JP4272070B2 - 修飾bace - Google Patents
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Description
本発明は組換えヒトBACEに関するものである。特に、本発明はアミノ酸位置33に修飾のある活性ヒトBACEに関するものである。
アルツハイマー病(AD)は主として加齢に伴う脳の進行性変性疾患である。ADの臨床的症状は、記憶力、認識力、推理力、判断力及び方向感覚の喪失が特徴である。病気が進行すると運動、感覚、及び言語能力も障害され、そしてついには複数の認知機能の総合的障害を生じる。これらの認知機能消失は徐々に生じるが、典型的に4年から12年の範囲内で重篤な障害を生じそして最終的に死に至る。
本発明は、Pro33Lys修飾を持つヒトBACEからなる単離ポリペプチド配列に関するものである。このポリペプチドは少なくとも膜貫通ドメインの部分、少なくともC-末端テイルの部分、及び/または少なくともシグナルペプチドの一部を含むことができる。
図1はヒトBACE [SEQ ID NO: 1]のアミノ酸配列を示す。
本発明はアミノ酸33位置(もしリーダー配列を数えるならば、54位置)に突然変異を有するヒトBACEポリペプチドを提供する。「BACE」(ベータ部位APP切断酵素)、はAPPのベータ部位において切断を仲介する酵素のことである。この酵素は、ベータ-セクレターゼ、Asp2及びメマプシン2としても知られている。BACEは、例えば、その全体をここに引用して取り入れたWO 00/17369, WO 00/47618及びWO 01/23533に記述されている。BACEはアスパラギン酸タンパク分解酵素からなり、古典的アスパラギン酸タンパク分解酵素活性部位共通モチーフ(DTG/DSG)を含んでいる。
E. coliにおいて組換えP33K-BACEタンパクを生産するための発現構築は、pET11a-BACEと呼ばれる既存構築から位置指定突然変異誘起により調製した。この構築は次の配列をコードするヌクレオチドを含んでいる:T7タグ(MASMTGGQQMGR)-GSM-BACE(A-8-S432)、これで発現するBACEフラグメントは図1に示す配列に比較してN-末端及びC-末端の両領域で短縮されている。挿入は膜貫通ドメイン及びリーダー配列の13 N-末端残基を欠失したタンパクをコードしている。メチオニンコドンは最初のBACEコドンに隣接して挿入されており、BamHIによるBACE挿入の除去及びT7タグのないBACE配列の発現のための潜在的再クローニングを促進している。しかし、このメチオニン残基は、T7 タグが含まれている場合には、必要ない。BACE cDNA配列はE. coliにおける発現のために望ましいコドンを含んでいる。これらのコドン変換は図4Aにおいて下線がついてる。
アミノ酸位置33のプロリンをリシンに変換するためのコドンに下線をつけた。リシンはAAGによってもコードされる。従って、順及び逆コドンはそれぞれAAG及びCTTのこともある。
この最終産物をゲル精製し、BamHIで消化し、ベクターpET11aの相当部位に連結した。pET11a-P33K-BACE構築の完全DNA及びアミノ酸配列を図4A及び4Bに示す。最初の15アミノ酸(下線付き)はベクターのT7 タグに相当し、BamHIクローニング部位並びに追加のメチオニンを含む。E. coliにおける発現に望ましいコドン変換を太字で示す。
増殖及びDNA単離のために連結したDNAをE. coli DH5αに導入した。生成したDNAを両鎖について完全に配列解析し、次いで発現のためにE. coli BL21 CodonPlus (DE3) Rpに導入した。100μg/mlアンピシリン及び34μg/mlクロラムフェニコールを加えたLuriaブロス(LB)、pH 7.5,中で37℃及び200 rpm(2.5インチ振幅)で、細胞を増殖した。構築のグリセロール保存の1ループを培地に接種し、A550=0.5-0.6になるまでインキュベートした。細胞を遠心分離により採取し、新鮮培地に再懸濁し、1:100に希釈して2次培養の種として使用した。細胞密度がA550=0.5-0.6に達したときに、細胞を室温にける遠心分離によって回収し、次いで再びアンピシリン及びクロラムフェニコールを含む新鮮LBに同じ濃度に再懸濁した。
最初の精製段階はQ-Sepharose(登録商標)FAST FLOWカラムを使用して、酵素検体を濃縮し、この段階で大量に存在する核酸を除去する。(BACEタンパク溶液のイオン強度とマッチさせるために)伝導度を0.9 mMhosにするために10 mM Tris (pH 8.2), 0.4 M尿素及びNaClで予め平衡した10 mlのQ-Sepharose(登録商標) FAST FLOWカラムに、1700 mlの酵素検体を負荷した。カラムを平衡するのに使用したのと同じ緩衝液に0-1.0 M NaClの直線グラジエントを適用した。5.5 mlのフラクションを集めた。タンパクフラクションの溶出液は氷室に保存した。
E. coliにおいて発現し、そして例1-3に示すように調製されたP33K-BACEの活性検定の対照を提供するために、下記表1に示すアミノ酸配列をコードするBACE構築(Asp2-2L-TM-His6)をCHO細胞中に発現し、約75リットルの馴化培地から精製した。精製操作は、タンジェンシャルフロー濃縮、硫酸アンモニウム沈殿、ニッケルアフィニティーカラム、及びアフィニティークロマトグラフィー(I-1 アフィニティー)の連続段階から成り立っていた。しかし、この精製タンパクは、図1のナンバリングによるT1QHGIRL......及びE25TDEEPEEPG......で始まるイソフォームの50:50の混合物を含んでいる。この2個のイソフォームは未だ不明のタンパク分解酵素による翻訳後切断により発生する。P33K-BACEをBACEポリヌクレオチドの位置指定突然変異誘起によりCHO細胞内に発現できることは容易に予想される。
上記例に従ってE. coli中に発現したP33K-BACEの活性を、上記のように調製されたP33K突然変異のないヒトBACEの活性、及びCHO細胞中に発現したヒトBACEと比較した。その結果を表2に示す。
Claims (21)
- 位置 33 にプロリンからリシンへの突然変異を有するヒトBACEからなる単離ポリペプチド。
- 少なくとも膜貫通ドメインの部分からなる請求項1に記載のポリペプチド。
- 少なくともC-末端テイルの部分からなる請求項1に記載のポリペプチド。
- 少なくともシグナルペプチドの部分からなる請求項1に記載のポリペプチド。
- 位置 33 にプロリンからリシンへの突然変異を有するBACEのプロ-酵素配列からなる活性ヒトBACEからなる組成物。
- BACEが少なくとも膜貫通ドメインの部分からなる請求項5に記載の組成物。
- BACEが少なくともC-末端テイルの部分からなる請求項5記載の組成物。
- BACEが少なくともシグナルペプチドの部分からなる請求項5に記載の組成物。
- SEQ ID NO: 2からなる単離ポリペプチド。
- SEQ ID NO: 2からなる単離ポリペプチド。
- 請求項1のポリペプチドをコードする配列からなる単離ポリヌクレオチド。
- SEQ ID NO: 2に記述されたアミノ酸配列をコードする配列からなる単離ポリヌクレオチド。
- SEQ ID NO: 8のヌクレオチド70-1365からなる単離ヌクレオチド。
- SEQ ID NO: 8のヌクレオチド70-1365からなる単離ヌクレオチド。
- 請求項11のポリヌクレオチドからなる発現ベクター。
- 該発現ベクターが適合する宿主細胞中に存在しそして宿主細胞が生産に適した条件の下に培養されたときに該発現ベクターが位置 33 にプロリンからリシンへの突然変異を有するヒト BACEを生産することができる、位置 33 にプロリンからリシンへの突然変異を有するヒト BACEポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる発現ベクター。
- 生産された位置 33 にプロリンからリシンへの突然変異を有するヒト BACEポリペプチドがSEQ ID NO: 2のポリペプチド配列からなる請求項16に記載の発現ベクター。
- 請求項15に記載の発現ベクターからなる組換え宿主細胞。
- a) 該ポリペプチドを生産することができる条件下で請求項18の組換え宿主細胞を培養し;そしてb) 培養からポリペプチドを回収する:の段階からなる位置 33 にプロリンからリシンへの突然変異を有するヒト BACEポリペプチドを生産する方法。
- 宿主細胞がE. coliである請求項19に記載の方法。
- 請求項19の培養宿主細胞から位置 33 にプロリンからリシンへの突然変異を有するヒト BACEを回収し、そしてポリペプチドを 1 ℃から15℃の温度の水で20-50倍に希釈することからなる活性位置 33 にプロリンからリシンへの突然変異を有するヒト BACEを生産する方法。
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