脏缺血再灌注损伤(renal ischemia reperfusion injury，肾IRI)是导致AKI的重要原因，也是肾移植术后影响移植肾早期功能恢复及长期存活的主要因素之一。肾脏由于其组织结构和功能的特殊性，是对缺血再灌注损伤敏感的器官之一。尽管肾IRI是AKI病人致病致死的重要诱因，但其具体致病机理尚不清楚，缺乏有效的药物治疗。故研究肾IRI的发病机制及寻找其可能的干预措施具有重要的临床意义。目前，对于肾IRI发病机制的研究多聚焦于再灌注损伤后的效应阶段，而对启动机制研究尚少，因此，深入探讨肾IRI发病的始动机制，寻求新的早期诊断或治疗干预靶点是研究肾IRI亟待解决的问题，也是早期治疗AKI延缓CKD发生发展的前提和关键所在。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供用于一种用于诊断或辅助诊断肾功能不全或肾损伤的诊断剂、试剂盒和应用。本发明发现RPS7基因和SRP14基因在肾功能不全或肾损伤群体中具有高表达的特点，基于此，RPS7基因和SRP14基因可以作为肾功能不全或肾损伤诊断或辅助诊断的标志物，为肾功能不全或肾损伤诊断或辅助诊断提供了一种新的思路和方法。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明实施例提供一种用于诊断或辅助诊断肾功能不全或肾损伤的诊断剂，所述诊断剂包括用于检测RPS7基因和/或SRP14基因表达水平的检测试剂。

本发明实施例首次发现并揭示了一种新的可用于肾功能不全或肾损伤诊断的标志物，其是RPS7基因(ribosomal protein S7，Gene ID:6201)和SRP14基因(signalrecognition particle 14，Gene ID:6727)，通过检测这两个基因或其中一种基因的表达水平，再根据表达水平可以对肾功能不全或肾损伤作出有效诊断或辅助诊断。

基于本发明实施例的研究内容，可以认为用于检测RPS7基因和/或SRP14基因表达水平的检测试剂可以作为诊断肾功能不全或肾损伤的诊断剂。基于此，本发明提供了一种新的肾功能不全或肾损伤的诊断剂，其包括用于检测RPS7基因和/或SRP14基因表达水平的检测试剂，该诊断剂检测RPS7基因或SRP14基因作为标志物，可以对肾功能不全或肾损伤进行有效的诊断。

在可选的实施方式中，所述表达水平是指RNA转录水平或蛋白表达水平。

基于本发明揭示的内容，本领域技术人员容易想到通过RNA转录水平或蛋白表达水平来检测RPS7基因和/或SRP14基因的表达，以对肾功能不全或肾损伤进行诊断。

在可选的实施方式中，当所述表达水平是指RNA转录水平时，所述检测试剂包括引物。

基于本发明揭示的内容，本领域技术人员容易设计出合适的引物在RNA水平上检测RPS7基因或SRP14基因的RNA转录水平，无论引物序列如何，只要是用于检测RPS7基因或SRP14基因的RNA转录水平以对肾功能不全或肾损伤进行诊断，即属于本发明的保护范围。

在可选的实施方式中，引物包括SEQ ID NO.1-2所示的第1引物对和/或SEQ IDNO.3-4所示的第2引物对。

第1引物对用于检测SRP14基因的RNA转录水平，第2引物对用于检测RPS7基因的RNA转录水平。

在可选的实施方式中，当所述表达水平是指蛋白表达水平时，所述检测试剂包括抗体。

基于本发明揭示的内容，本领域技术人员容易想到使用合适的抗体，在蛋白水平上检测RPS7蛋白或SRP14蛋白的表示水平，无论选用的抗体序列如何，只要是在蛋白水平上，检测RPS7蛋白或SRP14蛋白的表达水平以对肾功能不全或肾损伤进行诊断，即属于本发明的保护范围。

在可选的实施方式中，所述检测试剂包括抗SRP14蛋白抗体或抗RPS7蛋白抗体，所述检测试剂适用于通过ELISA法检测SRP14蛋白或RPS7蛋白的表达水平。

基于本发明揭示的内容，本领域技术人员容易想到使用抗SRP14蛋白抗体或抗RPS7蛋白抗体，基于合适的抗原/抗体结合的原理实现对SRP14蛋白或RPS7蛋白的表达水平的检测，例如包括但不限于ELISA法。因此，无论其所用试剂适用于何种方法检测SRP14蛋白或RPS7蛋白的表达水平，只要是检测SRP14蛋白或RPS7蛋白的表达水平以对肾功能不全或肾损伤进行诊断，即属于本发明的保护范围。

在可选的实施方式中，肾功能不全或肾损伤包括急性肾损伤、慢性肾脏病和其他肾脏损害等相关疾病，其都可以通过检测RPS7基因和/或SRP14基因的表达水平作为进行诊断或辅助诊断。

第二方面，本发明实施例提供一种用于诊断或辅助诊断肾功能不全或肾损伤的试剂盒，其含有前述实施方式任一项所述的诊断剂。

第三方面，本发明实施例提供目标基因表达水平的检测试剂在制备用于诊断或辅助诊断肾功能不全或肾损伤的诊断剂或试剂盒中的应用，目标基因包括RPS7基因和/或SRP14基因。

本发明实施例发现RPS7基因和SRP14基因在肾功能不全或肾损伤群体中具有高表达的特点，基于此，提出RPS7基因和SRP14基因作为一种新的标志物，用于到肾功能不全或肾损伤诊断或辅助诊断领域，为肾功能不全或肾损伤诊断或辅助诊断提供了一种新的思路和方法。

基于此，检测RPS7基因或SRP14基因表达水平的试剂具有了一种新的用途，即可以制备成用于诊断或辅助诊断肾功能不全或肾损伤的诊断剂或试剂盒，为肾功能不全或肾损伤诊断或辅助诊断提供了新的选择。

在可选的实施方式中，所述表达水平为RNA转录水平或蛋白表达水平。

在可选的实施方式中，当所述表达水平是指RNA转录水平时，所述检测试剂包括引物；当所述表达水平是指蛋白表达水平时，所述检测试剂包括抗体。

在可选的实施方式中，所述检测试剂包括抗SRP14蛋白抗或抗RPS7蛋白抗体，所述检测试剂适用于通过ELISA法检测SRP14蛋白或RPS7蛋白的表达水平。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1A：Label free所筛选出差异表达蛋白的聚类分析。

图1B：Label free筛选出28种蛋白显著上调表达和45种蛋白显著下调。

图1C：Label free所筛选出差异表达蛋白的火山图。

图1D：基于Label free所筛选出差异表达蛋白的PPI蛋白质相互作用分析；图中：“I”表示缺氧，“R”表示复氧。

图2：HE和PAS染色结果表明随着缺血时间的增加，C57小鼠肾脏肾小管的损伤越严重；图中：“I”表示缺血，“R”表示再灌注。

图3：免疫组化在小鼠IRI模型中验证出SRP14分子和RPS7随缺血时间的增加而表达显著上调；图中：“I”表示缺血，“R”表示再灌注。

图4：免疫组化结果表明在肾小管损伤的病人肾组织中SRP14的表达有显著增加(n＝5)。

图5：RPS7和SRP14在IRI以后小鼠肾组织中显著上调，图中：A.RT-PCR检测小鼠肾组织中RPS7的表达；B.RT-PCR检测小鼠肾组织中SRP14的表达；C.Western blot检测小鼠肾组织中RPS7和SRP14的表达；D.免疫组化检测小鼠肾组织中SRP14和RPS7的表达情况；图中：“Ctrl”表示假手术组；图中：“IRI”表示缺血45分钟再灌注24小时。

图6：采用ELISA检测不同分组人血清中SRP14的含量结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

蛋白质组学非标记定量技术(Label-free)是近年来重要的质谱定性定量方法，将提取的蛋白酶解之后，利用液质联用技术对肽段进行质谱分析，通过比较不同样品中相应肽段的信号强度，从而对肽段对应的蛋白质进行相对定量。

实验原理：每条肽段的丰度(量)与其在MS1中的峰面积或信号强度成正比；而不同样品的同一条肽段在LC上的保留时间(retention time，RT)是一致的，因此，可以通过对比MS图谱，再整合到相应蛋白，实现对蛋白质在不同样本中的相对表达水平的定量分析。

本实施例中，利用美国比卢普斯罗森堡(Bilupus)公司的MIC-101缺氧模块化孵化室系统在体外建立HK2人肾小管上皮细胞缺氧/复氧损伤(IRI)模型(I45min/R24h)，通过蛋白质组学非标记定量技术(Label free)对IRI早期肾小管上皮细胞进行差异蛋白质表达谱分析，结果见图1A-图1D，筛选出28种显著上调表达和45种识别表达的差异蛋白，其中核糖体蛋白质7(Ribosomal proteins 7，RPS7)RPS7和信号识别颗粒14(Signal recognitionparticle 14，SRP14)的表达显著上调，基于差异蛋白质表达谱分析结果的PPI分析预测在IRI早期肾小管上皮细胞内RPS7和SRP14之间存在分子间相互作用。

实施例2

HE和PAS染色检测肾脏损伤

IRI模型：C57小鼠经麻醉后，分离左肾肾蒂，用无损伤显微血管夹夹住左肾动静脉，阻断左肾血流，置于32摄氏度温箱中，左侧肾脏热缺血不同时间(0，15，30，45，60，120，240，360min)，然后松开左肾血管夹，恢复左肾血液灌注，在肾脏恢复血流灌注后24h处死小鼠，收集肾脏组织。

苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining，HE)染色法和过碘酸雪夫(PeriodicAcid-Schiff，PAS)染色，HE和PAS是常见的石蜡病理染色技术，常常用于肾脏病理中对肾脏病理性损伤的评价。

HE染色法原理：苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核酸着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。

PAS染色原理：过碘酸能使细胞内的多糖乙二醇基氧化成二醛，再与Schiff氏液的无色品红结合，红色，定位于胞浆上。

对收集的IRI模型肾脏组织HE和PAS染色的结果见图2，HE和PAS染色检测结果表明随着缺血时间的增加，C57小鼠肾脏肾小管的损伤越严重。

实施例3

免疫组化检测SRP14和RPS7的表达

IRI模型：C57小鼠经麻醉后，分离左肾肾蒂，用无损伤显微血管夹夹住左肾动静脉，阻断左肾血流，置于32摄氏度温箱中，左侧肾脏热缺血不同时间(0，15，30，45，60，120，240，360min)，然后松开左肾血管夹，恢复左肾血液灌注，在肾脏恢复血流灌注后24h处死小鼠，收集肾脏组织及血清。免疫组化检测小鼠石蜡包埋的肾脏组织切片中SRP14和RPS7的表达情况。免疫组化方法：根据抗原抗体反应和化学显色原理，小鼠肾组织切片中的抗原先和SRP14一抗或RPS7一抗结合，再利用一抗与标记生物素的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶(HRP)的抗生物素结合，最后通过呈色反应来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。

结果见图3，免疫组化在小鼠IRI模型中验证出SRP14分子和RPS7随缺血时间的增加而表达显著上调，随着缺血时间的增加小鼠肾小管中SRP14和RPS7的表达增加越多(见图3)。

实施例4

免疫组化检测人肾脏组织切片中SRP14的表达情况。

人肾脏组织切片来源:正常组选因外伤等因素造成肾脏切除病人的肾脏组织5例；MCD组和肾小管损伤组入选2018年11月-2019年11月期间在四川省人民医院住院的肾脏穿刺患者各5例，MCD指微小病变，肾小管损伤指肾小管坏死(ATN)，其病理判定指标均由肾脏专科的病理医师报告提示，入选患者并排除合并有影响肾功能的其他系统疾病。结果见图4，免疫组化结果表明在肾小管损伤的病人肾组织中SRP14的表达有显著增加(n＝5)。

实施例5

检测小鼠肾组织RPS7和SRP14的表达

IRI模型：C57小鼠经麻醉后，分离左肾肾蒂，用无损伤显微血管夹夹住左肾动静脉，阻断左肾血流，置于32摄氏度温箱中，左侧肾脏热缺血45min后松开左肾血管夹，恢复左肾血液灌注，在肾脏恢复血流灌注后24h处死小鼠，收集肾脏组织及血清。1.实时定量PCR检测小鼠肾组织中RPS7和SRP14的表达。

用Trizol试剂盒(#15596018，Invitrogen，Thermo Fisher Co，USA)提取小鼠肾组织的mRNA，再用两步法RT-PCR：先用逆转录试剂盒(#R037A，TAKARA，Japan)将提取出的小鼠肾组织mRNA逆转录成cDNA模板。再用PCR试剂盒(#820A，TAKARA，Japan)对目的基因进行扩增。

以下是引物序列信息：

SRP14基因：F:3’-CAGACATGCGAAAAGGGCTG-5’(SEQ ID NO.1)；

R:3’-ACCCACAGGCTTGCTATGAG-5’(SEQ ID NO.2)；

RPS7基因：F:3’-CCAAGCGAAATTGTGGGCAA-5’(SEQ ID NO.3)；

R:3’-CCTTGCCCGTGAGCTTGTA-5’(SEQ ID NO.4)；

内参基因GAPDH：F:5'-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3'(SEQ ID NO.5)；

R:5'-TAGGGCCTCTCTTGCTCAGT-3'(SEQ ID NO.6)。

两步法PCR扩增程序：

Step 1：95℃30秒；

Step 2：PCR反应；

GOTO：39(40 Cycles)；

95℃5秒；

60℃30秒；

Step 3：Melt Curve。

结果见图5中的A和B。

2.Western blot检测小鼠肾组织中RPS7和SRP14的表达

液氮研磨小鼠肾组织以后使用RIPA(#P0013B，碧云天生物技术公司，中国上海)裂解并提取小鼠肾组织总蛋白。通过蛋白质免疫印迹技术(Western blot)检测小鼠肾组织中RPS7和SRP14的表达情况。结果见图5中的C。

3.采用免疫组化检测小鼠肾组织中SRP14和RPS7的表达情况，结果见图5中的D。

图5结果显示，各中检测方法都显示，RPS7和SRP14在IRI以后小鼠肾组织中显著上调。由上述实施例的实验结果预示，RPS7和SRP14基因可以作为肾功能不全或肾损伤例如IRI的标志物，根据其表达水平可以诊断肾功能不全或肾损伤。

实施例6

SRP14基因在肾功能不全或肾损伤诊断中的具体应用

AKI组：入院后发生AKI的患者，纳入AKI组。

入组标准：有关AKI定义及分期均按照2012年改善全球肾脏病预后组织(KDIGO)指南上推荐的标准来定义。具体诊断标准如下(满足任意一条)：①48小时内血肌酐(Scr)增加≥0.3mg/dL(≥26.5μmol/L)；②Scr增加≥1.5倍基线值，这个基线值是已知或假定为发生在之前7天之内的；③尿量<0.5ml/kg/h达6小时。

AKI分期标准：

I期的定义：Scr升高至基础值的1.5-1.9倍或增加≥0.3mg/dL(≥26.5μmol/L)，尿量<0.5ml/kg/h达6小时。

II期的定义：Scr升高至基础值的2-2.9倍，尿量<0.5ml/kg/h达12小时。

III期的定义：Scr升高至基础值的3倍或增加≥4mg/dL(≥353.6μmol/L)或开始行肾脏替代治疗或<18岁的患者eGFR降至35ml.min.173m^-2，尿量<0.3ml/kg/h达24小时或无尿。

非AKI组：选取同时期内重症未合并AKI患者。

正常对照组：同时期内体检中心的健康志愿者，入住标准：血常规、肝肾功、尿常规正常，排除肾脏疾病患者。

慢性肾脏组：选择本中心慢性肾脏病II期且Scr≥100μmol/L的患者作为慢性肾脏病对照组。

对象及方法入选2016年11月-2017年11月期间在四川省人民医院住院的重症患者，收集入院后24小时内血清标本及48小时内尿液标本，分为AKI组和非AKI组。其中AKI组患者，血清共45例；慢性肾脏病组患者，血清共20例；非AKI组患者，血清16例；健康志愿者血清标本共22例为正常对照组。

结果见图6，ELISA((#ZC-54503，茁彩生物，中国上海)购于茁彩生物)检测人血清中SRP14的含量，分为四组，正常对照组22例平均含量是9.91±3.96pg/ml，而AKI组45例平均含量是18.79±12.46pg/ml，慢性肾脏病组20例平均含量是18.23±13.59pg/ml，非AKI组16例平均含量是13.28±12.26pg/ml。其中正常对照组与AKI组间p值是0.035有统计学意义，正常对照组与AKI组间p值是0.007有统计学意义。统计方法是单因素方差分析tamhane检验齐性。人血清SRP14 ELISA试剂盒(#ZC-54503，茁彩生物，中国上海)购于茁彩生物。

基于实施例的实验可以看出，当待测主体的血清中SRP14含量达18pg/ml或高于正常对照组血清含量9.91±3.96pg/ml时，预示待测主体患肾功能不全或肾损伤的风险较高。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川省人民医院

<120> 用于诊断或辅助诊断肾功能不全或肾损伤的诊断剂、试剂盒和应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cagacatgcg aaaagggctg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

acccacaggc ttgctatgag 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccaagcgaaa ttgtgggcaa 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

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<400> 4

ccttgcccgt gagcttgta 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggttgtctcc tgcgacttca 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tagggcctct cttgctcagt 20

Claims

1.一种用于诊断或辅助诊断肾功能不全或肾损伤的诊断剂，其特征在于，所述诊断剂包括用于检测RPS7基因和/或SRP14基因表达水平的检测试剂。

2.根据权利要求1所述的诊断剂，其特征在于，所述表达水平是指RNA转录水平或蛋白表达水平。

3.根据权利要求2所述的诊断剂，其特征在于，当所述表达水平是指RNA转录水平时，所述检测试剂包括引物。

4.根据权利要求2所述的诊断剂，其特征在于，当所述表达水平是指蛋白表达水平时，所述检测试剂包括抗体。

5.根据权利要求4所述的诊断剂，其特征在于，所述检测试剂包括抗SRP14蛋白抗体或抗RPS7蛋白抗体，所述检测试剂适用于通过ELISA法检测SRP14蛋白或RPS7蛋白的表达水平。

6.一种用于诊断或辅助诊断肾功能不全或肾损伤的试剂盒，其特征在于，其含有权利要求1-5任一项所述的诊断剂。

7.目标基因表达水平的检测试剂在制备用于诊断或辅助诊断肾功能不全或肾损伤的诊断剂或试剂盒中的应用，其特征在于，目标基因包括RPS7基因和/或SRP14基因。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述表达水平为RNA转录水平或蛋白表达水平。

9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，当所述表达水平是指RNA转录水平时，所述检测试剂包括引物；当所述表达水平是指蛋白表达水平时，所述检测试剂包括抗体。

10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述检测试剂包括抗SRP14蛋白抗体或抗RPS7蛋白抗体，所述检测试剂适用于通过ELISA法检测SRP14蛋白或RPS7蛋白的表达水平。