JPWO2018143312A1 - 多能性幹細胞の分化制御方法 - Google Patents
多能性幹細胞の分化制御方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2018143312A1 JPWO2018143312A1 JP2018565630A JP2018565630A JPWO2018143312A1 JP WO2018143312 A1 JPWO2018143312 A1 JP WO2018143312A1 JP 2018565630 A JP2018565630 A JP 2018565630A JP 2018565630 A JP2018565630 A JP 2018565630A JP WO2018143312 A1 JPWO2018143312 A1 JP WO2018143312A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- laminin
- cells
- differentiation
- cell
- fragment
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 title claims abstract description 169
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 81
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 77
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 340
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 99
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 34
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 34
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 claims description 242
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims description 72
- 210000001982 neural crest cell Anatomy 0.000 claims description 39
- 108010028309 kalinin Proteins 0.000 claims description 19
- 108010038862 laminin 10 Proteins 0.000 claims description 16
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 13
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 claims description 13
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 claims description 12
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims description 11
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 claims description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 2
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 219
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 45
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 37
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 37
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 34
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 29
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 22
- 102000013814 Wnt Human genes 0.000 description 21
- 108050003627 Wnt Proteins 0.000 description 21
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 19
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 18
- 101000759453 Homo sapiens YY1-associated protein 1 Proteins 0.000 description 16
- 102100023267 YY1-associated protein 1 Human genes 0.000 description 16
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 16
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 15
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 13
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 12
- 102100026879 Interleukin-2 receptor subunit beta Human genes 0.000 description 11
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 11
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 11
- 101000664703 Homo sapiens Transcription factor SOX-10 Proteins 0.000 description 10
- 102100038808 Transcription factor SOX-10 Human genes 0.000 description 10
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- 108050007957 Cadherin Proteins 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 102000016349 Myosin Light Chains Human genes 0.000 description 9
- 108010067385 Myosin Light Chains Proteins 0.000 description 9
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 102000000905 Cadherin Human genes 0.000 description 8
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 8
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 8
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 7
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 7
- 210000000933 neural crest Anatomy 0.000 description 7
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 7
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 7
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010032788 PAX6 Transcription Factor Proteins 0.000 description 6
- 102100037506 Paired box protein Pax-6 Human genes 0.000 description 6
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 6
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 6
- 230000004655 Hippo pathway Effects 0.000 description 5
- 101001015006 Homo sapiens Integrin beta-4 Proteins 0.000 description 5
- 101000854931 Homo sapiens Visual system homeobox 2 Proteins 0.000 description 5
- 102100033000 Integrin beta-4 Human genes 0.000 description 5
- 108050000637 N-cadherin Proteins 0.000 description 5
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 5
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 5
- 102100020676 Visual system homeobox 2 Human genes 0.000 description 5
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 5
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 5
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 5
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 5
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 4
- 102000003972 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 description 4
- 108090000385 Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 description 4
- 102100027881 Tumor protein 63 Human genes 0.000 description 4
- 101710140697 Tumor protein 63 Proteins 0.000 description 4
- 210000003560 epithelium corneal Anatomy 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 4
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 4
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 3
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 3
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 101000984042 Homo sapiens Protein lin-28 homolog A Proteins 0.000 description 3
- 101000713575 Homo sapiens Tubulin beta-3 chain Proteins 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 102100025460 Protein lin-28 homolog A Human genes 0.000 description 3
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102100036790 Tubulin beta-3 chain Human genes 0.000 description 3
- 102000003970 Vinculin Human genes 0.000 description 3
- 108090000384 Vinculin Proteins 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 3
- 230000017455 cell-cell adhesion Effects 0.000 description 3
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 3
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 description 3
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 210000001542 lens epithelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 3
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 210000003061 neural cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 3
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 3
- ZQFGRJWRSLZCSQ-ZSFNYQMMSA-N verteporfin Chemical compound C=1C([C@@]2([C@H](C(=O)OC)C(=CC=C22)C(=O)OC)C)=NC2=CC(C(=C2C=C)C)=NC2=CC(C(=C2CCC(O)=O)C)=NC2=CC2=NC=1C(C)=C2CCC(=O)OC ZQFGRJWRSLZCSQ-ZSFNYQMMSA-N 0.000 description 3
- 229960003895 verteporfin Drugs 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 230000004156 Wnt signaling pathway Effects 0.000 description 2
- 108010076089 accutase Proteins 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 2
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 2
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 210000001654 germ layer Anatomy 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 210000005157 neural retina Anatomy 0.000 description 2
- 238000012758 nuclear staining Methods 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LXHCVQFUTOUZEQ-YDALLXLXSA-N (2s)-2-amino-3-[4-(4-hydroxy-3-iodophenoxy)-3,5-diiodophenyl]propanoic acid;sodium Chemical compound [Na].IC1=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC=C(O)C(I)=C1 LXHCVQFUTOUZEQ-YDALLXLXSA-N 0.000 description 1
- 101150101112 7 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100035683 Axin-2 Human genes 0.000 description 1
- 239000012583 B-27 Supplement Substances 0.000 description 1
- 238000009020 BCA Protein Assay Kit Methods 0.000 description 1
- 102100024505 Bone morphogenetic protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 101000766308 Bos taurus Serotransferrin Proteins 0.000 description 1
- 102100031168 CCN family member 2 Human genes 0.000 description 1
- AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N CT 99021 Chemical compound CC1=CNC(C=2C(=NC(NCCNC=3N=CC(=CC=3)C#N)=NC=2)C=2C(=CC(Cl)=CC=2)Cl)=N1 AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 241000766026 Coregonus nasus Species 0.000 description 1
- 102000005889 Cysteine-Rich Protein 61 Human genes 0.000 description 1
- 108010019961 Cysteine-Rich Protein 61 Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 102100021084 Forkhead box protein C1 Human genes 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 101000874569 Homo sapiens Axin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000762379 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000777550 Homo sapiens CCN family member 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001052035 Homo sapiens Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001060261 Homo sapiens Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 description 1
- 101000818310 Homo sapiens Forkhead box protein C1 Proteins 0.000 description 1
- 101000994375 Homo sapiens Integrin alpha-4 Proteins 0.000 description 1
- 101000595669 Homo sapiens Pituitary homeobox 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102100032818 Integrin alpha-4 Human genes 0.000 description 1
- 102100022699 Lymphoid enhancer-binding factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108090001093 Lymphoid enhancer-binding factor 1 Proteins 0.000 description 1
- WRKPZSMRWPJJDH-UHFFFAOYSA-N N-(6-methyl-1,3-benzothiazol-2-yl)-2-[(4-oxo-3-phenyl-6,7-dihydrothieno[3,2-d]pyrimidin-2-yl)thio]acetamide Chemical compound S1C2=CC(C)=CC=C2N=C1NC(=O)CSC1=NC=2CCSC=2C(=O)N1C1=CC=CC=C1 WRKPZSMRWPJJDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102100036090 Pituitary homeobox 2 Human genes 0.000 description 1
- 239000012083 RIPA buffer Substances 0.000 description 1
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010008125 Tenascin Proteins 0.000 description 1
- 102100038126 Tenascin Human genes 0.000 description 1
- 102100024270 Transcription factor SOX-2 Human genes 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 1
- 102100035140 Vitronectin Human genes 0.000 description 1
- 229940126697 YAP-TEAD PPI inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 210000002821 alveolar epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000000013 bile duct Anatomy 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000009087 cell motility Effects 0.000 description 1
- 210000002953 cell of surface ectoderm Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 208000021921 corneal disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 210000005064 dopaminergic neuron Anatomy 0.000 description 1
- 210000003027 ear inner Anatomy 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 210000001900 endoderm Anatomy 0.000 description 1
- 210000003989 endothelium vascular Anatomy 0.000 description 1
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 208000030533 eye disease Diseases 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 102000057239 human FGF7 Human genes 0.000 description 1
- VWQWXZAWFPZJDA-CGVGKPPMSA-N hydrocortisone succinate Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)COC(=O)CCC(O)=O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VWQWXZAWFPZJDA-CGVGKPPMSA-N 0.000 description 1
- 229950006240 hydrocortisone succinate Drugs 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 1
- 210000002490 intestinal epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 108010057670 laminin 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010057717 laminin 8 Proteins 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 1
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 210000002161 motor neuron Anatomy 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 229940028444 muse Drugs 0.000 description 1
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 210000002856 peripheral neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 238000010587 phase diagram Methods 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 1
- 210000002363 skeletal muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 210000002785 stratified epithelial stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000005758 transcription activity Effects 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0618—Cells of the nervous system
- C12N5/0619—Neurons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0618—Cells of the nervous system
- C12N5/0621—Eye cells, e.g. cornea, iris pigmented cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/48—Reproductive organs
- A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells
- A61K35/545—Embryonic stem cells; Pluripotent stem cells; Induced pluripotent stem cells; Uncharacterised stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
- A61K38/1825—Fibroblast growth factor [FGF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/50—Proteins
- C12N2533/52—Fibronectin; Laminin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Neurology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Virology (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
〔1〕 多能性幹細胞との結合親和性を指標としてラミニン又はそのフラグメントを選択し、該ラミニン又はそのフラグメントの存在下に多能性幹細胞を分化誘導することを特徴とする、多能性幹細胞の分化制御方法。
〔2〕 ラミニン332又はラミニン332E8フラグメントの存在下に角膜上皮細胞への分化を制御する、前記〔1〕記載の分化制御方法。
〔3〕 ラミニン111又はラミニン111E8フラグメントの存在下に神経細胞への分化を制御する、前記〔1〕記載の分化制御方法。
〔4〕 ラミニン211又はラミニン211E8フラグメントの存在下に神経堤細胞への分化を制御する、前記〔1〕記載の分化制御方法。
〔5〕 ラミニン411又はラミニン411E8フラグメントの存在下に網膜細胞への分化を制御する、前記〔1〕記載の分化制御方法。
〔6〕 ラミニン411又はラミニン411E8フラグメントの存在下に神経堤細胞への分化を制御する、前記〔1〕記載の分化制御方法。
〔7〕 前記〔1〕〜〔6〕いずれかに記載の分化制御方法により誘導された多能性幹細胞の分化細胞を培養する、眼周囲細胞集団の製造方法。
〔8〕 得られる細胞集団が角膜上皮細胞集団である、前記〔7〕記載の製造方法。
〔9〕 前記〔8〕記載の製造方法により得られた角膜上皮細胞集団を使用することを特徴とする、移植用角膜上皮細胞シートの製造方法。
〔10〕 ラミニン111、ラミニン211、ラミニン332、ラミニン411及びラミニン511からなる群より選ばれるラミニン又はそのE8フラグメントを含有してなる、多能性幹細胞の分化制御剤。
〔11〕 多能性幹細胞の分化を制御するための、ラミニン111、ラミニン211、ラミニン332、ラミニン411及びラミニン511からなる群より選ばれるラミニン又はそのE8フラグメントの使用。
〔12〕 多能性幹細胞の分化制御において使用するための、ラミニン111、ラミニン211、ラミニン332、ラミニン411及びラミニン511からなる群より選ばれるラミニン又はそのE8フラグメント。
細胞集団(1):網膜細胞含有率が高い細胞集団
細胞集団(2):神経堤細胞含有率が高い細胞集団
細胞集団(3):神経細胞含有率が高い細胞集団
細胞集団(4):角膜上皮細胞含有率が高い細胞集団
iPS細胞から眼周囲細胞の分化誘導には、self-formed ectodermal autonomous multi-zone(SEAM)法を用いた(Hayashi et al. Nature. 2016 Mar 17;531(7594):376-80.)。分化誘導の工程概略を図1に示す。なお、用いたラミニンアイソフォームは、ラミニン111のE8フラグメント(ラミニン111E8)、ラミニン211のE8フラグメント(ラミニン211E8)、ラミニン332のE8フラグメント(ラミニン332E8)、ラミニン411のE8フラグメント(ラミニン411E8)及びラミニン511のE8フラグメント(ラミニン511E8)であり、いずれも公知技術に従って調製したものである。
実施例1と同様の方法で分化誘導し、開始から適切な期間培養した細胞を、培養液を除去し、PBSで洗浄した後、4% paraformaldehyde/PBS又は冷メタノールにて固定した。次いで、TBSで3回洗浄し、5%ロバ正常血清及び0.3%Triton-X100含有TBSで室温にて1時間ブロッキングした後、一次抗体を加え室温で1時間又は4℃で一晩反応させた。その後、TBSで3回洗浄した後、二次抗体を加え室温で1時間反応させた。なお、一次抗体として、神経堤細胞の検出には、抗p75抗体(Mouse monoclonal; ME20.4、ADVANCED TRGETING SYSTEMS)及び抗SOX10抗体(Goat polyclonal; N-20、Santa Cruz Biotechnology)を用いた。神経細胞の検出には、抗TUBB3抗体(Rabbit polyclonal; T2200、Sigma-Aldrich)を用いた。上皮細胞及び網膜細胞の検出には、それぞれ、抗E-cadherin抗体(Mouse monoclonal; 180215、R&D systems)及び抗CHX10抗体(Goat polyclonal; N-18、Santa Cruz Biotechnology)を用いた。角膜上皮細胞の検出には、抗PAX6抗体(Rabbit polyclonal; ab97866、Abcam)及び抗p63抗体(Mouse monoclonal; 4A4、Santa Cruz Biotechnology)を用いた。二次抗体には,Alexa Fluor(登録商標)488、567又は647標識抗マウス、ウサギ又はヒツジIgG抗体(Invitrogen)を使用した。抗体はいずれも1%ロバ正常血清及び0.3%Triton-X100含有TBSで希釈して使用した。核の染色は、100倍希釈濃度のHoechst 33342で室温にて10分間処理をすることで行った。観察にはAxio Observer.D1(Carl Zeiss)を使用した。結果を図3に示す。
実施例1と同様の方法で分化誘導し、分化培養の開始直前(0週)、4、6、12週後の細胞について、培養液を除去し、PBSで洗浄した後、QIAzol Lysis Reagent(QIAGEN)を用いて精製し、総量20μLの反応系にて,SuperScript(登録商標) III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR(Invitrogen)により逆転写を行い、作製したcDNAを鋳型に用いて、ABI Prism 7500 Fast Sequence Detection System(Life Technologies)により定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)を行った。結果を図4に示す。
「332」又は「511」(共に0.5μg/cm2)でコーティングした培養容器に、iPS細胞を播種し、IncuCyte(登録商標) Live Cell Analysis System(Essen BioScience)にてタイムラプス撮影後の各培養日数の位相差像を取得した。結果を図5に示す。
「332」又は「511」(いずれも0.5μg/cm2)でコーティングした培養容器にiPS細胞を播種し、10日間StemFit(登録商標)培地(味の素)で培養後の細胞又は10日間のStemFit(登録商標)培地で培養後に実施例1で用いた分化培地(DM)と同じ培地に交換して3日間培養した細胞を、培養液を除去した後、TBSで洗浄し、4% paraformaldehyde/PBS又は冷メタノールにて固定した。次いで、TBSで洗浄後、膜透過処理のため、1% NST/TBS(1% normal donkey serum、0.3% Triton-X100)に交換後、4℃で一晩静置した。更に、5%ロバ正常血清及び0.3%Triton-X100含有TBSで室温にて1時間ブロッキングした後、一次抗体を加え室温で1時間又は4℃で一晩反応させた。その後、PBSで3回洗浄した後、二次抗体を加え室温で1時間反応させた。一次抗体は、抗YAP抗体(Mouse monoclonal; 63.7、Santa Cruz Biotechnology)及び抗N-cadherin抗体(Rabbit monoclonal; EPR1791-4、Abcam)を用いた。二次抗体には、Alexa Fluor(登録商標)488又は594標識の抗マウス又はウサギIgG抗体(Invitrogen)を使用した。抗体はいずれも1% NST/TBSで希釈して使用した。核の染色は、Hoechst 33342で室温にて10分間処理をすることで行った。観察にはAxio Observer.D1(Carl Zeiss)を使用した。結果を図6に示す。左がiPS細胞培養10日後のYAPの染色結果、右が分化培養3日後のもので上段がYAPの染色結果、中段がN-cadherinの染色結果、下段が両者を重ねた結果である。
「111」、「211」、「332」、「411」又は「511」(いずれも0.5μg/cm2)でコーティングした培養容器にiPS細胞を播種し、実施例1と同様の方法で分化誘導した細胞を、Accutase (Life Technologies)にて処理後、KCM培地(5% FBS(Japan Bio Serum)、0.4μg/mL hydrocortisone succinate(Wako)、2nM 3,3′,5-Triiodo-l-thyronine sodium salt (MP biomedicals)、1nM cholera toxin(List Biological Laboratory)、2.25μg/mL 1 bovine transferrin HOLO form(Life Technologies)、2mM l-glutamine、0.5% insulin transferrin selenium solution(Life Technologies)、1% penicillin-streptomycinを含有させたDMEM without glutamine/Nutrient Mixture F-12 Ham培地(3:1(v/v)、Life Technologies))に再懸濁し、セルストレイナー(40μm、BD Biosciences)を通過させた後、抗SSEA-4抗体(MC813-70、Biolegend)、CD104抗体(ITGB4; 58XB4、Biolegend又は624024、BD Pharmingen)及びCD200抗体(624052、BD Pharmingen)にて氷上にて1時間染色後、PBSにて洗浄後、セルソーターSH800(SONY)又はFACS Verse(BD Biosciences)にて解析を行った。データ解析にはFlowJo(TreeStar)を用いた。結果を図7に示す。
「332」又は「511」(いずれも0.5μg/cm2)でコーティングした培養容器にiPS細胞を播種し、実施例1と同様の方法で分化誘導後4、6、12週後の細胞中の未分化マーカーLIN28Aの遺伝子発現を実施例3に記載の方法にて解析した。
実施例1と同様の方法で「511」を用いてiPS細胞より分化誘導6週後に形成されたSEAM構造中の第1〜4層の細胞をマニュアルピペッティングで回収後、StemPro(登録商標) Accutase(登録商標)(Thermo Fisher Scientific)にて解離又は実施例7に記載のFACS sortingにて単離したものを、同じ細胞数ずつ、「111」、「211」、「332」、「411」又は「511」(いずれも0.5μg/cm2)でコーティングした細胞培養プレートに播種した。播種後の細胞はCDM培地にて6週間培養後、細胞数をCell Counting Kit-8(同仁化学)により測定し、「511」に対する相対細胞生存率として算出した。結果を図9に示す。
実施例3において分化誘導細胞における遺伝子発現を検討したが、その際の発現量について詳細に対比を行った。具体的には、分化誘導4週目の神経堤マーカー遺伝子発現結果について、「211」上で分化誘導したものと「511」上で分化誘導したものを抽出した。また、同様に分化誘導12週におけるN-cadherin遺伝子の「411」と「511」の発現解析結果を抽出した。更に、実施例6において定量した角膜上皮マーカー陽性率を対比した結果も抽出した。結果を図10にまとめて示す。
「111」、「211」、「332」、「411」又は「511」(いずれも0.5μg/cm2)でコーティングした培養容器にiPS細胞を播種し、実施例1と同様の方法で分化誘導3日目のiPS由来細胞のWntシグナルの標的遺伝子の発現解析を行った。結果を図11に示す。
「511」のコーティング濃度を0.5、1.0、1.5(μg/cm2)にした状態で、実施例1と同様の方法で分化誘導を行い12週後の遺伝子発現解析を行った。結果を図12に示す。
「111」、「211」、「332」、「411」、「511」又は「VN」のコーティング濃度を0.5、1.0、1.5(μg/cm2)にした状態で、実施例1と同様の方法で分化誘導を行い、実施例6と同様にしてFACS解析にて、角膜上皮細胞画分を定量した。結果を図13に示す。
「111」、「211」、「332」、「411」又は「511」のコーティング濃度を0.5〜1.0(μg/cm2)にした状態で、実施例1と同様の方法で分化誘導3日目のiPS由来細胞から、公知の方法に従ってRNAを回収した。得られたRNAは、RNeasy Plus micro kit(Qiagen)を用いて精製し、Sure Print G3 human 8×60K slides(Agilent Technologies、Palo Alto、CA、USA)を用いてマイクロアレイ解析を行い(タカラバイオ)、GeneSpring GX software(Agilent Technologies)を用いて、神経堤細胞マーカー遺伝子のヒートマップを作製した。結果を図14に示す。
「211」のコーティング濃度を0.5〜1.0(μg/cm2)にした状態で、実施例1と同様の方法で4週間分化誘導した細胞を、実施例2と同様の方法で抗体と反応させた。一次抗体には、抗PITX2抗体(Abcam、Ab55599)及び抗FOXC1抗体(Cell Signaling Technology、8758)を用いた。二次抗体には、Alexa Fluor(登録商標)488、594標識抗マウス又はウサギIgG抗体(Invitrogen)を使用した。抗体はいずれも1% NST/TBS(1% normal donkey serum、0.3% Triton-X100含有TBS)で希釈して使用した。核の染色及び細胞の観察は、実施例2と同様にして行った。結果を図15に示す。
「111」、「211」、「332」、「411」又は「511」でコーティングした培養容器を用いて、実施例13と同様にして、Wntシグナル経路関連遺伝子のヒートマップを作製した。結果を図16に示す。
「211」を1.0μg/cm2又は「511」を0.5μg/cm2でコーティングした培養容器を用いて、実施例1と同様の方法で2週間分化誘導する際に、最初の3日間Wntシグナル経路阻害剤であるIWP-2又はWntシグナル経路促進剤であるCHIR99021で処理を行い、実施例6と同様にしてFACS解析を行った。FACSは、CD271(p75、C40-1457; BD Pharmingen、Franklin Lakes、NJ、USA)とCD40d(ITGA4、9F10; BioLegend)に対する抗体を用いて行った。なお、各ControlにはDMSOを添加した系を用いた。結果を図17に示す。なお、図中、上段には本実施例での分化誘導過程の概略図を示す。
実施例16で分化誘導された細胞について、p75抗体(ADVANCED TRGETING SYSTEMS、AB-N07)とSOX10抗体(Santa Cruz Biotechnology、sc-17342)を用いて、実施例2と同様にして免疫染色を行った。結果を図18に示す。
「211」を1.0μg/cm2、「332」を0.5μg/cm2又は「511」を0.5μg/cm2でコーティングした培養容器を用いて、実施例1と同様の方法で3日間iPS細胞を培養し、固定後、Myosin light chain (phospo S20)抗体(Abcam、ab2480)を用いて、実施例2と同様にして免疫染色を行った。結果を図19に示す。
実施例と18と同様にして10日間培養後のiPS細胞について、RIPA buffer(Thermo)で細胞抽出後、Pierce(登録商標)BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific)を用いてタンパク量を定量後、同タンパク量になるようにSDS-PAGEを行った。SDS-PAGE後は、iBlot system(Invitrogen、Waltham、MA、USA)を用いてメンブレンに転写し、p-MLC(ab2480、1:1000; Abcam、Cambridge、UK)、p-Vinculin(V4889、1:1,000; Sigma-Aldrich)Vinculin(ab18058; Abcam)又はGAPDH(ab8245、1:5,000; Abcam)に対する一次抗体、horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse IgG(ab6789、1:5,000; Abcam)又はanti-rabbit IgG(ab97051、1:5,000; Abcam)に対する二次抗体を用いて抗体反応を行った。ECL Prime reagent(GE Healthcare、Little Chalfont、UK)を用いて検出し、ChemiDoc XRS+ imaging system(Bio-Rad、Hercules、CA、USA)を用いてスキャンした。結果を図20に示す。
「332」を0.5μg/cm2又は「511」を0.5μg/cm2でコーティングした培養容器を用いて、実施例1と同様の方法で10日間培養したiPS細胞について、実施例2と同様にしてブロッキングと核染色を行って、細胞数をカウントし、1mm2あたりの細胞密度を算出した。結果を図21に示す。
「332」を0.5μg/cm2又は「511」を0.5μg/cm2でコーティングした培養容器を用いて、実施例1と同様の方法で10日間培養したiPS細胞について、実施例3と同様にして遺伝子発現を解析した。結果を図22に示す。
「511」を0.25〜1μg/cm2でコーティングした培養容器を用いて、実施例1と同様の方法で10日間培養したiPS細胞について、コロニーの直径をEVOS FL Auto system(Life Technologies)にて定量した。また、前記とは別に、そのまま分化誘導させた分化3日目の細胞について、実施例2と同様にして免疫染色を行った。結果を図23に示す。
「511」を0.5μg/cm2でコーティングした培養容器を用いて、実施例1と同様の方法で10日間iPS細胞を培養後、Verteporfin(VP)又はDMSOを添加した分化培地で3日間培養し、抗PAX6抗体(BioLegend、PRB-278P)を用いて実施例2と同様にして免疫染色を行った。また、実施例21と同様にして遺伝子発現も解析した。結果を図24に示す。
Claims (12)
- 多能性幹細胞との結合親和性を指標としてラミニン又はそのフラグメントを選択し、該ラミニン又はそのフラグメントの存在下に多能性幹細胞を分化誘導することを特徴とする、多能性幹細胞の分化制御方法。
- ラミニン332又はラミニン332E8フラグメントの存在下に角膜上皮細胞への分化を制御する、請求項1記載の分化制御方法。
- ラミニン111又はラミニン111E8フラグメントの存在下に神経細胞への分化を制御する、請求項1記載の分化制御方法。
- ラミニン211又はラミニン211E8フラグメントの存在下に神経堤細胞への分化を制御する、請求項1記載の分化制御方法。
- ラミニン411又はラミニン411E8フラグメントの存在下に網膜細胞への分化を制御する、請求項1記載の分化制御方法。
- ラミニン411又はラミニン411E8フラグメントの存在下に神経堤細胞への分化を制御する、請求項1記載の分化制御方法。
- 請求項1〜6いずれかに記載の分化制御方法により誘導された多能性幹細胞の分化細胞を培養する、眼周囲細胞集団の製造方法。
- 得られる細胞集団が角膜上皮細胞集団である、請求項7記載の製造方法。
- 請求項8記載の製造方法により得られた角膜上皮細胞集団を使用することを特徴とする、移植用角膜上皮細胞シートの製造方法。
- ラミニン111、ラミニン211、ラミニン332、ラミニン411及びラミニン511からなる群より選ばれるラミニン又はそのE8フラグメントを含有してなる、多能性幹細胞の分化制御剤。
- 多能性幹細胞の分化を制御するための、ラミニン111、ラミニン211、ラミニン332、ラミニン411及びラミニン511からなる群より選ばれるラミニン又はそのE8フラグメントの使用。
- 多能性幹細胞の分化制御において使用するための、ラミニン111、ラミニン211、ラミニン332、ラミニン411及びラミニン511からなる群より選ばれるラミニン又はそのE8フラグメント。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2017016302 | 2017-01-31 | ||
JP2017016302 | 2017-01-31 | ||
PCT/JP2018/003315 WO2018143312A1 (ja) | 2017-01-31 | 2018-01-31 | 多能性幹細胞の分化制御方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2018143312A1 true JPWO2018143312A1 (ja) | 2019-12-12 |
JP6942363B2 JP6942363B2 (ja) | 2021-09-29 |
Family
ID=63039756
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018565630A Active JP6942363B2 (ja) | 2017-01-31 | 2018-01-31 | 多能性幹細胞の分化制御方法 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11649433B2 (ja) |
EP (1) | EP3578640A4 (ja) |
JP (1) | JP6942363B2 (ja) |
KR (1) | KR102208889B1 (ja) |
CN (1) | CN110234755B (ja) |
AU (1) | AU2018215170B2 (ja) |
CA (1) | CA3052124A1 (ja) |
MY (1) | MY192056A (ja) |
SG (1) | SG11201907030VA (ja) |
WO (1) | WO2018143312A1 (ja) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20220008894A (ko) * | 2019-05-15 | 2022-01-21 | 아지노모토 가부시키가이샤 | 신경제세포 또는 각막 상피 세포의 순화 방법 |
JP7285520B2 (ja) * | 2019-08-06 | 2023-06-02 | 花王株式会社 | 皮膚由来多能性前駆細胞の作製方法 |
CN112458039A (zh) * | 2020-12-04 | 2021-03-09 | 浙江大学 | 一种肺泡类器官增殖和分化用的培养基及方法 |
CN116970566B (zh) * | 2023-09-22 | 2024-01-09 | 北京大学口腔医学院 | 诱导间充质干细胞神经分化的方法、神经干细胞及用途 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010134619A1 (ja) * | 2009-05-18 | 2010-11-25 | 国立大学法人東北大学 | 人工多能性幹細胞からの上皮系前駆細胞・幹細胞群及び角膜上皮細胞群の分化誘導方法 |
WO2012144582A1 (ja) * | 2011-04-20 | 2012-10-26 | 国立大学法人大阪大学 | 角膜上皮分化指向性iPS細胞 |
WO2016114285A1 (ja) * | 2015-01-15 | 2016-07-21 | 国立大学法人大阪大学 | 多能性幹細胞からの角膜上皮細胞の分化誘導 |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6361996B1 (en) | 1997-05-07 | 2002-03-26 | University Of Utah Research Foundation | Neuroepithelial stem cells and glial-restricted intermediate precursors |
US6703363B1 (en) * | 1999-04-30 | 2004-03-09 | Biostratum, Inc. | Recombinant laminin 5 |
AU2003228255A1 (en) | 2002-05-28 | 2003-12-19 | Becton, Dickinson And Company | Pancreatic acinar cells into insulin-producing cells |
MX347303B (es) * | 2006-03-07 | 2017-04-21 | Shroff Geeta | Composiciones que comprenden celulas madre embrionarias humanas y sus derivados, metodos de uso y metodos de preparacion. |
AU2006346492A1 (en) * | 2006-07-24 | 2008-01-31 | International Stem Cell Corporation | Synthetic cornea from retinal stem cells |
JP5590646B2 (ja) * | 2009-10-08 | 2014-09-17 | 国立大学法人大阪大学 | ヒト多能性幹細胞用培養基材およびその利用 |
US9598281B2 (en) | 2011-03-03 | 2017-03-21 | The Regents Of The University Of California | Nanopipette apparatus for manipulating cells |
CN105189738A (zh) | 2013-04-08 | 2015-12-23 | 国立研究开发法人医药基盘·健康·营养研究所 | 肝母细胞样细胞的培养方法及其培养物 |
WO2014199754A1 (ja) * | 2013-06-12 | 2014-12-18 | 国立大学法人大阪大学 | ラミニンフラグメントが乾燥状態でコーティングされている細胞培養器具 |
WO2015068505A1 (ja) | 2013-11-11 | 2015-05-14 | 住友化学株式会社 | 網膜色素上皮細胞の製造方法 |
BR112016011096A2 (pt) | 2013-11-27 | 2017-09-19 | Kyoto Prefectural Public Univ Corp | Aplicação de laminina à cultura de célula endotelial da córnea |
CN106167790B (zh) * | 2016-06-22 | 2019-11-19 | 中国人民解放军总医院 | 人胚胎干细胞定向诱导分化为角膜内皮细胞的方法 |
-
2018
- 2018-01-31 WO PCT/JP2018/003315 patent/WO2018143312A1/ja active Search and Examination
- 2018-01-31 SG SG11201907030VA patent/SG11201907030VA/en unknown
- 2018-01-31 US US16/482,160 patent/US11649433B2/en active Active
- 2018-01-31 KR KR1020197025356A patent/KR102208889B1/ko active IP Right Grant
- 2018-01-31 EP EP18748273.2A patent/EP3578640A4/en active Pending
- 2018-01-31 CA CA3052124A patent/CA3052124A1/en active Pending
- 2018-01-31 AU AU2018215170A patent/AU2018215170B2/en active Active
- 2018-01-31 MY MYPI2019004373A patent/MY192056A/en unknown
- 2018-01-31 CN CN201880009619.5A patent/CN110234755B/zh active Active
- 2018-01-31 JP JP2018565630A patent/JP6942363B2/ja active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010134619A1 (ja) * | 2009-05-18 | 2010-11-25 | 国立大学法人東北大学 | 人工多能性幹細胞からの上皮系前駆細胞・幹細胞群及び角膜上皮細胞群の分化誘導方法 |
WO2012144582A1 (ja) * | 2011-04-20 | 2012-10-26 | 国立大学法人大阪大学 | 角膜上皮分化指向性iPS細胞 |
WO2016114285A1 (ja) * | 2015-01-15 | 2016-07-21 | 国立大学法人大阪大学 | 多能性幹細胞からの角膜上皮細胞の分化誘導 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
NAT. COMMUN., vol. Vol. 3:1236, JPN6020023760, 2012, pages 1 - 10, ISSN: 0004302082 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2018143312A1 (ja) | 2018-08-09 |
JP6942363B2 (ja) | 2021-09-29 |
US11649433B2 (en) | 2023-05-16 |
CN110234755A (zh) | 2019-09-13 |
US20200010800A1 (en) | 2020-01-09 |
AU2018215170A1 (en) | 2019-09-12 |
KR102208889B1 (ko) | 2021-01-27 |
EP3578640A4 (en) | 2020-06-10 |
MY192056A (en) | 2022-07-25 |
EP3578640A1 (en) | 2019-12-11 |
AU2018215170B2 (en) | 2021-11-11 |
SG11201907030VA (en) | 2019-08-27 |
CN110234755B (zh) | 2023-08-29 |
KR20190112090A (ko) | 2019-10-02 |
CA3052124A1 (en) | 2018-08-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6942363B2 (ja) | 多能性幹細胞の分化制御方法 | |
JP5759536B2 (ja) | 角膜上皮分化指向性iPS細胞 | |
CN104508125B (zh) | 用于产生睫状边缘带样结构的方法 | |
SG192878A1 (en) | Method of producing retinal pigment epithelial cell sheet | |
JP2014082956A (ja) | 細胞培養基材、およびそれを用いた細胞培養方法並びに多能性幹細胞の分化誘導方法 | |
KR101562366B1 (ko) | 메타크릴레이트화된 젤라틴을 포함하는, 심근세포분화 유도용 세포 지지체 | |
WO2015015655A1 (ja) | フックス角膜内皮ジストロフィ不死化細胞株およびその作製法 | |
JP6226349B2 (ja) | 角膜内皮細胞マーカー | |
KR20200088880A (ko) | 신경 세포/조직 및 비신경 상피 조직을 포함하는 세포 덩어리의 제조 방법, 및 그로부터의 세포 덩어리 | |
JP7274683B2 (ja) | 多能性幹細胞から樹状分岐した集合管を伴う腎臓構造を作製する方法 | |
JP7016185B2 (ja) | 幹細胞由来涙腺組織の作製方法 | |
KR102142254B1 (ko) | 3,4''-다이하이드록시플라본을 이용한 소변줄기세포의 분리 효율 향상 및 소변줄기세포유래 만능줄기세포의 조혈줄기세포 분화 효율을 촉진시키는 방법 | |
WO2017078029A1 (ja) | 筋衛星細胞培養用材料および筋衛星細胞の培養方法 | |
JP7107595B2 (ja) | 多能性幹細胞由来結膜細胞の誘導方法 | |
JP2021151269A (ja) | 多能性幹細胞スフェロイドの製造方法、多能性幹細胞マーカーを発現させる方法、および多能性幹細胞スフェロイド | |
CN110168076B (zh) | 角膜上皮细胞群的制造方法 | |
EP1961810A1 (en) | Method for obtaining intestinal stem-precursor cell | |
CN113481158A (zh) | 一种无支架视网膜色素上皮细胞片的制备方法 | |
Croze | Pluripotent Stem Cell-Derived Retinal Pigmented Epithelium: Methods, Lines, and Behaviors | |
JP2018201472A (ja) | 神経幹細胞の培養方法及び神経幹細胞用培養基材 | |
Meier | Endothelial and epithelial differentiation potential of human adult stem cells PSC and MSC and the relation of ZO-1 isoform ratio to epithelial differentiation in Caco-2 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A529 | Written submission of copy of amendment under article 34 pct |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A5211 Effective date: 20190724 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20190724 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200714 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200911 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210216 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210401 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20210817 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20210901 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6942363 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |