JP2008508871A5

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Publication number: JP2008508871A5
Application number: JP2007524304A
Authority: JP
Filing date: 2005-08-12
Publication date: 2010-06-03
Anticipated expiration: 2025-08-12

Description

最近、酵素系のペプチド連結反応および／またはＣ末端修飾のさらにいくつかのやり方が記載されている。Breddamおよび共働者（例えばUS 5,985,627）は、蛍光またはアフィニティーラベルでのペプチドのＣ末端修飾におけるセリンプロテアーゼカルボキシペプチダーゼ Y（CPD-Y）の使用を記載する。この修飾は、ポリペプチドのＣ末端のアミノ酸を段階的に切断するCPD-Yの特殊能力に基づく。従ってこの方法は、ポリペプチドのＣ末端の修飾のための特異的なツールであるとみなされ得る。CPD-Yは、ペプチド-アシル-酵素-中間体の形成下にＣ末端アミノ酸を切断する。このアシル-酵素-中間体は求核攻撃の際、アシル基を除去され、アミド基転移反応をもたらす。所望のアミド基転移反応は、加水分解のような（不要な）副反応と同時に起こり得る。また、一つ以上のＣ末端アミノ酸が切断される可能性もあり、一方、またこの方法によってアミノ酸が付加され得る（Stennicke, H. R.ら, Anal. Biochem. 248 (1997) 141-148 および Buchardt, O.ら, US 5,580,751）。

本発明の修飾されたトリプシンは、対応する天然のトリプシンと比較した時に改良されたアシル基転移をすることができる。本明細書で使用される場合、「アシル基転移」は、求核試薬により、ペプチドフラグメントＣ末端からトリプシン切断部位へ変換される反応である。アシル基転移反応としては、チオール交換反応、エステル交換反応およびアミド基転移反応が挙げられる。「アミド基転移反応」は、アミド結合が求核試薬と標的ペプチド基質の間で形成される時に起こる。アミド基転移反応において、求核試薬はアミノ酸である必要はない。アミド基転移の重要な下位群としての「ペプチド転移」は、求核試薬が、アミノ酸、またはアミノ酸エステルもしくはアミノ酸アミド等のアミノ酸の誘導体である時に起こる。

「アシル化転移」または「アシル化転移した」という用語は、標的ペプチド（Xaa₁）のＣ末端アミノ酸が求核試薬に共有結合を介して結合することを示すのに用いられる。求核試薬がチオールである場合は、アシル化転移はチオレーションであり、求核試薬がヒドロキシル基を含む場合は、アシル化転移はエステル化であり、求核試薬がアミンである場合は、アシル化転移はアミド基転移である。アミド基転移反応は非常に重要で、本発明による好ましい態様を代表する。

実施例3
トリプシンバリアント Tn K60E、E151H、N143H、D189Kによって触媒される、Arg-NH₂ によるAla-Ala-Tyr-Arg-His-Ala-Glyのアミド基転移
ペプチドAla-Ala-Tyr-Arg-His-Ala-Glyを、実施例2に記載のようにFmoc-化学を用いた従来の固相ペプチド合成および予め加えたWang-樹脂によって合成した。それぞれのアミノ酸構成ブロックは市販されており、種々の供給業者から購入した。Arg-NH₂ は、Bachem (スイス)の市販品であった。

実施例6
トリプシンバリアント Tn K60E、E151H、N143H、D189Kによって触媒されるArg-His-Ala-Lys(6-CF)-OHによるBz-Ala-Ala-Tyr-Arg-His-Ala-Glyのアミド基転移
Bz-Ala-Ala-Tyr-Arg-His-Ala-Glyは、Fmoc-化学を用いた従来の固相ペプチド合成および予め加えたWang-樹脂により合成した。それぞれのアミノ酸構成ブロックは市販されており、種々の供給業者から購入した。Arg-His-Ala-Lys(6-CF)-OH を、フラグメント縮合(fragment condensation)によって合成した。保護されたトリペプチドBoc-Arg(Boc)₂-His(Trt)-Ala-OHを、従来の固相ペプチド合成を用いてクロロトリチル-樹脂上で合成した。塩化メチレン/酢酸/トリフルオロ酢酸 (v/v/v 8/1/1)を含む40 mlのカクテルで２回、ペプチドを樹脂から切断した。粗製物を、逆相HPLCにより精製した。他のフラグメントFmoc-Lys(6-カルボキシ-フルオレセイン)の合成を、3 mlのジオキシンおよび3 mlのDMF中、0.6 mmol Fmoc-Lys*HCl、0,655 mMol 6-カルボキシフルオレセイン (Molecular Probesから購入)から行なった。ピペリジンおよび逆相HPLCにより精製した粗製物を用いてFmoc-基を切断した。次いで、保護されたトリペプチドを、DMF中1当量のHBTU (Iris Biotech)および3当量のジイソプロピルエチルアミンで活性化した。1当量のLys(6-カルボキシ-フルオレセイン)を添加し、混合物を室温で2時間攪拌した。次いで、脱保護カクテル(18 mlのトリフルオロ酢酸、0.5 mlの水および0.5 mlのエタンジチオール)を用いて脱保護を行なった。ペプチドを、ジイソプロピルエーテルを用いて沈殿させ、RP-HPLCにより精製し、良好な収率で得た。

実施例7
トリプシンバリアント Tn K60E、E151H、N143H、D189Kによって触媒されるArg-His-Gly-PEGによるAKTAAALHIL VKEEKLALDL LEQIKNGADF GKLAKKHSIC PSGKRGGDLG EFRQGQMVPA FDKVVFSCPV LEPTGPLHTQ FGYHIIKVLY RHのアミド基転移
Arg-His-Gly-PEGを、Boc-Arg(Boc)₂-His(Trt)-Gly-OHのフラグメント縮合およびNektar/Shearwaterから購入したアミノ-PEG (20kD)により合成した。保護されたトリペプチドの合成およびフラグメントの活性化については実施例6を参照のこと。ここでは、0.5当量のアミノ-PEG (20 kD)を、求核試薬として用いた。脱保護後(カクテルについては実施例6を参照)、RP-HPLCを用いてすべての低分子不純物を分離した。

図1は、突然変異トリプシノーゲンの発現に用いたクローニングベクターである。左側に、トリプシノーゲンのコード領域を含む大腸菌シャトルベクターpSTの概略図を示す。該コード領域は、酵母内でのポリペプチド発現に最適化されたpYT-vectorに容易に挿入され得る。トリプシノーゲンのコード領域を含むpYT-ベクターの概略図をこの図の右側に示す。図2は、アミド基転移の速度論であり、a) 100μM EDTAまたはb) 100μM ZnCl2の存在下でのAla-Ala-Tyr-Arg-NH2 (丸)をもたらすトリプシンバリアント Tn K60E、E151H、N143H、D189Kによって触媒される、Arg-NH2によるAla-Ala-Tyr-Arg-His-Ala-Gly (三角)のアミド基転移の時間的経過である。四角は、タンパク質分解による反応の副生成物として形成されるAAYを表す。図3は、触媒活性に対するZn²⁺の影響である。トリプシンバリアント Tn K60E、E151H、N143H、D189Kによるペプチドターンオーバーの速度に対するZn²⁺イオンの存在(灰色バー)または非存在(黒いバー)の影響を示す。図4は、トリプシンバリアント Tn K60E、E151H、N143H、D189K触媒性(catalyzed)によって触媒される反応速度に対する認識配列の影響である。本発明によるバリアントトリプシンを、切断部位またはその付近に異なるペプチド配列を有するペプチド基質に対する触媒活性について試験した。ペプチド消費の初期速度(v)をnM/分で示す。図5は、Bz-Ala-Ala-Tyr-Arg-His-Lys (6-CF)-OHの質量スペクトルである。

Claims

アミド基転移反応を実施するように機能し得る突然変異トリプシンであって、該突然変異トリプシンは、キモトリプシン命名法によるK60位およびD189位にアミノ酸置換、ならびにN143位もしくはE151位またはN143位およびE151位の両方にヒスチジンによるアミノ酸置換を含み、K60位は、EまたはDで置換され、D189位は、K、HまたはRで置換され、キモトリプシン命名法によるアミノ酸60位、189位、143位、および151位は、それぞれ、配列番号：１に示される配列の43位、171位、123位、および131位に対応し、該突然変異トリプシンは、配列番号：１に示される配列と少なくとも90％の配列相同性を有する、突然変異トリプシン。
請求項１記載の突然変異トリプシンの基質としての、標的ペプチドおよび切断部位Xaa₁-Xaa₂-His（式中、Xaa₁はL、YまたはFであり、Xaa₂はRまたはKである）を含む制限部位ペプチドを含み、前記制限部位ペプチドが前記標的ペプチドのC末端のアミノ酸Xaa₁で標的ペプチドと重なる、ポリペプチドの使用。
(a) 標的ペプチドおよび切断部位Xaa₁-Xaa₂-His（式中、Xaa₁はL、YまたはFであり、Xaa₂はRまたはKである）を含む制限部位ペプチドを含み、前記制限部位ペプチドが前記標的ペプチドのC末端のアミノ酸Xaa₁で標的ペプチドと重なるポリペプチドを提供する工程、
(b) 前記ポリペプチドを、Xaa₁後の内部タンパク質分解性(endoproteolytic)切断、およびエンドプロテアーゼと標的ペプチドとのペプチド-アシル-酵素中間体の形成を可能にする条件下で、請求項１記載の突然変異トリプシンと接触させる工程、
(c) 適切な求核試薬を添加する工程、および
(d) 求核攻撃および標的ペプチドのC末端への前記求核試薬の結合時、ペプチド-アシル-酵素中間体から突然変異トリプシンを放出する工程
を含む、C末端がアミド基転移した標的ペプチドの生成方法。
修飾を含む前記求核試薬が、アミノ酸アミド、ペプチド、ペプチドアミド、標識、標識されたアミノ酸アミド、標識されたペプチド、標識されたペプチドアミド、およびポリエチレングリコールからなる群より選択される、請求項３記載の方法。
請求項１記載の突然変異トリプシンをコードするヌクレオチド分子。