CN110234755A - 多能干细胞的分化调控方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种多能干细胞的分化调控方法,其特征在于,将与多能干细胞的结合亲和力作为指标,选择层粘连蛋白或其片段,在该层粘连蛋白或其片段的存在下分化诱导多能干细胞,其中,结合亲和力可通过对细胞存活率及细胞的运动性进行经时观察而判断。根据本发明,能够由多能干细胞简便地制备使分化诱导细胞的比率任意变化的细胞群。通过该制备方法得到的细胞群在基于细胞治疗的疾病的治疗中极其有用。
Description
技术领域
本发明涉及一种多能干细胞的分化调控方法。更详细而言,涉及一种通过调控多能干细胞的分化,选择性诱导所需的多能干细胞衍生的眼原基的方法及其利用。
背景技术
人ES细胞或人iPS细胞等人多能干细胞在再生医疗上的应用受到世界瞩目。为了将人多能干细胞应用于再生医疗,需要开发一种将这些干细胞高效且稳定地分化诱导为体细胞的技术,人们对由人多能干细胞向任意的体细胞的选择性分化诱导方法进行了各种研究。
例如,作为针对角膜上皮干细胞缺乏等重度角膜疾病的新型治疗方法,本申请的发明人开发出了一种由iPS细胞制备角膜上皮细胞片的技术,并使用动物模型确认了其有效性(非专利文献1)。通过非专利文献1中记载的分化诱导方法、由iPS细胞生成的细胞为含有眼周各种细胞的细胞群,因此为了用于角膜上皮细胞片的制备,需要将所使用的细胞纯化为角膜上皮细胞。因此,在非专利文献1中,使用针对角膜上皮细胞特异性细胞表面标记物的抗体,通过FACS(流式细胞荧光分选技术)分选进行了纯化。
FACS分选为以鞘液使经过抗体染色的细胞流动,通过激光的照射确认细胞表面抗原的表达、分取特定的细胞的技术,但难以确保细胞通过的整个流路的无菌性,存在细胞污染的问题。此外,FACS分选存在回收的细胞的损伤较大的问题。进一步,FACS分选中所使用的机器的保养维护需要专业的知识或技术。因此,在大量制备用于制作移植用角膜上皮细胞片的细胞的情况下,FACS分选并非理想的方法,将非专利文献1的技术实用化及产业化时存在技术问题。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:Hayashi et al.,Nature.2016Mar 17;531(7594):376-80.doi:10.1038/nature 17000.Epub 2016Mar 9.
发明内容
本发明要解决的技术问题
本发明涉及一种多能干细胞的分化调控方法,该方法不从分化诱导多能干细胞而得到的细胞群中分取特定的细胞,而是能够在将多能干细胞分化诱导为眼原基时预先调控分化的方向性,由此调控所得到的细胞群中的细胞比率。
此外,本发明还涉及一种例如通过调控细胞比率,简便地制备可用于制备移植用角膜上皮细胞片的角膜上皮细胞群或侧重于除该角膜上皮细胞以外的眼周细胞的细胞群的方法,以及通过所述方法得到的细胞群的利用。
此外,进一步,本发明涉及一种能够在从多能干细胞分化诱导为眼原基时调控分化的方向性的所述细胞的分化诱导剂。
解决技术问题的技术手段
为了解决上述技术问题,本申请的发明人对iPS细胞的分化诱导条件进行了认真研究,结果发现,通过对分化诱导时所存在的层粘连蛋白的种类进行变更,能够调控得到的细胞群中的分化细胞的比率。在选择性分化诱导中,添加在培养基中的生长因子与细胞外基质的选择均很重要,但本申请的发明人首次发现:层粘连蛋白的多个同工型(isoform)在相同的分化诱导方法中,能够将分化诱导的细胞的方向性调控向各个方向。
即,本发明涉及以下的[1]~[10]。
[1]一种多能干细胞的分化调控方法,其特征在于,将与多能干细胞的结合亲和力作为指标,选择层粘连蛋白或其片段,在该层粘连蛋白或其片段的存在下分化诱导多能干细胞。
[2]根据所述[1]所述的分化调控方法,其中,在层粘连蛋白332或层粘连蛋白332E8片段的存在下,调控向角膜上皮细胞的分化。
[3]根据所述[1]所述的分化调控方法,其中,在层粘连蛋白111或层粘连蛋白111E8片段的存在下,调控向神经细胞的分化。
[4]根据所述[1]所述的分化调控方法,其中,在层粘连蛋白211或层粘连蛋白211E8片段的存在下,调控向神经嵴细胞的分化。
[5]根据所述[1]所述的分化调控方法,其中,在层粘连蛋白411或层粘连蛋白411E8片段的存在下,调控向视网膜细胞的分化。
[6]根据所述[1]所述的分化调控方法,其中,在层粘连蛋白411或层粘连蛋白411E8片段的存在下,调控向神经嵴细胞的分化。
[7]一种眼周细胞群的制备方法,其中,对通过所述[1]~[6]中任一项所述的分化调控方法诱导的多能干细胞的分化细胞进行培养。
[8]根据所述[7]所述的制备方法,其中,所得到的细胞群为角膜上皮细胞群。
[9]一种移植用角膜上皮细胞片的制备方法,其特征在于,使用通过所述[8]所述的制备方法得到的角膜上皮细胞群。
[10]一种多能干细胞的分化诱导剂,其含有选自由层粘连蛋白111、层粘连蛋白211、层粘连蛋白332、层粘连蛋白411及层粘连蛋白511组成的组中的层粘连蛋白或其E8片段而成。
此外,作为本发明的一个实施方式,还包括以下的[11]~[12]。
[11]用于调控多能干细胞的分化的、选自由层粘连蛋白111、层粘连蛋白211、层粘连蛋白332、层粘连蛋白411及层粘连蛋白511组成的组中的层粘连蛋白或其E8片段的应用。
[12]一种层粘连蛋白或其E8片段,其用于多能干细胞的分化调控,其选自由层粘连蛋白111、层粘连蛋白211、层粘连蛋白332、层粘连蛋白411及层粘连蛋白511组成的组。
发明效果
根据本发明,不用从分化诱导多能干细胞而得到的细胞群中另外分取所需的细胞,例如可通过简便的操作,从眼部周围的细胞群中选择性地大量制备能够用于制备移植用角膜上皮细胞片的角膜上皮细胞群。
附图说明
图1为示出由iPS细胞分化诱导为眼周细胞的方法的概略图的图。
图2为示出iPS细胞衍生的分化细胞的经时形态变化的一个例子的图。
图3为示出在iPS细胞衍生的分化细胞中表达的标记蛋白的一个例子的图。
图4为示出iPS细胞衍生的分化细胞的经时基因表达分析的结果的图。
图5为示出iPS细胞的集落形成过程的延时分析的结果的图。
图6为示出iPS细胞的集落中参与Hippo途径的转录共激活因子YAP的定位与神经外胚层分化的关系的图。
图7为示出对由iPS细胞分化诱导的细胞的角膜上皮标记物阳性率进行分析的结果的图。
图8为示出分化诱导过程中未分化标记物的基因表达分析与分化诱导6周的iPS细胞衍生的角膜上皮细胞片的截面的图。
图9为示出通过分化诱导形成的SEAM结构中的眼周细胞在各层粘连蛋白同工型上的相对细胞存活率的图。
图10为示出在分化诱导的细胞群中分化细胞的存在比率的图。
图11为示出分化细胞的Wnt信号靶基因的表达分析的结果的图。
图12为示出基于层粘连蛋白的包被浓度的分化调控的图。
图13为示出层粘连蛋白的种类及包被浓度对iPS细胞衍生的角膜上皮细胞的分化效率的影响的图。
图14为示出各层粘连蛋白上的分化细胞中神经嵴细胞标记基因表达量的图。
图15为示出在211上分化的细胞中眼周神经嵴细胞标记物的表达的图。
图16为示出在各层粘连蛋白上分化的细胞中Wnt信号传导途径相关基因表达量的图。
图17为示出在层粘连蛋白211或511上,在分化开始后3天,使用Wnt信号的激动剂或激活剂处理后,分化2周的细胞中神经嵴标记物的FACS分析的结果的图。
图18为示出研究Wnt信号传导途径对层粘连蛋白211或层粘连蛋白511上的向神经嵴细胞的分化的影响的免疫染色的结果的图。
图19为示出研究层粘连蛋白对iPS细胞集落的磷酸化MLC的定位的影响的结果的图。
图20为示出研究层粘连蛋白对iPS细胞集落的磷酸化MLC的表达量与细胞间相互作用的影响的结果的图。
图21为示出研究层粘连蛋白对iPS细胞集落内部及外缘部的细胞密度的影响的结果的图。
图22为示出研究层粘连蛋白对iPS细胞的YAP活性的影响的结果的图。
图23为示出研究基于层粘连蛋白浓度的iPS细胞集落的聚集与神经外胚层分化的关系的结果的图。
图24为示出研究iPS细胞集落中的YAP转录活性与神经外胚层分化的关联的结果的图。
具体实施方式
在非专利文献1中,发明人使用层粘连蛋白511E8片段,从iPS细胞中取得再现眼睛整体的生成的细胞群,通过FACS从得到的细胞群中仅回收角膜上皮(前驱)细胞并进行纯化,由此制备高纯度的细胞群。其中,再现眼睛整体的生成的细胞群为构成发生期的眼的各种细胞群,例如包含角膜上皮细胞、视网膜细胞、晶状体上皮细胞、神经嵴细胞等,其中潜藏着有助于开发每种细胞所对应的眼的部位的再生医疗的可能性。然而,即使欲通过所述方法由含有眼睛整体的细胞的细胞群制备高纯度含有目标细胞的细胞群,也还是存在诱导效率低的iPS细胞株,特别是对于角膜上皮细胞,要求改良为能够在更短期进行稳定生产的技术。于是,本申请的发明人例如着眼于为对眼细胞发生造成影响的因素的层粘连蛋白的同工型并进行研究后发现,由于同工型的差异,由多能干细胞得到的细胞群中的细胞构成发生较大变化,即由于同工型的差异,由多能干细胞分化诱导的原基或分化细胞的种类也不同。作为进行该选择性分化诱导的机理,确认到是由于同工型与多能干细胞的结合亲和力不同,细胞迁移、细胞骨架、贴壁或悬浮状态等发生变化,产生依赖于同工型的多能干细胞集落的极性,因此涉及分化的转录因子或信号传导途径发生变化。接着,认为与此同时不同细胞的自主分化受到调控,进一步,具有容易与同工型进行特异性结合的整合素亚单位的原基或分化细胞选择性增殖,由此得到的细胞群的细胞构成发生变化。因此认为,即使例如在培养基中添加相同的生长因子,通过使用以与多能干细胞的结合亲和力为指标而选择的同工型,能够进行选择性分化诱导。此外,认为在形成了上述那样的原基后,若根据该原基中整合素的种类而选择同工型,则能够进一步选择性地促进增殖。但是,本发明并不受这些推测的限定。
本发明提供一种调控多能干细胞的分化的方法,其具备以下特征:由多能干细胞诱导为分化细胞时,根据所需的分化细胞的种类,选择在培养时存在的层粘连蛋白或其片段的种类。具体而言,根据所需的分化细胞的种类,在以与多能干细胞的结合亲和力为指标而选择的特定的层粘连蛋白或其片段的存在下,通过使多能干细胞分化,例如即使存在相同的诱导眼周细胞的生长因子,所得到的细胞群仍为高度含有角膜上皮细胞的细胞群、或为高度含有神经嵴细胞的细胞群,能够通过使用的层粘连蛋白或其片段调控分化的方向性。换言之,通过选择的层粘连蛋白或其片段,能够由相同的多能干细胞中区分制备各种分化细胞。因此,本发明的多能干细胞的分化调控方法是指由多能干细胞向分化细胞的选择性分化诱导方法,也为分化细胞的选择方法或高度含有目标细胞的细胞群的制备方法。其中,只要与除了不存在所使用的层粘连蛋白或其片段以外均在相同条件下分化诱导时所得到的细胞群相比,特定细胞的存在比率高,则高度含有特定细胞的细胞群的程度没有特别限定。
本发明中的多能干细胞为:具有能够分化为生物体中存在的所有细胞的多能性,且同时具有增殖能力的干细胞。具体而言,例如可列举出胚胎干细胞(ES细胞)、来自通过核移植而得到的克隆胚胎的胚胎干细胞(ntES细胞)、精子干细胞(GS细胞)、胚胎生殖细胞(EG细胞)、诱导性多能干细胞(iPS细胞)、来自培养的成纤维细胞或骨髓干细胞的多能细胞(Muse细胞)。优选为ES细胞、ntES细胞及iPS细胞,更优选为iPS细胞。多能干细胞优选为哺乳动物的多能干细胞。哺乳动物没有特别限定,可列举出人、小鼠、大鼠、牛、猪等。其中优选为人。通过使用人多能干细胞,能够取得与可利用于人的再生医疗的安全的细胞种类相应的细胞群。
层粘连蛋白为由α链、β链及γ链三条亚基链组成的异三聚体分子。α链已知有α1~α5五种,β链已知有β1~β3三种,γ链已知有γ1~γ3三种,通过将它们进行组合,至少存在12种以上的同工型(参照表1)。作为可用于本发明的层粘连蛋白,可以是任一种同工型,可根据所需的分化细胞,选择将选自α1~α5的一种α链、选自β1~β3的一种β链、选自γ1~γ3的一种γ链进行适当组合而成的同工型。另外,在本说明书中,例如将α链为α1、β链为β1、γ链为γ1的同工型记作层粘连蛋白111,对其他的同工型也以相同方式进行记载。
[表1]
层粘连蛋白的来源没有特别限定,可使用来自各种生物的层粘连蛋白。优选为来自哺乳动物的层粘连蛋白。作为哺乳动物,例如可列举出人、小鼠、大鼠、牛、猪等,但并不限于此。此外,优选与所使用的多能干细胞为同种,例如,在培养用于得到人的再生医疗的材料的人干细胞时,优选使用来自人的层粘连蛋白。
可用于本发明的层粘连蛋白可以为全长,也可以为其片段。即,其可以为由全长α链、全长β链及全长γ链形成的全长的层粘连蛋白,也可以为由α链、β链及γ链的一个以上为短于全长的片段形成的层粘连蛋白片段。其中,需要层粘连蛋白片段形成异三聚体。此外,优选层粘连蛋白片段具有整合素结合活性。
作为层粘连蛋白片段,例如可使用如上所述的层粘连蛋白的E8片段。层粘连蛋白E8片段(以下,记作“层粘连蛋白E8”或“E8”)是指,形成使用弹性蛋白酶消化小鼠层粘连蛋白111而得到的异三聚体的片段,被鉴定为具有较强的细胞粘着活性的片段(Edgar D etal.,J.Cell Biol.,105:589-598,1987)。虽然推测在使用弹性蛋白酶消化除小鼠层粘连蛋白111以外的层粘连蛋白时,存在相当于小鼠层粘连蛋白111E8的片段,但未有使用弹性蛋白酶消化除小鼠层粘连蛋白111以外的层粘连蛋白,并分离、鉴定出E8的报告。因此,用于本发明的层粘连蛋白E8不需要为层粘连蛋白的弹性蛋白酶消化产物,只要为具有与小鼠层粘连蛋白111E8相同的细胞粘着活性、具有类似结构的层粘连蛋白片段即可。
层粘连蛋白E8为从α链的C末端片段上去除了球状域4及5的片段(α链E8)、β链的C末端片段(β链E8)及γ链的C末端片段(γ链E8)形成了三聚体的片段。三聚体的分子量没有特别限定,通常为约150~约170kDa。从γ链E8的C末端部数起的第三个谷氨酸残基对层粘连蛋白E8的整合素结合活性而言是必须的(Hiroyuki Ido et al.,The Journal ofBiological Chemistry,282,11144-11154,2007)。
另外,可通过公知的方法确认层粘连蛋白及层粘连蛋白片段形成异三聚体或具有整合素结合活性。例如,可通过将其供于SDS-PAGE来检测条带数等从而确认杂三聚体。此外,例如可通过ELISA法等确认整合素结合活性。
层粘连蛋白可以为天然型,也可以为一个或一个以上的氨基酸残基被修饰并维持其生物学活性的修饰型。层粘连蛋白片段也相同。层粘连蛋白的制备方法没有特别限定,例如可列举出从层粘连蛋白高表达细胞中进行提纯的方法、作为重组蛋白进行制备的方法等。层粘连蛋白片段的制备方法也没有特别限定,例如可列举出使用弹性蛋白酶等蛋白水解酶消化全长层粘连蛋白,分取、提纯目标片段的方法、或作为重组蛋白而进行制备的方法等。从制备量、品质的均匀性、制备成本等角度出发,优选层粘连蛋白及层粘连蛋白片段均作为重组蛋白而进行制备。
重组层粘连蛋白、重组层粘连蛋白片段可通过适当使用公知的基因重组技术而进行制备。作为重组层粘连蛋白、重组层粘连蛋白片段的制备方法,例如可通过以下方法制备:获得编码α链、β链及γ链的各全长蛋白的DNA、或获得例如当制备重组层粘连蛋白E8作为重组层粘连蛋白片段时编码各链的E8片段的DNA,将其分别插入表达载体,将得到的三种表达载体共导入至合适的宿主细胞中,使它们表达,使用公知的方法对形成三聚体的蛋白质进行提纯。作为重组层粘连蛋白(全长)的制备方法,例如可使用井户等(Hiroyuki Idoet al.,The Journal of Biological Chemistry,279,10946-10954,2004)的方法等,但不限于此。作为重组层粘连蛋白E8的制备方法,例如可使用井户等(Hiroyuki Ido et al.,The Journal of Biological Chemistry,282,11144-11154,2007)的方法,但不限于此。
对编码构成主要的哺乳动物的层粘连蛋白的α链、β链、γ链的基因的碱基序列信息及各链的氨基酸序列信息,可通过公知的数据库(GenBank等)获得。表2中示出了构成人层粘连蛋白的各个链的登录号。除此以外的各种生物的层粘连蛋白构成链的碱基序列信息及氨基酸序列信息同样也可通过公知的数据库(GenBank等)获得。
[表2]
氨基酸序列 | 碱基序列 | |
人层粘连蛋白α1链 | NP_005550 | NM_005559 |
人层粘连蛋白α2链 | NP_000417 | NM_000426 |
人层粘连蛋白α3链 | NP_000218 | NM_000227 |
人层粘连蛋白α4链 | NP_002281 | NM_002290 |
人层粘连蛋白α5链 | NP_005551 | NM_005560 |
人层粘连蛋白β1链 | NP_002282 | NM_002291 |
人层粘连蛋白β2链 | NP_002283 | NM_002292 |
人层粘连蛋白β3链 | NP_000219 | NM_000228 |
人层粘连蛋白γ1链 | NP_002284 | NM_002293 |
人层粘连蛋白γ2链 | NP_005553 | NM_005562 |
人层粘连蛋白γ3链 | NP_006050 | NM_006059 |
在本发明中,若选自由如上所述的层粘连蛋白及层粘连蛋白片段组成的组,则可根据所需的分化细胞的种类,单独使用或组合使用两种以上将与多能干细胞的结合亲和力作为指标而选择的层粘连蛋白或其片段。即,在本发明中,根据所需的分化细胞的种类选择层粘连蛋白及层粘连蛋白片段,使用与多能干细胞的结合亲和力作为其选择指标。在本说明书中,与细胞的结合亲和力可通过经时观察细胞存活率及细胞的运动性而进行判断。此外,可通过使用ELISA法等来确认整合素结合活性而进行判断。或者,在参考文献1(MatrixBiol.2006Apr;25(3):189-97.Epub 2006Jan 18.)中记载了重组整合素对层粘连蛋白同工型的解离常数(参照表3),可参考该内容进行判断。例如,以下示出了基于参考文献1,根据在iPS细胞中表达的层粘连蛋白结合型整合素的解离常数来判断结合亲和力。通过与下述表进行对比,可判断其他层粘连蛋白同工型的结合亲和力。
[表3]
*ND:Not Determined,ND(+):测量极限等级
基于以上述方式判断的结合亲和力,在得到中枢神经、视网膜细胞这样的分化细胞时,只要选择与多能干细胞的结合亲和力强的同工型即可,在得到角膜上皮细胞、表皮细胞、晶状体上皮细胞这样的上皮细胞时,只要选择与多能干细胞的结合亲和力为中等程度的同工型即可,在得到神经细胞、神经嵴细胞这样的分化细胞时,只要选择与多能干细胞的结合亲和力弱的同工型即可。若像这样确定所需的分化细胞,则能够决定所使用的层粘连蛋白或层粘连蛋白片段的种类,在如此选择的层粘连蛋白或层粘连蛋白片段的存在下,能够通过培养多能干细胞而形成所需的细胞或原基。
作为多能干细胞的分化诱导方法,只要能够在所述层粘连蛋白或其片段的存在下分化诱导,则可适当选择使用公知的方法。例如,可优选使用本申请的发明人开发的将多能干细胞分化诱导为眼周细胞的方法(非专利文献1)。具体而言,例如,在培养用培养皿等培养容器的培养表面上包被所述层粘连蛋白或层粘连蛋白片段,在其中接种人iPS细胞,经过数天形成集落后,在含有KnockOut血清替代品的培养基中培养,然后在含有人角质细胞生长因子(Keratinocyte Growth Factor:KGF)及人成纤维细胞生长因子-2(FibroblastGrowth Factor-2:FGF-2)的培养基中培养的方法。其中,有时将形成集落的培养记作“集落形成培养”,将在这之后的培养记作“分化培养”或“分化诱导”。此外,例如可列举出在小珠(beads)等载体上包被层粘连蛋白或层粘连蛋白片段,将该载体放入至细胞悬浮液中培养的方法。或者也可列举出将层粘连蛋白或层粘连蛋白片段直接添加到培养液中进行培养的方法。另外,在本发明中,交换培养基时存在的层粘连蛋白或其片段的量或种类可以相同,也可以不同。
层粘连蛋白或层粘连蛋白片段的使用浓度根据使用的层粘连蛋白或层粘连蛋白片段的种类,即根据与多能干细胞的结合亲和力适当选择并设定可达成目的的浓度即可。例如,在包被层粘连蛋白或层粘连蛋白片段而使其存在时,可从约0.1~约10μg/cm2的范围中选择。此外,在包被层粘连蛋白E8时,可以为约0.25~约2.0μg/cm2,也可以为约0.5~约1.5μg/cm2,还可以为约0.5~约1.0μg/cm2。当添加在培养液中时,也可以根据使用的培养器材的面积进行设定,以使其与所述包被时为相同程度的量。例如,通过以低浓度使用与多能干细胞的结合亲和力强的层粘连蛋白或层粘连蛋白片段,能够调节结合亲和力,调控分化诱导。另外,将层粘连蛋白或层粘连蛋白片段固定在器材上的固定化方法(包被方法)没有特别限定,例如可通过使其在适当的缓冲液中与固相接触而进行固定化。
本发明中使用的培养基没有特别限定,可使用将对细胞培养而言必需的成分进行混合而制成的公知培养基,例如可适当选择使用市售的培养基。这些培养基除了其原本的构成成分以外,也可含有其他成分。
具体而言,例如可含有与所需的分化细胞的种类相应的生长因子。作为生长因子,可根据公知技术进行适当选择,例如可例示出KGF、FGF-2、BMP4等。
培养开始时的细胞数量没有特别限定,例如优选为10~1×108个细胞/mL,更优选为1×102~5×107个细胞/mL,进一步优选为1×103~2×107个细胞/mL。此外,在贴壁培养时,可例示出优选为10~2500个细胞/cm2的范围,更优选为100~1000个细胞/cm2的范围,进一步优选为300~700个细胞/cm2的范围。培养条件没有特别限定,可使用用于通常的细胞培养的条件。例如,可在37℃、5%CO2等条件下进行培养。此外,可以以适当的时间间隔向细胞培养液中加入新鲜的培养基进行稀释或交换培养基或交换细胞培养用器材。
可在本发明中使用的细胞培养用器材没有特别限定,例如可使用培养皿(板)、斜颈培养瓶(flask)、培养袋、大型培养罐、生物反应器等。另外,作为培养袋,可使用细胞培养用CO2透气培养袋。此外,在工业上制备大量的细胞群时,可使用大型培养罐。此外,培养可在开放系、封闭系中的任一种中实施,从得到的细胞群的安全性的角度出发,优选在封闭系中进行培养。
在层粘连蛋白或层粘连蛋白片段的存在下培养多能干细胞的时间没有特别限定,只要根据所使用的层粘连蛋白或层粘连蛋白片段的种类或其量适当选择能够达成目标的时间即可。此外,培养时间中的层粘连蛋白或层粘连蛋白片段存在的时间可以为培养期的整个期间,也可以为任意一部分期间。在整个培养期中的至少初期阶段、优选在培养开始时,在层粘连蛋白或层粘连蛋白片段的存在下适当实施培养即可。
此外,在本发明中,通过在如上所述的层粘连蛋白或层粘连蛋白片段的存在下培养多能干细胞,得到原基,然后形成该原基后,根据该原基中的整合素的种类选择同工型,可选择性地促进增殖。本发明还包括该形态的分化诱导。具体而言,例如在为神经嵴细胞时,可使用层粘连蛋白211或其片段培养并诱导原基,在为上皮细胞时,可使用层粘连蛋白332或其片段培养并诱导原基,在为视网膜细胞或神经嵴细胞时,可使用层粘连蛋白411或其片段培养并诱导原基。
在本发明中,可根据需要添加除层粘连蛋白或层粘连蛋白片段以外的其他成分来进行培养。作为其他成分,例如可列举出玻连蛋白、纤连蛋白、胶原蛋白、人工基膜、明胶、多聚赖氨酸等。
此外,除所述以外,可根据所需的分化细胞的种类,例如在促进神经嵴细胞的分化诱导时添加Wnt信号传导途径激动剂。
由此,能够在与所需细胞相应的层粘连蛋白或层粘连蛋白片段的存在下,分化诱导多能干细胞,选择性地得到所需的细胞群。
作为被分化诱导的细胞没有特别限定,可例示出能够由多能干细胞分化诱导的所有体细胞。具体而言,例如作为来自外胚层的细胞,可列举出角膜细胞、多巴胺能神经元(insulin producing cell)、运动神经细胞、周围神经细胞、色素上皮细胞、皮肤细胞、内耳细胞等。作为来自内胚层的细胞,可列举出肝细胞、胰祖细胞、胰岛β细胞、胆管细胞、肺泡上皮细胞、肠上皮细胞等。作为来自中胚层的细胞,可列举出心肌细胞、骨骼肌细胞、血管内皮细胞、血细胞、骨细胞、软骨细胞、肾祖细胞、肾上皮细胞等。另外,体细胞不仅包括终末分化的成熟细胞,还包括未到达终末分化的分化过程中的细胞。
得到的细胞群中目标细胞的存在比率无法根据所使用的层粘连蛋白或层粘连蛋白片段的种类或培养条件笼统地进行规定。
此外,从得到的细胞群中回收目标细胞的方法没有特别限定。作为对未贴附在层粘连蛋白或层粘连蛋白片段上的细胞(非贴壁细胞)进行回收的方法,例如在使用包被有层粘连蛋白或层粘连蛋白片段的培养容器时,可通过对使用PBS等对回收的培养基及包被表面进行了数次清洗的清洗液中所含的细胞进行离心分离等而回收。将包被有层粘连蛋白或层粘连蛋白片段的载体放入细胞悬浮液时,可通过对回收了载体的细胞悬浮液中残留的细胞进行离心分离等而回收。
对贴附在层粘连蛋白或层粘连蛋白片段上的细胞(贴壁细胞)进行回收的方法没有特别限定,可适当选择使用分离贴壁细胞的公知的方法。使用包被有层粘连蛋白或层粘连蛋白片段的培养容器时,例如可在去除非贴壁细胞后,在层粘连蛋白或层粘连蛋白片段的包被面上添加EDTA液、胰蛋白酶溶液等公知的细胞分离用溶液并进行移液等,由此分离细胞并进行回收。使用包被有层粘连蛋白或层粘连蛋白片段的载体时,可在细胞分离用溶液中放入载体并进行移液等,由此使细胞分离并进行回收。
如此,通过本发明的多能干细胞的分化调控方法,能够根据所使用的层粘连蛋白的种类,调控由多能干细胞向所需的细胞的分化诱导,发挥能够得到以高比率含有所需细胞的细胞群这一优异的效果。此外,由于能够由多能干细胞直接得到所需的细胞,因此与非专利文献1的方法相比工序数量少,可以说为一种生产率较高的方法。此外,已知层粘连蛋白通过整合素抑制细胞的凋亡,维持细胞的生存,同时激活促进细胞增殖的细胞内信号传导途径(Gu J et al.The Journal of Biological Chemistry 277:19922-19928,2002)。因此,在本发明中,由于在层粘连蛋白或层粘连蛋白片段的存在下分化诱导细胞,因此还具有可得到处在维持高存活率状态的细胞群这一较大优点。
以下,例如对选择性分化诱导眼周细胞的方法进行说明。具体而言,例如为使用选自由层粘连蛋白111、层粘连蛋白211、层粘连蛋白332、层粘连蛋白411及层粘连蛋白511组成的组中的层粘连蛋白或其E8片段的例子。另外,除了所使用的层粘连蛋白或层粘连蛋白片段的种类不同以外,培养条件在任意情况下均相同,可参照上文所述内容。
层粘连蛋白111为α链为α1、β链为β1、γ链为γ1的同工型,有时也记作“层粘连蛋白1”、“层粘连蛋白α1β1γ1”。已知层粘连蛋白111在胎儿组织的基膜中表达,但在使用层粘连蛋白111或其E8片段时,能够适宜地诱导神经细胞、视网膜感觉层(神経網膜)、晶状体上皮细胞。
层粘连蛋白211为α链为α2、β链为β1、γ链为γ1的同工型,有时也记作“层粘连蛋白2”、“层粘连蛋白α2β1γ1”。已知层粘连蛋白211在肌肉组织或神经组织的基膜中特异性表达,但在使用层粘连蛋白211或其E8片段时,能够适宜地诱导神经细胞、神经嵴细胞。层粘连蛋白211或其E8片段与多能干细胞的结合亲和力非常弱,但由于能够存活,因此能够以无限接近神经细胞诱导中所使用的悬浮培养的状态贴壁培养。认为由此,Wnt信号被激活,分化为神经细胞或贴壁进行细胞迁移的神经嵴细胞。此外认为,此时,由于存在Wnt信号传导途径激动剂,更加促进了向神经嵴细胞的分化。对于这样的促进向神经细胞、神经嵴细胞的分化的层粘连蛋白211上的iPS细胞,黏着斑蛋白Y822的磷酸化增强,细胞粘着占优势。
层粘连蛋白332为α链为α3、β链为β2、γ链为γ2的同工型,有时也记作“层粘连蛋白5”、“层粘连蛋白α3β3γ2”。已知层粘连蛋白332在皮肤等复层上皮组织的基膜中特异性表达。为了使多能干细胞良好地存活,层粘连蛋白332可在集落形成培养中使用,但在形成集落时,由于其适度的结合强度,以细胞的集体运动活跃的状态发生集落形成,因此细胞的密度相对变低。由此,难以激活促进向神经外胚层的分化的传导途径,容易变成向表面外胚层的分化。此外,由于与分化的神经或视网膜感觉层等的细胞的结合亲和力低、与上皮细胞的亲和力高,因此认为可适当地诱导上皮细胞、尤其是角膜上皮细胞。
层粘连蛋白411为α链为α4、β链为β1、γ链为γ1的同工型,有时也记作“层粘连蛋白8”、“层粘连蛋白α4β1γ1”。已知层粘连蛋白411在血管内皮等的基膜中特异性表达,但在使用层粘连蛋白411或其E8片段时,可适宜地诱导视网膜感觉层细胞或神经嵴细胞等。在高浓度存在下与层粘连蛋白511相同,由于与多能干细胞的结合强度,因此不易引起细胞的集体运动,集落内的细胞密度相对变高,在集落的中央,激活促进向神经外胚层的分化的传导途径,容易引起向神经外胚层谱系的分化。另一方面,由于与神经嵴细胞或视网膜细胞的结合亲和力高于与上皮细胞的结合亲和力,因此认为可促进在此之后的视网膜的增殖。
层粘连蛋白511为α链为α5、β链为β1、γ链为γ1的同工型,有时也记作“层粘连蛋白10”、“层粘连蛋白α5β1γ1”。已知层粘连蛋白511在肾脏、肺、胰脏、血管等的基膜中特异性表达,但在使用层粘连蛋白511或其E8片段时,已知可平衡地诱导神经、视网膜、上皮细胞等。然而,若变成更高浓度,则由于与多能干细胞的结合强度,难以引起细胞的集体运动,在集落内、特别是在集落中央的细胞密度相对变高,在集落的中央,激活促进向神经外胚层的分化的传导途径,容易引起向神经外胚层谱系的分化。另一方面,通过设为低浓度,也能够促进细胞的集体运动,适当地诱导上皮细胞。此外,为高浓度时,还确认到了MLC的磷酸化,在集落外周易发生收缩。
像这样,通过使用选自由层粘连蛋白111、层粘连蛋白211、层粘连蛋白332、层粘连蛋白411及层粘连蛋白511组成的组中的层粘连蛋白或其E8片段,即使对于相同的眼周细胞,也能够分别制备高度含有不同种类的细胞的细胞群。
因此,本发明还提供一种使用所述本发明的多能干细胞的分化调控方法,制备含有选自由下述组成的组中的眼周细胞的至少一种细胞群的方法。
细胞群(1):视网膜细胞含有率高的细胞群
细胞群(2):神经嵴细胞含有率高的细胞群
细胞群(3):神经细胞含有率高的细胞群
细胞群(4):角膜上皮细胞含有率高的细胞群
作为本发明的细胞群的制备方法,只要进行本发明的多能干细胞的分化调控方法,则没有特别限定。例如,可通过在层粘连蛋白332或层粘连蛋白332E8的存在下培养多能干细胞,制备角膜上皮细胞含有率高的细胞群。另外,培养的具体操作或条件等可参考本发明的分化调控方法一项。
此外,使用层粘连蛋白332或层粘连蛋白332E8时,由于与多能干细胞的适当的结合强度,容易引起细胞的集体运动,在集落形成过程中细胞密度相对变低,因此Hippo途径不易激活,成为角膜上皮或表皮的原基的表面外胚层变得容易分化。使用与多能干细胞的结合性强的层粘连蛋白或层粘连蛋白片段时,例如与使用非专利文献1中记载的层粘连蛋白511E8的情况相比,还可得到促进向上皮细胞的分化诱导,且使分化诱导所需周期减半的效果。此外,进一步,由于通过促进分化诱导而得到的细胞中未分化状态的细胞或具有致瘤性的细胞比率变少,因而更加优选。因此,通过本发明的制备方法,还可发挥能够以高生产率制备角膜上皮细胞的优异效果。
对于通过本发明的制备方法制备的细胞群,例如若直接培养细胞群(4),就成为能够制备移植用角膜上皮细胞片的高纯度的角膜上皮细胞群。其中,“用于制备移植用角膜上皮细胞片的角膜上皮细胞群”需要为由对制备至少用于一只眼(单眼)的角膜上皮细胞片而言所必须的1×105个以上的细胞构成的细胞群。然而,若考虑到本发明在工业上的利用,“用于制备移植用角膜上皮细胞片的角膜上皮细胞群”最好具有对制备用于多只眼的角膜上皮细胞片而言所必需的细胞数量。因此,构成“用于制备移植用角膜上皮细胞片的角膜上皮细胞群”的细胞数量优选为2×105个细胞以上、4×105个细胞以上、6×105个细胞以上、8×105个细胞以上、1×106个细胞以上。此外,“用于制备移植用角膜上皮细胞片的角膜上皮细胞群”的杂细胞的含有率优选小于50%,更优选小于45%、小于40%、小于35%、小于30%。
移植用角膜上皮细胞片可通过以下方法制备:使用6孔板时,以1.5×105~6.0×105个细胞/孔的方式接种通过本发明的制备方法制备的细胞群,使用12孔板时,以0.5×105~1.0×105个细胞/孔的方式接种通过本发明的制备方法制备的细胞群,培养5~12天直至铺满(confluent)。
通过本发明的制备方法制备的角膜上皮细胞群可直接作为移植用角膜上皮细胞片的制备原料而使用。因此,本发明中包含移植用角膜上皮细胞片的制备方法,该方法包括培养通过本发明的制备方法制备的角膜上皮细胞群的工序。用于由通过本发明的制备方法制备的角膜上皮细胞群制备移植用角膜上皮细胞片的方法没有特别限定。例如可通过以下方法制备:使用6孔板时,以1.5×105~6.0×105个细胞/孔的方式接种通过本发明的制备方法制备的细胞群,使用12孔板时,以0.5×105~1.0×105个细胞/孔的方式接种通过本发明的制备方法制备的细胞群,培养5~12天直至铺满。培养基的交换优选以2天一次的频率进行。孔板可以使用通常的细胞培养板。此外,也可使用细胞片回收用温度敏感性细胞培养装置(CellSeed Inc.制造的“Up Cell(商品名称)”)。
此外,通过本发明的制备方法制备的细胞群由于以高比率含有特定细胞,因此例如能够为眼病的治疗药的药效评价或发病机理的分析等带来较大的贡献。
此外,本发明提供一种多能干细胞的分化诱导剂,其含有选自由层粘连蛋白111、层粘连蛋白211、层粘连蛋白332、层粘连蛋白411及层粘连蛋白511组成的组中的层粘连蛋白或其片段。本发明的分化诱导剂通过使用所述层粘连蛋白或层粘连蛋白片段,能够将多能干细胞选择性诱导为所需的细胞。详细内容可参照本发明的分化调控方法一项。
实施例
以下,通过实施例对本发明进行详细说明,但这些实施例为本发明的一个例子,本发明并不受这些实施例限定。另外,在后文中,室温表示25℃。
实施例1向眼周细胞的分化诱导
在由iPS细胞向眼周细胞的分化诱导中,使用了自我形成外胚层自主性多区结构(self-formed ectodermal autonomous multi-zone)(SEAM)法(Hayashi etal.Nature.2016Mar 17;531(7594):376-80.)。将分化诱导的工序纲要示于图1。另外,所使用的层粘连蛋白同工型为层粘连蛋白111的E8片段(层粘连蛋白111E8)、层粘连蛋白211的E8片段(层粘连蛋白211E8)、层粘连蛋白332的E8片段(层粘连蛋白332E8)、层粘连蛋白411的E8片段(层粘连蛋白411E8)及层粘连蛋白511的E8片段(层粘连蛋白511E8),它们均通过公知技术进行制备。
具体而言,在以0.5~1.0μg/cm2浓度包被了各层粘连蛋白同工型的E8片段的孔板上,以300~700个细胞/cm2的密度接种人iPS细胞株(201B7),在StemFit(注册商标)培养基(Ajinomoto Co.,Inc.)中培养8~10天后,在分化培养基(DM;含有10%knockout血清替代品(KSR,Life Technologies)、1mM丙酮酸钠(Life Technologies)、0.1mM非必需氨基酸(Life Technologies)、2mM L-谷氨酰胺(Life Technologies)、1%青霉素-链霉素溶液(Life Technologies)及55μM 2-巯基乙醇(Life Technologies)的GMEM培养基(LifeTechnologies))中培养4周。然后,在角膜分化培养基(CDM;含有20ng/mL KGF(Wako)、10μMY-27632(Wako)及1%青霉素-链霉素溶液的DM培养基与Cnt-20或Cnt-PR培养基(不含EGF及FGF2,CellnTEC Advanced Cell Systems)的1:1(v/v)混合培养基)中培养4周后,交换为角膜上皮维持培养基(CEM;含有2%B27细胞培养添加剂(Life Technologies),1%青霉素-链霉素溶液、20ng/mL KGF、10μM Y-27632的DMEM/F-12(2:1(v/v))培养基(LifeTechnologies))后进一步培养2~5周,进行分化诱导。另外,使用了层粘连蛋白511E8的样品为以与非专利文献1相同的方式进行了分化诱导的例子。
对于各层粘连蛋白同工型,使用蔡司顶级倒置荧光显微镜(Axio Observer.D1)(Carl Zeiss)获得分化诱导过程的细胞形态的相差图。将结果示于图2。另外,在图中,“111”为使用了层粘连蛋白111E8的例子、“211”为使用了层粘连蛋白211E8的例子、“332”为使用了层粘连蛋白332E8的例子、“411”为使用了层粘连蛋白411E8的例子、“511”为使用了层粘连蛋白511E8的例子,之后的实施例也以相同的方式进行记载。
图2中,使用非专利文献1中的“511”时所形成的SEAM为由第一层(图中的1st)、第二层(图中的2nd)、第三层(图中的3rd)、第四层(图中的4th)形成的四层结构,分别构成中枢神经、视网膜、角膜上皮、除角膜以外的上皮细胞。另一方面,已知若使用“111”则第一及第二层(1st/2nd)在6周(w)后被诱导,若使用“211”则第一层(1st)在6周后被诱导,若使用“332”则第三及第四层(3rd/4th)在6周后被诱导。此外,使用“411”时与使用了“511”的结构相似,但不形成第三及第四层(3rd/4th),与“511”不同。综上,对于根据同工型而分化为多种眼周细胞的、由多能干细胞向眼细胞的分化诱导,通过使用同工型,能够选择性地诱导特定的层。
实施例2分化诱导细胞中标记蛋白的表达
以与实施例1相同的方法进行分化诱导,对于从开始培养了适当时间的细胞,去除培养液,使用PBS进行清洗后,使用4%多聚甲醛/PBS或冷甲醇进行固定。然后,使用TBS清洗三次,在室温下使用含有5%驴正常血清及0.3%Triton-X100的TBS封闭1小时后,添加第一抗体,在室温下反应1小时或在4℃下反应过夜。然后,使用TBS清洗三次,然后加入第二抗体,在室温下反应1小时。另外,在神经嵴细胞的检测中,使用抗p75抗体(小鼠单克隆抗体;ME20.4,ADVANCED TRGETING SYSTEMS)及抗SOX10抗体(山羊多克隆抗体;N-20,Santa CruzBiotechnology)作为第一抗体。在神经细胞的检测中,使用了抗TUBB3抗体(兔多克隆抗体;T2200,Sigma-Aldrich)。在上皮细胞及视网膜细胞的检测中分别使用了抗上皮钙粘蛋白抗体(小鼠单克隆抗体;180215,R&D systems)及抗CHX10抗体(山羊多克隆抗体;N-18,SantaCruz Biotechnology)。在角膜上皮细胞的检测中使用了抗PAX6抗体(兔多克隆抗体;ab97866,Abcam)及抗p63抗体(小鼠单克隆抗体;4A4,Santa Cruz Biotechnology)。作为第二抗体使用了Alexa Fluor(注册商标)488、567或647标记抗小鼠、兔或绵羊IgG抗体(Invitrogen)。抗体均通过含有1%驴正常血清及0.3%Triton-X100的TBS进行稀释而使用。细胞核的染色通过使用100倍稀释浓度的Hoechst 33342在室温下处理10分钟来进行。使用蔡司顶级倒置荧光显微镜(Axio Observer.D1)(Carl Zeiss)进行观察。将结果示于图3。
神经嵴细胞可定义为p75/SOX10共阳性细胞。在培养第2周,在“511”上检测到了球状的p75/SOX10共阳性细胞,但在其他同工型上也可检测到p75/SOX10共阳性的神经嵴细胞。特别是使用“211”时,促进了神经嵴细胞的扩增及迁移。此外,在使用“511”的以往的方法中,在培养第4周,p75/SOX10共阳性的神经嵴细胞消失,但使用“211”时仍可检测到。
在对照的“511”上,在第一层、第二层中确认到神经细胞的标记物TUBB3的表达。此外,在“111”、“211”上,阳性细胞形成了纤维。在“411”中,与“511”相比,TUBB3阳性的第二层扩增。另一方面,在“332”中未确认到TUBB3阳性的神经细胞的出现。
在对照的“511”中,在第二层确认到了视网膜感觉层的标记物CHX10的表达,但在“411”中,CHX10阳性的视网膜感觉层细胞大幅扩增。在其他同工型中,未确认到视网膜感觉层的表达。另一方面,在对照的“511”中,在第三层更外侧确认到了上皮标记物的上皮钙粘蛋白,但在“332”中,上皮钙粘蛋白阳性的上皮细胞大幅扩增。在“111”或“211”中,上皮钙粘蛋白阳性细胞少。
角膜上皮细胞可定义为PAX6/p63共阳性细胞。通过使用“332”确认到了PAX6/p63共阳性细胞的角膜上皮细胞的分化正在扩大。
综上,“111”特异性地促进了神经细胞的分化,“211”特异性地促进了神经细胞及神经嵴细胞的分化,“332”特异性地促进了角膜上皮细胞或其他上皮细胞的分化,“411”特异性地促进了视网膜细胞的分化。
实施例3分化细胞的经时性基因表达分析
以与实施例1相同的方法进行分化诱导,对于分化培养开始前(0周(w))、4、6、12周(w)后的细胞去除培养液,使用PBS清洗后,用QIAzol裂解试剂(QIAzol Lysis Reagent)(QIAGEN)提纯,在总量为20μL的反应体系中使用用于qRT-PCR的III第一链合成SuperMix(SuperScript(注册商标)III First-Strand Synthesis SuperMix forqRT-PCR)(Invitrogen)进行逆转录,将制成的cDNA用于模板,通过ABI Prism 7500快速实时荧光定量PCR系统(Life Technologies)进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)。将结果示于图4。
在使用“332”时,神经标记物的SOX2的基因表达下调。在使用“211”时,虽然神经嵴标记物的SOX10及p75的基因表达在第4周上调,但作为眼睛主要转录因子的PAX6的表达较低。在使用“411”及“511”时,作为视网膜的标记物的RAX、VSX2的表达较高。在使用“332”时,上皮细胞标记的上皮钙粘蛋白(Ecad)、TP63、K14较高。通过以上可以定量地确认到由实施例2的定性的同工型造成的分化的方向变化。
实施例4 iPS细胞的集落形成过程的延时分析
在使用“332”或“511”(一共为0.5μg/cm2)进行了包被的培养容器上接种iPS细胞,使用IncuCyte(注册商标)活细胞分析系统(Essen BioScience)获得延时摄影后的各培养天数的相差图像。将结果示于图5。
iPS细胞在“332”上频繁地引起细胞集体运动并呈放射状,形成面积较广的集落,与此相对,在“511”上难以引起集体运动,确认到形成了密度较高的集落。
实施例5 iPS细胞的集落中参与Hippo途径的转录共激活因子YAP的定位与神经外胚层分化的关系
在使用“332”或“511”(均为0.5μg/cm2)进行了包被的培养容器上接种iPS细胞,对在StemFit(注册商标)培养基(Ajinomoto Co.,Inc.)中培养了10天后的细胞、或对在StemFit(注册商标)培养基中培养了10天后再交换为与在实施例1中使用的分化培养基(DM)相同的培养基培养3天的细胞去除培养液后,用TBS清洗,使用4%多聚甲醛/PBS或冷甲醇进行固定。然后,在用TBS清洗后,为了进行细胞破碎(膜透過処理),交换为1%NST/TBS(1%正常驴血清、0.3%Triton-X100)后,在4℃下静置过夜。进一步,在用含有5%驴正常血清及0.3%Triton-X100的TBS在室温下进行1小时封闭后,加入第一抗体,在室温下反应1小时或在4℃下反应过夜。然后,在用PBS清洗3次后,加入第二抗体,在室温下反应1小时。作为第一抗体,使用了抗YAP抗体(小鼠单克隆抗体;63.7、Santa Cruz Biotechnology)及抗神经钙粘蛋白抗体(兔单克隆抗体;EPR1791-4、Abcam)。作为第二抗体,使用了Alexa Fluor(注册商标)488或594标记的抗小鼠或兔IgG抗体(Invitrogen)。抗体均使用1%NST/TBS进行稀释而使用。细胞核的染色通过使用Hoechst 33342在室温下处理10分钟来进行。使用蔡司顶级倒置荧光显微镜(Axio Observer.D1)(Carl Zeiss)进行观察。将结果示于图6。左边为iPS细胞培养10天后的YAP的染色结果,右边为分化培养3天后的染色结果,其中上排为YAP的染色结果,中间为神经钙粘蛋白的染色结果,下排为将两者重叠的结果。
若在“511”上培养iPS细胞,则在集落的外周,YAP定位于细胞核内,与此相对,在密度高的集落中央,YAP定位于细胞核外,暗示了Hippo信号被激活。若在交换为分化培养基后培养3天,则仅在集落中央的YAP定位于核外的区域、即仅在Hippo途径激活区域上发生显示神经外胚层分化的神经钙粘蛋白阳性细胞的分化。另一方面,通过使用“332”减小iPS细胞集落的密度,并在集落的整个区域内通过使YAP定位于核内、即通过使Hippo途径失活,能够阻碍神经钙粘蛋白阳性细胞向神经外胚层的分化,促进向相当于之后的角膜上皮前驱的表面外胚层细胞的分化。
实施例6经过分化诱导的细胞的角膜上皮标记物阳性率的分析
在使用“111”、“211”、“332”、“411”或“511”(均为0.5μg/cm2)进行了包被的培养容器上接种iPS细胞,用Accutase(Life Technologies)对通过与实施例1相同的方法进行了分化诱导的细胞进行处理后,在KCM培养基(含有5%FBS(Japan Bio Serum)、0.4μg/mL氢化可的松琥珀酸酯(Wako)、2nM三碘代甲状腺素钠盐(MP biomedicals)、1nM霍乱毒素(ListBiological Laboratory)、2.25μg/mL牛饱和铁转铁蛋白(bovine transferrin HOLOform)(Life Technologies)、2mM L-谷氨酰胺、0.5%胰岛素-转铁蛋白-硒溶液(LifeTechnologies.)、1%青霉素-链霉素溶液的DMEM(不含L-谷氨酰胺/F-12营养混合物)培养基(3:1(v/v)、Life Technologies))中进行再混悬,通过细胞滤网(40μm,BD Biosciences)后,在冰上用抗SSEA-4抗体(MC813-70,Biolegend)、CD104抗体(ITGB4;58XB4、Biolegend或624024,BD Pharmingen)及CD200抗体(624052,BD Pharmingen)染色1小时,然后用PBS清洗,然后使用SH800流式细胞分选仪(Sony Corporation)或FACS VerseTM流式细胞仪(BDBiosciences)进行分析。数据分析使用FlowJo(Tree Star)。将结果示于图7。
角膜上皮(前驱)细胞可根据非专利文献1定义为SSEA4/ITGB4共阳性细胞,与使用“511”时相比,通过使用“332”,能够使SSEA4/ITGB4共阳性细胞的比例上升3倍左右。此外,在使用“511”时,需要通过手动的移液操作物理去除第一层与第二层的工序,假定应用于再生医疗时,存在耗费劳力、发生人为错误的可能性。另一方面,通过使用“332”,能够省略通过移液去除非上皮细胞的这一操作,暗示了其更有效。
实施例7分化诱导过程中未分化标记物的基因表达分析与分化诱导6周的iPS细胞衍生的角膜上皮细胞片的评价
在用“332”或“511”(均为0.5μg/cm2)包被的培养容器上接种iPS细胞,在通过与实施例1相同的方法进行分化诱导后,通过实施例3所述的方法对4、6、12周(w)后的细胞中的未分化标记物LIN28A的基因表达进行分析。
此外,同样地用实施例6所述的抗体对6周后的分化细胞进行染色后,通过SH800流式细胞分选仪(Sony Corporation)分选非专利文献1中记载的SSEA4、ITGB4共阳性细胞,接种至细胞培养池(BD Falcon)中,在CEM培养基中培养3周后,用手术刀连同膜一同切下,用OCT冰冻切片包埋剂包埋并冻结后,使用低温恒温器(RAICA CO.,LTD)制备切片。制成切片后,进行风干,在室温下用含有5%驴正常血清及0.3%Triton-X100的TBS封闭1小时后,加入第一抗体,在室温下反应1小时或在4℃下反应过夜。然后,在使用TBS清洗3次后,加入第二抗体,在室温下反应1小时。作为第一抗体,使用了抗PAX6抗体(兔多克隆抗体;ab97866,Abcam)及抗K12抗体(山羊多克隆抗体;N-16,Santa Cruz Biotechnology)。作为第二抗体,使用了Alexa Fluor(注册商标)488或567标记抗小鼠或兔IgG抗体(Invitrogen)。抗体均用含有1%驴正常血清及0.3%Triton-X100的TBS进行稀释而使用。细胞核的染色通过在室温下用100倍稀释浓度的Hoechst 33342处理10分钟来进行。使用蔡司顶级倒置荧光显微镜(Axio Observer.D1)(Carl Zeiss)进行观察。将结果示于图8。
在假定iPS细胞衍生的分化细胞的临床应用的情况下,存在由未分化细胞的混入造成的致瘤性的问题,有报告指出LIN28A对于未分化标记物的混入而言为有用的标记物。与“511”相比,通过使用“332”,能够将分化诱导的各阶段中的分化标记物LIN28A的表达量均抑制在2倍以上。此外,通常在制备角膜上皮片时,进行12周左右的分化诱导,然后通过FACS仅分离角膜上皮细胞,但在由分化诱导6周的细胞制备的片中,对于在“511”上分化的细胞,为角膜上皮标记物的PAX6、K12的表达不充分,而从在“332”上分化诱导的细胞中采集并制备的角膜上皮片充分地表达上述标记物。综上可知,通过使用“332”,能够将分化诱导的周期缩短至一半的6周。
实施例8各层粘连蛋白同工型上的眼周细胞的细胞存活率
通过与实施例1相同的方法,使用“511”,通过手动移液回收由iPS细胞分化诱导6周后形成的SEAM结构中的第一~第四层的细胞后,将通过StemPro(注册商标)Accutase(注册商标)(Thermo Fisher Scientific)进行解离的细胞或通过实施例7所述的FACS分选进行了分选的细胞,以相同的细胞数量分别接种在用“111”、“211”、“332”、“411”或“511”(均为0.5μg/cm2)进行了包被的细胞培养板上。在CDM培养基中对接种后的细胞进行6周培养后,利用Cell Counting Kit-8(Dojindo Molecular Technologies,Inc.)测定细胞数量,作为相对于“511”的相对细胞存活率进行计算。将结果示于图9。
在“332”上确认到了第一层(神经)与第二层(视网膜)的细胞几乎不增加,与此相对,确认到了第三层(角膜上皮)、第四层(其他上皮)的细胞的增殖。因此暗示了“332”使SEAM结构中的第三层与第四层的细胞特异性增殖。
实施例9各层粘连蛋白同工型上的分化细胞的比例
在实施例3中对分化诱导细胞的基因表达进行了研究,本实施例中对此时的表达量进行了详细对比。具体而言,对于分化诱导第4周的神经嵴标记基因表达结果,提取在“211”上分化诱导的细胞与在“511”上分化诱导的细胞。此外,同样地提取处在分化诱导12周的神经钙粘蛋白基因的“411”与“511”的表达分析结果。进一步,还提取了对在实施例6中定量的角膜上皮标记物阳性率进行对比的结果。将结果一并示于图10。
与“511”相比,在“211”上分化诱导第4周的神经嵴标记物的SOX10上升了约17倍,p75上升了约2倍。此外,图3中已示出了在“411”上视网膜(CHX10阳性细胞)区域扩增,但还示出了神经钙粘蛋白的表达比上升至1.25倍左右,相对于上皮细胞的占有比例,视网膜细胞的占有比例在“411”上更高。另一方面,通过在“332”上分化诱导,与“511”相比,角膜上皮标记物阳性细胞的比例增高了2倍以上。
实施例10Wnt信号靶基因的表达分析
在使用“111”、“211”、“332”、“411”或“511”(均为0.5μg/cm2)进行了包被的培养容器上接种iPS细胞,对以与实施例1相同的方法分化诱导第3天的iPS衍生细胞的Wnt信号的目的基因的表达进行分析。将结果示于图11。
通过在“211”上进行分化诱导,为Wnt信号的目的基因的AXIN2及LEF-1的基因表达上调。因此暗示了与在其他同工型上的分化诱导相比,在“211”上激活了促进神经嵴分化的Wnt信号。
实施例11基于层粘连蛋白的包被浓度的分化调节
在将“511”的包被浓度设为0.5、1.0、1.5(μg/cm2)的状态下,以与实施例1相同的方法进行分化诱导,对12周后的基因表达进行分析。将结果示于图12。
复层上皮干细胞标记物TP63的基因表达以依赖“511”的包被浓度的方式下调,另一方面,视网膜感觉层标记物VSX2的基因表达上调。综上,暗示了与iPS细胞的相互作用越强,则越促进视网膜的分化,若为中等程度则促进上皮化。
实施例12基于各层粘连蛋白同工型的包被浓度的向角膜上皮细胞的分化诱导
在将“111”、“211”、“332”、“411”、“511”或“VN”的包被浓度设为0.5、1.0、1.5(μg/cm2)的状态下,以与实施例1相同的方法进行分化诱导,以与实施例6相同的方式通过FACS分析对角膜上皮细胞部分进行定量。将结果示于图13。
通过使用“332”,能够在各浓度中稳定高效地诱导角膜上皮细胞。此外,已知在使用“511”时,若浓度变高则诱导效率下降。
实施例13神经嵴细胞标记基因的表达分析
在将“111”、“211”、“332”、“411”或“511”的包被浓度设为0.5~1.0(μg/cm2)的状态下,通过公知的方法,从以与实施例1相同的方法进行了分化诱导第3天的iPS衍生细胞中回收RNA。使用RNeasy Plus micro kit(Qiagen)对得到的RNA进行提纯,使用Sure PrintG3human8×60K slides(Agilent Technologies、Palo Alto、CA、USA)进行基因芯片分析(Takara Bio Inc.),使用GeneSpring GX软件(Agilent Technologies),制成神经嵴细胞标记基因的热图。将结果示于图14。
在使用“211”时,得到了各种神经嵴标记物的表达量多的分化细胞,因此表示:通过使用“211”,能够良好地进行向神经嵴细胞的分化调控。
实施例14神经嵴细胞标记物的表达分析
在将“211”的包被浓度设为0.5~1.0(μg/cm2)的状态下,通过与实施例2相同的方法,使以与实施例1相同的方法分化诱导了4周(w)的细胞与抗体反应。作为第一抗体,使用了抗PITX2抗体(Abcam,Ab55599)及抗FOXC1抗体(Cell Signaling Technology,8758)。作为第二抗体,使用了Alexa Fluor(注册商标)488、594标记抗小鼠或兔IgG抗体(Invitrogen)。抗体均使用1%NST/TBS(含有1%正常驴血清、0.3%Triton-X100的TBS)进行稀释而使用。以与实施例2相同的方式进行细胞核的染色及细胞的观察。将结果示于图15。
通过在“211”上的分化诱导,出现了眼周神经嵴标记物PITX2、FOXC1阳性细胞。
实施例15Wnt信号传导途径相关基因的表达分析
使用以“111”、“211”、“332”、“411”或“511”包被的培养容器,以与实施例13相同的方式制作Wnt信号传导途径相关基因的热图。将结果示于图16。
显示在使用“211”时,Wnt信号传导途径相关基因表达上调。
实施例16Wnt信号与向神经嵴细胞的分化(其一)
使用以1.0μg/cm2包被了“211”的培养容器或以0.5μg/cm2包被了“511”的培养容器,以与实施例1相同的方法进行2周分化诱导时,在最初的3天使用为Wnt信号传导途径拮抗剂的IWP-2或为Wnt信号传导途径激动剂的CHIR99021进行处理,以与实施例6相同的方式进行FACS分析。使用针对CD271(p75、C40-1457;BD Pharmingen、Franklin Lakes、NJ、USA)与CD40d(ITGA4、9F10;BioLegend,Inc.)的抗体来进行FACS。另外,在各对照中使用了添加有DMSO的体系。将结果示于图17。另外,在图中,上排表示本实施例的分化诱导过程的概略图。
通过在“211”上的分化诱导,神经嵴细胞以非常高的比例出现(43%)。然而,通过添加Wnt拮抗剂,“211”上的神经嵴细胞分化被抑制。另一方面,在“511”上的分化诱导中,神经嵴细胞的比例止于0.35%,但通过使用Wnt激动剂进行处理,该比例上升至6.2%。因此,体现了Wnt信号传导途径在神经嵴细胞分化中是重要的。
实施例17Wnt信号与向神经嵴细胞的分化(其二)
对于在实施例16中分化诱导的细胞,使用p75抗体(ADVANCED TRGETING SYSTEMS,AB-N07)与SOX10抗体(Santa Cruz Biotechnology,sc-17342),以与实施例2相同的方式进行免疫染色。将结果示于图18。
通过在“211”上的分化诱导,虽然出现了p75、SOX10共阳性的神经嵴细胞(DMSO),但共阳性细胞由于Wnt抑制而减弱(IWP)。另一方面,通过在“511”上的分化诱导,所出现的p75、SOX10共阳性的神经嵴细胞的出现由于Wnt促进而增加(DMSO与CHIR的对比)。箭头表示p75、SOX10共阳性的神经嵴细胞。
实施例18MLC(肌球蛋白轻链(Myosin light chain))的磷酸化分析
使用以1.0μg/cm2包被了“211”的培养容器、以0.5μg/cm2包被了“332”的培养容器、或以0.5μg/cm2包被了“511”的培养容器,以与实施例1相同的方法培养3天iPS细胞,固定后,使用肌球蛋白轻链(phospo S20)抗体(Abcam,ab2480),以与实施例2相同的方式进行免疫染色。将结果示于图19。
在“511”上,在iPS细胞集落的外周部确认到了MLC的磷酸化(图中的箭头部分),表示在集落外周发挥收缩作用。另一方面,显示在层粘连蛋白“211”上,在iPS细胞集落外周的收缩程度弱。
实施例19MLC与黏着斑蛋白的磷酸化分析
对于以与实施例18相同的方式培养10天后的iPS细胞,在使用RIPA缓冲液(Thermo)进行细胞提取后,使用Pierce(注册商标)BCA蛋白定量试剂盒(Thermo FisherScientific)对蛋白质的量进行定量,然后以成为相同的蛋白质量的方式进行SDS-PAGE。在SDS-PAGE后,使用iBlot system(Invitrogen、Waltham、MA、USA)转印至膜上,使用针对p-MLC(ab2480,1:1000;Abcam,Cambridge,UK)、磷酸化黏着斑蛋白(V4889,1:1,000;Sigma-Aldrich)、黏着斑蛋白(ab18058;Abcam)或GAPDH(ab8245,1:5,000;Abcam)的第一抗体,针对辣根过氧化物酶结合抗小鼠IgG(horseradish peroxidase-conjugated anti-mouseIgG)(ab6789、1:5,000;Abcam)或抗兔IgG(ab97051、1:5,000;Abcam)的第二抗体,进行抗体反应。使用ECL Prime试剂(GE Healthcare,Little Chalfont,UK)进行检测,使用ChemiDocXRS+成像系统(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)进行扫描。将结果示于图20。
MLC的磷酸化在“511”中较强,在“211”中较弱。另一方面,识别细胞间粘着的黏着斑蛋白的Y822的磷酸化在“211”中(J Cell Biol.2014Apr 28;205(2):251-63.doi:10.1083/jcb.201309092.Epub 2014Apr 21.)特别强。综上显示,在“511”上iPS细胞强烈收缩,在“211”中细胞粘着占优势。
实施例20iPS集落内的细胞密度
使用以0.5μg/cm2包被了“332”的培养容器或以0.5μg/cm2包被了“511”的培养容器,对于以与实施例1相同的方法培养了10天的iPS细胞,以与实施例2相同的方式进行封闭与细胞核染色,对细胞数量进行计数,计算每1mm2的细胞密度。将结果示于图21。
在“511”上的iPS集落的中央,细胞密度最高。
实施例21YAP活性的差异
使用以0.5μg/cm2包被了“332”的培养容器或以0.5μg/cm2包被了“511”的培养容器,对于以与实施例1相同的方法培养了10天的iPS细胞,以与实施例3相同的方式分析基因表达。将结果示于图22。
与“332”相比,“511”上的iPS细胞的YAP目的基因(CTGF、CYR61)的表达量低,因此显示在“511”上YAP的活性被抑制。
实施例22集落的聚集与神经外胚层分化
使用以0.25~1μg/cm2包被了“511”的培养容器,对于以与实施例1相同的方法培养了10天的iPS细胞,使用EVOS FL Auto system(Life Technologies)对集落的直径进行了定量。此外,与所述不同,对于直接分化诱导的分化第3天的细胞,以与实施例2相同的方式进行免疫染色。将结果示于图23。
iPS细胞集落依赖于“511”的包被浓度而聚集。此外,由于集落的聚集,PAX6的表达以依赖包被浓度的方式上调。因此显示“511”促进集落的凝集与神经外胚层分化。
实施例23YAP活化与神经外胚层分化
使用以0.5μg/cm2包被了“511”的培养容器,以与实施例1相同的方法培养iPS细胞10天后,在添加有Verteporfin(VP)或DMSO的分化培养基中培养3天,使用抗PAX6抗体(BioLegend,Inc.、PRB-278P),以与实施例2相同的方式进行免疫染色。此外,以与实施例21相同的方式分析基因表达。将结果示于图24。
通过为YAP-TEAD拮抗剂的VP处理,PAX6或RAX等神经外胚层标记物的表达上调。因此,显示在早期分化中的YAP的失活促进了神经外胚层分化。综上,显示“511”使iPS集落聚集,使细胞密度上升,促进YAP的失活,由此促进神经外胚层分化。
工业实用性
根据本发明,能够由多能干细胞简便地制备使分化诱导细胞的比率任意变化的细胞群。通过该制备方法得到的细胞群在基于细胞治疗的疾病治疗上是极其有用的。
Claims (12)
1.一种多能干细胞的分化调控方法,其特征在于,将与多能干细胞的结合亲和力作为指标,选择层粘连蛋白或其片段,在该层粘连蛋白或其片段的存在下分化诱导多能干细胞。
2.根据权利要求1所述的分化调控方法,其中,在层粘连蛋白332或层粘连蛋白332E8片段的存在下,调控向角膜上皮细胞的分化。
3.根据权利要求1所述的分化调控方法,其中,在层粘连蛋白111或层粘连蛋白111E8片段的存在下,调控向神经细胞的分化。
4.根据权利要求1所述的分化调控方法,其中,在层粘连蛋白211或层粘连蛋白211E8片段的存在下,调控向神经嵴细胞的分化。
5.根据权利要求1所述的分化调控方法,其中,在层粘连蛋白411或层粘连蛋白411E8片段的存在下,调控向视网膜细胞的分化。
6.根据权利要求1所述的分化调控方法,其中,在层粘连蛋白411或层粘连蛋白411E8片段的存在下,调控向神经嵴细胞的分化。
7.一种眼周细胞群的制备方法,其中,培养通过权利要求1~6中任一项所述的分化调控方法诱导的多能干细胞的分化细胞。
8.根据权利要求7所述的制备方法,其中,所得到的细胞群为角膜上皮细胞群。
9.一种移植用角膜上皮细胞片的制备方法,其特征在于,使用通过权利要求8所述的制备方法得到的角膜上皮细胞群。
10.一种多能干细胞的分化诱导剂,其含有选自由层粘连蛋白111、层粘连蛋白211、层粘连蛋白332、层粘连蛋白411及层粘连蛋白511组成的组中的层粘连蛋白或其E8片段而成。
11.用于调控多能干细胞的分化的、选自由层粘连蛋白111、层粘连蛋白211、层粘连蛋白332、层粘连蛋白411及层粘连蛋白511组成的组中的层粘连蛋白或其E8片段的应用。
12.一种层粘连蛋白或其E8片段,其用于多能干细胞的分化调控,其选自由层粘连蛋白111、层粘连蛋白211、层粘连蛋白332、层粘连蛋白411及层粘连蛋白511组成的组。
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