CN102604959A - 一种阿尔茨海默病致病基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了属于分子病理学领域技术领域的一种阿尔茨海默病致病基因及其应用，其cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明还涉及含有所述阿尔茨海默病致病基因的重组载体、含有该重组载体的重组细胞、阿尔茨海默病致病基因的编码蛋白以及阿尔茨海默病致病基因的外显子。本发明所述阿尔茨海默病致病基因的外显子，对该基因的检测可能用于AD患者的基因分子诊断，或利于明确AD患者亲属的发病风险预测。本发明可以对AD的发病机理提供重要线索，含有所述阿尔茨海默病致病基因的外显子载体可用于制备AD细胞或动物模型。

Description

一种阿尔茨海默病致病基因及其应用

技术领域

本发明属于分子病理学领域技术领域，具体涉及一种阿尔茨海默病致病基因及其应用。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种渐进性的神经退行性疾病，已成为老年痴呆的主要病因。AD的临床症状主要表现为进行性记忆力减退、认知功能下降和精神行为异常等，最终带来极高的病死率和致残率。AD病理特征为：大脑皮层及海马区的β淀粉样肽(β-amyloid peptide，Aβ)在胞外沉积并形成老年斑(senile plaque，SP)、脑神经细胞内tau蛋白异常聚集形成的神经原纤维缠结(neurofibrillary tangle，NFT)、神经元突触功能异常及锥体神经细胞丢失。

AD分可为家族性AD(familial Alzheimer’s disease，FAD)和散发性AD(sporadicAlzheimer’s disease，SAD)，其中FAD发病年龄通常早于65岁。现有究结果表明25-40％的AD病例与遗传因素有关，双生子研究认为这一比例可高达80％。FAD呈常染色体显性遗传，约30-50％的致病突变来自三个基因：位于21号染色体(21q.21.1)的APP(amyloid precursorprotein gene)，位于14号染色体(14q24.3)的PSEN-1(presenilin-1 gene)，和位于1号染色体(1q42.1)的PSEN-2(presenilin-2 gene)。APP基因含有18个外显子，其中外显子16、17编码APP分解产物Aβ，而Aβ为老年斑的主要成分；PSEN-1含有3个非编码外显子(Ex1A，1B，2)和10个编码外显子(Ex 3-12)；PSEN-2含有3个非编码外显子(Ex 1，2，3)和10个编码外显子(Ex 4-13)。

APP基因由于基因转录后剪接方式的不同，所得的mRNA可翻译生成数种亚型，其中最主要的为APP695(NM_201414)，APP751(NM_201413)，APP770(NM_000484)。三者的区别在于APP751比APP695多出一段Kunitz蛋白酶抑制物同源序列(Kunitz proteaseinhibitor，KPI)，APP770比APP695多出一段KPI序列和OX-2抗原序列，其中APP695在脑组织中表达量最多。

APP在胞内可经过两条途径水解，(1)不产生Aβ的途径：APP首先被α分泌酶(α-secretase)水解，产生胞外域sAPP_α和一个10kD的羧基端片段(C-terminal fragment)，即CTF_α或C83，C83经γ分泌酶(γ-secretase)水解产生一个3kD的P3和APP胞内区(APPintracellular domain，AICD)并很快被进一步降解；(2)产生Aβ的途径：APP首先被β分泌酶(β-site of APP cleaving enzyme 1，BACE 1)水解，产生胞外域sAPP_β和一个12kD的羧基端片段即CTF_β或C99，C99在γ分泌酶作用下产生Aβ40或42和AICD(也称CTF_γ)，其中Aβ42容易聚集，是老年斑的主要病理成分。大多数FAD基因突变改变APP蛋白的加工过程，导致Aβ42增加或Aβ42/40相对水平增高。

Goate等(1991)报道了第一个发生于FAD的APP突变。到目前为止，已发现32种APP基因突变(包括三体型)可导致FAD，所有已发现的APP基因点突变都位于其16和17号外显子，如位于16号外显子的APP KM670/671NL(Swedish APP，g.[269498G＞T；269499A＞C])(Mullan M，1992)、APPAsp678Asn(Tottori APP，g.269520G＞A)(Wakutani Y，2004)，位于17号外显子的APP Thr714Ile(Austrian APP，g.275333C＞T)(DeJonghe C，2000)、APP Leu723Pro(Australian APP，g.275360T＞C)(Kwok JB，1998)和APPLys724Asn(Belgian APP，g.275364G＞C)(Theuns J，2006)等。所有已知的APP基因突变体数据可参阅网络数据库www.molgen.ua.ac.be/ADMutations。

尽管FAD只占AD总量约5％，但鉴定AD基因致病突变对于家族性AD患者亲属的早期临床诊断、深入了解AD生物学和发病机理、建立细胞和动物疾病模型、提供药物治疗靶点和药物开发平台都具有重要意义和价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种阿尔茨海默病致病基因及其编码的蛋白质。

本发明的目的还在于提供包含上述阿尔茨海默病致病基因的重组载体和细胞。

本发明的目的还在于提供一种阿尔茨海默病致病基因的外显子及包含该外显子的重组载体及细胞。

本发明的目的还在于提供上述阿尔茨海默病致病基因的外显子在制备诊断阿尔茨海默病的药物及制备细胞或动物疾病模型中的应用。

一种阿尔茨海默病致病基因，其cDNA核酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

一种阿尔茨海默病致病基因编码的蛋白，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

一种重组载体，所述重组载体包含阿尔茨海默病致病基因。

上述重组载体的原始载体为真核表达载体pcDNA3.1，或者腺病毒骨架质粒AdEasy-1和穿梭质粒载体pShuttleCMV。

一种重组细胞，包含上述含阿尔茨海默病致病基因的重组载体。

上述重组细胞的原始细胞为腺病毒包装细胞HEK293。

一种阿尔茨海默病致病基因的外显子，其核酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。

一种重组载体，包含阿尔茨海默病致病基因的外显子。

一种重组细胞，包含上述含阿尔茨海默病致病基因的外显子的重组载体。

上述阿尔茨海默病致病基因的外显子在制备诊断阿尔茨海默病的药物及制备细胞或动物疾病模型中的应用。

本发明的有益效果：本发明发现了一种新的阿尔茨海默病致病基因，对该基因突变的检测可能用于辅助AD患者的基因诊断，利于明确AD患者的分子诊断及分子分型。本发明可以对AD的发病机理提供重要线索，对AD的诊断治疗具有十分重要的意义。本发明所述重组真核表达质粒载体和腺病毒载体，可用于在多种宿主细胞中高效表达所述阿尔茨海默病致病基因突变体，建立细胞和动物模型，研究AD致病基因突变的细胞及分子机制或用于筛选抗AD药物。

附图说明

图1  T017患者家系APP基因17号外显子测序结果图；

图中，①②：T017测序结果；③④：T018测序结果；⑤⑥：T019测序结果；⑦⑧：T020测序结果。

图2  T017患者家系图；

图中，II.1.T018，正常；II.2.T019，AD，带有APP K724M突变；II.3.T017，先证者，带有APP K724M突变；III.1.T020，尚未到发病年龄，带有APP K724M突变。

图3  Megaprimer-PCR法第一次PCR琼脂糖凝胶电泳结果图；

图中，M：DNA Marker DL2000；1：Megaprimer-PCR法第一次PCR产物。

图4  Megaprimer-PCR法第二次PCR琼脂糖凝胶电泳结果图；

图中，M：DNA Marker DL2000；1：Megaprimer-PCR法第二次PCR产物。

图5  重组腺病毒质粒pAd-APP695K724M的Pac I酶切鉴定图；

图中，M：DNA Marker DL15000；1：pAPP695K724M。

图6正常HEK293细胞及HEK293细胞包装腺病毒后病变结果图；

图中，a：正常HEK293细胞；b：HEK293细胞包装腺病毒后病变图。

图7  腺病毒Ad-APP695K724M的Western Blot鉴定图；

图中，1：HEK293细胞裂解物上清；2：HEK293感染了Ad-APP695K724M的细胞裂解物上清；较大分子量条带为APP，下面条带为GAPDH。

图8  多克隆细胞株的建立；

图中，左为G418处理8天后的多克隆细胞株；中为G418处理12天后的多克隆细胞株；右为G418处理15天后的多克隆细胞株。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1  阿尔茨海默病致病基因与AD发病关系的验证

发明人采集到AD、FTD病人及亲属样本，详见表1。

表1  AD样本收集情况

分别对以上12名正常人、14名AD患者、2名FTD患者以及9名FAD患者的基因组中阿尔茨海默病致病基因进行检测，通过PCR扩增后测序的方法获得阿尔茨海默病致病基因16号和17号外显子的序列，根据序列测定结果结合临床数据验证阿尔茨海默病致病基因与AD的相关性。

具体步骤如下：

1)AD外周血样本的收集

按照美国NINCDS-ADRDA诊断标准诊断为很可能的AD或确诊AD病人。AD病人及其亲属外周血样本收集自首都医科大学附属北京天坛医院。

2)基因组DNA的提取

采用北京博迈德科技发展有限公司的大量全血基因组DNA提取试剂盒提取外周血标本的DNA，具体步骤如下：

A)吸取30mL 1×红细胞裂解液到一个50mL离心管。

B)将抗凝全血(使用前恢复到室温)颠倒混匀后，吸取10mL加到上述装有红细胞裂解液离心管中，颠倒6-8次，并倒置轻弹管壁，确保充分混匀。

C)室温放置10min(期间应该颠倒轻弹混匀数次帮助裂解红细胞)。

D)2500g离心2min，倒弃红色上清，并小心的尽可能多的吸弃上清(注意不要吸到管底的细胞团)，留下完整的管底白细胞团和大约100μL的残留上清。(离心后在管底应该见到白色的白细胞团，也可能有一些红细胞残片和白细胞团在一起，但是如果看到的是大部分的红色细胞团，说明红细胞裂解很不充分，应该再加入适量的红细胞裂解液重悬细胞团后重复步骤C，D。)

E)涡旋振荡15s，重悬、充分分散白细胞团。

F)加入10mL细胞核裂解液到重悬的白细胞，迅速有力吹打混匀，以裂解白细胞。由于基因组DNA立刻释放出来，混合物会马上变得十分粘稠，立刻停止吹打(以免剪切断基因组DNA)，颠倒旋转离心管10次保证裂解液和所有的白细胞接触并裂解。

G)可选步骤：在裂解物中加入RNase A(10mg/mL)至终浓度30μg/mL，颠倒25次混匀，37℃温育15min去除残留RNA，然后冷却回室温。

H)加入3.33mL蛋白沉淀液后，在涡旋振荡器上高速连续振荡混匀20-25s。混匀后可能见到一些小的蛋白团块。

I)2500(可根据需要调整加大离心力)离心5min。这时候应可以见到管底暗褐色的蛋白沉淀，也可能见到一些蛋白沉淀漂浮在液体表面。

J)小心吸取上清(大约10mL)到一个新的50mL离心管中。(吸取上清时，注意不要吸到管底和漂浮在液体表面的蛋白沉淀。如果不小心将蛋白沉淀转入新的离心管中，可再次离心2min后取上清。)

K)加入等体积的室温异丙醇(约10mL)，轻柔颠倒30次混匀或者直到出现棉絮状(丝状)白色DNA沉淀。

L)垂直放置离心管，让白色DNA沉淀自然沉到管底，然后用枪头把沉淀吸到EP管中。

M)加入1mL 70％乙醇后，颠倒混匀，2000g离心2-3min，在管底可以见到白色的DNA沉淀块，倒弃上清。

N)重复步骤13，倒弃上清后在吸水纸上轻敲几下以控干残留乙醇，还可以用枪头小心吸掉管底沉淀周围和管壁的残留乙醇，空气晾干沉淀几分钟。(注意不要干燥过头，否则DNA极其难溶；也不能残留太多乙醇，否则乙醇可能抑制下游如酶切反应。)

O)加入600μL DNA溶解液重新水化溶解DNA沉淀，轻弹管壁混匀，可以放置在65℃温育30-60min，也可以在室温或者4℃放置过夜来重新水化DNA，期间不时的轻弹管壁帮助重新水化DNA。

P)DNA可以存放在2-8℃，如果要长时间存放，可以放置在-80℃。

3)PCR检测

根据阿尔茨海默病致病基因16号和17号外显子的核苷酸序列设计如下的引物：

APP-Ex16F：5′-TTGGGTAGGCTTTGTCTTACAGTG-3′

APP-Ex16R：5′-TTGATTTCTAGCACAGGATGAACCAG-3′

APP-Ex17F：5′-ATATAACCTCATCCAAATGTC-3′

APP-Ex17R：5′-GCCTAATTCTCTCATAGTCTTAATTC-3′

4)测序

上述PCR产物送往Invitrogen公司测序。对于可疑位点，采用高保真DNA聚合酶PrimeSTARTM HS DNA Polymerase进行PCR后重复测序。

5)结果分析

按上述方法进行的DNA测序结果表明，来自样本T017、T019和T020的APP基因17号外显子的第107位发生了A→T的突变，对应于APP基因第g.275363(GenBank：D87675.1)位碱基发生了A→T的突变，该突变导致APP基因编码的蛋白质第724位氨基酸序列(编码对应于APP770)由赖氨酸(K)变为蛋氨酸(M)，即APP K724M(g.275363A＞T)。T017、T019(T017的二姐)由首都医科大学附属北京天坛医院神经内科临床诊断为FAD，其中前者为先证者，而T020(T019之女)尚未到发病年龄，目前临床表现正常；T018为T017大姐，临床表现正常，APP基因测序结果未见异常。其它正常人及FTD样本未见上述APP突变。T017患者及其亲属的APP基因Ex17外显子的测序结果如图1所示。

Theuns等(2006)报道了APP K724N(Belgian APP，g.275364G＞C)突变为AD致病突变，K724为毗邻APP跨膜区胞质端的第一个氨基酸，对维持APP蛋白的跨膜结构域的稳定可能起重要作用，细胞实验发现APP K724N突变可引起Aβ42代谢产物增加2倍、Aβ40代谢减少30％，Aβ42/Aβ40比值增加2.6倍。本发明筛选到的APP K724M突变与已报道的APP K724N突变位置相同但突变成的氨基酸不同，且在家系中发生突变的情况与AD患病相一致，符合显性遗传特点，结合临床资料和遗传学数据可判断APP K724M突变是可导致FAD的致病突变。T017患者的家系图如图2所示。

实施例2  APP695K724M真核表达载体的构建及稳定表达细胞株的建立

1、小量提取质粒pcDNA3.1(-)(Invitrogen)DNA。

2、APP695K724M基因突变体的制备：

采用Megaprimer-PCR法引入K724M定点突变。

重叠引物PCR所用引物如表2：

表2  Megaprimer-PCR所用引物

(1)第一次PCR

以APP695 cDNA(可商业购买或按照GenBank序列合成)为模板，引入突变引物MP(K724M)为上游引物，APP-3’为下游引物，采用PrimeSTARTM HS DNAPolymerase扩增PP。

PCR反应体系为(50μL)：

PCR反应条件：

94℃预变性5min；

98℃变性10s，56℃退火15s，72℃延伸15s，共30个循环；

最后72℃延伸5min，4℃保存。

PCR反应结束后，取1μL产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

而后将PCR产物纯化后进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示。

(2)第二次PCR

以APP695 cDNA为模板，APP-5’Sal I为上游引物，一次PCR产物为下游引物，采用PrimeSTARTM HS DNA Polymerase扩增APP695K724M。

PCR反应体系为(50μL)：

PCR反应条件：

94℃预变性5min；

98℃变性10s，53℃退火15s，72℃延伸120s，共28个循环；

最后72℃延伸10min，4℃保存。

PCR反应结束后，取1μL产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

而后将PCR产物纯化后进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4。

3、真核表达质粒pcDNA3.1(-)-APP695K724M的构建

A)用限制性内切酶EcoR V和Xho I双酶切质粒pcDNA3.1(-)，琼脂糖凝胶电泳后，回收酶切产物；

B)将PCR扩增并经纯化后的目的基因片段APP695K724M进行酶切(Sal I)；

将经酶切胶回收纯化后的pcDNA3.1(-)和经酶切灭活处理的目的基因片段APP695K724M于16℃用T4 DNA Ligase以合适比例进行连接，得到真核表达质粒pcDNA3.1(-)-APP695K724M，将连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞中，经PCR鉴定，菌液PCR鉴定所用引物如表3：

表3  菌液PCR鉴定所用引物

1)pcDNA3.1(-)-APP695K724M转化大肠杆菌细胞的菌液PCR鉴定

取pcDNA3.1(-)-APP695K724M转化单克隆细胞菌液0.5μL为模板，APP840和pcDNA3.1-3’为上下游引物进行PCR初步鉴定阳性克隆。

PCR反应体系为(20μL)：

PCR反应条件：

94℃预变性5min；

94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸90s，共30个循环；

最后72℃延伸10min，4℃保存。

PCR反应结束后，取1μL产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，证明结果正确。

2)PCR鉴定的pcDNA3.1(-)-APP695K724M阳性克隆由Invitrogen公司进行DNA测序鉴定。pcDNA3.1(-)-APP695K724M可用于建立瞬时或稳定表达细胞模型，研究AD发病机制或用于抗AD药物筛选

4、稳定表达多克隆细胞株的建立

将测序正确的pcDNA3.1(-)-APP695K724M采用OMEGA Bio-Tek公司的E.Z.N.A.TMPlasmid Mini Kit进行质粒的小量提取，采用Lipofectamine 2000转染HEK293，具体步骤如下：

1)转染前20-24h将细胞以合适密度铺于24孔培养板中，确保转染时细胞丰度为80-90％。

2)将0.8μg DNA稀释于50μL Opti-MEM I中。

3)将1μL Lipofectamine 2000稀释于50μL Opti-MEM I中。

4)上述两液于室温静置5min后混匀，于室温静置20min。

5)将DNA/Lipofectamine 2000混合物加到细胞培养基中，轻摇混匀，37℃，CO₂培养箱中培养4-6h后，将培养基更换为新培养基。

转染48h后，将细胞传代至6孔培养板，同时使用G418筛选(终浓度800μg/mL)，连续培养3周后可获得稳定表达多克隆细胞株。G418处理8天后可见大量细胞死亡，处理12天后可见克隆形成，15天后克隆开始变大。G418连续筛选3周后可形成稳定表达多克隆细胞株，进一步采用有限稀释法获得单克隆转基因细胞株，结果如图8所示。

实施例3  阿尔茨海默病致病基因腺病毒表达载体的构建

研究FAD APP突变体的致病机理或者筛选抗AD药物，通常需要建立原代神经细胞或动物模型。普通的转染方法转染很难转染原代神经细胞，需要建立高效表达APP的病毒载体，如腺病毒、慢病毒、逆转录病毒、杆状病毒等。本实施例所述为重组腺病毒载体构建过程，具体步骤如下：

1、穿梭载体的构建

1)穿梭质粒pShuttleCMV的小量提取

取1μL穿梭质粒pShuttleCMV(Stratagene)转化Top10感受态细胞，Kan抗性LB琼脂平板(含50μg/mL卡那霉素)筛选，挑取单菌落接种于5mL LB培养基(含50μg/mL卡那霉素)中，37℃，250rpm摇培12-16h，采用OMEGA Bio-Tek公司的E.Z.N.A.^TMPlasmidMini Kit进行质粒的小量提取。

2)穿梭质粒pShuttleCMV的处理

将小量提取的质粒pShuttleCMV进行酶切(Kpn I)。

酶切反应体系为(30μL)：

酶切反应条件：37℃反应4h。

酶切反应结束后用琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物并进行纯化。

将质粒pShuttleCMV的Kpn I酶切产物进行纯化后用T4 DNA Polymerase补平。

补平反应体系为(40μL)：

补平反应条件：37℃反应30min。

补平反应结束后进行DNA纯化。

将质粒pShuttleCMV的Kpn I酶切产物进行纯化后用T4 DNA Polymerase补平，纯化后进行酶切(Hind III)。

酶切反应体系为(30μL)：

酶切反应条件：37℃反应4h。

酶切反应结束后用琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物并胶回收纯化酶切产物。

3)目的基因APP695K724M的处理

将含有目的基因APP695K724M的质粒pcDNA3.1(-)-APP695K724M进行酶切(XbaI)。

酶切反应体系为(30μL)：

酶切反应条件：37℃反应4h。

酶切反应结束后用琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物并进行纯化。

将质粒pcDNA3.1(-)-APP695K724M的Xba I酶切产物进行纯化后用T4 DNA Polymerase补平。

补平反应体系为(40μL)：

补平反应条件：37℃反应30min。

补平反应结束后进行DNA纯化。

将质粒pcDNA3.1(-)-APP695K724M的Xba I酶切产物进行纯化后用T4 DNA Polymerase补平，纯化后进行酶切(Hind III)。

酶切反应体系为(30μL)：

酶切反应条件：37℃反应4h。

酶切反应结束后用琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物并胶回收纯化酶切产物。

4)穿梭质粒pShuttleCMV酶切产物和目的基因APP695K724M酶切产物的连接和转化

将经酶切胶回收纯化处理的穿梭质粒pShuttleCMV和目的基因APP695K724M于16℃用T4 DNA Ligase以合适比例进行连接。

连接反应体系为(10μL)：

连接反应条件：16℃过夜连接。将连接产物转化至Top10感受态细胞中。

5)穿梭质粒pShuttleCMV-APP695K724M的菌液PCR鉴定

挑取转化平板上的单菌落接种于5mL LB培养基(含50μg/mL Kan)中，37℃，250rpm摇培12-16h。菌液PCR初步鉴定后送阳性克隆至Invitrogen公司测序。

取pShuttleCMV-APP695K724M菌液0.5μL为模板，APP840和APP-3’为上下游引物进行PCR初步鉴定阳性克隆(引物序列见表2和表3)。

PCR反应体系为(20μL)：

PCR反应条件：

94℃预变性5min；

94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸90s，共30个循环；

最后72℃延伸10min，4℃保存。

PCR反应结束后，取1μL产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

2、重组腺病毒质粒pAd-APP695K724M的构建

1)穿梭质粒pShuttleCMV-APP695K724M的线性化

将小量提取的穿梭质粒pShuttleCMV-APP695K724M进行酶切线性化(Pme I)。

酶切反应体系为(50μL)：

酶切反应条件：37℃酶切过夜。

酶切反应结束后用琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。

将酶切产物68℃水浴40min进行酶灭活。

2)线性化产物转化Adeasier感受态细胞

取穿梭质粒pShuttleCMV-APP695K724M线性化产物转化至含有腺病毒骨架质粒AdEasy-1的BJ5183(Stratagene)感受态细胞，卡那霉素抗性LB琼脂平板(含50μg/mL Kan)筛选，37℃恒温培养箱中倒置培养16-20h。挑取最小的单菌落接种于5mL LB培养基(含50μg/mL Kan)中，37℃，250rpm摇培12-16h，采用OMEGA Bio-Tek公司的E.Z.N.A.^TMPlasmid Mini Kit进行质粒的小量提取。

3)重组腺病毒质粒pAd-APP695K724M的酶切鉴定

将小量提取的重组腺病毒质粒pAd-APP695K724M进行Pac I(Promaga)酶切鉴定。

酶切反应体系为(20μL)：

酶切反应条件：37℃反应4h。

酶切反应结束后用琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，结果如图5所示。

将酶切鉴定的阳性克隆送至Invitrogen公司测序。

3、腺病毒载体Ad-APP695K724M的包装

1)重组腺病毒质粒pAd-APP695K724M的小量提取

将酶切鉴定正确的pAd-APP695K724M转化Top10感受态细胞(全式金)获得较高拷贝数，卡那霉素抗性LB琼脂平板(含50μg/mL卡那霉素)筛选，37℃恒温培养箱中倒置培养12-16h。挑取单菌落接种于5mL LB培养基(含50μg/mL卡那霉素)中，37℃，250rpm摇培12-16h，采用OMEGA Bio-Tek公司的E.Z.N.A.^TM Plasmid Mini Kit进行质粒的小量提取。

2)重组腺病毒质粒pAd-APP695K724M的Pac I酶切处理

将小量提取的重组腺病毒质粒pAd-APP695K724M用Pac I酶(Promega)切鉴定及去除Ori和卡那霉素抗性基因等质粒构件，暴露反向末端重复序列。

酶切反应体系为(100μL)：

酶切反应条件：37℃酶切过夜。

酶切反应结束后用琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。

3)重组腺病毒质粒pAd-APP695K724M的Pac I酶切产物的乙醇沉淀纯化

将重组腺病毒质粒pAd-APP695K724M的Pac I酶切产物进行乙醇沉淀，具体步骤如下：

1)在1.5mL EP管中将DNA：100μL，灭菌蒸馏水：200μL，NaAc(3M，pH 5.2)：33μL充分混匀，瞬时离心；

2)向EP管中加入2.5倍体积(832.5μL)无水乙醇(-20℃预冷)，瞬时离心，于-20℃放置1h；

3)4℃，14000g离心20min，弃上清；

4)向EP管中加入1mL 75％乙醇，4℃，14000g离心10min，弃上清(超净台中操作)；

5)4℃，14000g离心5min，用小枪头将残留液体吸弃；

6)加入20μL无菌Elution Buffer(10mM Tris-HCl，pH 8.5)，充分吹洗管壁。

4)重组腺病毒DNA转染腺病毒包装细胞HEK293

将经过乙醇沉淀纯化的重组腺病毒DNA采用Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染腺病毒包装细胞HEK293，具体步骤如下：

1)转染前20-24h将细胞以合适密度铺于60mm培养皿中，确保转染时细胞丰度为50-70％。

2)将3μg DNA稀释于250μL Opti-MEM I中。

3)将6μL Lipofectamine 2000稀释于250μL Opti-MEM I中。

4)上述两液于室温静置5min后混匀，于室温静置20min。

5)将DNA/Lipofectamine 2000混合物加到细胞培养基中，轻摇混匀，37℃，CO₂培养箱中培养4-6h后，将培养基更换为新培养基。

5)腺病毒Ad-APP695K724M的收获及病毒滴度的提高

转染后约9天可见细胞病变，细胞肿胀、变圆变亮、呈葡萄串状，如图6所示。细胞漂浮约80-90％后(转染后约14天)收获病毒，具体步骤为：

1)用细胞铲将细胞刮下，将细胞及培养基转移到冰上预冷的15mL离心管中。

2)4℃，500g离心10min，弃部分上清，留大约2mL，振荡重悬。

3)于-80℃冷冻30min，37℃轻摇融化。

4)重复上述冻融操作3次。

5)4℃，500g离心10min后将病毒上清分装冻于-80℃。

取收获病毒液体积的25％加入细胞丰度为50-70％的HEK293细胞中，37℃，CO₂培养箱中培养以提高病毒滴度，若获得的毒力较弱可重复上述操作。

6)腺病毒Ad-APP695K724M的Western Blot鉴定

a)细胞总蛋白的提取

以合适体积的腺病毒(可使细胞接毒后72h漂浮80-90％)接种于细胞丰度约80-90％的HEK293细胞，72h后收集感染后的细胞，采用碧云天生物技术研究所的Western及IP细胞裂解液裂解细胞，具体步骤如下：

1)4℃，5000rpm离心10min收集腺病毒Ad-APP695K724M感染后的HEK293细胞。

2)用冰上预冷的PBS漂洗细胞一次，4℃，5000rpm离心10min，弃上清。

3)每个60mm细胞培养皿中收集的细胞加入200μL Western及IP细胞裂解液(使用前加入蛋白酶抑制剂)，充分悬浮，冰上裂解30min。

4)4℃，12000rpm离心10min，吸取上清冻于-80℃。

b)聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

1)将玻璃板、样品梳用去离子水冲洗后擦拭干净，晾干，装好玻璃板。

2)按如下体积配制12％分离胶，混匀。

3)将配制好的分离胶灌入玻璃板间，立即覆一层灭菌蒸馏水，大约20min后胶即聚合。

4)按上表配制5％浓缩胶，混匀。

5)将上层灭菌蒸馏水倾去，用滤纸吸干，将配制好的浓缩胶灌入玻璃板间，插入样品梳。

6)装好电泳系统，加入Tris-甘氨酸缓冲液，拔去样品梳。

7)将已加入SDS-PAGE上样缓冲液的样品在沸水中加热10min，瞬时离心后将样品加入浓缩胶的样品孔中。

8)接通电源，先以稳压80V进行电泳，当溴酚蓝跑出积层胶时，将电压改为120V继续电泳直至溴酚蓝到达合适位置时停止，关闭电源。

9)从电泳系统上卸下胶板，将凝胶剥离下来。

c)蛋白免疫印迹(Western Blot)

1)半干法转膜：将剪成合适大小的6张滤纸和硝酸纤维素膜(NC膜)放入转膜液中浸泡10min，在电转移仪的正极(红色)面上从下至上依次放三层滤纸、NC膜、凝胶和三层滤纸。操作时要避免产生气泡，可用玻璃棒赶走里面的气泡。将半干电转移仪的负极(黑色)小心放上，避免移动。正确连接导线，接通电源，转膜电流按照0.8mA/cm²膜面积设置。根据目的蛋白的分子量设置合适的转膜时间。

2)转膜结束后，将NC膜放入封闭液5％脱脂奶中于室温在摇床上缓缓摇动封闭3h。

3)弃去封闭液，按照抗体说明将一抗按1∶1000稀释于5％脱脂奶中，将NC膜与抗体工作液放入杂交袋中，4℃孵育过夜。

4)将NC膜放入TBST中漂洗3次，每次10min。

5)按照抗体说明将二抗按1∶5000稀释于5％脱脂奶中，将NC膜与抗体工作液放入杂交袋中，于室温在摇床上缓缓摇动孵育1h。

6)将NC膜放入TBST中漂洗3次，每次10min。

7)在暗室中将化学发光底物的A液和B液等体积混合配制成工作液。

8)用镊子将NC膜(转有蛋白的一面向上)放于干净的保鲜膜上，放入显影暗盒，将化学发光底物的A液和B液混合物滴加到NC膜上，用保鲜膜将NC膜盖住。

9)关闭所有敏感光源，在保鲜膜上放一张显影底片，覆盖住NC膜，关闭显影暗盒进行曝光，可根据荧光强度和第一次曝光效果适当调整下次曝光时间。

10)将曝光后的胶片先后放入显影液和定影液浸泡，然后用清水冲洗干净。

一抗为鼠源抗人Aβ单抗A8，抗原识别表位为APP序列中Aβ分子N端的1-6位氨基酸；二抗为辣根过氧化酶标记山羊抗鼠IgG，内参选用GAPDH。Western Blot结果如图7所示。

Claims (10)

1.一种阿尔茨海默病致病基因，其特征在于，其cDNA核酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

2.一种阿尔茨海默病致病基因编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQID NO：2所示。

3.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包含权利要求1所述的阿尔茨海默病致病基因。

4.根据权利要求3所述重组载体，其特征在于，所述重组载体的原始载体为真核表达载体pcDNA3.1，或者腺病毒骨架质粒AdEasy-1和穿梭质粒载体pShuttleCMV。

5.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包含权利要求3所述的重组载体。

6.根据权利要求5所述一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞的原始细胞为腺病毒包装细胞HEK293。

7.一种阿尔茨海默病致病基因的外显子，其特征在于，其核酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。

8.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包含权利要求7所述的阿尔茨海默病致病基因的外显子。

9.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包含权利要求8所述的重组载体。

10.权利要求7所述阿尔茨海默病致病基因的外显子在制备诊断阿尔茨海默病的药物及制备细胞或动物疾病模型中的应用。

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