ES2278787T3 - Metodo para la sintesis de peptidos, peptidos mimeticos y proteinas. - Google Patents

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Abstract

Variante de tripsina D189K, K60E.

Description

Método para la síntesis de péptidos, péptidos miméticos y proteínas.
La presente invención se refiere a un método para la fabricación de péptidos, péptidos miméticos y proteínas mediante el uso de una enzima, cuya especificidad ha sido alterada de manera que se ha adaptado la estructura del grupo de partida del éster.
La síntesis de péptidos, péptidos miméticos y proteínas tiene una importancia cada día mayor para el estudio sistemático de las relaciones estructura-funciones de las proteínas como productos genéticos funcionales y sirve de forma decisiva para el descubrimiento de nuevos terapéuticos (véase, H.-D. Jakubke, Peptide: Chemie und Biologie, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, Oxford, 1996). El diseño de ligasas peptídicas (H.-D. Jakubke, Angew. Chem, 1995, 107,189) es decir, de enzimas que son capaces de catalizar la unión de un enlace peptídico específico entre dos segmentos peptídicos de forma selectiva e irreversible representa un gran reto puesto que en el transcurso de la evolución de la naturaleza dicho enzima no ha podido ser desarrollado hasta el momento. Un motivo decisivo para ello es la extraordinariamente alta exigencia de especificidad, no verificable, puesto que dicha ligasa-CN tan universal debería reconocer molecularmente todas las combinaciones posibles de los 21 aminoácidos proteinógenos, como los que podrían aparecer estadísticamente en la posición terminal C y N de los segmentos peptídicos que se van a enlazar, para catalizar una unión irreversible y selectiva. De la naturaleza se elegía por ello para la síntesis de proteínas en la célula una estructura a modo de etapas del término N a C bajo la catálisis de la peptidiltransferasa, que con una probabilidad muy elevada es un ribozima muy viejo (B. Zhang, T.R.Cech, Nature 1997, 390, 96), de manera que el reconocer la especificidad de los aminoácidos que se van a enlazar se consigue principalmente a través del efecto de intercambio codón-anticodón así como por una catálisis pre-establecida de la aminoacil-tRNA-sintetasa altamente específica.
El aprovechamiento del potencial de catálisis invertida de las peptidasas (compárese entre otros W. Kullmann, Enzymatic Peptide Síntesis, CRC Press, Boca Raton, 1987; H.-D. Jakubke, Enzymatic Peptide Synthesis, en: The Peptides: Análisis, Synthesis, Biology, Vol.9, (Eds.: S. Udenfriend, J. Meienhofer), Academic Press, New York, 1987, capítulo 3) ofrece ciertamente la posibilidad principal de unir enzimáticamente los segmentos peptídicos bajo unos requisitos especiales, aunque no se garantice ni la irreversibilidad del enlace peptídico especial formado ni se excluyan a priori las escisiones proteolíticas inesperadas en los segmentos que se van a unir o en un producto final, cuando existen allí puntos potenciales de escisión para la peptidasa empleada. Aunque por re-ingeniería de las distintas peptidasas, como por ejemplo, la subtilisina, el potencial de catálisis para la unión del enlace peptídico mejora y podría justificarse por condensaciones de fragmentos difíciles, no se pueden eliminar los inconvenientes anteriormente mencionados.
También los anticuerpos catalíticos (véase, entre otros, P.G. Schultz, R.A. Lerner, Science 1995, 269, 1835; G. MacBeath, D. Hilvert, Chem. Biol. 1996, 3, 433; D.B. Smithrub y cols., J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 278) muestran una actividad CN-ligasa, así como las ligasas peptídicas sintéticas a base de un coiled-coil-Motif de GCN4 (K. Severin y cols., Nature 1997, 389, 706) o bien de una matriz peptídica que consta de un péptido coiled-coil fuertemente ácido (S. Yao, J. Chmielewski, Biopolymers 1999, 51, 370), de manera que en todos estos casos se trata de puntos de partida interesantes para el diseño de las ligasas peptídicas, que requieren unos requisitos especiales para las ligaduras y cuya aplicabilidad general está por tanto extremadamente limitada.
Los métodos de captura de amina y tiol (D.S. Kemp y cols., J. Org. Chem. 1975, 40, 3465;N. Fotouhi y cols., J. Org. Chem. 1989, 54, 2803), de la ligadura química natural (M. Schnölzer, S. B. H. Kent, Science 1992, 256, 221; P.E. Dawson y cols., Science 1994, 266, 776) o bien el método del aldehído (C.-F.Liu, J.P. Tam, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91, 6584) desarrollados en base al concepto propuesto hace muchos años para las ligaduras CN químicas (T. Wieland y cols., Annalen 1953, 583, 129; M. Brenner y cols., Helv. Chim. Acta 1957, 40, 1497) requieren para su realización unos radicales aminoácidos terminales N ó C bien determinados, de manera que la aplicabilidad requiere unos prerrequisitos específicos de la secuencia. En la ligadura química nativa el acoplamiento de un péptido sintético con un grupo tioester terminal de C se realiza con un segundo péptido o proteína, que debe tener un radical cisteina N-terminal. Aprovechando los conocimientos sobre empalmes de proteína (véase Review: C. J. Noren y cols., Angew. Chem. 2000, 112, 458) se desarrollaba de nuevo la ligadura química nativa hacia una ligadura proteínica expresa (expressed protein ligation, EPL)(T.W.Muir y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95, 6705; G.J. Cotton y cols., J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 1100), en la que el grupo tioester del componente carboxi de una proteína recombinante, que se fusiona con un Intein encargado de la disociación, se configura en una columna por disociación tiolítica. El inconveniente de la necesidad de un radical de cisteina N-terminal en un extremo N del componente amino para la ligadura naturalmente no se podía eliminar. El tioester formado en la disociación tiolítica en la columna con el ácido 2-mercaptoetanosulfónico o bien el tiofenol puede obligatoriamente no solo ser atacado inicialmente tras la esterificación, sino directamente por el grupo \alpha-amino terminal del componente amino añadido, de manera que no se pueda excluir una epimerización parcial del éster del aminoácido C-terminal.
El cometido de la invención es el diseño racional y evolutivo de las variantes enzimáticas con una especificidad adaptada a las estructuras miméticas del sustrato para una actividad proteolítica simultánea reducida de forma significativa frente a péptidos o proteínas.
Este cometido se resuelve con un método para fabricar péptidos, miméticos peptídicos y proteínas, de manera que se altera la especificidad de un enzima empleado como biocatalizador en un proceso de síntesis, que se adapta a la estructura del grupo de partida del éster, lo que se produce por medio de una alteración química o racional o evolutiva del enzima, donde ésta puede abarcar tanto las regiones de enlace enzimáticas determinadas por la especificidad como las zonas del enlace primarias poco específicas o bien los radicales aminoácidos del enzima significativos desde un punto de vista catalítico. El determinante de especificidad en el grupo de partida del mimético del sustrato constituye ahora la región molecular y productiva catalítica para la ligasa-CN artificial, de manera que los enlaces entre los componentes de los aminoácidos ya no se disocian, sino que probablemente se acoplan. Los conceptos de grupo de partida así como de determinantes de especificidad son conocidos por el experto (F. Bordusa, Braz. J. Med. Biol. Res. 72(2000)469-485).
Puesto que tras el acoplamiento biocatalítico del enlace CN realizado conforme a la invención, la peptidasa empleada ya no reconoce como sustrato los enlaces CN sintetizados así como todos los demás enlaces CN con motivo del grupo de partida del éster específico que ya no existe en el producto de síntesis, y por tanto se excluyen las disociaciones enzimáticas, los resultados conforme a la invención son muy sorprendentes.
Preferiblemente se emplearán para el diseño conforme a la invención unas variantes de peptidasa pero también representantes de otras clases o subclases de enzimas como, por ejemplo, las esterasas.
Los péptidos y proteínas obtenidos se pueden separar y purificar con los métodos convencionales de química proteínica y peptídica.
Las ligasas peptídicas inactivas proteolíticamente, en particular las variantes de las peptidasas y por ejemplo las variantes de las esterasas, se pueden generar como biocatalizadores para la síntesis de péptidos a través de miméticos de sustrato, en particular a partir de proteasas nativas siguiendo tres estrategias. Una es la manipulación directa de la especificidad del sustrato, cuyo objetivo prioritario es la producción de especificidades enzimáticas adaptadas al mimético del sustrato. Esto debería llevar indiscutiblemente siempre a una minimización de la especificidad nativa, cuando la estructura del mimético del sustrato se diferencia de la estructura del aminoácido específico (Arg und Lys en el caso de la tripsina). Bajo este punto de vista resulta esperanzador el cambio de Asp 189 por los radicales básicos. Desde hace tiempo se sabe que Asp 189 produce la especificidad Arg/Lys del enzima y por tanto equivale al radical aminoácido más significativo para la especificidad nativa de la tripsina. (L. Graf y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988 85, 4961; L.B. Evnin y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990 87, 6659). El cambio de Asp 189 por His, Lys y Arg conduce por tanto a una especificidad artificial de la tripsina para las estructuras aromáticas o alifáticas con un grupo carboxilato negativo, como por ejemplo, el éster 4-carboxifenilo, 4-carboxibencilo, 3-carboxietilo o bien el éster aminoácido del ácido 5-hidroxi-indol-2-carbónico, por mencionar únicamente algunos tipos adecuados de miméticos del sustrato para estas ligasas peptídicas. Las cadenas laterales de aminoácidos de aminoácidos proteinogénicos apenas se adaptarán de forma productiva a la cartera de enlace modificada. Como consecuencia de ello, la velocidad de la proteolísis se hace más lenta o despreciable contrariamente al enzima natural o de referencia. Además la combinación de estas mutaciones con mutaciones adicionales en la zona S' de la tripsina (C terminal de la región enzimática respecto al lugar de desdoblamiento o ligadura) conduce a unas ligasas peptídicas inactivas proteolíticamente y siempre esta mutación aumenta la especificidad para el grupo de partida del mimético del sustrato. Así la mutación K60E de la mutante doble de la tripsina D189K, K60E produce un desplazamiento del enlace del éster 4-guadininofenilo del lugar de enlace S1 en el S1' del enzima. Incluso para los aminoácidos Lys y Arg sensibles a la disociación se puede constatar un desplazamiento de este tipo. Mientras que este último conduce sin embargo a un enlace no productivo, que no tienen como consecuencia una disociación, el mimético del sustrato se adapta de forma productiva y tiene lugar la síntesis.
Además de la manipulación directa de la especificidad del enzima es posible la sustitución de los aminoácidos de la tríada catalítica del enzima (en el caso de la tripsina His75, Asp102 y Ser195). Se sabe que para la disociación de los enlaces peptídicos contrariamente a los enlaces de ésteres (activados) o bien enlaces de amidas activados como, por ejemplo, en las 4-nitroanilidas peptídicas junto a la elevada nucleofilia de la función OH del Ser195 activado es esencial sobre todo la protonación de la función amino del enlace disociado. (A. Fersht, Enzyme Structure & Mechanism, 2ªed., W. H. Freeman & Co.,New York, 1984). Por lo que el cambio de la Asp 102 y/o la His57 lleva a una discriminación del enzima entre la actividad de la esterasa y la amidasa incluso en las reacciones en las que intervienen los miméticos del sustrato. Un efecto similar en la actividad proteolítica sería también imaginable para el cambio del Ser195 activo frente al Thr o el Cys.
La tercera estrategia incluye finalmente los estudios para la manipulación indirecta de la actividad enzimática con el objetivo de una estabilización similar al zimógeno y por tanto de las conformaciones enzimáticas inactivas proteolíticamente (los zimógenos son los enzimas precursores de las proteasas que aparecen de forma natural, que en general son inactivos proteolíticamente). Mientras que para el "verdadero" zimógeno, el tripsinógeno Lys15Gly (la disociación del enlace Lys15-lle16 conduce a la transformación del tripsinógeno en tripsina activa) no se detecta ninguna actividad de ligasa peptídica, las especies enzimáticas similares al zimógeno poseen un carácter de ligasa peptídica. Las especies enzimáticas similares al zimógeno son, por ejemplo, las variantes enzimáticas Asp194Asn (Asp 194 estabiliza la conformación enzimática activa por la formación de un puente salino respecto al término N de la tripsina activada) así como la variante Cys191Ala (Cys191 estabiliza la enzima activa mediante la formación de un puente disulfuro).
La presente invención se refiere además a un método para la fabricación de ligasas peptídicas básicamente inactivas proteolíticamente, en particular variantes de tripsina por medio de métodos genotecnológicos. Según el mismo, se introduce la mutación deseada procedente de vectores con la secuencia codificante de la proteasa, por ejemplo, con una secuencia codificante de tripsina o de tripsinógeno. Por ejemplo, se puede emplear el vector pST de E. coli, un vector Shuttle (lanzadera) de levadura con un promotor ADH/GAPDH y un factor \alpha de secuencia líder, que se fusiona con la secuencia codificante del tripsinógeno (L. Hedstorm y cols., Science 255(1992)1249). Después de ello se realiza la transformación del vector nuevo en una célula anfitriona adecuada, por ejemplo en la E. coli. En caso de que sea necesario, la secuencia de proteasa modificada, por ejemplo, la secuencia de tripsina o tripsinógeno modificada es subclonada en los vectores de expresión adecuados, por ejemplo, el vector de la levadura pYT. En caso de que la mutación proceda directamente de un vector de expresión, esta etapa adicional es nula. Luego se realiza la expresión de la variante de la proteasa en la célula anfitriona, por ejemplo, en E. coli o en la levadura. El aislamiento de la variante de proteasa modificada, por ejemplo, de la tripsina modificada o bien de su zimógeno, se realiza con los métodos bioquímicos proteínicos adecuados, como por ejemplo, la cromatografía de intercambio iónico. En caso de que en la variante de proteasa se trate de un zimógeno, por ejemplo, la variante del tripsinógeno, la activación se lleva a cabo habitualmente mediante el transporte de la variante del zimógeno en la variante de la proteasa, por ejemplo, mediante una disociación proteolítica. En caso de que sea necesario, se pueden realizar otras etapas de limpieza, por ejemplo, por medio de la cromatografía de afinidad (en caso de que después de la modificación sea posible un enlace a SBTJ) o bien mediante una cromatografía de perfusión. Por último, si es preciso, se dializa y se concentra la variante de la proteasa frente a un tampón adecuado.
La presente invención se explica a partir del principio del ejemplo de la variante de tripsina D189K, K60E así como de su utilización como ligasa CN en una condensación de segmentos. En este mutante de tripsina el aminoácido D es sustituido en la posición 189 por K y el aminoácido K en la posición 60 por E. La secuencia de la tripsina natural o de referencia es conocida por el experto. La especie de tripsina D189K, K60E se ha desarrollado de forma especial para la detección del grupo de partida del éster 4-guanidinofenilo. Debido a la inversión de carga en el lugar de enlace S1 determinante de la especificidad por la mutación D189K se evita la unión de los radicales aminoácidos Lys y Arg específicos originalmente para la tripsina. Esta mutación sola conduce en general a una disminución significativa de la actividad frente a los miméticos del sustrato del éster de acil-4-guanidinofenilo. El cambio adicional de Lys 60 por Glu produce según la invención y sorprendentemente para los expertos, configuración de un nuevo lugar de enlace específico para el grupo de partida del éster 4-guanidinofenilo en la región del lugar de enlace S1' del enzima. La consecuencia es un incremento significativo de la especificidad frente a los ésteres de acilo-4-guanidinfenilo, mientras de éstos se mantiene la inespecificidad frente a los radicales de aminoácidos originalmente específicos. La variante de tripsina D189K, K60E se empleará en el uso de péptidos, miméticos peptídicos y proteínas. La elección del sistema tampón, del tiempo de reacción y de otros parámetros como, por ejemplo, la temperatura de reacción etc. no es crítica y puede ser determinada fácilmente por un experto para transformaciones enzimáticas.
En la síntesis de péptidos, miméticos peptídicos y proteínas se emplea como componente del carboxilo un éster del péptido 4-guanidinofenilo y como componente amino otro péptido o mimético peptídico. Mediante la ligadura de los componentes amino y de los componentes carboxilo se forma el péptido, mimético peptídico o proteína deseado. Sorprendentemente este tipo de síntesis conduce a una modificación de las cadenas laterales de los aminoácidos funcionales de los aminoácidos trifuncionales, como por ejemplo, la lisina, incluso a una disociación proteolítica detectable de los recatándoos o del producto de ligadura.
La síntesis descrita a continuación del péptido activo biológicamente Ht31 (493-515) confirma el carácter de ligasa irreversible en que se basa, de esta variante de tripsina específica del mimético del sustrato.
Ejemplo 1 Síntesis del mutante de tripsina D189K, K60E Plásmido
Para llevar a cabo la mutagénesis orientable se puede emplear el vector pST de E. coli. Este tiene una parte de vector Bluescript así como el gen de tripsina de rata aniónico, que se fusiona con un líder del factor \alpha así como con un promotor de ADH/GAPDH.
La expresión proteínica se realizaba con ayuda del plásmido-pYT, un derivado del pBS24, que lleva el marcador de selección para el medio deficiente en uracilo y leucina. Tanto el plásmido pST como el pYT disponen de un gen de resistencia a la ampicilina. Las fichas de ambos vectores, es decir del plásmido pST (5,4 kb)- y del pYT(14 kb), con los lugares de corte correspondientes se representan en la figura 1.
Mutagénesis
Las mutagénesis orientables se realizaban utilizando el estuche Quik change® (STRATAGENE) en E. coli /plásmido pST.
El método empleado se parece a un PCR, en el que partiendo de dos bases sintéticas de oligonucleótidos, que contienen la mutación deseada, se replican ambas ramas del plásmido del vector pST de la polimerasa PFU. El pST natural o de referencia servía como patrón o plantilla para la producción de algunas mutaciones. Estos mutantes eran de nuevo el punto de partida para la construcción del mutante doble.
Se empleaban las siguientes bases de oligonucleótidos, donde las letras en negrita indicaban las mutaciones:
D189K a) 5'-GGA GGC AAG AAC GAT TCC TGC-3'
b) 5'-GCA GGA ATC GTT CTT GCC TCC-3'
K60E a) 5'-CAC TGC TAT GAG TCC CGC ATC-3'
b) 5'-GAT GCG GGA CTC ATA GCA GTG-3'
El producto PCR obtenido se transformaba en células azules XL II de E. coli ultracompetentes (STATAGENE). La selección siguiente se realizaba en placas de agar de cultivo que contenían ampicilina (LB-amp). Las colonias escogidas se transportaban a un medio líquido que contenía ampicilina (LB-amp) en el que tras el cultivo de un día se realizaba el aislamiento del plásmido utilizando el estuche SNAP (INVITROGENO). El control del ADN aislado se realizaba por medio de una electroforesis con un 1% de gel de agarosa. Mediante la secuenciación del gen completo se podía garantizar que solamente se obtenían las mutaciones deseadas.
Subclonación
Para todos los mutantes que se crean en el plásmido pST se precisaba una subclonación en un vector de expresión pYT. Esta se realizaba mediante una digestión de la restricción con Bam HI y Sal I y la ligadura en el fragmento del vector pYT correspondiente. Todos los fragmentos del vector se aplicaban en una mezcla de restricción correspondiente a un gel de agarosa que se fundía poco (0,8%) y se cortaban tras una separación o división suficiente. Las piezas de gel se fundían a 55ºC y se purificaban tras una combinación deseada y a 16ºC se ligaban a la ligasa T4 ADN durante la noche. La transformación necesaria y el aislamiento del plásmido se realizaban tal como se ha descrito.
Esta secuenciación del gen de tripsinógeno completo podía garantizar que únicamente se obtenían las mutaciones deseadas.
Transformación de levadura y selección
La célula madre de levadura empleada lleva la denominación de Saccharomyces cerevisiae DLM 101\alpha[Mat a,leu 2-3,-112 his 2,3-11,-15 can 1, ura 3\Delta, pep4\Delta,(cirº),DM 23J]. Para la creación de células de levadura competentes y la transformación del plásmido pYT se puede emplear el estuche de transformación de la levadura EZ (ZYMO-RESEARCH). La selección se realizaba sobre placas de SC deficientes en uracilo mediante la incubación a 30ºC durante 3 hasta 4 días. Las colonias individuales se inoculaban de nuevo en placas de SC deficientes en leucina y se incubaban asimismo durante 3 hasta 4 días a 30ºC, de manera que aumentaba el número de copias del plásmido en las células. Cada una de estas colonias de estas placas se cultivaba con un 8% de glucosa para inocular los cultivos previos del medio líquido de SC deficiente en leucina. La incubación se realizaba agitando a 30ºC y 120 rpm durante 3 días. Como inóculo para la inoculación de 1 litro de cultivo principal con un medio YPD (1% glucosa, 1% bactopeptona, 0,5% extracto de levadura) se empleaban 20 ml de cultivo previo. Los parámetros de incubación equivalían a los del cultivo previo, que se recogía al cabo de 4 días.
Aislamiento y limpieza de las variantes de tripsina
Mediante centrifugación durante 20 minutos y a 4000 rpm se separaban inicialmente las células y el residuo ajustado a pH 4,0 se volvía a centrifugar a 12.000 rpm. El sobrante que contenía tripsinógeno prácticamente libre de partículas se añadía a una columna de intercambio catiónico de Toyopearl 650M (SUPELCO) equilibrada con acetato sódico 2 mM/ácido acético 100 mM (pH 4,5). Se eluía por medio de un gradiente de pH lineal empezando con acetato sódico 2 mM/ácido acético 100 mM (pH 4,5) hasta Tris/HCl 200 mM (pH 8,0).
Mediante la electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida y utilizando un gel de poliacrilamida al 15% se podían averiguar las fracciones que contenían tripsinógeno y se recogían. El volumen de soluciones proteínicas se concentraba de unos 10 hasta 15 ml con ayuda de los concentradores Centriprep (AMICON).
La activación del variante de tripsinógeno a la correspondiente tripsina D189K+K60E se realizaba por medio de una enteroquinasa altamente purificada (BIOZYME) a un pH de 6,5 y se controlaba mediante la electroforesis en gel de SDS.
Utilizando un sistema de cromatografía de perfusión Biocad Sprint (PERSEPTIVE BIOSYSTEMS) se realizaba la limpieza del enzima activado. La separación de las muestras proteínicas se llevaba a cabo en una columna de intercambio aniónico POROS 20 HQ equilibrada con bis-/-tris-propano al 5% a pH 6,0 (4x100 mm, PERSEPTIVE BIOSYSTEMS) y la elusión del gradiente posterior hasta un 95% de solución de NaCl 3M. Se controlaba la pureza de las fracciones que contienen tripsina y se agrupaban. A continuación se realizaba la diálisis frente a HCl 1 mM a 4ºC y la concentración de las muestras con concentradores Centriprep de 2 hasta 4 ml.
Los rendimientos finales ascendían a unos 2 hasta 5 mg de proteínas por litro de medio de cultivo.
Determinación de la concentración
La concentración proteínica de los preparados se determinaba según el método de Bradford en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 595 nm. El registro de la curva de calibración se llevaba a cabo con una serie de diluciones de tripsina bovina entre 50 \mum/ml y 1 mg/ml.
Ejemplo 2 Síntesis del Ht31 (493-515) por medio de una variante de tripsina D189K, K60E
La síntesis de la molécula objetivo H-Asp-Leu-lle-Glu-Glu-Ala-Ala-Ser-Arg-lle-Val-Asp-Ala-Val-lle-Glu-Gin-Val-Lys-Ala-Ala-Gly-Ala-Tyr-OH (Ht31(493-515)) se realizaba mediante la ligadura del éster de octapéptido-4-guanidinofenilo Boc-Asp-Leu-lle-Glu-Glu-Ala-Ala-Ser-OGp (2,2 mg, aprox. 0,001 mmol). Como disolvente servía un sistema tampón acuoso con un 40% de disolvente orgánico. Tras la colocación de ambos reactantes se iniciaba la reacción mediante la adición de la variante de tripsina D189J,K60E y se analizaba tras la reacción completa del componente carboxi. La catálisis enzimática conducía a una acilación completa de los componentes amino. La identidad del producto de síntesis se analizaba a través de los métodos habituales de química orgánica que incluyen el análisis de aminoácidos. La reacción no conducía ni a una modificación de las cadenas laterales de aminoácidos trifuncionales ni a una disociación proteolítica detectable de los reactantes o del producto de ligadura.
<110> Roche Diagnostics GMBH y F. Hoffmann-La Roche AG
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<120> Método para la síntesis de péptidos, miméticos peptídicos y proteínas
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<141> 2001-10-05
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<160> 7
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Base sintética para crear mutaciones artificiales en un gen para la tripsina de rata aniónica
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<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskip
ggaggcaaga acgattcctg c 
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21 
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<210> 2
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<211> 21
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<212> ADN
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<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskip
gcaggaatcg ttcttgcctc c 
\hfill
21 
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<212> ADN
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Base sintética para crear mutaciones artificiales en un gen para la tripsina de rata aniónica
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cactgctatg agtcccgcat c 
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Base sintética para crear mutaciones artificiales en un gen para la tripsina de rata aniónica
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gatgcgggac tcatagcagt g 
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido de fusión, fabricado por ligadura de dos péptidos a través del mutante de tripsina
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<400> 5
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\sa{Asp Leu Ile Glu Glu Ala Ala Ser Arg Ile Val Asp Ala Val Ile}
\sac{Glu Gln Val Lys Ala Ala Gly Ala Tyr}
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido parcial que se une a otro péptido parcial a través de una actividad enzimática del mutante de tripsina
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<400> 6
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido parcial que se une a otro péptido parcial a través de una actividad enzimática del mutante de tripsina
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<400> 7
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\sa{Arg Ile Val Asp Ala Val Ile Glu Glu Val Lys Ala Ala}
\sac{Gly Ala Tyr}

Claims (4)

1. Variante de tripsina D189K, K60E.
2. Uso de la variante de tripsina conforme a la reivindicación 1 para la síntesis de péptidos, miméticos peptídicos o proteínas.
3. Uso de variantes de tripsina conforme a la reivindicación 2, que se caracteriza por que para la síntesis de la molécula objetivo H-Asp-Leu-Ile-Glu-Glu-Ala-Ala-Ser-Arg-Ile-Val-Asp-Aña-Val-Ile-Glu-Glu-Val-Lys-Ala-Tyr-OH (Ht31 (493-515)) se utiliza el componente carboxi Boc-Asp-Leu-Ile-Glu-Glu-Ala-Ala-Ser-OGp con el péptido H-Arg-Ile-Val-Asp-Ala-Val-Ile-Glu-Gln-Val-Lys-Ala-Ala-Gly-Ala-Tyr-OH que actúa como componente amino, en un sistema tampón acuoso con un 40% de disolvente orgánico, mediante la adición de la variante de tripsina D189K, K60E, lo que conduce a la acilación completa del componente amino.
4. Método de fabricación de la variante de tripsina D 189K, K60E introduciendo la mutación deseada en un vector con una secuencia que codifica la tripsina o el tripsinógeno, la transformación del vector nuevo en una célula anfitriona adecuada, en particular la E. coli, la subclonación de la secuencia modificada de tripsina o de tripsinógeno en un vector de expresión adecuado, la expresión de la variante de tripsina y asimismo activación de la variante de tripsina y purificación posterior del enzima.
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