PL205294B1 - Izolowany lub oczyszczony polipeptyd, oczyszczony lub izolowany polinukleotyd, wektor, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza, sposób wytwarzania polipeptydu, sposoby identyfikowania czynnika obniżającego, modulującego lub hamującego aktywność, zastosowanie takiego czynnika, izolowany kwas nukleinowy, obejmujący go wektor i ich zastosowanie, sposoby zmniejszania komórkowego wytwarzania beta amyloidu i zastosowanie antysensownego reagenta - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest izolowany lub oczyszczony polipeptyd, oczyszczony lub izolowany polinukleotyd, wektor, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza, sposób wytwarzania polipeptydu, sposoby identyfikowania czynnika obniżającego, modulującego lub hamującego aktywność, zastosowanie takiego czynnika, izolowany kwas nukleinowy, obejmujący go wektor i ich zastosowanie, sposoby zmniejszania komórkowego wytwarzania beta amyloidu i zastosowanie antysensownego reagenta.

Choroba Alzheimera (AD) powoduje postępującą demencję z następującym tworzeniem się płytek amyloidowych, splątków neurofibrylarnych, glejozą i utratą neuronów. Choroba występuje w postaci zarówno uwarunkowanej genetycznie jak i sporadycznej, których przebieg kliniczny i cechy patologiczne są bardzo podobne. Dotychczas odkryto trzy geny, które po zmutowaniu powodują autosomalną dominującą postać choroby Alzheimera. Kodują one białko prekursorowe amyloidu (APP) i dwa spokrewnione białka, presenilinę-1 (PS1) i presenilinę-2, które, jak sugeruje to ich nazwa, są zarówno strukturalnie, jak i funkcjonalnie spokrewnione. Mutacje w dowolnym z tych trzech genów zwiększają proteolityczną obróbkę APP przez wewnątrzkomórkowy szlak, który prowadzi do wytworzenia peptydu - amyloidu beta określonego jako peptyd Αβ (zwanego tu czasami Abeta), 40-42 aminokwasowego peptydu, który jest głównym składnikiem płytek amyloidowych w AD. Rozregulowanie wewnątrzkomórkowych szlaków proteolitycznej obróbki może odgrywać centralną rolę w patofizjologii AD. W przypadku tworzenia się płytek, mutacje w APP, PS1 albo PS2, konsekwentnie zmieniają proteolityczną obróbkę APP, zwiększając wytwarzanie Ae 1-42, postaci peptydu Λβ, która wydaje się szczególnie amyloidogenna, a zatem bardzo istotna w AD. Różne postaci APP w zakresie wielkości od 695 do 770 aminokwasów, lokalizują się na powierzchni komórki i mają pojedynczą C-końcową domenę transbłonową. Peptyd Abeta pochodzi z regionu APP sąsiadującego z domeną transbłonową i zawierającego jej część. Normalnie, obróbka APP w miejscach cięcia dla α-sekretazy prowadzi do cięcia w regionie środkowym sekwencji Λβ sąsiadującej z błoną i uwalnia z powierzchni komórki rozpuszczalną, zewnątrzkomórkową domenę APP. Ta obróbka APP z udziałem α-sekretazy prowadzi do powstania rozpuszczalnej APP-α i jest to normalne, więc nie sądzi się, aby przyczyniało się do AD.

Patologiczna obróbka APP w miejscach dla β i γ sekretazy daje inny wynik niż obróbka w miejscu α. Następująca kolejno obróbka w miejscach dla β i γ sekretazy uwalnia peptyd Ae, peptyd prawdopodobnie bardzo ważny w patogenezie AD. Obróbka w miejscach dla β i γ sekretazy może odbywać się zarówno w endoplazmatycznym retikulum (w neuronach), jak i w szlaku endosomalnym/lizosomalnym po pobraniu APP z powierzchni komórki do wnętrza (we wszystkich komórkach). Pomimo intensywnych wysiłków trwających ponad 10 lat zidentyfikowania enzymów odpowiedzialnych za obróbkę APP w miejscach β i γ z wytworzeniem peptydu Ae, proteazy te pozostawały nieznane do czasu tego ujawnienia. Tu po raz pierwszy donosimy o identyfikacji i scharakteryzowaniu enzymu sekretazy β. Ujawniamy niektóre znane i niektóre nowe ludzkie proteazy aspartylowe, które mogą działać jako sekretazy β i po raz pierwszy wyjaśniamy rolę, którą te proteazy odgrywają w AD. Opisujemy regiony proteaz krytyczne dla ich unikalnej funkcji i po raz pierwszy charakteryzujemy ich substrat. Jest to pierwszy opis wyrażonego wyizolowanego oczyszczonego aktywnego białka tego typu, testów, które wykorzystują to białko i dodatkowo identyfikacji i wytwarzania przydatnych linii komórkowych i inhibitorów.

Izolowany lub oczyszczony polipeptyd według wynalazku obejmuje sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z:

(a) sekwencji aminokwasowej przedstawionej na Fig. 2 (Id. Sekw. Nr: 6) (b) sekwencji aminokwasowej przedstawionej na Fig. 3 (Id. Sekw. Nr: 4) (c) fragmentów (a) i (b), które wykazują aktywność proteazy aspartylowej; i (d) konserwatywnie podstawionych wariantów (a)-(c) mających sekwencję aminokwasową identyczną z (a) lub (b) lub (c) za wyjątkiem konserwatywnych podstawień, przy czym konserwatywnie podstawiony wariant wykazuje aktywność proteazy aspartylowej.

Korzystnie polipeptyd obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną na Figurze 3 (Id. Sekw. Nr: 4) lub obejmujące jej fragment, który zachowuje aktywność proteazy aspartylowej.

Korzystnie polipeptyd obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną na Figurze 2 (Id. Sekw. Nr: 6) lub obejmujące jej fragment, który zachowuje aktywność proteazy aspartylowej.

Bardziej korzystnie poniżej opisane fragmenty obejmują tripeptydy DTG i DSG centrum aktywnego proteazy aspartylowej Asp-2, przy czym polipeptyd wykazuje aktywność proteazy aspartylowej włączonej w obróbkę APP do beta amyloidu.

PL 205 294 B1

Korzystnie polipeptyd obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną na Figurze 2 (Id. Sekw. Nr: 6) lub Figurze 3 (Id. Sekw. Nr: 4).

Korzystnie konserwatywnie podstawiony wariant obejmuje sekwencję aminokwasową przynajmniej w 95% identyczną z (a) lub (b) lub (c).

Korzystnie polipeptyd jest wytworzony sposobem obejmującym etapy: hodowania komórki gospodarza transformowanej lub transfekowanej kwasem nukleinowym kodującym polipeptyd w ostrych warunkach, przy czym komórka wyraża polipeptyd kodowany przez kwas nukleinowy, a kwas nukleinowy obejmuje sekwencję nukleotydową, która koduje polipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną na Figurze 2 (Id. Sekw. Nr: 6) lub Figurze 3 (Id. Sekw. Nr: 4) i izolowania wyrażanego polipeptydu.

Korzystnie polipeptyd obejmuje fragment sekwencji aminokwasowej białka Asp-2 o Id. Sekw. Nr: 4 lub Id. Sekw. Nr: 6, przy czym fragment obejmuje tripeptydy DTG i DSG centrum aktywnego proteazy aspartylowej i wykazuje aktywność proteazy aspartylowej włączonej w obróbkę APP do beta amyloidu, a polipeptydowi brak domeny transbłonowej, i polipeptyd wykazuje aktywność proteazy aspartylowej włączonej w obróbkę APP do beta amyloidu.

Korzystnie polipeptyd obejmuje aminokwasy 93 do 291 z Id. Sekw. Nr: 4.

Korzystnie polipeptyd obejmuje aminokwasy 93 do 266 z Id. Sekw. Nr: 6.

Korzystnie polipeptyd obejmuje sekwencję aminokwasową w przynajmniej 90% identyczną z fragmentem sekwencji aminokwasowej proteazy aspartylowej przedstawionej na Figurze 3 (Id. Sekw. Nr: 4) lub na Figurze 2 (Id. Sekw. Nr: 6) przy czym fragment obejmuje tripeptydy DTG i DSG centrum aktywnego proteazy aspartylowej i wykazuje aktywność proteazy aspartylowej Asp-2 włączonej w obróbkę APP do beta amyloidu, a różnice podstawień pomiędzy sekwencją aminokwasową polipeptydu i sekwencją aminokwasową fragmentu stanowią konserwatywne podstawienia i przy czym polipeptyd wykazuje aktywność proteazy aspartylowej włączonej w obróbkę APP do beta amyloidu.

Korzystnie polipeptyd obejmuje sekwencję aminokwasową przynajmniej w 95% identyczną z fragmentem sekwencji proteazy aspartylowej przedstawionej na Figurze 3 (Id. Sekw. Nr: 4) lub Figurze 2 (Id. Sekw. Nr: 6);

przy czym fragment obejmuje tripeptydy DTG i DSG centrum aktywnej proteazy aspartylowej i wykazuje aktywność proteazy aspartylowej Asp-2 włączonej w obróbkę APP do beta amyloidu, a różnice podstawień pomiędzy sekwencją aminokwasową polipeptydu i sekwencją aminokwasową fragmentu stanowią konserwatywne podstawienia, przy czym polipeptyd wykazuje aktywność proteazy aspartylowej włączonej w obróbkę APP do beta amyloidu.

Korzystnie w opisanych polipeptydach brak jest domeny transbłonowej.

Wynalazek dotyczy też izolowanego lub oczyszczonego polipeptydu, który obejmuje sekwencję aminokwasową, która jest w przynajmniej 95% identyczna z fragmentem sekwencji białka z Id. Sekw. Nr: 4 lub Id. Sekw. Nr: 6, przy czym fragment obejmuje tripeptydy DTG i DSG centrum aktywnego proteazy aspartylowej i wykazuje aktywność proteazy aspartylowej włączonej w obróbkę APP do beta amyloidu, a polipeptydowi brak domeny transbłonowej, przy czym polipeptyd wykazuje aktywność proteazy aspartylowej włączonej w obróbkę APP do beta amyloidu.

Korzystnie polipeptydy ponadto obejmują peptyd sygnałowy i/lub ponadto obejmują heterologiczny znacznik peptydowy.

W zakres wynalazku wchodzi również oczyszczony lub izolowany polinukleotyd obejmujący sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd według wynalazku.

Korzystnie sekwencja nukleotydową tego polinukleotydu obejmuje nukleotydy 277 do 873 z Id. Sekw. Nr: 3, lub nukleotydy 277 do 798 z Id. Sekw. Nr: 5.

Wynalazek dotyczy również oczyszczonego lub izolowanego polinukleotydu, obejmującego sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje w następujących ostrych warunkach z sekwencją komplementarną do sekwencji z Id. Sekw. Nr: 3 lub Id. Sekw. Nr: 5:

(1) hybrydyzacja w 42°C w buforze hybrydyzacyjnym obejmującym 6xSSC i 0,1% SDS i (2) przemywanie w 65°C w roztworze do przemywań obejmującym 1xSSC i 0,1% SDS; przy czym polinukleotyd koduje polipeptyd, któremu brak domeny transbłonowej i który wykazuje aktywność proteazy aspartylowej włączonej w obróbkę APP do beta amyloidu. Korzystnie polinukleotydy według wynalazku koduje polipeptyd, który obejmuje tripeptydy DTG i DSG centrum aktywnego proteazy aspartylowej.

PL 205 294 B1

W zakres wynalazku wchodzi również oczyszczony lub izolowany polinukleotyd obejmujący sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje w następujących ostrych warunkach z sekwencją komplementarną do sekwencji z Id. Sekw. Nr: 3 lub Id. Sekw. Nr: 5:

(1) hybrydyzacja w 42°C w buforze hybrydyzacyjnym obejmującym 6xSSC i 0,1% SDS i (2) przemywanie w 65°C w roztworze do przemywań obejmującym 1xSSC i 0,1% SDS; przy czym polinukleotyd koduje polipeptyd, który obejmuje sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z:

(a) sekwencji aminokwasowej przedstawionej w Id. Sekw. Nr: 4;

(b) sekwencji aminokwasowej przedstawionej w Id. Sekw. Nr: 6;

(c) fragmentu (a) lub (b), który obejmuje tripeptydy DTG i DSG centrum aktywnego protezy aspartylowej włączonej w obróbkę APP do beta amyloidu i (d) konserwatywnie podstawionego wariantu (a) lub (b) lub (c) mającego sekwencję aminokwasowi identyczną z (a) lub (b) lub (c) za wyjątkiem konserwatywnych podstawień, przy czym wariant konserwatywnego podstawienia wykazuje aktywność proteazy aspartylowej włączonej w obróbkę APP do beta amyloidu.

Korzystnie polinukleotyd według wynalazku koduje polipeptyd ponadto zawierający heterologiczny znacznik peptydowy.

Korzystnie polinukleotyd według wynalazku obejmuje sekwencję nukleotydową, która koduje peptyd sygnałowy sfuzowany w ramce z sekwencją nukleotydową kodującą polipeptyd; przy czym peptyd sygnałowy promuje zewnątrzkomórkowe wydzielanie w komórce gospodarza transfekowanej polinukleotydem; a polipeptyd jest wydzielany przez komórkę gospodarza i wykazuje aktywność proteazy aspartylowej włączonej w obróbkę APP do beta amyloidu.

Ponadto wynalazek dotyczy wektora zawierającego polinukleotyd według wynalazku.

W zakres wynalazku wchodzi również wektor ekspresyjny zawierają cy polinukleotyd wedł ug wynalazku, który jest funkcjonalnie połączony heterologiczną sekwencją kontrolującą ekspresję.

Korzystnie polinukleotyd jest funkcjonalnie połączony z heterologiczną sekwencją kontrolną do ekspresji w komórce ssaczego gospodarza, lub w komórce owadziego gospodarza.

Wynalazek dotyczy również komórki gospodarza transformowanej lub transfekowanej polinukleotydom według wynalazku lub wektorem według wynalazku.

Korzystnie komórka gospodarza jest komórką ssaczą lub pochodzi z ludzkiej linii komórkowej.

W zakres wynalazku wchodzi też sposób wytwarzania polipeptydu mającego aktywność proteazy aspartylowej obejmujący hodowanie komórki gospodarza według wynalazku w warunkach, w których komórka wyraża polipeptyd kodowany przez kwas nukleinowy.

Korzystnie ponadto sposób obejmuje izolowanie polipeptydu z komórki lub pożywki wzrostowej.

W zakres wynalazku wchodzi równie ż sposób identyfikowania czynnika, który obniż a aktywność proteazową polipeptydu proteazy aspartylowej kodowanego przez polinukleotyd według wynalazku, obejmujący etapy:

(a) hodowania komórki gospodarza transformowanej lub transfekowanej polinukleotydem w obecności lub nieobecności czynnika badanego, w warunkach w których komórka wyraża polipeptyd i (b) porównania aktywności proteolitycznej polipeptydu wyrażanego przez komórkę w obecności i nieobecnoś ci czynnika badanego, przy czym zmniejszenie aktywno ś ci proteolitycznej w obecnoś ci czynnika badanego identyfikuje go jako czynnik, który obniża aktywność proteolityczną polipeptydu proteazy aspartylowej.

Wynalazek dotyczy również sposobu identyfikowania czynnika obniżającego aktywność proteazową polipeptydu według wynalazku obejmującego etapy:

(a) mierzenia proteolitycznej aktywności polipeptydu w obecności lub nieobecności czynnika badanego; i (b) porównania proteolitycznej aktywności polipeptydu w obecności lub nieobecności czynnika badanego, przy czym zmniejszenie aktywności proteolitycznej w obecności czynnika badanego identyfikuje go jako czynnik, który obniża aktywność proteolityczną polipeptydu proteazy aspartylowej.

W obu sposobach korzystnie proteolityczna aktywność jest to proteolityczna aktywność polipeptydu względem białka prekursorowego amyloidu (APP) jako substratu.

W zakres wynalazku wchodzi też sposób identyfikowania czynnika, który moduluje aktywność proteazy aspartylowej Asp-2 obejmujący etapy:

(a) doprowadzenia do kontaktu proteazy aspartylowej Asp-2 i białka prekursorowego amyloidu (APP) w obecności lub nioeobecności czynnika badanego, przy czym proteaza aspartylowa Asp-2 jest

PL 205 294 B1 rekombinowanym polipeptydem, który wykazuje aktywność proteazy aspartylowej Asp-2 włączonej w obróbkę APP do beta amyloidu i jest wyrażany przez komórkę gospodarza transformowaną lub transfekowaną cząsteczką kwasu nukleinowego, która koduje polipeptyd i która hybrydyzuje w następujących ostrych warunkach hybrydyzacji z sekwencją komplementarną do sekwencji z Id. Sekw. Nr: 3 lub Id. Sekw. Nr: 5:

(1) hybrydyzacji w 42°C w buforze hybrydyzacyjnym obejmującym 6xSSC i 0,1% SDS i (2) przemywania w 65 °C w roztworze do przemywań obejmującym 1xSSC i 0,1% SDS;

(b) określania aktywności proteazy aspartylowej Asp-2 w obróbce APP w obecności lub nieobecności czynnika badanego; i (c) porównania aktywności proteazy aspartylowej Asp-2 w obróbce APP w obecności czynnika badanego z aktywnością w nieobecności czynnika w celu identyfikacji czynników, które modelują aktywność proteazy aspartylowej Asp-2, przy czym modulator, którym jest inhibitor Asp-2, zmniejsza obróbkę APP, a modulator, którym jest agonista Asp-2, zwiększa tę obróbkę.

Korzystnie białko prekursorowe amyloidu jest ludzką izoformą APP.

Korzystnie białko prekursorowe amyloidu obejmuje miejsce cięcia β-sekretazy APP, które obejmuje mutację szwedzką (K >N, M >L).

Korzystnie powyżej opisane białko prekursorowe amyloidu obejmuje dilizynę na C-końcu (KK).

Korzystnie białko prekursorowe amyloidu jest wyrażane przez komórkę.

Korzystnie proteaza z etapu (a) jest oczyszczona i izolowana.

Korzystnie etap doprowadzenia do kontaktu obejmuje hodowanie transformowanej lub transfekowanej komórki, która wyraża proteazę w obecności lub nieobecności czynnika badanego i przy czym białko prekursorowe amyloidu jest wyrażane przez komórkę.

W zakres wynalazku wchodzi również sposób identyfikowania czynnika, który hamuje aktywność obróbki APP przez proteazę obejmujący etapy:

(a) doprowadzenia do kontaktu proteazy z białkiem prekursorowym amyloidu (APP) jako substratem w obecności i nieobecności czynnika badanego, przy czym proteaza stanowi rekombinowany polipeptyd wyrażany przez komórkę transformowaną lub transfekowaną kwasem nukleinowym, który obejmuje sekwencję nukleotydową kodującą proteazę, a proteaza obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w Id. Sekw. Nr: 4 lub Id. Sekw. Nr: 6 lub jej fragment, który wykazuje aktywność proteazy aspartylowej Asp-2 włączonej w obróbkę APP do beta amyloidu, (b) określenia proteolitycznej aktywności proteazy względem substratu APP w obecności lub nieobecności czynnika badanego, i (c) porównania proteolitycznej aktywności obróbki przez proteazę aspartylową w obecności czynnika badanego z aktywnością w nieobecności czynnika badanego w celu zidentyfikowania czynnika, który hamuje aktywność obróbki APP przez proteazę, przy czym zmniejszenie aktywności w obecności czynnika badanego identyfikuje czynnik aktywny, który hamuje aktywność obróbki APP przez proteazę.

Korzystnie proteaza obejmuje sekwencję aminokwasową Asp-2 przedstawioną w Id. Sekw. Nr: 4 albo Id. Sekw. Nr: 6 lub jej fragment, który wykazuje aktywność proteazy Asp-2 włączonej w obróbkę APP do beta amyloidu.

Korzystnie proteaza obejmuje fragment sekwencji z Id. Sekw. Nr: 4, który obejmuje tripeptydy DTG i DSG centrum aktywnego proteazy aspartylowej z sekwencji o Id. Sekw. Nr: 4 i wykazuje aktywność proteazy Asp-2 włączonej w obróbkę APP do beta amyloidu.

Korzystnie proteaza obejmuje fragment sekwencji z Id. Sekw. Nr: 6, który obejmuje tripeptydy DTG i DSG centrum aktywnego proteazy aspartylowej z sekwencji Id. Sekw. Nr: 6 i wykazuje aktywność proteazy Asp-2 włączonej w obróbkę APP do beta amyloidu.

W zakres wynalazku wchodzi również sposób identyfikowania czynnika, który hamuje aktywność obróbki APP przez proteazę obejmujący etapy:

(a) doprowadzenia do kontaktu proteazy z białkiem prekursorowym amyloidu (APP) jako substratem w obecności lub nieobecności czynnika badanego, przy czym proteaza stanowi rekombinowany polipeptyd, który wykazuje aktywność proteazy Asp-2 włączonej w obróbkę APP do beta amyloidu i jest wyrażany przez komórkę transformowaną lub transfekowaną kwasem nukleinowym, który obejmuje sekwencję nukleotydową kodującą proteazę i hybrydyzującą w następujących ostrych warunkach hybrydyzacji z sekwencją komplementarną do sekwencji nukleotydowej przedstawionej w Id. Sekw,. Nr: 3 lub Id. Sekw. Nr: 5:

PL 205 294 B1 (1) hybrydyzacja w 42°C w buforze hybrydyzacyjnym obejmującym 6xSSC i 0,1% SDS i (2) przemywanie w 65°C w roztworze do przemywań obejmującym 1xSSC i 0,1% SDS;

(b) określania aktywności obróbki APP przez proteazę aspartylową Asp-2 w obecności lub nieobecności czynnika testowego; i (c) porównania proteolitycznej aktywności obróbki przez proteazę aspartylową w obecności czynnika badanego z aktywnością w nieobecności czynnika badanego w celu zidentyfikowania czynnika, który hamuje aktywność obróbki APP przez proteazę, przy czym obniżona aktywność w obecności czynnika badanego identyfikuje czynnik, który hamuje aktywność obróbki APP, przez proteazę.

Korzystnie w obu powyższych sposobach identyfikowania czynnika, który hamuje aktywność obróbki APP, proteaza z etapu (a) jest oczyszczona i izolowana, bardziej korzystnie proteaza w obu sposobach jest zasadniczo wolna od innych proteaz.

Korzystnie komórka obejmuje wektor, który zawiera kwas nukleinowy.

Korzystnie w obu sposobach etap doprowadzenia do kontaktu obejmuje hodowanie transformowanej lub transfekowanej komórki, która wyraża proteazę, w obecności lub nieobecności czynnika badanego.

Korzystniej substrat APP stanowi polipeptyd APP wyrażany przez komórkę.

Korzystnie etap określania obejmuje pomiar produkcji peptydu beta amyloidu przez komórkę w obecnoś ci lub nieobecnoś ci czynnika badanego.

Bardziej korzystnie komórka gospodarza jest komórką z linii komórkowej nerki zarodka ludzkiego 293 (HEK 293).

W obu powyż szych sposobach i ich korzystnych wykonaniach substrat APP obejmuje miejsce obróbki beta amyloidu (A-beta).

Korzystnie substrat APP jest peptydem obejmującym miejsce cięcia APP przez β-sekretazę.

Bardziej korzystnie substrat APP obejmuje mutację szwedzką (K >N, M >L).

Korzystnie miejsce cięcia β-sekretazy obejmuje wzór P2-P1'-P2', w którym P2 jest aminokwasem wybranym z K i N;

P1 jest aminokwasem wybranym z M i L;

P1' jest aminokwasem D; a

P2' jest aminokwasem A.

Korzystnie peptyd obejmuje sekwencję aminokwasową KMDA (Id. Sekw. Nr: 58 pozycje 4-7), lub obejmuje sekwencję aminokwasową EVKMDAEF (Id. Sekw. Nr: 58).

Korzystnie peptyd obejmuje sekwencję aminokwasową NLDA (Id. Sekw. Nr: 54 pozycje 4-7).

Korzystnie peptyd obejmuje sekwencję aminokwasową SEVNLDAEFR (Id. Sekw. Nr: 54).

Korzystnie substrat APP jest substratem fluorogennym lub chromogennym lub jest wyrażany przez komórkę i obejmuje dilizynę C-końca (KK), przy czym etap doprowadzania do kontaktu obejmuje hodowanie komórki, która wyraża proteazę i substrat APP w obecności i nieobecności czynnika badanego.

Korzystnie sposób obejmuje ponadto wytwarzanie kompozycji czynnika zidentyfikownego jako inhibitor proteazy i farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika.

W zakres wynalazku wchodzi również zastosowanie czynnika zidentyfikownego jako inhibitor aktywności proteazy aspartylowej za pomocą sposobu identyfikowania według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia choroby Alzheimera.

Wynalazek dotyczy też izolowanego kwasu nukleinowego obejmującego sekwencję nukleotydową o długości od 15 do 100 nukleotydów, przy czym kwas nukleinowy hybrydyzuje z co najmniej 15 sąsiadującymi nukleotydami z sekwencji z Id. Sekw. Nr: 3 albo Id. Sekw. Nr: 5 lub z sekwencji do niej komplementarnej w następujących warunkach hybrydyzacji:

inkubacja przez 2,5 godziny w roztworze hybrydyzacyjnym obejmującym 6xSSC i 0,1% SDS i przemywanie w 65°C w roztworze do przemywań obejmującym 1,0xSSC i 0,1% SDS;

przy czym kwas nukleinowy zmniejsza obróbkę beta amyloidu (Abeta) w komórkach HEK293-SwKK transfekowanych kwasem nukleinowym w porównaniu z obróbką Abeta w nietransfekowanych komórkach HEK293-SwKK.

Korzystnie kwas nukleinowy ma długość 15 do 30 nukleotydów lub 20 do 30 nukleotydów.

Korzystnie cząsteczka izolowanego kwasu nukleinowego obejmuje sekwencję komplementarną do sekwencji z Id. Sekw. Nr: 3.

Korzystniej izolowany kwas nukleinowy obejmuje DNA lub RNA.

PL 205 294 B1

Korzystnie izolowany kwas nukleinowy zmniejsza obróbkę Abeta (1-40) w transfekowanych komórkach o co najmniej 50% w porównaniu z komórkami nietransfekowanymi.

Korzystnie zmniejsza on obróbkę Abeta (1-42) w transfekowanych komórkach o co najmniej 50% w porównaniu z komórkami nietransfekowanymi.

Wynalazek dotyczy ponadto wektora obejmującego izolowany kwas nukleinowy według wynalazku.

W zakres wynalazku wchodzi również sposób zmniejszania komórkowego wytwarzania beta amyloidu (A.beta) z białka prekursorowego amyloidu (APP), który obejmuje etap transformowania lub transfekowania komórek in vitro kompozycją obejmującą reagent antysensowny zmniejszający wytwarzanie polipeptydu Asp-2 przez zmniejszenie transkrypcji lub translacji w komórkach, przy czym zmniejszone wytwarzanie polipeptydu Asp-2 w komórkach koreluje ze zmniejszoną obróbką APP do A. beta.

Ponadto w zakres wynalazku wchodzi sposób zmniejszania komórkowego wytwarzania beta amyloidu (A. Beta) z białka prekursorowego amyloidu (APP), który obejmuje etap transformowania lub transfekowania komórek in vitro kompozycją obejmującą izolowany kwas nukleinowy lub zawierający go wektor według wynalazku w ilości zmniejszającej wytwarzanie polipeptydu Asp-2 przez zmniejszenie transkrypcji lub translacji Asp-2 w komórkach, przy czym zmniejszone wytwarzanie polipeptydu Asp-2 w komórkach koreluje ze zmniejszoną komórkową obróbką APP do A. beta.

Korzystnie oba powyższe sposoby ponadto obejmują etap identyfikowania ssaczych komórek, które wytwarzają A. beta przed etapem transformowania lub transfekowania.

Korzystnie komórką jest komórka neutralna.

Korzystnie w sposobie zmniejszania komórkowego wytwarzania beta amyloidu (A.beta) z białka prekursorowego amyloidu (APP) antysensowny reagent obejmuje oligonukleotyd obejmujący sekwencję kwasu nukleinowego o pojedynczej nici wiążącą się z Hu-Asp mRNA lub wiążącą się z Hu-Asp DNA.

Wynalazek dotyczy też zastosowania izolowanego kwasu nukleinowego lub wektora według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia choroby Alzheimera.

Wynalazek dotyczy również zastosowania antysensownego reagenta zmniejszającego wytwarzanie beta amyloidu z białka prekursorowego amyloidu (APP) do wytwarzania leku do leczenia choroby Alzheimera.

Sposób identyfikowania komórki, którą można zastosować do poszukiwania inhibitorów aktywności sekretazy β, obejmuje:

(a) identyfikowanie komórki, która wyraża proteazę zdolną do cięcia APP w miejscu dla sekretazy β, obejmujące:

i) zebranie komórek albo supernatantu znad komórek, które mają być identyfikowane, ii) zmierzenie produkcji danego peptydu, który jest wybrany z grupy składającej się bądź z C-końcowego peptydu APP, bądź rozpuszczalnej APP, iii) wyselekcjonowanie komórek, które wytwarzają dany peptyd.

W niniejszym opisie ujawniono również izoformy APP.

W cytowanych opisach, izoforma oznacza dowolny polipeptyd APP, włączają c w to warianty

APP (łącznie z mutacjami) i fragmenty APP, które występują u ludzi, takie jak opisane w US 5,766,846, kol. 7, wiersz 45-67.

Niniejszy wynalazek dotyczy kwasów nukleinowych i cząsteczek zawierających polinukleotyd, który koduje polipeptyd wybrany z grupy składającej się z ludzkich proteaz aspartylowych. Ludzkie proteazy w szczególności obejmują proteazę aspartylową 1 (Hu-Asp1) i dwa warianty alternatywnego składania ludzkiej proteazy aspartylowej 2 (Hu-Asp-2), oznaczone tu jako Hu-Asp-2(a) i Hu-Asp-2(b). W niniejszym opisie wszelkie odniesienia do „Hu-Asp” powinny być rozumiane jako dotyczą ce wszystkich: Hu-Aspl, Hu-Asp-2(a) i Hu-Asp-2(b). Ponadto, wszelkie odniesienia do „Hu-Asp-2” powinny być rozumiane jako dotyczące Hu-Asp-2(a) i Hu-Asp-2(b). Najwyższy poziom ekspresji Hu-Asp1 ma miejsce w tkankach trzustki i prostaty, natomiast Hu-Asp-2(a) i Hu-Asp-2(b) są wyrażane najsilniej w tkankach trzustki i mózgu. Wynalazek ten dotyczy również wyizolowanych polipeptydów Hu-Asp-2 (a) i Hu-Asp-2(b), jak również ich fragmentów, które wykazują aktywność proteazy aspartylowej.

W innym aspekcie, wynalazek dotyczy wyizolowanej czą steczki kwasu nukleinowego zawierającej polinukleotyd, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z polinukleotydem kodującym Hu-Asp-2(a) i Hu-Asp-2(b) lub ich fragmentami ale ujawniono również polinukleotydy, które hybrydyzują w ostrych warunkach z polinukleotydem kodującym Hu-Asp1. Europejskie zgłoszenie patentowe EP 0 848 062 ujawnia polipeptyd określany jako „Asp 1”, który wykazuje znaczną homologię z Hu-Asp1, podczas

PL 205 294 B1 gdy międzynarodowe zgłoszenie W098/22597 ujawnia polipeptyd określany jako „Asp 2”, który wykazuje znaczną homologię z Hu-Asp-2(a).

Niniejszy wynalazek dotyczy również wektorów zawierających wyizolowane cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku, komórki gospodarza, do których można wprowadzać wektory i metody rekombinowania DNA w celu otrzymania polipeptydów Hu-Asp-2(a) i Hu-Asp-2(b), obejmujące hodowanie opisanych powyżej komórek gospodarza i izolowanie odpowiedniego polipeptydu.

Krótki opis listy sekwencji

Id. Sek. Nr:1 - ludzka Asp-1, sekwencja nukleotydowa

Id. Sek. Nr:2 - ludzka Asp-1, przewidywana sekwencja aminokwasowa

Id. Sek. Nr:3 - ludzka Asp-2(a), sekwencja nukleotydowa

Id. Sek. Nr:4- ludzka Asp-2(a), przewidywana sekwencja aminokwasowa

Id. Sek. Nr:5 - ludzka Asp-2(b), sekwencja nukleotydowa

Id. Sek. Nr:6- ludzka Asp-2(b), przewidywana sekwencja aminokwasowa

Id. Sek. Nr:7 - mysia Asp-2(a), sekwencja nukleotydowa

Id. Sek. Nr:8- mysia Asp-2(a), przewidywana sekwencja aminokwasowa

Id. Sek. Nr:9 - ludzka APP695, sekwencja nukleotydowa

Id. Sek. Nr:10- ludzka APP695, przewidywana sekwencja aminokwasowa

Id. Sek. Nr:11- ludzka APP695-Sw, sekwencja nukleotydowa

Id. Sek. Nr:12- ludzka APP695-Sw, przewidywana sekwencja aminokwasowa

Id. Sek. Nr:13 - ludzka APP695-VF, sekwencja nukleotydowa

Id. Sek. Nr:14 - ludzka APP695-VF, przewidywana sekwencja aminokwasowa

Id. Sek. Nr:15 - ludzka APP695-KK, sekwencja nukleotydowa

Id. Sek. Nr:16 - ludzka APP695-KK, przewidywana sekwencja aminokwasowa

Id. Sek. Nr:17 - ludzka APP695-Sw-KK, sekwencja nukleotydowa

Id. Sek. Nr:18 - ludzka APP695-Sw-KK, przewidywana sekwencja aminokwasowa

Id. Sek. Nr:19 - ludzka APP695-VF-KK, sekwencja nukleotydowa

Id. Sek. Nr:20 - ludzka APP69S-VF-KK, przewidywana sekwencja aminokwasowa

Id. Sek. Nr:21 - T7-ludzka-pro-Asp-2(a).-\TM, sekwencja nukleotydowa

Id. Sek. Nr:22 - T7-ludzka-pro-Asp-2(a^TM, sekwencja aminokwasowa

Id. Sek. Nr:23 - T7-kaspaza-ludzka-pro-Asp-2(a^TM, sekwencja nukleotydowa

Id. Sek. Nr:24 - T7- kaspaza-ludzka-pro-Asp-2(a^TM, sekwencja aminokwasowa

Id. Sek. Nr:25 - ludzka-pro-Asp-2(a^TM (niska zawartość GC), sekwencja nukleotydowa

Id. Sek. Nr:26 - ludzka-pro-Asp-2(a^TM (niska zawartość GC), sekwencja aminokwasowa

Id. Sek. Nr:27 - T7-kaspaza-miejsce cięcia dla kaspazy 8-ludzka-pro-Asp-2(a^TM, sekwencja nukleotydowa

Id. Sek. Nr:28 - T7-kaspaza-miejsce cięcia dla kaspazy 8-ludzka-pro-Asp-2(a^TM, sekwencja aminokwasowa

Id. Sek. Nr:29 - ludzka Asp-2(a).-\TM, sekwencja nukleotydowa

Id. Sek. Nr:30 - ludzka Asp-2(a).-\TM, sekwencja aminokwasowa

Id. Sek. Nr:31 - ludzka Asp-2(a).-\TM(His)₆, sekwencja nukleotydowa

Id. Sek. Nr:32 - ludzka Asp-2(a).-\TM(His)₆, sekwencja aminokwasowa

Id. Sek. Nr:33-46 są opisane poniżej w szczegółowym opisie wynalazku

Krótki opis figur

Fig. 1: Na Fig. 1 pokazano sekwencję nukleotydowa (Id. Sek. Nr:1) i przewidywaną sekwencję aminokwasowa (Id. Sek. Nr:2) ludzkiej Asp1.

Fig. 2: Na Fig. 2 pokazano sekwencję nukleotydowa (Id. Sek. Nr:3) i przewidywaną sekwencję aminokwasowa (Id. Sek. Nr:4) ludzkiej Asp-2(a).

Fig. 3: Na Fig. 3 pokazano sekwencję nukleotydowa (Id. Sek. Nr:5) i przewidywaną sekwencję aminokwasowa (Id. Sek. Nr:6) ludzkiej Asp-2(b). Przewidywana domena transbłonowa Hu-Asp-2(b) jest zawarta w nawiasach.

Fig. 4: Na Fig. 4 pokazano sekwencję nukleotydowa (Id. Sek. Nr:7) i przewidywaną sekwencję aminokwasowa (Id. Sek. Nr:8) mysiej Asp-2 (a).

Fig. 5: Na Fig. 5 pokazano dopasowanie BestFit przewidywanej sekwencji aminokwasowej Hu-Asp-2(a) i mysiej Asp-2(a).

Fig. 6: Na Fig. 6 pokazano sekwencję nukleotydową (Id. Sek. Nr:21) i przewidywaną sekwencję aminokwasową (Id. Sek. Nr:22) T7-ludzka-pro-Asp-2(a).-\TM.

PL 205 294 B1

Fig. 7: Na Fig. 7 pokazano sekwencję nukleotydową (Id. Sek. Nr:23) i przewidywaną sekwencję aminokwasową (Id. Sek. Nr:24) T7- kaspaza-ludzka-pro-Asp-2(a^TM.

Fig. 8: Na Fig. 8 pokazano sekwencję nukleotydową (Id. Sek. Nr:25) i przewidywaną sekwencję aminokwasową (Id. Sek. Nr:26) ludzka-pro-Asp-2(a^TM (niska zawartość GC)

Fig. 9: Western biot pokazujący obniżenie wytwarzania CTF99 przez komórki HEK125.3 transfekowane antysensownymi oligomerami nakierowanymi na mRNA Hu-Asp-2.

Fig. 10: Filtr Western pokazujący wzrost wytwarzania CTF99 przez mysie komórki Neuro-2a kotransfekowane APP-KK z Hu-Asp-2 i bez Hu-Asp-2 jedynie w komórkach kotransfekowanych Hu-Asp-2. Dalszy wzrost wytwarzania CTF99 jest widoczny w komórkach kotransfekowanych APP-Sw-KK z Hu-Asp-2 i bez Hu-Asp-2 jedynie w komórkach kotransfekowanych Hu-Asp-2.

Fig. 11: Na Fig. 11 pokazano przewidywaną sekwencję aminokwasową (Id. Sek. Nr:30) ludzka Asp-2(a^TM.

Fig. 12: Na Fig. 12 pokazano przewidywaną sekwencję aminokwasową (Id. Sek. Nr:30) ludzka Asp-2(a)ATM(His)6.

Dalej zostanie przedstawionych kilka definicji stosowanych w tym wynalazku, z których większość jest stosowana tak, jak są zwykle używane przez specjalistów w tej dziedzinie.

Peptyd-amyloid β oznacza dowolny peptyd będący wynikiem cięcia APP przez beta sekretazę. Obejmuje to peptydy złożone z 39, 40, 41, 42 i 43 aminokwasów, rozciągających się od miejsca cięcia dla β-sekretazy do 39, 40, 41,42 i 43 aminokwasów. Peptyd-amyloid β oznacza również sekwencje 1-6, Id. Sek. Nr:1-6 z patentu USA 5,750,349 wydanego 12 maja 1998. Ujawniony tu fragment po cięciu przez β-sekretazę jest nazywany CTF99 i rozciągają się od miejsca cięcia dla β-sekretazy do końca karboksylowego APP.

Gdy omawia się izoformę APP, wówczas oznacza to dowolny polipeptyd APP, włączając w to warianty APP (łącznie z mutantami) i fragmenty APP, które występują u ludzi, takie jak opisane w patencie USA 5,766,846, vol. 7, wiersze 45-67.

Stosowany tu termin „białko prekursorowe amyloidu β” (APP) oznacza polipeptyd, który jest kodowany przez gen o tej samej nazwie, zlokalizowany u człowieka na długim ramieniu chromosomu 21 i który zawiera eAP” - tutaj „białko amyloidu β”, patrz powyżej, w obrębie jego jednej trzeciej części karboksylowej. APP jest glikozylowanym białkiem, z pojedynczym białkiem transbłonowym wyrażanym w bardzo wielu komórkach w wielu tkankach u ssaków. Znane obecnie przykłady specyficznych izotypów APP u człowieka to 695-aminokwasowy polipeptyd opisany przez Kang et. A1. (1987) Nature 325:733-736, który jest oznaczony jako „normalne” APP; 751-aminokwasowy polipeptyd opisany przez Ponte et a1. (1988) Nature 331:525-527 (1988) i Tanzi et al. (1988) Nature 331:528-530; oraz 770-aminokwasowy polipeptyd opisany przez Kitaguchi et al. (1988) Nature 331:530-532. Przykłady specyficznych wariantów APP obejmują mutacje punktowe, które mogą różnić się od siebie zarówno pozycją, jak i fenotypem (praca przeglądowa, patrz Hardy (1992) Nature Genet. 1:233-234). Stosowany tu termin „fragmenty APP” dotyczy fragmentów APP innych niż te składające się jedynie z βAP albo fragmentów βAP. To znaczy, fragmenty APP będą obejmowały sekwencje aminokwasowe APP poza tymi, które tworzą nienaruszony βAP albo fragment βAP.

Gdy stosowany jest termin „dowolny aminokwas”, aminokwas ma być wybrany spośród następujących aminokwasów oznaczonych symbolem trzyliterowym i może być też stosowany symbol jednoliterowy:

Alanina, Ala, A; Arginina, Arg, R; Asparagina, Asp, N; Kwas asparaginowy, Asp, D; Cysteina, Cys, C; Glutamina, Gin, Q; Kwas glutaminowy, Glu, E; Glicyna, Gly, G; Histydyna, His, H; Izoleucyna, Ile, I; Leucyna, Leu, L; Lizyna, Lys, K; Metionina, Met, M; Fenyloalanina, Phe, F; Prolina, Pro, P; Seryna. Ser, S; Treonina, Thr, T; Tryptofan, Trp, W; Tyrozyna, Tyr, Y; Walina, Val, V; Kwas asparaginowy albo asparagina, Asx, B; Kwas glutaminowy albo glutamina, Glx, Z; Dowolny aminokwas, Xaa, X.

W dalszej części opisano sposób przeszukiwania baz danych genów pod względem prostego motywu centrum aktywnego charakterystycznego dla proteaz aspartylowych. Eukariotyczne proteazy aspartylowe, takie jak pepsyna i renina, mają strukturę dwudomenową, która fałduje się w sposób pozwalający na umieszczenie dwóch reszt aspartylowych w pobliżu centrum aktywnego. Znajdują się one w krótkim motywie tripeptydowego DTG, lub rzadziej - DSG. Większość proteaz aspartylowych występuje jako proenzym, którego N-koniec musi zostać odcięty, aby stały się aktywne. Motyw centrum aktywnego DTG lub DSG występuje około reszty 65-70 w proenzymie (proreninie, pepsynogenie), a około reszty 25-30 w enzymie aktywnym po odcięciu N-końcowej prodomeny. Ograniczona długość motywu centrum aktywnego utrudnia przeszukiwanie zbiorów krótkich sekwencji (EST)

PL 205 294 B1 w kierunku nowych proteaz aspartylowych. Sekwencje EST mają zwykle ś rednio 250 nukleotydów lub mniej, zatem kodują 80-90 reszt aminokwasowych lub mniej. Są zatem za krótkie, aby sekwencja mogła objąć dwa motywy centrum aktywnego. Korzystne jest przeszukanie bazy danych hipotetycznych lub uzyskanych ze składania sekwencji kodujących białka. W niniejszym opisie opisano metodę komputerową do znalezienia proteaz aspartylowych - kandydatów w bazach danych sekwencji białek. Metoda została użyta do identyfikacji siedmiu sekwencji kandydatów proteaz aspartylowych w genomie Caenorhabditis elegans. Sekwencji tych użyto następnie do identyfikacji przez poszukiwanie względem homologii Hu-Asp1 i dwóch wariantów powstających w wyniku alternatywnego składania Hu-Asp-2, określonych tu jako Hu-Asp-2(a) i Hu-Asp-2(b).

Główny aspekt wynalazku odnosi się do nowych informacji dotyczących obróbki APP. Patologiczna obróbka białka prekursora amyloidu (APP) na szlaku Αβ wymaga kolejnego działania dwóch proteaz określonych jako β-sekretaza i γ-sekretaza. Cięcie APP przez β-sekretazę i γ-sekretazę daje odpowiednio N-koniec i C-koniec peptydu. Ponieważ nadmiernemu wytwarzaniu peptydu Λβ, szczególnie Ae_1-42, przypisuje się rolę w wywoływaniu choroby Alzheimera, inhibitory β-sekretazy i/lub γ-sekretazy mają potencjalne działanie lecznicze w chorobie Alzheimera. Pomimo znaczenia β-sekretazy i γ-sekretazy w patologicznej obróbce APP, jak dotąd nie określono tych enzymów na poziomie molekularnym. Znaczy to, że nie było wiadomo, jakie enzymy są wymagane do cięcia w miejscach β-sekretazy lub γ-sekretazy. Same miejsca były znane, ponieważ znane były APP oraz peptyd Ae42, patrz opisy patentowe USA 5 766 846 i 5 837 672. Nie był natomiast znany enzym, jaki powoduje powstawanie peptydu Ae_1-42.

Niniejszy wynalazek dotyczy molekularnego określenia kilku nowych ludzkich proteaz aspartylowych, a jedna z nich, określona jako Hu-Asp-2(a) i Hu-Asp-2(b), została scharakteryzowana szczegółowo. Wcześniej znane postaci asp1 i Asp-2 zostały ujawnione, patrz EP 0848062 A2 i EP 0855444 A2, wynalazcy David Powel i in., przekazany na rzecz Smith Kline Beecham Corp. Ujawniamy tutaj stare i nowe postacie Hu-Asp-2. Po raz pierwszy zostały one wyrażone w aktywnej postaci, ujawnione są ich substraty i ich specyficzność. Przed ujawnieniem tego wynalazku do cięcia w miejscu cięcia β-sekretazy wymagane były komórki lub ekstrakty komórkowe, teraz w badaniach może być stosowane oczyszczone białko, co również tu opisano. W oparciu o wyniki (1) doświadczeń z wyłączaniem aktywności genu za pomocą sekwencji antysensownych, (2) doświadczeń z wyłączaniem aktywności genu w przejściowej transfekcji i (3) doświadczeń biochemicznych z użyciem oczyszczonej rekombinowanej Hu-Asp-2, wykazujemy, że Hu-Asp-2 jest β-sekretazą zaangażowaną w obróbkę APP. Choć opisywano sekwencję nukleotydową i przewidywaną sekwencję aminokwasową Hu-Asp-2(a), patrz wyżej, patrz EP 0848062 A2 i EP 0855444 A2, nie ujawniono charakterystyki funkcjonalnej enzymu. Tutaj autorzy charakteryzują enzym Hu-Asp-2 i są w stanie wytłumaczyć, dlaczego jest krytycznym i zasadniczym enzymem wymaganym do powstawania peptydu Aβ_1-42 i możliwe, że krytycznym czynnikiem w rozwoju AD.

W innym wykonaniu, opisano tu również nowy wariant składania Hu-Asp-2, opisywany jako Hu-Asp-2(b), nigdy przedtem nie ujawniony.

Ujawniono też wyizolowane cząsteczki kwasu nukleinowego zawierającego polinukleotyd kodujący polipeptyd wybrany z grupy składającej się z ludzkiej proteazy aspartylowej 1 (Hu-Asp-1). Wynalazek dotyczy dwóch, powstających w wyniku alternatywnego składania, wariantów ludzkiej proteazy aspartylowej 2 (Hu-Asp-2), opisywanych tu jako Hu-Asp-2(a) i Hu-Asp-2(b). Użyte tu wszystkie odniesienia do „Hu-Asp-2” powinny być rozumiane jako dotyczące zarówno Hu-Asp-2(a), jak i Hu-Asp-2(b). Hu-Asp-1 jest wyrażana najobficiej w tkankach trzustki i prostaty, podczas gdy Hu-Asp-2(a) i Hu-Asp-2(b) są wyrażane najobficiej w tkankach trzustki i mózgu. W opisie ujawniono również wyizolowany polipeptyd Hu-Asp-1, a wynalazek dotyczy wyizolowanych polipeptydów Hu-Asp-2(a) i Hu-Asp-2(b), jak również ich fragmentów wykazujących aktywność proteazy aspartylowej.

Przewidywane sekwencje aminokwasowe Hu-Asp-1, Hu-Asp-2(a) i Hu-Asp-2(b) wykazują znaczącą homologię z wcześniej zidentyfikowanymi ssaczymi proteazami aspartylowymi, takimi jak pepsynogen A, pepsynogen B, katepsyna D, katepsyna E i renina. P.B. Szecs, Scand. J. Clin. Lab.Invest. 52: Suppl.2105-22 (1992). Enzymy te charakteryzuje obecność podwójnego motywu sekwencji DTG/DSG. Ujawnione tu polipeptydy Hu-Asp-1 i Hu-Asp-2 również wykazują niezwykle wysoką homologię z motywem konsensusowym ProSite dla proteaz aspartylowych pobranych z bazy danych SwissProt.

Sekwencja nukleotydowa określona jako reszty 1-1554 Id. Sekw. Nr:1 odpowiada sekwencji nukleotydowej kodującej Hu-Asp-1, sekwencja nukleotydowa określona jako reszty 1-1503 Id. Sekw. Nr:3 odpowiada sekwencji nukleotydowej kodującej Hu-Asp-2(a), a sekwencja nukleotydowa określona

PL 205 294 B1 jako reszty 1-1428 Id. Sekw. Nr:5 odpowiada sekwencji nukleotydowej kodującej Hu-Asp-2(b). Wyodrębnienie i sekwencjonowanie DNA kodującego Hu-Asp-1, Hu-Asp-2(a) i Hu-Asp-2(b) jest opisane poniżej w Przykładach 1 i 2.

Jak opisano w Przykładach 1 i 2, do otrzymania sekwencji nukleotydowej Hu-Asp-1, Hu-Asp-2(a) i Hu-Asp-2(b) zastosowano metody automatycznego sekwencjonowania. Sekwencje nukleotydowe Hu-Asp otrzymano dla obu nici DNA i uważa się że są dokładne w 100%. Jednakże, jak wiadomo w tej dziedzinie, sekwencje nukleotydowe otrzymane automatycznymi metodami mogą zawierać pewne błędy. Sekwencje nukleotydowe określone automatycznie zwykle są co najmniej w około 90%, najczęściej przynajmniej w około 95% do około 99,9% identyczne z rzeczywistą sekwencją nukleotydowa danej cząsteczki kwasu nukleinowego. Rzeczywistą sekwencję można dokładniej ustalić stosując ręczne metody sekwencjonowania, znane dobrze w dziedzinie. Błąd w sekwencji wynikający z insercji bą d ź delecji jednego lub wię cej nukleotydów moż e powodować przesunię cie ramki odczytu w translacji, tak ż e przewidywana sekwencja aminokwasowa będzie się różniła od przewidywanej na podstawie rzeczywistej sekwencji nukleotydowej danej cząsteczki kwasu nukleinowego, zaczynając od miejsca zmiany. DNA Hu-Asp według wynalazku obejmuje cDNA, chemicznie syntetyzowany DNA, DNA otrzymany przez PCR, genomowy DNA i ich kombinacje. Genomowy DNA można uzyskać przez przeszukiwanie biblioteki genomowej opisanym tutaj cDNA Hu-Asp-2, stosując dobrze znane w dziedzinie metody, lub dzięki oligonukleotydom wybranym z sekwencji Hu-Asp-2, które będą starterami reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Niniejszy wynalazek obejmuje również RNA transkrybowany z Hu-Asp DNA.

W związku ze zdegenerowaniem kodu genetycznego, dwie róż niące się od siebie sekwencje DNA mogą wciąż kodować identyczne sekwencje aminokwasowe. W związku z tym wynalazek dotyczy izolowanych polinukleotydów o sekwencji kodującej polipeptyd Hu-Asp odpowiadający sekwencji aminokwasowej Id. Sekw. Nr:4, Id. Sekw. Nr:6, pełnej lub jej fragmentom.

Zastrzega się tu również oczyszczone polipeptydy Hu-Asp, zarówno rekombinowane jak i nierekombinowane. Co najważniejsze, zastrzega się sposoby wytwarzania polipeptydów Hu-Asp-2 w aktywnej postaci. Obejmuje to wytwarzanie polipem-tydów Hu-Asp-2 i ich wariantów w komórkach bakteryjnych, owadzich lub ssaczych, również w postaci umożliwiającej wydzielanie polipeptydu Hu-Asp-2 z komórek bakteryjnych, owadzich lub ssaczych do pożywki hodowlanej, jak również sposoby wytwarzania wariantów polipeptydu Hu-Asp-2 przez włączanie znaczników aminokwasowych ułatwiających następujące potem oczyszczanie. W korzystnym wykonaniu wynalazku polipeptyd Hu-Asp-2 jest przekształcany w formę aktywną proteolitycznie bądź w transformowanych komórkach, bądź po oczyszczeniu i przecięciu przez drugą proteazę w systemie poza komórkowym, a takie aktywne postaci polipeptydu Hu-Asp-2 zaczynają się od sekwencji N-końcowej TQHGIR lub ETDEEP. Warianty i pochodne, w tym fragmenty, białek Hu-Asp o natywnej sekwencji aminokwasowej podanej w SEkw. Id. Nr 4, i 6, utrzymują ce jaką kolwiek aktywność biologiczną Hu-Asp są również w zakresie wynalazku. Oczywiście specjalista w dziedzinie będzie mógł łatwo określić, czy wariant, pochodna, lub fragment białka Hu-Asp wykazuje aktywność Hu-Asp poddając wariant, pochodną, lub fragment standardowemu testowi proteazy aspartylowej. Fragmenty Hu-Asp pozostające w zakresie wynalazku obejmują te, które zawierają domenę centrum aktywnego zawierająca sekwencję aminokwasową DTG, te które zawierają domenę centrum aktywnego o sekwencji aminokwasowej DSG, fragmenty zawierające obie sekwencje centrum aktywnego DTG i DSG, fragmenty w których wydłużono odstęp dzielący sekwencje centrum aktywnego DTG i DSG, fragmenty w których skrócono odstęp. Również w zakresie wynalazku pozostają fragmenty Hu-Asp, w których domena transbłonowa została usunięta, aby umożliwić wytwarzanie Hu-Asp-2 w formie rozpuszczalnej. W innym wykonaniu wynalazku, dwie połówki HuAsp-2, każda zawierająca pojedyncze centra aktywne o sekwencji DTG lub DSG, mogą być wytwarzane osobno jako zrekombinowane polipeptydy, a następnie połączone w roztworze, w którym odtwarzają aktywną proteazę.

Warianty Hu-Asp można otrzymać, na przykład, przez mutację natywnych sekwencji nukleotydowych kodujących Hu-Asp. Wariant Hu-Asp, opisywany tutaj, jest polipeptydem zasadniczo homologicznym z natywnym polipeptydem Hu-Asp, ale o sekwencji aminokwasowej różniącej się od natywnej Hu-Asp wskutek jednej lub więcej delecji, insercji lub podstawień w sekwencji aminokwasowej. Wariant sekwencji aminokwasowej lub nukleotydowej jest korzystnie przynajmniej w 80% identyczny, bardziej korzystnie przynajmniej w 90% identyczny, najbardziej korzystnie przynajmniej w 95% identyczny z natywną sekwencją Hu-Asp. Zatem, wariant sekwencji nukleotydowej zawierający, na przykład, 5 mutacji punktowych na każde sto nukleotydów w porównaniu z natywnym genem Hu-Asp,

PL 205 294 B1 będzie w 95% identyczny z natywnym białkiem. Procent identyczności sekwencji, nazywany również homologią, między sekwencją natywną a wariantem Hu-Asp może być również określony, przykładowo, przez porównanie dwóch sekwencji przy użyciu któregokolwiek z programów komputerowych zwykle używanych w tym celu, jak program Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, wersja 8 dla Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wisconsin), stosujący algorytm Smitha i Watermana. (Adv. Appl. Math. 2: 482-489 (1981)).

Zmiana natywnej sekwencji aminokwasowej może być uzyskana którąkolwiek z licznych znanych technik. Przykładowo, mutacje mogą być wprowadzone w szczególne miejsca sposobami dobrze znanymi specjalistom w dziedzinie, jak ukierunkowana mutageneza z użyciem oligonukleotydów, opisana przez Walder et al. (Gene 42: 133 (1986); Bauer et al. (Gene 37:73 (1985)); Craik (BioTechniques, styczeń 1985, str. 12-19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principies and Methods, Plenum Press (1981)); oraz patenty USA nr 4,518,584 i 4,737,462.

Pozostające w zakresie wynalazku warianty Hu-Asp mogą zawierać konserwatywnie podstawiane sekwencje, co znaczy że jedna lub więcej reszt aminokwasowych polipeptydu Hu-Asp jest zastąpiona inną resztą nie zaburzającą drugorzędowej i/lub trzeciorzędowej struktury polipeptydu Hu-Asp. Takie podstawienia mogą obejmować zastąpienie aminokwasu resztą o podobnych właściwościach fizykochemicznych, jak podstawienie jednej reszty alifatycznej (Ile, Val, Leu, Ala) inną, lub podstawienie między zasadowymi resztami Lys i Arg, kwaśnymi resztami Glu i Asp, resztami amidowymi Gln i Asn, resztami hydroksylowymi Ser i Tyr lub resztami aromatycznymi Phe i Tyr. Dalsze informacje dotyczące tworzenia fenotypowo cichych zmian aminokwasów można znaleźć w Bowie et al. Science 247:1306-1310 (1990). Innymi wariantami Hu-Asp, które mogą zachowywać podstawowe aktywności biologiczne Hu-Asp są te, w których podstawienia aminokwasowe utworzono w obszarach poza regionami funkcjonalnymi białka.

W innym aspekcie wynalazek dotyczy wyizolowanego polinukleotydu hybrydyzującego w ostrych warunkach do części cząsteczek kwasu nukleinowego opisanych powyżej, np. do przynajmniej około 15 nukleotydów, korzystnie do przynajmniej około 20 nukleotydów, bardziej korzystnie do przynajmniej około 30 nukleotydów, jeszcze bardziej korzystnie do przynajmniej od około 30 do przynajmniej około 100 nukleotydów jednej z wcześniej opisanych cząsteczek kwasu nukleinowego. Takie części cząsteczek kwasu nukleinowego o opisanej długości odnosi się do np. co najmniej około 15 następujących po sobie nukleotydów referencyjnej cząsteczki kwasu nukleinowego.

Jako ostre warunki hybrydyzacji rozumie się inkubację przez noc w około 42°C przez około 2,5 godziny w 6XSSC/0,1% SDS, a następnie płukanie filtrów w 1,0XSSC w 65°C, 0,1% SDS.

Fragmenty opisanych tu polinukleotydów kodujących Hu-Asp, jak również polinukleotydy, które mogą z takimi kwasami nukleinowymi hybrydyzować, można zastosować jako sondy lub jako startery w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Takie sondy można zastosować, na przykład, do wykrywania obecności kwasów nukleinowych Hu-Asp w badaniach in vitro, jak również w analizach Southern i northern. Przy pomocy takich sond można również identyfikować typy komórek wyrażających Hu-Asp. Procedury te są dobrze znane i specjaliści w dziedzinie mogą wybrać sondy o długości odpowiedniej do danego zastosowania. Do PCR, startery 5' i 3' odpowiadające końcom żądanej cząsteczki kwasu nukleinowego Hu-Asp są używane do wyodrębnienia i amplifikacji tej sekwencji przy użyciu standardowych metod.

Innymi użytecznymi fragmentami cząsteczek kwasu nukleinowego Hu-Asp są sensowne lub antysensowne oligonukleotydy zawierające sekwencję jednoniciowego kwasu nukleinowego zdolną do wiązania się do docelowego mRNA Hu-Asp (przy użyciu nici sensownej) lub DNA Hu-Asp (przy użyciu nici antysensownej). W korzystnym wykonaniu wynalazku antysensowne oligonukleotydy Hu-Asp zmniejszają mRNA Hu-Asp i w konsekwencji wytwarzanie polipeptydów Hu-Asp.

Zarówno Hu-Asp-1, jak i Hu-Asp-2 posiadają kanoniczne miejsca akceptorowe dla cukrów zawiązanych z Asn, w przypadku Hu-Asp-1 są to dwa takie miejsca, a w Hu-Asp-2 - cztery miejsca. Wyrażane w drożdżowym lub ssaczym systemie ekspresyjnym (omówionym poniżej) Hu-Asp może być podobna do natywnego polipeptydu Hu-Asp masą cząsteczkową i wzorem glikozylacji lub znacząco się od niego różnić. Wyrażanie Hu-Asp w bakteryjnym systemie ekspresyjnym daje nieglikozylowane Hu-Asp.

Polipeptydy według wynalazku są dostarczane w wyizolowanej postaci lub w znacznym stopniu oczyszczone. Polipeptydy Hu-Asp można wyizolować i oczyścić z tkanek, hodowli komórkowych lub hodowli rekombinowanych komórek dobrze znanymi metodami, obejmującymi strącanie etanolem lub siarczanem amonu, anionową lub kationową chromatografię jonowymienną, chromatografię na fosfocelulozie, chromatografię oddziaływań hydrofobowych, chromatografię powinowactwa, chromatografię

PL 205 294 B1 na hydroksyapatycie, chromatografię na lektynie i wysokociśnieniową chromatografię cieczową (HPLC). W korzystnym wykonaniu wynalazku do polipeptydu Hu-Asp dodawany jest znacznik aminokwasowy przy użyciu dobrze znanych specjalistom technik inżynierii genetycznej, obejmujących dodanie sześciu reszt histydynowych pozwalających na oczyszczenie przez wiązanie z unieruchomionym na odpowiednim podłożu niklem, albo epitopy do przeciwciał poliklonalnych bądź monoklonalnych, między innymi epitop T7, epitop myc i epitop V5a oraz fuzje Hu-Asp-2 z odpowiednim białkiem, między innymi transferaza S-glutationowa czy białko wiążące maltozę. W korzystnym wykonaniu wynalazku te dodatkowe sekwencje aminokwasowe dodaje się na C-końcu Hu-Asp, ale mogą zostać dodane również do N-końca lub wewnątrz polipeptydu Hu-Asp-2.

Wynalazek dotyczy również wektorów zawierających polinukleotydy według wynalazku, jak również komórek gospodarzy transformowanych takimi wektorami. Każdy z polinukleotydów według wynalazku może zostać połączony z wektorem, zwykle posiadającym marker selekcyjny i miejsce początku replikacji, do namnażania się w komórkach gospodarza. Wektory obejmują DNA kodujący którykolwiek z opisanych powyżej lub poniżej polipeptydów Hu-Asp, funkcjonalnie połączony z odpowiednimi sekwencjami regulującymi transkrypcję lub translację, takimi jak pochodzące z genów ssaczych, wirusowych, owadzich lub drobnoustrojów. Przykłady sekwencji regulatorowych obejmują promotory transkrypcji, operatory, wzmacniacze, miejsca wiązania rybosomu przez mRNA i odpowiednie sekwencje kontrolujące transkrypcję i translację. Sekwencje nukleotydowe są funkcjonalnie połączone, gdy sekwencja regulatorowa oddziałuje funkcjonalnie z DNA kodującym Hu-Asp. Zatem sekwencja nukleotydowa promotora jest funkcjonalnie połączona z sekwencją DNA Hu-Asp, gdy sekwencja nukleotydowa promotora kieruje transkrypcją sekwencji Hu-Asp.

Wybór odpowiednich wektorów do klonowania polinukleotydów kodujących Hu-Asp lub do ekspresji polipeptydów Hu-Asp, będzie oczywiście zależał od komórki gospodarza, do której wektor ma być transformowany oraz, gdy tego dotyczy, komórki gospodarza, w której polipeptyd Hu-Asp będzie wyrażany. Odpowiednie komórki gospodarze do wyrażania polipeptydów Hu-Asp obejmują prokarionty, drożdże i komórki wyższych eukariontów, które są omówione poniżej.

Polipeptydy Hu-Asp do wyrażania w komórkach gospodarza mogą być również białkami fuzyjnymi, które obejmują regiony białek heterologicznych. Takie regiony mogą być włączone, aby umożliwić np. wydzielanie, poprawić stabilność lub ułatwić oczyszczenie polipeptydu. Przykładowo, można włączyć do wektora ekspresyjnego sekwencję kodującą odpowiedni peptyd sygnałowy. Sekwencja DNA peptydu sygnałowego (lidera sekrecyjnego) może być połączona w ramce odczytu z sekwencją Hu-Asp tak, że Hu-Asp ulega translacji jako białko fuzyjne zawierające peptyd sygnałowy. Peptyd sygnałowy funkcjonujący w odpowiedniej komórce gospodarza promuje zewnątrzkomórkowe wydzielanie Hu-Asp. Korzystnie, sekwencja sygnałowa jest odcinana od polipeptydu Hu-Asp podczas wydzielania Hu-Asp na zewnątrz komórki. Nieograniczające przykłady sekwencji sygnałowych, które mogą mieć zastosowanie w wykorzystaniu wynalazku, obejmują drożdżowy czynnik I oraz pszczeli lider melatynowy w owadzich komórkach sf9.

W korzystnym wykonaniu wynalazku polipeptyd Hu-Asp jest biał kiem fuzyjnym obejmującym region heterologiczny stosowany w celu ułatwienia oczyszczania polipeptydu. Liczne z dostępnych peptydów stosowanych w takim celu pozwalają na wybiórcze wiązanie białka fuzyjnego do odpowiedniego partnera wiążącego. Na przykład, polipeptyd Hu-Asp może być zmieniony tak, by zawierał peptyd, z którym tworzy białko fuzyjne specyficznie wiążące się do odpowiedniego czynnika wiążącego lub znacznika peptydowego. Nieograniczające przykłady takich znaczników peptydowych obejmują znacznik 6-His, znacznik tioredoksynowy, znacznik hemaglutyninowy, znacznik GST, znacznik sekwencji sygnałowej OmpA. Specjaliści w dziedzinie rozumieją, że odpowiedni czynnik wiążący może być jakąkolwiek cząsteczką lub związkiem zawierającym jony metalu (np. kolumny wykorzystujące powinowactwo do metalu), przeciwciałami lub ich fragmentami i jakimkolwiek białkiem lub peptydem wiążącym peptyd, jak np. znacznik FLAG.

Odpowiednie do ekspresji polipeptydu Hu-Asp komórki gospodarza obejmują prokarionty, drożdże i komórki wyższych eukariontów. Odpowiedni do ekspresji Hu-Asp gospodarze prokariotyczni obejmują bakterie z rodzajów Escherichia, Bacillus i Salmonella, jak również członków rodzajów Pseudomonas, Streptomyces i Staphylococcus. Do ekspresji, np. w E. coli, polipeptyd Hu-Asp może zawierać N-końcową resztę metioninową ułatwiającą ekspresję rekombinowanego polipeptydu w gospodarzu prokariotycznym. N-końcowa Met może ewentualnie być odcinana od wyrażanego polipeptydu Hu-Asp. Inne N-końcowe reszty aminokwasowe, które mogą zostać dodane do polipeptydu Hu-Asp, aby ułatwić wyrażanie w E. coli, obejmują, między innymi, sekwencję liderową T7, sekwencję

PL 205 294 B1 liderową T7-kaspaza 8, jak również inne lidery, w tym znaczniki do oczyszczania, jak znacznik 6-His (Przykład 9). Polipeptydy Hu-Asp wyrażane w E. coli mogą być skrócone przez usunięcie końca cytoplazmatycznego, domeny transbłonowej lub bliższego regionu błonowego. Polipeptydy Hu-Asp wyrażane w E. coli można otrzymywać w postaci rozpuszczalnej bądź nierozpuszczalnej, które ewentualnie mogą być obecne w postaci ciałek inkluzyjnych. Nierozpuszczalny polipeptyd można uczynić rozpuszczalnym przez działanie chlorowodorkiem guanidyny, mocznikiem lub innym czynnikiem denaturującym białka, a następnie ponowne sfałdowanie w rozpuszczalnej postaci przed lub po oczyszczeniu przez rozcieńczenie lub dializę w odpowiednim buforze wodnym. Jeśli nieaktywną formę proHu-Asp wytworzono przy pomocy rekombinacji, można ją uczynić aktywną odcinając prosegment drugą odpowiednią proteazą, jak proteaza ludzkiego wirusa niedoboru odporności.

Wektory ekspresyjne do stosowania w komórkach prokariotycznych gospodarzy zwykle zawierają jeden lub więcej genów markerowych pozwalających na selekcję fenotypową. Takie geny zwykle kodują np. białko nadające odporność na antybiotyk lub spełniające auksotroficzne wymaganie pokarmowe. Szeroka gama takich wektorów jest łatwo dostępna u komercyjnych dostawców. Przykłady obejmują wektory pSPORT, wektory pGEM (Promega), wektory pPROEX (LTI, Bethesda, MD), wektory Bluescript (Stratagene), wektory pET(Novagen) i wektory pQE (Qiagen).

Hu-Asp może być również wyrażana w komórkach drożdży z rodzajów obejmujących Saccharomyces, Pichia i Kluveromyces. Korzystnie, komórkami gospodarza są S. cerevisiae i P. pastoris. Wektory drożdżowe często zawierają sekwencję miejsca początku replikacji z drożdżowego plazmidu 2T, autonomicznie replikujące się sekwencje (ARS), region promotorowy, sekwencje odpowiadające za poliadenylację, sekwencje terminacji transkrypcji i selekcyjny gen markerowy. Można również stosować wektory replikujące zarówno w drożdżach, jak i E. coli (tak zwane wektory wahadłowe). Oprócz wspomnianych powyżej cech wektora drożdżowego, wektor wahadłowy zawiera również sekwencje pozwalające na replikację i wydzielanie w E. coli. Bezpośrednie wydzielanie polipeptydów Hu-Asp wyrażanych w komórkach gospodarza można uzyskać przez włączenie sekwencji nukleotydowej kodują cej sekwencję liderową drożdżowego czynnika I, na 5' końcu sekwencji nukleotydowej kodującej Hu-Asp.

Do wyrażania Hu-Asp można również stosować owadzie hodowle komórkowe. W korzystnym wykonaniu wynalazku, polipeptydy Hu-Asp według wynalazku są wyrażane przy użyciu systemu ekspresyjnego komórek owadzich (patrz Przykład 10). Dodatkowo, do wyrażania w komórkach owadzich może zostać użyty bakulowirusowy system ekspresyjny jak opisują Lucków i Summers, Biotechnology 6:47 (1988).

W innym korzystnym wykonaniu wynalazku polipeptyd Hu-Asp jest wyraż any w ssaczych komórkach gospodarza. Przykłady odpowiednich ssaczych linii komórkowych obejmują między innymi linie COS-7 komórek małpiej nerki (Gluzman i in., Cell 23:175 (1981)), ludzkie komórki embrionalne nerki 293 i komórki jajnika chomika chińskiego (CHO). Korzystnie do wyrażania białek Hu-Asp wykorzystuje się komórki jajnika chomika chińskiego (CHO) (Przykład 1).

Wybór odpowiedniego wektora ekspresyjnego do wyrażania polipeptydów Hu-Asp według wynalazku będzie oczywiście konkretnego zależał od szczególnego rodzaju używanych ssaczych komórek gospodarza i jest w kompetencji specjalisty w dziedzinie. Przykłady odpowiednich wektorów obejmują pcDNA3 (Invitrogen) i pSVL (Pharmacia Biotech). Korzystnie, wektorem do wyrażania polipeptydów Hu-Asp jest wektor pcDNA3.1-Hygro (Invitrogen). Wektory ekspresyjne do stosowania w ssaczych komórkach gospodarza mogą obejmować translacyjne i transkrypcyjne sekwencje kontrolujące, pochodzące z genomów wirusowych. Powszechnie stosowane sekwencje promotorowe i wzmacniające, które można zastosować w niniejszym wynalazku, obejmują, między innymi, te pochodzące z ludzkiego cytomegalowirusa (CMV), adenowirusa 2, wirusa polioma i mał piego wirusa 40 (SV40). Sposoby konstruowania ssaczych wektorów ekspresyjnych są ujawnione, na przykład, w Okayama and Berg (Mol.Cell Biol. 3:280 (1983); Cosman et al. (Mol. Immunol 23:935 (1986); Cosman et al. (Nature 312:768 (1984); EP-A-0367566 i WO 91/18982.

Polipeptydy według niniejszego wynalazku mogą być również przydatne do wytwarzania monoklonalnych i poliklonalnych przeciwciał, które są przydatne w testach diagnostycznych do wykrywania ekspresji polipeptydów Hu-Asp. Takie przeciwciała można otrzymywać przy zastosowaniu standardowych technik. Patrz na przykład Antibodies: A Laboratory Manuał, Harlow and Land (wyd.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988); Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al. (wyd.), Plenum Press, New York (1980). Syntetyczne peptydy zawierające części Hu-Asp zawierające od 5 do 20 aminokwasów można również zastosować do otrzymywania monoklonalnych i poliklonalnych przeciwciał po połączeniu

PL 205 294 B1 z odpowiednim białkiem łącznikowym, w tym mię dzy innymi, hemocyjaninę ze skałoczepu (KLH), owoalbuminę z kurczęcia albo albuminę z surowicy bydlęcej, przy zastosowaniu różnych odczynników sieciujących, włączając w to karboimidy, glutaraldehyd, a jeżeli peptyd zawiera cysteinę, N-metylomaleimid. Korzystny peptyd do immunizacji po połączeniu z KHL zawiera na C-końcu Hu-Asp-1 albo Hu-Asp-2 obejmujący QRRPRDPEVVNDESSLVRHRWK albo LRQQHDDFADDISLLK, odpowiednio.

Cząsteczki kwasu nukleinowego Hu-Asp są również ważne dla identyfikacji chromosomów, ponieważ mogą one hybrydyzować ze specyficznym miejscem na ludzkim chromosomie. Hu-Asp1 został zlokalizowany na chromosomie 21, podczas gdy Hu-Asp-2 został zlokalizowany na chromosomie 11q23.3-24.1. Obecnie istnieje potrzeba identyfikowania poszczególnych miejsc na chromosomie, ponieważ jak dotąd dostępnych jest niewiele odczynników stanowiących markery dla chromosomów w oparciu o aktualne dane z sekwencjonowania (polimorfizmy powtórzeń) do oznaczania położenia na chromosomie. Po zmapowaniu sekwencji do precyzyjnego miejsca na chromosomie, fizyczna pozycja sekwencji na chromosomie może być skorelowana z danymi z mapy genetycznej. Powiązania między genami i chorobami, które zostały zmapowane w tym samym regionie chromosomu mogą być następnie identyfikowane przez analizę sprzężeń, gdzie określa się współdziedziczenie sąsiadujących fizycznie genów. To, czy gen, który wydaje się być związany z daną chorobą rzeczywiście powoduje chorobę można określić przez porównanie sekwencji nukleotydowej osobników dotkniętych i niedotkniętych chorobą.

W opisie ujawniono sposób testowania funkcji Hu-Asp, a w szczególnoś ci funkcji Hu-Asp-2, który obejmuje inkubowanie w roztworze polipeptydu Hu-Asp-2 z odpowiednim substratem, w tym między innymi z syntetycznym peptydem zawierającym miejsce cięcia dla β-sekretazy w APP, korzystnie takim, który zawiera mutację znajdowaną w odmianie szwedzkiej wrodzonej AD, w której KM jest zamieniona na NL, gdzie taki peptyd zawiera sekwencję SEVNLDAEFR, w kwaśnym roztworze buforującym, korzystnie kwaśnym roztworze buforującym o pH 5,5 (patrz Przykład 12) przy zastosowaniu cięcia peptydu monitorowanego przez wysokorozdzielczą chromatografię cieczową jako miarę aktywności proteolitycznej Hu-Asp. Testy aktywności proteolitycznej wykorzystują substraty peptydowe do testów z wewnętrznym wygaszaniem, gdzie odpowiednie substraty obejmują peptydy, które mają przyłączoną parę: fluorofor i wygaszasz, w tym, między innymi, kumarynę i dinitrofenol, odpowiednio, tak, że cięcie peptydu przez Hu-Asp prowadzi do wzrostu fluorescencji na skutek fizycznego rozdziału fluorofora i wygaszacza. Testy kolorymetryczne aktywności proteolitycznej Hu-Asp wykorzystują inne substraty, które zawierają aminokwasy P2 i P1 zawierające rozpoznawane miejsce ciecia połączone z o-nitrofenolem przez wiązanie amidowe, tak, że cięcie przez Hu-Asp prowadzi do wzrostu gęstości optycznej po zmianie buforu testowego na pH alkaliczne.

W innym wykonaniu wynalazek dotyczy sposobu identyfikowania czynnika, który zwiększa aktywność polipeptydu Hu-Asp wybranego z grupy składającej się z Hu-Asp-2(a) i Hu-Asp-2(b), obejmującego jako część etapów

a) oznaczenie aktywności takiego polipeptydu Hu-Asp w obecności testowanego związku i w nieobecności testowanego związku; i

b) porównanie aktywności takiego polipeptydu Hu-Asp oznaczonej w obecności testowanego związku z aktywnością takiego polipeptydu Hu-Asp oznaczoną w nieobecności takiego testowanego związku;

gdzie wyższa aktywność w obecności takiego testowanego związku niż w nieobecności takiego testowanego związku wskazuje, że testowany związek zwiększył aktywność takiego polipeptydu Hu-Asp. Takie testy można przeprowadzić w systemie bezkomórkowym i hodowanych komórkach, które wyrażają Hu-Asp, jak również ich warianty i izoformy.

W innym wykonaniu wynalazek dotyczy sposobu identyfikowania czynnika, który zmniejsza aktywność polipeptydu Hu-Asp wybranego z grupy składającej się z Hu-Asp-2(a) i Hu-Asp-2(b) obejmującego jako część etapów

a) oznaczenie aktywności takiego polipeptydu Hu-Asp w obecności testowanego związku i w nieobecności testowanego związku; i

b) porównanie aktywności takiego polipeptydu Hu-Asp oznaczonej w obecności testowanego związku z aktywnością takiego polipeptydu Hu-Asp oznaczoną w nieobecności takiego testowanego związku;

gdzie niższa aktywność w obecności takiego testowanego związku niż w nieobecności takiego testowanego związku wskazuje, że testowany związek zmniejszył aktywność takiego polipeptydu Hu-Asp.

PL 205 294 B1

Takie testy można przeprowadzić w systemie bezkomórkowym i hodowanych komórkach, które wyrażają Hu-Asp, jak również ich warianty i izoformy.

W innym wykonaniu sposobu według wynalazek stosowana jest nowa linia komórkowa(komórki HEK125.3) do mierzenia obróbki amyloidu β^β) z białka prekursorowego amyloidu (APP). Komórki są stabilnymi transformantami ludzkich komórek z nerki embrionalnej 293 (HEK293) bicistronowym wektorem pochodzącym od pIRES-EGFP (Clontech) zawierającym zmodyfikowane cDNA ludzkiego APP, wewnętrzne miejsce wejścia rybosomu i cDNA wzmocnionego zielonego białka fluoryzującego (EGFP). cDNA APP został zmodyfikowany przez dodanie dwóch kodonów lizynowych do końca karboksylowego sekwencji kodującej APP. To zwiększa 2-4-krotnie powstawanie peptydu ^β) z ludzkiego APP. Ten poziom obróbki peptydu Aβ jest 60 razy większy niż obserwowany w nietransformowanych komórkach HEK293. Komórki HEK125.3 będą przydatne przy testowaniu związków, które hamują obróbkę peptydu Aβ. Możliwe jest również dodanie dwóch reszt lizynowych do końca C innych izoform APP, w tym izoform zawierających 751 i 770 aminokwasów, do izoform APP mających mutacje znalezione w ludzkiej AD, w tym szwedzkie mutacje KM >NL i mutacje V717 >F, do C-końcowych fragmentów APP, takich jak te, które rozpoczynają się od miejsca ciecia dla β-sekretazy, do C-końcowych fragmentów APP, które zostały połączone w sposób funkcjonalny z N-końcowym peptydem sygnałowym w celu wstawienia do błony i wydzielania, oraz z sekwencją repoterową, obejmującą ale nie wyłącznie zielone białko fluorescencyjne albo alkaliczną fosfatazę, tak, że cięcie przez p-sekretazę uwalnia białko reporterowe z powierzchni komórek wyrażających polipeptyd.

P r z y k ł a d y

P r z y k ł a d 1: Rozwój algorytmów przeszukujących przydatnych do identyfikacji proteaz aspartylowych i identyfikacji genów proteaz aspartylowych u C. elegans w Wormpep 12;

Materiały i metody

Klasyczne proteazy aspartylowe, takie jak pepsyna i renina, posiadają strukturę o dwóch domenach fałdujących się tak, że dwie reszty tyłowe znajdują się blisko siebie w centrum aktywnym. Są one otoczone przez krótki trójpeptydowy motyw DTG, lub rzadziej, DSG. Motyw centrum aktywnego DTG lub DSG pojawia się około reszt 25-30 enzymu, ale około reszt 65-70 proenzymu (proreniny, pepsynogenu). Ponownie motyw taki pojawia się około 150-200 reszt dalej. Proenzym ulega aktywacji przez cięcie N-końca prodomeny. Ten wzór daje przykład struktury dwudomenowej nowoczesnych enzymów aspartylowych, które najwyraźniej powstały przez duplikację genów i dywergencję. Tak więc;

NH2-----X D²⁵TG-----------Y-----D^Y+25TG----------C gdzie X oznacza początek enzymu, znajdujący się po N-końcowej prodomenie, a Y oznacza centrum cząsteczki, gdzie znowu zaczyna się powtórzenie genu.

W przypadku enzymów retro wirusowych, takich jak proteaza HIV, posiadają one jedynie połowę struktury o dwóch domenach dobrze znanych enzymów, takich jak pepsyna, katepsyna D, renina itd. Nie posiadają prosegmentu, ale są wycinane z prekursora poliproteinowego zawierającego białka wirusowe gag i pol. Można je przedstawić jako

NH2---------D²⁵TG---------------------C100

Monomer ten ma tylko około 100 aminokwasów, jest więc bardzo prosty w porównaniu z innymi „dimerami” proteaz aspartylowych, które mają 330 lub podobną liczbę aminokwasów, nie licząc N-końcowej prodomeny.

Ograniczona długość motywu centrum aktywnego eukariotycznych proteaz aspartylowych utrudnia przeszukiwanie kolekcji EST (ang. expressed sequence tags), pod kątem nowych sekwencji. Sekwencje EST typowo mają średnią długość 250 nukleotydów, stąd w takim przypadku rzadko będą obejmować oba motywy centrum aktywnego proteaz aspartylowych. Zamiast tego, zwróciliśmy się w kierunku genomu C. elegans. Szacuje się, że genom C. elegans zawiera około 13 000 genów. Z tych, około 12 000 zsekwencjonowano i w bazie danych Wormpep 12 umieszczono odpowiadające im domniemane otwarte ramki odczytu (ORF, ang. open reading frame). Wykorzystaliśmy tę bazę danych jako podstawę przeszukania całego genomu wyższego eukarionta pod kątem nowych proteaz aspartylowych, stosując specjalnie w tym celu opracowany algorytm. Następujący plik wsadowy napisany w języku AWK do lokalizacji białek zawierających dwa motywy DTG lub DSG wykorzystano do przeszukania powtarzanego czterokrotnie w celu odzyskania wszystkich sparowanych kombinacji motywu aspartylowego.

BEGIN {RS=”>”}/*definiuje ”>” jako separator zapisu dla formatu FASTA*/ ^{ pos = indeks($0,”DTG”) /*znajduje ”DTG” w zapisie*/

PL 205 294 B1 if (pos>0) { rest = substr($0,pos+3) /*otrzymuje resztę nagrania po pierwszym DTG*/ pos2 = index(rest,”DTG” /*znajduje drugie DTG*/ if (pos2>0) printf (”%s%s\n”,”>”,$0)} /*przedstawia trafienia*/ ^{} }}

Powyżej przedstawiony plik wsadowy napisany w języku AWK został użyty do przeszukania bazy Wormpep 12, ściągniętej z ftp.sanger.ac.uk/pub/databases/wormpep, pod kątem sekwencji zawierających przynajmniej dwa motywy DTG lub DSG. Stosując język AWK ograniczano każdy zapis do 3000 znaków lub mniej. Tak więc 35, lub podobną liczbę większych zapisów ręcznie wyeliminowano z Wormpep 12, chociaż w innym przypadku było mało prawdopodobne, żeby kodowały proteazy aspartylowe.

Wyniki i dyskusja

Baza danych Wormpep 12 zawiera 12 178 zgłoszeń, chociaż niektóre z nich (<10%) przedstawiają transkrypty tego samego genu, alternatywnie złożone. Oszacowanie liczby genów kodowanych w genomie C. elegans jest rzędu 13 000 genów, więc można ocenić, że Wormpep 12 obejmuje ponad 90% genomu C. elegans.

Eukariotyczne proteazy aspartylowe zawierają strukturę o dwóch domenach, prawdopodobnie powstałą w wyniku duplikacji genów u przodka. Każda domena zawiera motyw centrum aktywnego D(S/T)G umieszczony w pozycji aminokwasowej 20-25 w każdej domenie. Proteazy retrowirusowe (np. proteaza HIV) lub retrotranspozonowe są homodimerami podjednostek homologicznych z pojedynczą domeną eukariotycznej proteazy aspartylowej. Plik wsadowy napisany w języku AWK zastosowano do przeszukania bazy danych Wormpep 12 pod kątem białek, w których motyw D(S/T)G pojawia się przynajmniej dwa razy. Zidentyfikowano >60 białek posiadających dwa motywy DTG lub DSG). Przeglądanie wzrokowe zastosowano do wybrania białek, w których pozycja domen aspartylowych sugerowała strukturę dwudomenową pasującą do wyżej opisanych kryteriów.

Dodatkowo, do przeszukania Wormpep 12 pod kątem kandydatów na proteazy aspartylowe zastosowano wzór centrum aktywnego proteaz aspartylowych PS00141 dla Eukaryota i wirusów pochodzący z PROSITE (Bairoch A., Bucher P., Hofmann K., The PROSITE database: its status in 1997, Nucleic Acids Res. 24:217-221(1997)). W ten sposób uzyskano zachodzący na siebie zestaw sekwencji Wormpep 12. Wśród nich siedem sekwencji zawierało dwa motywy DTG lub DSG i wzór miejsca aktywnego proteaz aspartylowych z PROSITE. Z tych siedmiu, trzy znaleziono w tym samym klonie kosmidowym (F21F8.3, F21F8.4 i F21F8.7) co sugeruje, że reprezentują one rodzinę białek powstałą przez duplikację genów przodków. Dwie inne ORF o rozległej homologii do F21F8.3, F21F8.4 i F21F8.7 obecne są w tej samej grupie genów (F21F8.2 i F21F8.6), jednakże zawierają one jedynie pojedynczy motyw DTG. Wyczerpujące przeszukiwania bazy danych Wormpep 12 za pomocą tych siedmiu sekwencji i z zastosowaniem programu BLAST, nie pozwoliły na uzyskanie dodatkowych kandydatów na proteazy aspartylowe zawierające dwa powtórzenia motywu DTG lub DSG z genomu C. elegans.

Przeszukiwanie baz SWISS-PROT, GenPep i TREMBL każdą z sekwencji C. elegans za pomocą BLASTX ujawniło, że R12H7.2 było najbliższym homologiem znanych proteaz aspartylowych ssaków u robaka, i że T18H9.2 było raczej mniej spokrewnione, gdy CEASP1, F21F8.3, F21F8.4 i F21F8.7 tworzyły podgrupę posiadającą najmniejszą homologię sekwencji z sekwencjami ssaków.

Dyskusja

APP, preseniliny i p35, aktywator cdk5, wszystkie przechodzą obróbkę proteolityczną w miejscach odpowiadających specyficzności substratowej proteazy HIV. Zaburzenie regulacji komórkowej proteazy aspartylowej o tej samej specyficzności substratowej może więc prowadzić do ujednolicającego mechanizmu powodowania patologii płytek i splątków w AD. Tak więc poszukaliśmy nowych ludzkich proteaz aspartylowych. Przeszukiwanie całego genomu C. elegans ujawniło siedem otwartych ramek odczytu pasujących do profilu proteaz aspartylowych, który zidentyfikowaliśmy. Te siedem proteaz aspartylowych prawdopodobnie obejmuje całą zawartość takich proteaz u prostego wielokomórkowego eukarionta. Obejmuje to cztery blisko spokrewnione proteazy aspartylowe unikalne dla C. elegans, powstałe prawdopodobnie przez duplikację genu przodka. Pozostali trzej kandydaci na proteazy aspartylowe (T18H9.2, R12H7.2 i C11D2.2) posiadają homologię do sekwencji genów ssaków.

PL 205 294 B1

P r z y k ł a d 2: Identyfikacja nowych ludzkich proteaz aspartylowych z zastosowaniem przeszukiwania bazy danych przez łączenie genomów

Materiały i metody:

Komputerowa analiza baz danych EST, cDNA i przewidywanych sekwencji białek

Obszerne poszukiwania homologii baz danych EST z sekwencjami CEASP1, F21F8.3, F21F8.4 i F21F8.7 nie ujawniło nowych homologów u ssaków. Przeszukiwanie TBLASTN za pomocą R12H7.2 wykazało homologię do katepsyny D, katepsyny E, pepsynogenu A pepsynogenu C i reniny, szczególnie wokół motywu DTG w obrębie centrum aktywnego, ale także nie pozwoliło na identyfikację dodatkowych nowych proteaz aspartylowych u ssaków. Wskazuje to, że genom C. elegans prawdopodobnie zawiera wyłącznie pojedynczą, lizosomalną proteazę aspartylową, u ssaków reprezentowaną przez rodzinę genów powstałą w wyniku duplikacji i późniejszych modyfikacji genu przodka.

Przeszukiwanie przy użyciu TBLASTN za pomocą T18H9.2, pozostałą sekwencją C. elegans, zidentyfikowało kilka EST -ów składających się w kontig kodujący nową ludzką proteazę aspartylową (Hu-ASP-1). Jak opisano powyżej w Przykładzie 1, przeszukiwanie BLASTX kontigiem Hu-ASP bazy SWISS-PROT ujawniło, że motywy centrum aktywnego w sekwencji pasowały do centrów aktywnych innych proteaz aspartylowych. Obszerne, powtarzane rundy przeszukiwania za pomocą BLASTN baz LifeSeq, LifeSeqFL i publicznych kolekcji EST pozwoliło na zidentyfikowanie 102 EST z wielokrotnych bibliotek cDNA, składających się w pojedynczy kontig. 51 sekwencji w tym kontigu znalezionych w publicznych kolekcjach EST-ów także zostało złożonych w pojedynczy kontig (THC213329) przez The Institute for Genom Research (TIGR). Komentarz TIGR wskazuje, że nie udało się znaleźć żadnych wyników dla tego kontigu w bazie danych. Należy zauważyć, że kontig TIGR jest komplementarnym odwróceniem kontigu, który złożyliśmy z LifeSeq. Przeszukiwanie BLASTN sekwencji EST myszy i szczurów w ZooSeq za pomocą Hu-ASP1 ujawniło homologiczne EST w każdej z baz danych (klon Incyte 700311523 i klon IMAGE 313341, numer dostępu w GenBank W10530, odpowiednio).

Przeszukiwanie TBLAST baz danych LifeSeqFL i publicznej bazy EST złożoną sekwencją DNA dla Hu-ASP1, zidentyfikowało drugą, pokrewną sekwencję ludzką (Hu-Asp-2) reprezentowaną przez pojedyncze EST (2696295). Translacja tej częściowej sekwencji cDNA ujawnia pojedynczy motyw DTG mający homologię do motywu centrum aktywnego wołowej proteazy aspartylowej NM1.

Przeprowadzono przeszukiwania BLAST, składanie kontigu i porównywanie wielu sekwencji stosując narzędzie bioinformatyczne dostarczone z bazami danych LifeSeq, LifeSeqFL i LifeSeq Assembled z Incyte. Przewidziane motywy białkowe zidentyfikowano stosując albo słownik ProSite (Mitofs w GCG 9) lub bazę danych Pfam.

Klonowanie pełnej długości cDNA ludzkiego Ha-Asp1

Otwartej ramki odczytu genu T18H9.2CE z C. elegans użyto do zapytania baz danych Incyte: LifeSeq i LifeSeq-FL i wykryto pojedyncze złożenie elektroniczne oznaczone jako 1863920CE1. Z Incyte uzyskano klon 5', 1863920, z większością cDNA w tym kontigu i całkowicie zsekwencjonowano obie nici. Translacja otwartej ramki odczytu zawartej w klonie 1863920 ujawniła obecność zduplikowanego motywu centrum aktywnego proteazy asparatylowej (DTG/DSG) lecz koniec 5' nie był kompletny. Pozostałą sekwencję kodującą Hu-ASP1 ustalono przez analizę 5' Marathon RACE stosując gotową matrycę cDNA Marathon z ludzkiego łożyska (Clonetech). Antysensowny starter oligonukleotydowy 3' specyficzny dla końca 5' klonu 1863920 tworzył pary z sensownym starterem 5' specyficznym dla adaptora syntetycznego gotowego cDNA Marathon w reakcji PCR. Specyficzne produkty PCR bezpośrednio sekwencjonowano przez sekwencjonowanie cykliczne i uzyskane sekwencje składano z sekwencją klonu 1863920 by uzyskać pełną sekwencję kodującą Hu-Asp-1 (Id. Sekw. nr 1).

W pierwszorzędowej sekwencji aminokwasowej sekwencji Hu-Asp1, obecnych jest kilka interesujących cech (Figura 1, Id. Sekw. Nr 2). Sekwencja zawiera peptyd sygnałowy (reszty 1-20 w Id. Sekw. Nr 2), prosegment i domenę katalityczną zawierającą dwie kopie motywu centrum aktywnego proteazy aspartylowej (DTG/DSG). Odległość między pierwszym i drugim motywem centrum aktywnego wynosi około 200 reszt, które powinny odpowiadać oczekiwanemu rozmiarowi pojedynczej, eukariotycznej domeny proteazy aspartylowej. Co bardziej interesujące, sekwencja zawiera przewidywaną domenę transbłonową (reszty 469-492 w Id. Sekw. Nr 2) blisko końca C sugerującą, że proteaza zakotwiczona jest w błonie. Cechy takiej nie stwierdzono w żadnej innej proteazie aspartylowej.

Klonowanie cDNA Hu-Asp-2 pełnej długości:

Jak opisano powyżej w Przykładzie 1, przeszukiwanie bazy WormPep 12 całego genomu Caenorhabditis elegans pod kątem proteaz aspartylowych, a następnie przeszukiwanie baz ludzkich EST-ów ujawniło ludzki ortolog genu T18H9.2 C. elegans oznaczony jako Hu-Asp1. Złożony kontig dla Hu-Asp1

PL 205 294 B1 użyto do zapytania baz danych ludzkich EST-ów o ludzkie para logi, stosując narzędzie BLAST, i w bazie danych LifeSeq FL uzyskano pojedyncze znaczące przypasowanie (2696295CE1) o wspólnych 60% identyczności. Podobne zapytania albo gb105PubEST albo rodziny ludzkich baz danych osiągalnych z TIGR nie zidentyfikowały podobnych klonów EST. Klon cDNA 2696295 zidentyfikowany przez jednorazową analizę sekwencji z ludzkiej biblioteki cDNA z macicy otrzymano z Incyte i całkowicie zsekwencjonowano obie nici. Klon zawierał niepełną otwartą ramkę odczytu o 1266 bp kodującą polipeptyd o 422 aminokwasach bez inicjatorowego ATG na końcu 5'. Badanie przewidzianej sekwencji ujawniło obecność zduplikowanego motywu centrum aktywnego proteazy aspartylowej DTG/DSG, oddzielonego 194 resztami aminokwasowymi. Następne serie późniejszych wydań bazy EST LifeSeq zidentyfikowały dodatkowe EST-y sekwencjonowane z biblioteki cDNA astrocytów człowieka (4386993), które okazały się zawierać dodatkową sekwencję 5' w stosunku do klonu 2696295. Klon 4386993 otrzymano z Incyte i całkowicie zsekwencjonowano obie nici. Analiza porównawcza klonu 4386993 i klonu 2696295 potwierdziła, że klon 4386993 wydłużył otwartą ramkę odczytu o 31 reszt aminokwasowych zawierających dwa kodony inicjacji translacji w ramce. Mimo obecności dwóch ATG w ramce, nie zaobserwowano kodonu stop w ramce powyżej ATG wskazując, że 4386993 może nie być pełnej długości. Ponadto, porównanie sekwencji klonów 2696295 i 4386993 ujawniło insercję 75 par zasad w klonie 2696295 w stosunku do klonu 4386993 powodującą wstawienie 25 dodatkowych reszt aminokwasowych w 2696295. Pozostałą sekwencję kodującą Hu-Asp-2 ustalono przez analizę 5' Marathon RACE stosując gotową matrycę cDNA Marathon z ludzkiego hipokampa (Clonetech). Antysensowny starter oligonukleotydowy 3' specyficzny dla wspólnego końca 5' klonów 2696295 i 4386993 tworzył pary z sensownym starterem 5' specyficznym dla adaptora syntetycznego gotowego cDNA Marathon w reakcji PCR. Specyficzne produkty PCR bezpośrednio sekwencjonowano przez sekwencjonowanie cykliczne i uzyskane sekwencje składano z sekwencjami klonów 2696295 i 4386993 by uzyskać pełną sekwencję kodującą, odpowiednio, Hu-Asp-2(a) (Id. Sekw. Nr 3) i Hu-Asp-2(b) (Id. Sekw. Nr 5).

W pierwszorzędowej sekwencji aminokwasowej Hu-Asp-2(a) (Figury 2 i Id. Sekw. Nr 4) i Hu-Asp-2(b) (Figura 3, Id. Sekw. Nr 6) obecnych jest kilka interesujących cech. Obie sekwencje zawierają peptyd sygnałowy (reszty 1-21 w Id. Sekw. Nr 4 i Id. Sekw. Nr 6), prosegment i domenę katalityczną zawierającą dwie kopie motywu centrum aktywnego proteazy aspartylowej (DTG/DSG). Odległość między pierwszym a drugim motywem centrum aktywnego różni się z powodu delecji 25 reszt aminokwasowych w Hu-Asp-2(b) i składa się z 168-versus-l94 resztom aminokwasowym, odpowiednio dla Hu-Asp-2(b) i Hu-Asp-2 (a). Co bardziej interesujące, obie sekwencje zawierają przewidywaną domenę transbłonową (reszty 455-477 w Id. Sekw. Nr 4 i 430-452 w Id. Sekw. Nr 6) blisko końca C, wskazującą, że proteaza jest zakotwiczona w błonie. Cechy takiej nie znajduje się w żadnej innej proteazie aspartylowej oprócz Hu-Asp1.

P r z y k ł a d 3: Klonowanie molekularne cDNA i genomowego DNA Asp-2 myszy. Klonowanie i charakterystyka mysiego cDNA Asp-2

Sklonowano mysi ortolog Hu-Asp-2 stosując kombinację przeszukiwania biblioteki cDNA, PCR i klonowania genomowego. Około 500 000 niezależnych klonów z biblioteki cDNA mózgu myszy przeszukano za pomocą sondy z sekwencji kodującej znakowanej ³²P, przygotowanej z Hu-Asp-2. Powtarzalne wyniki pozytywne poddano analizie sekwencji DNA i najdłuższy cDNA zawierał cały region nie ulęgający translacji na końcu 3' i 47 aminokwasów w regionie kodującym.

Amplifikacja PCR tej samej biblioteki cDNA z mózgu myszy przy użyciu antysensownego startera oligonukleotydowego specyficznego dla końca 5' większości sekwencji cDNA ustalonej powyżej i sensownego startera specyficznego dla obszaru 5' ludzkiej sekwencji Asp-2, po której nastąpiła analiza sekwencji DNA, dała dodatkowe 980 bp sekwencji kodującej. Pozostała sekwencja 5' mysiego Asp-2 pochodziła z sekwencji genomowej (patrz poniżej).

Izolacja i analiza sekwencji mysiego genu Asp-2

Mysią sekwencję EST kodującą kawałek cDNA mysiego Asp-2 zidentyfikowano w bazie danych EST GenBank stosując narzędzie poszukiwawcze BLAST i sekwencję kodującą Hu-Asp-2 jako zapytanie. Klon g3160898 wykazywał 88% wspólnej identyczności z sekwencją ludzką, powyżej 352 bp. Następnie zsyntetyzowano pary starterów oligonukleotydowych specyficznych dla tego regionu mysiego Asp-2 i użyto ich do amplifikacji regionów genu mysiego. Mysi genomowy DNA uzyskany ze szczepu 129/SvJ amplifikowano przez PCR (25 cykli) stosując różne zestawy starterów specyficznych dla mysiego Asp-2 i produkt analizowano przez elektroforezę w żelu agarozowym. Zestaw starterów Zoo-1 i Zoo-4 amplifikował fragment 750 bp zawierający około 600 bp sekwencji intronu w oparciu o porównanie z znaną sekwencją cDNA. Ten zestaw starterów wykorzystano następnie do przeszukania, techniką

PL 205 294 B1

PCR, mysiej biblioteki na wektorze BAC i wyizolowano pojedynczy klon genomowy i, poprzez analizę sekwencji DNA, potwierdzono, że klon ten zawiera gen mysiego Asp-2. Sekwencjonowanie DNA techniką „shotgun” tego klonu genomowego Asp-2 i porównanie z cDNA obu: Hu-Asp-2 i częściowej mysiej sekwencji cDNA pozwoliło na zdefiniowanie sekwencji pełnej długości mysiego Asp-2 (Id. Sekw. Nr 7). Przewidywana sekwencja aminokwasowa mysiego Asp-2 (Id. Sekw. Nr 8) wykazywała 96,4% wspólnej identyczności (algorytm BestFit z GCG) z 18/501 podstawieniami aminokwasów w porównaniu z sekwencją człowieka (Figura 4).

P r z y k ł a d 4: Dystrybucja tkankowa ekspresji transkryptów Hu-Asp-2:

Materiały i metody

Dystrybucję tkankową ekspresji Hu-Asp-2 ustalono stosując filtr do hybrydyzacji typu Northern z licznych tkanek z Clonetech (Pało Alto, CA). Klon z Incyte 2696295 na wektorze pINCY całkowicie trawiono EcoRI/Notl i wstawkę cDNA 1,8 kb oczyszczano przez preparatywną elektroforezę w żelu agarozowym. Fragment ten znakowano radioaktywnie do aktywności specyficznej > 1x 10⁹ dpm/ng metodą losowych starterów (ang. random priming) w obecności [a-³²P-dATP] (>3000 Ci/mmol, Amersham, Arlington Heights, IL) i fragment Klenowa polimerazy DNA I. Filtry nylonowe zawierające zdenaturowane, frakcjonowane względem rozmiaru, poliA+ RNA izolowany z różnych ludzkich tkanek, hybrydyzowano z sondą 2 x 10⁶ dpm/ml w buforze ExpressHyb (Clonetech, Palo Alto, CA) przez 1 godzinę w 68°C i płukano zgodnie z zaleceniami producenta. Sygnały hybrydyzacji uwidaczniano przez autoradiografię stosując film BioMax XR (Kodak, Rochester, NY) z ekranami wzmacniającymi w -80°C.

Wyniki i Dyskusja

Ograniczone informacje o dystrybucji tkankowej ekspresji transkryptów Hu-Asp-2 uzyskano z analizy baz danych, w związku ze stosunkowo małą liczbą EST-ów wykrytych opisanymi wyżej metodami (<5). W próbie uzyskania następnych informacji o ekspresji genu Hu-Asp-2, wykorzystano analizę Northern, by ustalić zarówno wielkość(i) jak również ilość transkryptów Hu-Asp-2. PoliA+ RNA izolowane z serii tkanek obwodowych i obszarów mózgu unieruchomiono na podłożu stałym po rozdzieleniu w warunkach denaturujących i transkrypty Hu-Asp-2 wizualizowano przez hybrydyzację w ostrych warunkach z wyznakowaną radioaktywnie wstawką z klonu 2696295. Sonda cDNA 2696295 uwidoczniła konstelację transkryptów migrujących na poziomie rozmiarów 3,0 kb, 4,4 kb i 8,0 kb, z czego dwa ostatnie transkrypty były najbardziej liczne.

Spośród badanych tkanek, w transkrypty Hu-Asp-2 najbardziej zasobne były trzustka i mózg przy niższym lecz wykrywalnym poziomie obserwowanym we wszystkich innych badanych tkankach oprócz grasicy i PBL. Przy stosunkowo liczebnych transkryptach Hu-Asp-2 w mózgu, ustalono także ekspresję regionalną w obszarach mózgu. Podobną konstelację rozmiarów transkryptów wykryto we wszystkich badanych obszarach mózgu [móżdżku, korze móżdżku, biegunie potylicznym, płacie czołowym, płacie skroniowym i skorupie], z najwyższą zasobnością w rdzeniu przedłużonym i rdzeniu kręgowym.

P r z y k ł a d 5: Wykrywanie transkryptów Hu Asp-1 i HuAsp-2 w ludzkich liniach komórkowych przez hybrydyzację metodą Northern

Różne ludzkie linie komórkowe testowano pod kątem zdolności do produkcji mRNA Hu-Asp1 i Asp-2. Ludzkie komórki zarodkowe nerki (HEK-293), komórki afrykańskiej małpy zielonej (Cos-7), komórki jajnika chomika chińskiego (CHO), komórki HELA i linię komórkową neuroblastoma IMR-32 otrzymano z ATCC. Komórki hodowano w DME zawierającym 10% FCS, za wyjątkiem komórek CHO, które utrzymywano w a-MEM/10% FCS w 37°C w 5% CO₂, dopóki nie były bliskie konfluencji. Przepłukane mono warstwy komórek (3 x 10⁷) poddawano lizie na szalkach i ekstrahowano poliA⁺ RNA stosując zestaw Quiagen Oligotex Direct mRNA. Próbki zawierające 2 μg poliA+ RNA z każdej linii komórkowej frakcjonowano w warunkach denaturujących (traktowanie glioksalem), przenoszono na podłoże stałe z błony nylonowej przez siłę kapilarną i transkrypty wizualizowano przez hybrydyzację z sondami opartymi na wyznakowanych (³²P) metodą losowych starterów sekwencjach kodujących pochodzących z Hu-Asp1 lub Hu-Asp-2. Sygnały radioaktywne wykrywano przez ekspozycję na kliszy rentgenowskiej lub analizę obrazu urządzeniem Phosphorlmager.

Sonda cDNA Hu-Asp1 uwidoczniła podobną do wcześniej wykrytej w ludzkich tkankach konstelację transkryptów (2,6 kb i 3,5 kb). Względna obfitość ustalona przez zliczenie sygnałów radioaktywnych była następująca: Cos-7 > Hek 292 = HELA > IMR32.

Sonda cDNA Hu-Asp-2 także uwidoczniła podobną do tkankowej konstelację transkryptów (3,0 kb, 4,4 kb i 8 kb) o następującej, względnej obfitości ustalonej przez zliczenie sygnałów radioaktywnych: HEK293 > Cos7 > IMR32 > HELA.

PL 205 294 B1

P r z y k ł a d 6: Modyfikacja APP w celu zwiększenia obróbki Αβ do przeszukiwania in vitro

Ludzkie linie komórkowe obrabiające peptyd Ae z APP dostarczają środków do poszukiwania w testach komórkowych inhibitorów sekretaz β i γ. Produkcja i uwalnianie peptydu Ae do supernatantu w hodowli monitoruje się się przez test związanego z enzymem immunosorbenta (EIA, ang. enzymelinked immunosorbent assay). Chociaż ekspresja APP jest szeroko rozpowszechniona i zarówno neuronalne jak i nieneuronalne linie komórkowe obrabiają i uwalniają peptyd Ae, poziomy endogennej obróbki APP są niskie i trudne do wykrycia przez EIA. Obróbkę Ae można zwiększyć przez ekspresję w transformowanych liniach komórkowych mutacji w APP wzmacniających obróbkę Ae. Dokonaliśmy odkrywczej obserwacji, że dodanie dwóch reszt lizynowych do końca karboksylowego APP695 jeszcze bardziej podwyższa obróbkę Ae. Pozwala nam to na utworzenie stransformowanej linii komórkowej uwalniającej peptyd Ae do pożywki hodowlanej w znacznym poziomie 20 000 pg/ml.

Materiały i metody

Materiały:

Ludzką zarodkową linię komórkową nerki 293 (komórki HEK293) otrzymano we własnym zakresie. Wektor pIRES-EGFP zakupiono z Clonetech. Oligonukleotydy do mutacji przy użyciu reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) zakupiono z Genosys. Plazmid zawierający ludzki APP695 (Id. Sekw. Nr 9 [nukleotydy] i Id. Sekw. Nr 10 [aminokwasy]) otrzymano z Northwestern University Medical School. Subklonowano go w wektor pSK (Stratagene) w miejsce Notl tworząc plazmid pAPP695.

Protokół mutagenezy

Do pAPP695 wprowadzono mutację szwedzką (K670N, M671L) stosując Stratagene Qiuck Change Mutagenesis Kit, by utworzyć plazmid pAPP695NL (Id. Sekw. Nr 11 [nukleotydy] i Id. Sekw. Nr 12 [aminokwasy]). W celu wprowadzenia motywu dwóch lizyn na końcu C APP695 użyto startera lewego #276 5' GACTGACCACTCGACCAGGTTC (Id. Sekw. Nr 47) ze starterem-„łatą” #274 5' CGAATTAAATTCCAGCACACTGGCTACTTCTTGTTCTGCATCTCAAAGAAC (Id. Sekw. Nr 48) i starterem flankującym #275 CGAATTAAATTCCAGCACACTGGCTA (Id. Sekw. Nr 49), aby zmodyfikować koniec 3' cDNA APP694 (Id. Sekw. Nr 15 [nukleotydy] i Id. Sekw. Nr 16 [aminokwasy]). Dodawało to także miejsce restrykcyjne BstX1, które będzie kompatybilne z miejscem BstX1 w polilinkerze pIRES-EGFP. Amplifikację PCR przeprowadzono za pomocą zestawu Clontech HF Advantage cDNA PCR stosując mieszaninę polimeraz i bufory dostarczone przez producenta. Do PCR z „łatą” użyto startera-łaty w stosunku 1/20 stężenia molowego starterów flankujących. Produkty amplifikacji PCR oczyszczono stosując zestaw do oczyszczania produktów PCR QIAquick (Qiagen). Po trawieniu enzymami restrykcyjnymi, produkty rozdzielano w 0,8% żelach agarozowych i następnie wycięte fragmenty DNA oczyszczano stosując zestaw do ekstrakcji z żelu QIAquick (Quiagen).

Aby ponownie złożyć zmodyfikowany cDNA APP695-Sw, fragment 5' Not1-Bgl2 cDNA APP695-Sw i fragment cDNA 3' Bgl2-BstX1 APP695 otrzymany przez PCR ligowano z DNA plazmidu pIRES-EGFP otwartego w miejscach Not1 i BstX1. Ligacje przeprowadzano przez 5 minut w temperaturze pokojowej stosując zestaw Rapid DNA Ligation (Boehringer Mannheim) i transformowano do komórek Library Efficiency DH5a Competent Cells (GibcoBRL-Life Technologies). Kolonie bakteryjne przeszukiwano pod kątem wstawek przez amplifikację PCR stosując startery nr 276 i 275. DNA plazmidowy oczyszczono do transfekcji komórek ssaków stosując zestaw QIAprep Spin Miniprep (Qiagen). Otrzymany konstrukt oznaczono jako pMG125.3 (APPSW-KK, Id. Sekw. Nr 17 [nukleotydy] i Id. Sekw. Nr 18 [aminokwasy]).

Transfekcja komórek ssaków

Komórki HEK293 do transfekcji hodowano do 80% konfluencji w pożywce DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) z 10% płodową surowicą bydlęcą. Kotransfekcję przeprowadzono stosując LipofectAmine (Gibco-BRL) z 3 μg DNA pMG125.3 i 9 μg DNA pcDNA3.1 na 10 x 10⁶ komórek. Trzy dni po transfekcji, komórki przepasażowano na pożywkę zawierającą G418 w stężeniu 400 μg/ml. Po trzech dniach wzrostu w pożywce selekcyjnej komórki sortowano pod kątem ich fluorescencji.

Wybór klonów komórek 125.3 za pomocą FACS

Próbki komórek analizowano za pomocą cytometru przepływowego EPICS Elite ESP (Coulter, Hialeah, FL) wyposażonego w linię wzbudzenia 488 nm dostarczaną przez chłodzony powietrzem laser argonowy. Emisję EGFP mierzono za pomocą filtra pasmowego 525 nm i intensywność fluorescencji przedstawiano na 4-dekadowej skali logarytmicznej po bramkowaniu żywych komórek jak ustalono przez ugięcie światła w w osi wiązki lasera i rozpraszanie światła pod kątem 90°C. Pojedyncze zielone komórki rozdzielono do każdej studzienki płytki o 96 studzienkach zawierającej pożywkę wzrostową bez G418. Po czterech dniach odzysku dodano G418 do pożywki do końcowego stężenia

PL 205 294 B1

400 μg/ml. Po selekcji 32% studzienek zawierało namnożone klony. Studzienki z klonami przeniesionymi z płytki 96 studzienkowej na płytkę o 24 studzienkach, a następnie na płytkę o 6 studzienkach wybierając najszybciej rosnące kolonie pod kątem ekspansji przy każdym pasażu. Końcową wybraną linią komórkową była najszybciej rosnąca linia komórkowa ostatniego szóstego pasażu. Klon ten, oznaczony 125.3 utrzymywano w G418 w stężeniu 400 μg/ml pasażując co cztery dni do świeżej pożywki. Nie zaobserwowano utraty produkcji fluorescencji EGFP przez Ae przez 23 pasaże.

Analiza Αβ przez EIA (ELISA z podwójną kanapką przeciwciał dla hAp1-40/42)

Supernatanty hodowli komórkowych zbierane 48 godzin po transfekcji analizowano przez standardowy test Ae EIA w następujący sposób. Ludzkie Ae 1-40 lub 1-42 mierzono przy pomocy przeciwciał monoklonalnych (mAb) 6E10 (Senetek, St. Louis, MO) i biotynylowanej surowicy odpornościowej królika 162 lub 164 (New York State Institute for Basic Research, Staten Island, NY) w oznaczeniu ELISA o podwójnej kanapce. Wychwytywanie przeciwciała 6E10 jest specyficzne dla epitopu obecnego na N-końcowych resztach aminokwasowych 1-16 hAe. Skoniugowane przeciwciała wykrywające 162 i 164 są specyficzne odpowiednio dla hAe 1-40 i 1-42. W skrócie, immunopłytkę o 96 studzienkach Nunc Maxisorp opłaszczono 100 μl/studzienkę mAb 6E10 (5 μg/ml) rozcieńczonego w 0,1 M buforze węglanowym, pH 9,6 i inkubowano w 4°C przez noc. Po przepłukaniu płytki 3x 0,01 M DPBS (Modified Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (0,008 M fosforan sodu, 0,002M fosforan potasu, 0,14 M chlorek sodu, 0,01 M chlorek potasu, pH 7,4) z Pierce, Rockford, II) zawierającym 0,05% Tween-20 (DPBST), płytkę blokowano przez 60 min 200 μl 10% normalnej surowicy owczej (Sigma) w 0,01 M DPBS by uniknąć niespecyficznego wiązania. Standardy ludzkiego Ae 1-40 lub 1-42, 100 μl/studzienkę (Bachem, Torrance, CA) rozcieńczone, z roztworu zapasowego 1 mg/ml w DMSO, w pożywce do hodowli dodano po przepłukaniu płytki, jak również 100 μ!/ studzienkę próbki, tj. pożywki kondycjonowanej z komórek transfekowanych. Płytkę inkubowano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej i w 4°C przez noc. Następnego dnia, po przepłukaniu płytki, dodano 100 gl/ studzienkę biotynylowanej surowicy odpornościowej z królika 162 rozcieńczonej w stosunku 1:400 lub 164 w stosunku 1:50 w DPBST + 0,5% BSA i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę 15 minut. Po płukaniach nałożono po 100 gl/ studzienkę neutrawidyny-peroksydazy z chrzanu (Pierce, Rockford, II) rozcieńczonej 1:10 000 w DPBST i inkubowano 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po ostatnich płukaniach dodano jako substrat 100 gl/studzienkę dihydrochlorku fenylenodiaminy (Sigma Chemicals, St. Louis,MO) w buforze 50 mM kwas cytrynowy/ 100 mM fosforan sodu (Sigma Chemicals, St. Louis, MO), pH 5,0 i obserwowano pojawianie się zabarwienia przy 450 nm w kinetycznym czytniku do płytek przez 20 minut stosując oprogramowanie Soft max Pro. Wszystkie standardy i próbki stosowano w trzech powtórzeniach. Próbki o wartości absorbancji mieszczącej się w obrębie krzywej standardowej ekstrapolowano na podstawie krzywej standardowej za pomocą oprogramowania Soft max Pro i wyrażano w pg/ml pożywki do hodowli.

Wyniki

Dodanie dwóch reszt lizynowych do końca karboksylowego APP695 znacznie zwiększa obróbkę A(3 w komórkach HEK293 jak wykazano przez przejściową ekspresję (Tabela 1). Dodanie motywu dwóch lizyn do APP695 zwiększa obróbkę Ae do obserwowanego u APP695 zawierającego mutację szwedzką. Kombinacja motywu dwóch lizyn i mutacji szwedzkiej dalej dodatkowo podwyższa obróbkę 2,8-krotnie.

Kotransformacja komórek HEK293 za pomocą pMG125.3 i pcDNA3.1 pozwoliła na podwójną selekcję transformowanych komórek na oporność na G418 i wysoki poziom ekspresji EGFP. Po selekcji klonalnej przez FACS, otrzymana linia komórkowa, produkuje znaczące 20 000 pg peptydu Ae na mililitr pożywki do hodowli po wzroście przez 36 godzin na płytkach o 24 studzienkach. Produkcję peptydu Ae w różnych warunkach wzrostu podsumowano w Tabeli 2.

T a b e l a 1.

Uwalnianie peptydu Ae do pożywki do hodowli po 48 godzinach przejściowej transfekcji komórek HEK293 wskazanymi wektorami zawierającymi APP typu dzikiego lub zmodyfikowane. Wartości w tabeli są średnią + odchylenie standardowe i wartością P dla porównania par przy użyciu testu t-Studenta przy założeniu nierównych wariancji.

Konstrukt APP	Peptyd Ae 1-40 (pg/ml)	Współczynnik wzrostu	Wartość P
1	2	3	4
wektor pIRES-EGFP	147+28	1,0

PL 205 294 B1 cd. tabeli 1

1	2	3	4
wt APP695 (142.3)	194+15	1,3	0,051
wt APP695-KK (124.1)	424+34	2,8	3x10-5
APP695-Sw (143.3)	457+65	3,1	2x20-3
APP695-SwKK (125.3)	1308+98	8,9	3x10-4

T a b e l a 2.

Uwalnianie peptydu Λβ z komórek HEK125.3 przy różnych warunkach wzrostu.

Typ płytki do hodowli	Objętość pożywki	Długość hodowli	Ab 1-40 (pg/ml)	Ab 1-42 (pg/ml)
24 studzienki	400 pl	36 godz.	28 036	1 439

P r z y k ł a d 7: Inhibicja obróbki Abeta w komórkach HEK125.3 za pomocą antysensownego oligomeru

Sekwencje Hu-Asp-1 i Hu-Asp-2 dostarczono do Sequitur, Inc (Natick, MA) w celu selekcji znaczonych sekwencji stanowiących cel i zaprojektowania drugiej generacji chimerowych oligomerów antysensownych przy użyciu zastrzeżonej technologii Sequitur Ver. D zgłoszenie patentowe #3002). Oligomery antysensowne partia # S644, S645, S646 i S647 skierowano przeciw Asp1. Oligomery antysensowne partia # S648, S649, S650 i S651 skierowano przeciw Asp-2. Kontrolne oligomery antysensowne partia # S652, S653, S655 i S674 skierowano przeciw nieistotnemu genowi, a oligomery antysensowne partia # S656,S657, S658 i S659 skierowano przeciw drugiemu nieistotnemu genowi.

Do transformacji oligomerami antysensownymi komórki HEK125.3 hodowano do około 50% konfluencji na płytkach o 6 studzienkach w pożywce minimalnej (MEM, ang. Minimal Essential Medium) uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą. Roztwór zapasowy oligofektyny G (Sequitur Inc., Natick, MA) o 2 mg/ml rozcieńczono do 50 μg/ml w MEM pozbawionej surowicy. Oddzielnie roztwór zapasowy oligomerów o stężeniu 100 uM rozcieńczono do 800 nM w Opti-MEM (Gibco-BRL, Grand Island, NY). Rozcieńczone roztwory zapasowe oligofektyny G i oligomeru antysensownego zmieszano w stosunku 1:1 i inkubowano w temperaturze pokojowej. Po 15 minutach inkubacji odczynnik rozcieńczano dziesięciokrotnie w MEM zawierającej 10% płodową surowicę cielęcą i dodawano po 2 ml do każdej studzienki płytki o 6-studzienkowej po wcześniejszym usunięciu starej pożywki. Po transfekcji komórki rosły e ciągłej obecności oligofektynyG/antysensownego oligomeru. Aby obserwować uwalnianie peptydu Ab, co pewien okres usuwano ze studzienki do hodowli 400 μl kondycjonowanej pożywki i zastępowano czystą pożywką począwszy od 24 godzin po transfekcji. Przedstawione dane pochodzą z supernatantu z hodowli zebranego po 48 godzinach po transfekcji.

Wyniki różnymi oligomerami antysensownymi otrzymanymi z Seqiutur Inc transfekowano oddzielnie komórki HEK125.3 by ustalić ich wpływ na obróbkę peptydu Aβ. Tylko oligomery antysensowne skierowane przeciw Asp-1 & Asp-2 obniżały obróbkę Abeta przez komórki HEK125.3, z których skierowane przeciw Asp-2 miały większy wpływ hamujący. Zarówno Aβ (1-40) jak i Aβ (1-42) były hamowane w tym samym stopniu. W tabeli 3 obliczono procent inhibicji w odniesieniu do komórek nietransfekowanych. Odczynniki oligomerów antysensownych dające inhibicję wyższą niż 50% zaznaczono gwiazdką. Z testowanych odczynników, 3 z 4 oligomerów skierowanych przeciw ASP1 dawało średnio 52% inhibicji obróbki Aβ1-40 i 47% inhibicji obróbki Aβ1-42. Dla ASP-2, 4 z 4 oligomerów antysensownych dawały więcej niż 50% inhibicji ze średnią inhibicji wynoszącą 62% dla obróbki Aβ1-40 i 60% dla obróbki Aβ 1-42.

T a b e l a 3.

Hamowanie uwalniania peptydu Λβ z komórek HEK125.3 traktowanych oligomerami antysensownymi.

Gen docelowy	Oligomer antysensowny	Abeta (1-40)	Abeta (1-42)
1	2	3	4
Asp-1-1	S644	62%*	56%*
Asp-1-2	S645	41 %*	38%*

PL 205 294 B1 cd. tabeli 3

1	2	3	4
Asp-1-3	S646	52%*	46%*
Asp-1-4	S647	6%	25%
Asp-2-1	S648	71 %*	67%*
Asp-2-2	S649	83%*	76%*
Asp-2-3	S650	46%*	50%*
Asp-2-4	S651	47%*	46%*
Con1-1	S652	13%	18%
Con1-2	S653	35%	30%
Con1-3	S655	9%	18%
Con1-4	S674	29%	18%
Con2-1	S656	12%	18%
Con2-2	S657	16%	19%
Con2-3	S658	8%	35%*
Con2-4	S659	3%	18%

P r z y k ł a d 8. Wykazanie aktywności β-sekretazy Hu-Asp-2 w hodowlach komórkowych

Wykazano, że niektóre z mutacji w APP związane z wczesną postacią choroby Alzheimera zaburzają obróbkę peptydu Aβ. Znajdują się one w pobliżu N- i C-końcowych miejsc cięcia prowadzącego do uwolnienia Aβ z APP. Opisuje się je odpowiednio jako miejsca cięcia β-sekretazy i γ-sekretazy. Cięcie APP w miejscu cięcia β-sekretazy powoduje powstanie C-końcowego fragmentu APP, zawierającego 99 aminokwasów o ciężarze cząsteczkowym 11 145 daltonów. Szwedzka mutacja KM>NL, zaraz powyżej miejsca cięcia β-sekretazy powoduje na ogół podwyższenie wytwarzania obu postaci, 1-40 i 1-42 aminokwasowej, peptydu Aβ. Mutacja Londyn VF (717>F w izoformie APP770) ma niewielki wpływ na całkowitą produkcję peptydu Aβ, ale wydaje się wybiórczo zwiększać zawartość procentową dłuższej 1-42 aminokwasowej postaci peptydu Aβ przez wpływ na wybór miejsca cięcia γ-sekretazy podczas obróbki APP. Zatem, chcieliśmy określić, czy te mutacje zmieniają ilość i rodzaj peptydu Aβ wytwarzanego przez komórki hodowlane kotransfekowane konstruktem kierującym ekspresją Hu-Asp-2.

Wykonano dwa doświadczenia pokazujące aktywność β-sekretazy Hu-Asp-2 w hodowlach komórkowych. W pierwszym doświadczeniu, stwierdzono, że traktowanie komórek HEK125.3 antysensownymi wobec transkryptów Hu-Asp-2 oligomerami, jak opisano w przykładzie 7, zmniejsza ilość C-końcowego fragmentu APP powstającego przez cięcie β-sekretazy (CTF99)(Figura 9). Pokazuje to, że Hu-Asp-2 działa pośrednio lub bezpośrednio, ułatwiając cięcie β-sekretazy. W drugim doświadczeniu wykazano, że zwiększona ekspresja Hu-Asp-2 w transfekowanych mysich komórkach Neuro2A, powoduje wzrost akumulacji fragmentu CTF99 powstającego po cięciu β-sekretazy (Figura 10). Wzrost ten obserwuje się łatwiej, gdy do transfekcji użyty zostanie klon mutanta APP-KK, mający C-końcowy motyw dwulizynowy. Dalszy wzrost obserwuje się, gdy Hu-Asp-2 kotransfekuje się APP-Sw-KK zawierającym szwedzką mutację KM>NL. Wiadomo, że szwedzka mutacja zwiększa cięcie APP przez β-sekretazę.

Drugi zestaw doświadczeń wykazuje, że Hu-Asp-2 zwiększa aktywność γ-sekretazy w doświadczeniach z kotransfekcją na ludzkich embrionalnych komórkach nerki HEK293. Kotransfekcja Hu-Asp-2 klonem APP-KK bardzo zwiększa wytwarzanie i uwalnianie rozpuszczalnych peptydów Aβ1-40 i Aβ1-42 przez komórki HEK293. Odpowiednio większy wzrost dotyczy uwalniania Aβ1-42. Dalszy wzrost wytwarzania Aβ1-42 obserwuje się przy kotransfekcji Hu-Asp-2 klonami APP-VF (Id. Sekw. Nr:13 [nukleotydowa] i Id. Sekw. Nr: 14 [aminokwasowa]) lub APP-VF-KK (Id. Sekw. Nr:19 [nukleotydowa] i Id. Sekw. Nr: 20 [aminokwasowa]) zawierającymi mutację Londyn V717>F. Wiadomo, że mutacja V717>F zaburza specyficzność cięcia APP przez γ-sekretazę, tak że zwiększa się preferencyjnie

PL 205 294 B1 cięcie w miejscu Aβ42. Zatem, Asp-2 działa pośrednio lub bezpośrednio ułatwiając obróbkę APP przez γ-sekretazę w miejscu cięcia β42.

Materiały

Przeciwciała 6E10 i 4G8 zakupiono w Senetek (St.Louis, MO). Przeciwciało 369 otrzymano z laboratorium Paula Greengarda z Rockefeller University. Przeciwciało C8 otrzymano z laboratorium Dennis Selkoe w Harvard Medical School and Bringham and Women'Hospital.

Zastosowane konstrukty APP

Konstrukty APP zastosowane do doświadczeń z transfekcją zawierały co następuje:

APP APP695 (Id. Sekw. Nr: 9 i nr 10) typu dzikiego

APP-Sw APP695 zawierający szwedzką mutację KM>NL (Id. Sekw. Nr: 11 i Nr 12)

APP- VF APP695 zawierający mutację Londyn V>F (Id. Sekw. Nr: 13 i Nr 14)

APP-KK APP695 zawierający C-końcowy motyw KK (Id. Sekw. Nr: 15 i Nr 16)

APP-Sw-KK APP695-Sw zawierający C-końcowy motyw KK (Id. Sekw. Nr: 17 i Nr 18)

APP-VF-KK APP695-VF zawierający C-końcowy motyw KK (Id. Sekw. Nr: 19 i Nr 20)

Powyższe wklonowano do wektora pIRES-EGFP (Clonetech, Pało Alto CA) między miejsca restrykcyjne dla Notl i BstX1 stosując odpowiednie sekwencje linkerowe wprowadzone z pomocą PCR.

Transfekcja komórek HEK293, HEK125.3 i Neuro-2A antysensownymi oligomerami lub plazmidowymi konstruktami DNA

Ludzkie embrionalne komórki nerki HEK293 i mysie Neuro-2A transfekowano konstruktami ekspresyjnymi przy użyciu odczynnika Lipofectamine Plus, Gibco/BRL. Komórki wysiewano na 24 studzienkowej płutce hodowlanej do gęstości 70-80% konfluencji. Cztery studzienki z szalki transfekowano 2 μg DNA (3:1, APP: kotransfektant), 8 μl odczynnika Plus i 4 μl Lipofectaminy w OptiMEM. Dodawano OptiMEM do całkowitej objętości 1 ml i rozdzielano po 200 μl na studzienkę i inkubowano 3 godziny. Zwrócono uwagę na utrzymywanie stałych stosunków obu plazmidów stosowanych do kotransfekcji, jak również całkowitej ilości DNA używanej do transfekcji. Pożywkę transfekcyjną zastępowano DMEM z 10% FBS, pirogronianem sodu i antybiotykiem/środkiem przeciwgrzybowym, a komórki inkubowano przez 48 godzin w zwykłych warunkach (37°C, 5% CO2). Zebraną pożywkę umieszczano w polipropylenowych probówkach i przechowywano w -80°C do czasu oznaczania zawartości Aβ1-40 i Aβ1-42 za pomocą EIA jak opisano w poprzednich przykładach. Transfekcję komórek HEK125.3 antysensownymi oligomerami przeprowadzano jak opisano w Przykładzie 7.

Przygotowywanie ekstraktów komórkowych, protokół analizy Western

Komórki zbierano około 60 godzin po transfekcji plazmidowym DNA. Najpierw komórki przenoszono z szalek do 15 ml stożkowej probówki i wirowano przez 5 minut przy 1500 obr./min. aby usunąć pożywkę. Osad komórek płukano jeden raz PBS. Komórki następnie lizowano buforem do lizy (10 mM HEPES, pH 7,9, 150 mM NaCl, 10% glicerol, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 0,1 mM wanadian sodu i 1% NP-40). Zlizowane mieszaniny komórek wirowano przy 5000 obr./min., a supernatant i ekstrakt przechowywano w -20°C. Równe ilości ekstraktu z komórek HEK125.3 transfekowanych antysensownymi oligomerami Asp2 i kontroli strącano przy pomocy przeciwciała 369 rozpoznającego C-koniec APP, a następnie w immunoprecypitacie wykrywano CTF99 przy pomocy przeciwciała 6E10. Doświadczenie powtarzano używając C8, drugiego strącającego przeciwciała, które również rozpoznaje C-koniec APP. Do wykonania analizy Western ekstraktów z mysich Neuro-2A kotransfekowanych Hu-Asp-2 i APP-KK, APP-Sw-KK, APP-VF-KK lub APP-VF, równe objętości ekstraktów komórek poddawano elektroforezie w 4-10% lub 10-20% żelach gradientowych Tricine (NOVEX, San Diego, CA). Pełnej długości APP i produkty sekretazy β CTF99 wykrywano przeciwciałem 6E10.

Wyniki

Transfekcja komórek HEK125.3 antysensownymi oligomerami dla Asp-2-1 lub Asp-2-2 zmniejsza wytwarzanie produktu β-sekretazy CTF w porównaniu z komórkami podobnie transfekowanymi kontrolnymi oligomerami o odwrotnej sekwencji (Asp-2-1 odwrotny i Asp-2-2 odwrotny). W doświadczeniach z kotransfekcją, kotransfekcja mysich komórek Neuro-2a przez Hu-Asp-2 z konstruktem APP-KK zwiększała powstawanie CTF99. Zwiększało się ono jeszcze bardziej, gdy Hu-Asp-2 wyrażano wspólnie z APP-Sw-KK, zmutowaną postacią APP zawierającą szwedzką mutację KM>NL, która zwiększa obróbkę przez β-sekretazę.

Kotransfekcja Hu-Asp-2 z APP ma niewielki wpływ na wytwarzanie Aβ40, ale zwiększa wytwarzanie Aβ42 powyżej poziomu tła (Tabela 4). Dodanie motywu dwulizynowego do C-końca APP zwiększa obróbkę Aβ około dwukrotnie, choć wytwarzanie Aβ40 i Aβ42 pozostaje stosunkowo niskie (odpowiednio 352 pg/ml i 21 pg/ml). Kotransfekcja Asp-2 z APP-KK dalej zwiększa powstawanie

PL 205 294 B1 zarówno Ae40, jak i Ae42. Stymulacja wytwarzania Ae40 przez Hu-Asp-2 jest więcej niż trzykrotna, podczas gdy powstawanie Ae42 zwiększa się ponad 10 razy. Zatem, kotransfekcja Hu-Asp-2 z konstruktem APP-KK wybiórczo zwiększa powstawanie Ae42.

Wykazano, że mutacja APP V717 >F zwiększa obróbkę przez γ-sekretazę w miejscu cięcia Ae-42. Kotransfekcja Hu-Asp-2 z konstruktami APP-VF lub APP-VF-KK zwiększała wytwarzanie Ae42 (dwukrotny wzrost dla APP-VF i czterokrotny dla APP-VF-KK, Tabela 4), ale miała niejednakowy wpływ na wytwarzanie Ae40 (lekkie zmniejszenie dla APP-VF i dwukrotny wzrost dla APP-VF-KK w porównaniu z transfekowaną pędna kontrolą). Zatem, działanie Asp-2 na wytwarzanie Ae42 było proporcjonalnie większe prowadząc do wzrostu stosunku Ae42/całkowity Λβ. Rzeczywiście, stosunek Ae42/całkowity Ae w komórkach HEK293 kotransfekowanych Hu-Asp-2 i APP-VF-KK osiąga bardzo wysoką wartość 42%.

Analiza Western biot pokazująca zmniejszenie wytwarzania CTF99 przez komórki HEK125.3 transfekowane oligomerami antysensownymi kierującymi mRNAHu-Asp-2. (po prawej) Analiza Western biot pokazująca wzrost produkcji CTF99 w mysich komórkach Neuro-2a kotransfekowanych Hu-Asp-2 i APP-KK. Dalszy wzrost wytwarzania CTF99 jest obserwowany w komórkach kotransfekowanych Hu-Asp-2 i APP-Sw-KK.

T a b l e l a 4.

Wyniki kotranfekcji plazmidem z Hu-Asp-2 lub pcDNA wraz z różnymi konstruktami APP zawierającymi mutację V717>F modyfikującą obróbkę γ-sekretazy. Kotransfekcja Asp-2 istotnie zwiększa stosunek Ae42/całkowity Ae. Wartości ujęte w tabeli określają peptyd Ae w pg/ml.

kotransfekcja pcDNA_kotransfekcja Asp-2

	Ae40	Ae42	Ae42/całkowity	Ae40	Ae42	Ae42/całkowity
APP	192±18	<4	<2%	188±40	8±10	3,9%
APP-VF	118±15	15±19	11,5%	85±7	24±12	22,4%
APP-KK	352±24	21±6	5,5%	1062±101	1226±49	17,5%
APP-VF-KK	230±31	88±24	27,7%	491±35	355±36	42%

P r z y k ł a d 9. Ekspresja ludzkiego Asp-2L w bakteriach

Ekspresja zrekombinowanego Hu-Asp-2L w E.coli

Hu-Asp-2L może ulegać ekspresji w E.coli po dodaniu na N-końcu sekwencji, takiej jak znacznik T7 (Id. Sekw. Nr: 1 i Nr 22) lub znacznik T7 z następującą po nim sekwencją liderową kaspazy 8 (Id. Sekw. Nr: 23 i Nr 24). Alternatywnie, aby zwiększyć wydajność otrzymywania Hu-Asp-2, można drogą ukierunkowanej mutagenezy zmniejszyć zawartość GC sekwencji 5' (Id. Sekw. Nr: 25 i Nr 26). Dodatkowo, Asp-2 można zmienić dodając miejsce proteolizy (Id. Sekw. Nr: 27 i Nr 28). Aby wytworzyć białko rozpuszczalne po ekspresji i ponownym sfałdowaniu, z wyboru usuwa się domenę transbłonową i ogon cytoplazmatyczny lub bliższy region błonowy, domenę transbłonową i ogon cytoplazmatyczny.

Metody

Do otrzymania fuzji sekwencji kodującej Asp-2 z modyfikacjami sekwencji N-końca obejmującymi znacznik T7 (Id. Sekw. Nr: 1 i Nr 22) lub znacznik T7 z sekwencją liderową kaspazy 8 (Id. Sekw. Nr: 23 i Nr 24) zastosowano PCR ze straterami zawierającymi odpowiednie sekwencje linkerowe. Te konstrukty wklonowywano do wektorów ekspresyjnych pet23a(+) [Novagen], w których promotor T7 powoduje ekspresję znacznika T7 poprzedzającego sekwencje wielokrotnych miejsc klonowania. Do wklonowania sekwencji Hu-Asp-2 za lider znacznika T7 na pet23a+ użyto następujących oligonukleotydów, pozwalających na amplifikacje wybranych sekwencji Hu-Asp-2:

#553=GTGGATCCACCCAGCAC-GGCATCCGGCTG (Id. Sekw. Nr: 35) #554=GAAAGCTTTCATGACTCATCTGTCTGTGGAATGTTG (Id. Sekw. Nr: 36), które umiejscawiają odpowiednio na 5' i 3' końcu wstawki miejsca flankujące dla BamHI i Hindlll. Sekwencje Asp-2 amplifikowano z pełnej długości klonu cDNA Asp-2(b) w plazmidzie pcDNA3.1 przy użyciu AdvantageGC cDNA PCR [Clontech] według wskazówek producenta, stosując temperaturę anilingui przyłączania 68°C w dwustopniowej reakcji PCR przez 25 cykli. Wstawkę i wektor przecięto BamHI i Hindlll, oczyszczono przez elektroforezę w żelu agarozowym, a następnie zligowano przy użyciu zestawu Rapid DNA Ligation kit [Boehringer Mannheim]. Reakcji ligacji użyto do transformacji szczepu E.coli JM109(Promega) i pobrano kolonie do izolacji plazmidu (Qiagen, Qiaprep minispin) i analizy sekwencji DNA. Do zaindukowania ekspresji przy pomocy izopropylo β-D-tiogalaktopiranozydu (IPTG), wektor

PL 205 294 B1 ekspresyjny przeniesiono do szczepu E.coli BL21 (Stratagene). Hodowle bakteryjne prowadzono w pożywce płynnej LB z ampicyliną 100 μg/ml i zaindukowano je 1 mM IPTG w fazie wzrostu log przy OD600 wynoszącym 0,6-1,0 przez 4 godziny w 37°C. Osad komórek otrzymywano przez wirowanie.

Aby wklonować sekwencje Hu-Asp-2 między znacznik T7 i lider kaspazy (Id. Sekw. Nr: 23 i Nr 24), konstrukt utworzony jak powyżej zawierający sekwencję T7-Hu-Asp-2 (Id. Sekw. Nr: 21 i Nr 22), przecinano w miejscu BamHI i do wektorowego DNA przyłączano i ligowano ufosforylowane oligonukleotydy sekwencji liderowej kaspazy 8 #559=GATCGATGACTATCTCTGACTCTCCGCGTGAACAGGACG (Id. Sekw. Nr: 37), #560=GATCCGTCCTGTTCACGCGGAGAGTCAGAGATAGTCATC (Id. Sekw. Nr: 38). Dla każdego zestawu oligonukleotydów zaprojektowano 5' wystający jednoniciowy koniec w taki sposób, by pozwalał na ligację w miejsce BamHI, ale nie na późniejsze trawienie BamHI. Produktami ligacji transformowano JM109 jak opisano powyżej, analizę ekspresji białka przeprowadzano po przeniesieniu do szczepu E.coli BL21. W celu zmniejszenia zawartości GC końca 5' Asp-2 zaprojektowano parę antyrównoległych oligonukleotydów, aby zmienić zdegenerowane zasady w kodonach 15 aminokwasów z G/C na A/T (Id. Sekw. Nr: 25 i 26). Nowa sekwencja nukleotydowa na 5' końcu Asp-2 nie zmienia kodowanych przez nią aminokwasów i została wybrana, aby zoptymalizować ekspresję w E.coli. Sekwencja linkera sensownego to

5' CGGCATCCGGCTGCCCCTGCGTAGCGGTCTGGGTGGTGCTCCACTGGGTCTGCG TCTGCCCCGGGAGACCGACGAA G 3' (Id. Sekw. Nr: 39).

Sekwencja linkera antysensownego to: 5'

CGGCATCCGGCTGCCCCTGCGTAGCGGTCTGGGTGGTGCTCCACTGGGTCTGCG

TCTGCCCCGGGAGACCGACGAA G 3' (Id. Sekw. Nr: 40).

Po połączeniu się ufosforylowanych linkerów ze sobą w 0,1 M NaCl-10 mM Tris, pH 7,4 ligowano je z wektorem pTAC wykorzystując unikalne miejsca cięcia ClaI i Smal w Hu-Asp-2. Do zaindukowania ekspresji przy pomocy izopropylo β-D-tiogalaktopiranozydu (IPTG), wektor ekspresyjny przeniesiono do szczepu E.coli BL21 (Stratagene). Hodowle bakteryjne prowadzono w pożywce płynnej LB z ampicyliną 100 μg/ml i indukowano 1 mM IPTG w fazie wzrostu log przy OD600 wynoszącym 0,6-1,0 przez 4 godziny w 37°C. Osad komórek otrzymywano przez wirowanie.

Aby otrzymać wektor, dla którego sekwencje liderowe mogą być usunięte przez ograniczoną proteolizę kaspazą 8, tak, że uwalniany jest polipeptyd Hu-Asp-2 zaczynający się N-końcową sekwencją GSVF (Id. Sekw. Nr: 27 i 28), zastosowano następującą procedurę. Z pET23a+ przeciętym BamHI zligowano połączone ze sobą dwa ufosforylowane oligonukleotydy kodujące miejsce cięcia kaspazy 8 IETD, #571 = GATCGATGACTATCTCTGACTCTCCGCTGGACTCTGGTATCGAAACCGACG (Id. Sekw. Nr: 41) oraz #572 = GATCCGTCGGTTTCGATACCAGAGTCCAGCGGAGAGTCAGAGATAGTCATC (Id. Sekw. Nr: 42) transformacji JM109 otrzymano oczyszczone DNA plazmidu i określono orientację wstawki przez analizę sekwencji DNA. Do amplifikacji wybranej części sekwencji Hu-Asp-2 użyto następujących oligonukleotydów, umieszczających miejsca cięcia BamHI i Hindlll odpowiednio na 5' i 3' końcu wstawki: #573=5'AAGGATCCTTTGTGGAGATGGTGGACAACCTG (Id. Sekw Nr 43) #554=GAAAGCTTTCATGACTCATCTGTCTGTGGAATGTTG (Id. Sekw Nr 44).

Sekwencje Asp-2 amplifikowano na matrycy pełnej długości cDNA Asp-2 wklonowanego do pcDNA3.1 przy pomocy Advantage-GC cDNA PCR [Clonetech], stosując się do protokołu dostarczonego przez producenta przy temperaturze przyłączania i wydłużania 68°C w 25 cyklach dwustopniowej reakcji PCR. Wstawkę i wektor przecięto BamHI i Hindlll, oczyszczono przez elektroforezę w żelu agarozowym, a następnie zligowano przy użyciu Rapid DNA Ligation kit [Boehringer Mannheim]. Reakcji ligacji użyto do transformacji szczepu E.coli JM109 (Promega), pobrano kolonie do izolacji plazmidu (Qiagen, Qiaprep minispin) i analizy sekwencji DNA. Do zaindukowania ekspresji przy pomocy izopropylo-e-D-tiogalaktopiranozydu (IPTG), wektor ekspresyjny przeniesiono do szczepu E.coli BL21 (Stratagene). Hodowle bakteryjne prowadzono w pożywce płynnej LB z ampicyliną 100 μg/ml i indukowano je 1 mM IPTG w fazie wzrostu log przy OD600 wynoszącym 0,6-1,0 przez 4 godziny w 37°C. Osad komórek otrzymywano przez wirowanie.

Aby wspomóc oczyszczanie, do dowolnego z powyższych konstruktów można za liderem T7 wprowadzić znacznik 6-His, trawiąc konstrukt w miejscu BamHI, a następnie ligując go z połączonymi, ufosforylowanymi oligonukleotydami zawierającymi sekwencje sześciu reszt histydynowych: #565=GATCGCATCATCACCATCACCATG (Id. Sekw. Nr: 45)

PL 205 294 B1 #566=GATCCATGGTGATGGTGATGATGC (Id. Sekw. Nr: 4 6). Dla każdego zestawu oligonukleotydów zaprojektowano 5' wystający jednoniciowy koniec, w taki sposób, by pozwalał na ligację w miejsce BamHI, ale już nie na późniejsze trawienie BamHI.

Przygotowanie osadu bakterii:

36,34 g osadu bakterii pochodzącego z 10,8 l pożywki zawieszono w całkowitej objętości 200 ml w 2M KCl, 0,1M Tris, 0,05M EDTA, 1M DTT przy użyciu 20 mm sondy homogenizatora przy 3000 do 5000 rpm. Przewodzenie doprowadzono wodą do około 193 mMho.

Po zawieszeniu osadu, dodano KCl do objętości 500 ml. Zawiesinę następnie homogenizowano przez około 3 minuty przy 5000 rpm przy użyciu tej samej sondy. Następnie mieszaninę przepuszczono przez homogenizator wysokociśnieniowy Rannie przy 10 000 psi.

We wszystkich przypadkach osad zachowywano, usuwając frakcje rozpuszczalne. Powstały roztwór wirowano w rotorze GSA przez 1 godzinę przy 12 500 rpm. Osad zawieszono w tym samym roztworze (bez DTT), używając tej samej sondy homogenizatora przy 2 000 rpm. Po homogenizowaniu przez 5 minut przy 3000 rpm, objętość doprowadzono tym samym roztworem do 500 ml i wirowano przez godzinę przy 12 500 rpm. Osad następnie zawieszono jak uprzednio, ale w objętości końcowej 1,5 l tego samego roztworu, przed homogenizacją przez 5 minut. Po odwirowaniu przy tej samej prędkości co przedtem przez 30 minut, procedurę powtórzono. Następnie osad zawieszono w około 150 ml zimnej wody, pulując osad z sześciu probówek wirówkowych używanych w rotorze GSA. Osad homogenizowano przez 5 minut przy 3000 rpm, uzupełniano do objętości 250 ml zimną wodą i wirowano 30 minut. Waga otrzymanego osadu wyniosła 17,75 g.

Posumowanie: liza osadu bakteryjnego w roztworze KCl, a następnie wirowanie w rotorze GSA zostały wykorzystane do wstępnej preparatyki osadu. Tego samego roztworu używano później trzykrotnie do ponownego zawieszania/homogenizacji. Końcowe przemycie wodą/ homogenizację wykonano, aby usunąć nadmiar KCl i EDTA.

Solubilizacja rHuAsp-2L:

Aby rozpuścić wcześniej opisany osad używano roztworu w stosunku 9-10 ml/gram osadu. Rozmrożono 17,75 g osadu i dodano 150 ml 8M chlorowodorku guanidyny, 5 mM e-merkaptoetanolu, 0,1% DEA. Doprowadzono pH do 8,6 przy pomocy 3M Tris. Osad początkowo zawieszono w roztworze guanidyny przy użyciu 20 mM sondy homogenizatora przy 1000 rpm. Mieszaninę następnie mieszano w 4°C przez godzinę przed odwirowaniem przez 30 minut przy 12000 rpm przez 1 w rotorze GSA. Uzyskany supernatant odwirowano przez 30 minut przy 40000x g w rotorze SS-34. Końcowy supernatant przechowywano w -20°C, za wyjątkiem 50 ml.

Chromatografia powinowactwa na immobilizowanym złożu niklowym rozpuszczonego rHuAsp-2L

Stosowano następujące roztwory:

A) 6M chlorowodorek guanidyny, 0,1M NaP, pH 8,0, 0,01M Tris, 5 mM e-merkaptoetanol, 0,5M imidazol

A') 6M mocznik, 20 mM NaP, pH 6,80, 50 mM NaCl

B') 6M mocznik, 20 mM NaP, pH 6,20, 50 mM NaCl, 12 mM imidazol

C') 6M mocznik, 20 mM NaP, pH 6,80, 50 mM NaCl, 300 mM imidazol

Uwaga: bufory A' i C' mieszano w odpowiednich proporcjach, aby otrzymać pośrednie stężenia imidazolu.

Mieszano 50 ml rozpuszczonego materiału z 50 ml buforu A przed dodaniem do 100-125 ml Qiagen Ni-Nta SuperFlow (zrównoważonego wcześniej buforem A) na kolumnie 5 x 10 cm BioRad econo. Następnie wytrząsano delikatnie w 4°C przez noc w chłodni.

Etapy chromatografii:

1) Zlanie z kolumny nie związanej frakcji

2) Przemycie 50 ml buforu A (zebrane do nie związanej frakcji)

3) Przemycie 250 ml buforu A (przemycie 1)

4) Przemycie 250 ml buforu A (przemycie 2)

5) Przemycie 250 ml buforu A'

6) Przemycie 250 ml buforu B'

7) Przemycie 250 ml buforu A'

8) Elucja 250 ml 75 mM imidazolu

9) Elucja 250 ml 150 mM imidazolu (150-1)

10) Elucja 250 ml 150 mM imidazolu (150-2)

11) Elucja 250 ml 300 mM imidazolu (300-1)

PL 205 294 B1

12) Elucja 250 ml 300 mM imidazolu (300-2)

13) Elucja 250 ml 300 mM imidazolu (300-3)

Wyniki chromatografii:

rHuAsp wymywano przy 75 imidazolu do 300 mM imidazolu. Frakcja 75 mM, jak również pierwsza frakcja 150 mM imidazolu (150-1) zawierały zanieczyszczenia białkowe, co wykazano na żelach barwionych błękitem Coomassiego. Zatem, do doświadczeń z ponownym fałdowaniem się wykorzystano frakcje 150-2 i 300-1, gdyż one zawierają największe ilości białek (patrz żel barwiony błękitem Coomassiego).

Doświadczenia nad zwijaniem się rHuAsp-2L

Doświadczenie 1

Czterdzieści ml 150-2 zmieszano z 1M DTT, 3M Tris, pH 7,4 i DEA do końcowego stężenia odpowiednio 6 mM, 50 mM, 0,1%. Następnie szybko rozpuszczono (mieszając) w 200 ml zimnego (4°C) 20 mM NaP, pH 6,8, 150 mM NaCl. To rozcieńczenie daje końcowe stężenie mocznika 1M. Roztwór nie mętnieje, nawet przy pozostawieniu na powietrzu w temperaturze pokojowej lub 4°C.

Po pozostawieniu otwartego na powietrzu na 4-5 godzin w °C, roztwór dializowano przez noc wobec 20 mM NaP, pH 7,4, 150 mM NaCl, 20% glicerolu. Ta metoda skutecznie usuwa mocznik z roztworu bez wytrącania białka.

Doświadczenie 2:

Pewną ilość eluatu 150-2 zatężano dwukrotnie na Amicon Centriprep, 10 000 MWCO, potem postępowano jak w doświadczeniu 1. W tym wypadku białko również pozostawało w roztworze, nie było widocznej precypitacji.

Doświadczenie 3:

ml 150-2 zmieszano z 1M DTT, 3M Tris, pH 7,4 i DEA do końcowego stężenia odpowiednio 6 mM, 50 mM, 0,1%. Następnie szybko rozpuszczono (mieszając) w 445 ml zimnego (4°C) 20 mM NaP, pH 6,8, 150 mM NaCl. Roztwór wydawał się przejrzysty, bez widocznej precypitacji. Roztwór przeniesiono do temperatury pokojowej i mieszano 10 minut przed dodaniem MEA do końcowego stężenia 0,1 mM. Następnie powoli mieszano przez godzinę w temperaturze pokojowej. Do końcowego stężenia dodano cystaminę i CuSO₄ odpowiednio 1 mM i 10 μΜ. Roztwór powoli mieszano w temperaturze pokojowej przez 10 minut przed przeniesieniem do chłodni 4°C i powoli wytrząsano przez noc na powietrzu.

Następnego dnia roztwór (wciąż przejrzysty, bez widocznej precypitacji) wirowano przez 1 godzinę przy 100 000 x g. Zbierano razem supernatanty z wielu powtórzeń i dużą masę stabilizowanego białka dializowano wobec 20 mM NaP, pH 7,4, 150 mM NaCl, 20% glicerolu. Po dializie, materiał przechowywano w -20°C.

Pewną ilość (około 10 ml) roztworu białka (wciąż w 1M moczniku) zachowano w -20°C do analiz biochemicznych.

P r z y k ł a d 10. Ekspresja Hu-Asp-2 i pochodnych w komórkach owadzich

Ekspresja przez infekcję bakulowirusem - sekwencję kodującą Hu-Asp-2 i niektórych pochodnych zmieniono przy użyciu PCR, tak, by możliwa była jej ekspresja w komórkach owadzich. Dla sekwencji pełnej długości sparowano 5' sensowny starter oligonukleotydowy zmieniający początek translacji tak, by zgadzał się z konsensusową sekwencją Kozaka z antysensownym 3' starterem zawierającym właściwy kodon końca translacji sekwencji Hu-Asp-2. Jako matrycy do amplifikacji PCR użyto pcDNA3.1(hygro)/Hu-Asp-2 (patrz przykład 12). Również przy pomocy PCR przygotowano dwie pochodne Hu-Asp-2, jedną bez C-końcowej domeny transbłonowej (Id. Sekw. Nr: 29 i 30), drugą bez domeny transbłonowej, z sześciohistydynowym znacznikiem na C-końcu (Id. Sekw. Nr: 31 i 32). W amplifikacji PCR z pcDNA3.1(hygro)/Hu-Asp2L jako matrycą sparowano ten sam co powyżej 5' sensowny oligonukleotyd z albo 3' antysensownym starterem wprowadzającym (1) kodon stop po kodonie 453 (Id. Sekw. Nr: 3) lub (2) dołączającym sześciohistydynowy znacznik, po którym następował kodon stop. We wszystkich przypadkach reakcje PCR przeprowadzano przez 15 cykli przy pomocy polimerazy DNA Pwol (Boehringer-Mannheim) według wskazań producenta. Produkty reakcji strawiono całkowicie BamHI i Notl i zligowano z trawionym BamHI i Notl bakulowirusowym wektorem transferowym pVL1393 (Invitrogen). Część produktów reakcji ligacji wykorzystano do transformacji kompetentnych komórek E.coli DH5a, które następnie selekcjonowano pod względem oporności na antybiotyk na LB-Amp. Plazmidowy DNA przygotowywano standardową metodą lizy alkalicznej i oczyszczono w CsCl, aby otrzymać bakulowirusowe wektory transferowe pVL1393/Asp-2, pVL1393/Asp2ΔTM

PL 205 294 B1 i pVL1393/Asp2ΔTM(His)₆. Rekombinacji bakulowirusów i infekcji owadzich komórek sf9 dokonano standardowymi metodami.

Ekspresja po transfekcji - uzyskano stałą i przejściową ekspresję Hu-Asp2ΔTM i Hu-Asp2ΔTM-(His)6 w komórkach owadzich High 5 przy użyciu owadziego wektora ekspresyjnego pIZ/V5-His. Wstawki DNA z plazmidów ekspresyjnych pVL1393/Asp2, pVL1393/Asp2ΔTM i pVL1393/Asp2ΔTM(His)₆ wycięto przez podwójne trawienie BamHI i Notl i zligowano z trawionym BamHI i Notl pIZ/V5-His stosując standardowe metody. Powstałe plazmidy, opisane jako pIZ /Asp2ΔTM i pIZ /Asp2ΔTM(His)₆, pozyskano jak opisano powyżej.

Do transfekcji komórki owadzie High 5 hodowano w pożywce bez surowicy High Five uzupełnionej gentamycyną 10 gg/ml, w szczelnie zamkniętych butelkach w 27°C. Transfekcję wykonywano przy użyciu komórek owadzich High Five, pożywki bez surowicy High Five uzupełnionej gentamycyną 10 gg/ml i liposomów InsectinPlus (Invitrogen, Carlsbad, CA) stosując standardowe metody.

Do przejściowej transfekcji na dużą skalę wysiano po 1,2 x 10⁷ komórek High Five na 150 mm szalkach do hodowli tkankowych i pozwolono im osiąść przez 15-30 minut w temperaturze pokojowej. W czasie przyczepiania się komórek przygotowano mieszaninę DNA/liposomy przez zmieszanie 6 ml pożywki bez surowicy, 60 gg DNA Asp2ΔTM(+/- His) i 120 gl Insectin Plus i inkubowano przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Z szalek z komórkami usunięto pożywkę użytą do wysiewania i zastąpiono mieszaniną DNA/liposomy na 4 godziny w temperaturze pokojowej ze stałym wytrząsaniem przy 2 rpm. Dodatkowe 6 ml pożywki dodano do szalki po czym inkubowano przez 4 dni w 27°C w wilgotnym inkubatorze. Cztery dni po transfekcji zbierano pożywkę, odwirowywano przy 500 x g, testowano na ekspresję Asp-2 analizą Western. W przypadku stałej ekspresji komórki traktowano 50 gg/ml zeocyny i z puli przeżywających przygotowano klony komórek przez ograniczone rozcieńczanie, a następnie zbadano ekspresję jak opisano powyżej.

Oczyszczanie Hu-Asp2ΔTM i Hu-Asp2ΔTM(His)₆ - Usunięcie odcinka transbłonowego z Hu-Asp-2 spowodowało wydzielanie polipeptydu do pożywki hodowlanej. Po wytwarzaniu białka wskutek infekcji bakulowirusem bądź transfekcji, zbierano pożywkę, klarowano przez wirowanie i dializowano wobec Tris-HCl (pH 8,0). Tak uzyskany materiał oczyszczano przez kolejne powtórzenia chromatografii jonowymiennej z wymianą anionów Tris-HCl (pH 8,0) a następnie kationowej (bufor octanowy pH 4,5) z gradientem NaCl. Profil elucji monitorowano (1) analizą Western biot, (2) testem aktywności stosując substrat peptydowy jak opisano w Przykładzie 12. W przypadku Hu-Asp2ΔTM(His)₆ pozyskaną pożywkę po dializie wobec Tris-HCl (pH 8,0) czyszczono przez kolejne powtórzenia chromatografii na złożu IMAC, a następnie chromatografii jonowymiennej z wymianą anionów.

Analiza sekwencji oczyszczonego białka Hu-Asp2ATM(His)6 wykazała, że peptyd sygnałowy został odcięty [TQHGIRLPLR].

P r z y k ł a d 11. Ekspresja Hu-Asp-2 w komórkach CHO

Heterologiczna ekspresja Hu-Asp-2L w komórkach CHO-K1 - pełną sekwencję kodującą Hu-Asp-2 wklonowano do ssaczego wektora ekspresyjnego pcDNA3.1(+)Hygro (Invitrogen, Carlsbad, CA) zawierający kierujące ekspresją: bardzo wczesny promotor CMV i sygnał poliadenylacji bGH. Plazmid ekspresyjny pcDNA3.1(+)Hygro/Hu-Asp-2 otrzymano lizą alkaliczną i oczyszczono w gradiencie CsCl, a następnie całkowicie zsekwencjonowano obie nici, aby zweryfikować sekwencję kodującą.

Komórki jajnika chińskiego chomika (CHO-K1) typu dzikiego otrzymano z ATCC. Komórki utrzymywano w hodowli jednowarstwowej w α-MEM zawierającym 10% FCS w 37°C w 5% CO₂. Dwie 100 mm szalki komórek CHO-K1 (60% konfluencji) transfekowano samym pcDNA3.1(+)Hygro lub pcDNA3.1(+)Hygro/Hu-Asp-2 stosując kationowe liposomy DOTAP według zaleceń producenta. Komórki traktowano mieszaniną liposomy/plazmidowy DNA przez 15 godzin, a następnie pożywkę zastępowano pożywką wzrostową zawierającą higromycynę B 500 U/ml. W przypadku komórek CHO-K1 transfekowanych pcDNA3.1(+)Hygro/Hu-Asp-2 otrzymano klony pojedynczych komórek opornych na higromycynę B przez ograniczone rozcieńczanie. Po wzroście klonalnym poszczególnych linii komórkowych, ustalano analizą Western ekspresję białek Hu-Asp-2 stosując poliklonalną króliczą surowicę odpornościową przygotowaną przeciw rekombinowanemu Hu-Asp-2 przygotowanemu przez ekspresję w E.coli. Z niemal konfluentnych szalek każdej z linii komórkowych zbierano komórki w PBS przez zdrapywanie i odzyskiwano komórki przez wirowanie. Osady komórek zawieszano w zimnym buforze do Lizy (25 mM Tris-HCl (pH 8,0)/5 mM EDTA) zawierającym inhibitory proteaz i poddawano komórki lizie przez sonikację. Frakcje rozpuszczalną i błonową oddzielono wirując (105 000 x g, 60 minut) i znormalizowane ilości białka z każdej frakcji rozdzielano metodą SDS-PAGE. Po elektrotransferze rozdzielonych białek na filtry PVDF białko Hu-Asp-2L wykrywano króliczą surowicą odpornościową

PL 205 294 B1 przeciw Hu-Asp-2 (rozczieńcznie 1/1000) i koniugaty przeciwciało-antygen uwidaczniano stosując kozie przeciwciała antykrólicze sprzężone z fosfatazą alkaliczną (1/2500). Specyficznie immunoreagujące białko o wyraźnej masie 65 kDa wykryto w komórkach transferowanych pcDNA3.1(+)Hygro/Hu-Asp-2, nie wykryto w komórkach kontrolnych. Peptyd Hu-Asp-2 wykryto jedynie we frakcji błonowej, zgodnie z przewidywaną z sekwencji obecnością peptydu sygnałowego i pojedynczej domeny transbłonowej. Na podstawie tej analizy, stwierdzono najwyższy poziom ekspresji białka Hu-Asp-2 w klonie #5 i tę linię komórkową hodowano na dużą skalę, aby otrzymać materiał do oczyszczania.

Oczyszczanie rekombinowanego Hu-Asp-2L z klonu #5 CHO-K1 - W typowym oczyszczaniu używano jako materiału wyjściowego osadu komórek klonu #5 zebranych z konfluentnych szalek 20 150 mm. Osad komórek zawieszano w 50 ml zimnego buforu do lizy jak opisano powyżej. Komórki lizowano przez homogenizację homoenizatorem Politron (2 x 20 sekund) i lizat wirowano przez 20 minut przy 338 000 x g. Osad błon zawieszano ponownie w 20 ml zimnego buforu do lizy zawierającego 50 mM β-oktyloglukozyd i wytrząsano przez 1 godzinę w 4°C. Ekstrakt detergentowy klarowano wirując przy 338 000 x g przez 20 minut, po czym zbierano supernatant do dalszych analiz. Ekstrakt β-oktyloglukozydowy nakładano na anionową kolumnę jonowymienną Mono Q, wyrównaną wcześniej 25 mM Tris-HCl (pH 8,0)/50 mM β-oktyloglukozyd. Po nałożeniu próbki, kolumnę eluowano NaCl o liniowo wzrastającym stężeniu (0-1,0M przez 30 minut) i poszczególne frakcje badano analizą Western biot i pod względem aktywności β-sekretazy. Frakcje wykazujące zarówno immunoreaktywność Hu-Asp-2, jak i aktywność β-sekretazy, zbierano razem i dializowano wobec 25 mM NaOAc (pH 4,5)/50 mM β-oktyloglukozyd. Po dializie usunięto przez odwirowanie wytrącony materiał, a rozpuszczalną frakcję poddawano chromatografii na anionowej kolumnie jonowymiennej Mono Q, wyrównanej wcześniej 25 NaOAc /50 mM β-oktyloglukozyd. Kolumnę eluowano NaCl o liniowo wzrastającym stężeniu (0-1,0M przez 30 minut) i poszczególne frakcje badano analizą Western biot i pod względem aktywności β-sekretazy. Frakcje wykazujące zarówno immunoreaktywność Hu-Asp-2, jak i aktywność β-sekretazy połączono i określono stwierdzono czystość na >90% przez SDS-PAGE i barwienie Coomassie Blue.

P r z y k ł a d 12. Test aktywności β-sekretazy Hu-Asp-2 przy użyciu substratów peptydowych.

Test β-sekretazy - Aktywność β-sekretazy mierzono określając ilościowo hydrolizę syntetycznego peptydu zawierającego szwedzką mutację APP przez analizę RP-HPLC połączona z detekcją w UV. Każda mieszanina reakcyjna zawierała 50 mM Na-MES (pH 5,5), 1% β-oktyloglukozyd, substrat peptydowy (SEVNLDAEFR, 70 μM) i enzym (1-5 μg białka). Mieszaniny reakcyjne inkubowano w 37°C przez różny czas i produkty reakji rozdzielano przy pomocy RP-HPLC stosując liniowy gradient 0-70B przez 30 minut (A=0,1% TFA w wodzie, B=0,1% TFA w wodzie/90%AcCN). Profil elucji monitorowano mierząc absorbancję przz 214 nm. We wstępnych doświadczeniach potwierdzono zarówno sekwencjonowaniem metodą Edmana, jak i spektrometrią masową MALDI-TOF, że peptydy odpowiadające dwóm pikom eluowanym przed nieuszkodzonym peptydem, mają sekwencje DAEFR i SEVNL. Procentową hydrolizę substratu peptydowego obliczono porównując obszar pod pikami obu peptydów - produktów i materiału wyjściowego z absorbancji przy 214 nm. Specyficzność reakcji cięcia przez β-sekretazę określano wykonując test β-sekretazy w obecności koktajlu inhibitorów proteaz (8 μM pepstatyna A, 10 μM leupeptyna, 10 μM E64 i 5mM EDTA).

Alternatywny test β-sekretazy stosuje wewnętrznie przecinane fluorescencyjne substraty do śledzenia aktywności enzymu przy użyciu spektroskopii fluorescencyjnej w pojedynczej próbce lub w formacie wielostudzienkowym. Każda reakcja zawierała 50 mM Na-MES (pH 5,5), substrat peptydowy MCA-EVKMDAEF[K-DPN](BioSource International) (50 μM) i oczyszczony enzym Hu-Asp-2. Te składniki równoważono dla różnych czasów w temperaturze 37°C i zapoczątkowywano reakcje dodaniem substratu. Pobudzanie wykonywano przy 330 nm, a pomiar kinetyki reakcji wykonywano mierząc fluorescencję przy 390 nm. Aby wykryć składniki zmieniające aktywność Hu-Asp-2, badane składniki dodawano podczas preinkubacji i kinetykę reakcji śledzono jak opisano powyżej. Składniki zwiększające pojawianie się fluorescencji uznano za aktywatory, podczas gdy składniki zmniejszające pojawianie się fluorescencji uznano za inhibitory.

Jest zrozumiałe, że wynalazek może być stosowany inaczej niż w konkretnie opisanych powyżej opisach i przykładach.

Liczne modyfikacje i zmiany niniejszego wynalazku są możliwe w świetle powyższych doświadczeń i pozostają zatem w zakresie wynalazku.

Pełne ujawnienie wszystkich publikacji cytowanych w niniejszym zgłoszeniu jest włączone jako odniesienie.

PL 205 294 B1

LISTA SEKWENCJI <110> Gurney, Mark E.

Bieńkowski, Michael J. Heinrikson, Robert L.

Parodi, Luis A.

Yan, Riqiang

Pharmacia & Upjohn Company

<120> Sekretaza związana z chorobą Alzheimera
<130> 6177	. P CP
<140>
<141>
<150> 60/101,594
<151> 1998	-09-24
<160> 49
<170> Patentln Ver. 2	.0
<210> 1
<211> 1804
<212> DNA
<213> Homo	sapiens
<400> 1
atgggcgcac	tggcccgggc	gctgctgctg	cctctgctgg	cccagtggct	cctgcgcgcc	60
gccccggagc	tggcccccgc	gcccttcacg	ctgcccctcc	gggtggccgc	ggccacgaac	120
cgcgtagttg	cgcccacccc	gggacccggg	acccctgccg	agcgccacgc	cgacggcttg	180
gcgctcgccc	tggagcctgc	cctggcgtcc	cccgcgggcg	ccgccaactt	cttggccatg	240
gtagacaacc	tgcaggggga	ctctggccgc	ggctactacc	tggagatgct	gatcgggacc	300
cccccgcaga	agctacagat	tctcgttgac	actggaagca	gtaactttgc	cgtggcagga	360
accccgcact	cctacataga	cacgtacttt	gacacagaga	ggtctagcac	ataccgctcc	420
aagggctttg	acgtcacagt	gaagtacaca	caaggaagct	ggacgggctt	cgttggggaa	480
gacctcgtca	ccatccccaa	aggcttcaat	acttcttttc	ttgtcaacat	tgccactatt	540
tttgaatcag	agaatttctt	tttgcctggg	attaaatgga	atggaatact	tggcctagct	600
tatgccacac	ttgccaagcc	atcaagttct	ctggagacct	tcttcgactc	cctggtgaca	660
caagcaaaca	tccccaacgt	tttctccatg	cagatgtgtg	gagccggctt	gcccgttgct	720
ggatctggga	ccaacggagg	tagtcttgtc	ttgggtggaa	ttgaaccaag	tttgtataaa	780
ggagacatct	ggtatacccc	tattaaggaa	gagtggtact	accagataga	aattctgaaa	840
ttggaaattg	gaggccaaag	ccttaatctg	gactgcagag	agtataacgc	agacaaggcc	900
atcgtggaca	gtggcaccac	gctgctgcgc	ctgccccaga	aggtgtttga	tgcggtggtg	960
gaagctgtgg	cccgegeatc	tctgattcca	gaattctctg	atggtttctg	gactgggtcc	1020
cagctggcgt	gctggacgaa	ttcggaaaca	ccttggtctt	acttccctaa	aatctccatc	1080
tacctgagag	atgagaactc	cagcaggtca	ttccgtatca	caatcctgcc	tcagctttac	1140

PL 205 294 B1 attcagccca tgatgggggc cggcctgaat tatgaatgtt accgattcgg catttcccca 1200 tccacaaatg cgctggtgat cggtgccacg gtgatggagg gcttctacgt catcttcgac 1260 agagcccaga agagggtggg cttcgcagcg agcccctgtg cagaaattgc aggtgctgca 1320 gtgtctgaaa tttccgggcc tttctcaaca gaggatgtag ccagcaactg tgtccccgct 1380 cagtctttga gcgagcccat tttgtggatt gtgtcctatg cgctcatgag cgtctgtgga 1440 gccatcctcc ttgtcttaat cgtcctgctg ctgctgccgt tccggtgtca gcgtcgcccc 1500 cgtgaccctg aggtcgtcaa tgatgagtcc tctctggtca gacatcgctg gaaatgaata 1560 gccaggcctg acctcaagca accatgaact cagctattaa gaaaatcaca tttccagggc 1620 agcagccggg atcgatggtg gcgctttctc ctgtgcccac ccgtcttcaa tctctgttct 1680 gctcccagat gccttctaga ttcactgtct tttgattctt gattttcaag ctttcaaatc 1740 ctccctactt ccaagaaaaa taattaaaaa aaaaacttca ttctaaacca aaaaaaaaaa 1800 aaaa 1804 <210> 2 <211> 518 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Met Gly Ala Leu Ala Arg Ala Leu Leu Leu Pro Leu Leu Ala Gin Trp 15 10 15

Leu Leu Arg Ala Ala Pro Glu Leu Ala Pro Ala Pro Phe Thr Leu Pro 20 25 30

Leu Arg Val Ala Ala Ala Thr Asn Arg Val Val Ala Pro Thr Pro Gly 35 40 45

Pro Gly Thr Pro Ala Glu Arg His Ala Asp Gly Leu Ala Leu Ala Leu 50 55 60

Glu Pro Ala Leu Ala Ser Pro Ala Gly Ala Ala Asn Phe Leu Ala Met 65 70 75 80

Val Asp Asn Leu Gin Gly Asp Ser Gly Arg Gly Tyr Tyr Leu Glu Met 85 90 95

Leu Ile Gly Thr Pro Pro Gin Lys Leu Gin Ile Leu Val Asp Thr Gly 100 105 110

Ser Ser Asn Phe Ala Val Ala Gly Thr Pro His Ser Tyr Ile Asp Thr 115 120 125

Tyr Phe Asp Thr Glu Arg Ser Ser Thr Tyr Arg Ser Lys Gly Phe Asp 130 135 140

Val Thr Val Lys Tyr Thr Gin Gly Ser Trp Thr Gly Phe Val Gly 145 150 155

Glu

160

PL 205 294 B1

Asp

Leu

Val

Thr

Ile 165

Pro

Lys

Gly

Phe

Asn 170

Thr

Ser

Phe

Leu

Val 175

Asn

Ile

Ala

Thr

Ile 180

Phe

Glu

Ser

Glu

Asn 185

Phe

Phe

Leu

Pro

Gly 190

Ile

Lys

Trp

Asn

Gly 195

Ile

Leu

Gly

Leu

Ala 200

Tyr

Ala

Thr

Leu

Ala 205

Lys

Pro

Ser

Ser

Ser 210

Leu

Glu

Thr

Phe

Phe 215

Asp

Ser

Leu

Val

Thr 220

Gin

Ala

Asn

Ile

Pro 225

Asn

Val

Phe

Ser

Met 230

Gin

Met

Cys

Gly

Ala 235

Gly

Leu

Pro

Val

Ala 240

Gly

Ser

Gly

Thr

Asn 245

Gly

Gly

Ser

Leu

Val 250

Leu

Gly

Gly

Ile

Glu 255

Pro

Ser

Leu

Tyr

Lys 260

Gly

Asp

Ile

Trp

Tyr 265

Thr

Pro

Ile

Lys

Glu 270

Glu

Trp

Tyr

Tyr

Gin 275

Ile

Glu

Ile

Leu

Lys 280

Leu

Glu

Ile

Gly

Gly 285

Gin

Ser

Leu

Asn

Leu 290

Asp

Cys

Arg

Glu

Tyr 295

Asn

Ala

Asp

Lys

Ala 300

Ile

Val

Asp

Ser

Gly 305

Thr

Thr

Leu

Leu

Arg 310

Leu

Pro

Gin

Lys

Val 315

Phe

Asp

Ala

Val

Val 320

Glu

Ala

Val

Ala

Arg 325

Ala

Ser

Leu

Ile

Pro 330

Glu

Phe

Ser

Asp

Gly 335

Phe

Trp

Thr

Gly

Ser 340

Gin

Leu

Ala

Cys

Trp 345

Thr

Asn

Ser

Glu

Thr 350

Pro

Trp

Ser

Tyr

Phe 355

Pro

Lys

Ile

Ser

Ile 360

Tyr

Leu

Arg

Asp

Glu 365

Asn

Ser

Ser

Arg

Ser 370

Phe

Arg

Ile

Thr

Ile 375

Leu

Pro

Gin

Leu

Tyr 380

Ile

Gin

Pro

Met

Met 385

Gly

Ala

Gly

Leu

Asn 390

Tyr

Glu

Cys

Tyr

Arg 395

Phe

Gly

Ile

Ser

Pro 400

Ser

Thr

Asn

Ala

Leu 405

Val

Ile

Gly

Ala

Thr 410

Val

Met

Glu

Gly

Phe 415

Tyr

PL 205 294 B1

Val Ile Phe Asp Arg Ala Gin Lys Arg Val Gly Phe Ala Ala Ser Pro 420 425 430

Cys Ala Glu Ile Ala Gly Ala Ala Val Ser Glu Ile Ser Gly Pro Phe 435 440 445

Ser Thr Glu Asp Val Ala Ser Asn Cys Val Pro Ala Gin Ser Leu Ser 450 455 460

Glu Pro Ile Leu Trp Ile Val Ser Tyr Ala Leu Met Ser Val Cys Gly

465 470 475 480

Ala Ile Leu Leu Val Leu Ile Val Leu Leu Leu Leu Pro Phe Arg Cys

485 490 495

Gin Arg Arg Pro Arg Asp Pro Glu Val Val Asn Asp Glu Ser Ser Leu 500 505 510

Val Arg His Arg Trp Lys 515 <210> 3 <211> 2070 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atggcccaag ccctgccctg gctcctgctg tggatgggcg cgggagtgct gcctgcccac 60 ggcacccagc acggcatccg gctgcccctg cgcagcggcc tggggggcgc ccccctgggg 120 ctgcggctgc cccgggagac cgacgaagag cccgaggagc ccggccggag gggcagcttt 180 gtggagatgg tggacaacct gaggggcaag tcggggcagg gctactacgt ggagatgacc 240 gtgggcagcc ccccgcagac gctęaacatc ctggtggata caggcagcag taactttgca 300 gtgggtgctg ccccccaccc cttcctgcat cgctactacc agaggcagct gtccagcaca 360 taccgggacc tccggaaggg tgtgtatgtg ccctacaccc agggcaagtg ggaaggggag 420 ctgggcaccg acctggtaag catcccccat ggccccaacg tcactgtgcg tgccaacatt 480 gctgccatca ctgaatcaga caagttcttc atcaacggct ccaactggga aggcatcctg 540 gggctggcct atgctgagat tgccaggcct gacgactccc tggagccttt ctttgactct 600 ctggtaaagc agacccacgt tcccaacctc ttctccctgc acctttgtgg tgctggcttc 660 cccctcaacc agtctgaagt gctggcctct gtcggaggga gcatgatcat tggaggtatc 720 gaccactcgc tgtacacagg cagtctctgg tatacaccca tccggcggga gtggtattat 780 gaggtcatca ttgtgcgggt ggagatcaat ggacaggatc tgaaaatgga ctgcaaggag 840 tacaactatg acaagagcat tgtggacagt ggcaccacca accttcgttt gcccaagaaa 900 gtgtttgaag ctgcagtcaa atccatcaag gcagcctcct ccacggagaa gttccctgat 960 ggtCtctggc taggagagca gctggtgtgc tggcaagcag gcaccacccc ttggaacatt 1020 ttcccagtca tctcactcta cctaatgggt gaggttacca accagtcctt ccgcatcacc 1080 atccttccgc agcaatacct gcggccagtg gaagatgtgg ccacgtccca agacgactgt 1140

PL 205 294 B1 tacaagtttg ggcttctacg catgtgcacg gaagactgtg gtcatggctg cgctgcctcc aagtgaggag ctttggtcac ccacccacca ggactgtacc cttggtcacc ttgtccacca gtactggcat agaccaagct tgctttagag attaaaaaaa ccatctcaca ttgtctttga atgagttcag gctacaacat ccatctgcgc gctgcctgcg gcccatgggc aagtaggaga aatgcctctg tgtaggaaac tcaaatttaa ttcctttaaa cacacgcagg tgtttccctg acagggactg aaaaaaaaaa gtcatccacg tcgggcccga ga.cggcagcg tccacagaca cctcttcatg ccagcagcat agaagataga cacagatggc ccttgatgga agaaaagaga gtcgggaaat ttctccaacc ttaccttggc ctggccaaag tataaacaag aaaaaaaaaa ggcactgtta aaacgaattg gtggaaggcc gatgagtcaa ctgccactct gatgactttg gattcccctg acctgtggcc gaaggaaaag agaaagaagc tctgctgctt caaagtattc gtgtgtccct tcagtaggag cctaacattg tgggagctgt gctttgctgt cttttgtcac ccctcatgac gcctcatggt ctgatgacat gaccacacct agagcacctc gctggcaagg actctgctgg gaaacttcag ttcttttctt gtggtaccct aggatgcaca gtgcaaagat tatcatggag cagcgcttgc cttggacatg catagcctat gtgtcagtgg ctccctgctg ccgtggttca aggaccctcc tgggttccag cgggaatact ccctgaacct agtttcagaa ggcagagaag gtttgctatt tgcctcttga

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1740

1800

1860

1920

1980

2040

2070 <210> 4 <211> 501 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4

Met Ala Gin Ala Leu Pro Trp Leu Leu Leu Trp Met Gly Ala Gly Val 15 10 15

Leu Pro Ala His Gly Thr Gin His Gly Ile Arg Leu Pro Leu Arg Ser 20 25 30

Gly Leu Gly Gly Ala Pro Leu Gly Leu Arg Leu Pro Arg Glu Thr Asp 35 40 45

Glu Glu Pro Glu Glu Pro Gly Arg Arg Gly Ser Phe Val Glu Met Val 50 55 60

Asp Asn Leu Arg Gly Lys Ser Gly Gin Gly Tyr Tyr Val Glu Met Thr 65 70 75 80

Val Gly Ser Pro Pro Gin Thr Leu Asn Ile Leu Val Asp Thr Gly Ser 85 90 95

Ser Asn Phe Ala Val Gly Ala Ala Pro His Pro Phe Leu His Arg Tyr 100 105 110

Tyr Gin Arg Gin Leu Ser Ser Thr Tyr Arg Asp Leu Arg Lys Gly Val 115 120 125

Tyr Val Pro Tyr Thr Gin Gly Lys Trp Glu Gly Glu Leu Gly Thr Asp

PL 205 294 B1

130 135 140

Leu 145

Val

Ser

Ile

Pro

His Gly 150

Pro Asn Val

Thr 155

Val Arg

Ala

Asn

Ile 160

Ala

Ala

Ile

Thr

Glu

Ser

Asp

Lys

Phe

Phe

Ile

Asn

Gly

Ser

Asn

Trp

165

170

175

Glu

Gly

Ile

Leu

Gly

Leu

Ala

Tyr

Ala

Glu

Ile

Ala

Arg

Pro

Asp

Asp

180

185

190

Ser

Leu

Glu

Pro

Phe

Phe

Asp

Ser

Leu

Val

Lys

Gin

Thr

His

Val

Pro

195

200

205

Asn

Leu

Phe

Ser

Leu

His

Leu

Cys

Gly

Ala

Gly

Phe

Pro

Leu

Asn

Gin

210

215

220

Ser

Glu

Val

Leu

Ala

Ser

Val

Gly

Gly

Ser

Met

Ile

Ile

Gly

Gly

Ile

225

230

235

240

Asp

His

Ser

Leu

Tyr

Thr

Gly

Ser

Leu

Trp

Tyr

Thr

Pro

Ile

Arg

Arg

245

250

255

Glu

Trp

Tyr

Tyr

Glu

Val

Ile

Ile

Val

Arg

Val

Glu

Ile

Asn

Gly

Gin

260

265

270

Asp

Leu

Lys

Met

Asp

Cys

Lys

Glu

Tyr

Asn

Tyr

Asp

Lys

Ser

Ile

Val

275

280

285

Asp

Ser

Gly

Thr

Thr

Asn

Leu

Arg

Leu

Pro

Lys

Lys

Val

Phe

Glu

Ala

290

295

300

Ala

Val

Lys

Ser

Ile

Lys

Ala

Ala

Ser

Ser

Thr

Glu

Lys

Phe

Pro

Asp

305

310

315

320

Gly

Phe

Trp

Leu

Gly

Glu

Gin

Leu

Val

Cys

Trp

Gin

Ala

Gly

Thr

Thr

325

330

335

Pro

Trp

Asn

Ile

Phe

Pro

Val

Ile

Ser

Leu

Tyr

Leu

Met

Gly

Glu

Val

340

345

350

Thr

Asn

Gin

Ser

Phe

Arg

Ile

Thr

Ile

Leu

Pro

Gin

Gin

Tyr

Leu

Arg

355

360

365

Pro

Val

Glu

Asp

Val

Ala

Thr

Ser

Gin

Asp

Asp

Cys

Tyr

Lys

Phe

Ala

370

375

380

Ile

Ser

Gin

Ser

Ser

Thr

Gly

Thr

Val

Met

Gly

Ala

Val

Ile

Met

Glu

PL 205 294 B1

<210> 5 <211> 1977 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 atggcccaag ccctgccctg gctcctgctg tggatgggcg cgggagtgct gcctgcccac 60 ggcacccagc acggcatccg gctgcccctg cgcagcggcc tggggggcgc ccccctgggg 120 ctgcggctgc cccgggagac cgacgaagag cccgaggagc ccggccggag gggcagcttt 180 gtggagatgg tggacaacct gaggggcaag tcggggcagg gctactacgt ggagatgacc 240 gtgggcagcc ccccgcagac gctcaacatc ctggtggata caggcagcag taactttgca 300 gtgggtgctg ccccccaccc cttcctgcat cgctactacc agaggcagct gtccagcaca 360 taccgggacc tccggaaggg tgtgtatgtg ccctacaccc agggcaagtg ggaaggggag 420 ctgggcaccg acctggtaag catcccccat ggccccaacg tcactgtgcg tgccaacatt 480 gctgccatca ctgaatcaga caagttcttc atcaacggct ccaactggga aggcatcctg 540 gggctggcct atgctgagat tgccaggctt tgtggtgctg gcttccccct caaccagtct 600 gaagtgctgg cctctgtcgg agggagcatg atcattggag gtatcgacca ctcgctgtac 660 acaggcagtc tctggtatac acccatccgg cgggagtggt attatgaggt gatcattgtg 720 cgggtggaga tcaatggaca ggatctgaaa atggactgca aggagtacaa etatgacaag 780 agcattgtgg acagtggcac caccaacctt cgtttgccca agaaagtgtt tgaagctgca 840 gtcaaatcca tcaaggcagc ctcctccacg gagaagttcc etgatggttt ctggctagga 900 gagcagctgg tgtgctggca agcaggcacc aceccttgga acattttccc agtcatctca 960 ctctacctaa tgggtgaggt taccaaccag tccttccgca tcaccatcct tccgcagcaa 1020 tacctgcggc cagtggaaga tgtggccacg tcccaagacg actgttacaa gtttgccatc 1080

PL 205 294 B1 tcacagtcat ccacgggcac tgttatggga gctgttatca tggagggctt ctacgttgtc 1140 tttgatcggg cccgaaaacg aattggcttt gctgtcagcg cttgccatgt gcacgatgag 1200 ttcaggacgg cagcggtgga aggccctttt gtcaccttgg acatggaaga ctgtggctac 1260 aacattccac agacagatga gtcaaccctc atgaccatag cctatgtcat ggctgccatc 1320 tgcgccctct tcatgctgcc actctgcctc atggtgtgtc agtggcgctg cctccgctgc 1380 ctgcgccagc agcatgatga ctttgctgat gacatctccc tgctgaagtg aggaggccca 1440 tgggcagaag atagagattc ccctggacca cacctccgtg gttcactttg gtcacaagta 1500 ggagacacag atggcacctg tggccagagc acctcaggac cctccccacc caccaaatgc 1560 ctctgccttg atggagaagg aaaaggctgg caaggtgggt tccagggact gtacctgtag 1620 gaaacagaaa agagaagaaa gaagcactct gctggcggga atactcttgg tcacctcaaa 1680 tttaagtcgg gaaattctgc tgcttgaaac ttcagccctg aacctttgtc caccattcct 1740 ttaaattctc caacccaaag tattcttctt ttcttagttt cagaagtact ggcatcacac 1800 gcaggttacc ttggcgtgtg tccctgtggt accctggcag agaagagacc aagcttgttt 1860 ccctgctggc caaagtcagt aggagaggat gcacagtttg ctatttgctt tagagacagg 1920 gactgtataa acaagcctaa cattggtgca aagattgcct cttgaaaaaa aaaaaaa 1977 <210> 6 <211> 476 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6

Met 1

Ala

Gin

Ala

Leu 5

Pro

Trp

Leu

Leu

Leu 10

Trp

Met

Gly

Ala

Gly 15

Val

Leu

Pro

Ala

His 20

Gly

Thr

Gin

His

Gly 25

Ile

Arg

Leu

Pro

Leu 30

Arg

Ser

Gly

Leu

Gly 35

Gly

Ala

Pro

Leu

Gly 40

Leu

Arg

Leu

Pro

Arg 45

Glu

Thr

Asp

Glu

Glu 50

Pro

Glu

Glu

Pro

Gly 55

Arg

Arg

Gly

Ser

Phe 60

Val

Glu

Met

Val

Asp 65

Asn

Leu

Arg

Gly

Lys 70

Ser

Gly

Gin

Gly

Tyr 75

Tyr

Val

Glu

Met

Thr 80

Val

Gly

Ser

Pro

Pro 85

Gin

Thr

Leu

Asn

Ile 90

Leu

Val

Asp

Thr

Gly 95

Ser

Ser

Asn

Phe

Ala 100

Val

Gly

Ala

Ala

Pro 105

His

Pro

Phe

Leu

His 110

Arg

Tyr

Tyr

Gin

Arg 115

Gin

Leu

Ser

Ser

Thr 120

Tyr

Arg

Asp

Leu

Arg 125

Lys

Gly

Val

Tyr

Val 130

Pro

Tyr

Thr

Gin

Gly 135

Lys

Trp

Glu

Gly

Glu 140

Leu

Gly

Thr

Asp

PL 205 294 B1

Leu Val 145

Ala Ala

Glu Gly

Ala Gly

Ser Met 210

Trp Tyr 225

Arg Val

Asn Tyr

Pro Lys

Ser Thr 290

Cys Trp 305

Leu Tyr

Leu Pro

Asp Asp

Met Gly 370

Arg Lys 385

Ser

Ile

Ile

Phe

195

Ile

Thr

Glu

Asp

Lys

275

Glu

Gin

Leu

Gin

Cys

355

Ala

Arg

Ile Pro His Gly Pro Asn Val Thr Val Arg Ala Asn Ile 150 155 160

Thr Glu Ser Asp Lys Phe Phe Ile Asn Gly Ser Asn Trp 165 170 175

Leu Gly Leu Ala Tyr Ala Glu Ile Ala Arg Leu Cys Gly 180 185 190

Pro Leu Asn Gin Ser Glu Val Leu Ala Ser Val Gly Gly 200 205

Ile Gly Gly Ile Asp His Ser Leu Tyr Thr Gly Ser Leu 215 220

Pro Ile Arg Arg Glu Trp Tyr Tyr Glu Val Ile Ile Val 230 235 240

Ile Asn Gly Gin Asp Leu Lys Met Asp Cys Lys Glu Tyr 245 250 255

Lys Ser Ile Val Asp Ser Gly Thr Thr Asn Leu Arg Leu 260 265 270

Val Phe Glu Ala Ala Val Lys Ser Ile Lys Ala Ala Ser 280 285

Lys Phe Pro Asp Gly Phe Trp Leu Gly Glu Gin Leu Val 295 300

Ala Gly Thr Thr Pro Trp Asn Ile Phe Pro Val Ile Ser 310 315 320

Met Gly Glu Val Thr Asn Gin Ser Phe Arg Ile Thr Ile 325 330 335

Gin Tyr Leu Arg Pro Val Glu Asp Val Ala Thr Ser Gin 340 345 350

Tyr Lys Phe Ala Ile Ser Gin Ser Ser Thr Gly Thr Val 360 365

Val Ile Met Glu Gly Phe Tyr Val Val Phe Asp Arg Ala 375 380

Ile Gly Phe Ala Val Ser Ala Cys His Val His Asp Glu 390 395 400

PL 205 294 B1

Phe Arg Thr Ala Ala Val Glu Gly Pro Phe Val Thr Leu Asp Met Glu 405 410 415

Asp Cys Gly Tyr Asn Ile Pro Gin Thr Asp Glu Ser Thr Leu Met Thr 420 425 430

Ile Ala Tyr Val Met Ala Ala Ile Cys Ala Leu Phe Met Leu Pro Leu 435 440 445

Cys Leu Met Val Cys Gin Trp Arg Cys Leu Arg Cys Leu Arg Gin Gin 450 455 460

His Asp Asp Phe Ala Asp Asp Ile Ser Leu Leu Lys

465 470 475 <210> 7 <211> 2043 <212> DNA <213> Mus rausculus <400> 7 atggccccag cgctgcactg gctcctgcta tgggtgggct cgggaatgct gcctgcccag 60 ggaacccatc tcggcatccg gctgcccctt cgcagcggcc tggcagggcc acccctgggc 120 ctgaggctgc cccgggagac tgacgaggaa tcggaggagc ctggccggag aggcagcttt 180 gtggagatgg tggacaacct gaggggaaag tccggccagg gctactatgt ggagatgacc 240 gtaggcagcc ccccacagac gctcaacatc ctggtggaca cgggcagtag taactttgca 300 gtgggggctg ccccacaccc tttcctgcat cgctactacc agaggcagct gtccagcaca 360 tatcgagacc tccgaaaggg tgtgtatgtg ccctacaccc agggcaagtg ggagggggaa 420 ctgggcaccg acctggtgag catccctcat ggccccaacg tcactgtgcg tgccaacatt 480 gctgccatca ctgaatcgga caagttcttc atcaatggtt ccaactggga gggcatccta 540 gggctggcct atgctgagat tgccaggccc gacgactctt tggagccctt ctttgactcc 600 ctggtgaagc agacccacat tcccaacatc ttttccctgc agctctgtgg cgctggcttc 660 cccctcaacc agaccgaggc actggcctcg gtgggaggga gcatgatcat tggtggtatc 720 gaccactcgc tatacacggg cagtctctgg tacacaccca tccggcggga gtggtattat 780 gaagtgatca ttgtacgtgt ggaaatcaat ggtcaagatc tcaagatgga ctgcaaggag 840 tacaactacg acaagagcat tgtggacagt gggaccacca accttcgctt gcccaagaaa 900 gtatttgaag ctgccgtcaa gtccatcaag gcagcctcct cgacggagaa gttcccggat 960 ggcttttggc taggggagca gctggtgtgc tggcaagcag gcacgacccc ttggaacatt 1020 ttcccagtca tttcacttta cctcatgggt gaagtcacca atcagtcctt ccgcatcacc 1080 atccttcctc agcaatacct acggccggtg gaggacgtgg ccacgtccca agacgactgt 1140 tacaagttcg ctgtctcaca gtcatccacg ggcactgtta tgggagccgt catcatggaa 1200 ggtttctatg tcgtcttcga tcgagcccga aagcgaattg gctttgctgt cagcgcttgc 1260 catgtgcacg atgagttcag gacggcggca gtggaaggtc cgtttgttac ggcagacatg 1320 gaagactgtg gctacaacat tccccagaca gatgagtcaa cacttatgac catagcctat 1380 gtcatggcgg ccatctgcgc cctcttcatg ttgccactct gcctcatggt atgtcagtgg 1440 cgctgcctgc gttgcctgcg ccaccagcac gatgactttg ctgatgacat ctccctgctc 1500

PL 205 294 B1 aagtaaggag gctcgtgggc agatgatgga gacgcccctg gaccacatct gggtggttcc 1560 ctttggtcac atgagttgga gctatggatg gtacctgtgg ccagagcacc tcaggaccct 1620 caccaacctg ccaatgcttc tggcgtgaca gaacagagaa atcaggcaag ctggattaca 1680 gggcttgcac ctgtaggaca caggagaggg aaggaagcag cgttctggtg gcaggaatat 1740 ccttaggcac cacaaacttg agttggaaat tttgctgctt gaagcttcag ccctgaccct 1800 ctgcccagca tcctttagag tctccaacct aaagtattct ttatgtcctt ccagaagtac 1860 tggcgtcata ctcaggctac ccggcatgtg tccctgtggt accctggcag agaaagggcc 1920 aatctcattc cctgctggcc aaagtcagca gaagaaggtg aagtttgcca gttgctttag 1980

tgatagggac tgcagactca agcctacact ggtacaaaga ctgcgtcttg agataaacaa 2040
gaa	2043
<210> 8 <211> 501 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Met Ala Pro Ala Leu His Trp Leu	Leu Leu Trp Val Gly Ser Gly Met

10 15

Leu Pro Ala Gin Gly Thr His Leu Gly Ile Arg Leu Pro Leu Arg Ser 20 25 30

Gly Leu Ala Gly Pro Pro Leu Gly Leu Arg Leu Pro Arg Glu Thr Asp 35 40 45

Glu Glu Ser Glu Glu Pro Gly Arg Arg Gly Ser Phe Val Glu Met Val 50 55 60

Asp Asn Leu Arg Gly Lys Ser Gly Gin Gly Tyr Tyr Val Glu Met Thr 65 70 75 80

Val Gly Ser Pro Pro Gin Thr Leu Asn Ile Leu Val Asp Thr Gly Ser 85 90 95

Ser Asn Phe Ala Val Gly Ala Ala Pro His Pro Phe Leu His Arg Tyr 100 105 110

Tyr Gin Arg Gin Leu Ser Ser Thr Tyr Arg Asp Leu Arg Lys Gly Val 115 120 125

Tyr Val Pro Tyr Thr Gin Gly Lys Trp Glu Gly Glu Leu Gly Thr Asp 130 135 140

Leu Val Ser Ile Pro His Gly Pro Asn Val Thr Val Arg Ala Asn Ile 145 150 155 160

Ala Ala Ile Thr Glu Ser Asp Lys Phe Phe Ile Asn Gly Ser Asn Trp

PL 205 294 B1

165

170

175

Glu

Gly

Ile

Leu

Gly

Leu

Ala

Tyr

Ala

Glu

Ile

Ala

Arg

Pro

Asp

Asp

180

185

190

Ser

Leu

Glu

Pro

Phe

Phe

Asp

Ser

Leu

Val

Lys

Gin

Thr

His

Ile

Pro

195

200

205

Asn

Ile

Phe

Ser

Leu

Gin

Leu

Cys

Gly

Ala

Gly

Phe

Pro

Leu

Asn

Gin

210

215

220

Thr

Glu

Ala

Leu

Ala

Ser

Val

Gly

Gly

Ser

Met

Ile

Ile

Gly

Gly

Ile

225

230

235

240

Asp

His

Ser

Leu

Tyr

Thr

Gly

Ser

Leu

Trp

Tyr

Thr

Pro

Ile

Arg

Arg

245

250

255

Glu

Trp

Tyr

Tyr

Glu

Val

Ile

Ile

Val

Arg

Val

Glu

Ile

Asn

Gly

Gin

260

265

270

Asp

Leu

Lys

Met

Asp

Cys

Lys

Glu

Tyr

Asn

Tyr

Asp

Lys

Ser

Ile

Val

275

280

285

Asp

Ser

Gly

Thr

Thr

Asn

Leu

Arg

Leu

Pro

Lys

Lys

Val

Phe

Glu

Ala

290

295

300

Ala

Val

Lys

Ser

Ile

Lys

Ala

Ala

Ser

Ser

Thr

Glu

Lys

Phe

Pro

Asp

305

310

315

320

Gly

Phe

Trp

Leu

Gly

Glu

Gin

Leu

Val

Cys

Trp

Gin

Ala

Gly

Thr

Thr

325

330

335

Pro

Trp

Asn

Ile

Phe

Pro

Val

Ile

Ser

Leu

Tyr

Leu

Met

Gly

Glu

Val

340

345

350

Thr

Asn

Gin

Ser

Phe

Arg

Ile

Thr

Ile

Leu

Pro

Gin

Gin

Tyr

Leu

Arg

355

360

365

Pro

Val

Glu

Asp

Val

Ala

Thr

Ser

Gin

Asp

Asp

Cys

Tyr

Lys

Phe

Ala

370

375

380

Val

Ser

Gin

Ser

Ser

Thr

Gly

Thr

Val

Met

Gly

Ala

Val

Ile

Met

Glu

385

390

395

400

Gly

Phe

Tyr

Val

Val

Phe

Asp

Arg

Ala

Arg

Lys

Arg

Ile

Gly

Phe

Ala

405

410

415

Val

Ser

Ala

Cys

His

Val

His

Asp

Glu

Phe

Arg

Thr

Ala

Ala

Val

Glu

PL 205 294 B1

420

425

430

Gly

Pro

Phe 435

Val

Thr

Ala

Asp

Met 440

.Glu

Asp

Cys

Gly

Tyr 445

Asn

Ile

Pro

Gin

Thr 450

Asp

Glu

Ser

Thr

Leu 455

Met

Thr

Ile

Ala

Tyr 460

Val

Met

Ala

Ala

Ile 465

Cys

Ala

Leu

Phe

Met 470

Leu

Pro

Leu

Cys

Leu 475

Met

Val

Cys

Gin

Trp 480

Arg

Cys

Leu

Arg

Cys 485

Leu

Arg

His

Gin

His 490

Asp

Asp

Phe

Ala

Asp 495

Asp

Ile Ser Leu Leu Lys 500 <210> 9 <211> 208Θ <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 atgctgcccg gtttggcact gctcctgctg gccgcctgga cggctcgggc gctggaggta 60 cccactgatg gtaatgctgg cctgctggct gaaccccaga ttgccatgtt ctgtggcaga 120 ctgaacatgc acatgaatgt ccagaatggg aagtgggatt cagatccatc agggaccaaa ISO acctgcattg ataccaagga aggcatcctg cagtattgcc aagaagtcta ccctgaactg 240 cagatcacca atgtggtaga agccaaccaa ccagtgacca tccagaactg gtgcaagcgg 300 ggccgcaagc agtgcaagac ccatccccac tttgtgattc cctaccgctg cttagttggt 360 gagtttgtaa gtgatgccct tctcgttcct gacaagtgca aattcttaca ccaggagagg 420 atggatgttt gcgaaactca tcttcactgg cacaccgtcg ccaaagagac atgcagtgag 480 aagagtacca acttgcatga ctacggcatg ttgctgccct gcggaattga caagttccga 540 ggggtagagt ttgtgtgttg cccactggct gaagaaagtg acaatgtgga ttctgctgat 600 gcggaggagg atgactcgga tgtctggtgg ggcggagcag acacagacta tgcagatggg 660 agtgaagaca aagtagtaga agtagcagag gaggaagaag tggctgaggt ggaagaagaa 720 gaagccgatg atgacgagga cgatgaggat ggtgatgagg tagaggaaga ggctgaggaa 780 ccctacgaag aagccacaga gagaaccacc agcattgcca ccaccaccac caccaccaca 840 gagtctgtgg aagaggtggt tcgagttcct acaacagcag ccagtacccc tgatgccgtt 900 gacaagtatc tcgagacacc tggggatgag aatgaacatg cccatttcca gaaagccaaa 960 gagaggcttg aggccaagca ccgagagaga atgtcccagg tcatgagaga atgggaagag 1020 gcagaacgtc aagcaaagaa cttgcctaaa gctgataaga aggcagttat ccagcatttc 1080 caggagaaag tggaatcttt ggaacaggaa gcagccaacg agagacagca gctggtggag 1140 acacacatgg ccagagtgga agccatgctc aatgaccgcc gccgcctggc cctggagaac 1200 tacatcaccg ctctgcaggc tgttcctcct cggcctcgtc acgtgttcaa tatgctaaag 1260 aagtatgtcc gcgcagaaca gaaggacaga cagcacaccc taaagcattt cgagcatgtg 1320 cgcatggtgg atcccaagaa agccgctcag atccggtccc aggttatgac acacctccgt 1380 gtgatttatg agcgcatgaa tcagtctctc tccctgctct acaacgtgcc tgcagtggcc 1440

PL 205 294 B1 gaggagattc aggatgaagt tgatgagctg cttcagaaag agcaaaacta ttcagatgac 1500 gtcttggcca acatgattag tgaaccaagg atcagttacg gaaacgatgc tctcatgcca 1560 tctttgaccg aaacgaaaac caccgtggag ctccttcccg tgaatggaga gttcagcctg 1620 gacgatctcc agccgtggca ttcttttggg gctgactctg tgccagccaa cacagaaaac 1680 gaagttgagc ctgttgatgc ccgccctgct gccgaccgag gactgaccac tcgaccaggt 1740 tctgggttga caaatatcaa gacggaggag atctctgaag tgaagatgga tgcagaattc 1800 cgacatgact caggatatga agttcatcat caaaaattgg tgttctttgc agaagatgtg 1860 ggttcaaaca aaggtgcaat cattggactc atggtgggcg gtgttgtcat agcgacagtg 1920 atcgtcatca ccttggtgat gctgaagaag aaacagtaca catccattca tcatggtgtg 1980 gtggaggttg acgccgctgt caccccagag gagcgccacc tgtccaagat gcagcagaac 2040 ggctacgaaa atccaaccta caagttcttt gagcagatgc agaactag 2088 <210> 10 <211> 695 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10

Met 1

Leu

Pro

Gly

Leu 5

Ala

Leu

Leu

Leu

Leu 10

Ala

Ala

Trp

Thr

Ala 15

Arg

Ala

Leu

Glu

Val 20

Pro

Thr

Asp

Gly

Asn 25

Ala

Gly

Leu

Leu

Ala 30

Glu

Pro

Gin

Ile

Ala 35

Met

Phe

Cys

Gly

Arg 40

Leu

Asn

Met

His

Met 45

Asn

Val

Gin

Asn

Gly 50

Lys

Trp

Asp

Ser

Asp 55

Pro

Ser

Gly

Thr

Lys 60

Thr

Cys

Ile

Asp

Thr 65

Lys

Glu

Gly

Ile

Leu 70

Gin

Tyr

Cys

Gin

Glu 75

Val

Tyr

Pro

Glu

Leu 80

Gin

Ile

Thr

Asn

Val 85

Val

Glu

Ala

Asn

Gin 90

Pro

Val

Thr

Ile

Gin 95

Asn

Trp

Cys

Lys

Arg 100

Gly

Arg

Lys

Gin

Cys 105

Lys

Thr

His

Pro

His 110

Phe

Val

Ile

Pro

Tyr 115

Arg

Cys

Leu

Val

Gly 120

Glu

Phe

Val

Ser

Asp 125

Ala

Leu

Leu

Val

Pro 130

Asp

Lys

Cys

Lys

Phe 135

Leu

His

Gin

Glu

Arg 140

Met

Asp

Val

Cys

Glu 145

Thr

His

Leu

His

Trp 150

His

Thr

Val

Ala

Lys 155

Glu

Thr

Cys

Ser

Glu 160

PL 205 294 B1

Lys

Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met

Leu

Leu

Pro

Cys

Gly 175

Ile

165

170

Asp

Lys

Phe

Arg

Gly

Val

Glu

Phe

Val

Cys

Cys

Pro

Leu

Ala

Glu

Glu

180

185

190

Ser

Asp

Asn

Val

Asp

Ser

Ala

Asp

Ala

Glu

Glu

Asp

Asp

Ser

Asp

Val

195

200

205

Trp

Trp

Gly

Gly

Ala

Asp

Thr

Asp

Tyr

Ala

Asp

Gly

Ser

Glu

Asp

Lys

210

215

220

Val

Val

Glu

Val

Ala

Glu

Glu

Glu

Glu

Val

Ala

Glu

Val

Glu

Glu

Glu

225

230

235

240

Glu

Ala

Asp

Asp

Asp

Glu

Asp

Asp

Glu

Asp

Gly

Asp

Glu

Val

Glu

Glu

245

250

255

Glu

Ala

Glu

Glu

Pro

Tyr

Glu

Glu

Ala

Thr

Glu

Arg

Thr

Thr

Ser

Ile

260

265

270

Ala

Thr

Thr

Thr

Thr

Thr

Thr

Thr

Glu

Ser

Val

Glu

Glu

Val

Val

Arg

275

280

285

Val

Pro

Thr

Thr

Ala

Ala

Ser

Thr

Pro

Asp

Ala

Val

Asp

Lys

Tyr

Leu

290

295

300

Glu

Thr

Pro

Gly

Asp

Glu

Asn

Glu

His

Ala

His

Phe

Gin

Lys

Ala

Lys

305

310

315

320

Glu

Arg

Leu

Glu

Ala

Lys

His

Arg

Glu

Arg

Met

Ser

Gin

Val

Met

Arg

325

330

335

Glu

Trp

Glu

Glu

Ala

Glu

Arg

Gin

Ala

Lys

Asn

Leu

Pro

Lys

Ala

Asp

340

345

350

Lys

Lys

Ala

Val

Ile

Gin

His

Phe

Gin

Glu

Lys

Val

Glu

Ser

Leu

Glu

355

360

365

Gin

Glu

Ala

Ala

Asn

Glu

Arg

Gin

Gin

Leu

Val

Glu

Thr

His

Met

Ala

370

375

380

Arg

Val

Glu

Ala

Met

Leu

Asn

Asp

Arg

Arg

Arg

Leu

Ala

Leu

Glu

Asn

385

390

395

400

Tyr

Ile

Thr

Ala

Leu

Gin

Ala

Val

Pro

Pro

Arg

Pro

Arg

His

Val

Phe

405

410

415

PL 205 294 B1

Asn

Met

Leu

Lys 420

Lys

Tyr

Val

Arg

Ala 425

Glu

Gin

Lys

Asp

Arg 430

Gin

His

Thr

Leu

Lys 435

His

Phe

Glu

His

Val 440

Arg

Met

Val

Asp

Pro 445

Lys

Lys

Ala

Ala

Gin 450

Ile

Arg

Ser

Gin

Val 455

Met

Thr

His

Leu

Arg 460

Val

Ile

Tyr

Glu

Arg 465

Met

Asn

Gin

Ser

Leu 470

Ser

Leu

Leu

Tyr

Asn 475

Val

Pro

Ala

Val

Ala 480

Glu

Glu

Ile

Gin

Asp 485

Glu

Val

Asp

Glu

Leu 490

Leu

Gin

Lys

Glu

Gin 495

Asn

Tyr

Ser

Asp

Asp 500

Val

Leu

Ala

Asn

Met 505

Ile

Ser

Glu

Pro

Arg 510

Ile

Ser

Tyr

Gly

Asn 515

Asp

Ala

Leu

Met

Pro 520

Ser

Leu

Thr

Glu

Thr 525

Lys

Thr

Thr

Val

Glu 530

Leu

Leu

Pro

Val

Asn 535

Gly

Glu

Phe

Ser

Leu 540

Asp

Asp

Leu

Gin

Pro 545

Trp

His

Ser

Phe

Gly 550

Ala

Asp

Ser

Val

Pro 555

Ala

Asn

Thr

Glu

Asn 560

Glu

Val

Glu

Pro

Val 565

Asp

Ala

Arg

Pro

Ala 570

Ala

Asp

Arg

Gly

Leu 575

Thr

Thr

Arg

Pro

Gly 580

Ser

Gly

Leu

Thr

Asn 585

Ile

Lys

Thr

Glu

Glu 590

Ile

Ser

Glu

Val

Lys 595

Met

Asp

Ala

Glu

Phe 600

Arg

His

Asp

Ser

Gly 605

Tyr

Glu

Val

His

His 610

Gin

Lys

Leu

Val

Phe 615

Phe

Ala

Glu

Asp

Val 620

Gly

Ser

Asn

Lys

Gly 625

Ala

Ile

Ile

Gly

Leu 630

Met

Val

Gly

Gly

Val 635

Val

Ile

Ala

Thr

Val 640

Ile

Val

Ile

Thr

Leu 645

Val

Met

Leu

Lys

Lys 650

Lys

Gin

Tyr

Thr

Ser 655

Ile

His

His

Gly

Val 660

Val

Glu

Val

Asp

Ala 665

Ala

Val

Thr

Pro

Glu 670

Glu

Arg

PL 205 294 B1

<210> 11 <211> 2088 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 atgctgcccg gtttggcact gctcctgctg gccgcctgga cggctcgggc gctggaggta cccactgatg gtaatgctgg cctgctggct gaaccccaga ttgccatgtt ctgtggcaga ctgaacatgc acatgaatgt ccagaatggg aagtgggatt cagatccatc agggaccaaa acctgcattg ataccaagga aggcatcctg cagtattgcc aagaagtcta ccctgaactg cagatcacca atgtggtaga agccaaccaa ccagtgacca tccagaactg gtgcaagcgg ggccgcaagc agtgcaagac ccatccccac tttgtgattc cctaccgctg cttagttggt gagtttgtaa gtgatgccct tctcgttcct gacaagtgca aattcttaca ccaggagagg atggatgttt gcgaaactca tcttcactgg cacaccgtcg ccaaagagac atgcagtgag aagagtacca acttgcatga ctacggcatg ttgctgccct gcggaattga caagttccga ggggtagagt ttgtgtgttg cccactggct gaagaaagtg acaatgtgga ttctgctgat gcggaggagg atgactcgga tgtctggtgg ggcggagcag acacagacta tgcagatggg agtgaagaca aagtagtaga agtagcagag gaggaagaag tggctgaggt ggaagaagaa gaagccgatg atgacgagga cgatgaggat ggtgatgagg tagaggaaga ggctgaggaa ccctacgaag aagccacaga gagaaccacc agcattgcca ccaccaccac caccaccaca gagtctgtgg aagaggtggt tcgagttcct acaacagcag ccagtacccc tgatgccgtt gacaagtatc tcgagacacc tggggatgag aatgaacatg cccatttcca gaaagccaaa gagaggcttg aggccaagca ccgagagaga atgtcccagg tcatgagaga atgggaagag gcagaacgtc aagcaaagaa cttgcctaaa gctgataaga aggcagttat ccagcatttc caggagaaag tggaatcttt ggaacaggaa gcagccaacg agagacagca gctggtggag acacacatgg ccagagtgga agccatgctc aatgaccgcc gccgcctggc cctggagaac tacatcaccg ctctgcaggc tgttcctcct cggcctcgtc acgtgttcaa tatgctaaag aagtatgtcc gcgcagaaca gaaggacaga cagcacaccc taaagcattt cgagcatgtg cgcatggtgg atcccaagaa agccgctcag atccggtccc aggttatgac acacctccgt gtgatttatg agcgcatgaa tcagtctctc tccctgctct acaacgtgcc tgcagtggcc gaggagattc aggatgaagt tgatgagctg cttcagaaag agcaaaacta ttcagatgac gtcttggcca acatgattag tgaaccaagg atcagttacg gaaacgatgc tctcatgcca tctttgaccg aaacgaaaac caccgtggag ctccttcccg tgaatggaga gttcagcctg gacgatctcc agccgtggca ttcttttggg gctgactctg tgccagccaa cacagaaaac gaagttgagc ctgttgatgc ccgccctgct gccgaccgag gactgaccac tcgaccaggt tctgggttga caaatatcaa gacggaggag atctctgaag tgaatctgga tgcagaattc cgacatgact caggatatga agttcatcat caaaaattgg tgttctttgc agaagatgtg ggttcaaaca aaggtgcaat cattggactc atggtgggcg gtgttgtcat agcgacagtg atcgtcatca ccttggtgat gctgaagaag aaacagtaca catccattca tcatggtgtg gtggaggttg acgccgctgt caccccagag gagcgccacc tgtccaagat gcagcagaac ggctacgaaa atccaaccta caagttcttt gagcagatgc agaactag

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1740

1800

1860

1920

1980

2040

2088

PL 205 294 B1 <210> 12 <211> 695 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12

Met 1

Leu

Pro

Gly

Leu 5

Ala

Leu

Leu

Leu

Leu 10

Ala

Ala

Trp

Thr

Ala 15

Arg

Ala

Leu

Glu

Val 20

Pro

Thr

Asp

Gly

Asn 25

Ala

Gly

Leu

Leu

Ala 30

Glu

Pro

Gin

Ile

Ala 35

Met

Phe

Cys

Gly

Arg 40

Leu

Asn

Met

His

Met 45

Asn

Val

Gin

Asn

Gly 50

Lys

Trp

Asp

Ser

Asp 55

Pro

Ser

Gly

Thr

Lys 60

Thr

Cys

Ile

Asp

Thr 65

Lys

Glu

Gly

Ile

Leu 70

Gin

Tyr

Cys

Gin

Glu 75

Val

Tyr

Pro

Glu

Leu 80

Gin

Ile

Thr

Asn

Val 85

Val

Glu

Ala

Asn

Gin 90

Pro

Val

Thr

Ile

Gin 95

Asn

Trp

Cys

Lys

Arg 100

Gly

Arg

Lys

Gin

Cys 105

Lys

Thr

His

Pro

His 110

Phe

Val

Ile

Pro

Tyr 115

Arg

Cys

Leu

Val

Gly 120

Glu

Phe

Val

Ser

Asp 125

Ala

Leu

Leu

Val

Pro 130

Asp

Lys

Cys

Lys

Phe 135

Leu

His

Gin

Glu

Arg 140

Met

Asp

Val

Cys

Glu 145

Thr

His

Leu

His

Trp 150

His

Thr

Val

Ala

Lys 155

Glu

Thr

Cys

Ser

Glu 160

Lys

Ser

Thr

Asn

Leu 165

His

Asp

Tyr

Gly

Met 170

Leu

Leu

Pro

Cys

Gly 175

Ile

Asp

Lys

Phe

Arg 180

Gly

Val

Glu

Phe

Val 185

Cys

Cys

Pro

Leu

Ala 190

Glu

Glu

Ser

Asp

Asn 195

Val

Asp

Ser

Ala

Asp 200

Ala

Glu

Glu

Asp

Asp 205

Ser

Asp

Val

Trp

Trp 210

Gly

Gly

Ala

Asp

Thr 215

Asp

Tyr

Ala

Asp

Gly 220

Ser

Glu

Asp

Lys

PL 205 294 B1

Val Val Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Glu Val Glu Glu Glu

225 230 235 240

Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu

245 250 255

Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser Ile 260 265 270

Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg 275 280 285

Val Pro Thr Thr Ala Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu 290 295 300

Glu Thr Pro Gly Asp Glu Asn Glu His Ala His Phe Gin Lys Ala Lys

305 310 315 320

Glu Arg Leu Glu Ala Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gin Val Met Arg

325 330 335

Glu Trp Glu Glu Ala Glu Arg Gin Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp 340 345 350

Lys Lys Ala Val Ile Gin His Phe Gin Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu 355 360 365

Gin Glu Ala Ala Asn Glu Arg Gin Gin Leu Val Glu Thr His Met Ala 370 375 380

Arg Val Glu Ala Met Leu Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn

385 390 395 400

Tyr Ile Thr Ala Leu Gin Ala Val Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phe

405 410 415

Asn Met Leu Lys Lys Tyr Val Arg Ala Glu Gin Lys Asp Arg Gin His 420 425 430

Thr Leu Lys His Phe Glu His Val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala 435 440 445

Ala Gin Ile Arg Ser Gin Val Met Thr His Leu Arg Val Ile Tyr Glu 450 455 460

Arg Met Asn Gin Ser Leu Ser Leu Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala 465 470 475 480

PL 205 294 B1

Glu

Glu

Ile

Gin

Asp 485

Glu

Val

Asp

Glu

Leu 490

Leu

Gin

Lys

Glu

Gin 495

Asn

Tyr

Ser

Asp

Asp 500

Val

Leu

Ala

Asn

Met 505

Ile

Ser

Glu

Pro

Arg 510

Ile

Ser

Tyr

Gly

Asn 515

Asp

Ala

Leu

Met

Pro 520

Ser

Leu

Thr

Glu

Thr 525

Lys

Thr

Thr

Val

Glu 530

Leu

Leu

Pro

Val

Asn 535

Gly

Glu

Phe

Ser

Leu 540

Asp

Asp

Leu

Gin

Pro 545

Trp

His

Ser

Phe

Gly 550

Ala

Asp

Ser

Val

Pro 555

Ala

Asn

Thr

Glu

Asn 560

Glu

Val

Glu

Pro

Val 565

Asp

Ala

Arg

Pro

Ala 570

Ala

Asp

Arg

Gly

Leu 575

Thr

Thr

Arg

Pro

Gly 580

Ser

Gly

Leu

Thr

Asn 585

Ile

Lys

Thr

Glu

Glu 590

Ile

Ser

Glu

Val

Asn 595

Leu

Asp

Ala

Glu

Phe 600

Arg

His

Asp

Ser

Gly 605

Tyr

Glu

Val

His

His 610

Gin

Lys

Leu

Val

Phe 615

Phe

Ala

Glu

Asp

Val 620

Gly

Ser

Asn

Lys

Gly 625

Ala

Ile

Ile

Gly

Leu 630

Met

Val

Gly

Gly

Val 635

Val

Ile

Ala

Thr

Val 640

Ile

Val

Ile

Thr

Leu 645

Val

Met

Leu

Lys

Lys 650

Lys

Gin

Tyr

Thr

Ser 655

Ile

His

His

Gly

Val 660

Val

Glu

Val

Asp

Ala 665

Ala

Val

Thr

Pro

Glu 670

Glu

Arg

His

Leu

Ser

Lys

Met

Gin

Gin

Asn

Gly

Tyr

Glu

Asn

Pro

Thr

Tyr

Lys

675 680 685

Phe Phe Glu Gin Met Gin Asn 690 695 <210> 13 <211> 2088 <212> DNA <213> Homo sapiens

PL 205 294 B1 <400> 13 atgctgcccg cccactgatg ctgaacatgc acctgcattg cagatcacca ggccgcaagc gagtttgtaa atggatgttt aagagtacca ggggtagagt gcggaggagg agtgaagaca gaagccgatg ccctacgaag gagtctgtgg gacaagtatc gagaggcttg gcagaacgtc caggagaaag acacacatgg tacatcaccg aagtatgtcc cgcatggtgg gtgatttatg gaggagattc gtcttggcca tctttgaccg gacgatctcc gaagttgagc tctgggttga cgacatgact ggttcaaaca atcttcatca gtggaggttg ggctacgaaa gtttggcact gtaatgctgg acatgaatgt ataccaagga atgtggtaga agtgcaagac gtgatgccct gcgaaactca acttgcatga ttgtgtgttg atgactcgga aagtagtaga atgacgagga aagccacaga aagaggtggt tcgagacacc aggccaagca aagcaaagaa tggaatcttt ccagagtgga ctctgcaggc gcgcagaaca atcccaagaa agcgcatgaa aggatgaagt acatgattag aaacgaaaac agccgtggca ctgttgatgc caaatatcaa caggatatga aaggtgcaat ccttggtgat acgccgctgt atccaaccta gctcctgctg cctgctggct ccagaatggg aggcatcctg agccaaccaa ccatccccac tctcgttcct tcttcactgg ctacggcatg cccactggct tgtctggtgg agtagcagag cgatgaggat gagaaccacc tcgagttcct tggsgatgag ccgagagaga cttgcctaaa ggaacaggaa agccatgctc tgttcctcct gaaggacaga agccgctcag tcagtctctc tgatgagctg tgaaccaagg caccgtggag ttcttttggg ccgccctgct gacggaggag agttcatcat cattggactc gctgaagaag caccccagag caagttcttt gccgcctgga gaaccccaga aagtgggatt cagtattgcc ccagtgacca tttgtgattc gacaagtgca cacaccgtcg ttgctgccct gaagaaagtg ggcggagcag gaggaagaag ggtgatgagg agcattgcca acaacagcag aatgaacatg atgtcccagg gctgataaga gcagccaacg aatgaccgcc cggcctcgtc cagcacaccc atccggtccc tccctgctct cttcagaaag atcagttacg ctccttcccg gctgactctg gccgaccgag atctctgaag caaaaattgg atggtgggcg aaacagtaca gagcgccacc gagcagatgc cggctcgggc ttgccatgtt cagatccatc aagaagtcta tccagaactg cctaccgctg aattcttaca ccaaagagac gcggaattga acaatgtgga acacagacta tggctgaggt tagaggaaga ccaccaccac ccagtacccc cccatttcca tcatgagaga aggcagttat agagacagca gccgcctggc acgtgttcaa taaagcattt aggttatgac acaacgtgcc agcaaaacta gaaacgatgc tgaatggaga tgccagccaa gactgaccac tgaagatgga tgttctttgc gtgttgtcat catccattca tgtccaagat agaactag gctggaggta ctgtggcaga agggaccaaa ccctgaactg gtgcaagcgg cttagttggt ccaggagagg atgcagtgag caagttccga ttctgctgat tgcagatggg ggaagaagaa ggctgaggaa caccaccaca tgatgccgtt gaaagccaaa atgggaagag ccagcatttc gctggtggag cctggagaac tatgctaaag cgagcatgtg acacctccgt tgcagtggcc ttcagatgac tctcatgcca gttcagcctg cacagaaaac tcgaccaggt tgcagaattc agaagatgtg agcgacagtg tcatggtgtg gcagcagaac

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1740

1800

1860

1920

1980

2040

2088 <210> 14 <211> 695 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14

Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala 15 10

Ala Trp Thr Ala Arg 15

Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro

PL 205 294 B1

20

25

30

Gin

Ile

Ala

Met

Phe

Cys

Gly

Arg

Leu

Asn

Met

His

Met

Asn

Val

Gin

35

40

45

Asn

Gly

Lys

Trp

Asp

Ser

Asp

Pro

Ser

Gly

Thr

Lys

Thr

Cys

Ile

Asp

50

55

60

Thr

Lys

Glu

Gly

Ile

Leu

Gin

Tyr

Cys

Gin

Glu

Val

Tyr

Pro

Glu

Leu

65

70

75

80

Gin

Ile

Thr

Asn

Val

Val

Glu

Ala

Asn

Gin

Pro

Val

Thr

Ile

Gin

Asn

85

90

95

Trp

Cys

Lys

Arg

Gly

Arg

Lys

Gin

Cys

Lys

Thr

His

Pro

His

Phe

Val

100

105

110

Ile

Pro

Tyr

Arg

Cys

Leu

Val

Gly

Glu

Phe

Val

Ser

Asp

Ala

Leu

Leu

115

120

125

Val

Pro

Asp

Lys

Cys

Lys

Phe

Leu

His

Gin

Glu

Arg

Met

Asp

Val

Cys

130

135

140

Glu

Thr

His

Leu

His

Trp

His

Thr

Val

Ala

Lys

Glu

Thr

Cys

Ser

Glu

145

150

155

160

Lys

Ser

Thr

Asn

Leu

His

Asp

Tyr

Gly

Met

Leu

Leu

Pro

Cys

Gly

Ile

165

170

175

Asp

Lys

Phe

Arg

Gly

Val

Glu

Phe

Val

Cys

Cys

Pro

Leu

Ala

Glu

Glu

180

185

190

Ser

Asp

Asn

Val

Asp

Ser

Ala

Asp

Ala

Glu

Glu

Asp

Asp

Ser

Asp

Val

195

-

200

205

Trp

Trp

Gly

Gly

Ala

Asp

Thr

Asp

Tyr

Ala

Asp

Gly

Ser

Glu

Asp

Lys

210

215

220

Val

Val

Glu

Val

Ala

Glu

Glu

Glu

Glu

Val

Ala

Glu

Val

Glu

Glu

Glu

225

230

235

240

Glu

Ala

Asp

Asp

Asp

Glu

ASp

Asp

Glu

Asp

Gly

Asp

Glu

Val

Glu

Glu

245

250

255

Glu

Ala

Glu

Glu

Pro

Tyr

Glu

Glu

Ala

Thr

Glu

Arg

Thr

Thr

Ser

Ile

260

265

270

Ala

Thr

Thr

Thr

Thr

Thr

Thr

Thr

Glu

Ser

Val

Glu

Glu

Val

Val

Arg

PL 205 294 B1

275

280

285

Val

Pro

Thr

Thr

Ala

Ala

Ser

Thr

Pro

Asp

Ala

Val

Asp

Lys

Tyr

Leu

290

295

300

Glu

Thr

Pro

Gly

Asp

Glu

Asn

Glu

His

Ala

His

Phe

Gin

Lys

Ala

Lys

305

310

315

320

Glu

Arg

Leu

Glu

Ala

Lys

His

Arg

Glu

Arg

Met

Ser

Gin

Val

Met

Arg

325

330

335

Glu

Trp

Glu

Glu

Ala

Glu

Arg

Gin

Ala

Lys

Asn

Leu

Pro

Lys

Ala

Asp

340

345

350

Lys

Lys

Ala

Val

Ile

Gin

His

Phe

Gin

Glu

Lys

Val

Glu

Ser

Leu

Glu

355

360

365

Gin

Glu

Ala

Ala

Asn

Glu

Arg

Gin

Gin

Leu

Val

Glu

Thr

His

Met

Ala

370

375

380

Arg

Val

Glu

Ala

Met

Leu

Asn

Asp

Arg

Arg

Arg

Leu

Ala

Leu

Glu

Asn

385

390

395

400

Tyr

Ile

Thr

Ala

Leu

Gin

Ala

Val

Pro

Pro

Arg

Pro

Arg

His

Val

Phe

405

410

415

Asn

Met

Leu

Lys

Lys

Tyr

Val

Arg

Ala

Glu

Gin

Lys

Asp

Arg

Gin

His

420

425

430

Thr

Leu

Lys

His

Phe

Glu

His

Val

Arg

Met

Val

Asp

Pro

Lys

Lys

Ala

435

440

445

Ala

Gin

Ile

Arg

Ser

Gin

Val

Met

Thr

His

Leu

Arg

Val

Ile

Tyr

Glu

450

45,5

460

Arg

Met

Asn

Gin

Ser

Leu

Ser

Leu

Leu

Tyr

Asn

Val

Pro

Ala

Val

Ala

465

470

475

480

Glu

Glu

Ile

Gin

Asp

Glu

Val

Asp

Glu

Leu

Leu

Gin

Lys

Glu

Gin

Asn

485

490

49S

Tyr

Ser

Asp

Asp

Val

Leu

Ala

Asn

Met

Ile

Ser

Glu

Pro

Arg

Ile

Ser

500

505

510

Tyr

Gly

Asn

Asp

Ala

Leu

Met

Pro

Ser

Leu

Thr

Glu

Thr

Lys

Thr

Thr

515

520

525

Val

Glu

Leu

Leu

Pro

Val

Asn

Gly

Glu

Phe

Ser

Leu

Asp

Asp

Leu

Gin

PL 205 294 B1

530 535 540

Pro Trp His Ser Phe Gly Ala Asp Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn

545 550 555 560

Glu Val Glu Pro Val Asp Ala Arg Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr

565 570 575

Thr Arg Pro Gly Ser Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser 580 585 590

Glu Val Lys Met Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val 595 600 605

His His Gin Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys 610 615 620

Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val

625 630 635 640

Ile Phe Ile Thr Leu Val Met Leu Lys Lys Lys Gin Tyr Thr Ser Ile

645 650 655

His His Gly Val Val Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg 660 665 670

His Leu Ser Lys Met Gin Gin Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys 675 680 685

Phe Phe Glu Gin Met Gin Asn 690 695 <210> 15 <211> 2094 ' <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 atgctgcccg gtttggcact gctcctgctg gccgcctgga cggctcgggc gctggaggta 60 cccactgatg gtaatgctgg cctgctggct gaaccccaga ttgccatgtt ctgtggcaga 120 ctgaacatgc acatgaatgt ccagaatggg aagtgggatt cagatccatc agggaccaaa 180 acctgcattg ataccaagga aggcatcctg cagtattgcc aagaagtcta ccctgaactg 240 cagatcacca atgtggtaga agccaaccaa ccagtgacca tccagaactg gtgcaagcgg 300 ggccgcaagc agtgcaagac ccatccccac tttgtgattc cctaccgctg cttagttggt 360 gagtttgtaa gtgatgccct tctcgttcct gacaagtgca aattcttaca ccaggagagg 420 atggatgttt gcgaaactca tcttcactgg cacaccgtcg ccaaagagac atgcagtgag 480 aagagtacca acttgcatga ctacggcatg ttgctgccct gcggaattga caagttccga 540

PL 205 294 B1 ggggtagagt ttgtgtgttg cccactggct gaagaaagtg acaatgtgga ttctgctgat gcggaggagg atgactcgga tgtctggtgg ggcggagcag acacagacta tgcagatggg agtgaagaca aagtagtaga agtagcagag gaggaagaag tggctgaggt ggaagaagaa gaagccgatg atgacgagga cgatgaggat ggtgatgagg tagaggaaga ggctgaggaa ccctacgaag aagccacaga gagaaccacc agcattgcca ccaccaccac caccaccaca gagtctgtgg aagaggtggt tcgagttcct acaacagcag ccagtacccc tgatgccgtt gacaagtatc tcgagacacc tggggatgag aatgaacatg cccatttcca gaaagccaaa gagaggcttg aggccaagca ccgagagaga atgtcccagg tcatgagaga atgggaagag gcagaacgtc aagcaaagaa cttgcctaaa gctgataaga aggcagttat ccagcatttc caggagaaag tggaatcttt ggaacaggaa gcagccaacg agagacagca gctggtggag acacacatgg ccagagtgga agccatgctc aatgaccgcc gccgcctggc cctggagaac tacatcaccg ctctgcaggc tgttcctcct cggcctcgtc acgtgttcaa tatgctaaag aagtatgtcc gcgcagaaca gaaggacaga cagcacaccc taaagcattt cgagcatgtg cgcatggtgg atcccaagaa agccgctcag atccggtccc aggttatgac acacctccgt gtgatttatg agcgcatgaa tcagtctctc tccctgctct acaacgtgcc tgcagtggcc gaggagattc aggatgaagt tgatgagctg cttcagaaag agcaaaacta ttcagatgac gtcttggcca acatgattag tgaaccaagg atcagttacg gaaacgatgc tctcatgcca tctttgaccg aaacgaaaac caccgtggag ctccttcccg tgaatggaga gttcagcctg gacgatctcc agccgtggca ttcttttggg gctgactctg tgccagccaa cacagaaaac gaagttgagc ctgttgatgc ccgccctgct gccgaccgag gactgaccac tcgaccaggt tctgggttga caaatatcaa gacggaggag atctctgaag tgaagatgga tgcagaattc cgacatgact caggatatga agttcatcat caaaaattgg tgttctttgc agaagatgtg ggttcaaaca aaggtgcaat cattggactc atggtgggcg gtgttgtcat agcgacagtg atcgtcatca ccttggtgat gctgaagaag aaacagtaca catccattca tcatggtgtg gtggaggttg acgccgctgt caccccagag gagcgccacc tgtccaagat gcagcagaac ggctacgaaa atccaaccta caagttcttt gagcagatgc agaacaagaa gtag <210> 16 <211> 697 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16

Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg

5 10 15

Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro

25 30

Gin Ile Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gin 35 40 45

Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp 50 55 60

Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gin Tyr Cys Gin Glu Val Tyr Pro Glu Leu 65 70 75 80

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1740

1800

1860

1920

1980

2040

2094

PL 205 294 B1

Gin Ile Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gin Pro Val Thr Ile Gin Asn 85 90 95

Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gin Cys Lys Thr His Pro His Phe Val 100 105 110

Ile Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu 115 120 125

Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gin Glu Arg Met Asp Val Cys 130 135 140

Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu

145 150 155 160

Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly Ile

165 170 175

Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu 180 185 190

Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val 195 200 205

Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Asp Lys 210 215 220

Val Val Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Glu Val Glu Glu Glu

225 230 235 240

Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu

245 250 255

Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser Ile 260 ' 265 270

Ala

Thr

Thr

Thr

Thr

Thr

Thr

Thr

Glu

Ser

Val

Glu

Glu

Val

Val

Arg

275

280

285

Val

Pro

Thr

Thr

Ala

Ala

Ser

Thr

Pro

Asp

Ala

Val

Asp

Lys

Tyr

Leu

290

295

300

PL 205 294 B1

Glu

Trp

Glu Glu 340

Ala Glu

Arg Gin Ala 345

Lys

Asn

Leu

Pro

Lys 350

Ala

Asp

Lys

Lys

Ala

Val

Ile

Gin

His

Phe

Gin

Glu

Lys

Val

Glu

Ser

Leu

Glu

355

360

365

Gin

Glu

Ala

Ala

Asn

Glu

Arg

Gin

Gin

Leu

Val

Glu

Thr

His

Met

Ala

370

375

380

Arg

Val

Glu

Ala

Met

Leu

Asn

Asp

Arg

Arg

Arg

Leu

Ala

Leu

Glu

Asn

385

390

395

400

Tyr

Ile

Thr

Ala

Leu

Gin

Ala

Val

Pro

Pro

Arg

Pro

Arg

His

Val

Phe

405

410

415

Asn

Met

Leu

Lys

Lys

Tyr

Val

Arg

Ala

Glu

Gin

Lys

Asp

Arg

Gin

His

420

425

430

Thr

Leu

Lys

His

Phe

Glu

His

Val

Arg

Met

Val

Asp

Pro

Lys

Lys

Ala

435

440

445

Ala

Gin

Ile

Arg

Ser

Gin

Val

Met

Thr

His

Leu

Arg

Val

Ile

Tyr

Glu

450

455

460

Arg

Met

Asn

Gin

Ser

Leu

Ser

Leu

Leu

Tyr

Asn

Val

Pro

Ala

Val

Ala

465

470

475

480

Glu

Glu

Ile

Gin

Asp

Glu

Val

Asp

Glu

Leu

Leu

Gin

Lys

Glu

Gin

Asn

485

490

495

Tyr

Ser

Asp

Asp

Val

Leu

Ala

Asn

Met

Ile

Ser

Glu

Pro

Arg

Ile

Ser

500

505

510

Tyr

Gly

Asn

Asp

Ala

Leu

Met

Pro

Ser

Leu

Thr

Glu

Thr

Lys

Thr

Thr

515

520

525

Val

Glu

Leu

Leu

Pro

Val

Asn

Gly

Glu

Phe

Ser

Leu

Asp

Asp

Leu

Gin

530

535

540

Pro

Trp

His

Ser

Phe

Gly

Ala

Asp

Ser

Val

Pro

Ala

Asn

Thr

Glu

Asn

545

550

555

560

Glu

Val

Glu

Pro

Val

Asp

Ala

Arg

Pro

Ala

Ala

Asp

Arg

Gly

Leu

Thr

565

570

575

Thr

Arg

Pro

Gly

Ser

Gly

Leu

Thr

Asn

Ile

Lys

Thr

Glu

Glu

Ile

Ser

580

585

590

PL 205 294 B1

Glu

Val

Lys Met 595

Asp

Ala

Glu

Phe 600

Arg

His

Asp

Ser Gly Tyr 605

Glu

Val

His

His

Gin

Lys

Leu

Val

Phe

Phe

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Ser

Asn

Lys

610

615

620

Gly

Ala

Ile

Ile

Gly

Leu

Met

Val

Gly

Gly

Val

Val

Ile

Ala

Thr

Val

625

630

635

640

Ile

Val

Ile

Thr

Leu

Val

Met

Leu

Lys

Lys

Lys

Gin

Tyr

Thr

Ser

Ile

645

650

655

His

His

Gly

Val

Val

Glu

Val

Asp

Ala

Ala

Val

Thr

Pro

Glu

Glu

Arg

660

665

670

His

Leu

Ser

Lys

Met

Gin

Gin

Asn

Gly

Tyr

Glu

Asn

Pro

Thr

Tyr

Lys

675

680

685

Phe

Phe

Glu

Gin

Met

Gin

Asn

Lys

Lys

690 695 <210> 17 <211> 2094 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 atgctgcccg cccactgatg ctgaacatgc acctgcattg cagatcacca ggccgcaagc gagtttgtaa atggatgttt aagagtacca ggggtagagt gcggaggagg agtgaagaca gaagccgatg ccctacgaag gagtctgtgg gacaagtatc gagaggcttg gcagaacgtc caggagaaag acacacatgg gtttggcact gtaatgctgg acatgaatgt ataccaagga atgtggtaga agtgcaagac gtgatgccct gcgaaactca acttgcatga ttgtgtgttg atgactcgga aagtagtaga atgacgagga aagccacaga aagaggtggt tcgagacacc aggccaagca aagcaaagaa tggaatcttt ccagagtgga gctcctgctg cctgctggct ccagaatggg aggcatcctg agccaaccaa ccatccccac tctcgttcct tcttcactgg ctacggcatg cccactggct tgtctggtgg agtagcagag cgatgaggat gagaaccacc tcgagttcct tggggatgag ccgagagaga cttgcctaaa ggaacaggaa agccatgctc gccgcctgga gaaccccaga aagtgggatt cagtattgcc ccagtgacca tttgtgattc gacaagtgca cacaccgtcg ttgctgccct gaagaaagtg ggcggagcag gaggaagaag ggtgatgagg agcattgcca acaacagcag aatgaacatg atgtcccagg gctgataaga gcagccaacg aatgaccgcc cggctcgggc ttgccatgtt cagatccatc aagaagtcta tccagaactg cctaccgctg aattcttaca ccaaagagac gcggaattga acaatgtgga acacagacta tggctgaggt tagaggaaga ccaccaccac ccagtacccc cccatttcca tcatgagaga aggcagttat agagacagca gccgcctggc gctggaggta ctgtggcaga agggaccaaa ccctgaactg gtgcaagcgg cttagttggt ccaggagagg atgcagtgag caagttccga ttctgctgat tgcagatggg ggaagaagaa ggctgaggaa caccaccaca tgatgccgtt gaaagccaaa atgggaagag ccagcatttc gctggtggag cctggagaac

120 180 240 300 360 420 480 54 0 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200

PL 205 294 B1 tacatcaccg ctctgcaggc tgttcctcct cggcctcgtc acgtgttcaa tatgctaaag 1260 aagtatgtcc gcgcagaaca gaaggacaga cagcacaccc taaagcattt cgagcatgtg 1320 cgcatggtgg atcccaagaa agccgctcag atccggtccc aggttatgac acacctccgt 13BO gtgatttatg agcgcatgaa tcagtctctc tccctgctct acaacgtgcc tgcagtggcc 1440 gaggagattc aggatgaagt tgatgagctg cttcagaaag agcaaaacta ttcagatgac 1500 gtcttggcca acatgattag tgaaccaagg atcagttacg gaaacgatgc tctcatgcca 1560 tctttgaccg aaacgaaaac caccgtggag ctccttcccg tgaatggaga gttcagcctg 1620 gacgatctcc agccgtggca ttcttttggg gctgactctg tgccagccaa cacagaaaac 1680 gaagttgagc ctgttgatgc ccgccctgct gccgaccgag gactgaccac tcgaccaggt 1740 tctgggttga caaatatcaa gacggaggag atctctgaag tgaatctgga tgcagaattc 1800 cgacatgact caggatatga agttcatcat caaaaattgg tgttctttgc agaagatgtg 1860 ggttcaaaca aaggtgcaat cattggactc atggtgggcg gtgttgtcat agcgacagtg 1920 atcgtcatca ccttggtgat gctgaagaag aaacagtaca catccattca tcatggtgtg 1980 gtggaggttg acgccgctgt caccccagag gagcgccacc tgtccaagat gcagcagaac 2040 ggctacgaaa atccaaccta caagttcttt gagcagatgc agaacaagaa gtag 2094 <210> 18 <211> 697 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18

Met 1

Leu

Pro

Gly

Leu 5

Ala

Leu

Leu

Leu

Leu 10

Ala

Ala

Trp

Thr

Ala 15

Arg

Ala

Leu

Glu

Val 20

Pro

Thr

Asp

Gly

Asn 25

Ala

Gly

Leu

Leu

Ala 30

Glu

Pro

Gin

Ile

Ala 35

Met

Phe

Cys

Gly

Arg 40

Leu

Asn

Met

His

Met 45

Asn

Val

Gin

Asn

Gly 50

Lys

Trp

Asp

Ser

Asp 55

Pro

Ser

Gly

Thr

Lys 60

Thr

Cys

Ile

Asp

Thr 65

Lys

Glu

Gly

Ile

Leu 70

Gin

Tyr

Cys

Gin

Glu 75

Val

Tyr

Pro

Glu

Leu 80

Gin

Ile

Thr

Asn

Val 85

Val

Glu

Ala

Asn

Gin 90

Pro

Val

Thr

Ile

Gin 95

Asn

Trp

Cys

Lys

Arg 100

Gly

Arg

Lys

Gin

Cys 105

Lys

Thr

His

Pro

His 110

Phe

Val

Ile

Pro

Tyr 115

Arg

Cys

Leu

Val

Gly 120

Glu

Phe

Val

Ser

Asp 125

Ala

Leu

Leu

Val

Pro 130

Asp

Lys

Cys

Lys

Phe 135

Leu

His

Gin

Glu

Arg 140

Met

Asp

Val

Cys

PL 205 294 B1

Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu

145 150 155 160

Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly Ile

165 170 175

Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu 180 185 190

Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val 195 200 205

Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Asp Lys 210 215 220

Val Val Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Glu Val Glu Glu Glu

225 230 235 240

Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu

245 250 255

Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser Ile 260 265 270

Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg 275 280 285

Val Pro Thr Thr Ala Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu 290 295 300

Glu Thr Pro Gly Asp Glu Asn Glu His Ala His Phe Gin Lys Ala Lys

305 310 315 320

Glu Arg Leu Glu Ala Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gin Val Met Arg

325 330 335

Glu Trp Glu Glu Ala Glu Arg Gin Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp 340 345 350

Lys Lys Ala Val Ile Gin His Phe Gin Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu 355 360 365

Gin Glu Ala Ala Asn Glu Arg Gin Gin Leu Val Glu Thr His Met Ala 370 375 380

Arg Val Glu Ala Met Leu Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn 385 390 395 400

PL 205 294 B1

Tyr Ile Thr Ala Leu 405

Asn Met Leu Lys Lys 420

Thr Leu Lys His Phe 435

Ala Gin Ile Arg Ser 450

Arg Met Asn Gin Ser 465

Glu Glu Ile Gin Asp 485

Tyr Ser Asp Asp Val 500

Tyr Gly Asn Asp Ala 515

Val Glu Leu Leu Pro 530

Pro Trp His Ser Phe 545

Glu Val Glu Pro Val 565

Thr Arg Pro Gly Ser 580

Glu Val Asn Leu Asp 595

His His Gin Lys Leu 610

Gly Ala Ile Ile Gly 625

Ile Val Ile Thr Leu 645

Gin Ala Val Pro Pro 410

Tyr Val Arg Ala Glu 425

Glu His Val Arg Met 440

Gin Val Met Thr His 455

Leu Ser Leu Leu Tyr 470

Glu Val Asp Glu Leu 490

Leu Ala Asn Met Ile 505

Leu Met Pro Ser Leu 520

Val Asn Gly Glu Phe 535

Gly Ala Asp Ser Val 550

Asp Ala Arg Pro Ala 570

Gly Leu Thr Asn Ile 585

Ala Glu Phe Arg His 600

Val Phe Phe Ala Glu 615

Leu Met Val Gly Gly 630

Val Met Leu Lys Lys 650

Arg Pro Arg His Val Phe 415

Gin Lys Asp Arg Gin His 430

Val Asp Pro Lys Lys Ala 445

Leu Arg Val Ile Tyr Glu 460

Asn Val Pro Ala Val Ala 475 480

Leu Gin Lys Glu Gin Asn 495

Ser Glu Pro Arg Ile Ser 510

Thr Glu Thr Lys Thr Thr 525

Ser Leu Asp Asp Leu Gin 540

Pro Ala Asn Thr Glu Asn 555 560

Ala Asp Arg Gly Leu Thr 575

Lys Thr Glu Glu Ile Ser 590

Asp Ser Gly Tyr Glu Val 605

Asp Val Gly Ser Asn Lys 620

Val Val Ile Ala Thr Val 635 640

Lys Gin Tyr Thr Ser Ile 655

PL 205 294 B1

His	His	Gly	Val 660	Val	Glu	Val	Asp
His	Leu	Ser 675	Lys	Met	Gin	Gin	Asn 680
Phe	Phe 690	Glu	Gin	Met	Gin	Asn 695	Lys

Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg 665 670

Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys 685

Lys <210> 19 <211> 2094 <212> DNA <213> Homo <400> 19 atgctgcccg cccactgatg ctgaacatgc acctgcattg cagatcacca ggccgcaagc gagtttgtaa atggatgttt aagagtacca ggggtagagt gcggaggagg agtgaagaca gaagccgatg ccctacgaag gagtctgtgg gacaagtatc gagaggcttg gcagaacgtc caggagaaag acacacatgg tacatcaccg aagtatgtcc cgcatggtgg gtgatttatg gaggagattc gtcttggcca tctttgaccg gacgatctcc gaagttgagc tctgggttga cgacatgact sapiens gtttggcact gtaatgctgg acatgaatgt ataccaagga atgtggtaga agtgcaagac gtgatgccct gcgaaactca acttgcatga ttgtgtgttg atgactcgga aagtagtaga atgacgagga aagccacaga aagaggtggt tcgagacacc aggccaagca aagcaaagaa tggaatcttt ccagagtgga ctctgcaggc gcgcagaaca atcccaagaa agcgcatgaa aggatgaagt acatgattag aaacgaaaac agccgtggca ctgttgatgc caaatatcaa caggatatga gctcctgctg cctgctggct ccagaatggg aggcatcctg agccaaccaa ccatccccac tctcgttcct tcttcactgg ctacggcatg cccactggct tgtctggtgg agtagcagag cgatgaggat gagaaccacc tcgagttcct tggggatgag ccgagagaga cttgcctaaa ggaacaggaa agccatgctc tgttcctcct gaaggacaga agccgctcag tcagtctctc tgatgagctg tgaaccaagg caccgtggag ttcttttggg ccgccctgct gacggaggag agttcatcat gccgcctgga gaaccccaga aagtgggatt cagtattgcc ccagtgacca tttgtgattc gacaagtgca cacaccgtcg ttgctgccct gaagaaagtg ggcggagcag gaggaagaag ggtgatgagg agcattgcca acaacagcag aatgaacatg atgtcccagg gctgataaga gcagccaacg aatgaccgcc cggcctcgtc cagcacaccc atccggtccc tccctgctct cttcagaaag atcagttacg ctccttcccg gctgactctg gccgaccgag atctctgaag caaaaattgg cggctcgggc gctggaggta 60 ttgccatgtt ctgtggcaga 120 cagatccatc agggaccaaa 180 aagaagtcta ccctgaactg 240 tccagaactg gtgcaagcgg 300 cctaccgctg cttagttggt 360 aattcttaca ccaggagagg 420 ccaaagagac atgcagtgag 480 gcggaattga caagttccga 540 acaatgtgga ttctgctgat 600 acacagacta tgcagatggg 660 tggctgaggt ggaagaagaa 720 tagaggaaga ggctgaggaa 780 ccaccaccac caccaccaca 840 ccagtacccc tgatgccgtt 900 cccatttcca gaaagccaaa 960 tcatgagaga atgggaagag 1020 aggcagttat ccagcatttc 1080 agagacagca gctggtggag 1140 gccgcctggc cctggagaac 1200 acgtgttcaa tatgctaaag 1260 taaagcattt cgagcatgtg 1320 aggttatgac acacctccgt 1380 acaacgtgcc tgcagtggcc 1440 agcaaaacta ttcagatgac 1500 gaaacgatgc tctcatgcca 1560 tgaatggaga gttcagcctg 1620 tgccagccaa cacagaaaac 16BO gactgaccac tcgaccaggt 1740 tgaagatgga tgcagaattc 1800 tgttctttgc agaagatgtg 1860

PL 205 294 B1 ggttcaaaca aaggtgcaat cattggactc atggtgggcg gtgttgtcat agcgacagtg atcttcatca ccttggtgat gctgaagaag aaacagtaca catccattca tcatggtgtg gtggaggttg acgccgctgt caccccagag gagcgccacc tgtccaagat gcagcagaac ggctacgaaa atccaaccta caagttcttt gagcagatgc agaacaagaa gtag <210> 20 <211> 697 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20

Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg 15 10 15

Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro 20 25 30

1920

1980

2040

2094

Gin Ile Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gin 35 40 45

Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp

55 60

Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gin Tyr Cys Gin Glu Val Tyr Pro Glu Leu 65 70 75 80

Gin Ile Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gin Pro Val Thr Ile Gin Asn 85 90 95

Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gin Cys Lys Thr His Pro His Phe Val 100 105 110

Ile Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu

115 120 125

Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gin Glu Arg Met Asp Val Cys 130 135 140

Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu

145 150 155 160

Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly Ile

165 170 175

Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu 180 185 190

Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val

PL 205 294 B1

195

200

205

Trp

Trp

Gly

Gly

Ala

Asp

Thr

Asp

Tyr

Ala

Asp

Gly

Ser

Glu

Asp

Lys

210

215

220

Val

Val

Glu

Val

Ala

Glu

Glu

Glu

Glu

Val

Ala

Glu

Val

Glu

Glu

Glu

225

230

235

240

Glu

Ala

Asp

Asp

Asp

Glu

Asp

Asp

Glu

Asp

Gly

Asp

Glu

val

Glu

Glu

245

250

255

Glu

Ala

Glu

Glu

Pro

Tyr

Glu

Glu

Ala

Thr

Glu

Arg

Thr

Thr

Ser

Ile

260

265

270

Ala

Thr

Thr

Thr

Thr

Thr

Thr

Thr

Glu

Ser

Val

Glu

Glu

Val

Val

Arg

275

280

285

Val

Pro

Thr

Thr

Ala

Ala

Ser

Thr

Pro

Asp

Ala

Val

Asp

Lys

Tyr

Leu

290

295

300

Glu

Thr

Pro

Gly

Asp

Glu

Asn

Glu

His

Ala

His

Phe

Gin

Lys

Ala

Lys

305

310

315

320

Glu

Arg

Leu

Glu

Ala

Lys

His

Arg

Glu

Arg

Met

Ser

Gin

Val

Met

Arg

325

330

335

Glu

Trp

Glu

Glu

Ala

Glu

Arg

Gin

Ala

Lys

Asn

Leu

Pro

Lys

Ala

Asp

340

345

350

Lys

Lys

Ala

Val

Ile

Gin

His

Phe

Gin

Glu

Lys

Val

Glu

Ser

Leu

Glu

355

360

365

Gin

Glu

Ala

Ala

Asn

Glu

Arg

Gin

Gin

Leu

Val

Glu

Thr

His

Met

Ala

370

375

380

Arg

Val

Glu

Ala

Met

Leu

Asn

Asp

Arg

Arg

Arg

Leu

Ala

Leu

Glu

Asn

385

390

395

400

Tyr

Ile

Thr

Ala

Leu

Gin

Ala

Val

Pro

Pro

Arg

Pro

Arg

His

Val

Phe

405

410

415

Asn

Met

Leu

Lys

Lys

Tyr

Val

Arg

Ala

Glu

Gin

Lys

Asp

Arg

Gin

His

420

425

430

Thr

Leu

Lys

His

Phe

Glu

His

Val

Arg

Met

Val

Asp

Pro

Lys

Lys

Ala

435

440

445

Ala

Gin

Ile

Arg

Ser

Gin

Val

Met

Thr

His

Leu

Arg

Val

Ile

Tyr

Glu

PL 205 294 B1

450

455

460

Arg

Met

Asn

Gin

Ser

Leu

Ser

Leu

Leu

Tyr

Asn

Val

Pro

Ala

Val

Ala

465

470

475

480

Glu

Glu

Ile

Gin

Asp

Glu

Val

Asp

Glu

Leu

Leu

Gin

Lys

Glu

Gin

Asn

485

490

495

Tyr

Ser

Asp

Asp

Val

Leu

Ala

Asn

Met

Ile

Ser

Glu

Pro

Arg

Ile

Ser

500

505

SIO

Tyr

Gly

Asn

Asp

Ala

Leu

Met

Pro

Ser

Leu

Thr

Glu

Thr

Lys

Thr

Thr

515

520

525

Val

Glu

Leu

Leu

Pro

Val

Asn

Gly

Glu

Phe

Ser

Leu

Asp

Asp

Leu

Gin

530

535

540

Pro

Trp

His

Ser

Phe

Gly

Ala

Asp

Ser

Val

Pro

Ala

Asn

Thr

Glu

Asn

545

550

555

560

Glu

Val

Glu

Pro

Val

Asp

Ala

Arg

Pro

Ala

Ala

Asp

Arg

Gly

Leu

Thr

565

570

575

Thr

Arg

Pro

Gly

Ser

Gly

Leu

Thr

Asn

Ile

Lys

Thr

Glu

Glu

Ile

Ser

580

585

590

Glu

Val

Lys

Met

Asp

Ala

Glu

Phe

Arg

His

Asp

Ser

Gly

Tyr

Glu

Val

595

600

605

His

His

Gin

Lys

Leu

Val

Phe

Phe

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Ser

Asn

Lys

610

615

620

Gly

Ala

Ile

Ile

Gly

Leu

Met

Val

Gly

Gly

Val

Val

Ile

Ala

Thr

Val

625

630

635

640

Ile

Phe

Ile

Thr

Leu

Val

Met

Leu

Lys

Lys

Lys

Gin

Tyr

Thr

Ser

Ile

645

650

655

His

His

Gly

Val

Val

Glu

Val

Asp

Ala

Ala

Val

Thr

Pro

Glu

Glu

Arg

660

665

670

His

Leu

Ser

Lys

Met

Gin

Gin

Asn

Gly

Tyr

Glu

Asn

Pro

Thr

Tyr

Lys

675

680

685

Phe

Phe

Glu

Gin

Met

Gin

Asn

Lys

Lys

690

695

PL 205 294 B1

<210> <211> <212> <213>	21
1341 DNA Homo	sapiens
<400>	21
atggctagca	tgactggtgg	acagcaaatg	ggtcgcggat	ccacccagca	cggcatccgg	60
ctgcccctgc	gcagcggcct	ggggggcgcc	cccctggggc	tgcggctgcc	ccgggagacc	120
gacgaagagc	ccgaggagcc	cggccggagg	ggcagctttg	tggagatggt	ggacaacctg	180

aggggcaagt cggggcaggg ctactacgtg gagatgaccg tgggcagccc cccgcagacg 240 ctcaacatcc tggtggatac aggcagcagt aactttgcag tgggtgctgc cccccacccc 300 ttcctgcatc gctactacca gaggcagctg tccagcacat accgggacct ccggaagggt 360 gtgtatgtgc cctacaccca gggcaagtgg gaaggggagc tgggcaccga cctggtaagc 420 atcccccatg gccccaacgt cactgtgcgt gccaacattg ctgccatcac tgaatcagac 480 aagttcttca tcaacggctc caactgggaa ggcatcctgg ggctggccta tgctgagatt 540 gccaggcctg acgactccct ggagcctttc tttgactctc tggtaaagca gacccacgtt 600 cccaacctct tctccctgca cctttgtggt gctggcttcc ccctcaacca gtctgaagtg 660 ctggcctctg tcggagggag catgatcatt ggaggtatcg accactcgct gtacacaggc 720 agtctctggt atacacccat ccggcgggag tggtattatg aggtcatcat tgtgcgggtg 780 gagatcaatg gacaggatct gaaaatggac tgcaaggagt acaactatga caagagcatt 840 gtggacagtg gcaccaccaa ccttcgtttg cccaagaaag tgtttgaagc tgcagtcaaa 900 tccatcaagg cagcctcctc cacggagaag ttccctgatg gtttctggct aggagagcag 960 ctggtgtgct ggcaagcagg caccacccct tggaacattt tcccagtcat ctcactctac 1020 ctaatgggtg aggttaccaa ccagtccttc cgcatcacca tccttccgca gcaatacctg 1080 cggccagtgg aagatgtggc cacgtcccaa gacgactgtt acaagtttgc catctcacag 1140 tcatccacgg gcactgttat gggagctgtt atcatggagg gcttctacgt tgtctttgat 1200 cgggcccgaa aacgaattgg ctttgctgtc agcgcttgcc atgtgcacga tgagttcagg 1260 acggcagcgg tggaaggccc ttttgtcacc ttggacatgg aagactgtgg ctacaacatt 1320 ccacagacag atgagtcatg a 1341 <210> 22 <211> 446 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22

Met 1

Ala

Ser

Met

Thr 5

Gly

Gly

Gin

Gin

Met 10

Gly

Arg

Gly

Ser

Thr 15

Gin

His

Gly

Ile

Arg 20

Leu

Pro

Leu

Arg

Ser 25

Gly

Leu

Gly

Gly

Ala 30

Pro

Leu

Gly

Leu

Arg 35

Leu

Pro

Arg

Glu

Thr 40

Asp

Glu

Glu

Pro

Glu 45

Glu

Pro

Gly

Arg

Arg 50

Gly

Ser

Phe

Val

Glu 55

Met

Val

Asp

Asn

Leu 60

Arg

Gly

Lys

Ser

PL 205 294 B1

Gly Gin Gly Tyr 65

Leu Asn Ile Leu

Ala Pro His Pro 100

Thr Tyr Arg Asp 115

Lys Trp Glu Gly 130

Pro Asn Val Thr 145

Lys Phe Phe Ile

Tyr Ala Glu Ile 180

Ser Leu Val Lys 195

Cys Gly Ala Gly 210

Gly Gly Ser Met 225

Ser Leu Trp Tyr

Ile Val Arg Val 260

Glu Tyr Asn Tyr 275

Arg Leu Pro Lys 290

Ala Ser Ser Thr 305

Tyr Val Glu Met 70

Val Asp Thr Gly 85

Phe Leu His Arg

Leu Arg Lys Gly 120

Glu Leu Gly Thr 135

Val Arg Ala Asn 150

Asn Gly Ser Asn 165

Ala Arg Pro Asp

Gin Thr His Val 200

Phe Pro Leu Asn 215

Ile Ile Gly Gly 230

Thr Pro Ile Arg 245 ’

Glu Ile Asn Gly

Asp Lys Ser Ile 280

Lys Val Phe Glu 295

Glu Lys Phe Pro 310

Thr Val Gly Ser 75

Ser Ser Asn Phe 90

Tyr Tyr Gin Arg 105

Val Tyr Val Pro

Asp Leu Val Ser 140

Ile Ala Ala Ile 155

Trp Glu Gly Ile 170

Asp Ser Leu Glu 185

Pro Asn Leu Phe

Gin Ser Glu Val 220

Ile Asp His Ser 235

Arg Glu Trp Tyr 250

Gin Asp Leu Lys 265

Val Asp Ser Gly

Ala Ala Val Lys 300

Asp Gly Phe Trp 315

Pro Pro Gin Thr 80

Ala Val Gly Ala 95

Gin Leu Ser Ser 110

Tyr Thr Gin Gly 125

Ile Pro His Gly

Thr Glu Ser Asp 160

Leu Gly Leu Ala 175

Pro Phe Phe Asp 190

Ser Leu His Leu 205

Leu Ala Ser Val

Leu Tyr Thr Gly 240

Tyr Glu Val Ile 255

Met Asp Cys Lys 270

Thr Thr Asn Leu 285

Ser Ile Lys Ala

Leu Gly Glu Gin 320

PL 205 294 B1

Leu Val

Cys Trp Gin 325

Ala

Gly Thr Thr

Pro 330

Trp

Asn

Ile

Phe

Pro 335

Val

Ile

Ser

Leu

Tyr

Leu

Met

Gly

Glu

Val

Thr

Asn

Gin

Ser

Phe

Arg

Ile

340

345

350

Thr

Ile

Leu

Pro

Gin

Gin

Tyr

Leu

Arg

Pro

Val

Glu

Asp

Val

Ala

Thr

355

360

365

Ser

Gin

Asp

Asp

Cys

Tyr

Lys

Phe

Ala

Ile

Ser

Gin

Ser

Ser

Thr

Gly

370

375

380

Thr

Val

Met

Gly

Ala

Val

Ile

Met

Glu

Gly

Phe

Tyr

Val

Val

Phe

Asp

385

390

395

400

Arg

Ala

Arg

Lys

Arg

Ile

Gly

Phe

Ala

Val

Ser

Ala

Cys

His

Val

His

405

410

415

Asp

Glu

Phe

Arg

Thr

Ala

Ala

Val

Glu

Gly

Pro

Phe

Val

Thr

Leu

Asp

420

425

430

Met

Glu

Asp

Cys

Gly

Tyr

Asn

Ile

Pro

Gin

Thr

Asp

Glu

Ser

435

440

445

<210> 23 <211> 1380 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgcggat cgatgactat ctctgactct 60 ccgcgtgaac aggacggatc cacccagcac ggcatccggc tgcccctgcg cagcggcctg 120 gggggcgccc ccctggggct gcggctgccc cgggagaccg acgaagagcc cgaggagccc 180 ggccggaggg gcagctttgt ggagatggtg gacaacctga ggggcaagtc ggggcagggc 240 tactacgtgg agatgaccgt gggcagcccc ccgcagacgc tcaacatcct ggtggataca 300 ggcagcagta actttgcagt gggtgctgcc ccccacccct tcctgcatcg ctactaccag 360 aggcagctgt ccagcacata ccgggacctc cggaagggtg tgtatgtgcc ctacacccag 420 ggcaagtggg aaggggagct gggcaccgac ctggtaagca tcccccatgg ccccaacgtc 480 actgtgcgtg ccaacattgc tgccatcact gaatcagaca agttcttcat caacggctcc 540 aactgggaag gcatcctggg gctggcctat gctgagattg ccaggcctga cgactccctg 600 gagcctttct ttgactctct ggtaaagcag acccacgttc ccaacctctt ctccctgcac 660 ctttgtggtg ctggcttccc cctcaaccag tctgaagtgc tggcctctgt cggagggagc 720 atgatcattg gaggtatcga ccactcgctg tacacaggca gtctctggta tacacccatc 780 cggcgggagt ggtattatga ggtcatcatt gtgcgggtgg agatcaatgg acaggatctg 840 aaaatggact gcaaggagta caactatgac aagagcattg tggacagtgg caccaccaac 900 cttcgtttgc ccaagaaagt gtttgaagct gcagtcaaat ccatcaaggc agcctcctcc 960 acggagaagt tccctgatgg tttctggcta ggagagcagc tggtgtgctg gcaagcaggc 1020

PL 205 294 B1 accacccctt ggaacatttt cccagtcatc tcactctacc taatgggtga ggttaccaac 1080 cagtccttcc gcatcaccat ccttccgcag caatacctgc ggccagtgga agatgtggcc 1140 acgtcccaag acgactgtta caagtttgcc atctcacagt catccacggg cactgttatg 1200 ggagctgtta tcatggaggg cttctacgtt gtctttgatc gggcccgaaa acgaattggc 1260 tttgctgtca gcgcttgcca tgtgcacgat gagttcagga cggcagcggt ggaaggccct 1320 tttgtcacct tggacatgga agactgtggc tacaacattc cacagacaga tgagtcatga 1380 <210> 24 <211> 459 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24

Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gin Gin Met Gly Arg Gly Ser Met Thr 15 10 15

Ile Ser Asp Ser Pro Arg Glu Gin Asp Gly Ser Thr Gin His Gly Ile 20 25 30

Arg Leu Pro Leu Arg Ser Gly Leu Gly Gly Ala Pro Leu Gly Leu Arg 35 40 45

Leu Pro Arg Glu Thr Asp Glu Glu Pro Glu Glu Pro Gly Arg Arg Gly 50 55 60

Ser Phe Val Glu Met Val Asp Asn Leu Arg Gly Lys Ser Gly Gin Gly 65 70 75 80

Tyr Tyr Val Glu Met Thr Val Gly Ser Pro Pro Gin Thr Leu Asn Ile 85 90 95

Leu Val Asp Thr Gly Ser Ser Asn Phe Ala Val Gly Ala Ala Pro His 100 105 110

Pro Phe Leu His Arg Tyr Tyr Gin Arg Gin Leu Ser Ser Thr Tyr Arg 115 120 125

Asp Leu Arg Lys Gly Val Tyr Val Pro Tyr Thr Gin Gly Lys Trp Glu 130 135 140

Gly Glu Leu Gly Thr Asp Leu Val Ser Ile Pro His Gly Pro Asn Val

145 150 155 160

Thr Val Arg Ala Asn Ile Ala Ala Ile Thr Glu Ser Asp Lys Phe Phe

165 170 175

Ile Asn Gly Ser Asn Trp Glu Gly Ile Leu Gly Leu Ala Tyr Ala Glu 180 185 190

PL 205 294 B1

Ile	Ala	Arg 195	Pro	Asp	Asp	Ser	Leu 200
Lys	Gin 210	Thr	His	Val	Pro	Asn 215	Leu
Gly 225	Phe	Pro	Leu	Asn	Gin 230	Ser	Glu
Met	Ile	Ile	Gly	Gly 245	Ile	Asp	His
Tyr	Thr	Pro	Ile 260	Arg	Arg	Glu	Trp
Val	Glu	Ile 275	Asn	Gly	Gin	Asp	Leu 280
Tyr	Asp 290	Lys	Ser	Ile	Val	Asp 295	Ser
Lys 305	Lys	Val	Phe	Glu	Ala 310	Ala	Val
Thr	Glu	Lys	Phe	Pro 325	Asp	Gly	Phe
Trp	Gin	Ala	Gly 340	Thr	Thr	Pro	Trp
Tyr	Leu	Met 355	Gly	Glu	Val	Thr	Asn 360
Pro	Gin 370	Gin	Tyr	Leu	Arg	Pro 375	Val
Asp 385	Cys	Tyr	Lys	Phe	Ala 390	Ile	Ser
Gly	Ala	Val	Ile	Met 405	Glu	Gly	Phe
Lys	Arg	Ile	Gly 420	Phe	Ala	Val	Ser
Arg	Thr	Ala 435	Ala	Val	Glu	Gly	Pro 440

Glu Pro Phe Phe Asp Ser Leu Val 205

Phe Ser Leu His Leu Cys Gly Ala 220

Val Leu Ala Ser Val Gly Gly Ser 235 240

Ser Leu Tyr Thr Gly Ser Leu Trp 250 255

Tyr Tyr Glu Val Ile Ile Val Arg 265 270

Lys Met Asp Cys Lys Glu Tyr Asn 285

Gly Thr Thr Asn Leu Arg Leu Pro 300

Lys Ser Ile Lys Ala Ala Ser Ser 315 320

Trp Leu Gly Glu Gin Leu Val Cys 330 335

Asn Ile Phe Pro Val Ile Ser Leu 345 350

Gin Ser Phe Arg Ile Thr Ile Leu 365

Glu Asp Val Ala Thr Ser Gin Asp 380

Gin Ser Ser Thr Gly Thr Val Met 395 400

Tyr Val Val Phe Asp Arg Ala Arg 410 415

Ala Cys His Val His Asp Glu Phe 425 430

Phe Val Thr Leu Asp Met Glu Asp 445

PL 205 294 B1

Cys Gly Tyr Asn Ile Pro Gin Thr Asp Glu Ser 450 455 <210> 25 <211> 1302 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 atgactcagc ctgcgtctgc gtggagatgg gtgggcagcc gtgggtgctg taccgggacc ctgggcaccg gctgccatca gggctggcct ctggtaaagc cccctcaacc gaccactcgc gaggtcatca tacaactatg gtgtttgaag ggtttctggc ttcccagtca atccttccgc tacaagtttg ggcttctacg catgtgcacg gaagactgtg atggtattcg cccgggagac tggacaacct ccccgcagac ccccccaccc tccggaaggg acctggtaag ctgaatcaga atgctgagat agacccacgt agtctgaagt tgtacacagg ttgtgcgggt acaagagcat ctgcagtcaa taggagagca tctcactcta agcaatacct ccatctcaca ttgtctttga atgagttcag gctacaacat tctgccactg cgacgaagag gaggggcaag gctcaacatc cttcctgcat tgtgtatgtg catcccccat caagttcttc tgccaggcct tcccaacctc gctggcctct cagtctctgg ggagatcaat tgtggacagt atccatcaag gctggtgtgc cctaatgggt gcggccagtg gtcatccacg tcgggcccga gacggcagcg tccacagaca cgtagcggtc cccgaggagc tcggggcagg ctggtggata cgctactacc ccctacaccc ggccccaacg atcaacggct gacgactccc ttctccctgc gtcggaggga tatacaccca ggacaggatc ggcaccacca gcagcctcct tggcaagcag gaggttacca gaagatgtgg ggcactgtta aaacgaattg gtggaaggcc gatgagtcat tgggtggtgc ccggccggag gctactacgt caggcagcag agaggcagct agggcaagtg tcactgtgcg ccaactggga tggagccttt acctttgtgg gcatgatcat tccggcggga tgaaaatgga accttcgttt ccacggagaa gcaccacccc accagtcctt ccacgtccca tgggagctgt gctttgctgt cttttgtcac ga tccactgggt gggcagcttt ggagatgacc taactttgca gtccagcaca ggaaggggag tgccaacatt aggcatcctg ctttgactct tgctggcttc tggaggtatc gtggtattat ctgcaaggag gcccaagaaa gttccctgat ttggaacatt ccgcatcacc agacgactgt tatcatggag cagcgcttgc cttggacatg

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1302 <210> 26 <211> 433 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26

Met 1

Thr

Gin

His

Gly 5

Ile

Arg

Leu

Pro

Leu 10

Arg

Ser

Gly

Leu

Gly 15

Gly

Ala

Pro

Leu

Gly

Leu

Arg

Leu

Pro

Arg

Glu

Thr

Asp

Glu

Glu

Pro

Glu

20

25

30

Glu

Pro

Gly

Arg

Arg

Gly

Ser

Phe

Val

Glu

Met

Val

Asp

Asn

Leu

Arg

PL 205 294 B1

Gly

Lys 50

Ser

Gly

Gin

Gly Tyr Tyr 55

Val

Glu Met

Thr Val 60

Gly

Ser

Pro

Pro

Gin

Thr

Leu

Asn

Ile

Leu

Val

Asp

Thr

Gly

Ser

Ser

Asn

Phe

Ala

65

70

75

80

Val

Gly

Ala

Ala

Pro

His

Pro

Phe

Leu

His

Arg

Tyr

Tyr

Gin

Arg

Gin

85

90

95

Leu

Ser

Ser

Thr

Tyr

Arg

Asp

Leu

Arg

Lys

Gly

Val

Tyr

Val

Pro

Tyr

100

105

110

Thr

Gin

Gly

Lys

Trp

Glu

Gly

Glu

Leu

Gly

Thr

Asp

Leu

Val

Ser

Ile

115

120

125

Pro

His

Gly

Pro

Asn

Val

Thr

Val

Arg

Ala

Asn

Ile

Ala

Ala

Ile

Thr

130

135

140

Glu

Ser

Asp

Lys

Phe

Phe

Ile

Asn

Gly

Ser

Asn

Trp

Glu

Gly

Ile

Leu

145

150

155

160

Gly

Leu

Ala

Tyr

Ala

Glu

Ile

Ala

Arg

Pro

Asp

Asp

Ser

Leu

Glu

Pro

165

170

175

Phe

Phe

Asp

Ser

Leu

Val

Lys

Gin

Thr

His

Val

Pro

Asn

Leu

Phe

Ser

180

185

190

Leu

His

Leu

Cys

Gly

Ala

Gly

Phe

Pro

Leu

Asn

Gin

Ser

Glu

Val

Leu

195

200

205

Ala

Ser

Val

Gly

Gly

Ser

Met

Ile

Ile

Gly

Gly

Ile

Asp

His

Ser

Leu

210

215

220

Tyr

Thr

Gly

Ser

Leu

Trp

Tyr

Thr

Pro

Ile

Arg

Arg

Glu

Trp

Tyr

Tyr

225

230

235

240

Glu

Val

Ile

Ile

Val

Arg

Val

Glu

Ile

Asn

Gly

Gin

Asp

Leu

Lys

Met

245

250

255

Asp

Cys

Lys

Glu

Tyr

Asn

Tyr

Asp

Lys

Ser

Ile

Val

Asp

Ser

Gly

Thr

260

265

270

Thr

Asn

Leu

Arg

Leu

Pro

Lys

Lys

Val

Phe

Glu

Ala

Ala

Val

Lys

Ser

275

280

285

Zle

Lys

Ala

Ala

Ser

Ser

Thr

Glu

Lys

Phe

Pro

Asp

Gly

Phe

Trp

Leu

290

295

300

PL 205 294 B1

Gly Glu Gin Leu Val 305

Cys 310

Trp Gin

Ala Gly Thr 315

Thr

Pro Trp

Asn

Ile 320

Phe

Pro

Val

Ile

Ser

Leu

Tyr

Leu

Met

Gly

Glu

Val

Thr

Asn

Gin

Ser

325

330

335

Phe

Arg

Ile

Thr

Ile

Leu

Pro

Gin

Gin

Tyr

Leu

Arg

Pro

Val

Glu

Asp

340

345

350

Val

Ala

Thr

Ser

Gin

Asp

Asp

Cys

Tyr

Lys

Phe

Ala

Ile

Ser

Gin

Ser

355

360

365

Ser

Thr

Gly

Thr

Val

Met

Gly

Ala

Val

Ile

Met

Glu

Gly

Phe

Tyr

Val

370

375

380

Val

Phe

Asp

Arg

Ala

Arg

Lys

Arg

Ile

Gly

Phe

Ala

Val

Ser

Ala

Cys

385

390

395

400

His

Val

His

Asp

Glu

Phe

Arg

Thr

Ala

Ala

Val

Glu

Gly

Pro

Phe

Val

405

410

415

Thr

Leu

Asp

Met

Glu

Asp

Cys

Gly

Tyr

Asn

Ile

Pro

Gin

Thr

Asp

Glu

420 425 430

Ser <210> 27 <211> 1278 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 ' atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgcggat cgatgactat ctctgactct 60 ccgctggact ctggtatcga aaccgacgga tcctttgtgg agatggtgga caacctgagg 120 ggcaagtcgg ggcagggcta ctacgtggag atgaccgtgg gcagcccccc gcagacgctc 180 aacatcctgg tggatacagg cagcagtaac tttgcagtgg gtgctgcccc ccaccccttc 240 ctgcatcgct actaccagag gcagctgtcc agcacatacc gggacctccg gaagggtgtg 300 tatgtgccct acacccaggg caagtgggaa ggggagctgg gcaccgacct ggtaagcatc 360 ccccatggcc ccaacgtcac tgtgcgtgcc aacattgctg ccatcactga atcagacaag 420 ttcttcatca acggctccaa ctgggaaggc atcctggggc tggcctatgc tgagattgcc 480 aggcctgacg actccctgga gcctttcttt gactctctgg taaagcagac ccacgttccc 540 aacctcttct ccctgcacct ttgtggtgct ggcttccccc tcaaccagtc tgaagtgctg 600 gcctctgtcg gagggagcat gatcattgga ggtatcgacc actcgctgta cacaggcagt 660 ctctggtata cacccatccg gcgggagtgg tattatgagg tcatcattgt gcgggtggag 720 atcaatggac aggatctgaa aatggactgc aaggagtaca actatgacaa gagcattgtg 780

PL 205 294 B1 gacagtggca atcaaggcag gtgtgctggc atgggtgagg ccagtggaag tccacgggca gcccgaaaac gcagcggtgg cagacagatg ccaccaacct cctcctccac aagcaggcac ttaccaacca atgtggccac ctgttatggg gaattggctt aaggcccttt agtcatga tcgtttgccc ggagaagttc caccccttgg gtccttccgc gtcccaagac agctgttatc tgctgtcagc tgtcaccttg aagaaagtgt cctgatggtt aacattttcc atcaccatcc gactgttaca atggagggct gcttgccatg gacatggaag ttgaagctgc tctggctagg cagtcatctc ttccgcagca agtttgccat tctacgttgt tgcacgatga actgtggcta agtcaaatcc agagcagctg actctaccta atacctgcgg ctcacagtca ctttgatcgg gttcaggacg caacattcca

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1278 <210> 28 <211> 425 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28

Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gin Gin Met Gly Arg Gly Ser Met Thr 15 10 15

Ile Ser Asp Ser Pro Leu Asp Ser Gly Ile Glu Thr Asp Gly Ser Phe 20 25 30

Val Glu Met Val Asp Asn Leu Arg Gly Lys Ser Gly Gin Gly Tyr Tyr 35 40 45

Val Glu Met Thr Val Gly Ser Pro Pro Gin Thr Leu Asn Ile Leu Val 50 55 60

Asp Thr Gly Ser Ser Asn Phe Ala Val Gly Ala Ala Pro His Pro Phe

70 75 80

Leu His Arg Tyr Tyr Gin Arg Gin Leu Ser Ser Thr Tyr Arg Asp Leu

90 95

Arg Lys Gly Val Tyr Val Pro Tyr Thr Gin Gly Lys Trp Glu Gly Glu 100 105 110

Leu Gly Thr Asp Leu Val Ser Ile Pro His Gly Pro Asn Val Thr Val 115 120 125

Arg Ala Asn Ile Ala Ala Ile Thr Glu Ser Asp Lys Phe Phe Ile Asn 130 135 140

Gly Ser Asn Trp Glu Gly Ile Leu Gly Leu Ala Tyr Ala Glu Ile Ala 145 150 155 160

Arg Pro Asp Asp Ser Leu Glu Pro Phe Phe Asp Ser Leu Val Lys Gin 165 170 175

PL 205 294 B1

Thr His Val Pro Asn Leu Phe Ser Leu His Leu Cys Gly Ala Gly Phe 180 185 190

Pro Leu Asn Gin Ser Glu Val Leu Ala Ser Val Gly Gly Ser Met Ile 195 200 205

Ile Gly Gly Ile Asp His Ser Leu Tyr Thr Gly Ser Leu Trp Tyr Thr 210 215 220

Pro 225

Ile Arg Arg Glu Trp 230

Tyr

Tyr Glu Val

Ile 235

Ile

Val

Arg

Val

Glu 240

Ile

Asn

Gly

Gin

Asp

Leu

Lys

Met

Asp

Cys

Lys

Glu

Tyr

Asn

Tyr

Asp

245

250

255

Lys

Ser

Ile

Val

Asp

Ser

Gly

Thr

Thr

Asn

Leu

Arg

Leu

Pro

Lys

Lys

260

265

270

Val

Phe

Glu

Ala

Ala

Val

Lys

Ser

Ile

Lys

Ala

Ala

Ser

Ser

Thr

Glu

275

280

285

Lys

Phe

Pro

Asp

Gly

Phe

Trp

Leu

Gly

Glu

Gin

Leu

Val

Cys

Trp

Gin

290

295

300

Ala

Gly

Thr

Thr

Pro

Trp

Asn

Ile

Phe

Pro

Val

Ile

Ser

Leu

Tyr

Leu

305

310

315

320

Met

Gly

Glu

Val

Thr

Asn

Gin

Ser

Phe

Arg

Ile

Thr

Ile

Leu

Pro

Gin

325

330

335

Gin

Tyr

Leu

Arg

Pro

Val

Glu

Asp

Val

Ala

Thr

Ser

Gin

Asp

Asp

Cys

340

345

350

Tyr

Lys

Phe

Ala

Ile

Ser

Gin

Ser

Ser

Thr

Gly

Thr

Val

Met

Gly

Ala

355

360

365

Val

Ile

Met

Glu

Gly

Phe

Tyr

Val

Val

Phe

Asp

Arg

Ala

Arg

Lys

Arg

370

375

380

Ile

Gly

Phe

Ala

Val

Ser

Ala

Cys

His

Val

His

Asp

Glu

Phe

Arg

Thr

385

390

395

400

Ala

Ala

Val

Glu

Gly

Pro

Phe

Val

Thr

Leu

Asp

Met

Glu

Asp

Cys

Gly

405

410

415

Tyr

Asn

Ile

Pro

Gin

Thr

Asp

Glu

Ser

420

425

PL 205 294 B1 <210> 29 <211> 1362 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 atggcccaag ccctgccctg gctcctgctg tggatgggcg cgggagtgct gcctgcccac 60 ggcacccagc acggcatccg gctgcccctg cgcagcggcc tggggggcgc cccectgggg 120 ctgcggctgc cccgggagac cgacgaagag cccgaggagc ccggccggag gggcagcttt 180 gtggagatgg tggacaacct gaggggcaag tcggggcagg gctactacgt ggagatgacc 240 gtgggcagcc ccccgcagac gctcaacatc ctggtggata caggcagcag taactttgca 300 gtgggtgctg ccccccaccc cttcctgcat cgctactacc agaggcagct gtccagcaca 360 taccgggacc tccggaaggg tgtgtatgtg ccctacaccc agggcaagtg ggaaggggag 420 ctgggcaccg acctggtaag catcccccat ggccccaacg tcactgtgcg tgccaacatt 480 gctgccatca ctgaaŁcaga caagttcttc atcaacggct ccaactggga aggcatcctg 540 gggctggcct atgctgagat tgccaggcct gacgactccc tggagccttt ctttgactct 600 ctggtaaagc agacccacgt tcccaacctc ttctccctgc acctttgtgg tgctggcttc 660 cccctcaacc agtctgaagt gctggcctct gtcggaggga gcatgatcat tggaggtatc 720 gaccactcgc tgtacacagg cagtctctgg tatacaccca tccggcggga gtggtattat 780 gaggtcatca ttgtgcgggt ggagateaat ggacaggatc tgaaaatgga ctgcaaggag 840 tacaactatg acaagagcat tgtggacagt ggcaccacca accttcgttt gcccaagaaa 900 gtgtttgaag ctgcagtcaa atccatcaag gcagcctcct ccacggagaa gttccctgat 960 ggtttctggc taggagagca gctggtgtgc tggcaagcag gcaccacccc ttggaacatt 1020 ttcccagtca tctcactcta cctaatgggt gaggttacca accagtcctt ccgcatcacc 1080 atccttccgc agcaatacct gcggccagtg gaagatgtgg ccacgtccca agacgactgt 1140 tacaagtttg ccatctcaca gtcatccacg ggcacŁgtta tgggagctgt tatcatggag 1200 ggcttctacg ttgtctttga tcgggcccga aaacgaattg gctttgctgt cagcgcttgc 1260 catgtgcacg atgagttcag gacggcagcg gtggaaggcc cttttgtcac cttggacatg 1320 gaagaetgtg gctacaacat tccacagaca gatgagtcat ga 1362 <210> 30 <211> 453 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30

Met Ala Gin Ala Leu Pro Trp Leu Leu Leu Trp Met Gly Ala Gly Val 15 10 15

Leu Pro Ala His Gly Thr Gin His Gly Ile Arg Leu Pro Leu Arg Ser 20 25 30

Gly Leu Gly Gly Ala Pro Leu Gly Leu Arg Leu Pro Arg Glu Thr Asp 35 40 45

Glu Glu Pro Glu Glu Pro Gly Arg Arg Gly Ser Phe Val Glu Met Val

PL 205 294 B1

50

55

60

Asp

Asn

Leu

Arg

Gly

Lys

Ser

Gly

Gin

Gly

Tyr

Tyr

Val

Glu

Met

Thr

65

70

75

80

Val

Gly

Ser

Pro

Pro

Gin

Thr

Leu

Asn

Ile

Leu

Val

Asp

Thr

Gly

Ser

85

90

95

Ser

Asn

Phe

Ala

Val

Gly

Ala

Ala

Pro

His

Pro

Phe

Leu

His

Arg

Tyr

100

105

110

Tyr

Gin

Arg

Gin

Leu

Ser

Ser

Thr

Tyr

Arg

Asp

Leu

Arg

Lys

Gly

Val

115

120

125

Tyr

Val

Pro

Tyr

Thr

Gin

Gly

Lys

Trp

Glu

Gly

Glu

Leu

Gly

Thr

Asp

130

135

140

Leu

Val

Ser

Ile

Pro

His

Gly

Pro

Asn

Val

Thr

Val

Arg

Ala

Asn

Ile

145

150

155

160

Ala

Ala

Ile

Thr

Glu

Ser

Asp

Lys

Phe

Phe

Ile

Asn

Gly

Ser

Asn

Trp

165

170

175

Glu

Gly

Ile

Leu

Gly

Leu

Ala

Tyr

Ala

Glu

ile

Ala

Arg

Pro

Asp

Asp

180

185

190

Ser

Leu

Glu

Pro

Phe

Phe

Asp

Ser

Leu

Val

Lys

Gin

Thr

His

Val

Pro

195

200

205

Asn

Leu

Phe

Ser

Leu

Gin

Leu

Cys

Gly

Ala

Gly

Phe

Pro

Leu

Asn

Gin

210

215

220

Ser

Glu

Val

Leu

Ala

Ser

Val

Gly

Gly

Ser

Met

Ile

Ile

Gly

Gly

Ile

225

230

235

240

Asp

His

Ser

Leu

Tyr

Thr

Gly

Ser

Leu

Trp

Tyr

Thr

Pro

Ile

Arg

Arg

245

250

255

Glu

Trp

Tyr

Tyr

Glu

Val

Ile

Ile

Val

Arg

Val

Glu

Ile

Asn

Gly

Gin

260

265

270

Asp

Leu

Lys

Met

Asp

Cys

Lys

Glu

Tyr

Asn

Tyr

Asp

Lys

Ser

Ile

Val

275

280

285

Asp

Ser

Gly

Thr

Thr

Asn

Leu

Arg

Leu

Pro

Lys

Lys

Val

Phe

Glu

Ala

290

295

300

Ala

Val

Lys

Ser

Ile

Lys

Ala

Ala

Ser

Ser

Thr

Glu

Lys

Phe

Pro

Asp

PL 205 294 B1

305 310 315 320

Gly Phe Trp Leu Gly Glu Gin Leu Val Cys Trp Gin Ala Gly Thr Thr 325 330 335

Pro Trp Asn Ile Phe Pro Val Ile Ser Leu Tyr Leu Met Gly Glu Val 340 345 350

Thr Asn Gin Ser Phe Arg Ile Thr Ile Leu Pro Gin Gin Tyr Leu Arg 355 360 365

Pro Val Glu Asp Val Ala Thr Ser Gin Asp Asp Cys Tyr Lys Phe Ala 370 375 380

Ile Ser Gin Ser Ser Thr Gly Thr Val Met Gly Ala Val Ile Met Glu

385 390 395 400

Gly Phe Tyr Val Val Phe Asp Arg Ala Arg Lys Arg Ile Gly Phe Ala

405 410 415

Val Ser Ala Cys His Val His Asp Glu Phe Arg Thr Ala Ala Val Glu 420 425 430

Gly Pro Phe Val Thr Leu Asp Met Glu Asp Cys Gly Tyr Asn Ile Pro 435 440 445

Gin Thr Asp Glu Ser 450 <210> 31 <211> 1380 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 atggcccaag ccctgccctg gctcctgctg tggatgggcg cgggagtgct gcctgcccac 60 ggcacccagc acggcatccg gctgcccctg cgcagcggcc tggggggcgc ccccctgggg 120 ctgcggctgc cccgggagac cgacgaagag cccgaggagc ccggccggag gggcagcttt 180 gtggagatgg tggacaacct gaggggcaag tcggggcagg gctactacgt ggagatgacc 240 gtgggcagcc ccccgcagac gctcaacatc ctggtggata caggcagcag taactttgca 300 gtgggtgctg ccccccaccc cttcctgcat cgctactacc agaggcagct gtccagcaca 360 taccgggacc tccggaaggg tgtgtatgtg ccctacaccc agggcaagtg ggaaggggag 420 ctgggcaccg acctggtaag catcccccat ggccccaacg tcactgtgcg tgccaacatt 480 gctgccatca ctgaatcaga caagttcttc atcaacggct ccaactggga aggcatcctg 540 gggctggcct atgctgagat tgccaggcct gacgactccc tggagccttt ctttgactct 600 ctggtaaagc agacccacgt tcccaacctc ttctccctgc acctttgtgg tgctggcttc 660 cccctcaacc agtctgaagt gctggcctct gtcggaggga gcatgatcat tggaggtatc 720

PL 205 294 B1 gaccactcgc tgtacacagg cagtctctgg tatacaccca tccggcggga gtggtattat 780 gaggtcatca ttgtgcgggt ggagatcaat ggacaggatc tgaaaatgga ctgcaaggag 840 tacaactatg acaagagcat tgtggacagt ggcaccacca accttcgttt gcccaagaaa 900 gtgtttgaag ctgcagtcaa atccatcaag gcagcctcct ccacggagaa gttccctgat 960 ggtttctggc taggagagca gctggtgtgc tggcaagcag gcaccacccc ttggaacatt 1020 ttcccagtca tctcactcta cctaatgggt gaggttacca accagtcctt ccgcatcacc 1080 atccttccgc agcaatacct gcggccagtg gaagatgtgg ccacgtccca agacgactgt 1140 tacaagtttg ccatctcaca gtcatccacg ggcactgtta tgggagctgt tatcatggag 1200 ggcttctacg ttgtctttga tcgggcccga aaacgaattg gctttgctgt cagcgcttgc 1260 catgtgcacg atgagttcag gacggcagcg gtggaaggcc cttttgtcac cttggacatg 1320 gaagactgtg gctacaacat tccacagaca gatgagtcac agcagcagca gcagcagtga 1380 <210> 32 <211> 459 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32

Met 1

Ala

Gin

Ala

Leu 5

Pro

Trp

Leu

Leu

Leu 10

Trp

Met

Gly

Ala

Gly 15

Val

Leu

Pro

Ala

His 20

Gly

Thr

Gin

His

Gly 25

Ile

Arg

Leu

Pro

Leu 30

Arg

Ser

Gly

Leu

Gly 35

Gly

Ala

Pro

Leu

Gly 40

Leu

Arg

Leu

Pro

Arg 45

Glu

Thr

Asp

Glu

Glu 50

Pro

Glu

Glu

Pro

Gly 55

Arg

Arg

Gly

Ser

Phe 60

Val

Glu

Met

Val

Asp 65

Asn

Leu

Arg

Gly

Lys 70

Ser

Gly

Gin

Gly

Tyr 75

Tyr

Val

Glu

Met

Thr 80

Val

Gly

Ser

Pro

Pro 85

Gin

Thr

Leu

Asn

Ile 90

Leu

Val

Asp

Thr

Gly 95

Ser

Ser

Asn

Phe

Ala 100

Val

Gly

Ala

Ala

Pro 105

His

Pro

Phe

Leu

His 110

Arg

Tyr

Tyr

Gin

Arg 115

Gin

Leu

Ser

Ser

Thr 120

Tyr

Arg

Asp

Leu

Arg 125

Lys

Gly

Val

Tyr

Val 130

Pro

Tyr

Thr

Gin

Gly 135

Lys

Trp

Glu

Gly

Glu 140

Leu

Gly

Thr

Asp

Leu

Val

Ser

Ile

Pro

His

Gly

Pro

Asn

Val

Thr

Val

Arg

Ala

Asn

Ile

145 150 155 160

PL 205 294 B1

Ala Ala Ile Thr Glu Ser Asp Lys Phe Phe Ile Asn Gly Ser Asn Trp 165 170 175

Glu Gly Ile Leu Gly Leu Ala Tyr Ala Glu Ile Ala Arg Pro Asp Asp 180 185 190

Ser Leu Glu Pro Phe Phe Asp Ser Leu Val Lys Gin Thr His Val Pro 195 200 205

Asn Leu Phe Ser Leu Gin Leu Cys Gly Ala Gly Phe Pro Leu Asn Gin 210 215 220

Ser Glu Val Leu Ala Ser Val Gly Gly Ser Met Ile Ile Gly Gly Ile

225 230 235 240

Asp His Ser Leu Tyr Thr Gly Ser Leu Trp Tyr Thr Pro Ile Arg Arg

245 250 255

Glu Trp Tyr Tyr Glu Val Ile Ile Val Arg Val Glu Ile Asn Gly Gin 260 265 270

Asp Leu Lys Met Asp Cys Lys Glu Tyr Asn Tyr Asp Lys Ser Ile Val 275 280 285

Asp Ser Gly Thr Thr Asn Leu Arg Leu Pro Lys Lys Val Phe Glu Ala 290 295 300

Ala Val Lys Ser Ile Lys Ala Ala Ser Ser Thr Glu Lys Phe Pro Asp ³⁰⁵ 310 315 320

Gly Phe Trp Leu Gly Glu Gin Leu Val Cys Trp Gin Ala Gly Thr Thr

325 330 335

Pro Trp Asn Ile Phe Pro Val Ile Ser Leu Tyr Leu Met Gly Glu Val 340 345 350

Thr Asn Gin Ser Phe Arg Ile Thr Ile Leu Pro Gin Gin Tyr Leu Arg 355 360 365

Pro Val Glu Asp Val Ala Thr Ser Gin Asp Asp Cys Tyr Lys Phe Ala 370 375 380

Ile Ser Gin Ser Ser Thr Gly Thr Val Met Gly Ala Val Ile Met Glu

385 390 395 400

Gly Phe Tyr Val Val Phe Asp Arg Ala Arg Lys Arg Ile Gly Phe Ala

405 410 415

PL 205 294 B1

Val

Ser

Ala

Cys

His

Val

His

Asp

Glu

Phe

Arg

Thr

Ala

Ala

Val Glu

420

425

430

Gly

Pro

Phe

Val

Thr

Leu

Asp

Met

Glu

Asp

Cys

Gly

Tyr

Asn

Ile Pro

435

440

445

Gin

Thr

Asp

Glu

Ser

His

His

His

His

His

His

450 455 <210> 33 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33

Ser Glu Gin Gin Arg Arg Pro Arg Asp Pro Glu Val Val Asn Asp Glu ¹ 5 10 15

Ser Ser Leu Val Arg His Arg Trp Lys 20 25 <210> 34 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34

Ser Glu Gin Leu Arg Gin Gin His Asp Asp Phe Ala Asp Asp Ile Ser 1 5 10 15

Leu Leu Lys

<210> 35 <211> 29 <212> DNA <213> Homo	sapiens
<400> 35
gtggatccac	ccagcacggc atccggctg	29
<210> 36 <211> 36 <212> DNA <213> Homo	sapiens

PL 205 294 B1 <400> 36 gaaagctttc atgactcatc tgtctgtgga atgttg 36 <210> 37 <211> 39 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 37 gatcgatgac tatctctgac tctccgcgtg aacaggacg 39 <210> 38 <211> 39 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 38 gatccgtcct gttcacgcgg agagtcagag atagtcatc 39 <210> 39 <211> 77 <212> DNA <213> Sekwencja Sztuczna <220>

<223> Opis Sekwencji Sztucznej: Hu-Asp2 <400> 39 cggcatccgg ctgcccctgc gtagcggtct gggtggtgct ccactgggtc tgcgtctgcc 60 ccgggagacc gacgaag 77 <210> 40 <211> 77 <212> DNA <213> Sekwencja Sztuczna <220>

<223> opis Sekwencji Sztucznej: Hu-Asp2 <400> 40 cttcgtcggt ctcccggggc agacgcagac ccagtggagc accacccaga ccgctacgca 60 ggggcagccg gatgccg 77 <210> 41 <211> 51 <212> DNA <213> Sekwencja Sztuczna

PL 205 294 B1 <220» <223> Opis Sekwencji Sztucznej: Kaspaza 8

Miejsce Cięcia <400» 41 gatcgatgac tatctctgac tctccgctgg actctggtat cgaaaccgac g <210> 42 <211> 51 <212> DNA <213> Sekwencja Sztuczna <220>

<223> Opis Sekwencji Sztucznej: Kaspaza 8 Miejsce Cięcia <400> 42 gatccgtcgg tttcgatacc agagtccagc ggagagtcag agatagtcat c 51 <210» 43 <211> 32 <212> DNA <213» Homo sapiens <400> 43 aaggatcctt tgtggagatg gtggacaacc tg <210» 44 <211» 36 <212» DNA <213> Homo sapiens <400» 44 gaaagctttc atgactcatc tgtctgtgga atgttg 36 <210> 45 <211> 24 <212» DNA <213» Sekwencja Sztuczna <220» <223> Opis Sekwencji Sztucznej

6-His tag <400> 45 gatcgcatca tcaccatcac catg <210> 46

PL 205 294 B1 <211> 24 <212> DNA <213> Sekwencja Sztuczna <220>

<223> Opis Sekwencji Sztucznej <400> 46 gatccatggt gatggtgatg atgc <210> 47 <211> 22 <212> DNA <213> Sekwencja Sztuczna <220>

<223> Opis Sekwencji Sztucznej motyw <400> 47 gactgaccac tcgaccaggt tc <210> 48 <211> 51 <212> DNA <213> Opis Sekwencji Sztucznej <220>

<223> Opis Sekwencji Sztucznej motyw <400> 48 cgaattaaat tccagcacac tggctacttc <210> 49 <211> 26 <212> DNA <213> Sekwencja Sztuczna <220>

<223> Opis Sekwencji Sztucznej motyw <400> 49 cgaattaaat tccagcacac tggcta

6-His tag

Introduce KK

Introduce KK ttgttctgca tctcaaagaa c 51

Introduce KK

PL 205 294 B1

Claims (85)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Izolowany lub oczyszczony polipeptyd obejmują cy sekwencję aminokwasową wybraną z grupy skł adają cej się z:

   (a) sekwencji aminokwasowej przedstawionej na Fig. 2 (Id. Sekw. Nr: 6) (b) sekwencji aminokwasowej przedstawionej na Fig. 3 (Id. Sekw. Nr: 4) (c) fragmentów (a) i (b), które wykazują aktywność proteazy aspartylowej; i (d) konserwatywnie podstawionych wariantów (a)-(c) mających sekwencję aminokwasową identyczną z (a) lub (b) lub (c) za wyjątkiem konserwatywnych podstawień, przy czym konserwatywnie podstawiony wariant wykazuje aktywność proteazy aspartylowej.
2. 2. Izolowany lub oczyszczony polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną na Figurze 3 (Id. Sekw. Nr: 4) lub obejmuje jej fragment, który zachowuje aktywność proteazy aspartylowej.
3. 3. Izolowany lub oczyszczony polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną na Figurze 2 (Id. Sekw. Nr: 6) lub obejmuje jej fragment, który zachowuje aktywność proteazy aspartylowej.
4. 4. Izolowany lub oczyszczony polipeptyd wedł ug zastrz. 2 albo 3 , znamienny tym, ż e fragment obejmuje tripeptydy DTG i DSG miejsca aktywnego proteazy aspartylowej Asp2, przy czym polipeptyd wykazuje aktywność proteazy aspartylowej włączonej w obróbkę APP do beta amyloidu.
5. 5. Izolowany lub oczyszczony polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną na Figurze 2 (Id. Sekw. Nr: 6) lub Figurze 3 (Id. Sekw. Nr: 4).
6. 6. Izolowany lub oczyszczony polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, ż e konserwatywnie podstawiony wariant obejmuje sekwencję aminokwasową przynajmniej w 95% identyczną z (a) lub (b) lub (c).
7. 7. Izolowany lub oczyszczony polipeptyd według zastrz. 1, wytworzony sposobem obejmującym etapy:

   hodowania komórki gospodarza transformowanej lub transfekowanej kwasem nukleinowym kodującym polipeptyd w ostrych warunkach, przy czym komórka wyraża polipeptyd kodowany przez kwas nukleinowy, a kwas nukleinowy obejmuje sekwencję nukleotydową, która koduje polipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną na Figurze 2 (Id. Sekw. Nr: 6) lub Figurze 3 (Id. Sekw. Nr: 4) i izolowania wyrażanego polipeptydu.
8. 8. Izolowany lub oczyszczony polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje fragment sekwencji aminokwasowej białka Asp2 o Id. Sekw. Nr: 4 lub Id. Sekw. Nr: 6, przy czym fragment obejmuje tripeptydy DTG i DSG miejsca aktywnego proteazy aspartylowej i wykazuje aktywność proteazy aspartylowej włączonej w obróbkę APP do beta amyloidu, a polipeptydowi brak domeny transbłonowej, i polipeptyd wykazuje aktywność proteazy aspartylowej włączonej w obróbkę APP do beta amyloidu.
9. 9. Izolowany lub oczyszczony polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje aminokwasy 93 do 291 z Id. Sekw. Nr: 4.
10. 10. Izolowany lub oczyszczony polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje aminokwasy 93 do 266 z Id. Sekw. Nr: 6.
11. 11. Izolowany lub oczyszczony polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje sekwencję aminokwasową w przynajmniej 90% identyczną z fragmentem sekwencji aminokwasowej proteazy aspartylowej przedstawionej na Figurze 3 (Id. Sekw. Nr: 4) lub na Figurze 2 (Id. Sekw. Nr: 6), przy czym fragment obejmuje tripeptydy DTG i DSG miejsca aktywnego proteazy aspartylowej i wykazuje aktywność proteazy aspartylowej Asp2 włączonej w obróbkę APP do beta amyloidu, a różnice podstawień pomiędzy sekwencją aminokwasową polipeptydu i sekwencją aminokwasową fragmentu stanowią konserwatywne podstawienia i przy czym polipeptyd wykazuje aktywność proteazy aspartylowej włączonej w obróbkę APP do beta amyloidu.
12. 12. Oczyszczony lub izolowany polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje sekwencję aminokwasową przynajmniej w 95 % identyczną z fragmentem sekwencji proteazy aspartylowej przedstawionej na Figurze 3 (Id. Sekw. Nr: 4) lub Figurze 2 (Id. Sekw. Nr: 6);

    przy czym fragment obejmuje tripeptydy DTG i DSG miejsca aktywnej proteazy aspartylowej i wykazuje aktywność proteazy aspartylowej Asp2 włączonej w obróbkę APP do beta amyloidu,

    PL 205 294 B1 a różnice podstawień pomiędzy sekwencją aminokwasową polipeptydu i sekwencją aminokwasową fragmentu stanowią konserwatywne podstawienia, przy czym polipeptyd wykazuje aktywność proteazy aspartylowej włączonej w obróbkę APP do beta amyloidu.
13. 13. Izolowany lub oczyszczony polipeptyd, znamienny tym, że obejmuje sekwencję aminokwasową która jest w przynajmniej 95% identyczna z fragmentem sekwencji białka z Id. Sekw. Nr: 4 lub Id. Sekw. Nr: 6, przy czym fragment obejmuje tripeptydy DTG i DSG miejsca aktywnego proteazy aspartylowej i wykazuje aktywność proteazy aspartylowej włączonej w obróbkę APP do beta amyloidu, a polipeptydowi brak domeny transbł onowej, przy czym polipeptyd wykazuje aktywność proteazy aspartylowej włączonej w obróbkę APP do beta amyloidu.
14. 14. Oczyszczony lub izolowany polipeptyd według zastrz. 1-12, znamienny tym, że brak mu domeny transbłonowej.
15. 15. Oczyszczony lub izolowany polipeptyd według zastrz. 1-14, znamienny tym, że ponadto obejmuje peptyd sygnałowy.
16. 16. Izolowany lub oczyszczony polipeptyd według zastrz. 1-15, znamienny tym, że ponadto obejmuje heterologiczny znacznik peptydowy.
17. 17. Oczyszczony lub izolowany polinukleotyd obejmujący sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd określony w zastrz. 1-16.
18. 18. Oczyszczony lub izolowany polinukleotyd weług zastrz. 17, znamienny tym, że sekwencja nukleotydowa obejmuje nukleotydy 277 do 873 z Id. Sekw. Nr: 3.
19. 19. Oczyszczony lub wyizolowany polinukleotyd według zastrz. 17, znamienny tym, że sekwencja nukleotydowa obejmuje nukleotydy 277 do 798 z Id. Sekw. Nr: 5.
20. 20. Oczyszczony lub izolowany polinukleotyd, znamienny tym, że obejmuje sekwencję nukleotydową która hybrydyzuje w następujących ostrych warunkach z sekwencją komplementarną do sekwencji z Id. Sekw. Nr: 3 lub Id. Sekw. Nr: 5:

    (1) hybrydyzacja w 42°C w buforze hybrydyzacyjnym obejmującym 6xSSC i 0,1% SDS i (2) przemywanie w 65°C w roztworze do przemywań obejmującym 1xSSC i 0,1% SDS; przy czym polinukleotyd koduje polipeptyd, któremu brak domeny transbłonowej i który wykazuje aktywność proteazy aspartylowej włączonej w obróbkę APP do beta amyloidu.
21. 21. Oczyszczony lub izolowany polinukleotyd według zastrz. 20, znamienny tym, że polipeptyd obejmuje tripeptydy DTG i DSG miejsca aktywnego proteazy aspartylowej.
22. 22. Oczyszczony lub izolowany polinukleotyd, znamienny tym, że obejmuje sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje w następujących ostrych warunkach z sekwencją komplementarną do sekwencji z Id. Sekw. Nr: 3 lub Id. Sekw. Nr: 5:

    (1) hybrydyzacja w 42°C w buforze hybrydyzacyjnym obejmującym 6xSSC i 0,1% SDS i (2) przemywanie w 65 °C w roztworze do przemywań obejmującym 1xSSC i 0,1% SDS; przy czym polinukleotyd koduje polipeptyd, który obejmuje sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z:

    (a) sekwencji aminokwasowej przedstawionej w Id. Sekw. Nr: 4;

    (b) sekwencji aminokwasowej przedstawionej w Id. Sekw. Nr: 6;

    (c) fragmentu (a) lub (b), który obejmuje tripeptydy DTG i DSG miejsca aktywnego proteazy aspartylowej włączonej w obróbkę APP do beta amyloidu i (d) konserwatywnie podstawionego wariantu (a) lub (b) lub (c) mającego sekwencję aminokwasową identyczną z (a) lub (b) lub (c) za wyjątkiem konserwatywnych podstawień, przy czym wariant konserwatywnego podstawienia wykazuje aktywność proteazy aspartylowej włączonej w obróbkę APP do beta amyloidu.
23. 23. Izolowany lub oczyszczony polinukleotyd według zastrz. 17-22, znamienny tym, że koduje polipeptyd ponadto zawierający heterologiczny znacznik peptydowy.
24. 24. Oczyszczony lub izolowany polinukleotyd według zastrz. 17-23, znamienny tym, że obejmuje sekwencję nukleotydową która koduje peptyd sygnałowy sfuzowany w ramce z sekwencją nukleotydową kodującą polipeptyd; przy czym peptyd sygnałowy promuje zewnątrzkomórkowe wydzielanie w komórce gospodarza transfekowanej polinukleotydem; a polipeptyd jest wydzielany przez komórkę gospodarza i wykazuje aktywność proteazy aspartylowej włączonej w obróbkę APP do beta amyloidu.
25. 25. Wektor, znamienny tym, że zawiera polinukleotyd określony w zastrz. 17-24.

    PL 205 294 B1
26. 26. Wektor ekspresyjny, znamienny tym, że zawiera polinukleotyd określony w zastrz. 17-24, który jest funkcjonalnie połączony z heterologiczną sekwencją kontrolującą ekspresję.
27. 27. Wektor według zastrz. 26, znamienny tym, że polinukleotyd jest funkcjonalnie połączony z heterologiczną sekwencją kontrolną do ekspresji w komórce ssaczego gospodarza.
28. 28. Wektor według zastrz. 26, znamienny tym, że polinukleotyd jest funkcjonalnie połączony z heterologiczną sekwencją kontrolną do ekspresji w komórce owadziego gospodarza.
29. 29. Komórka gospodarza transformowana lub transfekowana polinukleotydem określonym w zastrz. 17-24 lub wektorem okreś lonym w zastrz. 25-28.
30. 30. Komórka gospodarza według zastrz. 29, znamienna tym, że jest komórką ssaczą.
31. 31. Komórka gospodarza według zastrz. 29, znamienna tym, że pochodzi z ludzkiej linii komórkowej.
32. 32. Sposób wytwarzania polipeptydu mającego aktywność proteazy aspartylowej, znamienny tym, że obejmuje hodowanie komórki gospodarza określonej w zastrz. 29-31 w warunkach, w których komórka wyraża polipeptyd kodowany przez kwas nukleinowy.
33. 33. Sposób według zastrz. 32, znamienny tym, że ponadto obejmuje izolowanie polipeptydu z komórki lub poż ywki wzrostowej.
34. 34. Sposób identyfikowania czynnika, który obniża aktywność proteazową polipeptydu proteazy aspartylowej kodowanego przez polinukleotyd określony w zastrz. 17-24, znamienny tym, że obejmuje etapy:

    (a) hodowania komórki gospodarza transformowanej lub transfekowanej polinukleotydem w obecności lub nieobecności czynnika badanego, w warunkach, w których komórka wyraża polipeptyd i (b) porównania aktywności proteolitycznej polipeptydu wyrażanego przez komórkę w obecności i nieobecnoś ci czynnika badanego, przy czym zmniejszenie aktywno ś ci proteolitycznej w obecnoś ci czynnika badanego identyfikuje go jako czynnik, który obniża aktywność proteolityczną polipeptydu proteazy aspartylowej.
35. 35. Sposób według zastrz. 34, znamienny tym, że proteolityczna aktywność obejmuje proteolityczną aktywność polipeptydu względem białka prekursorowego amyloidu (APP) jako substratu.
36. 36. Sposób identyfikowania czynnika obniżającego aktywność proteazową polipeptydu określonego w zastrz. 1-16, znamienny tym, że obejmuje etapy:

    (a) mierzenia proteolitycznej aktywności polipeptydu w obecności lub nieobecności czynnika badanego; i (b) porównania proteolitycznej aktywności polipeptydu w obecności lub nieobecności czynnika badanego, przy czym zmniejszenie aktywności proteolitycznej w obecności czynnika badanego identyfikuje go jako czynnik, który obniża aktywność proteolityczną polipeptydu proteazy aspartylowej.
37. 37. Sposób według zastrz. 36, znamienny tym, że proteolityczna aktywność obejmuje proteolityczną aktywność polipeptydu względem białka prekursorowego amyloidu (APP) jako substratu.
38. 38. Sposób identyfikowania czynnika, który moduluje aktywność proteazy aspartylowej Asp2, znamienny tym, że obejmuje etapy:

    (a) doprowadzenia do kontaktu proteazy aspartylowej Asp2 i białka prekursorowego amyloidu (APP) w obecności lub nieobecności czynnika badanego, przy czym proteaza aspartylowa Asp2 jest rekombinowanym polipeptydem, który wykazuje aktywność proteazy aspartylowej Asp2 włączonej w obróbkę APP do beta amyloidu i jest wyraż any przez komórkę gospodarza transformowaną lub transfekowaną cząsteczką kwasu nukleinowego, która koduje polipeptyd i która hybrydyzuje w następujących ostrych warunkach hybrydyzacji z sekwencją komplementarną do sekwencji z Id. Sekw. Nr: 3 lub Id. Sekw. Nr: 5:

    (1) hybrydyzacji w 42°C w buforze hybrydyzacyjnym obejmującym 6xSSC i 0,1% SDS i (2) przemywania w 65°C w roztworze do przemywań obejmującym 1xSSC i 0,1% SDS;

    (b) określania aktywności proteazy aspartylowej Asp2 w obróbce APP w obecności lub nieobecności czynnika badanego; i (c) porównania aktywności proteazy aspartylowej Asp2 w obróbce APP w obecności czynnika badanego z aktywnością w nieobecności czynnika w celu identyfikacji czynników, które modelują aktywność proteazy aspartylowej Asp2, przy czym modulator, którym jest inhibitor Asp2 zmniejsza obróbkę APP, a modulator, którym jest agonista Asp2, zwiększa tę obróbkę.
39. 39. Sposób według zastrz. 38, znamienny tym, że białko prekursorowe amyloidu jest ludzką izoformą APP.

    PL 205 294 B1
40. 40. Sposób według zastrz. 38 albo 39, znamienny tym, że białko prekursorowe amyloidu obejmuje miejsce cięcia β-sekretazy APP, które obejmuje mutację szwedzką (K >N, M >L).
41. 41. Sposób według zastrz. 38-40, znamienny tym, że białko prekursorowe amyloidu obejmuje dilizynę na C-końcu (KK).
42. 42. Sposób według zastrz. 38-41, znamienny tym, że białko prekursorowe amyloidu jest wyrażane przez komórkę.
43. 43. Sposób według zastrz. 38-41, znamienny tym, że proteaza z etapu (a) jest oczyszczona i izolowana.
44. 44. Sposób według zastrz. 38-41, znamienny tym, że etap doprowadzenia do kontaktu obejmuje hodowanie transformowanej lub transfekowanej komórki, która wyraża proteazę w obecności lub nieobecności czynnika badanego, przy czym białko prekursorowe amyloidu jest wyrażane przez komórkę.
45. 45. Sposób identyfikowania czynnika, który hamuje aktywność obróbki APP przez proteazę, znamienny tym, że obejmuje etapy:

    (a) doprowadzenia do kontaktu proteazy z białkiem prekursorowym amyloidu (APP) jako substratem w obecności i nieobecności czynnika badanego, przy czym proteaza stanowi rekombinowany polipeptyd wyrażany przez komórkę transformowaną lub transfekowaną kwasem nukleinowym, który obejmuje sekwencję nukleotydową kodującą proteazę, i proteaza obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w Id. Sekw. Nr: 4 lub Id. Sekw. Nr: 6 lub jej fragment, który wykazuje aktywność proteazy aspartylowej Asp2 włączonej w obróbkę APP do beta amyloidu, (b) określenia proteolitycznej aktywności proteazy względem substratu APP w obecności lub nieobecności czynnika badanego, i (c) porównania proteolitycznej aktywności obróbki przez proteazę aspartylową w obecności czynnika badanego z aktywnością w nieobecności czynnika badanego w celu zidentyfikowania czynnika, który hamuje aktywność obróbki APP przez proteazę, przy czym zmniejszenie aktywności w obecności czynnika badanego identyfikuje czynnik aktywny, który hamuje aktywność obróbki APP przez proteazę.
46. 46. Sposób według zastrz. 45, znamienny tym, że proteaza obejmuje sekwencję aminokwasową Asp2 przedstawioną w Id. Sekw. Nr: 4 albo Id. Sekw. Nr: 6 lub jej fragment, który wykazuje aktywność proteazy Asp2 włączonej w obróbkę APP do beta amyloidu.
47. 47. Sposób według zastrz. 45, znamienny tym, że proteaza obejmuje fragment sekwencji z Id. Sekw. Nr: 4, który obejmuje tripeptydy DTG i DSG miejsca aktywnego proteazy aspartylowej z sekwencji o Id. Sekw. Nr: 4 i wykazuje aktywność proteazy Asp2 włączonej w obróbkę APP do beta amyloidu.
48. 48. Sposób według zastrz. 45, znamienny tym, że proteaza obejmuje fragment sekwencji z Id. Sekw. Nr: 6, który obejmuje tripeptydy DTG i DSG miejsca aktywnego proteazy aspartylowej z sekwencji Id. Sekw. Nr: 6 i wykazuje aktywność proteazy Asp2 włączonej w obróbkę APP do beta amyloidu.
49. 49. Sposób identyfikowania czynnika, który hamuje aktywność obróbki APP przez proteazę, znamienny tym, że obejmuje etapy:

    (a) doprowadzenia do kontaktu proteazy z białkiem prekursorowym amyloidu (APP) jako substratem w obecności lub nieobecności czynnika badanego, przy czym proteaza obejmuje rekombinowany polipeptyd, który wykazuje aktywność proteazy Asp2 włączonej w obróbkę APP do beta amyloidu i jest wyrażany przez komórkę transformowaną lub transfekowaną kwasem nukleinowym, który obejmuje sekwencję nukleotydową kodującą proteazę i hybrydyzującą w następujących ostrych warunkach hybrydyzacji z sekwencją komplementarną do sekwencji nukleotydowej przedstawionej w Id. Sekw,. Nr: 3 lub Id. Sekw. Nr: 5:

    (1) hybrydyzacja w 42°C w buforze hybrydyzacyjnym obejmującym 6xSSC i 0,1% SDSi (2) przemywanie w 65°C w roztworze do przemywań obejmującym 1xSSC i 0,1% SDS;

    (b) określania aktywności obróbki APP proteazy aspartylowej Asp2 w obecności lub nieobecności czynnika testowego; i (c) porównania proteolitycznej aktywności obróbki przez proteazę aspartylową w obecności czynnika badanego z aktywnością w nieobecności czynnika badanego w celu zidentyfikowania czynnika, który hamuje aktywność obróbki APP przez proteazę, przy czym obniżona aktywność w obecności czynnika badanego identyfikuje czynnik, który hamuje aktywność obróbki APP przez proteazę.
50. 50. Sposób według zastrz. 45-49, znamienny tym, że proteaza z etapu (a) jest oczyszczona i izolowana.

    PL 205 294 B1
51. 51. Sposób według zastrz. 50, znamienny tym, że proteaza jest zasadniczo wolna od innych proteaz.
52. 52. Sposób według zastrz. 44-50, znamienny tym, że komórka obejmuje wektor, który zawiera kwas nukleinowy.
53. 53. Sposób według zastrz. 45-49, znamienny tym, że etap doprowadzenia do kontaktu obejmuje hodowanie transformowanej lub transfekowanej komórki, która wyraża proteazę, w obecności lub nieobecności czynnika badanego.
54. 54. Sposób według zastrz. 53, znamienny tym, że substrat APP stanowi polipeptyd APP wyrażany przez komórkę.
55. 55. Sposób według zastrz. 44 albo 54, znamienny tym, że etap określania obejmuje pomiar produkcji peptydu beta amyloidu przez komórkę w obecności lub nieobecności czynnika badanego.
56. 56. Sposób według zastrz. 55, znamienny tym, że komórka gospodarza jest komórką z linii komórkowej nerki zarodka ludzkiego 293 (HEK 293).
57. 57. Sposób według zastrz. 37 i 45-56, znamienny tym, że substrat APP obejmuje miejsce obróbki beta amyloidu (A-beta).
58. 58. Sposób według zastrz. 37 i 45-56, znamienny tym, że substrat APP jest peptydem obejmującym miejsce cięcia APP przez β-sekretazę.
59. 59. Sposób według zastrz. 57 albo 58, znamienny tym, że substrat APP obejmuje mutację szwedzką (K >N, M >L).
60. 60. Sposób według zastrz. 58, znamienny tym, że miejsce cięcia β-sekretazy obejmuje wzór P2-P1'-P2', w którym

    P2 jest aminokwasem wybranym z K i N;

    P1 jest aminokwasem wybranym z M i L;

    P1' jest aminokwasem D; a

    P2' jest aminokwasem A.
61. 61. Sposób według zastrz. 58, znamienny tym, że peptyd obejmuje sekwencję aminokwasową KMDA (Id. Sekw. Nr: 58 pozycje 4-7).
62. 62. Sposób według zastrz. 58, znamienny tym, że peptyd obejmuje sekwencję aminokwasową EVKMDAEF (Id. Sekw. Nr: 58 ).
63. 63. Sposób według zastrz. 58, znamienny tym, że peptyd obejmuje sekwencję aminokwasową NLDA (Id. Sekw. Nr: 54 pozycje 4-7).
64. 64. Sposób według zastrz. 58, znamienny tym, że peptyd obejmuje sekwencję aminokwasową SEVNLDAEFR (Id. Sekw. Nr: 54).
65. 65. Sposób według zastrz. 37 i 45-64, znamienny tym, że substrat APP jest substratem fluorogennym lub chromogennym.
66. 66. Sposób według zastrz. 37 i 45-64, znamienny tym, że substrat APP jest wyrażany przez komórkę i obejmuje dilizynę C-końca (KK), przy czym etap doprowadzania do kontaktu obejmuje hodowanie komórki, która wyraża proteazę i substrat APP w obecności i nieobecności czynnika badanego.
67. 67. Sposób według zastrz. 34-66, znamienny tym, że obejmuje ponadto wytwarzanie kompozycji czynnika zidentyfikownego jako inhibitor proteazy i farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika.
68. 68. Zastosowanie czynnika zidentyfikownego jako inhibitor aktywności proteazy aspatrylowej sposobem określonym w zastrz. 34-66 do wytwarzania leku do leczenia choroby Alzheimera.
69. 69. Izolowany kwas nukleinowy obejmujący sekwencję nukleotydową o długości od 15 do 100 nukleotydów, przy czym kwas nukleinowy hybrydyzuje z co najmniej 15 sąsiadującymi nukleotydami z sekwencji z Id. Sekw. Nr: 3 albo Id. Sekw. Nr: 5 lub z sekwencji do niej komplementarnej w następujących warunkach hybrydyzacji:

    inkubacja przez 2,5 godziny w roztworze hybrydyzacyjnym obejmującym 6xSSC i 0,1%SDS i przemywanie w 65°C w roztworze do przemywań obejmującym 1,0xSSC i 0,1% SDS;

    przy czym kwas nukleinowy zmniejsza obróbkę beta amyloidu (Abeta) w komórkach HEK293-SwKK transfekowanych kwasem nukleinowym w porównaniu do obróbki Abeta w nietransfekowanych komórkach HEK293-SwKK.
70. 70. Izolowany kwas nukleinowy według zastrz. 69, znamienny tym, że ma długość 15 do 30 nukleotydów.
71. 71. Izolowany kwas nukleinowy według zastrz. 69, znamienny tym, że ma długość 20 do 30 nukleotydów.

    PL 205 294 B1
72. 72. Izolowany kwas nukleinowy według zastrz. 69-71, znamienny tym, że cząsteczka kwasu nukleinowego obejmuje sekwencję komplementarną do sekwencji z Id. Sekw. Nr: 3.
73. 73. Izolowany kwas nukleinowy według zastrz. 69-72, znamienny tym, że stanowi DNA.
74. 74. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 69-72, znamienna tym, że stanowi RN A.
75. 75. Izolowany kwas nukleinowy według zastrz. 69-74, znamienny tym, że zmniejsza obróbkę Abeta (1-40) w transfekowanych komórkach o co najmniej 50% w porównaniu z komórkami nietransfekowanymi.
76. 76. Izolowany kwas nukleinowy według zastrz. 69-75, znamienny tym, że zmniejsza obróbkę Abeta (1-42) w transfekowanych komórkach o co najmniej 50% w porównaniu z komórkami nietransfekowanymi.
77. 77. Wektor obejmujący kwas nukleinowy według zastrz. 69-76.
78. 78. Sposób zmniejszania komórkowego wytwarzania beta amyloidu (A.beta) z białka prekursorowego amyloidu (APP), znamienny tym, że obejmuje etap transformowania lub transfekowania komórek in vitro kompozycją obejmującą reagent antysensowny zmniejszający wytwarzanie polipeptydu Asp2 przez zmniejszenie transkrypcji lub translacji w komórkach, przy czym zmniejszone wytwarzanie polipeptydu Asp2 w komórkach koreluje ze zmniejszoną obróbką APP do A.beta.
79. 79. Sposób zmniejszania komórkowego wytwarzania beta amyloidu (A.Beta) z białka prekursorowego amyloidu (APP), znamienny tym, że obejmuje etap transformowania lub transfekowania komórek in vitro kompozycją obejmującą kwas nukleinowy lub wektor określony w zastrz. 69-77, w ilości zmniejszającej wytwarzanie polipeptydu Asp2 przez zmniejszenie transkrypcji lub translacji Asp2 w komórkach, przy czym zmniejszone wytwarzanie polipeptydu Asp2 w komórkach koreluje ze zmniejszoną komórkową obróbką APP do A.beta.
80. 80. Sposób według zastrz. 78 albo 79, znamienny tym, że ponadto obejmuje etap identyfikowania ssaczych komórek, które wytwarzają A.beta przed etapem transformowania lub transfekowania.
81. 81. Sposób według zastrz.78-80, znamienny tym, że komórką jest komórka neutralna.
82. 82. Sposób według zastrz. 78, znamienny tym, że antysensowny reagent obejmuje oligonukleotyd obejmujący sekwencję kwasu nukleinowego o pojedynczej nici wiążącą się z Hu-Asp rnRNA.
83. 83. Sposób według zastrz. 78, znamienny tym, że antysensowny reagent obejmuje oligonukleotyd obejmujący sekwencję kwasu nukleinowego o pojedynczej nici wiążącą się z Hu-Asp DNA.
84. 84. Zastosowanie izolowanego kwasu nukleinowego lub wektora określonego w zastrz. 69-77 do wytwarzania leku do leczenia choroby Alzheimera.
85. 85. Zastosowanie antysensownego reagenta zmniejszającego wytwarzanie beta amyloidu z biał ka prekursorowego amyloidu (APP) do wytwarzania leku do leczenia choroby Alzheimera.