ES2309785T3 - Modificacion c-terminal de polipeptidos. - Google Patents
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Abstract
Una tripsina mutada que comprende una sustitución de aminoácido tanto en la posición K60 como D189, y al menos una sustitución de aminoácido más por histidina en la posición N143 o posición E151.
Description
Modificación C-terminal de
polipéptidos.
La presente invención está relacionada con una
tripsina mutada que comprende una sustitución aminoacídica en las
posiciones K60 y D189, y al menos otra sustitución aminoacídica por
histidina en la posición N143 o en la posición E151. Dicho mutante
de tripsina posee un punto de escisión preferible que comprende los
aminoácidos Xaa1-Xaa2-His, en el
que Xaa1 es L, Y o F y Xaa2 es R o K. La invención también está
relacionada con un polipéptido artificial que comprende un péptido
diana y el anterior punto de escisión, así como un método para
producir péptidos diana modificados en el extremo
C-terminal utilizando esta tripsina mutada.
El uso de péptidos biológicamente activos, por
ejemplo con propósitos farmacéuticos, es cada vez más importante
durante los últimos años. Existen varios métodos para producir tales
péptidos biológicamente activos, por ejemplo, técnicas de síntesis
química basada en las técnicas de síntesis de péptidos en fase
sólida o fase líquida, o el cultivo de microorganismos manipulados
genéticamente seguido del aislamiento y purificación de dichas
proteínas recombinantes producidas.
No obstante, sigue siendo difícil y costoso
sintetizar químicamente polipéptidos de más de 50 aminoácidos.
También representa un trabajo significativo modificar un péptido
obtenido mediante la síntesis química de péptidos y/o un
polipéptido obtenido de forma recombinante en su extremo
C-terminal. Uno de los métodos más potentes para la
modificación de polipéptidos es mediante una ligación controlada de
proteínas, en las que pueden incorporarse específicamente en un
polipéptido, análogos de péptido, aminoácidos artificiales, isótopos
estables, fluoróforos y otras moléculas bioquímicamente o
biofísicamente importantes. Uno de estos métodos se basa en la
introducción - principalmente de forma sintética - de un aminoácido
quimioselectivo, principalmente una cisteína que se modifica
posteriormente mediante un reactivo tioselectivo que ataca la cadena
lateral SH de este residuo aminoacídico. Otra alternativa es el
denominado sistema de ligación de proteínas basado en inteínas, que
puede generar un tioéster de proteínas mediante la proteólisis de la
correspondiente proteína de fusión proteína-inteína
(Blaschke, U.K., et al., Methods Enzymol. 328 (2000)
478-496). Este método se ha aplicado con éxito para
introducir modificaciones no naturales en proteínas. No obstante,
sigue habiendo dificultades, por ejemplo, debido a que la proteína
diana debe expresarse como una proteína de fusión junto a una
inteína.
Recientemente se han descrito varias
aproximaciones basadas en enzimas para la ligación y/o modificación
C-terminal de péptidos. Breddam y colaboradores
(por ejemplo, en la US 5.985.627) describen la utilización de la
proteasa de serina carboxipeptidasa Y (CPD-Y) para
la modificación C-terminal de péptidos con
fluorescencia o marcas de afinidad. Esta modificación se basa en la
capacidad específica de la CPD-Y de escindir
progresivamente aminoácidos del extremo C-terminal
de un polipéptido. Este método por lo tanto puede considerarse como
una herramienta específica para la modificación del extremo
C-terminal de un polipéptido. La
CPD-Y escinde el aminoácido
C-terminal a través de la formación de un
intermediario péptido-acilo-enzima.
Este intermediario acilo-enzima tras el ataque
nucleofílico se deacila, dando lugar a una reacción de
transamidación. La reacción de transamidación deseada puede ir
acompañada de reacciones secundarias (no deseadas) como la
hidrólisis. También es posible que más de un aminoácido
C-terminal sea escindido, aunque por otro lado,
también pueden añadirse aminoácidos mediante este método
(Stennicke, H. R., et al., Anal. Biochem. 248 (1997)
141-148 y Buchardt, O., et al., US
5.580.751) Abrahmson et al. (por ejemplo en la WO 94/18329)
describen el uso de variantes de proteasas de serina para la
ligación de péptidos. Las variantes de subtilisina que se describen
poseen una actividad ligasa de péptidos mejorada. No obstante, para
la ligación efectiva de péptidos es necesario utilizar un grupo
protector del extremo amino terminal apropiado y un grupo activador
del extremo carboxiterminal apropiado, respectivamente, para poder
ligar de forma eficiente dos sustratos peptídicos.
Recientemente se ha descrito la ligación de
proteínas mediada por sortasa como un método alternativo en la
ingeniería de proteínas (Mao, H., et al., J. Am. Chem. Soc.
126 (2004) 2670-2671). La sortasa, una enzima
aislada de Staphylococcus aureus, cataliza una reacción de
transpeptidación mediante la escisión entre treonina y glicina en
un motivo de reconocimiento que consiste en los aminoácidos LPXTG, y
la posterior unión del grupo carboxilo de la treonina con una
glicina N-terminal. En la naturaleza cataliza la
transpeptidación de la treonina con un grupo amino de pentaglicina
del peptidoglicano de la pared celular.
En el motivo de reconocimiento de la sortasa
LPXTG, X puede ser los aminoácidos D, E, A, N, Q o K. Esta enzima
se ha utilizado para ligar residuos de treonina carboxiterminal de
un péptido o una proteína a una glicina N-terminal
de un segundo péptido. Tal como se ha mencionado, la sortasa
requiere de un motivo de reconocimiento de cinco aminoácidos, de
los cuales cuatro aminoácidos (LPXT) estarán presentes en el
producto de ligación.
Por lo tanto, aunque existen varios métodos para
la modificación C-terminal de polipéptidos, existe
una gran necesidad de métodos alternativos o mejorados para la
modificación C-terminal de polipéptidos. Los
inventores de la presente invención han encontrado que es posible
utilizar mutantes especiales de tripsina para la modificación
C-terminal de polipéptidos.
En una realización, por lo tanto, la presente
invención está relacionada con una tripsina mutada, que comprende
una sustitución de aminoácidos en la posición K60 y D189, y al menos
una sustitución de aminoácidos por histidina en la posición N143 o
en la posición E151 de acuerdo con la nomenclatura de la
quimiotripsina, lo que corresponde a las posiciones 43, 171, 123 y
131, respectivamente, de la secuencia proporcionada en el Id. de
Sec. Nº:1.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Al experto en la materia le será familiar la
nomenclatura de la quimiotripsina anteriormente mencionada como,
por ejemplo, la descrita en Hartley, B.S., y Shotton, D.M., La
enzimas, P.D. Boyer (ed.), Vol. 3, (1971), Págs.
323-373 y no tendrá problemas en alinear las
posiciones de una variante de tripsina con las posiciones
proporcionadas de acuerdo con la nomenclatura de la quimiotripsina
con las posiciones correspondientes en la secuencia de tripsina de
Id. de Sec. Nº: 1.
La posición 60 de acuerdo con la nomenclatura de
la quimiotripsina corresponde a la posición 43 de la secuencia de
la tripsina II madura aniónica de rata, de Rattus norvegicus,
que se proporciona con Id. de Sec. Nº: 1.
La posición 143 de acuerdo con la nomenclatura
de la quimiotripsina corresponde a la posición 123 de la secuencia
de la tripsina II madura aniónica de rata, de Rattus
norvegicus, que se proporciona con Id. de Sec. Nº: 1.
La posición 151 de acuerdo con la nomenclatura
de la quimiotripsina corresponde a la posición 131 de la secuencia
de la tripsina II madura aniónica de rata, de Rattus
norvegicus, que se proporciona con Id. de Sec. Nº:1.
La posición 189 de acuerdo con la nomenclatura
de la quimiotripsina corresponde a la posición 171 de la secuencia
de la tripsina II madura aniónica de rata, de Rattus
norvegicus, que se proporciona con Id. de Sec. Nº: 1.
Como los expertos están acostumbrados a expresar
las posiciones en referencia a la nomenclatura de la quimiotripsina,
a continuación las referencias a posiciones de secuencia
específicas, por ejemplo la posición K60 o simplemente la posición
60, se basan exclusivamente en las posiciones según la nomenclatura
de la quimiotripsina.
La presente invención también está relacionada
con la utilización de un polipéptido sintético que comprende un
péptido diana y un péptido con el lugar de restricción que comprende
el punto de escisión Xaa1-Xaa2-His,
en el que Xaa1 es L, Y o F, y Xaa2 es R o K, y en el que dicho
péptido con el lugar de restricción se solapa con el péptido diana
por el aminoácido Xaa1 en el extremo C-terminal de
dicho péptido diana como substratos de un mutante de tripsina como
el descrito en la presente invención.
También se proporciona un método para producir
un péptido diana transacilado en C-terminal que
comprende los pasos de: (a) proporcionar un polipéptido que
comprende un péptido diana y un péptido con el lugar de restricción
que comprende el punto de escisión
Xaa1-Xaa2-His, en el que Xaa1 es L,
Y o F, y Xaa2 es R o K, en el que dicho péptido con el lugar de
restricción se solapa con el péptido diana por el aminoácido Xaa1 en
el extremo C-terminal de dicho péptido diana, (b)
poner en contacto dicho péptido con un mutante de tripsina de
acuerdo con la presente invención bajo condiciones que permiten la
escisión endoproteolítica tras Xaa1 y la formación de un
intermediario péptido diana de la
endoproteasa-acilo, (c) añadir un nucleófilo
apropiado y (d) tras el ataque nucleofílico y la unión de dicho
nucleófilo al extremo C-terminal del péptido diana,
liberar la tripsina mutada del intermediario péptido diana de la
endoproteasa-acilo.
En otra realización, la presente invención está
relacionada con secuencias nucleotídicas que codifican los nuevos
mutantes de tripsina, con vectores que comprenden tales mutantes y
con las células huésped transformadas que comprenden tales
vectores.
La tripsina mutada de acuerdo con la presente
invención es una tripsina que comprende sustituciones de aminoácido
en ambas posiciones K60 y D189 y al menos una sustitución de
aminoácido en la posición N143 o en la posición E151. La
sustitución en la posición 143 y/o posición 151 es por histidina
(His).
Preferiblemente, la tripsina mutada de acuerdo
con la presente invención comprende el aminoácido E o el aminoácido
D en la posición 60, reemplazando el aminoácido K normalmente
presente en la posición 60.
También es preferible que la tripsina mutada de
acuerdo con la presente invención comprenda el aminoácido K, el
aminoácido H o el aminoácido R en la posición 189, reemplazando así
el aminoácido D normalmente presente en esa posición.
Una sustitución muy preferible es K en la
posición 189.
En una realización más preferible la tripsina
mutada de acuerdo con la presente invención comprende mutaciones en
las posiciones 60, 143, 151 y 189. Las sustituciones preferibles en
esta enzima mutada son K60E o D, N143H, E151H y D189K o R.
Los mutantes de tripsina anteriormente descritos
tienen propiedades muy interesantes e importantes. Tales mutantes
parecen reconocer preferentemente un punto de unión o escisión que
consiste en 3 aminoácidos
Xaa1-Xaa2-His, en el que Xaa1 es L,
Y o F y Xaa2 es R o K. Esta diana de restricción es escindida por
los anteriores mutantes tras Xaa1. Esta es una característica muy
importante, ya que utilizando los nuevos mutantes de tripsina sólo
un aminoácido, es decir Xaa1 en C-terminal,
permanecerá en el polipéptido diana modificado.
Para facilitar el entendimiento de la invención,
se proporciona una breve discusión de la terminología utilizada en
conexión con la invención. La presente descripción utiliza la
terminología de Schechter, J. y Berger, A., Biochem. Biophys. Res.
Commun. 27 (1967) 157-162, para describir la
localización de varios residuos aminoacídicos en el sustrato
peptídico y en el centro activo de la enzima proteolítica
correspondiente.
\global\parskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con la terminología propuesta por
Schechter, J. y Berger, A., anteriormente, los residuos
aminoacídicos del sustrato peptídico se designan mediante la letra
"P". Los aminoácidos del sustrato en el lado
N-terminal del enlace peptídico a escindir (el
"punto de escisión") se designan Pn...P3, P2, P1, siendo Pn el
residuo aminoacídico más lejano del punto de escisión. Los residuos
aminoacídicos del sustrato peptídico en el lado
C-terminal del punto de escisión se designan P1',
P2', P3'...Pn', siendo Pn' el residuo aminoacídico más lejano del
punto de escisión. Por lo tanto, el enlace que se escinde (el
"punto de escisión") es el enlace P1-P1'.
La fórmula genérica para los aminoácidos del
sustrato de una endopeptidasa (como por ejemplo tripsina) es la
siguiente:
Pn-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-Pn'
La denominación de los puntos de unión del
sustrato de una endopeptidasa es análoga a la denominación de los
residuos aminoacídicos del sustrato peptídico. Sin embargo, los
subpuntos de unión de una endopeptidasa se designan mediante la
letra "S" y pueden incluir más de un residuo aminoacídico. Los
puntos de unión del sustrato a los aminoácidos en el lado
N-terminal del punto de escisión se denominan
Sn...S3, S2, S1. Los subpuntos de unión al sustrato a los
aminoácidos del lado carboxilo del punto de escisión se designan
S1', S2', S3', Sn'. Por lo tanto, en una endopeptidasa, el subpunto
S1' interacciona con el grupo P1' del sustrato peptídico y el
nucleófilo entrante. Una fórmula genérica para describir los puntos
de unión del sustrato de una endopeptidasa es:
\vskip1.000000\baselineskip
Sn-S3-S2-S1-S1'-S2'-S3'-Sn'
El punto de unión S1 se une a la cadena lateral
del penúltimo aminoácido, P1, del sustrato peptídico, en el caso de
una tripsina mutante de acuerdo con esta invención, el aminoácido
Xaa1. El punto de unión S1' interacciona con la cadena lateral de
P1', en el presente caso con Xaa2. Asimismo, el punto de unión S2'
interacciona con la cadena lateral del residuo de histidina en la
posición P2'.
Como un experto podrá apreciar la presente
invención también puede realizarse con variantes de tripsina que
comprenden una sustitución de aminoácido tanto en la posición K60
como D189, y al menos una sustitución de aminoácido más por
histidina en la posición N143 o posición E151.
El término "variante" se refiere a
polipéptidos con secuencias aminoacídicas que difieren en cierta
medida de una secuencia de polipéptido nativa. Normalmente, una
secuencia aminoacídica variante tendrá al menos alrededor del 80%
de homología con la correspondiente secuencia parental de tripsina,
y preferiblemente, tendrá al menos alrededor del 90%, más
preferiblemente al menos alrededor del 95% de homología con la
correspondiente secuencia parental de tripsina. Las variantes de
secuencia aminoacídica contienen sustituciones, deleciones, y/o
inserciones en ciertas posiciones de la secuencia aminoacídica de
la secuencia aminoacídica nativa. Preferiblemente, la homología de
secuencia será de al menos un 96% o 97%.
La "homología" se define como el porcentaje
de residuos en la variante de la secuencia aminoacídica que son
idénticos tras el alineamiento de las secuencias y la introducción
de huecos, si es necesaria, para alcanzar el máximo porcentaje de
homología. Los métodos y programas informáticos para el alineamiento
son bien conocidos en la materia. Uno de estos programas
informáticos es "Align 2", de Genentech, Inc., que se depositó
con la documentación para el usuario en la Oficina de Derechos de
Propiedad de Estados Unidos, Washington, DC 20559, el 10 de
diciembre de 1991.
Preferiblemente, una variante de la tripsina
como la descrita en la presente invención comparada con la
correspondiente secuencia salvaje, comprende 20 sustituciones de
aminoácido o menos, más preferiblemente 15 sustituciones de
aminoácido o menos, también preferiblemente 10 sustituciones de
aminoácido o menos, y también preferiblemente 6 sustituciones de
aminoácido o menos.
La tripsina modificada de la invención es capaz
de una transacilación mejorada comparada con la correspondiente
tripsina nativa. Como se utiliza aquí, "transacilación" es una
reacción en la que un fragmento peptídico C-terminal
al punto de escisión de la tripsina se intercambia por un
nucleófilo. Las reacciones de transacilación incluyen las
reacciones de transtiolación, transesterificación y transamidación.
La "transamidación" ocurre cuando se forma un enlace amida
entre el nucleófilo y el sustrato peptídico diana. En una reacción
de transamidación, el nucleófilo no es necesariamente un
aminoácido. La "transpeptidación" es un importante subgrupo de
transamidación que ocurre cuando el nucleófilo es un aminoácido o
derivado de aminoácido, como un éster aminoacídico o amida
aminoacídica.
\newpage
Una reacción de transacilación general de
acuerdo con la presente invención se muestra a continuación:
En el primer paso, la enzima ataca el enlace
peptídico entre Xaa1 y Xaa2, desplazando el resto de aminoácidos en
C-terminal y formando un enlace covalente (un acilo)
entre el residuo P1 (Xaa1 del péptido diana y la enzima. Este
intermediario se denomina un "intermediario
péptido-acilo-enzima" del péptido
diana o simplemente un intermediario acilo-enzima.
En presencia del nucleófilo apropiado, bajo las condiciones
apropiadas, la enzima causa la unión del nucleófilo al sustrato
peptídico escindido para producir un producto transacilado. Se cree
que el nucleófilo se une al grupo carboxilo del intermediario
acilo-enzima y desplaza la enzima del intermediario
acilo-enzima. De esta forma, el nucleófilo queda
unido al grupo carboxilo del sustrato peptídico.
En lugar de sufrir una reacción de
transacilación, el intermediario acilo-enzima puede
deacilarse mediante agua para dar lugar al producto hidrolizado. La
tripsina mutada de la invención se designa para producir
preferiblemente el producto de transacilación frente al producto de
hidrólisis.
La presente invención también está relacionada
con un polipéptido sintético que comprende un péptido diana y un
péptido con un lugar de restricción que comprende el punto de
escisión Xaa1-Xaa2-His, en el que
Xaa1 es L, Y o F, y Xaa2 es R o K, en el que dicho péptido con el
lugar de restricción se solapa con el péptido diana por el
aminoácido Xaa1 en el extremo C-terminal de dicho
péptido diana. Con otras palabras, está relacionada con un
polipéptido sintético que comprende un péptido diana y un péptido
con un lugar de restricción que comprende el punto de escisión
Xaa1-Xaa2-His, en el que Xaa1 es L,
Y o F, y Xaa2 es R o K, en el que dicho péptido con un lugar de
restricción y dicho péptido diana comparten el aminoácido Xaa1 en el
extremo C-terminal de dicho péptido diana. Más
preferiblemente, Xaa1 es Y o F, y es especialmente preferible que
Xaa1 sea Y.
El término péptido diana, por lo tanto, se
refiere al péptido o polipéptido de secuencia
Pn-P3-P2-Xaa1. El
péptido diana incluye así un aminoácido del punto de escisión de la
tripsina mutada de esta invención, es decir, el aminoácido Xaa1,
que es L, Y o F. El término péptido incluye los polipéptidos.
El término sintético se utiliza para indicar que
la secuencia peptídica es artificial, por ejemplo ha sido diseñada
por un científico o por un ordenador. La presente invención no está
relacionada con polipéptidos que aparecen naturalmente y que
comprenden el motivo de secuencia anteriormente definido
Xaa1-Xaa2-His. Simplemente está
relacionada con los polipéptidos sintéticos, por ejemplo obtenidos
mediante métodos de síntesis o recombinantes que se han diseñado
para que comprendan tanto un polipéptido diana así como un péptido
con un lugar de restricción que comprende el punto de escisión
Xaa1-Xaa2-His, siendo Xaa1 y Xaa2
como se han definido anteriormente. De acuerdo con nuestra
definición, el polipéptido diana contiene el aminoácido Xaa1 como
aminoácido C-terminal. El péptido con un lugar de
restricción comprende al menos los aminoácidos
Xaa2-His y opcionalmente otros aminoácidos en
C-terminal a éstos. Así, el punto de escisión que
consiste en Xaa1-Xaa2-His se solapa
con el polipéptido diana por un aminoácido (Xaa1) y por dos
aminoácidos (Xaa2-His) con el péptido con el lugar
de restricción. Como un experto podrá apreciar, en principio
cualquier polipéptido que comprende
Xaa1-Xaa2-His, en el que Xaa1 y
Xaa2 son como se han definido anteriormente, puede utilizarse como
sustrato para los mutantes de tripsina de acuerdo con la presente
invención, por ejemplo en el intento de una ligación de péptidos o
de una transacilación de un péptido en C-terminal,
por ejemplo con propósito de modificación y/o marcaje.
Preferiblemente, un polipéptido diana de acuerdo
con la presente invención consiste en de 20 a 2000 aminoácidos.
También es preferible un péptido diana que consiste en de 30 a 1500
aminoácidos. Más preferiblemente tal polipéptido diana consiste en
40-1000 aminoácidos.
Los polipéptidos diana preferibles son
polipéptidos utilizados en aplicaciones diagnósticas o
terapéuticas.
Los polipéptidos diana preferibles, por ejemplo,
comprenden agentes de unión específicos, como anticuerpos y
fragmentos de los mismos. También son preferibles los agentes de
unión específicos obtenidos mediante presentación en fagos (véase
por ejemplo, Allen, J.B., et al., TIBS 20 (1995)
511-516).
El término anticuerpo se refiere a un anticuerpo
policlonal, un anticuerpo monoclonal, fragmentos de tales
anticuerpos, así como a construcciones genéticas que comprenden el
dominio de unión de un anticuerpo. Cualquier fragmento de
anticuerpo que mantiene esencialmente las mismas propiedades de
unión que el anticuerpo parental también puede utilizarse.
Preferiblemente el polipéptido diana comprendido
en un polipéptido recombinante de acuerdo con la presente invención
es un polipéptido terapéuticamente activo. Tal polipéptido
terapéuticamente activo preferiblemente se selecciona de entre el
grupo que consiste en un anticuerpo terapéutico, eritropoyetina y un
interferón. Preferiblemente, la proteína terapéutica es
eritropoyetina o un interferón.
Será obvio para el experto que sólo se
utilizarán como polipéptidos diana los polipéptidos que no
comprenden el motivo de secuencia
Xaa1-Xaa2-His, siendo Xaa1 y Xaa2
como se han definido anteriormente, como parte de su secuencia en
N-terminal respecto al punto de escisión deseado. El
experto no tendrá problema en excluir aquellos polipéptidos con un
potencial punto de escisión para la tripsina mutada de la presente
invención. Como alternativa, tal secuencia interna del potencial
punto de escisión puede modificarse mediante técnicas rutinarias de
mutación y/o clonaje para cambiar y/o eliminar tal punto de escisión
interno no deseado.
En una realización preferible, el polipéptido de
acuerdo con la presente invención que comprende en su extremo
C-terminal, o cerca de éste, la secuencia
Xaa1-Xaa2-His, en el que Xaa1 y Xaa2
son como se han definido anteriormente, se produce mediante métodos
recombinantes. El experto no tendrá problema en modificar cualquier
polipéptido diana deseado que esté accesible para su producción
recombinante de forma que comprenda en su extremo
C-terminal, o cerca de éste, el lugar de
restricción anteriormente definido de
Xaa1-Xaa2-His.
El péptido con el lugar de restricción de
acuerdo con la presente invención al menos comprende los aminoácidos
Xaa2 (R o K)-His con Xaa2 en su extremo
N-terminal. Éste puede contener aminoácidos
adicionales hacia C-terminal para facilitar, por
ejemplo, la producción recombinante o una purificación sencilla. En
otra realización preferible, el polipéptido recombinante comprende
como parte del péptido con el lugar de restricción una llamada cola
de His en su extremo C-terminal, lo que permite una
fácil purificación mediante métodos cromatográficos bien
establecidos, por ejemplo, la utilización de
hexa-His y cromatografía de Ni-NTA
(Hochuli, E., et al., J. Chromatogr. 411 (1987)
177-184).
Preferiblemente, los mutantes de tripsina
anteriormente descritos se utilizan en un método para la acilación
C-terminal de un sustrato peptídico. Como el experto
podrá apreciar, tal sustrato peptídico comprenderá un punto de
escisión para la tripsina mutada de acuerdo con esta invención y el
método comprenderá los pasos de proporcionar un sustrato peptídico
apropiado, poniendo en contacto dicho sustrato peptídico con un
mutante de tripsina de acuerdo con la presente invención bajo
condiciones que permiten la escisión endoproteolítica tras Xaa1 y
la formación de un intermediario péptido diana de la
endoproteasa-acilo, que añadiendo un nucleófilo
apropiado, y tras el ataque nucleofílico y la unión de dicho
nucleófilo al extremo C-terminal del péptido diana
libera la tripsina mutada del intermediario péptido diana de la
endoproteasa-acilo.
Preferiblemente, los mutantes de tripsina
anteriormente descritos y los polipéptidos anteriormente descritos
que comprenden Xaa1-Xaa2-His, siendo
Xaa1 y Xaa2 como se han definido anteriormente, se utilizan en un
método de modificación de un polipéptido en
C-terminal mediante transacilación, por ejemplo en
un método para la ligación de péptidos. En una realización
preferible, la presente invención por lo tanto está relacionada con
un método para producir un péptido diana transacilado en
C-terminal que comprende los pasos de: (a)
proporcionar un polipéptido que comprende un péptido diana y un
péptido con el lugar de restricción que comprende el punto de
escisión Xaa1-Xaa2-His, en el que
Xaa1 es L, Y o F, y Xaa2 es R o K, (b) poner en contacto dicho
péptido con un mutante de tripsina de acuerdo con la presente
invención bajo condiciones que permiten la escisión
endoproteolítica tras Xaa1 y la formación de un intermediario
péptido diana de la endoproteasa-acilo, (c) añadir
un nucleófilo apropiado y (d) tras el ataque nucleofílico y la unión
de dicho nucleófilo al extremo C-terminal del
péptido diana, liberar la tripsina mutada del intermediario péptido
diana de la endoproteasa-acilo.
Como se utiliza aquí, un nucleófilo es una
molécula que dona un par de electrones a un aceptor de electrones,
en este caso el carbono \alpha-carboxilo del
intermediario péptido-acilo-enzima,
para formar un enlace covalente.
Preferiblemente, el nucleófilo se selecciona del
grupo que consiste en aminas primarias, iminas, aminas secundarias,
tiol e hidroxilo. Los nucleófilos adecuados por ejemplo incluyen los
aminoácidos, derivados de aminoácido, como los ésteres de
aminoácido y amidas de aminoácido, aminas, como el amonio o aminas
de bencilo.
Los términos "transacilación" o
"transacilado" se utilizan para indicar que el aminoácido
C-terminal del péptido diana (Xaa1) está unido a
través de un enlace covalente al nucleófilo. Si el nucleófilo es un
tiol la transacilación es una tiolación, si el nucleófilo comprende
un grupo hidroxílico la transacilación es una esterificación y si
el nucleófilo es una amina la transacilación resulta en una
transamidación. Las reacciones de transamidación son muy
importantes y representan una realización preferible de acuerdo con
la presente invención.
Como el experto fácilmente apreciará, los
nucleófilos apropiados pueden además comprender modificaciones que
introduzcan propiedades deseadas al extremo
C-terminal de un polipéptido diana apropiado.
Preferiblemente, la presente invención está relacionada con un
nucleófilo que comprende una modificación que se selecciona del
grupo que consiste en un péptido, una amida de péptido, un marcaje,
una amida de aminoácido marcada, un péptido marcado, una amida de
péptido marcada, un aminoácido no natural y polietilenglicol.
\newpage
El término marcaje es bien conocido para el
experto y puede ser cualquier estructura de interés deseada.
Preferiblemente, tal marcaje puede seleccionarse de entre cualquier
grupo detectable conocido, como los colorantes, grupos de marcaje
luminiscente como los grupos quimioluminiscentes, por ejemplo los
ésteres de acridinio o dioxoetanos, o colorantes fluorescentes, por
ejemplo fluoresceína, cumarina, rodamina, oxazina, resorufina,
cianina y derivados de los mismos. Otros ejemplos de grupo de
marcaje son los complejos metálicos luminiscentes como los complejos
de rutenio o europio, enzimas como los utilizados en el CEDIA
(Inmunoensayo de Enzima Donante Clonada, por ejemplo en la
PE-A-0 061 888) y radioisótopos.
Otro grupo preferible de marcajes de interés,
por ejemplo, comprende una de los miembros de un par de unión
bioafín. Mientras se realiza un ensayo este tipo de marcaje
interacciona específicamente, y preferiblemente no covalentemente,
con el otro miembro del par de unión bioafín. Ejemplos de miembros
de unión de los pares de unión bioafín son los haptenos o
antígeno/anticuerpo, biotina o análogos de biotina como la
aminobiotina, iminobiotina o destiobiotina/avidina o
estreptavidina, azúcar/lectina, ácidos nucleicos o análogos de
ácidos nucleicos/ácidos nucleicos complementarios,
receptor/ligando, por ejemplo receptor de la hormona
esteroidea/hormona esteroidea. Los marcajes preferibles de este
grupo se seleccionan de entre hapteno, antígeno y hormona. Los
marcajes especialmente preferibles son los haptenos como la digoxina
y biotina, y los análogos de los mismos.
Otro grupo de modificaciones preferibles son los
aminoácidos no naturales y los derivados de los mismos. Los más
interesantes son los aminoácidos no naturales que contienen grupos
funcionales, que son ortogonales a los aminoácidos naturales, por
ejemplo las funciones aldehído, hidrazinas, hidrazidas, azidas y
\alpha-halogeno-cetonas.
En caso de que el nucleófilo comprenda
polietilenglicol (PEG), este PEG preferiblemente tienen un peso
molecular en el rango de 2.000 Da a 50.000 Da. El PEG puede ser
linear o ramificado. Más preferiblemente el PEG tendrá un rango de
peso molecular entre 10.000 Da y 40.000 Da. Preferiblemente, el
grupo nucleofílico de tal nucleófilo que comprende PEG será una
arginina o una lisina con un grupo \alpha-amino
N-terminal libre. Esta arginina o lisina también
puede ser el extremo N-terminal de un péptido.
Preferiblemente, tal nucleófilo pegilado se selecciona del grupo
que consiste en Arg-His-PEG,
Arg-His-Ala-PEG,
Lys-His-PEG,
Lys-His-Ala-PEG y
Arg-His-Xaa-PEG, en
el que Xaa puede ser cualquier ácido di-amino
carboxílico natural o no natural. El ácido di-amino
carboxílico modificado con PEG puede comprender una o dos moléculas
de PEG unidas a uno o ambos de estos grupos amino, respectivamente.
El experto puede seleccionar o diseñar otros nucleófilos modificados
con PEG apropiados, como una cisteína pegilada y otros.
De acuerdo con los procedimientos conocidos en
el estado de la materia o de acuerdo con los procedimientos
proporcionados en la sección de ejemplos y gracias a las
instrucciones de la presente invención, ahora es posible obtener
secuencias de polinucleótidos que codifican las tripsinas mutantes
de la invención. Preferiblemente, la tripsina mutada de acuerdo con
la presente invención se expresa como un precursor inactivo
(zimógeno) que es escindido enzimáticamente para dar lugar a la
enzima activa. En otra realización, la presente invención está
relacionada con una secuencia nucleotídica que codifica la tripsina
mutada que comprende una sustitución de aminoácido en la posición
tanto K60 como D189, y al menos una sustitución de aminoácido más
por histidina en la posición N143 o posición E151,
respectivamente.
La presente invención además incluye un vector
de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico de
acuerdo con la presente invención ligada de forma operativa a una
secuencia promotor capaz de dirigir su expresión en una célula
huésped.
La presente invención además incluye un vector
de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico de
acuerdo con la presente invención ligada de forma operativa a una
secuencia promotor capaz de dirigir su expresión en una célula
huésped. Los vectores preferibles son los plásmidos como pST y pYT
que se muestran en la Figura 1.
Los vectores de expresión útiles en la presente
invención normalmente contienen un origen de replicación, un
promotor localizado corriente arriba en la secuencia de DNA, y
seguidamente la secuencia de DNA que codifica el mutante de
tripsina, seguido de secuencias de finalización de la transcripción
y el resto de vector. Los vectores de expresión también pueden
incluir otras secuencias de DNA conocidas en la materia, por
ejemplo, secuencias líder de estabilidad que proporcionan
estabilidad al producto de expresión, secuencias líder secretoras
que proporcionan la secreción del producto de expresión, secuencias
que permiten la modulación de la expresión de gen estructural (por
ejemplo, mediante la presencia o ausencia de nutrientes u otros
inductores en el medio de crecimiento), secuencias de marcado que
son capaces de proporcionar una selección fenotípica en las células
huésped transformadas, y las secuencias que proporcionan lugares de
escisión para las endonucleasas de restricción.
Las características del vector de expresión real
utilizado deben ser compatibles con la célula huésped que se va a
utilizar. Por ejemplo, si el clonaje es en un sistema de células
E. coli, el vector de expresión debería contener promotores
aislados a partir del genoma de células E. coli (por ejemplo,
lac o trp). Los orígenes de replicación adecuados en varios
huéspedes E. coli incluyen, por ejemplo, un origen de
replicación del plásmido ColE1. Los promotores adecuados incluyen,
por ejemplo, lac y trp. También es preferible que el vector de
expresión incluya una secuencia que codifique un marcador
seleccionable. El marcador seleccionable es preferiblemente un gen
de resistencia a antibióticos. Como marcadores seleccionables,
pueden utilizarse convenientemente la resistencia a ampicilina o la
resistencia a canamicina. Todos estos materiales son conocidos en la
material y están disponibles comercialmente.
Los vectores de expresión adecuados que
contienen las secuencias codificantes y de control deseadas pueden
obtenerse utilizando técnicas de DNA recombinante estándar conocidas
en la materia, muchas de las cuales se describen en Sambrook, J.
et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989).
La presente invención adicionalmente está
relacionada con las células huésped que contienen un vector de
expresión que comprende una secuencia de DNA que codifica el
mutante de tripsina de acuerdo con la presente invención. Son
preferibles las células huésped que contienen un vector de expresión
que comprende una o más secuencias de DNA reguladoras capaces de
dirigir la replicación y/o la expresión, y que está ligado de forma
operativa a una secuencia de DNA que codifica la totalidad o una
parte funcional del mutante de tripsina. Las células huésped
adecuadas incluyen, por ejemplo, E. coli HB101 (ATCC 33694)
disponible en Promega (2800 Woods Hollow Road, Madison, W1, USA),
XL1-Blue MRF disponible en Stratagene (11011 North
Torrey Pine Road, La Jolla, CA, USA) y similares.
Los vectores de expresión pueden introducirse en
las células huésped mediante varios métodos conocidos en la
materia. Por ejemplo, la transformación de células huésped con
vectores de expresión puede realizarse mediante el método de
transformación de protoplastos mediado por polietilenglicol
(Sambrook et al. 1989). Sin embargo, también pueden
utilizarse otros métodos para introducir vectores de expresión en
las células huésped, por ejemplo, la electroporación, inyección
bolística o fusión de protoplastos.
Una vez un vector de expresión que contiene un
mutante de tripsina se ha introducido en una célula huésped
apropiada, la célula huésped puede cultivarse bajo las condiciones
que permiten la expresión de los mutantes de tripsina deseados. Las
células huésped que contienen un vector de expresión que contiene
una secuencia de DNA que codifica el mutante de tripsina, por
ejemplo, se identifican mediante uno o más de las siguientes
aproximaciones generales: hibridación de DNA, presencia o ausencia
de las funciones del gen marcador, valoración del nivel de
transcripción medido por la producción de transcritos de mRNA de
tripsina en la célula huésped, y la detección del producto génico
de forma inmunológica.
Se entenderá, por supuesto, que no todos los
vectores de expresión y secuencias reguladoras de DNA funcionarán
igual de bien para la expresión de las secuencias de DNA de la
presente invención. Ni todas las células huésped funcionarán igual
de bien con el mismo sistema de expresión. Sin embargo, un experto
en la materia podrá seleccionar entre los diferentes vectores de
expresión, secuencias reguladoras de DNA y células huésped
utilizando las pautas que se proporcionan aquí sin una
experimentación indebida.
Los siguientes ejemplos, referencias, listado de
secuencias y figuras se proporcionan para una mejor comprensión de
la presente invención, cuyo verdadero alcance de la cual se fija en
las reivindicaciones anexas. Se entenderá que pueden realizarse
modificaciones en los procedimientos fijados sin alejarse del
espíritu de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
A la izquierda se muestra un esquema del vector
lanzadera pST de E. coli, que comprende una región
codificante del tripsinógeno. La región codificante puede
insertarse fácilmente en un vector pYT, optimizado para la expresión
de polipéptidos en levaduras. A la derecha de esta figura se
muestra un esquema del vector pYT que comprende una región
codificante del tripsinógeno.
\vskip1.000000\baselineskip
Ensayo a lo largo del tiempo de la
transamidación de
Ala-Ala-Tyr-Arg-His-Ala-Gly
(triángulos) con Arg-NH_{2} catalizada por la
variante de tripsina Tn K60E, E151H, N143H, D189K, que resulta en
Ala-Ala-Tyr-Arg-NH_{2}
(círculos) en presencia de a) EDTA 100 \muM o b) ZnCl_{2} 100
\muM. Los cuadrados representan AAY, que se forma como producto
secundario de la reacción debido a la proteólisis.
\vskip1.000000\baselineskip
Se muestra la influencia de la presencia (barras
grises) o ausencia (barras negras) de iones Zn^{2+} en la tasa de
recambio de péptido por la variante de tripsina Tn K60E, E151H,
N143H, D189K.
\vskip1.000000\baselineskip
Influencia de la secuencia de reconocimiento en
la tasa de reacción catalizada por la variante de tripsina Tn K60E,
E151H, N143H, D189K. Se ha analizado la actividad catalítica de la
variante de tripsina de acuerdo con la presente invención en
sustratos peptídicos con diferentes secuencias peptídicas en o
alrededor del punto de escisión. La tasa inicial (v) del consumo de
péptido se expresa en nM/min.
\vskip1.000000\baselineskip
Espectro de masas de
Bz-Ala-Ala-Tyr-Arg-His-Lys
(6-CF)-OH.
\vskip1.000000\baselineskip
1. Introducción de las mutaciones deseadas en la
tripsina o tripsinógeno utilizando un vector adecuado que comprende
el DNA que codifica la tripsina o tripsinógeno, por ejemplo, un
vector pST (véase la Fig. 1). El vector pST de E. coli
originalmente se construyó según L. Hedstrom y representa un vector
lanzadera de levaduras que contiene un promotor ADH/GAPDH y una
secuencia líder del factor \alpha fusionada a una secuencia que
codifica el tripsinógeno; véase: Hedstrom, L., et al.,
Science 255 (1992) 1249-1253.
2. Transformación del vector obtenido, por
ejemplo, en E. coli.
3. Subclonaje de la secuencia de la tripsina y
del tripsinógeno modificados, respectivamente, utilizando los
vectores de expresión adecuados, por ejemplo el vector pYT de
levaduras (véase la Fig. 1). En el caso de que la mutación deseada
se introduzca en este vector de expresión directamente, este paso no
es necesario.
4. Expresión de la tripsina o tripsinógeno
modificados en E. coli o levaduras.
5. Aislamiento de la tripsina o tripsinógeno
modificados utilizando los métodos de separación adecuados, por
ejemplo, cromatografía de intercambio de cationes.
6. En el caso de que se haya expresado el
tripsinógeno, el zimógeno aislado necesita de una activación
mediante una proteólisis limitada con enteroquinasa.
7. Purificación final de la tripsina activada
aplicando métodos de purificación adecuados, por ejemplo,
cromatografía de afinidad o cromatografía de intercambio
aniónico.
8. Diálisis.
En la tabla 1, se proporciona la secuencia
primaria de la variante de tripsina Tn K60E, E151H, N143H, D189K
(correspondiente a la tripsina II de rata aniónica mutada, sin
secuencia señal ni pro-secuencia).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Las mutaciones están en negrita)
Masa teórica del péptido: [pI teórico:
5,41/PM (masa media): 23843,00/PM (masa monoisotópica):
23827,59].
\vskip1.000000\baselineskip
A no ser que se especifique de otro modo los
péptidos mencionados en esta solicitud se sintetizaron mediante
síntesis peptídica en fase sólida con
fluorenilmetiloxi-carbonilo (Fmoc) en un
sintetizador de péptidos en lotes por ejemplo el A433 de Applied
Biosystems. En cada caso se utilizaron 4,0 equivalentes del derivado
de aminoácido que se muestra en la Tabla 2 para este proceso.
Los derivados de aminoácido se disolvieron en
N-metil-2-pirrolidinona.
El péptido se sintetizó sobre resina Wang (Wang, S.-S., J. Am.
Chem. Soc. 95 (1973) 1328-1333) o sobre resina de
cloruro de 2-clortritilo (Barlos, K., et
al., Tetrahedron Lett. 30 (1989) 3947-3950). La
resina se cargó con entre 0,5 y 1,0 mMol/g. Las reacciones de
acoplamiento se realizaron durante 20 minutos utilizando 4
equivalentes de diciclohexilcarbodiimida y 4 equivalentes de
N-hidroxi-benzotriazol en
dimetilformamida en relación al derivado de
aminoácido-Fmoc en dimetilformamida como medio de
reacción. El grupo Fmoc se escindió tras cada paso de síntesis con
piperidina al 20% en dimetilformamida durante 20 min. Los grupos
amino terminales en la fase sólida se acetilaron opcionalmente con
anhídrido acético.
La introducción de un marcaje, por ejemplo, una
marcaje de quelato metálico o un marcaje de fluoresceína o de PEG
en el extremo C-terminal se realizó durante la
síntesis en fase sólida mediante la incorporación directa de, por
ejemplo, un derivado de aminoácido acoplado a un quelato metálico o
fluoresceína (descrito en la WO 96/03409).
El péptido se liberó del soporte y los grupos
protectores lábiles al ácido se escindieron con 20 ml de ácido
trifluoroacético, 0,5 ml de etanodiol, 1 ml de tioanisol, 1,5 g de
fenol y 1 ml de agua durante 40 min. a temperatura ambiente.
Dependiendo de los derivados de aminoácido que se utilicen, también
es posible utilizar mezclas que contienen menos trampas de
radicales. A continuación se añadieron 300 ml de éter de
diisopropilo frío a la solución de reacción y se mantuvo durante 40
min. a 0ºC para precipitar completamente el péptido. El precipitado
se filtró, lavó con éter de diisopropilo y se disolvió en una
pequeña cantidad de ácido acético al 50% y se liofilizó. El
material bruto obtenido se purificó mediante HPLC preparativo en
Vydac RP C18 218TP152050 (columna 50 x 250 mm, 300 \ring{A}; 15
\mum) con un gradiente apropiado (eluyente A: agua, ácido
trifluoroacético al 0,1%, eluyente B: acetonitrilo, ácido
trifluoroacético al 0,1%) a lo largo de alrededor de 120 min. El
material eluido se identificó mediante espectrometría de masas.
Alternativamente el marcaje, por ejemplo el PEG,
también puede introducirse tras la escisión del péptido de la
resina. Para esto es ventajoso utilizar una resina de cloruro de
clortritilo. El péptido protegido se escindió de la resina con
ácido trifluoroacético al 1% en 10 ml de diclorometano durante 20
min. a temperatura ambiente. Luego, el extremo
C-terminal del péptido se activó mediante 2
equivalentes de diciclohexilcarbodiimida, 2 equivalentes de
N-hidroxibenzotriazol y 2 equivalentes de
trietilamina en dimetilformamida como medio de reacción y se añadió
un equivalente del derivado aminoacídico del grupo de marcaje o
grupo efector. Los grupos protectores se eliminaron mediante la
utilización de 20 ml de ácido trifluoroacético, 0,5 ml de etanodiol,
1 ml de tioanisol, 1,5 g de fenol y 1 ml de agua durante 40 min. a
temperatura ambiente. Dependiendo de los derivados de aminoácido
que se utilicen, también es posible utilizar mezclas que contienen
menos trampas de radicales. A continuación se añadieron 300 ml de
éter de diisopropilo frío a la solución de reacción y la solución de
reacción se mantuvo durante 40 min. a 0ºC para precipitar
completamente el péptido. La purificación por HPLC se realizó como
se ha descrito anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
El péptido
Ala-Ala-Tyr-Arg-His-Ala-Gly
se sintetizó mediante una síntesis de péptidos en fase sólida
convencional utilizando química de Fmoc y una resina de Wang
precargada como se describe en el Ejemplo 2. Los respectivos
bloques de construcción de aminoácidos están comercialmente
disponibles y se adquirieron de varios distribuidores.
Arg-NH_{2} es un producto comercial de Bachem
(Suiza).
Un volumen de reacción de 1 ml que contiene
Ala-Ala-Tyr-Arg-His-Ala-Gly
1 mM (Id. de Sec. Nº: 2) y Arg-NH_{2} 5 mM
disueltos en tampón Hepes 0,1 M pH 8,0, variante de tripsina Tn
K60E, E151H, N143H, D189K 20 \muM, ZnCl_{2} 100 \muM o,
alternativamente EDTA 100 \muM se agitó a 25ºC. Tras intervalos de
tiempo definidos se recogieron alícuotas y la reacción se detuvo
mediante la adición de ácido trifluoroacético al 1% en metanol/agua
(1:1, v/v) lo que resulta en un pH final de 2 en las muestras
recogidas. Estas últimas se analizaron mediante HPLC analítico
dando lugar a ensayos a lo largo del tiempo de las reacciones como
se muestra en la Fig. 2. La identidad del producto final de
síntesis se verificó mediante espectroscopia de masas.
\vskip1.000000\baselineskip
Los sustratos peptídicos
Bz-Ala-Ala-Tyr-Arg-His-Ala-Ala-Gly,
Bz-Ala-Ala-Tyr-Arg-His-Ala-Gly,
Bz-Ala-Ala-Tyr-Arg-His-Asp-Ala-Gly,
Bz-Ala-Ala-Tyr-Arg-Arg-Ala-Gly
y
Bz-Ala-Ala-Tyr-Asp-His-Ala-Gly
se sintetizaron mediante una síntesis de péptidos en fase sólida
convencional utilizando la química de Fmoc y una resina de Wang
precargada. Los respectivos bloques de construcción de aminoácidos
están comercialmente disponibles y se adquirieron de varios
distribuidores.
Un volumen de reacción de 1 ml que contiene uno
de los siguientes péptidos 1 mM,
Bz-Ala-Ala-Tyr-Arg-His-Ala-Ala-Gly
(Id. de Sec. Nº: 3),
Bz-Ala-Ala-Tyr-Arg-His-Ala-Gly
(Id. de Sec. Nº: 4),
Bz-Ala-Ala-Tyr-Arg-His-Asp-Ala-Gly
(Id. de Sec. Nº: 5),
Bz-Ala-Ala-Tyr-Arg-Arg-Ala-Gly
(Id. de Sec. Nº: 6) o
Bz-Ala-Ala-Tyr-Asp-His-Ala-Gly
(Id. de Sec. Nº: 7) disueltos en tampón Pipes/Tris 0,1 M pH 8,0; ,
variante de tripsina Tn K60E, E151H, N143H, D189K 20 \muM,
ZnCl_{2} 100 \muM, o alternativamente EDTA, se agitó a 30ºC.
Tras intervalos de tiempo definidos las reacciones se detuvieron
mediante la adición de ácido trifluoroacético al 1% en metanol/agua
(1:1, v/v). Las mezclas de reacción bloqueadas se analizaron
mediante HPLC analítico. Las respectivas tasas de las reacciones se
muestran en la Fig. 3. La identidad de los productos finales se
verificó mediante espectroscopía de masas.
\vskip1.000000\baselineskip
Los péptidos benzoilados en N^{\alpha} de Id.
de Sec. Nº: 3-19 se sintetizaron mediante una
síntesis de péptidos en fase sólida convencional utilizando la
química de Fmoc y una resina de Wang precargada. Los respectivos
bloques de construcción de aminoácidos están comercialmente
disponibles y se adquirieron de varios distribuidores.
Un volumen de reacción de 1 ml que contiene el
péptido benzoilados en N^{\alpha} 1 mM disueltos en tampón
Pipes/Tris 0,1 M pH 8,0; variante de tripsina Tn K60E, E151H, N143H,
D189K 20 \muM y ZnCl_{2} 100 \muM, se agitó a 30ºC. Tras
intervalos de tiempo definidos las reacciones se detuvieron mediante
la adición de ácido trifluoroacético al 1% en metanol/agua (1:1,
v/v).
Las mezclas de reacción bloqueadas se analizaron
mediante HPLC analítico. Las respectivas tasas de las reacciones se
muestran en la Fig. 4. La identidad de los productos finales se
verificó mediante espectroscopía de masas.
Como puede observarse fácilmente en la Fig. 4 la
variante de tripsina Tn (=K60E, E151H, N143H, y D189K) muestra una
fuerte preferencia por un punto de escisión que comprende L, F o Y
en posición P1, R o K en posición P1' y His en posición P2'.
\vskip1.000000\baselineskip
Bz-Ala-Ala-Tyr-Arg-His-Ala-Gly
se sintetizó mediante una síntesis de péptidos en fase sólida
convencional utilizando la química de Fmoc y una resina de Wang
precargada. Los respectivos bloques de construcción de aminoácidos
están comercialmente disponibles y se adquirieron de varios
distribuidores.
Arg-His-Ala-Lys(6-CF)-OH
se sintetizó mediante una condensación de fragmentos. El tripéptido
Boc-Arg(Boc)_{2}-His(Trt)-Ala-OH
protegido se sintetizó sobre una resina de clorotritilo utilizando
una síntesis de péptidos en fase sólida convencional. El péptido se
escindió de la resina con 2 x 40 ml de una mezcla que contiene
cloruro de metileno/ácido acético/ácido trifluoroacético (v/v/v
8/1/1). El material bruto se purificó mediante HPLC de fase inversa.
La síntesis del otro fragmento,
Fmoc-Lys(6-carboxi-fluoresceína),
se realizó a partir de 0,6 mmol de Fmoc-Lys*HCl,
0,655 mmol de 6-carboxifluoresceína (adquirida en
Molecular Probes) en 3 ml de dioxina y 3 ml de DMF. El grupo Fmoc
se escindió con piperidina y el material bruto se purificó mediante
HPLC de fase inversa. Luego el tripéptido protegido se activó con 1
equivalente de HBTU (Iris Biotech) y 3 equivalentes de
diisopropiletilamina en DMF. Se añadió 1 equivalente de
Lys(6-carboxi-fluoresceína) y
la mezcla se agitó durante 2 h a temperatura ambiente. Luego se
realizó la desprotección utilizando una mezcla de desprotección (18
ml de ácido trifluoroacético, 0,5 ml de agua y 0,5 ml de
etanoditiol). El péptido se precipitó con éter de diisopropilo, se
purificó mediante RP-HPLC y se obtuvo con un buen
rendimiento.
Un volumen de reacción de 1 ml que contiene
Bz-Ala-Ala-Tyr-Arg-His-Ala-Gly
(Id. de Sec. Nº: 20) 0,5 mM y
Arg-His-Ala-Lys(6-CF)-OH
2,5 mM disueltos en tampón Pipes/Tris 0,1 M pH 8,0, variante de
tripsina Tn K60E, E151H, N143H, D189K 20 \muM, ZnCl_{2} 100
\muM, o alternativamente EDTA 100 \muM, se agitó a 30ºC. Tras
intervalos de tiempo definidos se recogieron las respectivas
alícuotas y se detuvieron las reacciones mediante la adición de
ácido trifluoroacético al 1% en metanol/agua (1:1, v/v), lo que
resulta en un pH final de 2 en las muestras recogidas. Se utilizó
un HPLC para analizar el curso de la reacción y aislar el producto
de la síntesis. Este último se obtuvo con un rendimiento de >99%
y se analizó posteriormente mediante espectroscopía de masas como
se muestra en la Fig. 5.
\vskip1.000000\baselineskip
Arg-His-Gly-PEG
se sintetizó mediante la condensación de los fragmentos
Boc-Arg(Boc)_{2}-His(Trt)-Gly-OH
y amino-PEG (20 kD) adquiridos en
Nektar/Shearwater. Para la síntesis del tripéptido protegido y la
activación del fragmento véase el ejemplo 6. Aquí se utilizaron 0,5
equivalentes de amino-PEG (20 kD) como nucleófilo.
Tras la desprotección (mezcla, véase el ejemplo 6) se separaron
todas las impurezas de bajo peso molecular utilizando
RP-HPLC.
El polipéptido AKTAAALHIL VKEEKLALDL LEQIKNGADF
GKLAKKHSIC PSGKRGGDLG EFRQGQMVPA FDKWFSCPV LEPTGPLHTQ FGYHIIKVLY RH
(Id. de Sec. Nº: 21), que contiene la secuencia de reconocimiento
Tyr-Arg-His en su extremo
C-terminal, se obtuvo a partir de la parvulina 10
nativa de E. coli mediante el intercambio de la matriz de Asn
original en C-terminal por una His artificial. Tras
la expresión y purificación, la respectiva variante de parvulina 10
modificada (Asn92His) se disolvió en tampón Pipes/Tris pH 8,0. Se
añadieron a esta mezcla de reacción concentraciones finales de la
variante de tripsina Tn K60E, E151H, N 143H, D189K 20 \muM,
ZnCl_{2} 100 \muM y un exceso de
Arg-His-Gly-PEG.
Tras la agitación a 30ºC la reacción se detuvo mediante la adición
de ácido trifluoroacético al 1% en metanol/agua (1:1, v/v). El
análisis se realizó mediante HPLC, electroforesis en gel y/o
espectroscopia de masas. El aislamiento del producto final
AKTAAALHIL VKEEKLALDL LEQIKNGADF GKLAKKHSIC PSGKRGGDLG EFRQGQMVPA
FDKWFSCPV LEPTGPLHTQ FGYHIIKVLY
RH-Gly-PEG se realizó mediante
técnicas convencionales de purificación de proteínas, por ejemplo
mediante métodos cromatográficos.
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<211> 223
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> variante de tripsina
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 7
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Péptido sintético
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<223> Péptido sintético
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<223> Péptido sintético
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<213> Artificial
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<220>
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<400> 11
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<223> Péptido sintético
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<223> Péptido sintético
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<400> 14
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<210> 15
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<213> Artificial
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<400> 15
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Péptido sintético
\newpage
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<400> 16
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Péptido sintético
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<400> 17
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<213> Artificial
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<223> Péptido sintético
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<400> 18
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<210> 19
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<213> Artificial
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<223> Péptido sintético
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<400> 19
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<210> 20
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<211> 92
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> polipéptido
\newpage
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<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (8)
1. Una tripsina mutada que comprende una
sustitución de aminoácido tanto en la posición K60 como D189, y al
menos una sustitución de aminoácido más por histidina en la posición
N143 o posición E151.
2. La tripsina mutada de la reivindicación 1, en
el que K60 está sustituido por E o D.
3. La tripsina mutada de la reivindicación 1, en
el que D189 está sustituido por K, H o R.
4. Un método para la producción de un péptido
diana transacilado en C-terminal que comprende los
pasos de:
(a) proporcionar un polipéptido que comprende un
péptido diana y un péptido con un lugar de restricción que
comprende el punto de escisión
Xaa1-Xaa2-His, en el que Xaa1 es L,
Y o F, y Xaa2 es R o K, en el que dicho péptido con un lugar de
restricción se solapa con el péptido diana por el aminoácido Xaa1 en
el extremo C-terminal de dicho péptido diana,
(b) poner en contacto dicho péptido con un
mutante de tripsina de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 bajo condiciones que permiten la escisión
endoproteolítica tras Xaa1 y la formación de un intermediario
péptido diana de la endoproteasa-acilo,
(c) añadir un nucleófilo apropiado y
(d) tras el ataque nucleofílico y la unión de
dicho nucleófilo al extremo C-terminal del péptido
diana, liberar la tripsina mutada del intermediario péptido diana
de la endoproteasa-acilo.
5. El método de la reivindicación 4, en el que
dicho nucleófilo se selecciona de entre el grupo que consiste en
aminas primarias, iminas, aminas secundarias, tiol e hidroxilo.
6. El método de la reivindicación 4, en el que
dicho nucleófilo que comprende una modificación se selecciona de
entre el grupo que consiste en una amida de aminoácido, un péptido,
una amida de péptido, un marcaje, una amida de aminoácido marcada,
un péptido marcado, una amida de péptido marcada y
polietilenglicol.
7. El método de la reivindicación 6, en el que
dicha modificación es polietilenglicol.
8. Una secuencia nucleotídica que codifica para
la tripsina mutada como se define en cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3.
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