CN116970566B - 诱导间充质干细胞神经分化的方法、神经干细胞及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开诱导间充质干细胞神经分化的方法、神经干细胞及用途。该方法包括利用电信号和化学信号诱导间充质干细胞，从而诱导所述间充质干细胞向神经分化。本发明解决了现有技术中诱导干细胞神经分化依赖于诱导剂及生长因子、效率低、组成复杂、靶向性低、易逸散的问题。同时本发明的制备方法简单，可控性强，不添加神经营养因子，较其他神经复合物诱导的方法更加简便、可控、效果明确。此外，本发明能够解决大量神经干细胞来源不足的问题，为开发种子细胞提供新来源，从而用于神经干细胞的工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及神经组织再生技术领域，特别是高效神经分化诱导方法，具体涉及诱导间充质干细胞神经分化的方法、神经干细胞及用途。
背景技术
在临床工作中，周围神经损伤(peripheral nerve injury, PNI)发病率和致残率高、恢复周期长，造成严重的社会和经济负担。据流行病学统计，周围神经损伤约占创伤患者的2.8%，国内每年新增病例30万-50万。将干细胞诱导分化为功能性神经元，进而细胞移植是突破神经缺损修复中大量神经元来源瓶颈的重要发展方向。然而，干细胞来源有限、神经诱导分化效率低，极大的限制了其临床应用。同时神经干细胞移植技术需要足够数量的内源性神经干细胞，存在神经干细胞来源不足和供区手术缺损的问题。目前提高成体干细胞神经分化效率主要通过多种化学诱导剂及生长因子混合诱导，效率低、组成复杂、靶向性低、易逸散，且脑源性神经营养因子不能透过血脑屏障，存在给药途径和给药安全性问题。
基于组织的电学特性，电学微环境因其安全有效、动态可调控性在组织再生领域受到广泛关注。课题组前期研究表明电学微环境可通过机械传导参与干细胞命运的调控。电刺激作为一种广泛使用的神经诱导手段，其促进间充质干细胞神经分化的早期效果得到了充分论证，但长期效果不佳，可能是由于电信号激活细胞分泌纤连蛋白形成细胞骨架，对干细胞成骨、成脂、成神经等多向分化命运均有促进作用，使得基质电刺激诱导牙源性干细胞神经长期分化效率不足。
因此，开发一种高效、高特异性、高靶向性的神经诱导分化策略是取得临床技术突破的关键。
背景技术中的信息仅仅在于说明本发明的总体背景，不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明提供一种电信号联合化学信号调控的神经再生诱导方法，同时该方法具有快速、侵袭性和人工干预更小、副作用更少的优势。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的第一方面，提供一种诱导间充质干细胞神经分化的方法，其包括利用电信号和化学信号诱导间充质干细胞，从而诱导所述间充质干细胞向神经分化。
在某些实施方案中，根据本发明所述的诱导间充质干细胞神经分化的方法，其中，所述电信号和所述化学信号先后或同时诱导。
在某些实施方案中，根据本发明所述的诱导间充质干细胞神经分化的方法，其中，所述电信号来源于电活性材料的物理电刺激，其中，所述电活性材料包括铁电高分子聚合物和/或无机铁电材料。
在某些实施方案中，根据本发明所述的诱导间充质干细胞神经分化的方法，其中，所述电活性材料具有不低于5pCN-1的d33压电常数，优选不低于10 pCN-1，更优选不低于15pCN-1，如不低于20 pCN-1。
在某些实施方案中，根据本发明所述的诱导间充质干细胞神经分化的方法，其中，所述化学信号是指使用化学试剂抑制YAP蛋白进入细胞核通路信号。
在某些实施方案中，根据本发明所述的诱导间充质干细胞神经分化的方法，其中，所述化学试剂包括Cyto D、Blebbistatin、Vertepofin和XAV939中的至少一种或其组合。
在某些实施方案中，根据本发明所述的诱导间充质干细胞神经分化的方法，其中，所述间充质干细胞为牙源性间充质干细胞。
本发明的第二方面，提供一种神经干细胞，其通过第一方面所述的方法分化得到。
本发明的第三方面，提供一种药物组合物，其包含本发明所述的神经干细胞。
本发明的第四方面，提供本发明所述的神经干细胞在用于制备神经再生治疗的药物中的用途。
本发明解决了现有技术中诱导干细胞神经分化依赖于诱导剂及生长因子、效率低、组成复杂、靶向性低、易逸散在非目标位点产生副作用的问题。同时本发明所采用的制备方法简单且成本低，可控性强，不添加神经营养因子，较其他神经复合物诱导的方法更加简便、可控、效果明确。此外，本发明有望解决大量神经干细胞来源不足的问题，为开发种子细胞提供新来源，从而为神经干细胞的工业化生产提供了可能性。
本发明进一步解决了电刺激信号诱导干细胞神经分化的长期效果不佳的难题，能够避免供区二次创伤，且自体来源有效避免免疫排斥。此外，本发明中电信号联合化学信号能够协同促进干细胞神经分化效率并提高间充质干细胞神经向分化特异性。
附图说明
图1示出了在无谱系特异性诱导刺激的情况下，复合膜材料的表面电荷有利于启动神经分化，但其长期作用不佳。图1的e图中，从左至右各柱依次代表NC-8d和C-8d，图1的g图中，从左至右各柱依次代表NC和C。
图2示出了复合膜材料的表面电荷持续激活机械转导信号通路。
图3示出了抑制YAP/β-catenin机械转导信号轴并促进脱落乳牙牙髓干细胞(SHED)长效神经分化的分子机制。
图4示出了本发明的方法能够诱导多种类型干细胞神经分化。图4中，从左至右各柱依次代表常规培养基、添加有Verteporfin的培养基。
图5为不同靶点分别抑制FAK-YAP信号通路后干细胞成骨分化情况。图5中，从左至右各柱依次代表常规培养基、添加有各种抑制剂的培养基。
图6示出了添加XAV939后，SEHD神经分化效率提高以及被激活的信号通路。图6的a图和b图中，从左至右各柱依次代表常规培养基Normal-2d、XAV939-2d、Normal-8d、XAV939-8d。
图7示出了添加Cyto D后，SEHD神经分化效率提高以及被激活的信号通路。图7的a图和b图中，从左至右各柱依次代表常规培养基Normal-2d、Cyto D-2d、Normal-8d、Cyto D-8d。
图8示出了添加Blebbistatin后，SEHD神经分化效率提高以及被激活的信号通路。图8的a图和b图中，从左至右各柱依次代表常规培养基Normal-2d、Ble-2d、Normal-8d、Ble-8d。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
诱导间充质干细胞神经分化的方法
本发明的第一方面，提供一种诱导间充质干细胞神经分化的方法，该诱导方法为体外方法，包括在体外利用电信号和化学信号诱导间充质干细胞，从而诱导所述间充质干细胞向神经分化。
本发明通过研究发现，电信号和化学信号能够协同提高或促进间充质干细胞向神经分化，因此，本发明所用术语“诱导间充质干细胞神经分化”还包括以下情形：提高或促进间充质干细胞向神经分化、提高或促进间充质干细胞向神经分化的特异性、促进或提高间充质干细胞神经分化效率、增加或提高神经干细胞的数量等。
本发明通过前期研究发现，单独使用电信号或者化学信号并不能持续地诱导间充质干细胞向神经干细胞定向分化，例如在使用电信号诱导间充质干细胞神经分化时，虽然在前期(诱导6h)能够检测到部分分化的神经干细胞，但随着时间推移，在诱导8d后，分化效率大大下降，而这种情况在联合电信号和化学信号进行诱导后得到了显著改善，神经分化进一步增强的同时几乎检测不到成骨相关基因。电信号和化学信号进行诱导的顺序不特别限定，可以先后诱导或同时诱导。
本发明中，所述电信号来源于电活性材料的物理电刺激。优选地，电活性材料具有不低于5pCN-1的d33压电常数，还优选为5-40pCN-1，进一步优选为5-35pCN-1，例如5、10、15、20、25、30、35pCN-1。
在一个优选的实施方案中，电活性材料具有0.4-1.2V之间的表面电势，还优选为0.5-1.2V，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2V。
本发明中，电信号作用时间不低于15min，优选不低于2h，还优选不低于6h，例如不低于12h、1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d、9d、10d等。
虽然在具体实施方案使用了BaTiO3/P(VDF-TrFE)铁电纳米复合膜材料，但本领域技术人员可理解的是，任何能够提供电信号作用的铁电高分子聚合物和/或无机铁电材料均在本发明的保护范围之内。无机铁电材料的实例包括但不限于钛酸钡、钛酸锶钡、钛酸锶、铁酸铋、铌酸钾钠和铌酸锂中的一种或多种。铁电高分子聚合物不特别限定，包括聚偏氟乙烯或其共聚物，其实例包括但不限于聚偏二氟乙烯、聚偏氟乙烯-六氟丙烯和聚偏氟乙烯-三氟乙烯和聚乳酸。
可使用例如CN115252872A、CN114904054A、CN104208754A、CN115286883A和CN115282345A中所公开的材料，其内容通过引用整体并入本文。
本发明中，化学信号是指使用化学试剂，特别是小分子抑制剂抑制YAP蛋白进入细胞核通路信号，本发明人的在先研究已经表明，电信号作用持续激活机械转导信号通路是干细胞神经分化长效性不佳的原因，而在本发明中，通过使用抑制剂抑制YAP/β-catenin机械转导信号轴促进了干细胞长效神经分化。
在一个优选的实施方案中，本发明所使用的化学试剂包括Cyto D、Blebbistatin、Vertepofin和XAV939中的至少一种或其组合。
本发明中，所述间充质干细胞是指具有多向分化能力的多能干细胞，其能够分化为脂肪、骨、软骨、神经细胞等。在一个优选的实施方案中，间充质干细胞为牙源性间充质干细胞，例如牙龈间充质干细胞(GMSC)、脱落乳牙牙髓干细胞(SHED)。在另一个优选的实施方案中，间充质干细胞为非牙源性间充质干细胞，例如BMSC。
基于同一发明构思，本发明还提供一种制备神经干细胞或神经细胞的方法，从而用于医药用途，其包括利用电信号和化学信号诱导间充质干细胞，从而诱导所述间充质干细胞向神经分化。
分离的神经干细胞
本发明的第二方面，提供一种分离的神经干细胞，其通过本发明所述的方法经分化得到。术语“分离的”当用于描述一个或多个神经干细胞时是指已经从它们的天然环境中分离出来的一个或多个细胞，包括从细胞起源的对象(例如受试者)中分离，和/或从天然环境中的一种或多种其它组分(例如碎片、组织、组织聚集体和其它细胞)中分离。
在体外获得或在体外培养的生物实体的神经干细胞及其后代(例如神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞)也涵盖在本发明的保护范围之内。
药物组合物
本发明还提供一种药物组合物，其包含本发明所述的神经干细胞和药学上可接受的载体。本领域技术人员可以理解的是，神经干细胞包括分化的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。
“药学上可以接受的载体”指的是一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且具有足够的纯度和足够低的毒性。药学上可以接受的载体部分实例包括但不限于氯化钠、葡萄糖、乳酸钠、明胶、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、稳定剂、抗氧化剂等。
用途
本发明提供神经干细胞在用于制备神经再生治疗药物中的用途，其中，神经再生治疗药物用于神经系统病变疾病或周围神经损伤相关病症，所述神经系统病变疾病包括但不限于脑神经损伤、脊髓损伤、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化症、脑卒中等。
实施例1
本实施例示出了通过电信号联合化学信号诱导间充质干细胞神经分化的方法，其中电信号来源于电活性材料的物理电刺激，以下仅以BaTiO3/P(VDF-TrFE)铁电纳米复合膜材料进行示例性说明，本领域技术人员基于该教导，可以使用任何其它能够提供物理电刺激的材料。
1. 带电BaTiO3/P(VDF-TrFE)铁电纳米复合膜材料的制备
称取0.30g盐酸多巴胺粉末，加入120ml去离子水中，搅拌均匀后加入6.00g纳米碳酸钡粉末，置于60℃恒温磁力搅拌器上，水浴加热，搅拌至少12小时。静置溶液至出现明显分层，用巴氏管吸弃上清，加入30ml无水乙醇，常温搅拌30分钟。静置溶液，待其出现明显分层后，吸弃上清，加入30ml去离子水，常温搅拌30分钟。重复以上操作，至最后一次加入去离子水搅拌，静置分层后，上清澄澈无明显浑浊。吸弃上清，将经过盐酸多巴胺改性的BaTiO3纳米颗粒(BTO)置于55℃恒温真空干燥箱中，完全干燥。
称取3g P(VDF-TrFE)聚合物粉末，加入21ml N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中。为使P(VDF-TrFE)粉末均匀混合、除去溶液中的气泡以提高成膜致密度，使用磁力搅拌器均匀搅拌至少3小时。同时称取上一步得到的干燥BTO颗粒0.534g，加入9ml DMF，搅拌30分钟，随后超声30分钟，重复联合使用机械搅拌和超声分散至少3次，使材料充分混合均匀。
将超声分散后的BTO混悬液滴加到P(VDF-TrFE)溶液中，搅拌至少12h，使材料充分混合，得到均匀、稳定的BaTiO3/P(VDF-TrFE)混合液。搅拌过程中均使用保鲜膜密封，防止溶剂挥发。将混悬液放在真空干燥箱内，对其进行短时间真空除泡处理。分别用丙酮、无水乙醇、去离子水彻底清洁石英玻璃板后，将除泡后的混悬液使用流涎法，在洁净的石英玻璃上刮成厚度均匀一致，为30μm的BaTiO3/P(VDF-TrFE)铁电纳米复合膜。水平仪校准加热平台，之后将BaTiO3/P(VDF-TrFE)铁电纳米复合膜置于55℃恒温的加热平台上烘干，至溶剂完全挥发。期间加热平台和材料保持水平，并保持环境洁净。120℃退火处理30分钟，随炉冷却至室温，2.15kV/mm场强电晕极化30min，得到电活性BaTiO3/P(VDF-TrFE)铁电纳米复合膜。
2. 复合膜材料的电学性能表征
本发明对所制备的复合膜材料的电学性能进行了测定，结果发现，材料的表面电势在0.4-1.2V之间，d33压电常数为5-30pCN-1。
3. 复合膜材料在体外对牙源性间充质干细胞SEHD分化的影响
将复合膜材料在体外与牙源性间充质干细胞共培养探究其对牙源性间充质干细胞分化的影响，如图1所示，结果表明在无谱系特异性诱导刺激的情况下，复合膜材料的表面电荷有利于启动神经分化，但其长期作用不佳。单纯电刺激对干细胞的主要分化方向显示其对成骨分化/成神经分化/成血管分化均有显著促进作用，但干细胞分化方向特异性较差，神经分化效率不足，尤其是长期(8d)时电刺激对细胞成神经分化的诱导不佳。
图1的结果显示在无谱系特异性诱导刺激的情况下，表面电荷有利于启动神经分化，但其长期作用不佳。图1中的a、b、c、d图为在常规培养基中培养6h，早期神经分化标志物Nestin的表征，表明电荷早期有利于干细胞神经分化。图1中的e、f、g、h、i、j图是在常规培养基中培养8d的结果。其中e图为qRT-PCR结果，带电膜上SHED成神经分化基因被抑制，说明长效促神经分化效果不佳。f图为8d时对SHED进行RNA-Seq分析后的差异基因热图，显示其三系分化状态：成神经分化降低，成骨/成血管分化被促进。g、h、i、j图示出了对SHED的主要分化方向之一-成骨分化进行验证，g图的qRT-PCR显示成骨相关标志基因表达上调，h图为典型成骨分化标记物BMP2的细胞免疫荧光染色，i图示出了典型成骨分化标记物OPN蛋白表达水平，j图为i中OPN蛋白表达灰度统计分析。
为了进一步明确上述作用机制，本发明对涉及的信号通路进行了探究，结果如图2所示，图2的a、c图显示在常规培养基中培养8d，电荷促进了FAK蛋白表达增加，b、d图显示在常规培养基中培养8d，电荷促进YAP磷酸化。结果表明复合膜材料的表面电荷持续激活机械转导信号通路是干细胞神经分化长效性不佳的原因。
虽然电信号促进神经干细胞/神经前体细胞分化、成熟的重要作用屡见报道，但对于初始神经分化潜能较低且具有多向分化潜能的牙源性间充质干细胞的神经转分化诱导仍需依赖于神经诱导因子或转基因等手段提供神经谱系分化助力。电学特性是神经组织的重要生理特性，基于仿生设计的各种电活性材料广泛运用于神经再生组织工程领域，但促进神经分化的早期效果较好，长期效果不佳。因此，有必要将电信号和机械感应信号轴联系起来以取代化学诱导，并解决电刺激诱导干细胞神经分化的长期有效性。
4. 配制添加小分子抑制剂的培养基
DMEM-high glucose + 10%(体积分数)FBS + 1%(体积分数)青链霉素(双抗)+ 2μmol/L小分子抑制剂Vertepofin。
5. 联合培养方案
将SHED接种到电活性BaTiO3/P(VDF-TrFE)铁电纳米复合膜上，隔天换添加抑制剂的培养基；体内培养方案：制作3mm大鼠坐骨神经缺损模型，将SHED以1×107/ml的密度包裹于GelMA，光照固化后按照每缺损200μl置入，局部注射含2 μmol/L的Vertepofin的生理盐水。
图3示出了抑制YAP/β-catenin机械转导信号轴，表面电荷在促进SHED长效神经分化的分子机制。图3的a、b、c、d、e、f、g图为在含有/不含Verteporfin的常规培养基中，在带电C纳米复合膜上培养8d的结果。SHED的差异基因热图显示成神经分化相关基因上调，细胞增殖相关基因下调。KEGG通路富集结果被激活的主要信号通路中PI3K-Akt信号通路下游的GSK-3影响胞质中β-catenin降解复合物的形成。a、b图显示添加Verteporfin后，磷酸化YAP显著增加。c图示出了p-YAP与β-catenin降解复合物结合的结合靶点AXIN1基因表达上调。d、e图示出了AXIN1蛋白表达上调，β-catenin蛋白表达下调。f图示出了添加Verteporfin后，SHED中细胞周期蛋白Cyclin D1的基因表达下调，退出细胞周期，开始分化。g图为在含有/不含Verteporfin的常规培养基中，带电C纳米复合膜上培养14d后，SHED中细胞成神经分化晚期标记物TUBB3免疫荧光，证明添加Verteporfin可有效解决表面电荷诱导牙源性干细胞成神经分化的长期效果不佳的难题。
6. 电信号联合化学信号诱导多种类型干细胞神经分化的研究
为了进一步探究联合诱导对于其他干细胞的影响，本发明对不同来源的干细胞进行了研究，结果如图4所示，结果表明，使用Vertepofin小分子抑制剂能够抑制YAP入核，进而促进其他来源干细胞成神经分化。
本发明在无化学诱导条件下，抑制YAP介导的机械信号转导入核促进牙源性干细胞成神经转分化，实现对转分化过程的精准调控，以期解决周围神经再生修复的大量种子细胞来源困境。
7. 在不同靶点分别抑制FAK-YAP信号通路后干细胞成骨分化情况
本发明还探究了在不同靶点分别抑制FAK-YAP信号通路，干细胞成骨分化情况。具体如图5所示。图5示出了分别添加四种抑制剂作用于FAK-YAP信号通路的不同靶点，SHED成骨分化被抑制，图5的a图表明添加抑制剂Cyto D能够抑制肌动蛋白聚合，带电膜上SHED中成骨分化标记物BMP2、RUNX2、OSX表达下调，b图表明添加抑制剂Blebbistatin能够抑制肌动蛋白-肌球蛋白收缩，带电膜上SHED中成骨分化标记物BMP2、RUNX2、OSX表达下调，c图表明添加抑制剂Verteporfin能够抑制YAP-TAZ结合，带电膜上SHED中成骨分化标记物BMP2、RUNX2、OSX表达下调，d图表明添加抑制剂XAV939能够促进AMOT与YAP结合，从而抑制YAP入核后，带电膜上SHED中成骨分化标记物BMP2、RUNX2、OSX表达下调。
实施例2
本实施例示出了通过电信号联合化学信号诱导间充质干细胞神经分化的方法，其中使用其他类型的小分子化学试剂抑制YAP蛋白进入细胞核通路信号。
1. 将小分子抑制剂替换为XAV939
图6示出了添加XAV939后，SEHD神经分化效率提高以及被激活的信号通路。图6的a图示出了在常规培养基中添加XAV939后，带电膜上SHED早期成神基因表达显著上调，b图示出了SHED中晚期成神经基因表达显著上调，c图示出了典型神经标记物MAP2蛋白表达量显著上调，RNA-Seq测序分析的差异基因热图结果显示添加抑制剂XAV939后，成神经分化相关基因表达在12h、24h时明显上调，KEGG通路富集分析结果显示添加抑制剂XAV939后，成神经分化相关基因通路在6h、12h、24h时均被富集。
2. 将小分子抑制剂替换为Cyto D
图7示出了添加Cyto D后，SEHD神经分化效率提高以及被激活的信号通路。图7的a图示出了在常规培养基中添加Cyto D后，带电膜上SHED早期成神基因表达情况，b图示出了SHED中晚期成神经基因表达情况，c图示出了典型神经标记物MAP2蛋白表达量上调。
3. 将小分子抑制剂替换为Blebbistatin
图8示出了添加Blebbistatin后，SEHD神经分化效率提高以及被激活的信号通路。图8的a图示出了在常规培养基中添加Blebbistatin后，带电膜上SHED早期成神基因表达上调，b图示出了SHED中晚期成神经基因表达上调，c图示出了典型神经标记物MAP2蛋白表达量上调。
尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。
Claims (2)
1. 一种体外诱导间充质干细胞神经分化的方法，其特征在于，包括在不添加神经营养因子的情况下利用电信号和化学信号同时诱导间充质干细胞，从而诱导所述间充质干细胞向神经分化，所述间充质干细胞包括牙源性间充质干细胞和/或骨髓间充质干细胞，所述电信号来源于电活性材料的物理电刺激，所述材料的表面电势在0.4-1.2V之间，d33压电常数为5-30pCN-1，所述化学信号是指使用化学试剂抑制YAP蛋白进入细胞核通路信号，所述化学试剂为Cyto D、Blebbistatin、Vertepofin和XAV939中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的体外诱导间充质干细胞神经分化的方法，其特征在于，所述电活性材料包括铁电高分子聚合物和/或无机铁电材料。
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