JP3892397B2 - ペプチド、ペプチド模倣物およびタンパク質を合成するための方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
本発明は、その特異性が変更された酵素をエステル脱離基の構造に適合されるような様式で使用することにより、ペプチド、ペプチド模倣物およびタンパク質を合成する方法に関する。
【０００２】
ペプチド、ペプチド模倣物およびタンパク質の合成は、機能的な遺伝子産物としてのタンパク質における構造−機能関係の体系的な研究に対してますます重要になっており、新規の有効な治療剤の発見に寄与するのに重要である（H.-D. Jakubke,「Peptide: Chemie und Biologie, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, Oxford, 1996参照）。ペプチドリガーゼ（H.-D. Jakubke, Angew. Chem. 1995, 107, 189) 、すなわち特異的なペプチド結合による２つのペプチドセグメントの選択的かつ不可逆的な連結を触媒しうる酵素の設計は、自然は進化の過程の間にかかる酵素をまだ創り出すことができていないので、主な挑戦となっている。この重要な理由は、特異性に対する実証できない極めて高い要求である。なぜなら、選択的不可逆的連結反応を触媒するために、かかる普遍的CNリガーゼは、連結されるペプチドセグメントのC-末端およびN-末端の位置に統計的に生じうる、21個のタンパク質産生アミノ酸の全ての可能な組合せを分子的に認識しうるはずであるからである。したがって、自然は、進化においておそらく非常に古いリボザイムであるペプチジルトランスフェラーゼにより触媒されるN-末端からC-末端への細胞中における逐次タンパク質合成を選択した(B.Zhang, T.R.Cech, Nature 1997,390,96) 。ここで、連結されるアミノ酸の特異性認識は、コドン−アンチコドン相互作用により、および高い特異的アミノアシルtRNAシンテターゼによる事前触媒作用により主に達成される。
【０００３】
原則としてペプチダーゼの逆触媒作用潜在能力（特に、W.Kullmann, Enzymatic Peptide Synthesis, CRC Press, Boca Raton, 1987; H.-D. Jakubke, Enzymatic Peptide Synthesis,: The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, vol. 9,(S.Udenfriend, J. Meienhofer編), Academic Press, New York, 1987,第３章）が、特殊な環境下でペプチドセグメントを酵素的に連結するのに使用されうるが、それは、連結した特殊なペプチド結合の不可逆性を保証しないし、切断されるセグメントまたは最終産物において、使用されるペプチダーゼに対して潜在的な切断部位を含む場合、所望でないタンパク質分解的切断を優先的に除外しない。種々のペプチダーゼ、例えば、非常に手のかかる断片縮合によりまた示されているサブチリシンを再び作り変えることにより、ペプチド結合の連結に対する触媒作用潜在能力を改善することが可能となっているが（特に、D.Y.Jackson ら、Science 1994, 266, 243）、前記不利益がまだ適用される。
【０００４】
触媒抗体（特に、P.G.Schultz, R.A.Lerner, Science 1995, 269, 1835; G. MacBeath, D.Hilvert, Chem. Biol, 1996, 3, 433; D.B.Smithrubら、J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 278）はまた、GCN4のコイルドコイルモチーフ(K. Severin ら、Nature, 1997, 389, 706) に基づくか、または強酸性コイルドコイルペプチドからなるペプチドテンプレート(S.Yao, J.Chmielewski, Biopolymers 1999, 51, 370) に基づく合成ペプチドリガーゼが有するようなCNリガーぜ活性を有する。しかし、これらは全てペプチドリガーゼを設計するための興味深いアプローチであるが、それは連結反応のための特殊な条件を必要とし、そのためにその一般的な適用は極めて制限される。
【０００５】
アミンおよびチオール捕獲(D.S.Kemp ら、J. Org. Chem. 1975, 40, 3465; N.Fotouhi ら、J. Org. Chem. 1989, 54, 2803) 、天然の化学的連結反応(M.Schnoelzer, S.B.H.Kent, Science 1992, 256, 221;P.E.Dawsonら、Science 1994, 266, 776) ならびにまたアルデヒド法(C.-F.Liu, J.P.Tam, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91, 6584)などの何年も前に提案された化学的CN連結反応に対する分子クリップ(molecular clip)の概念に基づく方法(T.Wielandら、Annalen 1953, 583, 129; M.Brenner ら、Helv. Chim. Acta 1957, 40, 1497)は、非常に特殊なN-末端アミノ酸残基またはC-末端アミノ酸残基を必要とし、したがってそれは特殊な配列が存在する場合に使用されうるのみである。天然の化学的連結反応の場合、C-末端チオエステル基を有する合成ペプチドは、N-末端システイン残基を含むにちがいない第２のペプチドまたはタンパク質と連結される。タンパク質スプライシングについての知識(Review:C.J.Noren ら、Angew. Chem. 2000, 112, 458 参照) が、天然の化学的連結反応をインテイン媒介タンパク質連結反応(expressed protein ligetion, EPL) にさらに発展させるのに使用された(T.W.Muir ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95, 6705; G.J.Cotton ら、J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 1100)。そこでは、切断能力のあるインテルと融合されている組換えタンパク質由来のカルボキシ成分のチオエステル基が、カラム上でチオール切断により形成される。連結反応に対するアミノ成分のN-末端にあるN-末端システイン残基の必要性の不利益は、もちろんこれによって除去されなかった。2-メルカプトエタンスルホン酸またはチオフェノールを用いるカラム上のチオール切断の結果として形成するチオエステルは、追加のアミノ成分の末端α- アミノ基により、エステル化後だけでなく直接求核攻撃され得、したがって、C-末端アミノ酸残基の部分的なエピマー化は除外され得ない。
【０００６】
本発明の目的は、基質模倣物構造に特別に適合される特異性を有する一方で、ペプチドおよびタンパク質に対する有意に低減されたタンパク質分解活性をまた有する酵素バリアントの合理的および発展的設計である。
【０００７】
この目的は、ペプチド、ペプチド模倣物およびタンパク質の作製方法により達成される。この方法において、生じた人工のC-N リガーゼが分子的かつ触媒的に重要な領域として基質模倣物の脱離基における特異性決定因子を認識する様式で、酵素の特異性を決定するアミノ酸残基または触媒的に重要なアミノ酸残基に対する酵素における化学的、合理的または進化遺伝的に作製された変化により、エステル脱離基の構造に適合されるようにおよびアミノ酸構造ブロックの間の結合が連結されるように合成プロセスにおいて生体触媒として使用される酵素の特異性が変化する。
【０００８】
本発明によれば、専門家の一般的な意見に反して、エステル脱離基の構造に酵素の特異性を適合させることにより、人工のC-N リガーゼが設計される。それは、酵素における化学的変化ならびに合理的または進化遺伝子的に作製された変化により達成され得、酵素の特異性決定酵素結合領域または主に数個の特異的結合領域のみまたは触媒的に重要なアミノ酸残基に関与しうる。次に、基質模倣物の脱離基における特異性決定因子は、アミノ酸構造ブロックの間の結合がもはや切断されずに連結されるような、人工のCNリガーゼに対する分子および触媒生産的認識領域を構成する。脱離基および特異性決定因子という用語は、当業者に公知である(F.Bordusa, Braz. J. Med. Biol. Res. 72 (2000) 469-485) 。
【０００９】
本発明の知見は、非常に驚くべきものである。なぜなら、本発明の方法によるCN結合の生体触媒的連結の後、ペプチダーゼは、特異的なエステル脱離基が合成産物中にもはや存在せず、このために酵素切断が妨げられうるので、合成CN結合も他のCN結合も基質としてもはや認識できない。
【００１０】
ペプチダーゼバリアントならびにエステラーゼ等の他の酵素クラスおよびサブクラスのメンバーは、好ましくは、本発明の設計に使用される。
【００１１】
得られたペプチドおよびタンパク質は、ペプチドおよびタンパク質化学の通常法により分離および精製されうる。
【００１２】
基質模倣物媒介ペプチド合成に対する生体触媒として作用するタンパク質分解的に不活性なペプチドリガーゼ、特にペプチダーゼバリアントおよび例えばエステラーゼバリアントは、遺伝子工学によりおよび特に３つの戦略により天然のプロテアーゼから作製されうる。第１は、基質模倣物に適合する酵素特異性を生じることに主な目的を有する基質特異性の直接操作である。基質模倣物の構造が特異的アミノ酸の構造と異なる場合（トリプシンの場合、Arg およびLys)、これは必然的にいつも天然の特異性の低減をもたらすべきである。この関係において、塩基性残基によるAsp189の置換は、例えば、特に有望である。Asp189が、酵素のArg/Lys 特異性の原因であり、したがって、トリプシンの天然の特異性に対して最も重要なアミノ酸残基を構成することが、長い間知られている(L. Grafら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85, 4961;L.B.Evninら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87, 6659) 。したがって、His 、Lys およびArg によるAsp189の置換は、これらのペプチドリガーゼに対するほんの少しの適切な基質模倣物と称される4-カルボキシフェニル、4-カルボキシベンジル、3-カルボキシエチルエステルまたは5-ヒドロキシ- インドール-2- カルボン酸と同等のアミノ酸エステルなどの負のカルボキシル基を有する芳香族構造または脂肪族性構造に対するトリプシンの人工的特異性をもたらす。対照的に、タンパク質産生アミノ酸のアミノ酸側鎖は、修飾された結合ポケットに生産的にしっかりと適合する。結果として、タンパク質分解率は、野生型酵素よりもかなり低いか、またはごくわずかである。さらに、トリプシンのS'領域（切断または連結反応部位のC-末端側における酵素領域）におけるさらなる変異とこれらの変異の組合せは、この変異が基質模倣物の脱離基に対する特異性を増加する場合はいつも、タンパク質分解的に不活性なペプチドリガーゼをもたらす。したがって、トリプシン二重変異体D189K 、K60Eの変異K60Eは、酵素のS1からS1' 結合部位への4-グアニジノフェニルエステルの結合のシフトを生じる。かかるシフトはまた、以前の切断感受性アミノ酸Lys およびArg に対して見出されている。しかしながら、後者は、切断を生じない非生産性結合をもたらすのみである一方で、基質模倣物は生産的に適合され、合成をもたらす。
【００１３】
酵素特異性の直接の操作に加えて、酵素の触媒性三つ組(triad) におけるアミノ酸（トリプシンの場合：His75 、Asp102およびSer195）を置換することも可能である。（活性化された）エステル結合または活性化されたアミド結合（例えばペプチド4-ニトロアニリドにおいて）と対照的に、ペプチド結合の切断には活性Ser195のOH官能基の増加した求核性に加えて、切断された結合のアミノ官能基のプロトン化が必須である(A.Fersht, Enzyme Structure & Mechanism,第２版, W.H.Freemann & Co., New York, 1984) 。したがって、Asp102および／またはHis75 の置換は、基質模倣物媒介性反応中であってさえエステラーゼ活性とアミダーゼ活性との間の酵素の識別を生じる。タンパク質分解活性における類似の効果がまた、Thr またはCys による活性Ser195の置換に対して考えられる。
【００１４】
最後に第３戦略は、チモーゲン様およびしたがってタンパク質分解的に不活性な酵素コンホメーションを安定化することを意図する酵素活性の間接的な操作を研究することからなる（チモーゲンは、プロテアーゼの天然に存在する前駆体酵素であるが、タンパク質分解的に不活性である）。「真の」チモーゲントリプシノゲンLys15Gly（Lys15-Ile16 結合の切断は、活性トリプシンへのトリプシノゲンの変換をもたらす）はペプチドリガーゼ活性を持たない一方で、チモーゲン様酵素種は、ペプチドリガーゼ特性を実際に有する。チモーゲン様酵素種は、例えば、酵素バリアントAsp194Asn(Asp194は、活性化トリプシンのN-末端と塩橋を形成することにより活性酵素コンホメーションを安定化する) およびまたバリアントCys191Ala(Cys191は、ジスルフィド架橋を形成することにより活性酵素を安定化する) である。
【００１５】
本発明はまた、本質的にタンパク質分解的に不活性なペプチドリガーゼ、特にトリプシンバリアントの遺伝子工学による作製方法に関する。プロテアーゼコード配列、例えば、トリプシンコード配列またはトリプシノゲンコード配列を含むベクターを用いて開始することにより所望の変異が導入される。例えば、大腸菌ベクターpST 、ADH/GAPDH プロモーターを有する酵母シャトルベクターおよびトリプシノゲンコード配列に融合されるα因子リーダー配列を用いることが可能である(L.Hedstorm ら、Science 255 (1992) 1249)。その後、新規ベクターは大腸菌などの適切な宿主に形質転換される。必要であれば、修飾されたトリプシンまたはトリプシノゲン配列などの修飾されたプロテアーゼ配列は、酵母ベクターpYT などの適切な発現ベクターにサブクローン化されうる。変異が発現ベクターを用いて直接生じる場合、この追加の段階が省略されうる。その後、プロテアーゼバリアントが、大腸菌または酵母などの宿主細胞で発現される。修飾されたトリプシンまたはそのチモーゲンなどの修飾されたプロテアーゼバリアントは、イオン交換クロマトグラフィーなどの適切なタンパク質−生化学的方法により単離される。プロテアーゼバリアントが、例えばチモーゲン、例えばトリプシノゲンバリアントである場合、それは、例えばタンパク質分解的切断によりチモーゲンバリアントをプロテアーゼバリアントに変換することにより通常の様式で活性化される。必要であれば、これは、例えばアフィニティークロマトグラフィーによるか（修飾後もまたSBTJへの結合が可能である場合）、またはパーフュージョンクロマトグラフィーによるさらなる精製段階に続きうる。最終的に、プロテアーゼバリアントは、必要であれば、適切な緩衝液に対して透析され、濃縮される。
【００１６】
本発明の原理は、トリプシンバリアントD189K 、K60Eおよびセグメント縮合におけるCNリガーゼとしてのその使用により説明される。このトリプシン変異体において、189 位のアミノ酸D がK に置換され、60位のアミノ酸K がE に置換される。トリプシン野生型の配列は、当業者に公知である。トリプシン種D189K 、K60Eは、4-グアニジノフェニルエステル脱離基を認識するために特別に開発された。変異D189K による主要な特異性決定S1結合ポケットにおける電荷の逆転は、トリプシンに本来特異的であったアミノ酸残基Lys およびArg の結合を妨げる。しかしながら、単独のこの変異はまた、アシル-4- グアニジノフェニルエステル基質模倣物に対する活性の有意な減少をもたらす。本発明のLys60 のGlu によるさらなる置換は、4-グアニジノフェニルエステル脱離基に特異的である酵素のS1' 結合部位領域における新規結合ポケットの形成を生じ、これは当業者にとって驚くべきことである。この結果は、アシル-4- グアニジノフェニルエステルに対する特異性における有意な増加である一方、本来特異的なアミノ酸残基に対するその非特異性が残っている。トリプシンバリアントD189K 、K60Eは、ペプチド、ペプチド模倣物およびタンパク質を調製するために使用される。緩衝液系、反応時間および反応温度などの他のパラメータの選択は、比較的重要でなく、酵素的形質転換の当業者により簡単に決定されうる。
【００１７】
ペプチド、ペプチド模倣物およびタンパク質の作製のために、ペプチド-4- グアニジノフェニルエステルなどのアシル-4- グアニジノフェニルエステルがカルボキシル成分として使用され、他のペプチドまたはペプチド模倣物がアミノ成分として使用される。所望の完全なペプチド、ペプチド模倣物またはタンパク質が、アミノ成分とカルボキシル成分とを連結反応させることにより形成される。驚くべきことに、合成のこの型は、リジンなどの三官能基アミノ酸の機能性アミノ酸側鎖の修飾も、反応物または連結反応産物の検出可能なタンパク質分解的切断ももたらさない。
【００１８】
以下に記載した生物学的に活性なHt31(493-515) ペプチドの合成は、それに基づく基質模倣物−特異的トリプシンバリアントの不可逆的リガーゼ特性を確かにする。
【００１９】
実施例１−トリプシン変異体D189K 、K60Eの作製
プラスミド
大腸菌ベクターpST を部位指向変異誘発に用いた。これは、Bluescriptベクターの一部およびα因子リーダーおよびADH/GAPDH プロモーターと融合されているアニオンラットトリプシンに対する遺伝子を含む。
【００２０】
タンパク質をpYT プラスミド、ウラシンおよびロイシン枯渇培地に対する選択マーカーを保有するpBS24 誘導体の助けをかりて発現させた。
【００２１】
pST およびpYT プラスミドはアンピシリン耐性遺伝子を有する。対応する切断部位を有する両ベクター、すなわちプラスミドpST （5.4kb ）およびpYT （14kb）のマップを、図１に示す。
【００２２】
変異誘発
部位指向変異誘発を、E.coliプラスミドpST においてQuik change （登録商標）キット（STRATAGENE）を用いて実施した。
【００２３】
この手順は、pST ベクターの両プラスミド鎖を所望の変異を含む２つの合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて開始してPFU ポリメラーゼによって複製するPCR の手順と同様である。野生型pST をテンプレートとして利用して単一の変異を作製した。これらの単一の変異は、再度、二重変異体を構築するための開始点であった。
【００２４】
以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用した、太字は変異を示す：
【００２５】
得られたPCR 産物をウルトラコンピテントE.coli XL IIブルー細胞（STRATAGENE）に形質転換した。次いで選択を、アンピシリン（LB-amp）を含有する普通寒天プレート上で実施した。選び取ったコロニーを、アンピシリン（LB-amp）を含有する液体培地へ移し、培養１日後、プラスミドをSNAPキット（INVITROGENE ）を用いて単離した。単離したDNA を１％アガロースゲルを用いる電気泳動によって調べた。完全な遺伝子を配列決定することによって、所望の変異のみが存在していることを確実にし得た。
【００２６】
サブクローニング
pYT 発現ベクターにおけるサブクローニングは、pST プラスミドにおいて作製された全ての変異体について必要であった。サブクローニングをBam HIおよびSal I を用いる制限消化および対応するpYT ベクターフラグメントへのライゲーションによって実施した。全てのベクターフラグメントを適切な制限混合によって低融解アガロースゲル（0.8 ％）へ移動し、適切な分離後切断した。ゲル片を55℃で融解し、所望の組み合わせに従ってプールし、T4 DNAリガーゼを用いて16℃で一晩ライゲーションした。形質転換および再度必要な場合プラスミド単離を上記のように実施した。
【００２７】
成功したサブクローニングを、アガロースゲルにおいてEco RIおよびBam HIを用いる二重消化後、特有な制限パターンによって試験した。
【００２８】
完全なトリプシノゲン遺伝子を配列決定することによって、所望の変異のみが存在していることを確実にし得た。
【００２９】
酵母形質転換および選択
使用した酵母細胞株を、サッカロマイセス・セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）DLM 101 α[Mat a,leu 2-3,-112 his 2,3-11, -15 can 1, ura 3 , pep4 , [cir0], DM 23]と呼ぶ。EZ酵母形質転換キット（ZYMO research ）を使用して、コンピテント酵母細胞を調製し、pYT プラスミドを形質転換した。選択をウラシル欠損SCプレート上で30℃にて３〜４日間インキュベートすることによって実施した。ロイシン欠損SCプレートに個々のコロニーを接種し、また30℃にて３〜４日間インキュベートして、細胞におけるプラスミドのコピー数の増加を誘導した。これらのプレートの個々のコロニーを使用して、８％グルコースを含有するロイシン欠損SC液体培地の前培養に接種した。これらを30℃、120rpm、３日間振盪することによってインキュベートした。20mlの前培養を接種物として用いて、YPD 培地（１％グルコース、１％バクトペプトン、0.5 ％酵母エキス）を含有する１リットルの主培養へ接種した。インキュベーションパラメーターは、前培養のパラメーターと一致し、４日後収穫した。
【００３０】
トリプシンバリアントの単離および精製
細胞をまず第一に4000rpm で20分間遠心分離することによって分離し、上清をpH4.0 に調整し、再度12000rpmで遠心分離した。トリプシノゲンを含有するほとんどの粒子のない上清を、2mM 酢酸ナトリウム／100mM 酢酸（pH4.5 ）で平衡にしたToyopearl 650M（SUPELCO ）陽イオン交換カラムに適用した。2mM 酢酸ナトリウム／100mM 酢酸（pH4.5 ）〜200mM Tris／HCl （pH8.0 ）の線形pH勾配によって溶出した。
【００３１】
トリプシノゲンを含有する画分を、15％ポリアクリルアミドゲルを用いるSDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって測定し、プールした。タンパク質溶液の容量をCentriprep濃縮器（AMICON）によって、約10〜15mlに濃縮した。
【００３２】
トリプシノゲンバリアントの対応するトリプシンD189K ＋K60Eへの活性化を高度に精製されたエンテロキナーゼ（BIOZYME ）を用いてpH6.5 で実施し、SDS ゲル電気泳動によってモニタリングした。
【００３３】
活性化された酵素を、Biocad Sprint 灌流クロマトグラフィーシステム（PERSEPTIVE BIOSYSTEMS ）を用いて精製した。タンパク質サンプルを、５％Bis ／TrisプロパンpH6.0 を用いて平衡にしたPOROS 20 HQ （陰イオン交換カラム（４×100mm 、PERSEPTIVE BIOSYSTEMS ））上で、引き続き95％ 3M NaCl溶液までの勾配溶出によって分離した。トリプシンを含有する画分をSDS ゲルの助けを借りて試験し、プールした。これらを引き続き、1mM HCl に対して４℃にて透析し、このサンプルをCentriprep濃縮器で２〜４mlに濃縮した。
【００３４】
最終収率は、１リットルの培養培地あたり約２〜５mgタンパク質であった。
【００３５】
濃度の決定
調製物のタンパク質濃度を、Bradfordの方法に従って595nm の波長で分光光度計で測定した。校正曲線を50μm/ml〜１mg/ml のウシトリプシンの連続希釈に基づいてプロットした。
【００３６】
実施例２−トリプシンバリアントD189K 、K60EによるHt31（493 〜515 ）の合成 標的分子H-Asp-Leu-Ile-Glu-Glu-Ala-Ala-Ser-Arg-Ile-Val-Asp-Ala-Val-Ile-Glu-Gln-Val-Lys-Ala-Ala-Gly-Ala-Tyr-OH（Ht31（493 〜515 ））を、カルボキシ成分として使用するオクタペプチド-4- グアニジノフェニルエステルBoc-Asp-Leu-Ile-Glu-Glu-Ala-Ala-Ser-OGp （2.2mg 、おおよそ0.001mmol ）をアミノ成分として作用するペプチドH-Arg-Ile-Val-Asp-Ala-Val-Ile-Glu-Gln-Val-Lys-Ala-Ala-Gly-Ala-Tyr-OH（１mg、おおよそ0.0005mmol）とライゲーションすることで合成した。40% 有機溶媒を含有する水性緩衝液系を溶媒として使用した。両反応物を添加した後、反応をトリプシンバリアントD189K 、K60Eを添加することによって開始し、カルボキシ成分の完全変換後分析した。酵素触媒は、アミノ成分の完全アシル化を誘導する。合成産物の同一性を、アミノ酸分析を包含する有機化学の従来の方法によって確認した。この反応は、三機能性アミノ酸側鎖を修飾せず、反応体またはライゲーション産物の検出可能なタンパク質分解性切断を誘導しなかった。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、pST およびpYT プラスミドはアンピシリン耐性遺伝子を有する。対応する切断部位を有する両ベクター、すなわちプラスミドpST （5.4kb ）およびpYT （14kb）のマップを示す。
本発明は、その特異性が変更された酵素をエステル脱離基の構造に適合されるような様式で使用することにより、ペプチド、ペプチド模倣物およびタンパク質を合成する方法に関する。
【０００２】
ペプチド、ペプチド模倣物およびタンパク質の合成は、機能的な遺伝子産物としてのタンパク質における構造−機能関係の体系的な研究に対してますます重要になっており、新規の有効な治療剤の発見に寄与するのに重要である（H.-D. Jakubke,「Peptide: Chemie und Biologie, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, Oxford, 1996参照）。ペプチドリガーゼ（H.-D. Jakubke, Angew. Chem. 1995, 107, 189) 、すなわち特異的なペプチド結合による２つのペプチドセグメントの選択的かつ不可逆的な連結を触媒しうる酵素の設計は、自然は進化の過程の間にかかる酵素をまだ創り出すことができていないので、主な挑戦となっている。この重要な理由は、特異性に対する実証できない極めて高い要求である。なぜなら、選択的不可逆的連結反応を触媒するために、かかる普遍的CNリガーゼは、連結されるペプチドセグメントのC-末端およびN-末端の位置に統計的に生じうる、21個のタンパク質産生アミノ酸の全ての可能な組合せを分子的に認識しうるはずであるからである。したがって、自然は、進化においておそらく非常に古いリボザイムであるペプチジルトランスフェラーゼにより触媒されるN-末端からC-末端への細胞中における逐次タンパク質合成を選択した(B.Zhang, T.R.Cech, Nature 1997,390,96) 。ここで、連結されるアミノ酸の特異性認識は、コドン−アンチコドン相互作用により、および高い特異的アミノアシルtRNAシンテターゼによる事前触媒作用により主に達成される。
【０００３】
原則としてペプチダーゼの逆触媒作用潜在能力（特に、W.Kullmann, Enzymatic Peptide Synthesis, CRC Press, Boca Raton, 1987; H.-D. Jakubke, Enzymatic Peptide Synthesis,: The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, vol. 9,(S.Udenfriend, J. Meienhofer編), Academic Press, New York, 1987,第３章）が、特殊な環境下でペプチドセグメントを酵素的に連結するのに使用されうるが、それは、連結した特殊なペプチド結合の不可逆性を保証しないし、切断されるセグメントまたは最終産物において、使用されるペプチダーゼに対して潜在的な切断部位を含む場合、所望でないタンパク質分解的切断を優先的に除外しない。種々のペプチダーゼ、例えば、非常に手のかかる断片縮合によりまた示されているサブチリシンを再び作り変えることにより、ペプチド結合の連結に対する触媒作用潜在能力を改善することが可能となっているが（特に、D.Y.Jackson ら、Science 1994, 266, 243）、前記不利益がまだ適用される。
【０００４】
触媒抗体（特に、P.G.Schultz, R.A.Lerner, Science 1995, 269, 1835; G. MacBeath, D.Hilvert, Chem. Biol, 1996, 3, 433; D.B.Smithrubら、J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 278）はまた、GCN4のコイルドコイルモチーフ(K. Severin ら、Nature, 1997, 389, 706) に基づくか、または強酸性コイルドコイルペプチドからなるペプチドテンプレート(S.Yao, J.Chmielewski, Biopolymers 1999, 51, 370) に基づく合成ペプチドリガーゼが有するようなCNリガーぜ活性を有する。しかし、これらは全てペプチドリガーゼを設計するための興味深いアプローチであるが、それは連結反応のための特殊な条件を必要とし、そのためにその一般的な適用は極めて制限される。
【０００５】
アミンおよびチオール捕獲(D.S.Kemp ら、J. Org. Chem. 1975, 40, 3465; N.Fotouhi ら、J. Org. Chem. 1989, 54, 2803) 、天然の化学的連結反応(M.Schnoelzer, S.B.H.Kent, Science 1992, 256, 221;P.E.Dawsonら、Science 1994, 266, 776) ならびにまたアルデヒド法(C.-F.Liu, J.P.Tam, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91, 6584)などの何年も前に提案された化学的CN連結反応に対する分子クリップ(molecular clip)の概念に基づく方法(T.Wielandら、Annalen 1953, 583, 129; M.Brenner ら、Helv. Chim. Acta 1957, 40, 1497)は、非常に特殊なN-末端アミノ酸残基またはC-末端アミノ酸残基を必要とし、したがってそれは特殊な配列が存在する場合に使用されうるのみである。天然の化学的連結反応の場合、C-末端チオエステル基を有する合成ペプチドは、N-末端システイン残基を含むにちがいない第２のペプチドまたはタンパク質と連結される。タンパク質スプライシングについての知識(Review:C.J.Noren ら、Angew. Chem. 2000, 112, 458 参照) が、天然の化学的連結反応をインテイン媒介タンパク質連結反応(expressed protein ligetion, EPL) にさらに発展させるのに使用された(T.W.Muir ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95, 6705; G.J.Cotton ら、J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 1100)。そこでは、切断能力のあるインテルと融合されている組換えタンパク質由来のカルボキシ成分のチオエステル基が、カラム上でチオール切断により形成される。連結反応に対するアミノ成分のN-末端にあるN-末端システイン残基の必要性の不利益は、もちろんこれによって除去されなかった。2-メルカプトエタンスルホン酸またはチオフェノールを用いるカラム上のチオール切断の結果として形成するチオエステルは、追加のアミノ成分の末端α- アミノ基により、エステル化後だけでなく直接求核攻撃され得、したがって、C-末端アミノ酸残基の部分的なエピマー化は除外され得ない。
【０００６】
本発明の目的は、基質模倣物構造に特別に適合される特異性を有する一方で、ペプチドおよびタンパク質に対する有意に低減されたタンパク質分解活性をまた有する酵素バリアントの合理的および発展的設計である。
【０００７】
この目的は、ペプチド、ペプチド模倣物およびタンパク質の作製方法により達成される。この方法において、生じた人工のC-N リガーゼが分子的かつ触媒的に重要な領域として基質模倣物の脱離基における特異性決定因子を認識する様式で、酵素の特異性を決定するアミノ酸残基または触媒的に重要なアミノ酸残基に対する酵素における化学的、合理的または進化遺伝的に作製された変化により、エステル脱離基の構造に適合されるようにおよびアミノ酸構造ブロックの間の結合が連結されるように合成プロセスにおいて生体触媒として使用される酵素の特異性が変化する。
【０００８】
本発明によれば、専門家の一般的な意見に反して、エステル脱離基の構造に酵素の特異性を適合させることにより、人工のC-N リガーゼが設計される。それは、酵素における化学的変化ならびに合理的または進化遺伝子的に作製された変化により達成され得、酵素の特異性決定酵素結合領域または主に数個の特異的結合領域のみまたは触媒的に重要なアミノ酸残基に関与しうる。次に、基質模倣物の脱離基における特異性決定因子は、アミノ酸構造ブロックの間の結合がもはや切断されずに連結されるような、人工のCNリガーゼに対する分子および触媒生産的認識領域を構成する。脱離基および特異性決定因子という用語は、当業者に公知である(F.Bordusa, Braz. J. Med. Biol. Res. 72 (2000) 469-485) 。
【０００９】
本発明の知見は、非常に驚くべきものである。なぜなら、本発明の方法によるCN結合の生体触媒的連結の後、ペプチダーゼは、特異的なエステル脱離基が合成産物中にもはや存在せず、このために酵素切断が妨げられうるので、合成CN結合も他のCN結合も基質としてもはや認識できない。
【００１０】
ペプチダーゼバリアントならびにエステラーゼ等の他の酵素クラスおよびサブクラスのメンバーは、好ましくは、本発明の設計に使用される。
【００１１】
得られたペプチドおよびタンパク質は、ペプチドおよびタンパク質化学の通常法により分離および精製されうる。
【００１２】
基質模倣物媒介ペプチド合成に対する生体触媒として作用するタンパク質分解的に不活性なペプチドリガーゼ、特にペプチダーゼバリアントおよび例えばエステラーゼバリアントは、遺伝子工学によりおよび特に３つの戦略により天然のプロテアーゼから作製されうる。第１は、基質模倣物に適合する酵素特異性を生じることに主な目的を有する基質特異性の直接操作である。基質模倣物の構造が特異的アミノ酸の構造と異なる場合（トリプシンの場合、Arg およびLys)、これは必然的にいつも天然の特異性の低減をもたらすべきである。この関係において、塩基性残基によるAsp189の置換は、例えば、特に有望である。Asp189が、酵素のArg/Lys 特異性の原因であり、したがって、トリプシンの天然の特異性に対して最も重要なアミノ酸残基を構成することが、長い間知られている(L. Grafら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85, 4961;L.B.Evninら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87, 6659) 。したがって、His 、Lys およびArg によるAsp189の置換は、これらのペプチドリガーゼに対するほんの少しの適切な基質模倣物と称される4-カルボキシフェニル、4-カルボキシベンジル、3-カルボキシエチルエステルまたは5-ヒドロキシ- インドール-2- カルボン酸と同等のアミノ酸エステルなどの負のカルボキシル基を有する芳香族構造または脂肪族性構造に対するトリプシンの人工的特異性をもたらす。対照的に、タンパク質産生アミノ酸のアミノ酸側鎖は、修飾された結合ポケットに生産的にしっかりと適合する。結果として、タンパク質分解率は、野生型酵素よりもかなり低いか、またはごくわずかである。さらに、トリプシンのS'領域（切断または連結反応部位のC-末端側における酵素領域）におけるさらなる変異とこれらの変異の組合せは、この変異が基質模倣物の脱離基に対する特異性を増加する場合はいつも、タンパク質分解的に不活性なペプチドリガーゼをもたらす。したがって、トリプシン二重変異体D189K 、K60Eの変異K60Eは、酵素のS1からS1' 結合部位への4-グアニジノフェニルエステルの結合のシフトを生じる。かかるシフトはまた、以前の切断感受性アミノ酸Lys およびArg に対して見出されている。しかしながら、後者は、切断を生じない非生産性結合をもたらすのみである一方で、基質模倣物は生産的に適合され、合成をもたらす。
【００１３】
酵素特異性の直接の操作に加えて、酵素の触媒性三つ組(triad) におけるアミノ酸（トリプシンの場合：His75 、Asp102およびSer195）を置換することも可能である。（活性化された）エステル結合または活性化されたアミド結合（例えばペプチド4-ニトロアニリドにおいて）と対照的に、ペプチド結合の切断には活性Ser195のOH官能基の増加した求核性に加えて、切断された結合のアミノ官能基のプロトン化が必須である(A.Fersht, Enzyme Structure & Mechanism,第２版, W.H.Freemann & Co., New York, 1984) 。したがって、Asp102および／またはHis75 の置換は、基質模倣物媒介性反応中であってさえエステラーゼ活性とアミダーゼ活性との間の酵素の識別を生じる。タンパク質分解活性における類似の効果がまた、Thr またはCys による活性Ser195の置換に対して考えられる。
【００１４】
最後に第３戦略は、チモーゲン様およびしたがってタンパク質分解的に不活性な酵素コンホメーションを安定化することを意図する酵素活性の間接的な操作を研究することからなる（チモーゲンは、プロテアーゼの天然に存在する前駆体酵素であるが、タンパク質分解的に不活性である）。「真の」チモーゲントリプシノゲンLys15Gly（Lys15-Ile16 結合の切断は、活性トリプシンへのトリプシノゲンの変換をもたらす）はペプチドリガーゼ活性を持たない一方で、チモーゲン様酵素種は、ペプチドリガーゼ特性を実際に有する。チモーゲン様酵素種は、例えば、酵素バリアントAsp194Asn(Asp194は、活性化トリプシンのN-末端と塩橋を形成することにより活性酵素コンホメーションを安定化する) およびまたバリアントCys191Ala(Cys191は、ジスルフィド架橋を形成することにより活性酵素を安定化する) である。
【００１５】
本発明はまた、本質的にタンパク質分解的に不活性なペプチドリガーゼ、特にトリプシンバリアントの遺伝子工学による作製方法に関する。プロテアーゼコード配列、例えば、トリプシンコード配列またはトリプシノゲンコード配列を含むベクターを用いて開始することにより所望の変異が導入される。例えば、大腸菌ベクターpST 、ADH/GAPDH プロモーターを有する酵母シャトルベクターおよびトリプシノゲンコード配列に融合されるα因子リーダー配列を用いることが可能である(L.Hedstorm ら、Science 255 (1992) 1249)。その後、新規ベクターは大腸菌などの適切な宿主に形質転換される。必要であれば、修飾されたトリプシンまたはトリプシノゲン配列などの修飾されたプロテアーゼ配列は、酵母ベクターpYT などの適切な発現ベクターにサブクローン化されうる。変異が発現ベクターを用いて直接生じる場合、この追加の段階が省略されうる。その後、プロテアーゼバリアントが、大腸菌または酵母などの宿主細胞で発現される。修飾されたトリプシンまたはそのチモーゲンなどの修飾されたプロテアーゼバリアントは、イオン交換クロマトグラフィーなどの適切なタンパク質−生化学的方法により単離される。プロテアーゼバリアントが、例えばチモーゲン、例えばトリプシノゲンバリアントである場合、それは、例えばタンパク質分解的切断によりチモーゲンバリアントをプロテアーゼバリアントに変換することにより通常の様式で活性化される。必要であれば、これは、例えばアフィニティークロマトグラフィーによるか（修飾後もまたSBTJへの結合が可能である場合）、またはパーフュージョンクロマトグラフィーによるさらなる精製段階に続きうる。最終的に、プロテアーゼバリアントは、必要であれば、適切な緩衝液に対して透析され、濃縮される。
【００１６】
本発明の原理は、トリプシンバリアントD189K 、K60Eおよびセグメント縮合におけるCNリガーゼとしてのその使用により説明される。このトリプシン変異体において、189 位のアミノ酸D がK に置換され、60位のアミノ酸K がE に置換される。トリプシン野生型の配列は、当業者に公知である。トリプシン種D189K 、K60Eは、4-グアニジノフェニルエステル脱離基を認識するために特別に開発された。変異D189K による主要な特異性決定S1結合ポケットにおける電荷の逆転は、トリプシンに本来特異的であったアミノ酸残基Lys およびArg の結合を妨げる。しかしながら、単独のこの変異はまた、アシル-4- グアニジノフェニルエステル基質模倣物に対する活性の有意な減少をもたらす。本発明のLys60 のGlu によるさらなる置換は、4-グアニジノフェニルエステル脱離基に特異的である酵素のS1' 結合部位領域における新規結合ポケットの形成を生じ、これは当業者にとって驚くべきことである。この結果は、アシル-4- グアニジノフェニルエステルに対する特異性における有意な増加である一方、本来特異的なアミノ酸残基に対するその非特異性が残っている。トリプシンバリアントD189K 、K60Eは、ペプチド、ペプチド模倣物およびタンパク質を調製するために使用される。緩衝液系、反応時間および反応温度などの他のパラメータの選択は、比較的重要でなく、酵素的形質転換の当業者により簡単に決定されうる。
【００１７】
ペプチド、ペプチド模倣物およびタンパク質の作製のために、ペプチド-4- グアニジノフェニルエステルなどのアシル-4- グアニジノフェニルエステルがカルボキシル成分として使用され、他のペプチドまたはペプチド模倣物がアミノ成分として使用される。所望の完全なペプチド、ペプチド模倣物またはタンパク質が、アミノ成分とカルボキシル成分とを連結反応させることにより形成される。驚くべきことに、合成のこの型は、リジンなどの三官能基アミノ酸の機能性アミノ酸側鎖の修飾も、反応物または連結反応産物の検出可能なタンパク質分解的切断ももたらさない。
【００１８】
以下に記載した生物学的に活性なHt31(493-515) ペプチドの合成は、それに基づく基質模倣物−特異的トリプシンバリアントの不可逆的リガーゼ特性を確かにする。
【００１９】
実施例１−トリプシン変異体D189K 、K60Eの作製
プラスミド
大腸菌ベクターpST を部位指向変異誘発に用いた。これは、Bluescriptベクターの一部およびα因子リーダーおよびADH/GAPDH プロモーターと融合されているアニオンラットトリプシンに対する遺伝子を含む。
【００２０】
タンパク質をpYT プラスミド、ウラシンおよびロイシン枯渇培地に対する選択マーカーを保有するpBS24 誘導体の助けをかりて発現させた。
【００２１】
pST およびpYT プラスミドはアンピシリン耐性遺伝子を有する。対応する切断部位を有する両ベクター、すなわちプラスミドpST （5.4kb ）およびpYT （14kb）のマップを、図１に示す。
【００２２】
変異誘発
部位指向変異誘発を、E.coliプラスミドpST においてQuik change （登録商標）キット（STRATAGENE）を用いて実施した。
【００２３】
この手順は、pST ベクターの両プラスミド鎖を所望の変異を含む２つの合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて開始してPFU ポリメラーゼによって複製するPCR の手順と同様である。野生型pST をテンプレートとして利用して単一の変異を作製した。これらの単一の変異は、再度、二重変異体を構築するための開始点であった。
【００２４】
以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用した、太字は変異を示す：
得られたPCR 産物をウルトラコンピテントE.coli XL IIブルー細胞（STRATAGENE）に形質転換した。次いで選択を、アンピシリン（LB-amp）を含有する普通寒天プレート上で実施した。選び取ったコロニーを、アンピシリン（LB-amp）を含有する液体培地へ移し、培養１日後、プラスミドをSNAPキット（INVITROGENE ）を用いて単離した。単離したDNA を１％アガロースゲルを用いる電気泳動によって調べた。完全な遺伝子を配列決定することによって、所望の変異のみが存在していることを確実にし得た。
【００２６】
サブクローニング
pYT 発現ベクターにおけるサブクローニングは、pST プラスミドにおいて作製された全ての変異体について必要であった。サブクローニングをBam HIおよびSal I を用いる制限消化および対応するpYT ベクターフラグメントへのライゲーションによって実施した。全てのベクターフラグメントを適切な制限混合によって低融解アガロースゲル（0.8 ％）へ移動し、適切な分離後切断した。ゲル片を55℃で融解し、所望の組み合わせに従ってプールし、T4 DNAリガーゼを用いて16℃で一晩ライゲーションした。形質転換および再度必要な場合プラスミド単離を上記のように実施した。
【００２７】
成功したサブクローニングを、アガロースゲルにおいてEco RIおよびBam HIを用いる二重消化後、特有な制限パターンによって試験した。
【００２８】
完全なトリプシノゲン遺伝子を配列決定することによって、所望の変異のみが存在していることを確実にし得た。
【００２９】
酵母形質転換および選択
使用した酵母細胞株を、サッカロマイセス・セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）DLM 101 α[Mat a,leu 2-3,-112 his 2,3-11, -15 can 1, ura 3 , pep4 , [cir0], DM 23]と呼ぶ。EZ酵母形質転換キット（ZYMO research ）を使用して、コンピテント酵母細胞を調製し、pYT プラスミドを形質転換した。選択をウラシル欠損SCプレート上で30℃にて３〜４日間インキュベートすることによって実施した。ロイシン欠損SCプレートに個々のコロニーを接種し、また30℃にて３〜４日間インキュベートして、細胞におけるプラスミドのコピー数の増加を誘導した。これらのプレートの個々のコロニーを使用して、８％グルコースを含有するロイシン欠損SC液体培地の前培養に接種した。これらを30℃、120rpm、３日間振盪することによってインキュベートした。20mlの前培養を接種物として用いて、YPD 培地（１％グルコース、１％バクトペプトン、0.5 ％酵母エキス）を含有する１リットルの主培養へ接種した。インキュベーションパラメーターは、前培養のパラメーターと一致し、４日後収穫した。
【００３０】
トリプシンバリアントの単離および精製
細胞をまず第一に4000rpm で20分間遠心分離することによって分離し、上清をpH4.0 に調整し、再度12000rpmで遠心分離した。トリプシノゲンを含有するほとんどの粒子のない上清を、2mM 酢酸ナトリウム／100mM 酢酸（pH4.5 ）で平衡にしたToyopearl 650M（SUPELCO ）陽イオン交換カラムに適用した。2mM 酢酸ナトリウム／100mM 酢酸（pH4.5 ）〜200mM Tris／HCl （pH8.0 ）の線形pH勾配によって溶出した。
【００３１】
トリプシノゲンを含有する画分を、15％ポリアクリルアミドゲルを用いるSDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって測定し、プールした。タンパク質溶液の容量をCentriprep濃縮器（AMICON）によって、約10〜15mlに濃縮した。
【００３２】
トリプシノゲンバリアントの対応するトリプシンD189K ＋K60Eへの活性化を高度に精製されたエンテロキナーゼ（BIOZYME ）を用いてpH6.5 で実施し、SDS ゲル電気泳動によってモニタリングした。
【００３３】
活性化された酵素を、Biocad Sprint 灌流クロマトグラフィーシステム（PERSEPTIVE BIOSYSTEMS ）を用いて精製した。タンパク質サンプルを、５％Bis ／TrisプロパンpH6.0 を用いて平衡にしたPOROS 20 HQ （陰イオン交換カラム（４×100mm 、PERSEPTIVE BIOSYSTEMS ））上で、引き続き95％ 3M NaCl溶液までの勾配溶出によって分離した。トリプシンを含有する画分をSDS ゲルの助けを借りて試験し、プールした。これらを引き続き、1mM HCl に対して４℃にて透析し、このサンプルをCentriprep濃縮器で２〜４mlに濃縮した。
【００３４】
最終収率は、１リットルの培養培地あたり約２〜５mgタンパク質であった。
【００３５】
濃度の決定
調製物のタンパク質濃度を、Bradfordの方法に従って595nm の波長で分光光度計で測定した。校正曲線を50μm/ml〜１mg/ml のウシトリプシンの連続希釈に基づいてプロットした。
【００３６】
実施例２−トリプシンバリアントD189K 、K60EによるHt31（493 〜515 ）の合成 標的分子H-Asp-Leu-Ile-Glu-Glu-Ala-Ala-Ser-Arg-Ile-Val-Asp-Ala-Val-Ile-Glu-Gln-Val-Lys-Ala-Ala-Gly-Ala-Tyr-OH（Ht31（493 〜515 ））を、カルボキシ成分として使用するオクタペプチド-4- グアニジノフェニルエステルBoc-Asp-Leu-Ile-Glu-Glu-Ala-Ala-Ser-OGp （2.2mg 、おおよそ0.001mmol ）をアミノ成分として作用するペプチドH-Arg-Ile-Val-Asp-Ala-Val-Ile-Glu-Gln-Val-Lys-Ala-Ala-Gly-Ala-Tyr-OH（１mg、おおよそ0.0005mmol）とライゲーションすることで合成した。40% 有機溶媒を含有する水性緩衝液系を溶媒として使用した。両反応物を添加した後、反応をトリプシンバリアントD189K 、K60Eを添加することによって開始し、カルボキシ成分の完全変換後分析した。酵素触媒は、アミノ成分の完全アシル化を誘導する。合成産物の同一性を、アミノ酸分析を包含する有機化学の従来の方法によって確認した。この反応は、三機能性アミノ酸側鎖を修飾せず、反応体またはライゲーション産物の検出可能なタンパク質分解性切断を誘導しなかった。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、pST およびpYT プラスミドはアンピシリン耐性遺伝子を有する。対応する切断部位を有する両ベクター、すなわちプラスミドpST （5.4kb ）およびpYT （14kb）のマップを示す。
Claims (4)
- トリプシン二重バリアントD189K 、K60E。
- ペプチド、ペプチド模倣物またはタンパク質を合成するための請求項１記載のトリプシン二重バリアントの使用。
- カルボキシ成分Boc-Asp-Leu-Ile-Glu-Glu-Ala-Ala-Ser-OGp およびアミノ成分として作用するペプチドH-Arg-Ile-Val-Asp-Ala-Val-Ile-Glu-Gln-Val-Lys-Ala-Ala-Gly-Ala-Tyr-OHを使用して、40％の有機溶媒を含む水性緩衝液系において標的分子H-Asp-Leu-Ile-Glu-Glu-Ala-Ala-Ser-Arg-Ile-Val-Asp-Ala-Val-Ile-Glu-Gln-Val-Lys-Ala-Ala-Gly-Ala-Tyr-OH（Ht31(493〜515)）を合成し、該反応がアミノ成分の完全アシル化を誘導するトリプシン二重バリアントD189K 、K60Eの添加によって開始されることを特徴とする、請求項２記載のトリプシン二重バリアントの使用。
- トリプシンコード配列またはトリプシノゲンコード配列を含むベクターへ所望の変異を導入し、該新規なベクターを適切な宿主細胞、特にE.coliへ形質転換し、修飾トリプシン配列またはトリプシノゲン配列を適切な発現ベクターにサブクローニングし、トリプシンバリアントを発現させ、任意にトリプシノゲンバリアントを活性化し、その後酵素を精製することによる、トリプシン二重バリアントD189K 、K60Eの製造方法。
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