CN101010425A - 多肽的c－末端修饰 - Google Patents

多肽的c－末端修饰 Download PDF

Info

Publication number
CN101010425A
CN101010425A CNA2005800273012A CN200580027301A CN101010425A CN 101010425 A CN101010425 A CN 101010425A CN A2005800273012 A CNA2005800273012 A CN A2005800273012A CN 200580027301 A CN200580027301 A CN 200580027301A CN 101010425 A CN101010425 A CN 101010425A
Authority
CN
China
Prior art keywords
peptide
xaa
ala
amino acid
gly
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA2005800273012A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101010425B (zh
Inventor
E·霍斯
F·博杜萨
R·赫尔曼
H·-D·贾库布克
W·蒂斯彻
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Frank Bodusa
Jukko Edith Bio Science Co.,Ltd.
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of CN101010425A publication Critical patent/CN101010425A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101010425B publication Critical patent/CN101010425B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6427—Chymotrypsins (3.4.21.1; 3.4.21.2); Trypsin (3.4.21.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及突变的胰蛋白酶，其含有在位置K60和D189的氨基酸置换，以及至少一个另外的在位置N143或位置E151的置换为组氨酸的氨基酸置换。这类胰蛋白酶突变体具有优选的切割位点，该切割位点含有氨基酸Xaa1－Xaa2－His，其中Xaa1是L、Y或者F，Xaa2是R或者K。本发明还涉及含有靶肽和上述切割位点的人造多肽，本发明还涉及一种通过使用这种突变的胰蛋白酶制备C－末端被修饰的靶肽的方法。

Description

多肽的C-末端修饰
本发明涉及突变的胰蛋白酶，其含有在位置K60和D189的氨基酸置换，以及至少一个另外的在位置N143或位置E151由组氨酸进行的氨基酸置换。这类胰蛋白酶突变体具有优选的含有氨基酸Xaa1-Xaa2-His的切割位点，其中Xaa1是L、Y或者F，Xaa2是R或者K。本发明还涉及含有靶肽(target peptide)和上述切割位点的人造多肽，以及一种通过使用这种突变的胰蛋白酶制备C-末端被修饰的靶肽的方法。
在过去几年中，生物活性肽的应用例如用于制药目的，已经变得越来越重要。存在多种制备这类生物活性肽的方法，例如基于固相或者液相肽合成技术的化学合成，或者在培养经过基因处理的微生物之后，分离和纯化这样产生的重组蛋白质。
然而，化学合成多于大约50个氨基酸的多肽仍然是困难的和昂贵的。对通过化学肽合成获得的肽和/或通过重组获得的多肽在其C-末端进行修饰还代表了重要的任务。修饰多肽的最有力的方法之一是通过受控的蛋白质连接，这样肽类似物、非天然氨基酸、稳定同位素、荧光团以及其它生物化学或者生物物理上重要的分子能够被特异性地加入到多肽中。这些方法之一是基于化学选择性氨基酸的引入(主要是通过合成)，其主要是半胱氨酸，随后该半胱氨酸被攻击该氨基酸残基SH-侧链的硫-选择性试剂修饰。此外，可供替换的是，所谓的基于内含肽的蛋白质连接体系，其能够通过相应的蛋白质-内含肽融合蛋白的蛋白质水解产生蛋白质硫酯(Blaschke，U.K.等人，Methods Enzymol.328(2000)478-496)。该方法已经被成功地应用于将非天然修饰引入到蛋白质中。然而，困难仍然存在，例如因为靶蛋白必须被表达为与内含肽的融合蛋白。
最近，已经描述了另外几种用于肽连接和/或C-末端修饰的基于酶的方法。Breddam及其合作者(例如US 5,985,627)描述了丝氨酸蛋白酶羧肽酶Y(CPD-Y)在具有荧光或亲和标记的肽的C-末端修饰中的应用。这种修饰基于CPD-Y逐步从多肽的C-末端切除氨基酸的特异性能力。因此，该方法可以被认为是用于多肽的C-末端修饰的特异性工具。CPD-Y在形成肽-酰基-酶-中间体后切除C-末端氨基酸。这种酰基-酶-中间体通过亲核攻击被去酰基化，这导致了转酰胺基反应。所期望的转酰胺基反应可以伴随着(不希望的)副反应例如水解。还可以是多于一个的C-末端氨基酸被切除，另一方面通过该方法氨基酸可以被加入(Stennicke，H.R.等人，Anal.Biochem.248(1997)141-148；Buchardt，O.等人，US 5,580,751)。
Abrahmson等人(例如WO 94/18329)描述了丝氨酸蛋白酶变体用于肽连接的应用。枯草杆菌蛋白酶变体被公开，其具有提高的肽连接酶活性。然而，对于有效的肽连接，必须分别使用适当的氨基末端保护基团以及适当的羧基末端激活基团，以便有效地连接两个肽底物。
最近分选酶介导的蛋白质连接已经被描述为蛋白质工程中的替代性方法(Mao，H.等人，J.Am.Chem.Soc.126(2004)2670-2671)。分选酶，一种从金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)中分离的酶，其通过在识别基序中的苏氨酸与甘氨酸之间进行切割，接着将苏氨酸的羧基连接到N-末端的甘氨酸上来催化转肽反应，其中所述的识别基序由氨基酸LPXTG构成。本质上，其催化苏氨酸向细胞壁肽聚糖上的五甘氨酸的氨基的转肽反应。
在分选酶识别基序LPXTG中，X可以是氨基酸D、E、A、N、Q或K。这种酶已经被用于将肽或蛋白质的羧基末端苏氨酸残基连接到第二个肽的N-末端甘氨酸上。正如提到的，分选酶需要5个氨基酸的识别基序，其中四个氨基酸(LPXT)将出现在连接产物中。
因此，尽管存在多种用于多肽C-末端修饰的方法，但是，对于多肽的C-末端修饰的替换性或者改进的方法仍有巨大的需求。本发明的发明人已经发现将特定的胰蛋白酶突变体用于多肽的C-末端修饰是可能的。
因此，在一个实施方式中，本发明涉及突变的胰蛋白酶，其含有在位置K60和D189的氨基酸置换，以及至少一个在位置N143或者位置E151的变为组氨酸的氨基酸置换，根据胰凝乳蛋白酶命名法，其分别对应于SEQ ID NO：1中所提供序列的位置43、171、123和131。
本领域技术人员熟悉所谓的胰凝乳蛋白酶命名法，例如在Hartley，B.S.和Shotton，D.M.，The Enzymes，P.D.Boyer(ed.)，Vol.3，(1971)，pp.323-373中所描述的，并且可以将具有根据胰凝乳蛋白酶命名法所提供的位置的胰蛋白酶变体的位置与SEQ ID NO：1的胰蛋白酶序列中相应的位置进行比对。
根据胰凝乳蛋白酶命名法的位置60对应于SEQ ID NO：1所提供的来自褐家鼠(Rattus norvegicus)的成熟阴离子大鼠胰蛋白酶II序列的位置43。
根据胰凝乳蛋白酶命名法的位置143对应于SEQ ID NO：1所提供的来自褐家鼠(Rattus norvegicus)的成熟阴离子大鼠胰蛋白酶II序列的位置123。
根据胰凝乳蛋白酶命名法的位置151对应于SEQ ID NO：1所提供的来自褐家鼠(Rattus norvegicus)的成熟阴离子大鼠胰蛋白酶II序列的位置131。
根据胰凝乳蛋白酶命名法的位置189对应于SEQ ID NO：1所提供的来自褐家鼠(Rattus norvegicus)的成熟阴离子大鼠胰蛋白酶II序列的位置171。
由于本领域技术人员习惯于参考胰凝乳蛋白酶命名法表达位置，因此，在下文中对特定序列位置的引用例如位置K60或者简单地位置60将特定地基于根据胰凝乳蛋白酶命名法的位置。
本发明还涉及含有靶肽和含切割位点Xaa1-Xaa2-His的限制性位点肽的人造多肽的应用，其中Xaa1是L、Y或F，Xaa2是R或K，其中所述限制性位点肽通过所述靶肽的C-末端氨基酸Xaa1与靶肽重叠，其中所述多肽作为本发明中所公开的胰蛋白酶突变体的底物。
还提供了制备C-末端被转酰基化的靶肽的方法，其包括以下步骤：(a)提供一种多肽，其含有靶肽和含切割位点Xaa1-Xaa2-His的限制性位点肽，其中Xaa1是L、Y或F，Xaa2是R或K，其中所述限制性位点肽通过所述靶肽的C-末端氨基酸Xaa1与靶肽重叠；(b)将所述肽与根据本发明的胰蛋白酶突变体进行接触，其在允许在Xaa1之后进行内切蛋白质水解切割以及形成内切蛋白酶靶肽-酰基-中间体的条件下进行；(c)加入适当的亲核体；以及(d)在所述亲核体对靶肽的C-末端进行亲核攻击和结合之后，从该内切蛋白酶靶肽-酰基-中间体释放突变的胰蛋白酶。
在另一个实施方式中，本发明涉及编码新型胰蛋白酶突变体的核苷酸序列，还涉及含有这些突变体的载体，以及涉及含有这些载体的被转化的寄主细胞。
根据本发明的突变胰蛋白酶是含有在位置K60和D189的氨基酸置换，以及至少一个在位置N143或位置E151的氨基酸置换的胰蛋白酶。在位置143和/或位置151的置换是由组氨酸进行的置换。
优选的是，根据本发明的突变胰蛋白酶在位置60含有氨基酸E或者氨基酸D，这样替换了在位置60通常出现的氨基酸K。
还优选的是，根据本发明的突变胰蛋白酶含有在位置189的氨基酸K、氨基酸H或者氨基酸R，这样替换了在该位置正常出现的氨基酸D。非常优选的是在位置189变为K的置换。
在另一个优选的实施方式中，根据本发明的突变胰蛋白酶含有在位置60、143、151和189的突变。在该突变的酶中优选的置换是K60E或D、N143H、E151H以及D189K或R。
上面所描述的胰蛋白酶突变体具有令人非常感兴趣和非常重要的特性。这些突变体表现出优先识别由3个氨基酸Xaa1-Xaa2-His所构成的结合或切割位点，其中Xaa1是L、Y或F，Xaa2是R或K。该限制性位点被上述突变体在Xaa1之后切割。这是非常重要的特征，因为通过使用该新型胰蛋白酶突变体，只有一个氨基酸(即：C-末端Xaa1)将保留在被修饰的靶多肽内。
为了便于理解本发明，将提供在本发明中所使用术语的简要介绍。这里所公开的内容使用Schechter，J.，和Berger，A.，Biochem.Biophys.Res.Commun.27(1967)157-162的术语描述在肽底物以及在相应的蛋白质水解酶的活性位点中各种氨基酸残基的定位。
根据之前Schechter，J.和Berger所提出的术语，肽底物的氨基酸残基由字母“P”所表示。在有待切割的肽键(“切割位点”)的N-末端侧的底物的氨基酸被表示为Pn…P3，P2，P1，其中Pn是距离切割位点最远的残基。在切割位点C-末端侧的肽底物氨基酸残基被表示为P1`，P2`，P3`…Pn`，其中Pn`是距离切割位点最远的残基。因此，将要被切割的键(“切割位点”)是P1-P1`键。
肽链内切酶(类似例如胰蛋白酶)的底物的氨基酸的通式如下：
Pn-P3-P2-P1-P1`-P2`-P3`-Pn`。
肽链内切酶底物结合位点的标记与肽底物的氨基酸残基的标记类似。然而，肽链内切酶的结合亚位点(binding sub site)被字母“S”表示，并可以包含多于一个的氨基酸残基。在切割位点的N-末端侧的氨基酸的底物结合位点被标记为Sn…S3，S2，S1。在切割位点的羧基侧的氨基酸的底物结合亚位点被表示为S1`，S2`，S3`，Sn`。因此，在肽链内切酶中，S1`亚位点(sub site)与肽底物的P1`基团以及要进入的亲核体相互作用。用于描述肽链内切酶的底物结合位点的通式是：
Sn-S3-S2-S1-S1`-S2`-S3`-Sn`。
S1结合位点结合肽底物的倒数第二个氨基酸P1的侧链，其中在根据本发明的胰蛋白酶突变体的情况下，该氨基酸为Xaa1。S1`结合位点与P1`的侧链相互作用，在本发明的情况下，P1`为Xaa2。类似的，该S2`结合位点与P2`位置的组氨酸残基的侧链相互作用。
本领域技术人员能够理解，本发明还可以通过利用胰蛋白酶变体实现，其中该胰蛋白酶变体含有在位置K60和D189的氨基酸置换，以及至少一个另外的在位置N143或位置E151的变为组氨酸的氨基酸置换。
术语“变体”是指具有与天然多肽序列在某些程度上不同的氨基酸序列的多肽。通常，变体氨基酸序列将具有与相应的亲代胰蛋白酶序列至少大约80％的同源性，优选的是其为至少大约90％，更加优选的是与这类相应的亲代胰蛋白酶具有至少大约95％的同源性。氨基酸序列变体具有在天然氨基酸序列的氨基酸序列内部的某些位置的置换、缺失和/或插入。优选的是，序列同源性为至少96％或97％。
“同源性”被定义为在将序列进行比对和如果必要的话引入缺口之后，氨基酸序列变体中相同的氨基酸残基的百分比，其中引入缺口为了达到最大的同源性百分比。用于比对的方法和计算机程序是本领域熟知的。一种这类的计算机程序是由Genentech，Inc.创作的“Align2”，其于1991年12月10日与用户文件提交到美国版权局(United StatesCopyright Office)，Washington，DC 20559。
优选的是，与相应的野生型序列相比，本发明中所公开的胰蛋白酶变体含有20个氨基酸的置换或者更少，更优选15个氨基酸的置换或者更少，同样优选10个氨基酸的置换或者更少，同样优选6个氨基酸的置换或者更少。
在与相应的天然胰蛋白酶进行比较时，本发明的修饰的胰蛋白酶能够进行提高的转酰基作用。这里所使用的“转酰基作用”是胰蛋白酶切割位点C-末端的肽片段被替换为亲核体的反应。转酰基反应包括转硫醇反应、转酯反应以及转酰胺反应。当酰胺键被形成于亲核体与靶肽底物之间时，发生“转酰胺基反应”。在转酰胺基反应中，亲核体不必然是氨基酸。当亲核体是氨基酸或者氨基酸衍生物，诸如氨基酸酯或者氨基酸酰氨时，发生“转肽作用”。
下面表示了根据本发明的一般转酰基反应：
Pn-P3-P2-Xaa1-Xaa2-His-P3`-Pn`+      N          ---->
   底物                       亲核体    突变的胰蛋白酶
Pn-P3-P2-Xaa1-N+Xaa2-His-P3`-Pn`
被修饰的底物    被切除的C末端
在第一步中，该酶攻击Xaa1和Xaa2之间的肽键，替换了更靠C-末端的氨基酸，并形成了靶肽的P1残基(Xaa1)与该酶之间的共价键(酰基键)。这种中间体被称作靶肽“肽-酰基-酶中间体”或者简单地称作酰基-酶中间体。在存在适当的亲核体时，在适当条件下，该酶造成亲核体加入切割的肽底物产生转酰基化的产物。相信亲核体连接到酰基-酶中间体的羧基并替换来自酰基-酶中间体的酶。以这种方式，该亲核体被连接到肽底物的羧基。
酰基-酶中间体可以被水去酰基化以产生水解产物，而不是经历转酰基反应。本发明突变的胰蛋白酶被设计为相对于水解产物更优先地产生转酰基产物。
本发明还涉及人造多肽，其含有靶肽和含切割位点Xaa1-Xaa2-His的限制性位点肽，其中Xaa1是L、Y或F，Xaa2是R或K，其中所述限制性位点肽通过所述靶肽的C-末端氨基酸Xaa1与靶肽重叠。换句话说，其涉及含有靶肽和限制性位点肽的人造多肽，其中所述限制性位点肽含有切割位点Xaa1-Xaa2-His，其中Xaa1是L、Y或F，Xaa2是R或K，其中所述限制性位点肽与所述靶肽在该靶肽的C-末端共有氨基酸Xaa1。更优选的Xaa1是Y或F，特别优选的Xaa1是Y。
因此，术语靶肽指序列为Pn-P3-P2-Xaa1的肽或多肽。因此，该靶肽含有本发明突变的胰蛋白酶的切割位点的一个氨基酸，即氨基酸Xaa1，其为L、Y或F。术语肽包括多肽。
术语人造被用于说明该肽序列是人工的，即其是被科学家或者计算机设计的。本发明不涉及含有上述序列基序Xaa1-Xaa2-His的天然出现的多肽。其仅仅涉及人造多肽，诸如通过合成制备的或者通过重组制备的多肽，其被设计为含有靶肽和限制性位点肽以含有切割位点Xaa1-Xaa2-His，其中Xaa1和Xaa2如上所述。根据我们的定义，该靶肽具有氨基酸Xaa1作为其C-末端氨基酸。该限制性位点含有至少氨基酸Xaa2-His，并任选地含有C-末端的另外的氨基酸。因此，该由Xaa1-Xaa2-His组成的切割位点通过一个氨基酸(Xaa1)与靶肽重叠，并通过两个氨基酸(Xaa2-His)与限制性位点肽重叠。本领域技术人员可以理解，原则上，任何含有Xaa1-Xaa2-His的多肽，其中Xaa1和Xaa2如上所述，都可以用作根据本发明的胰蛋白酶突变体的底物，例如在肽连接中，或者在C-末端肽转酰基作用中，例如用于修饰和/或标记的目的。
优选根据本发明的靶多肽由20～2000个氨基酸构成。同样优选的是由30～1500个氨基酸构成的靶肽。更优选的这类靶多肽由40～1000个氨基酸构成。
优选的靶多肽是用于诊断或者治疗应用中的多肽。
例如优选的靶多肽包括特异性结合剂例如抗体及其片段。同样优选的是可以通过噬菌体展示获得的特异性结合剂(参见例如Allen，J.B.等人，TIBS 20(1995)511-516)。
术语抗体是指多克隆抗体、单克隆抗体、这类抗体的片段以及含有抗体结合结构域的基因构建体。任何保持与亲代抗体基本上相同结合性能的抗体也可以被使用。
优选，在根据本发明的重组多肽中所包含的靶多肽是治疗活性多肽。优选，这类治疗活性多肽选自由治疗性抗体、红细胞生成素以及干扰素所组成的组。优选地，该治疗蛋白是红细胞生成素或干扰素。
对于本领域技术人员显而易见的是只有这类不含有序列基序Xaa1-Xaa2-His作为该期望切割位点N-末端序列的一部分的多肽能够被用作靶多肽，其中Xaa1和Xaa2如上所述。本领域技术人员能够排除那些具有本发明突变胰蛋白酶潜在切割位点的多肽。可以替换的是，这类潜在的内部切割位点序列可以被常规的突变和/或克隆技术所修饰以改变和/或去除这类不期望的内部切割位点。
在优选的实施方式中，在其C-末端或者靠近C-末端含有序列Xaa1-Xaa2-His的根据本发明的多肽，其中Xaa1和Xaa2如上所述，是通过重组方法被制备的。本领域技术人员将能够工程化任何可重组生产的期望的靶多肽，以便在C-末端或者靠近C-末端含有上述Xaa1-Xaa2-His的限制性位点。
根据本发明的限制性位点肽至少含有氨基酸Xaa2(R或K)-His，其中Xaa2在其N-末端。其可以另外含有额外的C-末端氨基酸，其促进例如重组制备或者便于纯化。在另一个优选的实施方式中，该重组多肽将在其C-末端含有作为限制性位点肽的一部分的所谓His-标签(His-tag)，这允许通过成功建立的层析法进行容易的纯化，例如使用六-His(hexa-His)和Ni-NTA-层析(Hochuli，E.等人，J.Chromatogr.411(1987)177-184)。
优选，上述的胰蛋白酶突变体被用于肽底物的C-末端酰基化的方法中。本领域技术人员能够理解，这类肽底物将含有根据本发明的突变的胰蛋白酶的切割位点，所述方法将包括以下步骤：提供适当的肽底物；将所述肽底物与根据本发明的胰蛋白酶突变体进行接触，其在容许在Xaa1之后进行内切蛋白质水解切割以及形成内切蛋白酶靶肽-酰基-中间体的条件下进行；加入适当的亲核体；以及在所述亲核体对靶肽的C-末端进行亲核攻击和结合之后，从内切蛋白酶靶肽-酰基-中间体释放突变的胰蛋白酶。
优选，上述突变的胰蛋白酶以及上述含有Xaa1-Xaa2-His的多肽被用于通过转酰基作用的C-末端多肽修饰的方法中，例如在用于肽连接的方法中，其中Xaa1和Xaa2如上所述。因此，在优选的实施方式中，本发明涉及制备C-末端被转酰基的靶肽的方法，其包括以下步骤：(a)提供多肽，其含有靶肽和含切割位点Xaa1-Xaa2-His的限制性位点肽，其中Xaa1是L、Y或F，Xaa2是R或K；(b)将所述肽与根据本发明的胰蛋白酶突变体进行接触，其在能够在Xaa1之后进行内切蛋白质水解切割以及形成内切蛋白酶靶肽-酰基-中间体的条件下；(c)加入适当的亲核体；以及(d)通过亲核体的攻击和所述亲核体结合到靶肽的C-末端，从内切蛋白酶靶肽-酰基-中间体释放突变的胰蛋白酶。
这里所使用的亲核体是为电子受体提供电子对以形成共价键的分子，在这种情况中电子受体为肽-酰基-酶中间体的α-羧基碳。
优选，该亲核体选自由以下所组成的组：伯胺、亚胺、仲胺、硫醇和羟基。例如适当的亲核体包括氨基酸；氨基酸衍生物例如氨基酸酯或者氨基酸酰胺；胺例如氨或苄胺。
术语“转酰基作用”或者“转酰基的”用于说明靶肽C-末端的氨基酸(Xaa1)通过共价键被连接到亲核体。如果所述亲核体是硫醇，则所述转酰基作用是硫醇化作用；如果所述亲核体包括羟基，则所述转酰基作用是酯化作用；如果所述亲核体是胺，则所述转酰基作用导致转酰胺基作用。转酰胺基反应是非常重要的，并代表根据本发明的优选实施方式。
本领域技术人员容易理解的是，适当的亲核体可以还含有修饰，其为适当靶多肽的C-末端引入期望的性质。优选，本发明涉及含有修饰的亲核体，其中所述修饰选自由下列所组成的组：肽、肽酰胺、标记、被标记的氨基酸酰胺、被标记的肽、被标记的肽酰胺、非天然氨基酸以及聚乙二醇。
术语标记是本领域技术人员熟知的，其可以是任何感兴趣的期望结构。优选，这类标记可以选自任何已知的可检测基团例如染料，发光标记基团例如化学发光基团如吖啶酯或二氧杂环丁烷(dioxetanes)，或荧光染料例如荧光素、香豆素、若丹明、嗪、试卤灵、菁蓝及其衍生物。标记基团的其它例子是发光金属复合物例如钌复合物或铕复合物，用于CEDIA的酶(克隆酶供体免疫分析，例如EP-A-0 061 888)以及放射性同位素。
另一组优选的感兴趣的标记例如包括生物亲合结合对(bioaffinebinding pair)的一个配偶体。在进行分析时，这种标记与生物亲合结合对的另一配偶体特异性地并优选非共价地相互作用。生物亲合结合对的适当的结合配偶体的例子是半抗原或抗原/抗体，生物素或生物素类似物例如氨基生物素、亚氨基生物素或脱硫生物素/抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白，糖/植物凝集素，核酸或核酸类似物/互补核酸，受体/配体例如类固醇激素受体/类固醇激素。在这组中优选的标记选自半抗原、抗原和激素。特别优选的标记是半抗原例如地高辛和生物素及其类似物。
另一组优选的修饰是非天然氨基酸及其衍生物。最感兴趣的是含有官能团的非天然氨基酸，其与天然氨基酸正交(orthogonal)，所述官能团例如醛官能团、肼、酰肼、叠氮和α-卤素-酮。
如果该亲核体含有聚乙二醇(PEG)，则优选该PEG具有在2,000Da～50,000Da范围内的分子量。该PEG可以是线性或者支链的。更优选该PEG具有在10,000Da～40,000Da范围内的分子量。优选，这类含有PEG的亲核体的亲核基团为具有N-末端自由α-氨基的精氨酸或赖氨酸。该精氨酸或赖氨酸也可以是肽的N-末端。优选，这类PEG化的亲核体(pegylated nucleophile)选自由以下所组成的组：Arg-His-PEG、Arg-His-Ala-PEG、Lys-His-PEG、Lys-His-Ala-PEG和Arg-His-Xaa-PEG，其中Xaa可以为任何天然或者非天然双氨基羧酸。该PEG修饰的双氨基羧酸可以含有一个或者两个分别结合到这些氨基中的一个或者两个上的PEG分子。本领域技术人员可以选择或者设计其它适当的被PEG修饰的亲核体，例如PEG化的半胱氨酸等
根据本领域已知的方法，或者根据在本发明实施例部分所提供的方法，通过本发明的教导，目前可以获得编码本发明胰蛋白酶突变体的多聚核苷酸序列。优选，根据本发明的突变的胰蛋白酶是无活性的前体(酶原)，其被酶切以得到活性酶。在另一个实施方式中，本发明涉及编码突变的胰蛋白酶的核苷酸序列，其中该突变的胰蛋白酶在位置K60和D189含有氨基酸置换，以及至少一个另外的分别在位置N143或位置E151的置换为组氨酸的氨基酸置换。
本发明还包括表达载体，其含有根据本发明的核酸序列，其中所述核酸序列被可操作地连接到能够指导其在寄主细胞中表达的启动子上。
本发明还包括表达载体，其含有根据本发明的核酸序列，其中所述核酸序列被可操作地连接到能够指导其在寄主细胞中表达的启动子上。优选的载体是诸如在图1中所示pST和pYT的质粒。
可以在本发明中使用的表达载体通常含有复制的起始点，定位于DNA序列上游的启动子，接着是编码胰蛋白酶突变体的DNA序列，接着是转录终止序列以及剩余的载体。这些表达载体还可以含有其它本领域已知的DNA序列，例如提供表达产物稳定性的稳定性引导序列，提供表达产物分泌的分泌引导序列，能够使结构基因的表达被调节的序列(例如通过在生长基质中存在或者不存在营养物或其它诱导剂)，能够提供在被转化的寄主细胞中进行表型筛选的标志序列，以及提供限制性内切酶切割位点的序列。
实际使用的表达载体的特征必须要与要采用的寄主细胞兼容。例如在大肠杆菌(E.coli)细胞体系中克隆时，所述表达载体应该含有从大肠杆菌(E.coli)细胞的基因组中分离的启动子(例如lac或trp)。在各种大肠杆菌(E.coli)寄主中的适合的复制起始点包括例如ColE1质粒复制起始点。适合的启动子包括例如lac和trp。还优选，所述表达载体含有编码可以被筛选的标志的序列。所述可以被筛选的标志优选是抗生素抗性基因。作为可以被筛选的标志，通常氨苄青霉素抗性或者卡那霉素(canamycin)抗性可以被方便地采用。所有这些材料都是本领域已知并可以通过商业途径获得的。
使用本领域已知的标准重组DNA技术，可以构建含有期望的编码和控制序列的适当表达载体，在Sambrook，J.等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(1989)中描述了一些这类技术。
另外，本发明涉及含有表达载体的寄主细胞，其中所述表达载体含有编码根据本发明的突变的胰蛋白酶的DNA序列。优选的是，所述寄主细胞含有表达载体，所述表达载体含有一种或者多种调节DNA序列，其被可操作地连接到编码突变的胰蛋白酶的全部或者功能部分的DNA序列，该调节DNA序列能够指导编码突变的胰蛋白酶的全部或者功能部分的DNA序列的复制和/或表达。适当的寄主细胞包括例如可以从Promega(2800 Woods Hollow Road，Madison，WI，USA)获得的大肠杆菌(E.coli)HB101(ATCC 33694)，可以从Stratagene(11011 NorthTorrey Pine Road，La Jolla，CA，USA)获得的XL1-Blue MRF等。
通过各种本领域已知的方法可以将表达载体引入寄主细胞中。例如可以通过聚乙二醇介导的原生质体转化方法用表达载体对寄主细胞进行转化(Sambrook等人1989)。然而，还能够采用其它将表达载体引入寄主细胞的方法例如电穿孔、整体注射(bolistic injection)或原生质体融合。
一旦已经将含有胰蛋白酶突变体的表达载体引入适当的寄主细胞，则可以在允许表达所期望胰蛋白酶突变体的条件下对所述寄主细胞进行培养。含有表达载体的寄主细胞，其中表达载体含有编码胰蛋白酶突变体的DNA序列，是例如通过下面常用方法中的一种或者多种被鉴定的：DNA杂交，出现或者未出现标志基因的功能，  评估转录水平，例如通过寄主细胞内胰蛋白酶mRNA转录体的产生来检测，以及通过免疫学方法检测基因产物。
当然，需要理解的是，不是所有的表达载体和DNA调节序列都能够同样好地发挥功能以表达本发明的DNA序列。也不是所有的寄主细胞与相同的表达体系都能够同样好地发挥功能。然而，本领域的技术人员能够通过使用这里所提供的指导不需要过多地实验以在表达载体、DNA调节序列以及寄主细胞中做出选择。
下面的实施例、参考文献、序列表和附图被提供以辅助理解本发明，本发明的真正范围在所附的权利要求书中被提出。需要理解，可以对所提出的方法做出修饰，而不离开本发明的精神。
附图说明
图1用于表达突变的胰蛋白酶原的克隆载体
在左边，表示了含有胰蛋白酶原编码区的大肠杆菌(E.coli)穿梭载体pST的示意图。该编码区可以被容易地插入到pYT-载体中，为在酵母内表达多肽而优化。在该图的右面提供了含有胰蛋白酶原编码区的pYT-载体的示意图。
图2转酰胺基作用的动力学
胰蛋白酶变体Tn K60E、E151H、N143H和D189K所催化的Ala-Ala-Tyr-Arg-His-Ala-Gly(三角形)与Arg-NH2的转酰胺基作用的时间进程，其在存在a)l00μM EDTA或b)100μM ZnCl2时得到Ala-Ala-Tyr-Arg-NH2(圆形)。正方形代表AAY，其是作为由于蛋白质裂解的反应副产物而被形成的。
图3 Zn2+对催化活性的影响
存在Zn2+(灰方决)和不存在Zn2+(黑方决)对胰蛋白酶变体TnK60E、E151H、N143H和D189K所催化的肽转换(peptide turnover)的速率的影响。
图4识别序列对胰蛋白酶变体Tn K60E、E151H、N143H和D189K所催化反应的速率的影响。
检测了根据本发明的胰蛋白酶变体对在切割位点或者临近切割位点处具有不同肽序列的肽底物的催化活性。以nM/分钟提供肽消耗的起始速率(v)。
图5 Bz-Ala-Ala-Tyr-Arg-His-Lys(6-CF)-OH的质谱
实施例
实施例1
产生胰蛋白酶变体的一般程序：
1.使用含有编码胰蛋白酶或胰蛋白酶原的DNA的适当载体例如pST载体(参见图1)将期望的突变引入胰蛋白酶或胰蛋白酶原。大肠杆菌(E.coli)载体pST已经被L.Hedstrom首先构建，并代表酵母穿梭载体，其含有ADH/GAPDH-启动子以及与编码胰蛋白酶原的序列融合的α-因子引导序列；参见：Hedstrom，L.等人，Science 255(1992)1249-1253。
2.所构建的载体的转化，例如在大肠杆菌(E.coli)中。
3.使用适当的表达载体例如酵母载体pYT(参见图1)分别亚克隆被修饰的胰蛋白酶或胰蛋白酶原序列。在直接将期望的突变引入该表达载体的情况中，这一步是不需要的。
4.在大肠杆菌(E.coli)或酵母中表达被修饰的胰蛋白酶或胰蛋白酶原。
5.使用适当的分离方法例如阳离子交换色谱分离被修饰的胰蛋白酶或胰蛋白酶原。
6.在胰蛋白酶原已经被表达的情况下，需要利用肠激酶的有限蛋白质水解激活所分离的酶原。
7.采用适当的纯化方法例如亲和色谱或者阴离子交换色谱对被激活的胰蛋白酶进行最终的纯化。
8.透析。
在表1中，提供了胰蛋白酶变体Tn K60E、E151H、N143H和D189K(相应于突变的阴离子大鼠胰蛋白酶II，其没有信号序列和前-序列)的一级序列。
表1：
胰蛋白酶变体K60E、N143H、E151H和D183K的基础特征
 质量    位置  肽序列(＝SEQ ID NO.：1)
23828.5978 1-223  IVGGYTCQENSVPYQVSLNSGYHFCGGSLINDQWVVSAAHCYESRIQVRLGEHNINVLEGNEQFVNAAKIIKHPNFDRKTLNNDIMLIKLSSPVKLNARVATVALPSSCAPAGTQCLISGWGHTLSSGVNHPDLLQCLDAPLLPQADCEASYPGKITDNMVCVGFLEGGKKSCQGDSGGPVVCNGELQGIVSWGYGCALPDNPGVYTKVCNYVDWIQDTI AAN
(粗体为突变)
理论肽质量：
[理论pI：5.41/Mw(平均质量)：23843.00/Mw(单一同位素质量)：23827.59]
实施例2
通过固相肽合成制备肽
除非特别说明，在本申请中所提到的肽是通过芴基甲氧基羰基-(Fmoc)-固相肽合成在例如来自Applied Biosystems A433的分批肽合成仪上被合成的。在每种情况中，4.0当量的表2中所示氨基酸衍生物被用于该工艺。
表2：
 A  Fmoc-Ala-OH
 C  Fmoc-Cys(Trt)-OH
 D  Fmoc-Asp(OtBu)-OH
 E  Fmoc-Glu(OtBu)-OH
 F  Fmoc-Phe-OH
 G  Fmoc-Gly-OH
 H  Fmoc-His(Trt)-OH
 I  Fmoc-Ile-OH
 K  Fmoc-Lys(Boc)-OH
 L  Fmoc-Leu-OH
 M  Fmoc-Met-OH
 N  Fmoc-Asn(Trt)-OH
 P  Fmoc-Pro-OH
 Q  Fmoc-Gln(Trt)-OH
 R  Fmoc-Arg(Pbf)-OH
 S  Fmoc-Ser(tBu)-OH
 T  Fmoc-Thr(tBu)-OH
 V  Fmoc-Val-OH
 W  Fmoc-Trp-OH
 Y  Fmoc-Tyr(tBu)-OH
将氨基酸衍生物溶解在N-甲基-2-吡咯烷酮(N-methyl-2-pyrrolidinon)中。在Wang树脂(Wang resin)(Wang，S.-S.，J.Am.Chem.Soc.95(1973)1328-1333)或2-氯三苯甲基氯化物-树脂(2-chlortritylchloride-resin)(Barlos，K.等人，Tetrahedron Lett.30(1989)3947-3950)上，肽被合成。该树脂以0.5～1.0mMol/g被装载。相对于二甲基甲酰胺中的Fmoc-氨基酸衍生物，使用二甲基甲酰胺中的4当量二环己基碳二亚胺和4当量N-羟基苯并三唑作为反应介质进行偶联反应20分钟。在合成的每步之后，使用二甲基甲酰胺中的20％哌啶将Fmoc基团切割20分钟。任选地，固相上的末端氨基被乙酸酐乙酰化。
在固相合成过程中通过直接加入例如金属螯合剂或者偶联氨基酸衍生物的荧光素，在C-末端引入标记例如金属螯合剂标记或者荧光素标记或者PEG标记(在WO 96/03409中所描述的)。
使用20ml三氟乙酸、0.5ml乙二醇、1ml茴香硫醚、1.5g苯酚和1ml水在室温下40分钟内，肽被从支持物上释放出来，酸不稳定的保护基团被切割。根据所使用的氨基酸衍生物，还可以使用含有较少自由基捕获剂的混合物。接着，将300ml被冷却的二异丙基醚加入到反应溶液中在0℃下保持40分钟，以完全沉淀该肽。该沉淀物被过滤，用二异丙基醚清洗，并溶解在少量的50％乙酸中，并冻干。通过制备型高效液相色谱在Vydac RP C18 218TP152050(柱50×250mm，300；15μm)通过适当的梯度(洗脱液A：水，0.1％三氟乙酸；洗脱液B：乙腈，0.1％三氟乙酸)在大约120分钟内纯化所得到的粗材料。通过质谱对洗脱的材料进行鉴定。
可以替换的是，标记例如PEG也可以在从树脂切下肽后被引入。对此，有利的是使用氯三苯甲基氯化物-树脂。通过室温下使用10ml二氯甲烷中的1％三氟乙酸20分钟，被保护的肽被从树脂切除。
接着，该肽的C-末端被在作为反应介质的二甲基甲酰胺中的2当量二环己基碳二亚胺、2当量N-羟基苯并三唑和2当量三乙胺所激活，并加入了1当量标记基团或者效应基团的氨基酸衍生物。通过使用20ml三氟乙酸、0.5ml乙二醇、1ml茴香硫醚、1.5g苯酚和1ml水在室温下40分钟内保护基团被去除。根据所使用的氨基酸衍生物，还可以使用含有较少自由基捕获剂(radical traps)的混合物。接着，将300ml冷却的二异丙基醚加入到反应溶液中在0℃下保持40分钟，以完全沉淀该肽。如上所述进行HPLC纯化。
实施例3
由胰蛋白酶变体Tn K60E、E151H、N143H和D189K催化的Ala-Ala-Tyr-Arg-His-Ala-Gly与Arg-NH2的转酰胺基作用
肽Ala-Ala-Tyr-Arg-His-Ala-Gly是通过实施例2中所描述使用Fmoc-化学和预装的Wang-树脂的传统固相肽合成被合成的。每种氨基酸构建模块(building block)是可以商业上获得的，并从多个供应商被购得。Arg-NH2是Bachem(Switzerland)的商业产品。
含有溶解在0.1M Hepes缓冲液pH 8.0的1mM Ala-Ala-Tyr-Arg-His-Ala-Gly(SEQ ID NO：2)和5mM Arg-NH2的1ml反应体积；20μM胰蛋白酶变体Tn K60E、E151H、N143H和D189K；100μM ZnCl2或者备选地100μM EDTA在25℃下被搅拌。在规定的时间后，取出等分样品，通过加入甲醇/水(1∶1，v/v)中的1％三氟乙酸停止反应，这得到了所取出样品最终为2的pH值。通过分析型HPLC对后者进行分析，其中反应的时间进程被表示在图2中。通过质谱确认所合成的最终产物。
实施例4
Zn2+离子对胰蛋白酶变体Tn K60E、E151H、N143H和D189K的特异性的影响
肽底物Bz-Ala-Ala-Tyr-Arg-His-Ala-Ala-Gly、Bz-Ala-Ala-Tyr-Arg-His-Ala-Gly、Bz-Ala-Ala-Tyr-Arg-His-Asp-Ala-Gly、Bz-Ala-Ala-Tyr-Arg-Arg-Ala-Gly和Bz-Ala-Ala-Tyr-Asp-His-Ala-Gly是通过使用Fmoc-化学和预装的Wang-树脂的传统固相肽合成被合成的。每种氨基酸构建模块是可以商业上获得的，并从多个供应商被购得。
含有溶解在0.1M Pipes/Tris-缓冲液pH 8.0中的1mM以下的肽中的一种：Bz-Ala-Ala-Tyr-Arg-His-Ala-Ala-Gly(SEQ ID NO：3)、Bz-Ala-Ala-Tyr-Arg-His-Ala-Gly(SEQ ID NO：4)、Bz-Ala-Ala-Tyr-Arg-His-Asp-Ala-Gly(SEQ ID NO：5)、Bz-Ala-Ala-Tyr-Arg-Arg-Ala-Gly(SEQ ID NO：6)或Bz-Ala-Ala-Tyr-Asp-His-Ala-Gly(SEQ ID NO：7)的1ml反应体积；20μM胰蛋白酶变体Tn K60E、E151H、N143H、D189K，100μM ZnCl2或备选地EDTA在30℃下被搅拌。在规定的时间段后，通过加入甲醇/水(1∶1，v/v)中的1％三氟乙酸结束反应。通过分析型HPLC对被停止的反应混合物进行分析。图3表示了反应的各自反应速率。通过质谱确认所合成的最终产物。
实施例5
识别序列对胰蛋白酶变体Tn K60E、E151H、N143H和D189K所催化反应的速率的影响
SEQ ID NO：3-19的Nα-苯甲酰化的肽已经通过使用Fmoc-化学和预装的Wang-树脂的传统固相肽合成被合成。每种氨基酸构建模块是可以商业上获得的，并从多个供应商被购得。
含有溶解在0.1M Pipes/Tris-缓冲液pH 8.0中的1mM Nα-苯甲酰化的肽的1ml反应体积；20μM胰蛋白酶变体Tn K60E、E151H、N143H和D189K；100μM ZnCl2在30℃下被搅拌。在规定的时间段后，通过加入甲醇/水(1∶1，v/v)中的1％三氟乙酸结束反应。通过分析型HPLC对被停止的反应混合物进行分析。图4表示了反应的各自反应速率。通过质谱确认所合成的最终产物。
可以容易地从图4中看出，胰蛋白酶变体Tn(＝K60E、E151H、N143H和D189K)对在位置P1含有L、F或Y，在位置P1′含有R或K，在位置P2′含有His的切割位点具有强优选性。
实施例6
胰蛋白酶变体Tn K60E、E151H、N143H和D189K催化的Bz-Ala-Ala-Tyr-Arg-His-Ala-Gly与Arg-His-Ala-Lys(6-CF)-OH的转酰胺基作用
Bz-Ala-Ala-Tyr-Arg-His-Ala-Gly已经通过使用Fmoc-化学和预装的Wang-树脂的传统固相肽合成被合成。每种氨基酸构建模块(building block)是可以商业上获得的，并从多个供应商被购得。Arg-His-Ala-Lys(6-CF)-OH是通过片段缩合被合成的。被保护的三肽Boc-Arg(Boc)2-His(Trt)-Ala-OH是在使用传统固相肽合成的氯三苯甲基-树脂(chlorotrityl-resin)上被合成的。使用2×40ml含有二氯甲烷/乙酸/三氟乙酸(v/v/v 8/1/1)的混合物将该肽从树脂切除。粗材料被通过反相HPLC纯化。其他片段Fmoc-Lys(6-羧基-荧光素)的合成是从3ml二氧芑和3ml DMF中的0.6mmol Fmoc-Lys*HCl、0.655mMol 6-羧基荧光素(从Molecular Probes购买)进行的。使用哌啶将Fmoc-基团切除，粗材料被通过反相HPLC纯化。接着，使用DMF中1当量的HBTU(Iris Biotech)和3当量的二异丙基乙胺活化被保护的三肽。加入1当量的Lys(6-羧基-荧光素)，在室温下该混合物被搅拌2小时。使用去保护混合物(18ml三氟乙酸、0.5ml水和0.5ml乙二硫醇)进行了去保护反应。使用二异丙醚，该肽被沉淀，并通过RP-HPLC而被纯化，并以良好的产量而被获得。
含有溶解在0.1M Pipes/Tris-缓冲液pH8.0中的0.5mM Bz-Ala-Ala-Tyr-Arg-His-Ala-Gly(SEQ ID NO：20)和2.5mM Arg-His-Ala-Lys(6-CF)-OH的1ml反应体积；20μM胰蛋白酶变体Tn K60E、E151H、N143H和D189K；100μM ZnCl2或者备选地100μM EDTA在30℃下被搅拌。在规定的时间段后，分别取出等分样品，通过加入甲醇/水(1∶1，v/v)中的1％三氟乙酸停止反应，这得到了所取出样品最终2的pH值。HPLC被用于分析反应的进程并分离合成的产物。如图5所示，后者以＞99％的产率被获得，并被进一步通过质谱进行分析。
实施例7
胰蛋白酶变体Tn K60E、E151H、N143H和D189K催化的AKTAAALHIL VKEEKLALDL LEQIKNGADF GKLAKKHSICPSGKRGGDLG EFRQGQMVPA FDKVVFSCPV LEPTGPLHTQFGYHIIKVLY RH与Arg-His-Gly-PEG的转酰胺基作用。
Arg-His-Gly-PEG被通过从Nektar/Shearwater购得的Boc-Arg(Boc)2-His(Trt)-Gly-OH与氨基-PEG(20kD)的片段缩合而合成。为了合成被保护的三肽和激活该片段，参见实施例6。此处，使用0.5当量的氨基-PEG(20kD)作为亲核体。在去保护后(参见实施例6的混合物)，利用RP-HPLC，所有的小分子杂质都被分离掉。
在其C-末端含有识别序列Tyr-Arg-His的多肽AKTAAALHILVKEEKLALDL LEQIKNGADF GKLAKKHSIC PSGKRGGDLGEFRQGQMVPA FDKVVFSCPV LEPTGPLHTQ FGYHIIKVLYRH(SEQ ID NO：21)由天然大肠杆菌(E.coli)细小蛋白(parvulin)10通过将原始C-末端Asn部分与人造His进行交换而制备。在表达和纯化之后，每种被修饰的细小蛋白10(Asn92His)变体被溶解在Pipes/Tris-缓冲液pH 8.0中。最终浓度20μM的胰蛋白酶变体TnK60E、E151H、N143H和D189K，100μM的ZnCl2和过量的Arg-His-Gly-PEG被加入到该反应混合物中。在30℃下搅拌后，通过加入甲醇/水(1∶1，v/v)中的1％三氟乙酸，反应被停止。通过HPLC、凝胶电泳和/或质谱完成分析。通过传统的蛋白质纯化技术例如通过色谱方法完成对最终产物AKTAAALHIL VKEEKLALDLLEQIKNGADF GKLAKKHSIC PSGKRGGDLG EFRQGQMVPAFDKVVFSCPV LEPTGPLHTQ FGYHIIKVLY RH-Gly-PEG的分离。
对比文件列表
Allen，J.B.等人，TIBS 20(1995)511-516
Barlos，K.等人，Tetrahedron Lett.30(1989)3947-3950
Blaschke，U.K.等人，Methods Enzymol.328(2000)478-496EP-A-0 061 888
Hartley，B.S.，and Shotton，D.M.，The Enzymes，P.D.Boyer(ed.)，Vol.3，(1971)，pp.323-373
Hedstrom，L.等人，Science 255(1992)1249-1253
Hochuli，E.等人，J.Chromatogr.411(1987)177-184
Mao，H.等人，J.Am.Chem.Soc.126(2004)2670-2671
Sambrook等人，ed.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989
Schechter，J.，and Berger，A.，Biochem.Biophys.Res.Commun.27(1967)157-162
Stennicke，H.R.等人，Anal.Biochem.248(1997)141-148
US 5,580,751
US 5,985,627
Wang，S.-S.，J.Am.Chem.Soc.95(1973)1328-1333
WO 94/18329
WO 96/03409
序列表
<110>Roche Diagnostics GmbH
     F.Hoffmann-La Roche GmbH
<120>多肽的C-末端修饰
<130>22684 WO
<150>EP 04019237.9
<151>2004-08-13
<160>20
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>223
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>胰蛋白酶变体
<400>1
Ile Val Gly Gly Tyr Thr Cys Gln Glu Asn Ser Val Pro Tyr Gln Val
1               5                   10                  15
Ser Leu Asn Ser Gly Tyr His Phe Cys Gly Gly Ser Leu Ile Asn Asp
            20                  25                  30
Gln Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Tyr Glu Ser Arg Ile Gln Val
        35                  40                  45
Arg Leu Gly Glu His Asn Ile Asn Val Leu Glu Gly Asn Glu Gln Phe
    50                  55                  60
Val Asn Ala Ala Lys Ile Ile Lys His Pro Asn Phe Asp Arg Lys Thr
65                  70                  75                   80
Leu Asn Asn Asp Ile Met Leu Ile Lys Leu Ser Ser Pro Val Lys Leu
                85                  90                  95
Asn Ala Arg Val Ala Thr Val Ala Leu Pro Ser Ser Cys Ala Pro Ala
            100                 105                 110
Gly Thr Gln Cys Leu Ile Ser Gly Trp Gly His Thr Leu Ser Ser Gly
        115                 120                 125
Val Asn His Pro Asp Leu Leu Gln Cys Leu Asp Ala Pro Leu Leu Pro
    130                 135                 140
Gln Ala Asp Cys Glu Ala Ser Tyr Pro Gly Lys Ile Thr Asp Asn Met
145                 150                 155                 160
Val Cys Val Gly Phe Leu Glu Gly Gly Lys Lys Ser Cys Gln Gly Asp
                165                 170                 175
Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Asn Gly Glu Leu Gln Gly Ile Val Ser
            180                 185                 190
Trp Gly Tyr Gly Cys Ala Leu Pro Asp Asn Pro Gly Val Tyr Thr Lys
        195                 200                 205
Val Cys Asn Tyr Val Asp Trp Ile Gln Asp Thr Ile Ala Ala Asn
    210                 215                 220
<210>2
<211>7
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成的肽
<400>2
Ala Ala Tyr Arg His Ala Gly
1               5
<210>3
<211>8
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成的肽
<400>3
Ala Ala Tyr Arg His Ala Ala Gly
1               5
<210>4
<211>7
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成的肽
<400>4
Ala Ala Tyr Arg His Ala Gly
1               5
<210>5
<211>8
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成的肽
<400>5
Ala Ala Tyr Arg His Asp Ala Gly
1               5
<210>6
<211>7
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成的肽
<400>6
Ala Ala Tyr Arg Arg Ala Gly
1               5
<210>7
<211>7
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成的肽
<400>7
Ala Ala Tyr Asp His Ala Gly
1               5
<210>8
<211>7
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成的肽
<400>8
Ala Ala Tyr Lys His Ala Gly
1               5
<210>9
<211>8
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成的肽
<400>9
Ala Ala Tyr Arg His Tyr Ala Gly
1               5
<210>10
<211>7
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成的肽
<400>10
Ala Ala Phe Arg His Ala Gly
1               5
<210>11
<211>8
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成的肽
<400>11
Ala Ala Tyr Arg His Arg Ala Gly
1               5
<210>12
<211>7
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成的肽
<400>12
Ala Ala Leu Arg His Ala Gly
1               5
<210>13
<211>7
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成的肽
<400>13
Ala Ala Phe Lys His Ala Gly
1               5
<210>14
<211>7
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成的肽
<400>14
 Ala Ala Tyr Ala His Ala Gly
 1               5
<210>15
<211>7
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成的肽
<400>15
Ala Ala Tyr Arg Ala Ala Gly
1               5
<210>16
<211>7
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成的肽
<400>16
Ala Ala Arg Arg His Ala Gly
1               5
<210>17
<211>7
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成的肽
<400>17
Ala Ala Ala Arg His Ala Gly
1               5
<210>18
<211>7
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成的肽
<400>18
Ala Ala Tyr Arg Asn Ala Gly
1               5
<210>19
<211>7
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成的肽
<400>19
Ala Ala Asp Arg His Ala Gly
1               5
<210>20
<211>92
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>多肽
<400>20
Ala Lys Thr Ala Ala Ala Leu His Ile Leu Val Lys Glu Glu Lys Leu
1               5                   10                  15
Ala Leu Asp Leu Leu Glu Gln Ile Lys Asn Gly Ala Asp Phe Gly Lys
            20                  25                  30
Leu Ala Lys Lys His Ser Ile Cys Pro Ser Gly Lys Arg Gly Gly Asp
        35                  40                  45
Leu Gly Glu Phe Arg Gln Gly Gln Met Val Pro Ala Phe Asp Lys Val
    50                  55                  60
Val Phe Ser Cys Pro Val Leu Glu Pro Thr Gly Pro Leu His Thr Gln
65                  70                  75                  80
Phe Gly Tyr His Ile Ile Lys Val Leu Tyr Arg His
                85                  90

Claims (9)

1.一种突变的胰蛋白酶，其含有在位置K60和D189的氨基酸置换，以及至少一个另外的在位置N143或位置E151的置换为组氨酸的氨基酸置换。
2.根据权利要求1所述的突变的胰蛋白酶，其中K60被E或D置换。
3.根据权利要求1所述的突变的胰蛋白酶，其中D189被K、H或R置换。
4.含有靶肽和限制性位点肽的多肽作为根据权利要求1～3中任一项所述胰蛋白酶突变体的底物的应用，其中所述的限制性位点肽含有切割位点Xaa1-Xaa2-His，其中Xaa1是L、Y或F，Xaa2是R或K，其中所述限制性位点肽通过所述靶肽的C末端氨基酸Xaa1与靶肽重叠。
5.一种制备C-末端被转酰基化的靶肽的方法，其包括以下步骤：
(a)提供多肽，其含有靶肽和含切割位点Xaa1-Xaa2-His的限制性位点肽，其中Xaa1是L、Y或F，Xaa2是R或K，其中所述限制性位点肽通过所述靶肽的C末端氨基酸Xaa1与靶肽重叠；
(b)将所述肽与根据权利要求1～3中任一项所述的胰蛋白酶突变体进行接触，其在允许在Xaa1之后进行内切蛋白质水解切割以及形成内切蛋白酶靶肽-酰基-中间体的条件下进行；
(c)加入适当的亲核体；以及
(d)在所述亲核体对该靶肽的C-末端进行亲核攻击和结合之后，从该内切蛋白酶靶肽-酰基-中间体释放该突变的胰蛋白酶。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述的亲核体选自由以下所组成的组：伯胺、亚胺、仲胺、硫醇和羟基。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述的含有修饰的亲核体选自由以下所组成的组：氨基酸酰胺、肽、肽酰胺、标记、被标记的氨基酸酰胺、被标记的肽、被标记的肽酰胺以及聚乙二醇。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述修饰是聚乙二醇。
9.一种核苷酸序列，其编码权利要求1～3中任一项所述的突变的胰蛋白酶。
CN2005800273012A 2004-08-13 2005-08-12 多肽的c-末端修饰 Active CN101010425B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP04019237 2004-08-13
EP04019237.9 2004-08-13
PCT/EP2005/008809 WO2006015879A1 (en) 2004-08-13 2005-08-12 C-terminal modification of polypeptides

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101010425A true CN101010425A (zh) 2007-08-01
CN101010425B CN101010425B (zh) 2010-05-26

Family

ID=34926160

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2005800273012A Active CN101010425B (zh) 2004-08-13 2005-08-12 多肽的c-末端修饰

Country Status (10)

Country Link
US (2) US20080064079A1 (zh)
EP (1) EP1778839B1 (zh)
JP (1) JP4538501B2 (zh)
CN (1) CN101010425B (zh)
AT (1) ATE400647T1 (zh)
CA (1) CA2569707C (zh)
DE (1) DE602005008071D1 (zh)
ES (1) ES2309785T3 (zh)
HK (1) HK1110888A1 (zh)
WO (1) WO2006015879A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102740896A (zh) * 2010-02-11 2012-10-17 霍夫曼-拉罗奇有限公司 Igf-i聚乙二醇缀合物

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102005046113A1 (de) * 2005-09-27 2007-03-29 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Verfahren zur Amidierung von Polypetiden mit C-terminalen basischen Aminosäuren unter Verwendung spezifischer Endoproteasen
DE102006031955A1 (de) 2006-07-11 2008-01-17 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Verfahren zur Herstellung von Insulinanaloga mit dibasischem B-Kettenende
DE102006031962A1 (de) * 2006-07-11 2008-01-17 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Amidiertes Insulin Glargin
HUE037449T2 (hu) 2008-10-17 2018-08-28 Sanofi Aventis Deutschland Egy inzulin és egy GLP-1 agonista kombinációja
CN102482340B (zh) 2009-04-06 2015-05-13 诺沃—诺迪斯克有限公司 因子viii蛋白向血小板的靶向递送
WO2011058082A1 (de) 2009-11-13 2011-05-19 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Pharmazeutische zusammensetzung umfassend einen glp-1-agonisten und methionin
AR080669A1 (es) 2009-11-13 2012-05-02 Sanofi Aventis Deutschland Composicion farmaceutica que comprende un agonista de glp-1, una insulina y metionina
ES2606554T3 (es) 2010-08-30 2017-03-24 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Uso de AVE0010 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la diabetes mellitus de tipo 2
US9821032B2 (en) 2011-05-13 2017-11-21 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Pharmaceutical combination for improving glycemic control as add-on therapy to basal insulin
BR112014004726A2 (pt) 2011-08-29 2017-04-04 Sanofi Aventis Deutschland combinação farmacêutica para uso no controle glicêmico em pacientes de diabetes tipo 2
TWI559929B (en) 2011-09-01 2016-12-01 Sanofi Aventis Deutschland Pharmaceutical composition for use in the treatment of a neurodegenerative disease
PL3229828T3 (pl) 2014-12-12 2023-07-31 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Formulacja o ustalonym stosunku insuliny glargine/liksysenatydu
TWI748945B (zh) 2015-03-13 2021-12-11 德商賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 第２型糖尿病病患治療
TW201705975A (zh) 2015-03-18 2017-02-16 賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 第２型糖尿病病患之治療
US10738338B2 (en) 2016-10-18 2020-08-11 The Research Foundation for the State University Method and composition for biocatalytic protein-oligonucleotide conjugation and protein-oligonucleotide conjugate
JP2021523878A (ja) 2018-05-18 2021-09-09 バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド 血友病ａを処置する方法
EP3650541A1 (en) 2018-11-08 2020-05-13 BioPharma Translationsinstitut Dessau Forschungs GmbH Trypsin mutant for c- and n-terminal modification of polypeptides
JP7360742B2 (ja) * 2018-12-19 2023-10-13 バイオファーマ トランスレーションズインスティテュート デッサウ フォルシュングス ゲーエムベーハー 酵素特性が改善したトリプシン変異体およびその使用ならびに基質の直交二重修飾のための方法
EP4073096A1 (en) 2019-12-10 2022-10-19 Sanofi A method of forming a conjugate of a sulfonamide and a polypeptide

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE9001705D0 (sv) * 1990-05-11 1990-05-11 Medscand Ab Saett foer diagnostik av virusbaerande tumoerer genom immunoassay
US5580751A (en) * 1990-09-14 1996-12-03 Carlsberg A/S Process for the preparation of C-terminally amidated peptides
AU6171594A (en) 1993-02-04 1994-08-29 Genentech Inc. Serine protease variants having peptide ligase activity
US6187579B1 (en) * 1993-10-28 2001-02-13 Carlsberg A/S Customized proteases
CA2172145C (en) 1994-07-25 2010-09-21 Hans-Peter Josel Metal complexes with a charged linker
US5985627A (en) 1997-02-28 1999-11-16 Carlsberg Laboratory Modified carboxypeptidase
DE10049673A1 (de) * 2000-10-07 2002-04-25 Univ Leipzig Verfahren zur Herstellung von Peptiden, Peptidmimetika und Proteinen
CN1354253A (zh) * 2001-12-24 2002-06-19 南京医科大学 淡色库蚊胰蛋白酶基因

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102740896A (zh) * 2010-02-11 2012-10-17 霍夫曼-拉罗奇有限公司 Igf-i聚乙二醇缀合物
CN102740896B (zh) * 2010-02-11 2014-08-27 霍夫曼-拉罗奇有限公司 Igf-i聚乙二醇缀合物

Also Published As

Publication number Publication date
CA2569707A1 (en) 2006-02-16
WO2006015879A1 (en) 2006-02-16
HK1110888A1 (en) 2008-07-25
ES2309785T3 (es) 2008-12-16
CN101010425B (zh) 2010-05-26
US20080064079A1 (en) 2008-03-13
US8927230B2 (en) 2015-01-06
CA2569707C (en) 2013-09-24
EP1778839B1 (en) 2008-07-09
JP2008508871A (ja) 2008-03-27
ATE400647T1 (de) 2008-07-15
JP4538501B2 (ja) 2010-09-08
US20130177940A1 (en) 2013-07-11
DE602005008071D1 (de) 2008-08-21
EP1778839A1 (en) 2007-05-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101010425B (zh) 多肽的c-末端修饰
Kawata et al. Amino‐acid sequence of ribonuclease T2 from Aspergillus oryzae
Guzmán et al. Peptide synthesis: chemical or enzymatic
Hara-Nishimura et al. A unique vacuolar processing enzyme responsible for conversion of several proprotein precursors into the mature forms
US20070031879A1 (en) Novel enterokinase cleavage sequences
US20100159564A1 (en) Protease resistant recombinant bacterial collagenases
Eugster et al. Production and characterization of two major Aspergillus oryzae secreted prolyl endopeptidases able to efficiently digest proline-rich peptides of gliadin
AU2020242724A1 (en) Aminoacyl-tRNA synthetase for efficiently introducing lysine derivative in protein
US6906176B2 (en) Enterokinase cleavage sequences
Seidah et al. The cDNA structure of the porcine pro-hormone convertase PC2 and the comparative processing by PC1 and PC2 of the N-terminal glycopeptide segment of porcine POMC
CN1125466A (zh) 生产酶的方法
CN110093336B (zh) 一种稳定的胰蛋白酶及其制备方法
CN101412994B (zh) 使用粒酶b蛋白酶切割融合蛋白
US7939295B2 (en) Methods for reducing immunogenicity of polypeptides
EP3650541A1 (en) Trypsin mutant for c- and n-terminal modification of polypeptides
čeřovský et al. Enzymatic semisynthesis of dicarba analogs of calcitonin
AU618035B2 (en) A method for the selective cleavage of fusion proteins
US6531294B1 (en) Preparation of pancreatic procarboxypeptidase B, isoforms and muteins thereof and their use
Mil'Gotina et al. Glutamyl endopeptidases: structure, function, and practical application
US6428997B1 (en) Aminopeptidase derived from Bacillus licheniformis and process for preparation of natural type proteins
Fité et al. Integrated process for the enzymatic synthesis of the octapeptide PhAcCCK‐8
CN111996132A (zh) 一种解脂耶氏酵母表面展示方法
EP1173572B1 (en) Method of removing n-terminal alanine residues from polypeptides with aeromonas aminopeptidase
Berdal et al. Patterns of extracellular proline-specific endopeptidases in Legionella and Flavobacterium spp. demonstrated by use of chromogenic peptides
US6743600B1 (en) Method of removing N-terminal alanine residues from polypeptides with Aeromonas aminopeptidase

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1110888

Country of ref document: HK

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: GR

Ref document number: 1110888

Country of ref document: HK

ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: YOUKEDISI BIOLOGICAL SCIENCE CO., LTD.

Free format text: FORMER OWNER: BORDUSA FRANK

Effective date: 20131011

Owner name: BORDUSA FRANK

Free format text: FORMER OWNER: F. HOFFMANN-LA ROCHE AG

Effective date: 20131011

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20131011

Address after: Austria Vienna

Patentee after: Jukko Edith Bio Science Co.,Ltd.

Address before: German Rossbach

Patentee before: Frank Bodusa

Effective date of registration: 20131011

Address after: German Rossbach

Patentee after: Frank Bodusa

Address before: Basel, Switzerland

Patentee before: Hoffman-La Roche Ltd.