CN110664815B - 长春花碱iii在制备预防或治疗阿尔茨海默症药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供长春花碱III在制备预防或治疗阿尔茨海默症药物中的应用。研究发现，长春花碱III(CNP)能通过NF‑YB途径增加ADAM10基因转录，增加ADAM10的表达；同时减少BACE1的表达，使APP代谢倾向于非淀粉样途径。动物实验显示，CNP能明显改善AD模型小鼠的空间学习记忆能力和海马依赖性的学习记忆能力，从而为开发预防或治疗阿尔茨海默病等神经性疾病的药物提供了新思路。

Description

长春花碱III在制备预防或治疗阿尔茨海默症药物中的应用

技术领域

本发明涉及长春花碱III的医药用途，具体涉及长春花碱III在制备预防或治疗阿尔茨海默症药物中的应用，属于新药开发技术领域。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer Disease,AD)是最常见的老年痴呆，一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病，临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征，病因迄今未明。随着人口老龄化，我国痴呆的患病率已达8/1000人群，发病率为4％，其中AD患者超过1000万[Reitz,C.and R.Mayeux,Alzheimer disease:epidemiology,diagnostic criteria,riskfactors and biomarkers.Biochem Pharmacol,2014.88(4):p.640-51]。

AD病人的特征性病理改变为β淀粉样蛋白(Aβ)沉积形成的细胞外老年斑、神经元丢失伴随的胶质细胞增生等。关于AD的发病机制，有一系列复杂的遗传及环境因素参与其中，至今仍无定论，众说纷纭，而目前较为广泛接受的是β淀粉样蛋白假说。该假说建立在早发性老年痴呆(early-onset AD)分子水平的研究基础上，提出APP、PS1或PS2基因突变会导致细胞内Aβ蛋白的异常增加，Aβ多聚化形成斑块，Aβ寡聚物通过一系列级联反应最终使得神经元轴突间隙受到损伤，在这个过程中小胶质细胞和星型胶质细胞会被激活，受损的神经元细胞会改变离子通透性(钙离子水平在细胞质中大幅度提高)，同时会引起氧化性损伤，改变激酶磷酸酶活性形成神经纤维丝缠结，最终导致认知障碍。Aβ主要是由淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)经过两条降解途径产生，一条是淀粉样途径，依次经过BACE1(beta site APP-cleaving enzyme 1，β-分泌酶)和γ-分泌酶(PS1)降解；另一条是非淀粉样途径，即经α-分泌酶(a disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 10,ADAM10)及γ-分泌酶降解。概括起来，BACE1促进Aβ产生；相反，ADAM10则抑制Aβ产生。因此，通过抑制BACE1和/或促进ADAM10的活力来减轻Aβ在脑内的沉积，从而减轻AD的病理改变，可能是最有希望治疗AD的方法。

目前，临床上治疗阿尔茨海默病的药物，主要有胆碱酯酶抑制剂(AChE1)、脑代谢改善药和抗氧化抗自由基类药物等。胆碱酯酶抑制剂，如Aricept(donepezil，多奈哌齐)、Exelon(rivastigmine，利斯的敏)、Razadyne(galantamine，加兰他敏)，它们能选择性增强脑皮质和海马等部位乙酰胆碱，明显改善患者的认知功能、日常生活能力，缓解病情严重程度。脑代谢改善药，如吡拉西坦、奥拉西坦等吡咯脘类药物，为GABA的类似物，具有激活、保护和修复脑细胞的作用，能改善脑缺氧、活化大脑细胞、提高大脑中ATP/ADP比值，促进氨基酸和磷酯的吸收、蛋白质合成以及葡萄糖的利用和能量的储存，促进脑代谢，增加脑血流量，加速大脑半球间经过胼胝体的信息传递速度，提高学习记忆及思维活动的能力。抗氧化抗自由基类药物，如褪黑激素、红景天提取物、姜黄素等具有对抗细胞氧化性损伤、降低细胞内钙离子浓度及减少神经细胞死亡的作用，通过减少生物体内自由基的水平，保护细胞和组织免受自由基攻击，避免氧化应激损伤的发生抗淀粉样蛋白通过阻止Aβ的合成和沉淀，可以改善神经元的退变及凋亡。但这些临床上使用的药物有的因疗效不好、有的因其毒副作用而限制了其应用，所以有必要开发出新的治疗阿尔茨海默病的药物。

日本全药工业株式会社在专利WO2008/047952A中公开了一类杂环化合物作为β-淀粉样蛋白沉积抑制剂。中国科学院上海生命科学研究院在专利CN201710384817.7A中公开了一类五羟色胺受体亚型6拮抗剂作为Aβ淀粉样蛋白沉积抑制剂。瑞典阿斯利康有限公司在专利CN 106008355A中公开了一类作为BACE抑制剂的杂环化合物；日本卫材R&D管理有限公司在专利WO2012/098213A中公开了一类可用作BACE抑制剂的稠合氨基二氢噻嗪衍生物；比利时詹森药业有限公司在专利WO2012/117027A中公开了一类BACE抑制剂6，7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-4-基胺衍生物；瑞士霍夫曼-拉罗奇有限公司在专利WO2012/156284A中公开了一类BACE1抑制剂的1,3-噁嗪类化合物；美国伊莱利利公司在专利WO2016/043996A中公开了一种作为BACE抑制剂的四氢吡咯并[3,4-D][1,3]噻嗪衍生物；德国贝林格尔·英格海姆国际有限公司在专利WO2013/134085A中公开了一类BACE1活性抑制剂螺环酰基胍类化合物等。这些药物主要用于治疗阿尔茨海默病的相关症状、与阿尔茨海默病相关的神经变性或痴呆(包括混合型血管和退行性源性的痴呆、早老性痴呆、老年性痴呆和与帕金森病相关的痴呆)。尽管在过去的20多年里，全球各大制药公司相继投入数千亿美元研发新的治疗阿尔茨海默病的药物，但大多已宣告失败。

发明内容

为了解决现有技术中的问题，本发明的目的在于提供长春花碱III在制药领域的应用。

长春花碱III(Conophylline，简称CNP)是一种长春花碱类小分子物质，其分子式为C₄₄H₅₀N₄O₁₀。实验表明，长春花碱III具有抑制子宫内膜癌细胞的黏附和侵袭的作用(lrieT.Kubushiro K。Suzuki K，et a1.Inhibition of attachment and chemotacticinvasion of uterine endometfial cancer cells by a new vinca alkaloid，conophyHine[J].Anficaneer Research，1999，19(4B)：306l-3066.)。其结构如下：

本发明的目的是这样实现的：

本发明提供长春花碱III(CNP)在制备淀粉样蛋白Aβ抑制剂中的应用。所述长春花碱III(CNP)能够抑制淀粉样蛋白Aβ产生或降低淀粉样蛋白Aβ水平。

本发明提供长春花碱III(CNP)在制备淀粉样蛋白Aβ抑制剂中的应用，其特征在于：长春花碱III(CNP)抑制BACE1和/或促进ADAM10的活力来减轻Aβ在脑内的沉积。

长春花碱III在制药领域的应用。具体而言，可以列举例如阿尔茨海默病(家族性阿尔茨海默病和散发性阿尔茨海默病)、老年痴呆、唐氏综合征、帕金森病、克雅氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、糖尿病性神经病、亨廷顿氏病、癫痫、多发性硬化症等。其中，优选为阿尔茨海默病。

长春花碱III(CNP)在制备预防或治疗阿尔茨海默症药物中的应用。本发明具体涉及长春花碱III(CNP)作为制备预防或治疗阿尔茨海默症药物中的应用；作为制备预防或治疗语言运用障碍药物中的应用；作为制备预防或治疗视觉空间障碍药物中的应用；作为制备预防或治疗注意力障碍的药物中的应用；作为制备预防或治疗推理和抽象思维能力障碍的药物中的应用。

本发明具体涉及长春花碱III(CNP)作为制备预防或治疗阿尔茨海默症药物中的应用；作为制备预防或治疗空间和联想学习记忆障碍药物中的应用；作为制备预防或治疗海马依赖性学习记忆障碍药物中的应用。

本发明还提供了治疗患者的阿尔茨海默氏病的方法，所述方法包括：给予需要这种治疗的患者有效量的长春花碱III(CNP)化合物。本发明进一步提供了防止患者的轻微认知损害发展成为阿尔茨海默氏病的方法，所述方法包括：给予需要这种治疗的患者有效量的长春花碱III(CNP)化合物。本发明还提供了抑制患者的淀粉样蛋白Aβ的方法，所述方法包括：给予需要这种治疗的患者有效量的长春花碱III(CNP)化合物。

本发明所使用的长春花碱III(CNP)原料纯度最好是99.0％以上，以重量百分数计。

轻微认知损害定义为：基于临床表现和表现为轻度认知损害的患者随时间推移向阿尔茨海默氏痴呆的进展，与阿尔茨海默氏病相关的痴呆的潜在的有前驱症状的阶段(Morris等人，Arch.Neurol.,58,397-405(2001)；Petersen等人，Arch.Neurol.,56,303-308(1999))。术语“防止轻微认知损害发展成为阿尔茨海默氏病”包括减缓、阻滞或逆转患者的轻微认知损害向阿尔茨海默氏病的发展。

本文使用的术语“治疗”包括限制、减缓、终止或逆转所存在的症状或病症的进展或严重程度。

本文使用的术语“患者”是指人。

本文使用的术语“有效量”是指本发明长春花碱III(CNP)化合物或其可药用盐的数量或剂量，当给予患者单或多剂量时，这种数量或剂量能够为诊断或治疗中的患者提供预期效果。作为本领域技术人员，诊断医生通过利用已知的技术，并且观察在类似情况下所获得的结果，可以容易地确定有效量。在确定患者的有效量的过程中，诊断医生会考虑大量因素，包括但不限于∶患者的种类；年龄和常规健康情况；所涉及的具体疾病或病症；疾病或病症的复杂度或严重程度；个体患者的响应；给予的具体化合物；给药模式；给予的制剂的生物利用度特征；选择的剂量方案；使用的伴随药物；及其它相关的情况。

优选，将本发明的长春花碱III(CNP)化合物配制为药物组合物，通过能够使化合物生物可利用的任何途径给予，包括口服、透皮和肠胃外途径。最优选，口服或透皮给予这样的组合物，尤其优选口服。这样的药物组合物和其制备方法在本领域为大家所熟知，如片剂，滴丸剂，粉剂，颗粒剂，胶囊剂等；注射剂如注射用粉剂，注射用冻干粉等剂型，以上剂型均可以按照常规方法制得。上述剂型优选为口服胶囊剂、片剂和注射剂。

作为以本发明的化合物作为有效成分的制剂或药物组合物的形式，没有特别限定，可以列举例如片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、经口液剂、乳剂、酏剂、柠檬水剂、悬浊剂、糖浆剂、口腔用片剂、经口冻剂、吸入剂、栓剂、注射剂、软膏剂、眼软膏剂、滴眼剂、滴鼻剂、滴耳剂、贴剂、外用液剂等制剂。制剂化中可以使用通常使用的赋形剂、粘合剂、润滑剂、着色剂、矫味矫臭剂和根据需要的稳定剂、乳化剂、吸收促进剂、表面活性剂、pH调节剂、防腐剂、抗氧化剂等，配合通常作为药物制剂的原料使用的成分通过常规方法进行制剂化。例如，在制造经口制剂时，加入本发明的结晶或非结晶化合物和赋形剂并进一步根据需要加入粘合剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、矫味矫臭剂等作为添加剂，然后，通过常规方法制成散剂、细粒剂、颗粒剂、片剂、包衣片剂、胶囊剂等。作为添加剂，可以列举例如：大豆油、牛脂、合成甘油酯等动植物油；液体石蜡、角鲨烷、固体石蜡等烃；肉豆蔻酸辛基十二烷基酯、肉豆蔻酸异丙酯等酯油；鲸蜡硬脂醇、山嵛醇等高级醇；有机硅树脂；硅油；聚氧乙烯脂肪酸酯、脱水山梨醇脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯硬化蓖麻油、聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物等表面活性剂；羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、聚丙烯酸、羧基乙烯基聚合物、聚乙二醇、聚乙烯基吡咯烷酮、甲基纤维素等水溶性高分子；乙醇、异丙醇等低级醇；甘油、丙二醇、二丙二醇、山梨醇等多元醇；葡萄糖、蔗糖等糖；无水硅酸、硅酸铝镁、硅酸铝等无机粉体、纯化水等。作为赋形剂，可以使用例如乳糖、玉米淀粉、白糖、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇、结晶纤维素、二氧化硅等，作为粘合剂，可以使用例如聚乙烯醇、聚乙烯醚、甲基纤维素、乙基纤维素、阿拉伯胶、黄芪胶、明胶、结冷胶、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、聚丙二醇·聚氧乙烯·嵌段聚合物、葡甲胺等，作为崩解剂，可以使用例如淀粉、琼脂、明胶粉末、结晶纤维素、碳酸钙、碳酸氢钠、柠檬酸钙、糊精、果胶、羧甲基纤维素·钙等，作为润滑剂，可以使用例如硬脂酸镁、滑石、聚乙二醇、二氧化硅、硬化植物油等，作为着色剂，可以使用允许添加到医药品中的着色剂，作为矫味矫臭剂，可以使用可可粉、薄荷脑、芳香散、薄荷油、龙脑、桂皮粉末等。在制造片剂或颗粒剂时，可以包覆糖衣，此外可以根据需要进行适当包衣。另外，在制造糖浆剂、乳剂、酏剂、柠檬水剂、悬浊剂、注射用制剂等液剂时，可以在本发明的化合物进一步根据需要添加pH调节剂、溶解剂、乳化剂、分散剂、等渗剂等、助溶剂、稳定剂等作为添加剂并通过常规方法进行制剂化。制造外用剂时的方法没有限定，可以通过常规方法制造。即，作为制剂化时使用的基剂原料，可以使用医药品、医药部外品、化妆品等中通常使用的各种原料。作为使用的基剂原料，具体而言，可以列举例如动植物油、矿物油、酯油、蜡类、高级醇类、脂肪酸类、硅油、表面活性剂、磷脂类、醇类、多元醇类、水溶性高分子类、粘土矿物类、树脂、塑料、橡胶等非水溶性的天然或合成高分子化合物、纯化水等原料，进而，可以根据需要添加pH调节剂、抗氧化剂、螯合剂、防腐防霉剂、着色料、香料等，但本发明的外用剂的基剂原料不限于此。另外，还可以根据需要配合具有分化诱导作用的成分、血流促进剂、杀菌剂、消炎剂、细胞激活剂、维生素类、氨基酸、保湿剂、角质溶解剂等成分。另外，上述基剂原料的添加量为达到通常外用剂的制造时设定的浓度的量。

有益效果

本发明首次通过实验证明，长春花碱III(CNP)可以在人的神经细胞系上降低淀粉样蛋白Aβ产生，由于在病人脑脊液中，Aβ的浓度变化早于tau蛋白水平的改变，淀粉样蛋白沉积也早于临床症状的出现，考虑到从Aβ小肽聚集到斑块形成是Aβ浓度依赖的，找到降低Aβ浓度的方法对于治疗而言就显得非常重要。因此，长春花碱III(CNP)降低Aβ产生及相关机制的揭示可为阿尔茨海默症的治疗及进一步的药物研发提供临床实验的指导意义。本发明研究发现，长春花碱III(CNP)能通过NF-YB途径增加ADAM10基因转录，增加ADAM10的表达，同时减少BACE1的表达，使APP代谢倾向于非淀粉样途径。在进一步的动物实验中发现，长春花碱III(CNP)能明显改善AD模型小鼠的空间学习记忆能力和联想学习记忆能力。CNP可以通过多靶点作用拮抗AD的病理机制，而且CNP的脂溶性较高，其LogP(分配系数)值为4.49，可以透过血脑屏障，具有很大的开发应用价值。

附图说明

图1是CNP在多种细胞中促进ADAM10表达的结果图；其中SH-SY5Y(A)、HEK293(B)和HT22细胞(C)用不同浓度CNP(0、50、100和200ng/mL)处理24h后，Western bloting(WB)检测ADAM10蛋白表达，(D)RT-PCR检测ADAM10mRNA表达，E、F、G分别为A、B、C的统计图，*P<0.05，**P<0.01。

图2是CNP对ADAM10不同启动子区荧光素酶活性分析结果图，其中(A)将ADAM10启动子区(-508～-300)截成不同片段后构建质粒，(B)将以上不同片段质粒转染HEK293细胞，100ng/mlCNP处理24h，检测荧光素酶活性，pGL4.17为阴性对照，pGL4.51为阳性对照，**P<0.01。结果显示：-508～-300核苷酸序列介导了CNP的作用。

图3是CNP通过转录因子NFYB调节ADAM10结果图，HEK293细胞转染不同转录因子的siRNA(siUSF1、siSP1或siNF-YB)24h，然后100ng/mlCNP再处理24h，Western检测相关蛋白的表达；其中A：药物干预后WB检测SP1、USF1、NF-YB蛋白表达，B：转染siUSF1后WB检测ADAM10、USF1蛋白表达，C：转染siSP1后WB检测ADAM10、SP1蛋白表达，D：转染NF-YB后WB检测ADAM10、NF-YB蛋白表达，E、F、G、H分别为A、B、C、D的统计图，*P<0.05，**P<0.01。结果显示：NF-YB(而不是USF1或者SP1)介导了CNP的作用。

图4是CNP减少了APP的淀粉样蛋白途径降解结果图，其中A：HEK-APP细胞用100ng/ml CNP处理24h，WB检测APP代谢；B：Y5Y细胞用100ng/ml CNP处理24小时，qPCR检测BACEmRNA；C：为A的统计图；*P<0.05，**P<0.01。结果：CNP减少了Aβ产生的相关过程。

图5是CNP改善了APP/PS1小鼠病理改变结果图，ADAM10，BACE1，APP蛋白在小鼠海马表达水平；其中A图为WB条带，B图为A图的统计图.数据显示为均值±标准差，*P<0.05。结果提示CNP增加ADAM10并减少BACE1蛋白，与离体细胞试验结果一致。

图6是CNP改善APP/PS1小鼠学习和记忆结果图，A、B、C Morris水迷宫实验结果，其中A为定位航行实验中小鼠到达平台所使用的时间(Escape latency，逃避潜伏期)，B、C分别为空间搜索实验中小鼠穿越原隐藏平台位置次数和小鼠在原平台所在象限探索时间，D、E为场景恐惧(联想学习记忆能力的检测指标)实验结果，D为小鼠静止不动时间，E为小鼠静止不动次数，F为小鼠筑巢实验评分，数据显示为均值±标准，ns：无统计学意义，*P<0.05，**P<0.01(n＝6)。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行具体描述，在此指出以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术熟练人员可以根据上述发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。本发明原料及试剂均为市售产品。长春花碱III(Conophylline，简称CNP)购买自云南西力(中国)公司，DMSO(Dimethylsulfoxide,二甲基亚砜)购自中国北京索莱宝科技有限公司。HEK293细胞来自于中科院细胞库；SH-SY5Y细胞来自于中科院细胞库；HT22细胞来自于中科院细胞库；HEK-APP细胞来自于重医神经病学实验室。ADAM10兔抗人单抗、APP/CTF兔抗人单抗和BACE1兔抗人单抗购买自美国Abcam公司；SP1小鼠抗人单抗、USF1兔抗人单抗和NF-YB小鼠抗人单抗购买自美国杉塔公司；GAPDH小鼠抗人单抗购买自武汉三鹰公司；ECL化学发光液购买自美国Themro公司。siRNA购买自中国吉玛基因公司。培养基、胎牛血清和Opti-MEM均购买自Gibco公司(美国)。pGL4.51[luc2/CMV/Neo]、pGL4.17[luc2/Neo]质粒均购买自美国Vector Promega公司。HiScript II Q RT super Mix购买自南京诺唯赞生物科技有限公司，PCR引物购买自中国生工公司，SYBR Premix Ex Taq II购买自日本Ta KaRa公司。

实施例1细胞实验

CNP通过NF-YB途径增加增加ADAM10的表达

人胚肾细胞HEK293、人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y、小鼠海马神经元细胞HT22接种于6孔板，HEK293细胞每孔2×10⁵个，Y5Y细胞每孔4×10⁵个，HT22细胞每孔2×10⁵个，待HEK293和HT22细胞的细胞融合率为60％-70％左右、Y5Y细胞的细胞融合率为80％-90％左右，加药处理24h，加药浓度分别为0ng/ml,50ng/ml,100ng/ml,200ng/mL。实验验证100ng/mL浓度安全且稳定有效，后续实验均选择100ng/mL作为药物处理浓度。

为了验证转录和蛋白水平的表达，进行RT-PCR及免疫印迹(WB)实验，具体实验操作：

RT-PCR

RNA提取：1mL RNAiso Plus/每孔(6孔板)，每管分别加入200uL氯仿，剧烈震荡，离心后将最上层吸入EP管内，加入500ul异丙醇，静置10min。之后将其置于4℃离心机中12000g离心10min，离心后留底部沉淀，弃上清，并加入1mL 75％乙醇，离心4℃、7500g5min。弃上清，室温5-10min，加20-50ul DEPC(视沉淀量及所需浓度调整)。EP管55-60℃水浴10-15min，取1ul测量RNA浓度及纯度，剩余RNA储存-80℃。

RNA质量鉴定：取RNA 5ul做琼脂糖凝胶电泳。若28S处条带的亮度为18S条带亮度的2倍，则表示RNA质量合格。OD260/OD280在1.7-2.1之间为纯度合格。

RT-PCR：根据所测RNA浓度计算所需RNA量，按以下体系加至200uLEP管中(冰上进行)。反应组分：5×No RT Mix 2ul，模板RNA 500ng，RNase-Free H2O补齐至10ul。

PCR仪行RT-PCR反应，结束得到cDNA行荧光定量PCR，剩余保存于-20℃。反应程序：

25℃ 10min

42℃ 30min

85℃ 5min。

实时定量PCR(RT-PCR)：使用

Premix Ex Taq^TMII试剂操作步骤设置参数，反应程序：

RT-PCR引物见如下：

(4)实验结果用2-△△CT法计算。

蛋白印迹(WB)

细胞在处理24小时后，用冰的PBS洗两遍，于冰上加入适当体积的细胞裂解液，用细胞刮将细胞刮下来加入离心管，97℃水浴煮沸5min。然后用细胞超声粉碎机将细胞打碎，4℃低温离心10min。然后按BSA试剂盒说明书操作进行蛋白的定量，计算出WB样品的上样量。使用8％分离胶和4％浓缩胶，将3ul蛋白预染Marker和10ul蛋白样品量分别加入相应泳道。先用80V约20min使其到达下层胶，然后120V约60min，使溴酚蓝到达分离胶底部后停止电泳，然后400mA恒流转膜30min，转膜结束后，室温用5％脱脂奶粉封闭1h。封闭结束后的膜TBST(Nacl 8.76g+Tris base 2.44g+Tween20 500ul)清洗三次后放入事先配好的相应的一抗稀释液中，4℃缓慢摇动孵育。16-20小时后将膜用TBST液清洗3次后，放入用封闭液按1:5000稀释二抗中，室温缓慢摇动孵育1h。再将膜用TBST洗3次，ECL化学发光液A和B按1:1比例混匀，均匀滴加到膜上，Fusion成像系统扫描分析，然后用quantity one软件分析各个条带的分度值，并统计。结果显示，CNP 100ng/ml对SH-SY5Y、HEK293、HT22细胞ADAM10的mRNA和蛋白水平均有促进作用，ADAM10蛋白较对照组增加分别约为2.8、1.7、2.8倍，Y5Y细胞干预后ADAM10mRNA增加约2.8倍(图1)。

为了探究CNP对ADAM10启动子的作用及相关机制，发明人利用ADAM10核心启动子区不同长度的片段进行荧光素酶活性分析。具体实验步骤：HEK293铺96孔板，每孔3000个细胞及加入100uL10％FBS培养基，37℃、5％CO2敷箱过夜。第二天待融合率为60％左右时，按照Lipo2000操作手册转染96孔板，将5个不同片段的质粒、阴性对照质粒pGL4.17和阳性对照质粒pGL4.51转染HEK293细胞，质粒量为700ng，于转染24h后，把药物溶于培养液中，浓度为CNP 100ng/ml，按200ul/每孔加入上述含药物的培养液，继续培养。药物处理24h后，Luciferase Assay Substrate化学发光剂(避光)按照与培养基1：1浓度加入每孔。96孔板中每孔加入100uL的Steady-

试剂和100uL的Steady-

试剂，避光常温放置30-60分钟后，用GloMax-96检测仪测荧光素酶活性。取3个复孔均值，同时参考阳性对照、阴性对照结果，独立重复三次实验进行数据计算。结果显示，CNP对转染了pGL4.17-ADAM10-E/E1/E2的HEK293细胞，具有荧光素酶活性增强的作用，其中ADAM10-E片段的趋势最明显(图2)，较阴性对照组上升约2倍。这说明CNP对ADAM10的调控位点很有可能集中在ADAM10转录起始位点以前的-508—-300区域。ADAM10核心启动子区-508—-300片段上，主要有SP1，USF，CAAT-Box三个转录因子的结合位点。将100ng/mL的CNP处理HEK293细胞24h，WB检测SP1、USF1及ADAM10蛋白表达水平。结果发现CNP对SP1和USF1的蛋白表达无影响，而且采用SiRNA方法成功下调两种蛋白水平后，CNP对ADAM10的增高作用并未受到影响(图3)，说明CNP对ADAM10的调控并非通过SP1、USF1与ADAM10的相互作用实现。在ADAM10启动子(-508—-467)区域有一个CCAAT框。已知C/EBP、HITF2A、NF-Y都是可结合CCAAT框的转录因子，而核因子Y(NF-Y)作为真核生物中进化保守的转录因子，识别启动区上CCAAT框的作用最明显。NF-Y对基因可发挥转录激活或抑制双重作用，NF-YB是NF-Y的三种亚基之一，将100ng/mL的CNP处理HEK293细胞24h，WB检测NF-YB蛋白表达水平，结果显示CNP干预组NF-YB较对照组上升约1.8倍，运用RNAi技术下调NF-YB，具体实验步骤：

1.选用传代数少，存活率高的Hek293细胞进行siRNA转染。镜下观察状态，密度按1×105个/孔铺12孔板、每孔加入1mL培养基，37℃、5％CO2敷箱培养。

2.铺板24h后融合率约为70％进行siRNA转染，按照说明书计算每孔需要加入的Lipofectamine 2000的量，12孔板所用Lipofectamine为2.5ul/孔，siRNA进行浓度梯度确定最终所用siRNA量均为30pmol/孔。所用的siRNA序列为：SP1-siRNA(5’-3’)：

Sense:UUCUCCGAACGUGUCACGUTT

Antisense:ACGUGACACGUUCGGAGAATT

USF 1-siRNA(5’-3’)：

Sense:GCUGGACAAUGACGUCCUUTT，

Antisense:AAGCACGUCAUUGUCCAGCTT

NF-YB-siRNA(5’-3’)：

Sense:GCUUCUCAACUAGGAAUCUTT Antisense:

AGAUUCCUAGUUGAGAAGCTT。

3.转染24h后换为新鲜培养基；按如下分组加CNP 100ng/ml处理细胞：

4.加药处理24h后，提蛋白并通过WB(同前操作)检测ADAM10等指标表达情况。通过上述实验，具有如下实验结果:WB检测到敲低NF-YB后ADAM10的蛋白水平显著下降，约降至非敲低组的40％(图3)，CNP对ADAM10的促进作用被抑制，而敲低SP1、USF1没有阻断CNP对ADAM10的促进作用，说明CNP通过NF-YB发挥对ADAM10的调控功能。

CNP减少了APP的淀粉样蛋白途径降解

稳定过表达APP的HEK细胞HEK-APP细胞接种于6孔板，待细胞融合率为60％-70％左右，加药处理，加药浓度为100ng/mL。药物作用HEK-APP细胞24h后，采用WB(同前操作)检测APP总蛋白、APP淀粉样降解途径产物不可溶性sAPPβ、β-CTF和非淀粉样途径产物sAPPα、α-CTF，以及BACE1表达情况。实验结果显示，APP总蛋白无明显改变，但CNP明显减少了BACE1、sAPPβ、β-CTF蛋白水平，BACE1约下降至对照组的42％，sAPPβ约下降至对照组的40％，β-CTF约下降至对照组的68％。相反CNP明显增加了sAPPα、α-CTF蛋白水平，分别较非药物干预组增加约1.8倍及2.5倍(图4A、C)。

Y5Y细胞接种于6孔板，待细胞融合率为70％-80％左右，加CNP100ng/mL作用36h后，提取RNA进行RT-PCR(操作同前，引物如下：BACE1：Sense 5’-TCTGTCGGAGGGAGCATGAT-3’

Antisense 5’-GCAAACGAAGGTTGGTGGT-3’

GADPH：Sense 5’-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3’

Antisense 5’-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3’)，结果显示药物干预组BACE1mRNA下降至非干预组的78％左右，以上结果说明CNP减少了APP的淀粉样蛋白途径降解，增加了非淀粉样蛋白途径降解，而且CNP对BACE1的调控作用定位在转录水平(图4B)。

实施例2动物实验

实验动物：实验所用APP/PS1转基因小鼠，同窝野生型小鼠均为繁殖所得，其亲代购买于美国JACKSON实验室。小鼠饲养于重庆医科大学SPF转基因小鼠代养室，所有动物饲养过程均参照《中国实验动物管理条例》。所有的动物实验均严格遵守1995年中国神经科学协会颁布的《动物使用政策》。

实验方法

实验分为四组：WT+CTRL，WT+CNP，AD+CNP，AD+CNP。

Conophylline(简称CNP)药物处理方法：6月龄AD鼠与同龄的WT的实验组用1μg/KgCNP隔天同一时间腹腔注射一次，对照组小鼠等量的DMSO(Dimethyl sulfoxide,二甲基亚砜)注射，连续注射2个月。

Western Blotting

组织蛋白提取：从每个组织(皮层/海马)样本中取约0.5g，放入1.5ml离心管中，并置于冰上待用；在冰上向每个组织样品中加入400ul预先配好并解冻的组织裂解液；用组织匀浆器匀浆组织，使其充分裂解。4℃低温离心12000rpm 15min，离心后吸取上清液于新的离心管中，冰上放置；蛋白浓度测定：同前。根据各样品的容积，按1:1加入2X上样缓冲液buffer，煮沸10min。-80℃保存待用。

Western Blotting具体实验步骤同实施例1。

Morris水迷宫方法

为了排除外界环境因素干扰，在行为学实验开始前1周，将小鼠从实验动物中心取出置于行为学实验室，使其适应新环境。实验第一天，先进行运动能力测试，排除游泳能力缺陷的小鼠。Morris水迷宫22℃-25℃的恒温游泳池有东南西北4个象限，平台所在象限为第4象限，直径为8cm。整个游泳池颜色呈黑色，直径1.2米。Morris水迷宫测试包括前5天的平台试验和第6天的探测试验。在平台试验时，将软件设置成探索最长时间为60s，平台停留时间为5s。同时为了排除颜色干扰，用白色食用色素将水染成白色，以便摄像追踪系统对黑色小鼠的识别。小鼠面向水池边缘入水，待其找到平台。若未能在60s内找到平台，试验者引导其找到平台并使其在上停留10s。每个象限依次进行，小鼠进行下一象限试验间期时间维持在30min以上。连续训练5天完成平台试验。此后撤掉平台，进行探索试验。所有小鼠从第2象限入水。视频追踪系统记录，软件分析，统计平台试验中的上台潜伏期，及探索试验中的第四象限探索时间及路程和平台穿越次数。

场景恐惧实验方法

场景恐惧实验按3天的常规测试方法。在实验第一天，小鼠先在训练室适应环境120秒，然后再接受一个30秒声音刺激(2800赫兹，85分贝，30秒)，最后2秒同时接受足电刺激(0.45mA，2秒)，此后又有120s的适应期。此过程重复3次。在实验第二天，小鼠仅置于训练室中，但无任何刺激。最后一天，小鼠在120s的适应期后仅接受一个30秒声音刺激不伴有电刺激。每只小鼠实验结束后用70％的乙醇清洗训练室以减少小鼠的气味干扰。视频追踪系统记录和分析各只小鼠的凝滞时间和凝滞次数。

实验数据统计与分析

所有数据来源于三次独立的重复实验，以X±s表示，用GraphPad软件，进行数据统计。两个独立样本间的比较,用独立样本t检验，两个以上样本间的比较，采用one-wayANOVA with Dunnett’s multiple comparison test检验。P<0.05为差异具有统计学意义。使用GraphPad Prism 5及CorelDRAW X4软件绘图。

通过上述实验，发现CNP改善了APP/PS1小鼠病理改变，改善了APP/PS1小鼠学习记忆能力。具体情况如下。

选取同质的6月龄的WT和APP/PS1小鼠，以CNP1μg/Kg腹腔注射，隔天一次，连续2月，然后提取小鼠海马脑组织蛋白进行western blot、进行水迷宫和场景恐惧实验、筑巢实验。WB结果表明CNP增加了APP/PS1小鼠的ADAM10蛋白水平，减少了APP/PS1小鼠的BACE1的蛋白水平(图5)，减少了APP的β淀粉样途径降解途径，与体外细胞水平实验结果一致。

在平台试验中，发现CNP处理组APP/PS1小鼠的逃避潜伏期明显少于对照组APP/PS1小鼠，平均少约7.57秒(图6A)。在探索试验中，发现CNP处理组APP/PS1小鼠穿越平台平均约2次，而对照组APP/PS1小鼠平均仅有0.2次，两者之间存在显著差异(图6B)。CNP处理组APP/PS1小鼠在平台所在象限探索的时间明显较对照组APP/PS1小鼠长约9.8秒，且接近于WT组小鼠(图6C)，而WT组的处理组较对照组无明显差异。这些结果提示药物处理以后APP/PS1小鼠的空间学习记忆能力得以改善。

各组小鼠在水迷宫实验以后休息了1周，再进行场景恐惧实验。在第二天适应和第三天仅有条件刺激存在下，发现药物处理组APP/PS1小鼠较对照组小鼠发生凝滞的平均时间长约100秒，发生凝滞的平均次数多约14次，接近于WT小鼠水平(图6D、6E)。这一结果说明药物处理改善了APP/PS1小鼠的海马依赖性的学习记忆能力。

筑巢行为的完成度与海马的功能密切相关，进行筑巢实验的结果显示APP/PS1小鼠的筑巢行为评分显著低于WT小鼠，而药物处理组的APP/PS1小鼠的筑巢行为评分为2.6分，高于未药物干预组的1.6分，有显著差异，而WT组的处理组较对照组无明显差异(图6F)。

上述实验显示，CNP在视觉空间障碍、注意力障碍、思维能力障碍、学习记忆障碍等方面有明显的改善作用，具有作为制备预防或治疗语言运用障碍药物、视觉空间障碍药物、注意力障碍的药物、推理和抽象思维能力障碍的药物开发的潜能；尤其是用于预防或治疗空间和联想学习记忆障碍药物和海马依赖性学习记忆障碍药物的开发。

Claims (6)

1.长春花碱III在制备预防或治疗阿尔茨海默症药物中的应用：所述长春花碱III能够抑制淀粉样蛋白Aβ产生或降低淀粉样蛋白Aβ水平；所述长春花碱III抑制BACE1和/或促进ADAM10的活力来减轻Aβ在脑内的沉积。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述长春花碱III能够预防或治疗语言运用障碍；所述长春花碱III能够预防或治疗视觉空间障碍；所述长春花碱III能够预防或治疗注意力障碍；所述长春花碱III能够预防或治疗推理和抽象思维能力障碍。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述长春花碱III能够预防或治疗空间和联想学习记忆障碍；所述长春花碱III能够预防或治疗海马依赖性学习记忆障碍。

4.如权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于：所述长春花碱III原料纯度是99.0％以上，以重量百分数计。

5.如权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于：将长春花碱III化合物配制为药物组合物，通过能够使化合物生物可利用的任何途径给予，选自口服或肠胃外途径。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述药物组合物选自片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、酏剂、柠檬水剂、栓剂、注射剂、软膏剂、贴剂。

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