JP4538501B2 - ポリペプチドのc末端修飾 - Google Patents
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Description
Pn _P3 _P2 _P1 _P1`_P2`_P3`_Pn`
Sn _S3 _S2 _S1 _S1`_S2`_S3`_Sn`
トリプシンバリアント作製の一般的手順:
1. トリプシンまたはトリプシノーゲンをコードするDNAを含む適当なベクター、例えばpSTベクター(図1参照)を用いるトリプシンまたはトリプシノーゲン内への所望の突然変異の導入。大腸菌ベクターpSTは、もともと、L. Hedstromから構築され、ADH/GAPDH-プロモーターおよびトリプシノーゲンをコードする配列と融合させたα-因子リーダー配列を含有する酵母シャトルベクターを表す; Hedstrom, Lら, Science 255 (1992) 1249-1253を参照のこと。
2. 構築されたベクターの、例えば大腸菌内での形質転換。
3. それぞれ適当な発現ベクター、例えば酵母ベクターpYT (図1参照)を用いた、修飾トリプシン配列およびトリプシノーゲン配列のサブクローニング。所望の突然変異をこの発現ベクターに直接導入した場合、この工程は必要でない。
4. 大腸菌または酵母での修飾トリプシンまたはトリプシノーゲンの発現。
5. 適当な分離法、例えばカチオン交換クロマトグラフィーを用いる、修飾トリプシンまたはトリプシノーゲンの単離。
6. トリプシノーゲンが発現された場合は、単離されたチモーゲンは、エンテロキナーゼによる限定的なタンパク質分解によって活性化する必要がある。
7. 適当な精製法、例えばアフィニティクロマトグラフィーまたはアニオン交換クロマトグラフィーを適用する活性化されたトリプシンの最終精製。
8. 透析
[理論的pI: 5.41/Mw (平均質量): 23843.00/Mw (モノアイソトピック質量): 23827.59]
固相ペプチド合成によるペプチドの調製
別途指定する場合を除き、本出願において記載するペプチドは、バッチペプチド合成装置、例えばApplied BiosystemsのA433で、フルオレニルメチルオキシカルボニル-(Fmoc)-固相ペプチド合成により合成した。この方法では、各場合において、表2に示すアミノ酸誘導体4.0当量を使用した。
トリプシンバリアント Tn K60E、E151H、N143H、D189Kによって触媒される、Arg-NH2 によるAla-Ala-Tyr-Arg-His-Ala-Glyのアミド基転移
ペプチドAla-Ala-Tyr-Arg-His-Ala-Glyを、実施例2に記載のようにFmoc-化学を用いた従来の固相ペプチド合成および予め加えたWang-樹脂によって合成した。それぞれのアミノ酸構成ブロックは市販されており、種々の供給業者から購入した。Arg-NH2 は、Bachem (スイス)の市販品であった。
トリプシンバリアントTn K60E、E151H、N143H、D189Kの特異性に対するZn2+イオンの影響
ペプチド基質Bz-Ala-Ala-Tyr-Arg-His-Ala-Ala-Gly、Bz-Ala-Ala-Tyr-Arg-His-Ala-Gly、Bz-Ala-Ala-Tyr-Arg-His-Asp-Ala-Gly、Bz-Ala-Ala-Tyr-Arg-Arg-Ala-Gly、およびBz-Ala-Ala-Tyr-Asp-His-Ala-Glyを、Fmoc-化学を用いた従来の固相ペプチド合成および予め加えたWang-樹脂によって合成した。それぞれのアミノ酸構成ブロックは市販されており、種々の供給業者から購入した。
トリプシンバリアント Tn K60E、E151H、N143H、D189Kにより触媒される反応速度に対する認識配列の影響
配列番号: 3〜19のNα-ベンゾイル化ペプチドを、Fmoc-化学を用いた従来の固相ペプチド合成および予め加えたWang-樹脂により合成した。それぞれのアミノ酸構成ブロックは市販されており、種々の供給業者から購入した。
トリプシンバリアント Tn K60E、E151H、N143H、D189Kによって触媒されるArg-His-Ala-Lys(6-CF)-OHによるBz-Ala-Ala-Tyr-Arg-His-Ala-Glyのアミド基転移
Bz-Ala-Ala-Tyr-Arg-His-Ala-Glyは、Fmoc-化学を用いた従来の固相ペプチド合成および予め加えたWang-樹脂により合成した。それぞれのアミノ酸構成ブロックは市販されており、種々の供給業者から購入した。Arg-His-Ala-Lys(6-CF)-OH を、フラグメント縮合(fragment condensation)によって合成した。保護されたトリペプチドBoc-Arg(Boc)2-His(Trt)-Ala-OHを、従来の固相ペプチド合成を用いてクロロトリチル-樹脂上で合成した。塩化メチレン/酢酸/トリフルオロ酢酸 (v/v/v 8/1/1)を含む40 mlのカクテルで2回、ペプチドを樹脂から切断した。粗製物を、逆相HPLCにより精製した。他のフラグメントFmoc-Lys(6-カルボキシ-フルオレセイン)の合成を、3 mlのジオキシンおよび3 mlのDMF中、0.6 mmol Fmoc-Lys*HCl、0,655 mMol 6-カルボキシフルオレセイン (Molecular Probesから購入)から行なった。ピペリジンおよび逆相HPLCにより精製した粗製物を用いてFmoc-基を切断した。次いで、保護されたトリペプチドを、DMF中1当量のHBTU (Iris Biotech)および3当量のジイソプロピルエチルアミンで活性化した。1当量のLys(6-カルボキシ-フルオレセイン)を添加し、混合物を室温で2時間攪拌した。次いで、脱保護カクテル(18 mlのトリフルオロ酢酸、0.5 mlの水および0.5 mlのエタンジチオール)を用いて脱保護を行なった。ペプチドを、ジイソプロピルエーテルを用いて沈殿させ、RP-HPLCにより精製し、良好な収率で得た。
トリプシンバリアント Tn K60E、E151H、N143H、D189Kによって触媒されるArg-His-Gly-PEGによるAKTAAALHIL VKEEKLALDL LEQIKNGADF GKLAKKHSIC PSGKRGGDLG EFRQGQMVPA FDKVVFSCPV LEPTGPLHTQ FGYHIIKVLY RHのアミド基転移
Arg-His-Gly-PEGを、Boc-Arg(Boc)2-His(Trt)-Gly-OHのフラグメント縮合およびNektar/Shearwaterから購入したアミノ-PEG (20kD)により合成した。保護されたトリペプチドの合成およびフラグメントの活性化については実施例6を参照のこと。ここでは、0.5当量のアミノ-PEG (20 kD)を、求核試薬として用いた。脱保護後(カクテルについては実施例6を参照)、RP-HPLCを用いてすべての低分子不純物を分離した。
Claims (5)
- アミド基転移反応を実施するように機能し得る突然変異トリプシンであって、該突然変異トリプシンは、キモトリプシン命名法によるK60位およびD189位にアミノ酸置換、ならびにN143位もしくはE151位またはN143位およびE151位の両方にヒスチジンによるアミノ酸置換を含み、K60位は、EまたはDで置換され、D189位は、K、HまたはRで置換され、キモトリプシン命名法によるアミノ酸60位、189位、143位、および151位は、それぞれ、配列番号:1に示される配列の43位、171位、123位、および131位に対応し、該突然変異トリプシンは、配列番号:1に示される配列と少なくとも90%の配列相同性を有する、突然変異トリプシン。
- 請求項1記載の突然変異トリプシンの基質としての、標的ペプチドおよび切断部位Xaa1-Xaa2-His(式中、Xaa1はL、YまたはFであり、Xaa2はRまたはKである)を含む制限部位ペプチドを含み、前記制限部位ペプチドが前記標的ペプチドのC末端のアミノ酸Xaa1で標的ペプチドと重なる、ポリペプチドの使用。
- (a) 標的ペプチドおよび切断部位Xaa1-Xaa2-His(式中、Xaa1はL、YまたはFであり、Xaa2はRまたはKである)を含む制限部位ペプチドを含み、前記制限部位ペプチドが前記標的ペプチドのC末端のアミノ酸Xaa1で標的ペプチドと重なるポリペプチドを提供する工程、
(b) 前記ポリペプチドを、Xaa1後の内部タンパク質分解性(endoproteolytic)切断、およびエンドプロテアーゼと標的ペプチドとのペプチド-アシル-酵素中間体の形成を可能にする条件下で、請求項1記載の突然変異トリプシンと接触させる工程、
(c) 適切な求核試薬を添加する工程、および
(d) 求核攻撃および標的ペプチドのC末端への前記求核試薬の結合時、ペプチド-アシル-酵素中間体から突然変異トリプシンを放出する工程
を含む、C末端がアミド基転移した標的ペプチドの生成方法。 - 修飾を含む前記求核試薬が、アミノ酸アミド、ペプチド、ペプチドアミド、標識、標識されたアミノ酸アミド、標識されたペプチド、標識されたペプチドアミド、およびポリエチレングリコールからなる群より選択される、請求項3記載の方法。
- 請求項1記載の突然変異トリプシンをコードするヌクレオチド分子。
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