CN109468325A

CN109468325A - 影响prrsv复制和增殖的srp14基因及其应用

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Publication number: CN109468325A
Application number: CN201811583505.XA
Authority: CN
Inventors: 肖书奇; 李爽; 郑紫方; 张晓彬; 闫云欢
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2018-12-24
Filing date: 2018-12-24
Publication date: 2019-03-15

Abstract

本发明公开了一种能够影响PRRSV复制和增殖的SRP14基因，利用靶向猪SRP14的siRNA特异性敲低SRP14及腺病毒介导的特异性高表达SRP14，然后通过RT‑qPCR、TCID50和western blot检测SRP14对PRRSV感染宿主细胞的影响。特异性敲低猪SRP14具有抑制PRRSV复制和增殖的作用、腺病毒介导的特异性高表达SRP14具有增强PRRSV复制和增殖的作用，猪SRP14基因有望应用于研制预防或治疗猪蓝耳病的药物、疫苗及抗猪蓝耳病的基因修饰猪，为猪蓝耳病的有效防控提供新方法和全新视角。

Description

影响PRRSV复制和增殖的SRP14基因及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及影响PRRSV复制和增殖的SRP14基因及其应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是一种由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive andrespiratorysyndrome virus，PRRSV)引起的以母猪繁殖障碍和各年龄段特别是仔猪呼吸道症状为主要特征的猪重要病毒性传染病。该病于1987年首次爆发于美国，随后迅速蔓延并广泛流行。1991年和1992年分别在欧洲和美国分离到了PRRSV。

该病给全球养猪业造成了巨大的经济损失，仅美国养猪业每年因该病造成的经济损失就高达6.4亿美元。自1995年底在我国发现PRRS以来，该病蔓延至全国几乎所有省份，对中国猪业产生了严重影响。2006年主要由北美型高致病性PRRS病毒(HP-PRRSV)的变异株引起的高致病性PRRS给我国养猪业造成了几乎毁灭性的打击，仔猪发病率达100％，死亡率达50％以上；母猪流产率可达30％以上；育肥猪也可发病死亡，损失极为惨重，对我国养猪业造成的经济损失已远高于美国。该病严重影响了我国和全球养猪业的健康和稳定发展。由于PRRSV具有高度变异性、主要感染肺泡巨噬细胞、抗体依赖性增强作用和持续性感染等特征，且未完全清楚PRRSV的生物学特性及其感染和致病机制，至今仍无确实有效的防制措施。

信号识别颗粒(SRP)是细胞内一种高度保守的蛋白质靶向机器，SRP与其受体相互作用影响新生蛋白质的合成与其膜定位，这是一种非常保守和必须的细胞机制。蛋白质的正确定位对于维持正常细胞的秩序和结构是必需的。大约30％的蛋白质组最初被定位于真核内质网(ER)或细菌质膜，通常认为这些蛋白质中的大多数是通过SRP传送的。SRP提供蛋白质合成和易位之间的严格耦合，从而确保新生多肽不会在细胞质中折叠或错误折叠。SRP14和SRP9蛋白形成异源二聚体，阻止新生多肽链的延伸并调控细胞对于应激和病毒感染应答的翻译。但SRP14在PRRSV感染过程中的作用完全未知。

因此，提供一种能够影响PRRSV复制和增殖的SRP14基因是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种能够影响PRRSV复制和增殖的SRP14基因，为猪蓝耳病的有效防控提供新方法和全新视角。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

猪信号识别颗粒SRP14基因，其mRNA核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

猪信号识别颗粒SRP14基因，其CDS区核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示基因的第118～450位。

猪信号识别颗粒SRP14基因，其编码如SEQ ID NO.2所示的蛋白质。

一种靶向SRP14基因的siRNA，所述siRNA的核苷酸序列如下：

正义链：GAAGAAAUAUGAUGGUCGAdTdT(有意义链)；SEQ ID NO.3；

反义链：UCGACCAUCAUAUUUCUUCdTdT(无意义链)；SEQ ID NO.4。

进一步，所述siRNA在抑制SRP14基因表达中的应用。

进一步，所述siRNA在制备预防或治疗猪蓝耳病的药物或制剂中的应用。

进一步，SRP14基因在抑制PRRSV复制和增殖中的应用，特异性敲低

SRP14的siRNA转染PAMs细胞后，能够有效抑制SRP14的表达，从而抑制PRRSV在PAMs细胞中的复制和增殖。

进一步，含有猪SRP14基因的表达载体，其特征在于，所述表达载体选自腺病毒表达载体。

进一步，上述腺病毒表达载体，是将SEQ ID NO.1所示基因的第118～450位插入到穿梭载体pAdTrack-CMV的KpnⅠ和XholⅠ之间。

进一步，过表达猪SRP14在增强PRRSV在易感细胞MARC145中复制与增殖中的应用。

进一步，过表达猪SRP14在制备PRRSV疫苗中的应用。

进一步，对猪SRP14基因进行敲除或定点突变，在研制抗猪蓝耳病的基因修饰猪中的应用。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种能够影响PRRSV复制和增殖的SRP14基因，利用靶向猪SRP14的siRNA特异性敲低SRP14及腺病毒介导的特异性高表达SRP14，然后通过RT-qPCR、TCID50和westernblot检测SRP14对PRRSV感染宿主细胞的影响。特异性敲低猪SRP14具有抑制PRRSV复制和增殖的作用、腺病毒介导的特异性高表达SRP14具有增强PRRSV复制和增殖的作用，猪SRP14基因有望应用于研制预防或治疗猪蓝耳病的药物、疫苗及抗猪蓝耳病的基因修饰猪，为猪蓝耳病的有效防控提供新方法和全新视角。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明PAMs细胞中敲低SRP14抑制高致病性HP-PRRSV复制，PAMs中SRP14mRNA的相对表达量；

图2附图为本发明PAMs细胞中敲低SRP14抑制高致病性HP-PRRSV复制，PRRSV ORF7mRNA的相对表达量；

图3附图为本发明PAMs细胞中敲低SRP14抑制高致病性HP-PRRSV复制，PAMs培养上清液中PRRSV基因组拷贝数；

图4附图为本发明PAMs细胞中敲低SRP14抑制高致病性HP-PRRSV复制，细胞培养液上清中的病毒滴度；

图5附图为本发明PAMs细胞中敲低SRP14抑制高致病性HP-PRRSV复制，SRP14和PRRSVN蛋白的westernblot检测；

其中，SRP14-siRNA：(向细胞中转染特异性沉默SRP14的siRNA的实验组)；对照siRNA组：(向细胞中转染无关siRNA的实验组)；正常细胞对照：(向细胞中只加转染试剂而不加siRNA的实验组)；空白对照：(既不加转染试剂也不加siRNA的实验组)；

图6附图为本发明PAMs细胞中敲低SRP14抑制低致病性N-PRRSV复制，PAMs中SRP14mRNA的相对表达量；

图7附图为本发明PAMs细胞中敲低SRP14抑制低致病性N-PRRSV复制，PRRSV ORF7mRNA的相对表达量；

图8附图为本发明PAMs细胞中敲低SRP14抑制低致病性N-PRRSV复制，PAMs培养上清液中PRRSV基因组拷贝数；

图9附图为本发明PAMs细胞中敲低SRP14抑制低致病性N-PRRSV复制，细胞培养液上清中的病毒滴度；

图10附图为本发明在MARC-145细胞中高表达SRP14增强高致病性HP-PRRSV复制，SRP14腺病毒组感染的细胞中SRP14基因相对表达量；

图11附图为本发明在MARC-145细胞中高表达SRP14增强高致病性HP-PRRSV复制，SRP14腺病毒组细胞中PRRSV ORF7基因的相对表达量；

图12附图为本发明在MARC-145细胞中高表达SRP14增强高致病性HP-PRRSV复制，SRP14腺病毒组细胞上清中PRRSV的病毒拷贝数；

图13附图为本发明在MARC-145细胞中高表达SRP14增强高致病性HP-PRRSV复制，SRP14腺病毒组细胞培养液上清中的病毒滴度；

图14附图为本发明在MARC-145细胞中高表达SRP14增强低致病性N-PRRSV复制，SRP14腺病毒组感染的细胞中SRP14基因相对表达量；

图15附图为本发明在MARC-145细胞中高表达SRP14增强低致病性N-PRRSV复制，SRP14腺病毒组细胞中PRRSV ORF7基因的相对表达量；

图16附图为本发明在MARC-145细胞中高表达SRP14增强低致病性N-PRRSV复制，SRP14腺病毒组细胞上清中PRRSV的病毒拷贝数；

图17附图为本发明在MARC-145细胞中高表达SRP14增强低致病性N-PRRSV复制，SRP14腺病毒组细胞培养液上清中的病毒滴度。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

DMEM培养基、Opti-MEM培养基、RPMI-1640培养基以及siRNA转染试剂均购于LifeTech公司；胰蛋白酶和胎牛血清购于BI公司；siRNA及引物由上海Invitrogen公司合成；FastStart Universal SYBR Green Master试剂购于Roche公司；HS酶，RNA提取试剂(RNAiso Plus)，反转录试剂盒(PrimeScriptTM RT ReagentKit)购于Takara公司；PAMs细胞为(猪肺泡巨噬细胞)分离于6周仔猪的肺脏组织；MARC-145细胞(非洲绿猴肾细胞MA-104的衍生细胞系)，高致病性PRRSV毒株GD-HD(GenBank ID：KP793736.1)、低致病性PRRSV毒株CH1a(GenBank ID：AY032626.1)、腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV(购自NTCC)由西北农林科技大学兽医病原生物学实验室保存。

实施例1在PAMs细胞中敲低SRP14对高致病性HP-PRRSV复制的影响

(1)SRP14的siRNA转染及细胞接毒：

1)铺板：从6周龄的仔猪肺脏组织中分离猪肺泡巨噬细胞，并进行细胞计数与铺板，于37℃5％CO₂培养箱中培养；

2)转染：转染试剂为Life Tech公司的Lipofectamine RNAiMAX Reagent，按照转染试剂的操作步骤进行转染。铺板12h后配制转染混合液(SRP14的siRNA与LipofectamineRNAiMAX Reagent分别溶于Opti-MEM中，再将两者混合)室温孵育5min。将24孔板从温箱中取出，用PBS清洗后换成Opti-MEM，将混合物逐滴加入摇晃混匀，置于细胞培养箱中培养；

3)接毒：转染24h后接毒，以0.1MOI接种HP-PRRSV GD-HD毒株，根据公式PFU＝细胞个数×MOI＝0.7×TCID50计算所需的病毒液；将24孔板取出，用PBS清洗后，加入病毒稀释液，37℃培养1h后弃去所接病毒液，换为血清含量3％的1640培养基；

4)收样：感染后0h、12h、24h收取细胞样品以及细胞培养上清液，-80℃保存。细胞样品用于检测细胞中PRRSV ORF7基因的相对表达水平以及N蛋白的表达情况，细胞培养上清液用于检测释放到培养液上清中病毒基因组的拷贝数。

(2)RT-qPCR检测PAMs中的SRP14和PRRSV ORF7 mRNA相对表达水平：

1)提取细胞中的RNA并反转录为cDNA

使用Takara公司RNAiso Plus提取PAMs细胞的总RNA：

步骤为：细胞中加入TAKARA公司的RNAiso Plus，充分裂解；按照操作说明依次加入氯仿，异丙醇，离心后RNA沉于管底；加入75％乙醇清洗RNA，待沉淀干燥后，加入适量的RNase-free水进行溶解。

测定RNA浓度，纯度及完整性，在Biotek微孔定量仪上测定RNA浓度及纯度，其OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值在1.8-2.0之间，同时进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统观察所检测RNA的5S rRNA,18S rRNA和28S rRNA条带，显示三条带清晰完整。

使用Takara公司反转录试剂盒(PrimeScriptTM RT ReagentKit)对于所提取的RNA进行反转录。

反转录反应体系：为5×PrimeScriptBuffer，2μl；RT EnzymeMixI，0.5μl；Oligo dT Primer(50μM)，0.5μl；Random Primer(100μM)，0.5μl；Total RNA，500ng；RNase Free ddH₂O，补足10μl。

反转录的反应条件为：37℃，20min；85℃，5s；4℃。

2)进行qPCR检测，检测每个样品PAMs中的SRP14和PRRSV ORF7的mRNA表达量，内参都为HPRT-1基因，PCR反应体系(10μl)：2×SYBR Green Mix 5.0μl、ddH₂O 2.0μl、上游引物(12μM)0.25μl、下游引物(12μM)0.25μl、模板cDNA 2.5μl。

PCR反应程序为：95℃10min；95℃15s；60℃30s；95℃15s；40个循环。

用Real-Time PCR System仪器的StepOne Software v2.3软件进行结果的分析。

qPCR引物为：

SRP14-F：GGTTCTGTGGAGGGATTTGA；SEQ ID NO.5；

SRP14-R：CCTTTACTGTGCTGCTTTGC；SEQ ID NO.6；

PRRSV-ORF7-F：AGATCATCGCCCAACAAAAC；SEQ ID NO.7；

PRRSV-ORF7-R：GACACAATTGCCGCTCACTA；SEQ ID NO.8；

HPRT1-F：TGGAAAGAATGTCTTGATTGTTGAAG；SEQ ID NO.9；

HPRT1-R：ATCTTTGGATTATGCTGCTTGACC；SEQ ID NO.10。

PAMs中SRP14mRNA的相对表达量结果如图1所示，在PAMs中转染针对SRP14的siRNA后感染HP-PRRSV GD-HD毒株时，PAMs中SRP14 mRNA的相对表达量在0hpi、12hpi和24hpi时，与对照siRNA组相比分别降低了60％、70％和74％。

PRRSV ORF7 mRNA的相对表达量结果如图2所示，在PAMs中转染针对SRP14的siRNA后感染HP-PRRSV GD-HD毒株时，PRRSV ORF7 mRNA的相对表达量在12hpi和24hpi时，与对照siRNA组相比分别降低了82％和78％。

(3)RT-qPCR检测测定上清样品中PRRSV基因组拷贝数：

1)将步骤(1)中所收取的400ul的细胞培养上清液与400ul RNAiso Plus混合后进行裂解，提取RNA并溶于15μl的RNase-free水中；

2)配置反转录反应体系：为5×PrimeScript Buffer，2μl；RTEnzyme MixI，0.5μl；Oligo dT Primer(50μM)，0.5μl；Random Primer(100μM)，0.5μl；Total RNA，6.5μl。反转录的反应条件为：37℃，20min；85℃，5s；4℃；

3)制备阳性标准品(含有PRRSV ORF7基因片段的质粒标准品)并计算上清样品中PRRSV基因组拷贝数：将PRRSV ORF7完整CDS区域(372bp)克隆入pMD-18T载体，转化至trans5α感受态，提取质粒后测序鉴定。测定质粒DNA浓度，作为绝对定量的标准品，命名为pMD-18T-ORF7(初始浓度为5.5ng/μl)进行以10为倍数的梯度稀释，根据公式：拷贝数(copies)＝(质量/分子量)×6.0×1023，计算不同稀释度标准品的拷贝数，形成qPCR的标准曲线，用PRRSV-ORF7 qPCR引物进行检测，用Real time PCR分析仪分析数据，计算出每毫升细胞培养上清液中的PRRSV基因组拷贝数。

结果如图3所示，在PAMs中转染针对SRP14的siRNA后感染HP-PRRSV GD-HD毒株12hpi和24hpi时，PAMs培养上清液中PRRSV基因组拷贝数与对照siRNA组相比分别下降了61％和81％。

(4)TCID50测定上清样品中PRRS病毒的滴度：

1)铺板：将胰酶消化好的MARC-145细胞加入适量的含有10％FBS的DMEM培养基，调整密度为1×10⁵个/ml，加到96孔细胞培养板中，使细胞长成单层；

2)在灭菌EP管中用无血清的DMEM培养基将所收取含有病毒的细胞上清液进行连续10倍稀释，从10^-1～10^-10，每个稀释要充分混合均匀；

3)按稀释度从高到低依次接种到MARC-145细胞中，每一稀释度接种一纵排8孔，每孔接种100μl，取两纵排为正常细胞对照；

4)从第二天开始逐日进行观察并记录结果，一般观察5～7天；

5)参照Reed-Muench方法对于TCID50进行计算。

结果如图4所示，在PAMs中转染针对SRP14的siRNA后感染HP-PRRSV GD-HD毒株时，细胞培养液上清中的病毒滴度在12hpi和24hpi时分别下降了0.7-log和1.0-log(P<0.05)。

(5)westernblot检测PRRSVN蛋白的表达情况：

1)样品准备：将收取的细胞样品500×g离心10min，弃上清后用PBS(K+)重悬细胞沉淀，500×g离心10min后弃掉上清；用含有蛋白酶抑制剂的NP40裂解液裂解细胞，冰上充分裂解30min；4℃，12,000×g离心10min，将上清转移至新的离心管中并做好标记；依据北京博迈德基因技术有限公司的BCA蛋白定量试剂盒说明书测定样品中的蛋白浓度；用NP40裂解液统一各样品的总蛋白浓度后加入5×SDS-PAGE loading buffer，100℃煮沸5min；将处理好的蛋白样品进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。

2)SDS-PAGE：按照Bio-Rad说明书组装好胶板后并固定在配胶架上，首先配制12％分离胶(10ml)：在配胶专用锥形瓶中依次加入3.8ml ddH₂O、3.4ml 30％丙烯酰胺、2.6ml1.5M Tris-HCl(pH 8.8)、0.1ml 10％SDS、0.1ml10％过硫酸铵、0.004ml TEMED。加完后轻轻晃动混匀防止产生气泡，将混匀的分离胶快速灌入组装好的胶板两层玻璃板缝隙中，加至胶板高度的三分之二处后，在分离胶的上层用200μl移液器轻轻覆盖一层超纯水，室温静置30-60min。待分离胶凝固后，将分离胶上层超纯水倒出并用吸水纸轻轻吸干后，立即配制5％浓缩胶(4ml)：ddH₂O 2.8ml、30％丙烯酰胺0.66ml、1.0M Tris-HCl(pH 6.8)0.5ml、10％SDS 0.04ml、10％过硫酸铵0.04ml、TEMED 0.004ml。在清洗干净的锥形瓶中一次加入上述组分混匀后立即灌满胶板缝隙，灌满后立即插入对应的梳子，室温放置30-60min。

胶配好以后，把胶板从配胶架上取下并按照Bio-Rad说明书插入电泳槽内，将凝胶中的梳子轻轻竖直拔出，在加样孔中加入相同体积的处理好的样品以及蛋白Marker。向电泳槽中加入适量电泳液，接通电源并调节至恒压200V开始电泳，至溴酚蓝迁移至分离胶底部停止电泳。

3)转膜：SDS-PAGE完成后，将胶板取出，小心分离两层玻璃板，取出凝胶并切除浓缩胶。将剩余的凝胶、活化的PVDF膜(甲醇中浸泡30s)、两块滤纸和海绵浸泡在转膜液中；打开转膜夹子，由负极到正极依次叠放海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵(尤其注意凝胶与海绵之间不能有气泡)，放好后将夹子迅速扣好，避免凝胶与PVDF膜发生移动；组装好后将夹子插入转膜槽补充适量转膜缓冲液，将转膜槽置入冰水中，以免转膜过程大量产热造成蛋白降解；接通电源并调节至恒压100V转膜1-2h。

4)封闭及孵育抗体：封闭，转膜结束后将PVDF膜取出浸泡在封闭液中，37℃封闭1h；然后将PVDF膜浸在相应一抗稀释液中，在孵育摇床上室温孵育2h或者4℃孵育过夜；一抗孵育结束后将PVDF膜在PBST中洗3次，每次10min；洗膜完毕后，将PVDF膜按照蛋白大小裁开，分别浸润在相应的HRP标记的二抗稀释液中，室温孵育1h；二抗孵育结束后，PBST洗膜3次，每次10min；

5)显色：用ECL化学发光试剂盒显色后，将PVDF膜放入化学发光显色成像系统，拍摄并保存图片。

westernblot检测结果如图5所示，在PAMs中转染针对SRP14的siRNA后感染HP-PRRSV GD-HD毒株时，SRP14和PRRSV N蛋白的表达结果与RT-qPCR结果一致，转染siSRP14显著敲低了PAMs中SRP14的蛋白表达，同时几乎完全抑制了PRRSV N蛋白的表达.

上述结果表明，敲低SRP14的表达可显著抑制HP-PRRSV在PAMs细胞中的复制。

实施例2在PAMs细胞中敲低SRP14对低致病性N-PRRSV复制的影响

(1)SRP14的siRNA转染及细胞接毒：

铺板、转染、接毒(0.1MOI N-PRRSV CH1a)及收样同实施例1。

(2)RT-qPCR检测PAMs中的SRP14和PRRSV ORF7 mRNA相对表达水平

提取细胞中RNA、反转录为cDNA以及qPCR检测同实施例1。

PAMs中SRP14mRNA的相对表达量结果如图6所示，在PAMs中转染针对SRP14的siRNA后感染N-PRRSV CH1a毒株时，PAMs中SRP14 mRNA的相对表达量在0hpi和12hpi、24hpi时，与对照siRNA组相比分别降低了99％、99％和97％。

PRRSV ORF7 mRNA的相对表达量结果如图7所示，在PAMs中转染针对SRP14的siRNA后感染N-PRRSV CH1a毒株时，PRRSV ORF7 mRNA的相对表达量在12hpi和24hpi时，与对照siRNA组相比均降低了99％。

(3)RT-qPCR检测测定上清样品中PRRSV基因组拷贝数

提取细胞培养液上清中RNA、反转录、制备阳性标准品(含有PRRSV ORF7基因片段的质粒标准品)并计算上清样品中PRRSV基因组拷贝数同实施例1。

结果如图8所示，在PAMs中转染针对SRP14的siRNA后感染N-PRRSV CH1a毒株12hpi和24hpi时，PAMs培养上清液中PRRSV基因组拷贝数与对照siRNA组相比分别下降了89.4％和98.6％。

(4)TCID50测定上清样品中PRRS病毒的滴度

铺板、倍比稀释含有病毒的细胞上清液、测定、观察以及计算同实施例1。

结果如图9所示，在PAMs中转染针对SRP14的siRNA后感染N-PRRSV CH1a毒株时，细胞培养液上清中的病毒滴度在12hpi和24hpi时分别下降了0.45-log和0.5-log(P<0.05)。

上述结果表明，敲低SRP14的表达可显著抑制N-PRRSV在PAMs细胞中的复制。

实施例3在MARC-145细胞中高表达SRP14对高致病性HP-PRRSV复制的影响

(1)SRP14的高表达及细胞接毒：(使用腺病毒载体转入Marc-145细胞，实现高表达)。

1)腺病毒载体的构建及包装：将SEQ ID NO.1所示基因的第118～450位插入到穿梭载体pAdTrack-CMV的KpnⅠ和XholⅠ之间。经鉴定正确的pAdTrack-CMV-pSRP14采用PmeⅠ进行单酶切后转化入BJ5183感受态细胞中，挑菌鉴定筛选出正确重组的pAdEasy-pSRP14腺病毒质粒。

将鉴定正确的pAdEasy-pSRP14载体和pAdEasy空载体(pAdEasy是由pAdTrack-CMV经PmeⅠ单酶切后转入BJ5183感受态细胞中重组所得)各自转染HEK-293T细胞，于37℃5％CO₂条件下培养10天左右，收取细胞及上清反复冻融3次后，500g离心10min，转移上清至5ml离心管中，各取1ml上清进行TCID₅₀测定包装好的pAdEasy-pSRP14腺病毒和pAdEasy腺病毒滴度，其余标记后于-80℃中冻存使用。TCID₅₀测定、观察绿色荧光以及计算同实施例1。

2)铺板：将状态较好的Marc145细胞消化下来并进行细胞计数，将细胞密度调整为1.0×10⁵个细胞/ml，铺于24孔板中，每孔加入500μl细胞悬液，放入37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养。

3)接腺病毒：待细胞达到80～90％汇合度时，分别接种腺病毒空载体以及重组腺病毒pAdEasy-pSRP14(MOI＝10)，根据公式PFU＝细胞个数×MOI＝0.7×TCID50计算所需的病毒液，每个处理组两孔重复，接种腺病毒后将6孔板放置于37℃，5％CO₂接毒细胞培养箱中培养。

4)接毒：腺病毒感染24h小时后接种0.1MOI HP-PRRSV GD-HD毒株，将24孔板取出，用PBS清洗后，加入病毒稀释液，37℃培养1h后弃去所接病毒液，换为血清含量3％的DMEM培养基；

5)收样：感染后0h、12h、24h和36h收取细胞样品以及细胞培养上清液，-80℃保存。细胞样品用于检测细胞中PRRSV ORF7基因的相对表达水平，细胞培养上清液用于检测释放到培养液上清中病毒基因组的拷贝数以及病毒滴度。

(2)RT-qPCR检测MARC-145中的SRP14和PRRSV ORF7 mRNA相对表达水平

提取细胞中RNA、反转录为cDNA以及qPCR检测同实施例1，内参都为actin基因。

RT-qPCR引物为：

actin-F：TCCCTGGAGAAGAGCTACGA；SEQ ID NO.11；

actin-R：AGCACTGTGTTGGCGTACAG；SEQ ID NO.12。

结果如图10所示，在MARC-145中过表达SRP14后感染HP-PRRSV GD-HD毒株时，与空载腺病毒组相比SRP14腺病毒组感染的细胞中SRP14显著上调表达，分别于PRRSV感染0hpi、12hpi、24hpi和36hpi上调了6.6倍、19.6倍、14.7倍和41.7倍。

结果如图11所示，在MARC-145中过表达SRP14后感染HP-PRRSV GD-HD毒株时，与空载腺病毒组相比，SRP14腺病毒组细胞中PRRSV ORF7 mRNA的表达水平在PRRSV感染12hpi、24hpi和36hpi分别升高了6.4倍、9.2倍和10.1倍。

(3)RT-qPCR检测测定上清样品中PRRSV基因组拷贝数

结果如图12所示，在MARC-145中过表达SRP14后感染HP-PRRSV GD-HD毒株，与空载腺病毒组相比，SRP14腺病毒组细胞上清中PRRSV的病毒拷贝数在PRRSV感染12hpi、24hpi和36hpi分别升高了2倍、3倍和4倍。

(4)TCID50测定上清样品中PRRS病毒的滴度

结果如图13所示，在MARC-145中过表达SRP14后感染HP-PRRSV GD-HD毒株，与空载腺病毒组相比，SRP14腺病毒组细胞培养液上清中的病毒滴度在12hpi、24hpi和36hpi时分别分别升高了0.46-log、0.63-log和1.04-log(P<0.05)。

上述结果表明，高表达SRP14可显著增强高致病性HP-PRRSV在MARC-145细胞中的复制。

实施例4在MARC-145细胞中高表达SRP14对低致病性N-PRRSV复制的影响

(1)SRP14的高表达及细胞接毒：

铺板、转染、接毒(0.1MOICH1a)及收样同实施例3。

(2)RT-qPCR检测MARC-145中的SRP14和PRRSV ORF7 mRNA相对表达水平

提取细胞中RNA、反转为cDNA以及qPCR检测同实施例3。

结果如图14所示，在MARC-145中过表达SRP14后感染N-PRRSV CH1a毒株时，与空载腺病毒组相比SRP14腺病毒组感染的细胞中SRP14显著上调表达，分别于PRRSV感染0hpi、12hpi、24hpi和36hpi上调了12.77倍、16.66倍，15.41倍和40.41倍。

结果如图15所示，在MARC-145中过表达SRP14后感染N-PRRSV CH1a毒株时，与空载腺病毒组相比，SRP14腺病毒组细胞中PRRSV ORF7 mRNA的表达水平在PRRSV感染12hpi、24hpi和36hpi分别升高了10.73倍、18.66倍和6.21倍。

(3)RT-qPCR检测测定上清样品中PRRSV基因组拷贝数

结果如图16所示，在MARC-145中过表达SRP14后感染N-PRRSV CH1a毒株，与空载腺病毒组相比，SRP14腺病毒组细胞上清中PRRSV的病毒拷贝数在PRRSV感染12hpi、24hpi和36hpi分别升高了2.75倍、5.76倍和22.34倍。

(4)TCID50测定上清样品中PRRS病毒的滴度

结果如图17所示，在MARC-145中高表达SRP14后感染N-PRRSV CH1a毒株，与空载腺病毒组相比，SRP14腺病毒组细胞培养液上清中的病毒滴度在12hpi、24hpi和36hpi时分别分别升高了0.75-log、1.45-log和1.17-log(P<0.05)。

上述结果表明，高表达SRP14可显著增强低致病性N-PRRSV在MARC-145细胞中的复制。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 西北农林科技大学

<120> 影响PRRSV复制和增殖的SRP14基因及其应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3404

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

gcagggattg ggtagaagag agcagaaaaa tagcggaagt cccgcccagc cagggtggaa 60

cttccggttc cgactgcttg gggcttgtgc tgactgagcg gagcccgcag tgccggtatg 120

gtgctactgg agagtgagca gttcctgacg gagctgacga ggctcttcca gaagtgccgg 180

ttgtcgggca gcgtcttcat caccctgaag aaatatgatg gtcgaactaa acccattcca 240

aggaaaggtt ctgtggaggg atttgagccc gcggacaaca agtgtctatt aagagctact 300

gatgggaaaa agaagatcag cactgtggtg agctccaaag aagtgaataa gtttcagatg 360

gcttattcga acctgttgag agctaacatg gatgggttga agaagaggga caaaaagagc 420

aagagtaaga agagcaaagc agcacagtaa agggcatcag atttcccgcc ttcaccaact 480

aaccactgag ttgctgtttt tcatttggtt tttactttcg gctacaaagc tgggtttttg 540

attcccgtac aataactgtt ttcatgtgag attagggtca cttttggatg gaagaaaggc 600

tgcattgttt acagggtagt ttattttaga agccaattta ttttagatct ggctaagtgg 660

tctgtgttgt atgtttgttt attcctggat tatagtttag agtctctgta gcctgtgaag 720

agcactgtac cattaaacct gtatttatca tcactatctt ttattccttt tcccactcca 780

taaaaagttt ctggcaatag ctactcattc tggaatggtg ggattacaaa taggctttag 840

gccctatctt gtgggttatt ggaattgaaa cctgacaatt ttacaaaaag ctgtgttatt 900

tcatgggtgt ttttcccaac cgttagtgta attttgtttt cttagttcct ttagcaaatt 960

cgaatgagtt ctcatagcca attgagagtt tgcttaacaa aacttagttt atgacaaaat 1020

catcaagaat aaagatccca ggttaatgat gatatttgat ttctttatgc ccttgacttt 1080

ggacattttc atgtgcttag acagtagggc taagagaaga acaaggctat tttcttgtgt 1140

tctagctcca caaaatcttt agtgccaagg caattaaaga gcagcagata tatgaaaaca 1200

tttattatat tcaaaaagat aaatttataa tatacatgaa aaacttacaa agctcaactt 1260

tgtaggacag cttcttagaa tattaattta aaattacagt gaatgtacag cattttatag 1320

tataagctcc tgtccatttg aacaatgtaa tgattgttct ttaggattaa aataagattc 1380

tgtagtaatc atctctgtag ctatacagga atagcacaga caccctgcaa aaaaggggaa 1440

aagacaggat gagtgtaatg ggtagagaat agagttgata aattattttt agaacactta 1500

actataggag ttttgtataa tcaaaaacaa ggtggaaggc tagtcactaa aaaaattact 1560

taagttttac aggagctgtg gctggcaaac atccagagta taaatgtcta cataaggagt 1620

ccatcattca cctcacaggc tttgttgttg ccttttaagt ggatgatcac atgaacaact 1680

ggcattctgg tatggggaca taaagcacag cagtcacacc tgctttcttt catttcagtg 1740

tttctaggac ttacctgggt gatgacagct ataactggga tagttgctac tgggaccact 1800

gtgtttgtta ttgacaaggt catggctgtg attcacagtc ctgaggagta ttactggtta 1860

ccagttgcag ttctaacata gcagcttatt agccatctaa cctcaataag acaataaaaa 1920

tatttgatac tttaaaatcc ctcaggggaa aaaacaaacc tcgaatcttt cccatgtcaa 1980

aagctgcaat gcgttaataa cttacttttt ttctactttg atgttataaa tttcatcaca 2040

gactaatttg aggtatcttt gctttggcag gcgtgacaac agctgcttca cagttgtgtt 2100

aaatgcctgt tcatcagcat cccactagga aaaaatagat aagacttaat cactggtact 2160

agggtttatt aactggcttt ttctgggtga ctaatgaaat gtcaatgcca tttccccctt 2220

taagtatact gaagagatca gttacaggga gagagaacca gtggggagac tgcttgggtt 2280

ctttgaagta ttgagtttct ctccaagacc accttactag atcctgattg acaatgctgc 2340

agccgcagtg tgccactgtg acttgtgtac cagttatttc tgccaactgt tgacttcatg 2400

tgaaatggag ataccacctc tgatgtgaat atgaatggct tataaagcag taaactgcta 2460

gtacagtgct atgtgcttat ttaccagaca agagaatacc aatggggaaa gggaaggcgg 2520

agagttagcc tttttttttt tttttaaata atttttacag ccgcacctgc agtatatgga 2580

cgttcgcagg tcaagggtca aattggagct gcagcttgta gaaacagtgg atccttaact 2640

cactgaatga agccagggat cgaacccaca ttctcacaga gaaaatgatg tcgggtccct 2700

aatctgctga gccacaaaca ggaactctga gagtaagctt ataaaagaag ctacaagggt 2760

atattatata gctcagggaa tatggccagt attttatata aacagagtat gactttaaaa 2820

agacccagaa aatggtagtg tttaatgtta gttctggggc aaaattcgtc tttcatctaa 2880

tgtaatctgt gactacacat tctggataga cgaaagtatt ttttggtatg acatgtaaaa 2940

atcacctcta ggttataaac tttcttatag caaaggtaag tataaagatt tttaaaagtt 3000

caattaggct atctgataat aagggtatac ctgtaaaaaa aaaaaaaaag cataaaggac 3060

ctaaattaat ttaattttta caaaaagatc tccatgtagt tctagttctg caaatgagct 3120

tccctggtta gaacagtttg tttgaagcag aataatatag tggttaagaa atccttgctc 3180

tgcagcttcc tagttgggtg actttgaata agatacttaa cttctctgct tctgttctcc 3240

acaaaatgta aaatgattcc atttatctgt aaaatggaga cctgtaaaaa aggtaataat 3300

atgtatccct tggggttgtt atgattaaat gagttaatat ttgtaaaatg cttagaacaa 3360

gaccttccag agcctaacac acaataaaat catctctgag attt 3404

<210> 2

<211> 110

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Met Val Leu Leu Glu Ser Glu Gln Phe Leu Thr Glu Leu Thr Arg Leu

1 5 10 15

Phe Gln Lys Cys Arg Leu Ser Gly Ser Val Phe Ile Thr Leu Lys Lys

20 25 30

Tyr Asp Gly Arg Thr Lys Pro Ile Pro Arg Lys Gly Ser Val Glu Gly

35 40 45

Phe Glu Pro Ala Asp Asn Lys Cys Leu Leu Arg Ala Thr Asp Gly Lys

50 55 60

Lys Lys Ile Ser Thr Val Val Ser Ser Lys Glu Val Asn Lys Phe Gln

65 70 75 80

Met Ala Tyr Ser Asn Leu Leu Arg Ala Asn Met Asp Gly Leu Lys Lys

85 90 95

Arg Asp Lys Lys Ser Lys Ser Lys Lys Ser Lys Ala Ala Gln

100 105 110

<210> 3

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gaagaaauau gauggucga 19

<210> 4

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

ucgaccauca uauuucuuc 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

ggttctgtgg agggatttga 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

cctttactgt gctgctttgc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

agatcatcgc ccaacaaaac 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

gacacaattg ccgctcacta 20

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

tggaaagaat gtcttgattg ttgaag 26

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

atctttggat tatgctgctt gacc 24

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

tccctggaga agagctacga 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

agcactgtgt tggcgtacag 20

Claims

1.一种靶向SRP14基因的siRNA，其特征在于，所述siRNA的核苷酸序列如下：

正义链：GAAGAAAUAUGAUGGUCGAdTdT；SEQ ID NO.3；

反义链：UCGACCAUCAUAUUUCUUCdTdT；SEQ ID NO.4。

2.根据权利要求1所述的一种靶向SRP14基因的siRNA，其特征在于，所述siRNA在抑制SRP14基因表达中的应用。

3.根据权利要求1所述的一种靶向SRP14基因的siRNA，其特征在于，所述siRNA在制备预防或治疗猪蓝耳病的药物或制剂中的应用。

4.SRP14基因在抑制PRRSV复制和增殖中的应用，其特征在于，特异性敲低SRP14的siRNA转染PAMs细胞后，能够有效抑制SRP14的表达，从而抑制PRRSV在PAMs细胞中的复制和增殖。

5.含有猪SRP14基因的表达载体，其特征在于，所述表达载体选自腺病毒表达载体。

6.根据权利要求2所述的腺病毒表达载体，其特征在于，是将SEQ IDNO.1所示基因的第118～450位插入到穿梭载体pAdTrack-CMV的KpnⅠ和XholⅠ之间。

7.过表达猪SRP14在增强PRRSV在易感细胞MARC145中复制与增殖中的应用。

8.过表达猪SRP14在制备PRRSV疫苗中的应用。

9.对猪SRP14基因进行敲除或定点突变，在研制抗猪蓝耳病的基因修饰猪中的应用。