ES2278787T3 - Metodo para la sintesis de peptidos, peptidos mimeticos y proteinas. - Google Patents
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Abstract
Variante de tripsina D189K, K60E.
Description
Método para la síntesis de péptidos, péptidos
miméticos y proteínas.
La presente invención se refiere a un método
para la fabricación de péptidos, péptidos miméticos y proteínas
mediante el uso de una enzima, cuya especificidad ha sido alterada
de manera que se ha adaptado la estructura del grupo de partida del
éster.
La síntesis de péptidos, péptidos miméticos y
proteínas tiene una importancia cada día mayor para el estudio
sistemático de las relaciones estructura-funciones
de las proteínas como productos genéticos funcionales y sirve de
forma decisiva para el descubrimiento de nuevos terapéuticos (véase,
H.-D. Jakubke, Peptide: Chemie und Biologie, Spektrum
Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, Oxford, 1996). El diseño de
ligasas peptídicas (H.-D. Jakubke, Angew. Chem, 1995,
107,189) es decir, de enzimas que son capaces de catalizar la unión
de un enlace peptídico específico entre dos segmentos peptídicos de
forma selectiva e irreversible representa un gran reto puesto que
en el transcurso de la evolución de la naturaleza dicho enzima no ha
podido ser desarrollado hasta el momento. Un motivo decisivo para
ello es la extraordinariamente alta exigencia de especificidad, no
verificable, puesto que dicha ligasa-CN tan
universal debería reconocer molecularmente todas las combinaciones
posibles de los 21 aminoácidos proteinógenos, como los que podrían
aparecer estadísticamente en la posición terminal C y N de los
segmentos peptídicos que se van a enlazar, para catalizar una unión
irreversible y selectiva. De la naturaleza se elegía por ello para
la síntesis de proteínas en la célula una estructura a modo de
etapas del término N a C bajo la catálisis de la
peptidiltransferasa, que con una probabilidad muy elevada es un
ribozima muy viejo (B. Zhang, T.R.Cech, Nature 1997, 390, 96), de
manera que el reconocer la especificidad de los aminoácidos que se
van a enlazar se consigue principalmente a través del efecto de
intercambio codón-anticodón así como por una
catálisis pre-establecida de la
aminoacil-tRNA-sintetasa altamente
específica.
El aprovechamiento del potencial de catálisis
invertida de las peptidasas (compárese entre otros W. Kullmann,
Enzymatic Peptide Síntesis, CRC Press, Boca Raton,
1987; H.-D. Jakubke, Enzymatic Peptide Synthesis, en:
The Peptides: Análisis, Synthesis, Biology, Vol.9, (Eds.: S.
Udenfriend, J. Meienhofer), Academic Press, New York, 1987,
capítulo 3) ofrece ciertamente la posibilidad principal de unir
enzimáticamente los segmentos peptídicos bajo unos requisitos
especiales, aunque no se garantice ni la irreversibilidad del enlace
peptídico especial formado ni se excluyan a priori las escisiones
proteolíticas inesperadas en los segmentos que se van a unir o en
un producto final, cuando existen allí puntos potenciales de
escisión para la peptidasa empleada. Aunque por
re-ingeniería de las distintas peptidasas, como por
ejemplo, la subtilisina, el potencial de catálisis para la unión
del enlace peptídico mejora y podría justificarse por condensaciones
de fragmentos difíciles, no se pueden eliminar los inconvenientes
anteriormente mencionados.
También los anticuerpos catalíticos (véase,
entre otros, P.G. Schultz, R.A. Lerner, Science 1995, 269,
1835; G. MacBeath, D. Hilvert, Chem. Biol. 1996, 3,
433; D.B. Smithrub y cols., J. Am. Chem. Soc. 1997,
119, 278) muestran una actividad CN-ligasa, así
como las ligasas peptídicas sintéticas a base de un
coiled-coil-Motif de GCN4 (K.
Severin y cols., Nature 1997, 389, 706) o bien de una
matriz peptídica que consta de un péptido
coiled-coil fuertemente ácido (S. Yao, J.
Chmielewski, Biopolymers 1999, 51, 370), de manera que
en todos estos casos se trata de puntos de partida interesantes
para el diseño de las ligasas peptídicas, que requieren unos
requisitos especiales para las ligaduras y cuya aplicabilidad
general está por tanto extremadamente limitada.
Los métodos de captura de amina y tiol (D.S.
Kemp y cols., J. Org. Chem. 1975, 40, 3465;N. Fotouhi
y cols., J. Org. Chem. 1989, 54, 2803), de la
ligadura química natural (M. Schnölzer, S. B. H. Kent, Science
1992, 256, 221; P.E. Dawson y cols., Science
1994, 266, 776) o bien el método del aldehído (C.-F.Liu, J.P.
Tam, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91, 6584)
desarrollados en base al concepto propuesto hace muchos años para
las ligaduras CN químicas (T. Wieland y cols., Annalen
1953, 583, 129; M. Brenner y cols., Helv. Chim. Acta
1957, 40, 1497) requieren para su realización unos radicales
aminoácidos terminales N ó C bien determinados, de manera que la
aplicabilidad requiere unos prerrequisitos específicos de la
secuencia. En la ligadura química nativa el acoplamiento de un
péptido sintético con un grupo tioester terminal de C se realiza con
un segundo péptido o proteína, que debe tener un radical cisteina
N-terminal. Aprovechando los conocimientos sobre
empalmes de proteína (véase Review: C. J. Noren y cols., Angew.
Chem. 2000, 112, 458) se desarrollaba de nuevo la
ligadura química nativa hacia una ligadura proteínica expresa
(expressed protein ligation, EPL)(T.W.Muir y cols., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95, 6705; G.J. Cotton y
cols., J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 1100), en la que
el grupo tioester del componente carboxi de una proteína
recombinante, que se fusiona con un Intein encargado de la
disociación, se configura en una columna por disociación tiolítica.
El inconveniente de la necesidad de un radical de cisteina
N-terminal en un extremo N del componente amino para
la ligadura naturalmente no se podía eliminar. El tioester formado
en la disociación tiolítica en la columna con el ácido
2-mercaptoetanosulfónico o bien el tiofenol puede
obligatoriamente no solo ser atacado inicialmente tras la
esterificación, sino directamente por el grupo
\alpha-amino terminal del componente amino
añadido, de manera que no se pueda excluir una epimerización
parcial del éster del aminoácido C-terminal.
El cometido de la invención es el diseño
racional y evolutivo de las variantes enzimáticas con una
especificidad adaptada a las estructuras miméticas del sustrato
para una actividad proteolítica simultánea reducida de forma
significativa frente a péptidos o proteínas.
Este cometido se resuelve con un método para
fabricar péptidos, miméticos peptídicos y proteínas, de manera que
se altera la especificidad de un enzima empleado como biocatalizador
en un proceso de síntesis, que se adapta a la estructura del grupo
de partida del éster, lo que se produce por medio de una alteración
química o racional o evolutiva del enzima, donde ésta puede abarcar
tanto las regiones de enlace enzimáticas determinadas por la
especificidad como las zonas del enlace primarias poco específicas o
bien los radicales aminoácidos del enzima significativos desde un
punto de vista catalítico. El determinante de especificidad en el
grupo de partida del mimético del sustrato constituye ahora la
región molecular y productiva catalítica para la
ligasa-CN artificial, de manera que los enlaces
entre los componentes de los aminoácidos ya no se disocian, sino
que probablemente se acoplan. Los conceptos de grupo de partida así
como de determinantes de especificidad son conocidos por el experto
(F. Bordusa, Braz. J. Med. Biol. Res.
72(2000)469-485).
Puesto que tras el acoplamiento biocatalítico
del enlace CN realizado conforme a la invención, la peptidasa
empleada ya no reconoce como sustrato los enlaces CN sintetizados
así como todos los demás enlaces CN con motivo del grupo de partida
del éster específico que ya no existe en el producto de síntesis, y
por tanto se excluyen las disociaciones enzimáticas, los resultados
conforme a la invención son muy sorprendentes.
Preferiblemente se emplearán para el diseño
conforme a la invención unas variantes de peptidasa pero también
representantes de otras clases o subclases de enzimas como, por
ejemplo, las esterasas.
Los péptidos y proteínas obtenidos se pueden
separar y purificar con los métodos convencionales de química
proteínica y peptídica.
Las ligasas peptídicas inactivas
proteolíticamente, en particular las variantes de las peptidasas y
por ejemplo las variantes de las esterasas, se pueden generar como
biocatalizadores para la síntesis de péptidos a través de miméticos
de sustrato, en particular a partir de proteasas nativas siguiendo
tres estrategias. Una es la manipulación directa de la
especificidad del sustrato, cuyo objetivo prioritario es la
producción de especificidades enzimáticas adaptadas al mimético del
sustrato. Esto debería llevar indiscutiblemente siempre a una
minimización de la especificidad nativa, cuando la estructura del
mimético del sustrato se diferencia de la estructura del aminoácido
específico (Arg und Lys en el caso de la tripsina). Bajo este punto
de vista resulta esperanzador el cambio de Asp 189 por los
radicales básicos. Desde hace tiempo se sabe que Asp 189 produce la
especificidad Arg/Lys del enzima y por tanto equivale al radical
aminoácido más significativo para la especificidad nativa de la
tripsina. (L. Graf y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988 85,
4961; L.B. Evnin y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990 87,
6659). El cambio de Asp 189 por His, Lys y Arg conduce por tanto a
una especificidad artificial de la tripsina para las estructuras
aromáticas o alifáticas con un grupo carboxilato negativo, como por
ejemplo, el éster 4-carboxifenilo,
4-carboxibencilo, 3-carboxietilo o
bien el éster aminoácido del ácido
5-hidroxi-indol-2-carbónico,
por mencionar únicamente algunos tipos adecuados de miméticos del
sustrato para estas ligasas peptídicas. Las cadenas laterales de
aminoácidos de aminoácidos proteinogénicos apenas se adaptarán de
forma productiva a la cartera de enlace modificada. Como
consecuencia de ello, la velocidad de la proteolísis se hace más
lenta o despreciable contrariamente al enzima natural o de
referencia. Además la combinación de estas mutaciones con
mutaciones adicionales en la zona S' de la tripsina (C terminal de
la región enzimática respecto al lugar de desdoblamiento o
ligadura) conduce a unas ligasas peptídicas inactivas
proteolíticamente y siempre esta mutación aumenta la especificidad
para el grupo de partida del mimético del sustrato. Así la mutación
K60E de la mutante doble de la tripsina D189K, K60E produce un
desplazamiento del enlace del éster
4-guadininofenilo del lugar de enlace S1 en el S1'
del enzima. Incluso para los aminoácidos Lys y Arg sensibles a la
disociación se puede constatar un desplazamiento de este tipo.
Mientras que este último conduce sin embargo a un enlace no
productivo, que no tienen como consecuencia una disociación, el
mimético del sustrato se adapta de forma productiva y tiene lugar
la síntesis.
Además de la manipulación directa de la
especificidad del enzima es posible la sustitución de los
aminoácidos de la tríada catalítica del enzima (en el caso de la
tripsina His75, Asp102 y Ser195). Se sabe que para la disociación
de los enlaces peptídicos contrariamente a los enlaces de ésteres
(activados) o bien enlaces de amidas activados como, por ejemplo,
en las 4-nitroanilidas peptídicas junto a la elevada
nucleofilia de la función OH del Ser195 activado es esencial sobre
todo la protonación de la función amino del enlace disociado. (A.
Fersht, Enzyme Structure & Mechanism, 2ªed., W. H. Freeman &
Co.,New York, 1984). Por lo que el cambio de la Asp 102 y/o la
His57 lleva a una discriminación del enzima entre la actividad de la
esterasa y la amidasa incluso en las reacciones en las que
intervienen los miméticos del sustrato. Un efecto similar en la
actividad proteolítica sería también imaginable para el cambio del
Ser195 activo frente al Thr o el Cys.
La tercera estrategia incluye finalmente los
estudios para la manipulación indirecta de la actividad enzimática
con el objetivo de una estabilización similar al zimógeno y por
tanto de las conformaciones enzimáticas inactivas proteolíticamente
(los zimógenos son los enzimas precursores de las proteasas que
aparecen de forma natural, que en general son inactivos
proteolíticamente). Mientras que para el "verdadero" zimógeno,
el tripsinógeno Lys15Gly (la disociación del enlace
Lys15-lle16 conduce a la transformación del
tripsinógeno en tripsina activa) no se detecta ninguna actividad de
ligasa peptídica, las especies enzimáticas similares al zimógeno
poseen un carácter de ligasa peptídica. Las especies enzimáticas
similares al zimógeno son, por ejemplo, las variantes enzimáticas
Asp194Asn (Asp 194 estabiliza la conformación enzimática activa por
la formación de un puente salino respecto al término N de la
tripsina activada) así como la variante Cys191Ala (Cys191 estabiliza
la enzima activa mediante la formación de un puente disulfuro).
La presente invención se refiere además a un
método para la fabricación de ligasas peptídicas básicamente
inactivas proteolíticamente, en particular variantes de tripsina por
medio de métodos genotecnológicos. Según el mismo, se introduce la
mutación deseada procedente de vectores con la secuencia codificante
de la proteasa, por ejemplo, con una secuencia codificante de
tripsina o de tripsinógeno. Por ejemplo, se puede emplear el vector
pST de E. coli, un vector Shuttle (lanzadera) de levadura con
un promotor ADH/GAPDH y un factor \alpha de secuencia líder, que
se fusiona con la secuencia codificante del tripsinógeno (L.
Hedstorm y cols., Science 255(1992)1249). Después de
ello se realiza la transformación del vector nuevo en una célula
anfitriona adecuada, por ejemplo en la E. coli. En caso de
que sea necesario, la secuencia de proteasa modificada, por ejemplo,
la secuencia de tripsina o tripsinógeno modificada es subclonada en
los vectores de expresión adecuados, por ejemplo, el vector de la
levadura pYT. En caso de que la mutación proceda directamente de un
vector de expresión, esta etapa adicional es nula. Luego se realiza
la expresión de la variante de la proteasa en la célula anfitriona,
por ejemplo, en E. coli o en la levadura. El aislamiento de
la variante de proteasa modificada, por ejemplo, de la tripsina
modificada o bien de su zimógeno, se realiza con los métodos
bioquímicos proteínicos adecuados, como por ejemplo, la
cromatografía de intercambio iónico. En caso de que en la variante
de proteasa se trate de un zimógeno, por ejemplo, la variante del
tripsinógeno, la activación se lleva a cabo habitualmente mediante
el transporte de la variante del zimógeno en la variante de la
proteasa, por ejemplo, mediante una disociación proteolítica. En
caso de que sea necesario, se pueden realizar otras etapas de
limpieza, por ejemplo, por medio de la cromatografía de afinidad
(en caso de que después de la modificación sea posible un enlace a
SBTJ) o bien mediante una cromatografía de perfusión. Por último,
si es preciso, se dializa y se concentra la variante de la proteasa
frente a un tampón adecuado.
La presente invención se explica a partir del
principio del ejemplo de la variante de tripsina D189K, K60E así
como de su utilización como ligasa CN en una condensación de
segmentos. En este mutante de tripsina el aminoácido D es
sustituido en la posición 189 por K y el aminoácido K en la posición
60 por E. La secuencia de la tripsina natural o de referencia es
conocida por el experto. La especie de tripsina D189K, K60E se ha
desarrollado de forma especial para la detección del grupo de
partida del éster 4-guanidinofenilo. Debido a la
inversión de carga en el lugar de enlace S1 determinante de la
especificidad por la mutación D189K se evita la unión de los
radicales aminoácidos Lys y Arg específicos originalmente para la
tripsina. Esta mutación sola conduce en general a una disminución
significativa de la actividad frente a los miméticos del sustrato
del éster de acil-4-guanidinofenilo.
El cambio adicional de Lys 60 por Glu produce según la invención y
sorprendentemente para los expertos, configuración de un nuevo
lugar de enlace específico para el grupo de partida del éster
4-guanidinofenilo en la región del lugar de enlace
S1' del enzima. La consecuencia es un incremento significativo de
la especificidad frente a los ésteres de
acilo-4-guanidinfenilo, mientras de
éstos se mantiene la inespecificidad frente a los radicales de
aminoácidos originalmente específicos. La variante de tripsina
D189K, K60E se empleará en el uso de péptidos, miméticos peptídicos
y proteínas. La elección del sistema tampón, del tiempo de reacción
y de otros parámetros como, por ejemplo, la temperatura de reacción
etc. no es crítica y puede ser determinada fácilmente por un
experto para transformaciones enzimáticas.
En la síntesis de péptidos, miméticos peptídicos
y proteínas se emplea como componente del carboxilo un éster del
péptido 4-guanidinofenilo y como componente amino
otro péptido o mimético peptídico. Mediante la ligadura de los
componentes amino y de los componentes carboxilo se forma el
péptido, mimético peptídico o proteína deseado. Sorprendentemente
este tipo de síntesis conduce a una modificación de las cadenas
laterales de los aminoácidos funcionales de los aminoácidos
trifuncionales, como por ejemplo, la lisina, incluso a una
disociación proteolítica detectable de los recatándoos o del
producto de ligadura.
La síntesis descrita a continuación del péptido
activo biológicamente Ht31 (493-515) confirma el
carácter de ligasa irreversible en que se basa, de esta variante de
tripsina específica del mimético del sustrato.
Para llevar a cabo la mutagénesis orientable se
puede emplear el vector pST de E. coli. Este tiene una parte
de vector Bluescript así como el gen de tripsina de rata aniónico,
que se fusiona con un líder del factor \alpha así como con un
promotor de ADH/GAPDH.
La expresión proteínica se realizaba con ayuda
del plásmido-pYT, un derivado del pBS24, que lleva
el marcador de selección para el medio deficiente en uracilo y
leucina. Tanto el plásmido pST como el pYT disponen de un gen de
resistencia a la ampicilina. Las fichas de ambos vectores, es decir
del plásmido pST (5,4 kb)- y del pYT(14 kb), con los lugares
de corte correspondientes se representan en la figura 1.
Las mutagénesis orientables se realizaban
utilizando el estuche Quik change® (STRATAGENE) en E. coli
/plásmido pST.
El método empleado se parece a un PCR, en el que
partiendo de dos bases sintéticas de oligonucleótidos, que
contienen la mutación deseada, se replican ambas ramas del plásmido
del vector pST de la polimerasa PFU. El pST natural o de referencia
servía como patrón o plantilla para la producción de algunas
mutaciones. Estos mutantes eran de nuevo el punto de partida para
la construcción del mutante doble.
Se empleaban las siguientes bases de
oligonucleótidos, donde las letras en negrita indicaban las
mutaciones:
| D189K | a) | 5'-GGA | GGC | AAG | AAC | GAT | TCC | TGC-3' | |
| b) | 5'-GCA | GGA | ATC | GTT | CTT | GCC | TCC-3' | ||
| K60E | a) | 5'-CAC | TGC | TAT | GAG | TCC | CGC | ATC-3' | |
| b) | 5'-GAT | GCG | GGA | CTC | ATA | GCA | GTG-3' |
El producto PCR obtenido se transformaba en
células azules XL II de E. coli ultracompetentes (STATAGENE).
La selección siguiente se realizaba en placas de agar de cultivo
que contenían ampicilina (LB-amp). Las colonias
escogidas se transportaban a un medio líquido que contenía
ampicilina (LB-amp) en el que tras el cultivo de un
día se realizaba el aislamiento del plásmido utilizando el estuche
SNAP (INVITROGENO). El control del ADN aislado se realizaba por
medio de una electroforesis con un 1% de gel de agarosa. Mediante la
secuenciación del gen completo se podía garantizar que solamente se
obtenían las mutaciones deseadas.
Para todos los mutantes que se crean en el
plásmido pST se precisaba una subclonación en un vector de expresión
pYT. Esta se realizaba mediante una digestión de la restricción con
Bam HI y Sal I y la ligadura en el fragmento del vector pYT
correspondiente. Todos los fragmentos del vector se aplicaban en una
mezcla de restricción correspondiente a un gel de agarosa que se
fundía poco (0,8%) y se cortaban tras una separación o división
suficiente. Las piezas de gel se fundían a 55ºC y se purificaban
tras una combinación deseada y a 16ºC se ligaban a la ligasa T4 ADN
durante la noche. La transformación necesaria y el aislamiento del
plásmido se realizaban tal como se ha descrito.
Esta secuenciación del gen de tripsinógeno
completo podía garantizar que únicamente se obtenían las mutaciones
deseadas.
La célula madre de levadura empleada lleva la
denominación de Saccharomyces cerevisiae DLM
101\alpha[Mat a,leu 2-3,-112 his
2,3-11,-15 can 1, ura 3\Delta,
pep4\Delta,(cirº),DM 23J]. Para la creación de células de
levadura competentes y la transformación del plásmido pYT se puede
emplear el estuche de transformación de la levadura EZ
(ZYMO-RESEARCH). La selección se realizaba sobre
placas de SC deficientes en uracilo mediante la incubación a 30ºC
durante 3 hasta 4 días. Las colonias individuales se inoculaban de
nuevo en placas de SC deficientes en leucina y se incubaban
asimismo durante 3 hasta 4 días a 30ºC, de manera que aumentaba el
número de copias del plásmido en las células. Cada una de estas
colonias de estas placas se cultivaba con un 8% de glucosa para
inocular los cultivos previos del medio líquido de SC deficiente en
leucina. La incubación se realizaba agitando a 30ºC y 120 rpm
durante 3 días. Como inóculo para la inoculación de 1 litro de
cultivo principal con un medio YPD (1% glucosa, 1% bactopeptona,
0,5% extracto de levadura) se empleaban 20 ml de cultivo previo.
Los parámetros de incubación equivalían a los del cultivo previo,
que se recogía al cabo de 4 días.
Mediante centrifugación durante 20 minutos y a
4000 rpm se separaban inicialmente las células y el residuo
ajustado a pH 4,0 se volvía a centrifugar a 12.000 rpm. El sobrante
que contenía tripsinógeno prácticamente libre de partículas se
añadía a una columna de intercambio catiónico de Toyopearl 650M
(SUPELCO) equilibrada con acetato sódico 2 mM/ácido acético 100 mM
(pH 4,5). Se eluía por medio de un gradiente de pH lineal empezando
con acetato sódico 2 mM/ácido acético 100 mM (pH 4,5) hasta Tris/HCl
200 mM (pH 8,0).
Mediante la electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida y utilizando un gel de
poliacrilamida al 15% se podían averiguar las fracciones que
contenían tripsinógeno y se recogían. El volumen de soluciones
proteínicas se concentraba de unos 10 hasta 15 ml con ayuda de los
concentradores Centriprep (AMICON).
La activación del variante de tripsinógeno a la
correspondiente tripsina D189K+K60E se realizaba por medio de una
enteroquinasa altamente purificada (BIOZYME) a un pH de 6,5 y se
controlaba mediante la electroforesis en gel de SDS.
Utilizando un sistema de cromatografía de
perfusión Biocad Sprint (PERSEPTIVE BIOSYSTEMS) se realizaba la
limpieza del enzima activado. La separación de las muestras
proteínicas se llevaba a cabo en una columna de intercambio
aniónico POROS 20 HQ equilibrada con
bis-/-tris-propano al 5% a pH 6,0 (4x100 mm,
PERSEPTIVE BIOSYSTEMS) y la elusión del gradiente posterior hasta
un 95% de solución de NaCl 3M. Se controlaba la pureza de las
fracciones que contienen tripsina y se agrupaban. A continuación se
realizaba la diálisis frente a HCl 1 mM a 4ºC y la concentración de
las muestras con concentradores Centriprep de 2 hasta 4 ml.
Los rendimientos finales ascendían a unos 2
hasta 5 mg de proteínas por litro de medio de cultivo.
La concentración proteínica de los preparados se
determinaba según el método de Bradford en un espectrofotómetro a
una longitud de onda de 595 nm. El registro de la curva de
calibración se llevaba a cabo con una serie de diluciones de
tripsina bovina entre 50 \mum/ml y 1 mg/ml.
La síntesis de la molécula objetivo
H-Asp-Leu-lle-Glu-Glu-Ala-Ala-Ser-Arg-lle-Val-Asp-Ala-Val-lle-Glu-Gin-Val-Lys-Ala-Ala-Gly-Ala-Tyr-OH
(Ht31(493-515)) se realizaba mediante la
ligadura del éster de
octapéptido-4-guanidinofenilo
Boc-Asp-Leu-lle-Glu-Glu-Ala-Ala-Ser-OGp
(2,2 mg, aprox. 0,001 mmol). Como disolvente servía un sistema
tampón acuoso con un 40% de disolvente orgánico. Tras la colocación
de ambos reactantes se iniciaba la reacción mediante la adición de
la variante de tripsina D189J,K60E y se analizaba tras la reacción
completa del componente carboxi. La catálisis enzimática conducía a
una acilación completa de los componentes amino. La identidad del
producto de síntesis se analizaba a través de los métodos
habituales de química orgánica que incluyen el análisis de
aminoácidos. La reacción no conducía ni a una modificación de las
cadenas laterales de aminoácidos trifuncionales ni a una disociación
proteolítica detectable de los reactantes o del producto de
ligadura.
<110> Roche Diagnostics GMBH y F.
Hoffmann-La Roche AG
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<120> Método para la síntesis de péptidos,
miméticos peptídicos y proteínas
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Base sintética para crear mutaciones artificiales en un
gen para la tripsina de rata aniónica
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<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskipggaggcaaga acgattcctg c
\hfill21
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<210> 2
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<211> 21
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Base sintética para crear mutaciones artificiales en un
gen para la tripsina de rata aniónica
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Base sintética para crear mutaciones artificiales en un
gen para la tripsina de rata aniónica
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Base sintética para crear mutaciones artificiales en un
gen para la tripsina de rata aniónica
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\hskip-.1em\dddseqskipgatgcgggac tcatagcagt g
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<210> 5
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido de fusión, fabricado por ligadura de dos
péptidos a través del mutante de tripsina
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<400> 5
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\sa{Asp Leu Ile Glu Glu Ala Ala Ser Arg Ile Val
Asp Ala Val Ile}
\sac{Glu Gln Val Lys Ala Ala Gly Ala Tyr}
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<210> 6
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<211> 8
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido parcial que se une a otro péptido parcial a
través de una actividad enzimática del mutante de tripsina
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 6
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\sa{Asp Leu Ile Glu Glu Ala Ala Ser}
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido parcial que se une a otro péptido parcial a
través de una actividad enzimática del mutante de tripsina
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<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Ile Val Asp Ala Val Ile Glu Glu Val Lys
Ala Ala}
\sac{Gly Ala Tyr}
Claims (4)
1. Variante de tripsina D189K, K60E.
2. Uso de la variante de tripsina conforme a la
reivindicación 1 para la síntesis de péptidos, miméticos peptídicos
o proteínas.
3. Uso de variantes de tripsina conforme a la
reivindicación 2, que se caracteriza por que para la síntesis
de la molécula objetivo
H-Asp-Leu-Ile-Glu-Glu-Ala-Ala-Ser-Arg-Ile-Val-Asp-Aña-Val-Ile-Glu-Glu-Val-Lys-Ala-Tyr-OH
(Ht31 (493-515)) se utiliza el componente carboxi
Boc-Asp-Leu-Ile-Glu-Glu-Ala-Ala-Ser-OGp
con el péptido
H-Arg-Ile-Val-Asp-Ala-Val-Ile-Glu-Gln-Val-Lys-Ala-Ala-Gly-Ala-Tyr-OH
que actúa como componente amino, en un sistema tampón acuoso con un
40% de disolvente orgánico, mediante la adición de la variante de
tripsina D189K, K60E, lo que conduce a la acilación completa del
componente amino.
4. Método de fabricación de la variante de
tripsina D 189K, K60E introduciendo la mutación deseada en un vector
con una secuencia que codifica la tripsina o el tripsinógeno, la
transformación del vector nuevo en una célula anfitriona adecuada,
en particular la E. coli, la subclonación de la secuencia
modificada de tripsina o de tripsinógeno en un vector de expresión
adecuado, la expresión de la variante de tripsina y asimismo
activación de la variante de tripsina y purificación posterior del
enzima.
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