KR100626475B1 - 프리세닐린과 베타-아밀로이드 펩타이드 또는 이의 전구체간의 상호작용을 억제할 수 있는 펩타이드 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규 펩타이드와 뉴클레오타이드, 및 이들의 약학적 용도에 관한 것이다. 좀더 구체적으로 말하면, 본 발명은 프리세닐린 1 또는 프리세닐린 2와 β-아밀로이드 펩타이드 전구체 및/또는 β-아밀로이드 펩타이드 간의 상호작용을 적어도 부분적으로 억제할 수 있는 신규 폴리펩타이드에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 분자, 특히 상호작용을 억제할 수 있는 분자의 검출을 위한 시험관내 시험의 제조에 관한 것이다.
프리세닐린, β-아밀로이드 펩타이드, 알츠하이머병
Description
본 발명은 신규 펩타이드 및 뉴클레오타이드 서열에 관한 것이다. 좀더 구체적으로 말하면, 본 발명은 한편으로는 프리세닐린 1 또는 프리세닐린 2와, 다른 한편으로는 β-아밀로이드 펩타이드 전구체 및/또는 β-아밀로이드 펩타이드 간의 상호작용을 부분적으로 억제할 수 있는 신규 폴리펩타이드에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 분자, 특히 이러한 상호작용을 억제할 수 있는 소형 분자를 검출하기 위한 시험관내 시험의 개발에 관한 것이다.
37 내지 42개의 아미노산으로 이루어진 Aβ-아밀로이드 펩타이드는 알츠하이머병의 특징적인 노인성 플라크의 주된 단백질 성분이다. 이러한 펩타이드는 이의 전구체, 즉 아밀로이드 펩타이드 전구체 단백질(APP)의 절단에 의해 생성된다. APP에 대한 유전자에서의 돌연변이는 특정한 조숙성 가족형 알츠하이머병의 원인이 된다. 그러나, 이들 형태의 대다수는 두 유전자, 즉 프리세닐린 PS1(초기에는 S182로 명명되었음) 및 PS2(초기에는 STM2로 명명되었음)에서의 돌연변이 존재와 연관되어 있으며, 이들은 최근에 와서 위치별 클로닝에 의해 확인되었다(Hardy, 1997). 이러 한 형태는 우성이고 이러한 이상 모두는 엑손의 결실을 유도하는 하나를 제외하고는 미스센스 돌연변이에 상응한다. 프리세닐린은 약 45 내지 50 kDa의 분자량을 갖는 소수성 막 단백질이며 상호 67%의 동일성을 보인다. 이들은 C. elegans의 두 단백질 SPE4 및 Sel-12와 상동성이며, 각각 세포내 수송과 Notch 수용체의 시그널링에 간접적으로 연루되어 있다. 그러나, 프리세닐린의 생리적 기능은 아직 알려져 있지 않다. 이러한 두 유사 단백질의 알츠하이머병에의 연루는 프리세닐린이 이러한 병리의 병인에서 필수적인 생리학적 경로쪽으로 기여한다는 개념을 이끈다.
단백질 PS1은 467 아미노산을 포함하고 PS2는 448 아미노산을 포함한다. 둘 모두 6 내지 8개의 잠재적인 막횡단 도메인을 갖는 막 단백질의 구조를 취하고 있다. 각각의 프리세닐린은 생체내에서 정확한 단백질분해성 절단을 받아 N(아미노) 말단 단편 및 C(카복시) 말단 단편으로 언급되는 두 단편을 생성한다(Thinakaran et al., 1996). 이러한 절단은 PS1의 잔기 291 내지 299에서(Podlisny et al., 1997) 및 PS2의 상동 영역에서 맵핑되었다. 따라서 "N-말단(N-ter) 단편"이란 표현은 PS1의 위치 1에서 대략 291까지의 단편을 의미하고, "C 말단 단편"이란 표현은 일반적으로 나머지 부분을 의미한다. 비록, 지질 막에서 프리세닐린의 정확한 토폴로지가 명확하게 확립되지는 않았지만, 이들의 N-말단과 C 말단[RC1], 및 대형 소수성 루프가 세포질 구획에 존재하고 있다고 제안되어 있다(Doan et al., 1996, 도 1 참조).
본 발명에 이르러, 프리세닐린의 돌연변이형이 보균자(Scheuner et al., 1996) 및 형질감염 세포(Borchelt et al., 1996) 또는 트랜스제닉 마우스(Duff et al., 1996)에서 Aβ 1-40의 것에 비해 긴 Aβ 1-42의 생성 증가를 유도함이 입증되었다. Aβ 아밀로이드 펩타이드는 병리의 특징적인 병변인 노인성 플라크를 형성하고, 이의 각종 형태는 아밀로이드 전구체 단백질 APP의 이화작용으로부터 유도된다. 특히, 아밀로이드 펩타이드의 두 필수형이 기재되어 왔으며, 하나는 40개의 잔기로 이루어진 Aβ40, 다른 하나는 카복시 말단에 두 개의 부수적인 잔기를 함유하는 Aβ42이다. 시험관내에서, Aβ 펩타이드는 Aβ42형에 대해 증가되는 강한 응집성을 지니며, 이러한 후자 형태는 병리에서 검출가능한 제 1 응집물을 효과적으로 형성하는 듯하다. 더욱이, Aβ42형은 사람에서 두개골 외상 후에 특이적으로 생성되며, 이는 알츠하이머병의 가장 잘 확립된 환경적 위험인자 중 하나를 구성한다. 아울러, APP 상의 돌연변이(6개) 및 프리세닐린 1과 2 상의 돌연변이와 연관된 질환의 초기 유전형 모두는 Aβ42/Aβ40비의 증가쪽으로 기여한다. 인자의 이러한 세트는 질환의 유전형 및 산재형 모두에서 주요제로서 Aβ42를 지정하는 것으로 보이며 이의 형성 메커니즘 규명은 근본적인 이슈가 되어왔다.
이와 관련하여, β-아밀로이드 펩타이드 전구체와 PS1 또는 PS2 간의 동일 세포 엔벨로프에서 복합체의 형성이 보고되었다(Weidemann et al., 1997, Xia et al., 1997); 그러나, β-아밀로이드 펩타이드의 생성에 관여하는 사건의 정확한 성질은 알려져 있지 않으며 이들 복합체의 가능한 역할과 β-아밀로이드 펩타이드 Aβ42의 생성 간에 어떠한 연관도 확립시킬 수 없었다. 그럼에도 불구하고, 펩타이드 Aβ42(Aβ40이 아님)가 뉴런 세포에서 소포체에 위치되어 있는 것으로 보인다는 점을 주목하는 것이 중요하다(Hartmann et al., 1997).
본 발명은 프리세닐린 1(PS1)과 프리세닐린 2(PS2)의 특정 영역, 및 APP/PS1 및 APP/PS2 복합체의 형성에 연루된 β-아밀로이드 펩타이드 전구체(APP)의 특정 영역의 본 출원인에 의한 동정 및 특징규명 결과이다.
본 발명은 특히, PS2의 친수성 N-말단 영역(아미노산 1 내지 87)의 상이한 APP 도메인 인식능을 입증함에 따른 결과이다. 또한 본 발명은 PS1의 말단 영역(단편 1-213)에 대한 유사 특성의 증명에 기인한다. 본 발명은 또한, 전술한 프리세닐린의 영역으로부터 유도된 폴리펩타이드의 APP와 프리세닐린 간의 복합체 형성 억제능의 입증에 기인한다. 본 출원의 프리세닐린은 본질적으로 프리세닐린 1(PS1) 및/또는 프리세닐린 2(PS2)에 상응한다.
본 발명은 또한, 지질막에 대한 상호작용에서 영역의 예상하지 못한 특이적 세포 위치의 입증에 기인한다. 본 발명은 또한, 이러한 상호작용이 막 수준에서 뿐만 아니라 소포체의 루멘 수준에서 및 세포외 구획에서도 일어날 수 있다는 사실로부터 기인한다. 이러한 사실은 (상호작용에 관련된) PS의 N-말단 영역이 표준 조건하에서 일반적으로 세포질에 위치하는 것으로 생각된다고 가정하면 예상밖이다.
APP 및 프리세닐린의 상호작용 도메인의 특징규명 및 이러한 상호작용의 각종 세포 위치의 증명은 약학적으로 사용될 수 있는 신규 폴리펩타이드의 제조를 구상할 수 있게 한다.
따라서, 본 발명의 제 1 주제는 프리세닐린과 β-아밀로이드 펩타이드 전구체 및/또는 β-아밀로이드 펩타이드의 상호작용을 적어도 부분적으로 억제할 수 있 는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
상호작용을 억제할 수 있다는 의미에서, 본 발명의 폴리펩타이드 및/또는 본 발명 공정의 도움으로 검출된 리간드 및/또는 분자의 존재가 프리세닐린 및/또는 이의 N-말단과 β-아밀로이드 펩타이드 전구체 및/또는 β-아밀로이드 펩타이드, 바람직하게는 Aβ1-42 펩타이드 간의 상호작용을 적어도 부분적으로 억제하기에 충분함이 이해된다.
본 출원의 실시예에서, 본 발명의 폴리펩타이드 중 하나와의 이러한 상호작용 억제가 세포내 아밀로이드 펩타이드 β1-42의 생성 감소를 유도함이 입증된다. 따라서, 이러한 기능적 결과는 본 발명의 임의 폴리펩타이드 및/또는 본 발명의 공정을 이용하여 검출된 리간드 및/또는 분자에 대해 구상된다. 이러한 상호작용의 억제 및 따라서 Aβ1-42의 억제는 결과적으로 이러한 형태의 아밀로이드 펩타이드를 수반하는 질환에서 선택의 치료 표적을 나타낸다.
특정의 일 양태에 따르면, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 β-아밀로이드 펩타이드 전구체 및/또는 β-아밀로이드 펩타이드와의 상호작용을 허용하는 프리세닐린 2(PS2)의 적어도 일부를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 PS2의 일부가 PS2의 친수성 N-말단 단편에 상응한다는 점에서 특징이 있다. 좀더 바람직하게는, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 서열번호 1의 서열에 상응하는 서열 또는 이로부터 유도된 서열의 전부 또는 일부를 포함한다.
다른 양태에 따라, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 β-아밀로이드 펩타이드 전구체 및/또는 β-아밀로이드 펩타이드와의 상호작용을 허용하는 적어도 PS1의 일부를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 서열번호 2의 서열 또는 이로부터 유도된 서열의 전부 또는 일부를 포함한다.
다른 양태에 따라, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열에 상응하는 적어도 공통의 상동 영역을 포함한다.
다른 양태에 따라, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 β-아밀로이드 펩타이드 전구체(APP)의 적어도 일부를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 β-아밀로이드 펩타이드에 상응하는 영역이 아닌 APP의 일부를 포함한다. 한층 더 바람직하게는, 폴리펩타이드는 β-아밀로이드 펩타이드 전구체의 일부가 단편 1-596의 전부 또는 일부를 포함한다는 데 특징이 있다. 좀더 바람직하게는, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 서열번호 3의 서열의 단편 1-596에 상응하는 서열 또는 유도된 서열 중에서 선택된 서열의 전부 또는 일부를 포함한다.
본 발명의 목적상, "유도된 폴리펩타이드 서열"이란 표현은 유전적 및/또는 화학적 성질의 하나 이상의 변형에 의해 수득되고, 프리세닐린 1 또는 프리세닐린 2와 β-아밀로이드 펩타이드 전구체 및/또는 β-아밀로이드 펩타이드 간의 상호작용을 적어도 부분적으로 억제하는 능력을 지닌, 서열번호 1 또는 서열번호 2로 제시된 서열, 또는 서열번호 3의 지정 단편에 상응하는 폴리펩타이드 서열과는 상이한 폴리펩타이드 서열을 의미한다. "유전적 및/또는 화학적 성질의 변형"이란 표현은 하나 이상의 잔기의 돌연변이, 치환, 결실, 첨가 및/또는 변형을 의미한다. 이러한 유도체는 상이한 목적을 위해서, 예를 들면, 특히 이의 상호작용 부위에 대한 펩타이드의 친화성 증가, 이의 생성 수준 향상, 이의 프로테아제 내성 증가, 이의 치료 효능 증가 또는 이의 부작용 감소, 또는 신규한 약력학 및/또는 생물학적 성질 부여를 위해 생성시킬 수 있다.
본 발명은 또한, 약학적으로 사용될 수 있는, 배타적으로 펩타이드성이 아닌 비-펩타이드 화합물을 제공한다. 구체적으로는, 본 출원에 기재된 폴리펩타이드를 출발물질로 하여, 프리세닐린 1 또는 프리세닐린 2와 β-아밀로이드 펩타이드 전구체 및/또는 β-아밀로이드 펩타이드 간의 상호작용을 적어도 부분적으로 억제하고, 배타적으로 펩타이드성이 아니고 약학적 용도에 적합한 분자를 제조할 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명은 활성에 중요한 이들 폴리펩타이드의 구조적 요소의 측정 및 비-펩타이드 구조물 또는 배타적으로 펩타이드성이 아닌 구조물의 재생에 의한, 약리학적으로 활성인, 비-펩타이드 분자, 또는 배타적으로 펩타이드성이 아닌 분자의 제조를 위한 전술한 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 주제는 또한, 이와 같이 하여 제조된 하나 이상의 분자를 포함하는 약학 조성물이다.
본 발명에 따른 폴리펩타이드는 프리세닐린과 β-아밀로이드 펩타이드 전구체 및/또는 β-아밀로이드 펩타이드 간의 상호작용을 억제하도록, 정확한 셀룰로스 국재를 허용하는 서열을 포함한다. 바람직하게는, 이들은 외생성 세포 국재 서열을 포함하는 서열번호 1 및 서열번호 2로부터 유도된 폴리펩타이드 및 좀더 바람직하게는 PS1 또는 PS2의 N-말단을 포함하는 폴리펩타이드이다. 언급될 수 있는 서열로는 IgkB 시그널 펩타이드, APP 시그널 펩타이드, 근육과 중추 아세틸콜린 니코틴 수용체 아단위의 시그널 펩타이드 등의 서열과 같은 시그널 펩타이드 서열이 있다.
특히 유리한 폴리펩타이드로는, PS2의 N-말단의 처음 87개의 잔기를 포함하는 폴리펩타이드 및 IgkB 시그널 펩타이드를 들 수 있다.
본 발명의 주제는 또한, 프리세닐린 1 또는 프리세닐린 2와 β-아밀로이드 펩타이드 전구체 및/또는 β-아밀로이드 펩타이드 간의 상호작용을 적어도 부분적으로 억제할 수 있는 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드이다. 하나의 특정 양태에 따라, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열 또는 이로부터 유도된 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 뉴클레오타이드 서열이다. 다른 양태에 따라, 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열 또는 이로부터 유도된 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 뉴클레오타이드 서열이다. 바람직하게는, 서열번호 1 및 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열에 공통인 상동 지역을 포함하는 뉴클레오타이드 서열이다. 다른 양태에 따라, 서열번호 3 또는 유도된 서열의 단편 1-596(핵산 1 내지 1788)에 상응하는 뉴클레오타이드 서열이다.
본 발명의 목적상, "유도된 뉴클레오타이드 서열"이란 표현은 유전적 및/또는 화학적 성질의 하나 이상의 변형에 의해 수득된 유전 암호의 축퇴성으로 해서 고려 중의 서열과는 상이한 서열, 및 이들 서열 또는 이들의 단편과 하이브리드화하고 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 의미한다. "유전적 및/또는 화학적 성질의 변형"이란 표현은 하나 이상의 잔기의 돌연변이, 치환, 결실, 첨가 및/또는 변형을 의미할 수 있다. "유도체"란 용어는 또한 다른 세포원으로부터, 특히 인간 기원의 세포로부터, 또는 다른 유기체로부터 유도된, 고려 중의 서열과 상동성인 서열을 포함한다. 이러한 상동성 서열은 하이브리드화 실험에 의해 수득 될 수 있다. 하이브리드화는 가변적인 하이브리드화 조건하에서, 천연 서열 또는 이의 단편을 탐침으로서 사용하여, 핵산 라이브러리의 도음하에 수행될 수 있다(Maniatis et al., 1982).
본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열은 인공 기원 또는 천연 기원일 수 있다. 이들은 게놈 서열, cDNA 서열, RNA 서열, 하이브리드 서열 또는 합성이나 반합성 서열일 수 있다. 이들 서열은 예를 들면, 전술한 서열을 토대로 하여 개발된 탐침을 사용하여 DNA 라이브러리(게놈 DNA 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리)를 스크리닝함으로써 수득될 수 있다. 이러한 라이브러리는 당업자에 공지된 통상의 분자생물학 기술에 의해 상이한 기원의 세포로부터 제조될 수 있다. 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 또한, 화학적 합성에 의해 또는 라이브러리 스크리닝에 의해 수득된 서열의 화학적 또는 효소적 변형을 포함하는 혼합방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 핵산은 당업자에 공지된 임의 기술에 따라 제조될 수 있다.
본 발명의 다른 주제는 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 세포를 서열이 발현되는 조건 하에서 배양한 다음 생성된 폴리펩타이드를 회수하는, 본 발명의 폴리펩타이드 제조방법에 관한 것이다. 이 경우에, 폴리펩타이드를 암호화하는 부분은 일반적으로, 숙주세포에서의 발현을 허용하는 시그널의 조절하에 놓인다. 이러한 시그널(프로모터, 터미네이터, 분비 리더 서열 등)의 선택은 사용된 숙주세포에 따라 변할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 자가 또는 통합성 복제 벡터일 수 있는 벡터의 부분을 형성할 수 있다. 좀더 구체적으로는, 자가 복제 벡터는 선택된 숙주에서 자가 복제하는 서열을 사용하여 제조될 수 있다. 통합성 벡터의 경우, 이들은 예를 들면, 상동성 재조합에 의해 벡터의 통합을 허용하는, 숙주 게놈의 특정 영역과 상동한 서열을 사용하여 제조할 수 있다.
본 발명의 주제는 또한, 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산으로 형질전환된 숙주세포이다. 재조합 경로를 통해 본 발명의 펩타이드 생성에 사용될 수 있는 숙주세포는 진핵세포 숙주 및 원핵세포 숙주 모두이다. 적당한 진핵세포 숙주로는, 동물 세포, 효모 또는 진균을 들 수 있다. 특히, 효모로는, 사카로마이시즈 속, 클루이베로마이시즈 속, 피치아 속, 슈바니오마이시즈 속 또는 한세눌라 속을 들 수 있다. 동물 세포로는, COS, C127, 인간 신경아세포종 세포 등을 들 수 있다. 진균으로는, 특히 아스퍼질러스 종, 또는 트리코더마 종을 들 수 있다. 바람직하게 사용되는 진핵세포 숙주는 이.콜라이, 바실러스 또는 스트렙토마이시즈 박테리아이다.
하나의 바람직한 양태에 따라, 숙주세포는 유리하게는 본 발명 핵산의 발현 및 이로부터 유도된 단백질의 생성을 위한 재조합 효모균으로 대표된다.
바람직하게는, 숙주세포는 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 생산을 위한 서열번호 1 또는 서열번호 2의 서열 또는 서열번호 3으로 나타낸 단편 중에서 선택된 적어도 하나의 서열 또는 서열의 단편을 포함한다.
본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열은 유전자 요법에서, 특히 프리세닐린 1 또는 프리세닐린 2와 β-아밀로이드 펩타이드 전구체 및/또는 β-아밀로이드 펩타이드 간의 상호작용을 적어도 부분적으로 억제할 수 있는 폴리펩타이드의 생체내 생산 및 전달을 위해, 서열번호 1 및 서열번호 2의 유도체에 대한 시그널 펩타이드 의 첨가에 의해 사용될 수 있다. 구체적으로는, 본 특허출원에서 예상밖으로, 프리세닐린과 β-아밀로이드 펩타이드 전구체 및/또는 β-아밀로이드 펩타이드 간의 상호작용을 억제시키기 위해, 소포체의 루멘에서 본 발명의 폴리펩타이드의 어드레싱에 및 따라서 서열번호 1 및 서열번호 2로부터 유도된 폴리펩타이드에 생물학적 활성을 부여하기 위해서는 시그널 펩타이드가 요구됨이 입증되었다.
본 발명의 다른 양태에 따라, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 발현 벡터에 사용될 수 있는 발현 카세트의 작제에 사용된다. 특히, 발현 벡터는 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 생산 역할을 한다.
본 발명의 폴리펩타이드는 당업자에 공지된 기술을 사용하거나, 이들 기술의 조합에 의해, 재조합 DNA 중으로 혼입되거나 혼입되지 않은 전술한 뉴클레오타이드 서열을 숙주세포에서 발현시킴으로써 수득될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 핵산 서열은 청구된 폴리펩타이드의 생체내, 생체외 및/또는 시험관내 발현을 유도하는 데 유용한 벡터 부분을 구성한다. 사용되는 벡터는 다양한 기원일 수 있으며, 단 동물 세포, 바람직하게는 인간 신경 세포를 형질감염시킬 수 있어야 한다. 이는 바이러스 또는 비-바이러스 벡터 또는 플라스미드 벡터일 수 있다. 본 발명의 하나의 바람직한 양태에서, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 아데노-수반 바이러스(AAV), 허피스바이러스, 사이토메갈로바이러스(CMV), 백시니아 바이러스 등으로부터 유도될 수 있는 바이러스 벡터가 사용된다. 이종 핵산서열을 혼입하는 아데노바이러스, 레트로바이러스 또는 AAV로부터 유도된 벡터는 문헌[참조: Akli et al., Nature Genetics 3 (1993) 224; Stratford- Perricaudet et al., Human Gene Therapy 1 (1990) 241; EP 185 573, Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Le Gal la Salle et al., Science 259 (1993) 988; Roemer and Friedmann, Eur. J. Biochem. 208 (1992) 211; Dobson et al., Neuron 5 (1990); Chiocca et al., New Biol. 2 (1990) 739; Miyanohara et al., New Biol. 4 (1992) 238; WO 91/18088]에 기재되어 있다.
따라서, 본 발명은 또한, 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 전술한 핵산 서열을 게놈 중에 삽입되어 포함하는 재조합 바이러스에 관한 것이다.
유리하게는, 본 발명에 따른 재조합 바이러스는 결손 바이러스이다. "결손 바이러스"란 용어는 표적세포에서 복제할 수 없는 바이러스를 의미한다. 일반적으로, 본 발명에 사용된 결손 바이러스의 게놈은 감염세포에서 바이러스의 복제에 요구되는 서열 중 적어도 하나가 결여되어 있다. 이들 영역은 (전부 또는 부분적으로) 제거되거나, 비-기능성으로 만들거나 다른 서열, 특히 본 발명의 핵산으로 치환될 수 있다. 바람직하게는, 그럼에도 불구하고 결손 바이러스는 바이러스 입자의 캡시드화에 요구되는 게놈의 서열을 보존한다.
본 발명의 핵산 서열은 결손 재조합 아데노바이러스, AAV 또는 레트로바이러스와 혼입된 형태로 사용하는 것이 특히 유리하다. 바람직한 일 양태에 따르면, 아데노바이러스이다.
상이한 혈청형의 아데노바이러스가 존재하며, 구조와 특성이 다소 다양하다. 이들 혈청형 중에서, 본 발명에서는 2 또는 5형 인간 아데노바이러스(Ad2 또는 Ad 5) 또는 동물 기원의 아데노바이러스(특허출원 WO 94/26914 참조)를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 사용될 수 있는 동물 기원의 아데노바이러스로는, 개, 소, 쥐(예를 들면, Mav1, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), 양, 돼지, 조류 또는 원숭이(예를 들면, SAV) 기원의 아데노바이러스를 들 수 있다.
바람직하게는, 동물 기원의 아데노바이러스는 개 아데노바이러스, 좀더 바람직하게는 CAV2 아데노바이러스[예를 들면 Manhattan 균주 또는 A26/61 균주 (ATCC VR-800)]이다. 바람직하게는, 본 발명에서, 인간 또는 개 또는 혼합 기원의 아데노바이러스가 사용된다. 바람직하게는, 본 발명의 아데노바이러스의 게놈에서, E1 영역은 적어도 비기능성이다. 관련 바이러스 유전자는 당해 분야의 숙련인에게 공지된 기술, 특히 관련 유전자 또는 유전자들에 대한 1 이상의 염기의 전체 억제, 치환, 부분 결실 또는 첨가에 의해 비기능성으로 만들 수 있다. 기타 영역, 특히 E3 영역(WO 95/02697), E2 영역(WO 94/28938), E4 영역(WO 94/28152, WO94/12649, WO95/02697) 및 L5 영역(WO 95/02697)도 변형될 수 있다. 일 바람직한 양태에 따르면, 아데노바이러스는 E1 및 E4 영역에 하나의 결실을 포함한다. 또다른 바람직한 양태에 따르면, 이는 E1 영역에 하나의 결실을 포함하고 있어 E4 영역과 암호화 영역이 삽입된다. 본 발명의 바이러스에서, E1 영역에서의 결실은 바람직하게는 아데노바이러스 Ad5 서열상의 뉴클레오타이드 455에서 3329에 걸친다. 또다른 바람직한 양태에 따르면, 외생성 핵산 서열이 E1 영역의 결실 부위에 삽입된다.
본 발명의 결손 재조합 바이러스는 결손 바이러스와, 특히 앞서 정의된 뉴클레오타이드 서열을 운반하는 플라스미드 간의 상동 재조합에 의해 제조될 수 있다(Levrero et al., Gene 101(1991) 195; Graham, EMBO J. 3(12) (1984) 2917). 상동 재조합은 바이러스와 플라스미드가 적당한 세포주에서 함께 형질감염된 후에 일어난다. 사용된 세포주는 바람직하게는 (i) 상기 요소들에 의해 형질전환될 수 있고 (ii) 바람직하게는 재조합의 위험을 피하기 위해 통합된 형태로, 결손 바이러스의 게놈의 일부와 상보적일 수 있는 서열을 포함해야 한다. 결손 재조합 아데노바이러스의 제조에 사용될 수 있는 세포주의 예로는, 인간 배 신장 세포주 293(Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59)이 언급될 수 있고, 특히 게놈, 아데노바이러스 Ad5(12%)의 게놈의 좌측부에 통합된다. 결손 재조합 레트로바이러스의 제조에 사용될 수 있는 세포주의 예로는, CRIP주가 언급될 수 있다(Danos and Mulligan, PNAS 85 (1988) 6460). 다음, 증식된 바이러스는 통상적인 분자 생물학 기술에 따라 회수 및 정제된다.
본 출원의 주제는 또한 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 암호화 하는 이종 핵산 서열을 포함하는 결손 재조합 바이러스이다.
본 발명의 또다른 주제는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 또는 항체 단편이다. 이러한 항체는 당해 분야의 숙련인에게 공지된 방법에 의해 생성될 수 있다. 특히, 이들 항체는 서열이 서열번호 1 또는 서열번호 2의 서열 또는 서열번호 3의 지정된 단편 중에서 선택된 폴리펩타이드에 대해 동물을 면역화시킨 다음, 혈액 샘플을 취해 항체를 분리하여 제조될 수 있다. 이들 항체는 또한 당해 분야의 숙련인에게 공지된 기술에 따라 하이브리도마를 제조하여 생성될 수도 있다. 본 발명에 따른 항체 또는 항체 단편은 특히 프리세닐린 1 또는 프리세닐린 2와 β-아밀로이드 펩타이드 전구체 및/또는 β-아밀로이드 펩타이드 간의 상호작용을 적어도 부분 적으로 억제한다.
본 발명의 또다른 주제는 프리세닐린 1 또는 프리세닐린 2와 β-아밀로이드 펩타이드 전구체 및/또는 β-아밀로이드 펩타이드 간의 상호작용을 적어도 부분적으로 변형하거나 억제할 수 있는 화합물을 동정하는 공정에 관한 것이다. 특히, 본 공정은 이러한 억제 화합물을 동정하기 위해 분자 선별을 위한 시험으로 이용될 수 있다.
이 시험은 특히 프리세닐린(1 또는 2)과 APP 또는 Aβ 펩타이드, 특히 펩타이드 Aβ1-42와 PS2의 N-말단 간의 일반적인 상호작용의 억제를 확인하는데 기초한다. 구체적으로 말하면, 특히 면역침강에 의해, 프리세닐린 또는 이의 단편과 적당한 규명 시스템에 결합된 마커 단백질을 이용하거나, 크로모포어 또는 플루오로포어를 사용하여, 앞서 언급된 단백질 또는 이의 단편의 상호작용의 억제를 전반적으로 확인할 수 있다. 이러한 공정은 프리세닐린 및/또는 APP 또는 이의 단편을 표지하는 적어도 1 단계 및 펩타이드 Aβ1-42와 프리세닐린, 바람직하게는 PS2의 N-말단, 또는 전체 APP와 프리세닐린 단백질 간의 상호작용의 억제를 확인하는 단계를 포함한다.
본 공정의 제 1 양태에 따르면, 이러한 화합물의 검출 및/또는 동정은 하기 단계에 따라 수행된다:
- 펩타이드 Aβ1-42를 배양하여 니트로셀룰로스 막상으로 미리 흡수시키고;
- 프리세닐린(PS1 또는 PS2)의 전부 또는 일부 및 유리하게는 N-말단을 함유 하는 박테리아 추출물을 분자 또는, 각종 시험 분자를 함유하는 혼합물과 함께 배양하기 위해 첨가하며;
- 세척 후, 니트로셀룰로스 필터상의 Aβ1-42 펩타이드와 프리세닐린의 상호작용을 프리세닐린-마커 단백질에 의해 검출한다. 원하는 분자는 상호작용을 억제하여 마커 단백질로부터 나온 시그널의 강도를 감소시킨다.
사용된 마커 단백질은 유리하게는 a) 알칼라인 포스파타제 또는 형광 크로모포어에 커플링된 S-tag-결합 단백질, 또는 b) 안티-PSNT 항체, 즉, 프리세닐린의 N-말단에 대한 항체이다.
본 공정의 또다른 양태에 따르면, 신규 화합물에 대한 조사는 하기의 방법으로 수행된다:
- Aβ42 펩타이드를 웰(96-웰 포멧 이상)을 함유하는 플레이트상에서 미리배양하고,
- 정제된 재조합 프리세닐린의 N-말단을 배양을 위해, 분자 또는 각종 시험 분자를 함유하는 혼합물과 함께 첨가하며,
- 세척 후, 플레이트내의 Aβ1-42 펩타이드와 프리세닐린의 상호작용을 프리세닐린-마커 단백질로 검출한다. 분광 광도계에 의해 프리세닐린과 β-아밀로이드 펩타이드 전구체 및/또는 β-아밀로이드 펩타이드 간의 상호작용 손실이 검출된다.
마커 단백질로서 알칼라인 포스파타제에 커플링된 S-tag-결합 단백질을 이용하는 특정 경우에, 측색 기질에 의해 확인된 후, 시그널은 450 nm에서 검출된다.
본 공정의 유리하고 바람직한 양태에 따르면, 일반적으로 프리세닐린 1 또는 프리세닐린 2와 β-아밀로이드 펩타이드 전구체 및/또는 β-아밀로이드 펩타이드, 특히 Aβ1-42 펩타이드와 PS2의 N-말단 간의 상호작용을 적어도 부분적으로 변형시키거나 억제할 수 있는 화합물의 검출 및/또는 분리가 하기 단계에 따라 수행된다:
- 분자 또는, 합성된 Aβ1-42 펩타이드와 각종 분자를 함유하는 혼합물을 바이오틴 및, N-말단 (위치 1의 상류)에서의 3 β-아닐린 (또는 3 라이신)의 아암과 접촉시키고,
- 상기 반응 혼합물을 제 1 플루오로포어로 표지된 정제 프리세닐린의 N-말단과 함께 배양하며 (유리하게는, 플루오로포어는 유로피움 크립테이트임),
- 제 2 플루오로포어 (제 2 플루오로포어는 제 1 플루오로포어의 방출 파장에서 여기될 수 있으며 이로 인해 두 플루오로포어가 함께 모이면 형광 전달에 있어 유리함)에 커플링된 스트렙타비딘(biot-Aβ1-42 펩타이드의 바이오틴에 결합됨)을 첨가하며,
- 상호작용을 억제하는 신규 화합물은 제 1 플루오로포어의 방출 파장에서 형광측정법에 의하고/의하거나 제 2 플루오로포어의 방출 파장에서 시그널의 감소를 측정하여 검출된다.
일 특정 양태에 따르면, 이러한 제 2 플루오로포어는 화학적으로 가교결합된 알로피코시아닌인 XL665로서, 665 nm(CisBiointernational)에서 형광도를 증가시킨다. 상호작용의 손실은 제 1 플루오로포어의 방출 파장에서의 형광계 및 방출 파장 이 665 nm인 XL665의 시그널에 있어 감소에 의해 검출된다.
본 공정은 액체, 상동상에서 프리세닐린과 APP 및/또는 Aβ 펩타이드 간의 상호작용을 직접 감지하고 차후 상기 상호작용을 억제하는 분자를 검출하기 때문에 전반적으로 유리하다. 구체적으로 말하면, 본 공정은 이들 두 크로모포어가 물리적으로 가까이 접근한다면(Aβ1-42와 재조합 단백질 간의 상호작용의 경우) 두 플루오로포어 간의 형광 전달에 기초한다. 본 공정의 일 바람직한 변형에 따르면, 제 1 플루오로포어는 표지된 재조합 단백질(337 nm에서 여기)에 의해 운반된 유로피움 크립테이트이고, 이는 biot-Aβ 펩타이드, 특히 biot-Aβ1-42 펩타이드에 결합된 스트렙타비딘-XL665와 반응한다. 유리하게는, 표지된 단백질은 프리세닐린(PSNT-K)의 일 또는 기타의 N-말단으로 구성된다. 유로피움 크립테이트가 특징적인 665 nm에서의 형광 손실 및 620 nm에서의 형광 증가는 프리세닐린 또는 이의 N-말단과 원하는 분자에 의한 APP 및/또는 Aβ 펩타이드 간의 상호작용의 억제를 나타낸다.
본 공정의 일 변형에 따르면, 분자 또는 각종 분자를 함유하는 혼합물은 우선 유로피움 크립테이트(PSNT-K)로 표지된 정제 프리세닐린의 N-말단과 접촉한 다음 바이오틴 및, N-말단에서 3 β-아닐린 (또는 3 라이신)의 아암을 운반하는 Aβ1-40 또는 Aβ1-42 펩타이드와 접촉될 수 있다. 프리세닐린 1 또는 프리세닐린 2와 β-아밀로이드 펩타이드 전구체 및/또는 β-아밀로이드 펩타이드 간의 상호작용을 적어도 부분적으로 변형하거나 억제할 수 있는 신규 분자는 XL665-표지된 스트렙타비딘을 첨가한 후, 상기 공정에 따른 분광측광법에 의해, 특히 665 nm에서의 형광도 를 확인함으로써 검출된다.
본 공정의 마지막 양태에 따르면, 일반적으로 프리세닐린 (1 또는 2)과 APP 또는 Aβ 펩타이드, 구체적으로는 Aβ1-42 펩타이드와 PS2의 N-말단 간의 상호작용을 억제하는 화합물의 검출 공정은 하기 단계를 포함한다:
- a) 프리세닐린(PS1 또는 PS2)의 전부 또는 일부 및 유리하게는 N-말단을 함유하는 세포 용해물, b) APP를 함유하는 세포 용해물(바이러스, 특히 배큘로바이러스로 감염된 세포에서 얻어짐), 및 c) 시험 분자 또는 각종 시험 분자를 함유하는 혼합물의 혼합물을 접촉시키고,
- 프리세닐린 또는 APP 또는 Aβ 펩타이드에 상응하는 용해된 단백질을 당해 분야의 숙련인에게 익히 공지된 적당한 항체에 의해 함께 면역침강시키며,
- 시험 분자가 원하는 억제성을 가지는지를 나타내는 표지 항체를 이용한 웨스턴 블로팅에 의해 프리세닐린과 APP의 공-면역침강 손실이 확인된다.
일 특정 양태에서, 앞서 기술된 본 발명의 공정은 프리세닐린과 β-아밀로이드 펩타이드 전구체 및/또는 β-아밀로이드 펩타이드 간의 상호작용의 리간드, 효능제 또는 길항제의 검출 및/또는 분리에 적용된다.
본 발명은 또한 폴리펩타이드에 대한 리간드, 특히 프리세닐린, β-아밀로이드 펩타이드 전구체 및/또는 β-아밀로이드 펩타이드, 바람직하게는 Aβ1-42 펩타이드 및/또는 PS2의 N-말단에 대한 리간드의 검출, 및 프리세닐린과 β-아밀로이드 펩타이드 전구체 및/또는 β-아밀로이드 펩타이드 간의 상호작용을 적어도 부분적 으로 억제할 수 있는 화합물의 검출을 위해 상술된 폴리펩타이드의 이용에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 주제는 의약품으로서, 상술된 공정에 따라 동정되고/동정되거나 얻어진 리간드 또는 변형제의 이용에 관한 것이다. 프리세닐린과 β-아밀로이드 펩타이드 전구체 및/또는 β-아밀로이드 펩타이드 간의 상호작용을 억제하는 성질로 인해, 이러한 리간드 또는 변형제는 Aβ1-42 아밀로이드 펩타이드의 생산을 변형시키고 특정 신경계 질환, 특히 알츠하이머병을 치료할 수 있다.
본 발명의 또다른 주제는 프리세닐린과 β-아밀로이드 펩타이드 전구체 및/또는 β-아밀로이드 펩타이드, 바람직하게는 Aβ1-42 펩타이드와 PS2의 N-말단 간의 상호작용 시험의 개발에 관한 것으로, 이는 상기 분자에 결합된 두 플루오로포어 간의 형광 전달의 적어도 1 단계 및 분광 광도계로 측정된 상호작용을 확인하는 단계를 포함함이 특징적이다. 앞서 언급된 바와 같이, 이 시험은 또한 본 출원에 기재된 상호작용의 억제를 확인하는 과정에 따라, 상호작용을 억제하는 분자의 검출에 이용된다.
본 발명의 주제는 또한 활성 성분으로서, 앞서 정의된 적어도 하나의 폴리펩타이드를 포함하는 약학 조성물이다.
본 발명의 주제는 또한 활성 성분으로서, 앞서 정의된 적어도 하나의 항체 또는 항체 단편, 및/또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 및/또는 앞서 정의된 리간드를 포함하는 약학 조성물이다. 본 발명의 주제는 또한 활성 성분으로서, 앞서 정의된 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 약학 조성물이다.
또한, 본 발명의 주제는 또한 앞서 정의된 펩타이드, 항체, 리간드 및 뉴클레오타이드가 함께 결합하거나 기타 활성 성분과 결합되는 약학 조성물이다.
본 발명의 주제는 또한 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열이 바이러스 또는 비-바이러스 재조합 벡터에 혼입되는 조성물이다.
본 발명에 따른 약학 조성물을 사용하여 프리세닐린과 β-아밀로이드 펩타이드 전구체 및/또는 β-아밀로이드 펩타이드 간의 상호작용을 적어도 부분적으로 억제할 수 있다. 이들은 좀더 바람직하게는 신경퇴행성 질환, 예를 들면 알츠하이머병의 치료를 위한 약학 조성물이다.
본 발명의 또다른 주제는 프리세닐린과 β-아밀로이드 펩타이드 전구체 및/또는 β-아밀로이드 펩타이드 간의 상호작용을 적어도 부분적으로 억제하기 위해 앞서 기재된 폴리펩타이드를 사용, 바람직하게는 이들 폴리펩타이드를 사용하여 신경퇴행성 질환, 특히 알츠하이머병의 치료를 위한 약품을 얻는 데 있다.
본 발명에 따른 이들 용도로서, 한편으로는 본 발명의 폴리펩타이드, 또는 다른 한편으로는 프리세닐린과 β-아밀로이드 펩타이드 전구체 및/또는 β-아밀로이드 펩타이드 간의 상호작용을 적어도 부분적으로 억제할 수 있는 분자, 및 상응하는 핵산 서열, 또는 상술된 벡터는 바람직하게는 1 이상의 약학적으로 허용가능한 비히클과 결합되어 국부, 경구, 비경구, 비내, 경피 등 투여를 위해 제형된다. 바람직하게는, 이들은 경구 형태로 이용된다. 그렇지만, 주사 형태가 포함될 수 있고 이는 특히 등장액, 멸균 식염액 (모노나트륨 포스페이트, 디나트륨 포스페이트, 나트륨 클로라이드, 칼륨 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 마그네슘 클로라이드 등 또는 이러한 염의 혼합물) 또는 건조 조성물, 특히 동결 건조 조성물과 함께 제형될 수 있는데, 멸균 수 또는 생리 색염의 첨가시에는, 경우에 따라, 주사액으로 제조될 수 있다.
벡터, 특히 투여에 이용된 바이러스의 양은 각종 파라미터의 함수, 특히 관련 투여 부위 (기관, 신경 조직 또는 근육 조직), 주사 횟수, 발현될 유전자 또는 원하는 치료 기간에 따라 조절될 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스는 104 내지 1014 pfu, 바람직하게는 106 내지 1010 pfu의 투여량 형태로 제형 및 투여된다. 용어 "pfu" (플라크 형성 단위)는 바이러스 용액의 감염력에 대응되고, 적당한 세포 배양물의 감염 및 일반적으로 2주 후, 감염된 세포의 플라크 수를 측정함으로써 알 수 있다. 바이러스 용액의 pfu 역가를 측정하는 기술은 문헌에 잘 실려있다.
본 발명은 프리세닐린과 β-아밀로이드 펩타이드 전구체 및/또는 β-아밀로이드 펩타이드 간의 상호작용과 관련된 질병 치료, 바람직하게는 신경퇴행성 질환, 특히 알츠하이머병의 치료에 효과적인 수단을 제공한다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 좀더 상세히 기재될 것이고, 이들 실시예는 설명적이면서 동시에 비제한적인 것으로 간주된다.
도 1: a) 끝잘린 PS2 작제물의 지도
b) COS1 세포에서의 발현
도 2: PS2의 끝잘린 형태와 APP의 상호작용
도 3: a) 세포질 형태와 세포외 APP의 상호작용이 아닌, PS2 (SecPS2NT)의 분비된 N-말단과 세포외 APP의 상호작용.
b) 세포외 배지에서 SecPS2NT/APP 상호작용 검출, myc-PS2NT/APP 상호작용은 검출되지 않음.
도 4: APP의 끝잘린 형태와 PS2의 상호작용.
a) APP(MC45F)의 세포질 도메인과의 상호작용이 아닌, SPA4CT 형태를 한 PS2의 상호작용.
b) APP의 C100 형태와 PS2의 상호작용.
도 5: APP 및 이의 짧은 형태와 PS1 및 PS1DC2의 상호작용:
a) APP의 전체 형태 및 끝잘린 SPA4CT 형태와 PS1의 상호작용.
b) APP와 PS1 (PS1 ΔC2)의 끝잘린 형태의 상호작용.
도 6: 삽입 세포에서 PS1과 APP의 상호작용.
a) 안티-히스티딘 면역침강물 (PS1상에서 표지), APP 확인.
b) 안티-PS1 면역침강물, APP 확인.
c) 안티-APP 역전 면역침강물, PS1 확인.
도 7: 세포외 배지에서 Aβ 펩타이드와 PS2NT의 분비된 형태의 상호작용.
도 8: 시험관내 니트로셀룰로스 필터상에서 Aβ/PS2NT 상호작용의 재구성.
a) PS2NT의 농도의 함수에 따른 투여량-의존성.
b) Aβ의 농도의 함수에 따른 투여량-의존성.
도 9: 시험관내 PS1과 APP의 전체 형태의 상호작용.
a) 안티-히스티딘 면역침강물.
b) 안티-PS1 면역침강물.
도 10: 시그널 펩타이드 (SecPS2NT)뒤의 PS2의 N-말단에 의해, PS1과 단편 SPA4CT 간의 상호작용의 치환.
도 11: 시험관내에서 Aβ1-42 펩타이드와 PS2NT의 상호작용: 96-웰 플레이트 시험(ELISA)에 의해 검출.
도 12: Aβ1-42 펩타이드와 PS2NT의 상호작용, HTRF (균일 시간-해상 형광) 형광-전달 시험에 의해 검출.
도 13: SecPS2NT와 APP/PS1 상호작용의 차단이 Aβ1-42 아밀로이드 펩타이드의 세포내 생성을 억제한다.
a) SecPS2NT와 APP/PS1 상호작용의 차단이 Aβ1-42 아밀로이드 펩타이드의 세포내 생성을 억제하는 설명.
b) SecPS2NT의 발현이 각종 트랜스유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 대조군.
도 14: 락타시스틴을 이용한 약리학적 치료에 의해 COS 세포의 내인성 APP와 PS2의 상호작용 검출.
도 15: Aβ 펩타이드와 상이한 APP의 제 2 영역과 PS2 및 PS2NT의 상호작용.
재료 및 방법
A/ 재료
1. 프리세닐린을 발현시키는 작제물
인간 단백질 PS1과 PS2를 위한 포유동물 세포에서의 발현 벡터(숙주 벡터, pcDNA3, InVitrogen) 생산은 앞서 기재되어있다(Pradier et al., 1996). PS2의 C-말단에 의해 다수의 연속 결실이 일어난다 (도 1a 참조). 위치 1로서 PS2의 출발 코돈을 택해 넘버링한다.
PS2 벡터 (비암호 5' 말단, 위치 -55에서 위치 1080의 내부)의 HindIII 제한 단편을 정제하고 HindIII로 선형화되고 알칼라인 포스파타제로 처리된 벡터 pcDNA3로 연결한다. 이렇게 생성된 끝잘린 PS2 (PS2ΔC1)는 N-말단에서 잔기 361 + 3' 말단이 제공하는 7 잔기까지 확장되고 이로 인해 최초 6 막횡단 도메인과 친수성 루프의 큰 부위를 포함한다(도 1a).
PS2ΔC2는 PstI (위치 679의 내부)로 PS2 플라스미드를 절단하여 PS2 벡터의 비암호 3' 부위에 상응하는 PstI 단편으로 연결하여 작제된다. 끝잘린 단백질 PS2ΔC2는 위치 1에서 PS2의 잔기 228 + 3' 말단이 제공하는 추가 18 잔기까지 확장한다. 이는 PS2의 최초 4 막횡단 도메인을 포함한다.
N141I 돌연변이를 운반하는 PS2의 경우 유사한 작제물, PS2ΔC2*이 제조된다.
PS2ΔC2 작제물의 HindIII 제한 단편 (-55)/MscI (590)을 HindIII로 처리되어 ApaI 말단이 블런팅되는 pcDNA3 벡터로 클로닝한다. 이 작제물 PS2ΔC3는 N-말 단에서 잔기 198 + 추가 2 잔기까지 확장되어, PS2의 최초 3 막횡단 도메인을 포함한다.
DNA 폴리머라제의 클레노우 단편으로 처리하여 NcoI 말단에서 블런팅된 PS2ΔC2, (-55)/NcoI(504)의 HindIII 제한 단편을 동일한 pcDNA3 벡터 HindIII/ (ApaI 블런트 말단)으로 재클로닝시켜 PS2의 잔기 168 + 추가 3 잔기까지 확장하는 PS2ΔC4를 작제한다.
ext5' 올리고뉴클레오타이드: 5'-CGGAATTCATCGATTCCACCATGCTCACATTCATGGCC-3' (서열번호 4)(짙은 색은 초기 ATG 중복, 및 밑줄은 EcoRI 제한 부위의 도입)와 ext3' 올리고뉴클레오타이드: 5'-CCGCTCGAG
TCATTGTCGACCATGCTTCGCTCCGTATTTGAGG-3' (서열번호 5)(밑줄친 PS2의 잔기 90 이후의 종결 코돈 및 XhoI 제한 부위 도입)를 이용하여 PS2 서열을 증폭시켜 PS2의 친수성 N-말단을 작제한다.
TA 클로닝 방법(InVitrogen)에 의해 pCRII 벡터로 클로닝한 후, PCR 단편의 일치성을 서열 분석으로 체크한다. 이 단편 (EcoRI/XhoI)을 N-말단에서의 myc 에피토프: mycPS2Nter에 상응하는 서열과 동위상으로 pcDNA3 벡터로 도입한다.
PS2의 토폴로지를 손상시키지 않기 위해, 동일한 Nter 단편을 pSectagB 벡터 중으로, PS2Nter 단백질의 분비를 지시하는 IgkB 시그널 펩타이드 서열: SecPS2-Nter과 동위상으로 재클로닝한다.
PS2의 C-말단은 pSecTagB HindIII/PstI 벡터, 잔기 361에서 C-말단까지 뻗어있는 SecPS2Cter로 재클로닝되거나, myc 에피토프와 동위상으로 pcDNA3myc 벡터로 재클로닝된 HindIII 제한 단편 (1080)PstI (비-암호 3' 말단)을 이용하여 동일한 방법으로 작제된다.
마찬가지로 끝잘린 PS1 작제물이 얻어진다. pcDNA3-PS1 벡터를 PS1 서열의 비암호 3' 말단에서 pflmI (PS1의 암호화 핵산 서열의 위치 636에서의 부위)과 XhoI으로 절단한다. 이들 부위를 T4DNA 폴리머라제로 처리하여 블런트 말단중으로 형질전환시킨다. 아가로스 겔상에서 정제된 벡터 단편을 자가 재연결시키면 PS1의 N-말단에서 잔기 Ile213 (5번째 막횡단 도메인 뒤) + 추가 12 잔기까지 확장되는 끝잘린 PS1 발현 벡터가 생성된다. 이 작제물은 ΔC2 카이머에 대응되고 PS2ΔC2로 불린다.
2. APP를 발현시키는 작제물
2.1. APP 작제물
다양한 작제물: 완전 APP(이소형태 695) 및 SPA4CT(막으로 삽입되는 시그널 펩타이드 뒤의 APP(아미노산 597-695)의 마지막 100 잔기)에 관해 앞서 기재되었다(Dyrks et al., 1993). C100 및, APP의 세포질 도메인의 발현을 위한 벡터가 하기의 방법으로 얻어진다: 합성 프라이머로서 하기 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 효소적 DNA 증폭 (PCR (폴리머라제 연쇄 반응))에 의해 상응하는 cDNA를 얻는다: C100의 경우: 올리고뉴클레오타이드 8172 및 8181; APP의 세포질 도메인의 경우: 올리고뉴클레오타이드 8171 및 8181.
올리고 8172 5' CAAAGATCT GATGCAGAATTCCGACAT 3' (서열번호 6)는
- 제한 효소 BglII에 대한 인식 부위 (밑줄)
- APP의 아미노산 597-602에 대한 암호화 서열 (짙은 색) [695 아미노산의 APP 넘버링]을 함유하고:
올리고 8181 5' CAAGCGGCCGCTCATCCCTTGTCATCGTCGTCCT
TGTAGTCTCCGTTCTGCATCTGCTC 3' (서열번호 7)은
- 제한 효소 NotI에 대한 인식 부위 (밑줄)
- APP의 아미노산 691-695에 대한 암호화 서열에 상보적인 서열 (짙은 색)[695 아미노산의 APP 넘버링]
- FLAG 에피토프에 상응하는 서열 Asp-Tyr-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys에 상보적인 서열 (이탤릭체)을 함유한다.
올리고 8171 5' CAAAGATCT AAGAAACAGTACACATCC 3' (서열번호 8)은
- 제한 효소 BglII에 대한 인식 부위 (밑줄)
- APP의 아미노산 650-655를 암호화하는 서열 (짙은 색) [695 아미노산의 APP 넘버링]을 함유한다.
효소적 DNA 증폭 산물을 pCRII 벡터로 클로닝한다. 뉴클레오타이드 서열을 특정 DNA 터미네이터법으로 체크한다.
pSV2 플라스미드에서 유도되고 동일한 해독 프레임에 MYC 에피토프를 함유하는 발현 플라스미드중으로 연결에 의해 cDNA를 도입한다.
2.2 APP의 가용형: a-sAPP 및 β-sAPP의 작제
PCR에 의해 α- 및 β-절단 부위에서 끝나는 APP의 분비된 형태에 상응하는 cDNA를 얻는다.
올리고뉴클레오타이드 1:
5'-ccatcgatgg
cta
CATCTTCACTTCAGAG-3' (서열번호 9)는
- β 절단 부위에 상응하는 APP의 위치 1788 뒤의 (밑줄친 역전 상보성 서열) 종결 코돈,
- 및 ClaI 제한 부위를 도입한다.
올리고뉴클레오타이드 2:
5'-ccatcgatgg
cta
TTTTTGATGATGAACTTC-3' (서열번호 10)은
- α 절단 부위에 상응하는 APP의 위치 1836 이후의 (밑줄친 역전 상보성 서열) 종결 코돈,
- 및 ClaI 제한 부위를 도입한다.
올리고뉴클레오타이드 3:
5'-CCGTG
GAGCTC
CTCCCG-3' (서열번호 11)은 두가지 형태가 일반적이고, (밑줄친) APP의 SacI 내부 제한 부위를 포함하는 APP의 영역 1583에서 1600에 상응한다.
β-sAPP와 α-sAPP 각각의 경우 쌍으로 된 oligo3-oligo1 및 oligo3-oligo2를 이용하여 PCR에 의해 APP의 cDNA를 증폭시킨다. 증폭 산물을 상기와 같이 pCRII로 아클로닝하고 서열을 서열 분석으로 체크한다. 각각에 대한 SacI-ClaI 제한 단편을 정제하고 APP 발현 벡터(상기 참조)로 재클로닝하며, 이는 SacI-ClaI으로 자체 절단되어 APP의 C-말단 부위를 β-sAPP와 α-sAPP 각각의 C-말단으로 대체하고, 전체 단백질을 재구성한다.
3. 배큘로바이러스 작제물
포유동물 세포에 대한 발현 벡터를 이용하여 인간 PS1 단백질을 암호화하는 배큘로바이러스 전달 벡터를 생성한다(Pradier et al., 1996). PS1 단백질을 암호화하는 cDNA를 제한 효소 XhoI과 NotI을 이용하여 절단시켜 추출한 다음, 전달 플라스미드 pAcHTLB (6-히스티딘 융합 단백질) 및 pAcSG2(천연 단백질) 중으로 클로닝한다. 재조합 배큘로바이러스의 생산은 공급자의 (Pharmingen) 프로토콜에 따라 수행되고 이는 관련 유전자를 함유한 전달 플라스미드 1㎍과 바이러스 DNA 0.5㎍ (Baculogold)로 2 x 106 삽입 세포 (sf9)를 공형질감염시키는데 있다. 27℃에서 5일 후, 세포를 모아 원심분리하고, 상등액을 바이러스 역가의 증폭 및 측정을 위한 바이러스 스톡으로 이용하고, 단백질 발현을 세포 펠릿상에서 웨스턴 블로팅에 의해 확인한다.
인간 APP (695)를 발현시키는 배큘로바이러스의 생산에 관해서는 앞서 기재되어있다(Essalmani et al., 1996).
PS1과 APP의 발현 연구를 위해, sf9 세포를 인간 APP (695), 인간 프리세닐린 1 (PS1) 단백질, 또는 N-말단 6-히스티딘 tag (6HisPS1)를 지닌 PS1, 또는 N-말단 6-히스티딘 tag (6HisXylE)를 지닌 슈도모나스 푸트리다의 XylE 대조군 단백질을 발현시키는 배큘로바이러스를 이용하여 M.O.I. 2로 공감염시킨 다음, 10 mM Tris, 130 mM NaCl, 1% Triton 100배, 1% NP40, pH 7.5 완충액으로 용해시킨다.
용해된 단백질을 anti히스티딘 항체(A), antiPS1 항체 (1805)(B) 또는 antiAPP 항체 (22C11) (C)와 함께 면역침강시킨다. APP 또는 PS1의 존재를 antiAPP 항체 aCT43(A), 22C11(B) 또는 antiPS1 항체 95/23(C)를 이용한 웨스턴 블로팅에 의해 확인한다.
APP, PS1 또는 6HisPS1을 함유하는 용해된 분획을 혼합한 다음 4℃에서 밤새 안티-히스티딘 또는 antiPS1 항체의 존재하에 면역침강시킨다. APP의 공면역침강은 αCT43 또는 22C11 항체를 이용한 웨스턴 블로팅 후에 확인된다.
4. 플라스미드
본 발명에 사용된 플라스미드는 하기와 같다:
- pcDNA는 포유동물 세포에서 PS1과 PS2 서열 및 이들의 끝잘린 형태의 클로닝 및 발현에 이용되는 시판 플라스미드(InVitrogen)이고,
- pCRII은 PCR 단편을 클로닝하는데 사용된 시판 플라스미드 (InVitrogen)이며,
- pSecTagB는 포유동물 세포에서 분비 시그널(Ig k 시그널 펩타이드)가 첨가된 cDNA의 클로닝 및 발현을 위해 사용된 시판 플라스미드(InVitrogen)이며,
- pSV2는 포유 동물세포에서 cDNA의 클로닝 및 발현에 사용된 시판 플라스미드 (Pharmacia)이며;
- pAcHTLB는 (His) 6 에피토프를 cDNA에 삽입하고 배큘로바이러스를 이용한 상동 재조합을 위한 시판 플라스미드 (Pharmingen)이며,
- pAcSG2는 배큘로바이러스와의 상동 재조합을 위한 시판 플라스미드 (Pharmingen)이며,
- pET29a는 박테리아에서 cDNA의 발현을 위한 시판 플라스미드 (Novagene)이다.
B/ 방법
1. 세포의 형질감염
COS1 세포 또는 CHO 세포의 경우 확립된 방법은 DNA의 응축 및 형질감염 효율을 최적화하기 위해 동일한 비율로 DNA와 합성 펩타이드 H1 (서열: KTPKKAKKPKTPKKAKKP)에 대해 1 내지 8 (중량/중량)의 비로 리포펙탄트를 사용하는데 있다. 이 방법은 특히 리포펙탄트의 양전하와 DNA 포스페이트 전하의 중화에 기초한다.
COS1 세포를 37℃, 95% 습도 및 3% L-글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 10% 태 송아지 혈청이 보충된 4.5 g/ℓ의 글루코스(Gibco-BRL)를 함유하는 DMEM (Dulbecco 변형 이글 배지)중의 5% CO2의 배양기에서 배양한다.
형질감염 하루 전, 세포를 100 mm 접시당 2.5 x 106 세포 밀도로 배양한다. 형질감염 당일에, 세포를 PBS(포스페이트-완충 식염수)으로 2회 세정하고 배양기에서 적어도 15분간 잔류시간 동안 OptiMEM(특허 조성물: Gibco-BRL)으로 1회 세정한다.
플라스미드 DNA 총 8 ㎍을 100 mm 접시-당량당 OptiMEM 300 ㎕와 펩타이드 H1 64 ㎍에 첨가한다. 10초간 격렬하게 와동시킨 후, 상기 혼합물을 5분간 정치시키고 OptiMEM 300 ㎕에 희석된 리포펙타민 (32 ㎕, 즉, 64 ㎍)을 첨가한다. 전체를 다시 격렬하게 와동시킨 다음 30분 동안 방치한다. 튜브 당 OptiMEM 5 ㎖를 첨가하고 와동시킨 혼합물을 세포상에 둔다(세포의 배지는 미리 제거되었다). 이어서 세 포를 4시간 동안 배양기에 두고, 그 후에 혼합물을 완전 배지로 치환한다.
2. 세포의 용해와 단백질 분석
세포는 통상적으로 형질감염 48시간 후 용해된다(통상적인 최대발현에서). 용해 완충액은 Tris pH 7.5 10 mM, EDTA 1 mM, 1% Triton X100, 1% NP40 및 프로테아제 억제제의 칵테일(CompleteR, Boehringer-Mannheim)을 함유한다. PBS로 세정한 후에, 각 플라크에 대해 차가운 완충액 800 ㎕를 첨가한다. 이어서 용해물을 초음파처리한 다음 4℃에서 밤새 마그네틱 바로 교반한다. 15000 rpm에서 30분 동안 원심분리를 해서 상등액으로부터 펠렛을 분리한다. 이어서 가용성 단백질을 BCA kit(Pierce)에 따라 분석하여 하기의 실험을 표준화하도록 한다.
3. 면역침강
PS2 N-말단 펩타이드, 95041(Blanchard et al., 1997)과 PS1의 처음 20개의 아미노산(Duff et al., 1996)에 대한 항체가 합성 펩타이드로 면역된 토끼에서 수득된다. 면역침강을 위해서, 단백질 100 ㎍을 변형된 RIPA(150 mM NaCl, 50 mM Tris pH 8.0, 1% Triton X100 v/v, 1% NP40 v/v) 400 ㎕로 희석한다. 단백질 A 세파로스 현탁액(PBS에 용해된 0.1% m/v) 30 ㎕와 항체 3 ㎕가 첨가된다. 현탁액은 4℃에서 밤새 회전 진탕기로 부드럽게 혼합된다. 단백질 A 세파로스 복합체를 변형된 RIPA 0.5 ㎖로 3회, "Wash C" 세척 완충액(10 mM Tris pH 7.5) 0.5 ㎖로 1회 세척한다.
4. 면역전이
샘플(세포 용해물)을 침착 완충액(125 mM Tris pH 6.8, 4% m/v SDS, 20% 글 리세롤, 0.02% 브로모페놀 블루, 50 mM 디티오트레이톨)의 등용적으로 5분 동안 95℃에서 변성시킨다. 프리세닐린 발현의 분석을 위해, 샘플을 37℃에서 8 M 우레아의 존재하에 변성시켜 95℃에서 프리세닐린 고유의 응집을 피한다.
샘플을 구별되는 분자량에 따라 아크릴아미드의 상이한 %로 트리스-글라이신 겔(Novex) 상에 침착시킨다. 분자량 마커 또한 침착된다(Broad Range, BioRad). 이동은 SDS 1X 최종 완충액(Novex)에서 일정한 100볼트에서 약 2시간 동안 일어난다. 이어서 겔은 니트로셀룰로스 상으로 또는 PVDF 막(10% 메탄올과 함께 1X 최종이동 완충액(Novex))으로 일정한 150 mA에서 2시간 동안 이동한다.
이동 후, 막을 실온에서 2시간 동안 2% 탈지분유(Merck)를 함유하는 PBS-T(0.5% Tween과 PBS) 50 ㎖로 블로킹시킨다. 제 1 항체(2% 탈지유를 함유하거나 함유하지 않은 PBS-T의 약 1/1000 내지 1/1500의 최대농도로 희석)를 4℃에서 밤새 둔다. PBS-T로 잠시 세정한 후, 막을 "ECL"이라고 불리는 완충액(20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1% Tween)에서 1/5000로 희석된 제 2 항체(경우에 따라 호스래디쉬 퍼옥시다제와 커플링된 안티-마우스 또는 안티-토끼 IgG)의 존재하에 45분 동안 배양시킨다.
이어서 막을 "ECL" 완충액에서 15분 동안 4회 세정한다. 이는 사용할 때 등용적으로 함께 혼합되어야 하는 두 완충액으로 이루어진 ECL 시약(Amersham)으로 나타날 수 있다. 사진 필름(Hyperfilm ECL; Amersham)의 다양한 노출을 실행한 다음 현상한다.
5. PS2 NT와 Aβ 아밀로이드 펩타이드의 시험관내 고정
5.1 박테리아에서 PS2 NT 재조합 단백질의 생산
PS2NT(아미노산 1 내지 87)에 대한 박테리아 발현벡터를 생산하기 위해, PS2의 cDNA가 올리고뉴클레오타이드 3'(CCGCTCGAGTCATTGTCGACCATGCTTCGCTCCGTATTTGAGG) 및 5'(CCGGAATTCATCGATTCCACCATGCTCACATTCATGGCC)를 사용하여 PCR에 의해 증폭된다. 생성된 단편은 pCRⅡ로 클로닝되고 서열을 확인한다. 이러한 단편은 이어서 S-tag 표지 서열과 동위상으로 pET29a 벡터(Novagene)로 아클로닝된다. 단백질이 BL21 박테리아에서 생성된다. 5시간 동안 IPTG로 유도한 후, 박테리아는 원심분리(6000 rpm에서 10분)로 회수되고 세포 펠렛은 RIPA 완충액(23으로 나눈 배지의 용적으로 유도 후 배지의 OD를 곱함으로써 계산된 용적)으로 용해된다. 박테리아는 음파처리되고 용해물을 4℃에서 20분 동안 13000 rpm으로 원심분리한다. 상등액(총 추출액)은 결합 연구에 사용된다.
PS2NT 재조합 단백질은 또한 공급자(Novagene)에 의해 설명된 것처럼 Nickel 컬럼(pET29a 벡터에서 공급된 폴리-히스 표지)상에서 전체 추출액으로부터 정제된다.
5.2 니트로셀룰로스 막에 결합하는 PS2NT/Aβ42의 시험
합성 Aβ 펩타이드(용액에서)를 니트로셀룰로스 막(Schleicher and Schuell)으로 96-웰 닷-블롯(96-well dot-blot) 기계를 사용해서 침착시킨다. 침착 후, 필터는 TBST에서 10배 희석된 젤라틴 블로킹제(Novagen)로 블로킹된다(비-특이성 단백질 결합부위에 대해). 블로킹 후, 필터를 닷-블롯 기계에 다시 배치하고 PS2NT 박테리아 추출액을 실온에서 2시간 동안 배양하기 위해 웰에 첨가한다. 대조군으로서, 엠프티(empty) pET29 플라스미드를 함유하는 박테리아 추출액을 웰상에서 이중으로 사용한다. 이어서 필터를 RIPA 완충액으로 1회 세척한 다음 기계로부터 제거하고 PBST로 3회(각 세척은 15분)세척한다. 이어서 S-tag 표지의 검출을 공급자(Novagen)의 처방에 따라 측로 실행한다. 측색 반응(침강)의 정량은 필터의 광학 스캐닝으로 실행되고 각 웰에서 강도의 정량은 Tina 2.1 프로그램(Raytest)를 사용해서 실행된다.
5.3 ELISA 포맷에서 PS2NT/Aβ42 상호작용의 시험
합성 Aβ 펩타이드(1-40 및 1-42)(100 ㎖, 2 ㎍/㎖)는 플라스틱에 결합하기 위해 96-웰 플레이트에서 밤새 배양된다. 플레이트는 PBS로 2회 세정하고 비-특이성 결합부위는 PBS 중의 5%(w/v) 소 혈청 알부민과 배양함으로써 포화된다. 정제되고(5.1에 설명된 프로토콜에 따라) 완충액(25 mM Tris/HCl, pH 7.5, 0.5% Triton X-100, 0.5% NP40)에서 희석된 재조합 단백질, PS2NT가 첨가되고 실온에서 4시간 동안 배양된다. PBS-0.5% Tween으로 2회 세정한 후, 플레이트에 보유된 PS2NT 단백질(Aβ 펩타이드와 상호작용함으로써)은 전술한 바와 같이 알칼라인 포스파타제와 커플링된 S-tag 결합 단백질과 배양함으로써 나타난다. 시그널은 450 nm에서 분광광도계로 확인한다.
5.4 HTRF(균질 시간-분할 형광) 포맷에서 PS2NT/Aβ1-42 상호작용의 시험
정제된 PS2NT 단백질(5.1에 설명된 프로토콜에 따라 생성)을 플루오로포어 유로피움 크립테이트(PS2NT-K)를 사용해서 표지한다. 펩타이드 Aβ1-40과 Aβ1-42가 바이오틴과 3 β-알라닌(또는 3 라이신)의 스페이서 암으로 이들의 N-말단(Aβ 펩타이드의 1 위치의 업스트림)에서 및 두개의 아르기닌(R)으로 이들의 C-말단에서 합성되어서, 펩타이드 biot-3K-Aβ40RR 및 biot-3K-Aβ42RR 합성을 촉진한다.
PS2NT-K와 biot-Aβ40 또는 biot-Aβ42의 상호작용 반응을 150 mM NaCl, 3.4 mM EDTA 및 3 mM CHAPS(세제)를 함유하는 10 mM HEPES 완충액, pH 7.2에서 실행한다. 표지된 PS2NT 단백질(최종 농도 6 nM, 즉 초기 15 nM용액의 40 ㎕)을 biot-Aβ40 또는 biot-Aβ42 펩타이드(최종 농도 2 ㎛, 즉 초기 5 ㎛ 용액의 40 ㎕와 20 ㎕의 완충액)와 10분 동안 배양한 다음, XL665(XL665는 가교결합된 알로피코시아닌이다, CisBio International)로 표지되는 스트렙타비딘을 400 mM KF, 133mM EDTA 및 1 g/ℓ의 BSA를 함유하는 100 mM pH 7.0 HEPES 완충액에서 8 ㎍/㎖(즉, 16㎍/㎖에서 초기용액 100 ㎕)의 농도로 첨가한다. 반응물은 실온에서 4시간 동안 또는 4℃에서 24시간 동안 배양되고, 플레이트는 한편으로 337 nm에서 여기 후 620nm에서 유로피움 크립테이트의 방출을 측정하고, 다른 한편으로는 유로피움 크립테이트에서 XL 665로 형광 전이 후 665 nm에서 XL665의 방출을 측정하는 Packard Discovery 카운터로 판독된다. XL665-스트렙타비딘/biot-Aβ42/PS2NT-크립테이트 복합체의 형성은 크립테이트로부터 XL665까지의 형광 전이를 유도하고, 이는 카운터에 의해 665 nm에서 측정된다. XL665-스트렙타비딘/biot-Aβ42/PS2NT-크립테이트 복합체의 형성 부재시에는, 유로피움 크립테이트 형광은 620 nm에서 나타난다.
실시예 1. APP와 PS2의 상호작용 및 PS2 상의 상호작용대의 지도작성
본 실시예의 목적은 PS2의 상호작용대를 결정하고 이 상호작용대와 APP 간의 상호작용을 검출하는 것이다.
포유류 세포에서 APP와 PS2 단백질의 상호작용은 도 2에 예시되었다. PS2와 APP로 형질감염된 COS 세포의 용해물은 PS2의 N-말단에 대한 항체로 면역침강된다(95041, Blanchard et al., 1997). 이어서 면역침강물은 안티-APP 항체로 면역전이에 의해 분석된다. APP는 확실히 APP와 PS2로 공-형질감염된 세포의 면역침강물에서 검출되지만, 전술한 바와 같이(Weidemann et al., 1997) PS2의 부재시에는(도 2, 레인 7과 비교되는 레인 6) 검출되지 않는다. 이 두 단백질 간의 상호작용대를 지도작성하기 위해, PS2의 여러 절단된 형태가 작제된다. 막 단백질의 N-말단부위에 의해 일반적으로 결정되는 PS2의 막 토폴로지를 보존하기 위해서, PS2의 C-말단부위의 점진적인 절단을 생성하고, 상이한 막횡단 도메인 TM6(PS2ΔC1), TM4(PS2ΔC2), TM3(PS2ΔC3) 및 TM2(PS2ΔC4) 후에 끝난다(개략도, 도 1a). PS2의 친수성 N-말단(87 잔기) 또한 세포질형(천연 서열)으로 또는 Igk 쇄에 대한 시그널 펩타이드의 삽입에 의한 분비형으로 작제된다. 이러한 다양한 형태의 발현은 도 1b에 예시되고, 안티-PS2 항체(95041)로 나타난다. 소수성 도메인을 함유하는 작제물은 부가적으로 기대 분자량(이 경우에 근접한 이중선 형성)을 갖는 단량체 형태, 이량체 형태 및 PS2의 전형적인 고분자량 응집체에 해당하는 밴드를 제공한다(도 1b, 레인 3-5). 특히 완전 PS2 경우, 이러한 응집체만이 이 도에서 검 출되는 반면, 단량체 형태는 검출되지 않는다(레인 6). PS2의 친수성 N-말단의 두 작제물: mycPS2NT 및 SecPS2NT는 기대 분자량의 밴드를 부여한다(도 1b, 레인 1 및 2). 작제물 SecPS2NT는 또한 세포외 매질에서 분비되는 반면(도 3b, 레인 2), 작제물 mycPS2NT는 세포질성이다.
이러한 작제물은 각각 APP로 공-형질감염된다. 세포 용해물의 세제 가용성 분획은 PS2의 N-말단에 대한 항체로 면역침강되고 이러한 면역침강물은 면역블로팅으로 분석된다. 전체 PS2처럼, APP는 PS2의 모든 절단된 형태, PS2ΔC2 내지 PS2ΔC4로(도 2, 레인 3-5) 면역침강물에서 검출되고, 이는 APP와 PS2의 N-말단을 함유하는 형태 사이의 상호작용을 설명한다. APP와의 이러한 상호작용은 PS2 N-말단 작제물이 분비형(도 2, 레인2)으로 보존되고, 이는 이러한 상호작용을 위해 지질막에 PS2NT를 고정시킬 필요없다는 것을 설명한다. 반대로, 세포질형의 mycPS2NT는 APP와 상호작용하지 않는다(도 2, 레인 1).
안티-APP 항체로 면역침강하고 PS2 N-말단 항체로 검출하는 반대실험은 상이한 실험 조건하에서 APP와 SecPS2NT 간의 상호작용을 확인시켜 준다.
APP와 SecPS2Nt로 공-형질감염된 세포를 위한 배양배지에서, 이 두 단백질 간의 상호작용은 또한 공-면역침강에 의해 설명된다(도 3a, 레인 4 및 도 3b, 레인 3). mycPS2NT 형태는 배지에서 APP와 상호작용하지 않는다(도 3b, 레인 2). 배지에서 이러한 상호작용의 존재는 APP/PS2NT 복합체가 분비과정 동안 비교적 안정하다는 것을 설명한다.
실시예 2. APP와 PS2 간의 상호작용 및 APP상의 상호작용대의 지도작성
본 실시예의 목적은 APP상에서 상호작용대를 설명하고 상호작용대와 프리세닐린 2 간의 상호작용을 검출하는 것이다.
이에 따라, APP의 절단된 형태는 APP 상에서 상호작용대 범위를 정하는데 사용된다. 통제하에 APP 또는 그렇지 않으면 분비 펩타이드의 말단 100 잔기(SPA4CT 및 C100, Dyrks et al., 1993)를 포함하는 작제물과 세포질 도메인(APP의 최종 45 잔기)만을 포함하는 작제물이 사용되고 이들의 존재는 APP의 세포질 도메인에 대한 항체(αCT43, Stephens and Austen, 1996)를 사용하여 검출된다. PS2로 공-형질감염된 세포에서, PS2와 APP의 세포질 도메인이 아닌 SPA4CT의 상호작용이 검출될 수 있다(도 4a, 비교 레인 4 및 5). PS2와 작제물 C100(분비 시그널 없음)의 상호작용 또한 나타날 수 있다(도 4b, 레인 7). IL2의 알파 수용체의 이론적인 작제물로 APP의 세포질 도메인과 막을 결합시켜도, PS2와의 상호작용은 관찰되지 않는다. 이 실시예는 세포질 도메인(잔기 651 내지 695)이 아닌 SPA4CT(APP의 597 내지 695 잔기)와의 상호작용이 있으며, 결국 APP상에서, Aβ(잔기 597 내지 637) 부위와 막횡단 절편의 나머지(잔기 650 까지)가 PS2와의 상호작용에서 중요하다는 것을 설명한다.
실시예 3. PS1과 APP의 상호작용과 초기 지도작성
본 실시예의 목적은 PS1상에서 상호작용대를 결정하고 상호작용대와 APP 간의 상호작용을 확인하는 것이다.
PS2에 대해 수득된 결과(실시예 1 및 2)와 유사하게, PS1과 APP의 상호작용 에 대한 연구가 동일한 COS1 세포 시스템에서 실행된다. PS1의 최종 20개의 아미노산에 대한 항체(Duff et al., 1996)로 공-면역침강 후에 SPA4CT, APP의 C-말단 단편은 침강물에서 검출될 수 있다(도 5a, 레인 4). APP는 또한 PS1과 상호작용한다. 유사하게, PS1의 절단된 형태, PS1ΔC2(1-213)은 APP와 상호작용한다(도 5b, 레인 4). 이러한 첫번째 데이타는 APP와 PS1의 상호작용대가 PS2로 예시한 바와 유사함을 설명한다.
이러한 PS1/APP의 상호작용의 확실성과 일반성을 체크하기 위해서, 상이한 세포 시스템이 사용되고, 여기에서 곤충 세포는 His6 표지와 함께 또는 없이 PS1과 APP를 발현하는 재조합 배큘로바이러스로 감염된다(재료 및 방법 참조). 세포 용해물의 연구는 한 형태의 단백질만이 발현되는 경우(레인 1,2 및 3)가 아닌 세포가 두가지 형태의 재조합 바이러스로 공-감염될 경우에 APP가 안티-His6 면역침강물(PS1-His6, 도 6a, 레인 4) 또는 antiPS1(His6과 함께 또는 없이 PS1, 도 6b, 레인 4 및 5)에서 검출되게 한다. 반대로, 안티-APP 면역침강물에서, PS1-His6 및 PS1 단백질이 이중 감염에 대해서도 검출가능하다(도 6c, 레인 4 및 5). 이러한 실험은 상이한 항체로 반대 의미의 상호작용을 확인하게 한다.
실시예 4. 세포에서 Aβ와 PS2의 상호작용
APP와 PS2 간의 상호작용 영역이 APP 상에 아밀로이드 펩타이드(595 내지 635)를 포함하는 영역 및 PS2 상에 친수성 N-말단 도메인을 포함한다고 가정하면, 본 실시예에서 PS2는 세포에 의해 생성된 아밀로이드 펩타이드(Aβ)와 직접적으로 상호작용한다는 것이 설명된다. COS 세포에서 SPA4CT(시그널 펩타이드에 의해 선행 되는 APP의 최종 100 잔기에 해당하는)의 발현은, 부분적으로는 SPA4CT가 Aβ의 생물학적 전구체로 고려되기 때문에 아밀로이드 펩타이드의 강력한 생성을 초래한다. COS세포는 SPA4CT만으로, SPA4CT 및 SecPS2Nt로 또는 CesPS2Nt만으로 형질감염된다. 상응하는 세포외 매질은 antiPS2 항체로 면역침강되고 Aβ 펩타이드는 특이적 항체 WO2(Nida et al. (1996) J.Biol.Chem. 271, 22908-914)에 의해 검출된다(도 7). Aβ 펩타이드는 SecPS2Nt와 SPA4CT로 공-형질감염된 세포에 대해서만 낮은 강도의 밴드로(도 7, 레인 1) 확인되고, 개개의 대조군(레인 2 및 3)으로는 확인되지 않는다. 게다가, 대략 40 kDa에서 부가의 밴드는 또한 이중 형질감염 세포에서 특이적으로 검출된다. 필터를 세척하고 PS2 항체로 검출한 후, 동일 분자량의 밴드가 또한 PS2-면역반응성인 것으로 보인다(도 7, 레인 4). 이 밴드는 또한 기대되는 대로 SecPS2Nt로 형질감염된 세포에 대해 존재한다. 따라서, 이중 형질감염 세포에서, 이러한 밴드는 SecPS2Nt와 Aβ 간의 SDS-안정 복합체를 나타내고, 이는 이러한 두 종의 상호작용을 확인하게 한다. Aβ 펩타이드(4 kDa)에 의해 나타나는 질량에서의 약간의 차이는 SecPS2Nt만으로 형질감염된 세포와 크기에서 검출가능한 차이가 왜 없는지를 설명할 것이다. 이러한 실험 결과는 PS2의 분비형(secPS2Nt)이 시험관내에서 Aβ 펩타이드(APP695의 597-637 잔기)와 상호작용한다는 결론을 내리게 한다.
실시예 5. 니트로셀룰로스 막에서의 시험관내 시험에서 Aβ와 PS2Nt의 상호작용의 재구성
본 실시예의 목적은 시험관내에서 PS2Nt-APP(Aβ) 상호작용의 재구성을 설명 하는 것이다.
Aβ 펩타이드와 PS2Nt(PS2의 N-말단) 간의 상호작용을 확인하기 위해서, 시험관내 결합의 시험이 전개된다. N-말단에 표지/마커 펩타이드 S(S-tag)를 운반하는 PS2Nt 용해 단백질이 작제되고 박테리아에서 발현된다. 펩타이드 Aβ1-40과 Aβ1-42는 PS2Nt 단백질을 발현하는 박테리아 추출액의 존재하에 배양되는 니트로셀룰로스 막에 침착된다. 이어서, S-tag는 알칼라인 포스파타제와 커플링된 S-tag-결합 단백질로 측색 반응에 의해 나타난다. S-tag-PS2Nt 단백질은 실제로 이 시험관내 시험에서 Aβ 펩타이드와 결합한다(도 8a). 대조군으로서, 복제물을 Aβ 펩타이드(1-40 및 1-42 형태) 상에서 비-특이적 결합의 수준으로 사용되는 펩타이드 S만을 발현하는 박테리아 추출액의 존재하에서 배양된다. 박테리아 추출액의 연속희석은 이 결합이 용량-의존형이고 포화된다는 것을 설정하게 한다. 이 실험에서, 결합은 Aβ1-40상에서 보다 Aβ1-42 상에서 더 큰것 같지만, 일정한 가변성을 보인다. 예를 들면, PS2Nt의 결합은 막에 침착된 Aβ의 용량에 의존하는 반면, Aβ1-40 및 Aβ1-42는 동등한 결합가를 보인다.
따라서, 본 실시예는 합성 Aβ와 박테리아 기원의 PS2NT 간의 시험관내 PS2Nt-APP(Aβ) 상호작용 재구성의 설명을 제공한다. PS2의 병리학적 돌연변이가 다수의 시스템에서 생성된 Aβ1-42/Aβ1-40 비의 증가를 초래하고, 더욱이 PS2와 APP 간의 물리적 상호작용이 있다고 가정하면, 이 물리적인 상호작용은 Aβ1-42 펩타 이드의 생성에 관여할 것이다. 따라서, 이러한 상호작용의 억제는 알츠하이머병의 치료에서 매우 새로운 접근을 이룬다.
실시예 6. 96-웰(ELISA 유형) 포맷에서 Aβ42/PS2NT 상호작용의 시험,
도 11
실시예 5는 니트로셀룰로스 막에서 Aβ 펩타이드와 PS2NT 단백질 간의 직접적인 상호작용을 설명하는 결과를 제공한다. 이 실시예의 목적은 실시예 5의 정보를 확인하고 96-웰-플레이트 포맷에서 상호작용의 검출을 설명하는 것이다. Aβ 펩타이드(Aβ40 또는 Aβ42)는 배양에 의해 플라스틱 96-웰 플레이트에 결합된다. 이어서 플레이트는 재조합 PS2NT 단백질과 배양된다. 세정 후, 상호작용(Aβ/PS2NT)의 검출은 S-tag-결합 단백질을 웰에 결합시키고 측색 규명으로 실행된다. PS2NT는 용량 의존식으로 Aβ1-42 펩타이드(도 11)에는 결합하지만 Aβ1-40 펩타이드에는 결합하지 않거나, 역전된 서열 Aβ40-1 펩타이드에는 결합하지만 다른 아밀로이드를 생성하는 펩타이드, 아밀린에는 결합하지 않는다. 플레이트에 결합하는 Aβ1-42 또는 Aβ1-40 펩타이드의 양은 면역검출로 확인되는 바와 같이 동일하다. Aβ42 상 PS2NT에 대한 결합상수는 0.18 μM이다. Aβ40에 대해 펩타이드 Aβ42 형태에 대한 PS2NT의 특이성은 간단히 실시예 5에서 설명된다. 이 실시예는 이러한 특이성을 설정하고, 이는 완전히 본 시험에서 재현가능하다.
Aβ42/PS2NT 상호작용의 이러한 시험 포맷은 이러한 상호작용을 억제하는 분자 스크리닝 시험을 쉽게 구상하게 한다.
실시예 7. HTRF 포맷에서 Aβ42/PS2NT 상호작용의 시험
실시예 5와 6에서, Aβ42 펩타이드와 PS2NT 단백질의 직접적인 상호작용은 우선 니트로셀룰로스 막에서 증명되고 두번째로 96-웰 플레이트(ELISA 형태)에서 증명된다.
본 실시예의 목적은 이러한 데이타를 확인하고, 형광전이 기술을 사용하는 액체/균질 상에서 상호작용의 검출을 설명하는 것이다.
재료 및 방법(5.4)에 설명된 시험의 원리는 형광전이에 기초한다. 유로피움 크립테이트(PS2NT-K)로 표지되는 재조합 단백질 PS2NT는 도 12에서 도시된 것처럼(bar No.3) biot-Aβ42 펩타이드와 상호작용한다. 이 시그널은 감소하고 따라서 PS2NT-K/biot-Aβ42 상호작용은 과량의 비표지 PS2NT(IC50 = 400nM)로 치환된다. 검출된 형광 시그널은 시간에 걸쳐 안정하다: 실온에서 4시간 내지 4℃에서 24시간(재료 및 방법에 설명된 것처럼, 선택된 조건에 따라).
이러한 상호작용은 biot-Aβ42 펩타이드(0 내지 2.5 μM의 시그널 선형대)와 PS2NT-K(0 내지 7.5 nM의 시그널 선형대)에 대해 용량 의존형이다. 도 12, bar No.5에 표시된 바와 같이, PS2NT-K와 부가의 특이성 요소를 함유하고 있는 biot-Aβ40 펩타이드의 상호작용은 없다. Aβ40에 비해 Aβ42 형태의 펩타이드에 대한 PS2NT의 특이성은 실시예 5에서 간단히 설명된 바와 같이 실시예 6과 본 실시예에서 확인된다.
따라서, PS2NT와 Aβ42 간의 상호작용의 이러한 HTRF 시험(세포에서 APP/PS 상호작용을 반영)은 고-처리 스크리닝에 의해 수단으로 이러한 상호작용을 억제하는 화학분자의 동정을 가능하게 한다.
실시예 8. 시험관내에서 APP/PS1 상호작용의 재구성
본 실시예의 목적은 완전 APP와 PS1 단백질 간의 상호작용이 상호작용을 검출하기 위해서만 함께 혼합되는, 상이한 세포 용해물을 사용하여 재생성될 수 있다는 것을 설명하는 것이다.
배큘로바이러스 발현 시스템이 다량의 재조합 단백질의 발현을 허용하기 때문에, 3종의 바이러스 각각으로 감염된 세포의 용해물 각각은 APP, PS1 및 PS1-His6 단백질의 기원으로 사용된다. APP, PS1 또는 6HisPS1을 함유하는 가용화 분획은 함께 혼합된 다음 안티-히스티딘 또는 안티-PS1 항체의 존재하에 4℃에서 밤새 면역침강된다. APP는 확실히 면역침강물에서 검출되고(도 9a, 레인 3 및 도 9b, 레인 3), 이는 APP와 PS1-His 또는 PS1의 상호작용이 시험관내에서 두 단백질을 배양함으로써 재구성된다는 것을 설명한다. APP만이 안티-PS1 항체(도 9b, 레인 1)에 의해 약간 침강되지만 안티-His 항체에 의해서는 침강되지 않고, 따라서 후자의 경우에 상호작용의 특이성을 확인한다. 이러한 결과는 두가지 전체 단백질 APP와 PS1의 시험관내 상호작용 시험의 실행을 가능하게 한다.
실시예 9. SecPS2Nt는 형질감염된 세포에서 APP와 PS1의 상호작용을 블로킹한다
전술한 실시예에서 APP는 PS2와 상호작용하는 유사한 방법으로 PS1과 상호작용하고, PS2의 경우, SecPS2NT 작제물은 APP와의 상호작용에 충분하다는 것을 설명했다. 본 실시예의 목적은 SecPS2Nt가 APP에 결합하는 것이 교차된(이종의) 방식으로 PS1과의 상호작용을 블로킹할 수 있는지 없는지를 평가하는 것이다. COS1 시스 템에서, SPA4CT(시그널 펩타이드에 의해 선행되는 APP의 최종 100 잔기에 해당하는)는 SPA4CT 및 wt PS1 또는 돌연변이체 PS1, PS1*(도 10a, 레인 1 및 2)를 발현하는 세포의 안티-PS1, 면역침강물에서 검출될 수 있다. 또한, SecPS2NT 또한 공-형질감염될 경우, SPA4CT 시그널은 실질적으로 안티-PS1 면역침강물에서 사라진다(도 10a, 레인 3 및 4). 안티-PS1 면역침강 후, 상등액(단백질 A 세파로스에 결합하지 않은 분획)은 안티-PS2 항체로 두번째 면역침강을 시행한다. SPA4CT는 확실히 PS1과 SecPS2NT로 공-형질감염된 세포에서 검출되고(도 10b, 레인 3 및 4), 이는 이러한 세포에서, 결합될 때 SecPS2NT는 SPA4CT가 PS1에 결합하는 것을 대신한다는 것을 설명한다. 따라서 이 실험은 SecPS2NT가 APP에 결합할 수 있을 뿐만 아니라 APP가 PS1 및 아마도 PS2에 결합하는 것을 대신할 수 있는 분자라고 결론을 내리게 한다. 따라서 SecPS2NT는 세포에서 APP와 두 프리세닐린 PS1과 PS2가 상호작용하는 것을 블로킹하기 위한 유인물로서 사용될 수 있다. 특히, PS1/APP 상호작용의 지도작성의 결과는 관여하는 상호작용대가 PS2의 것들과 유사하다는 것을 확인시켜 준다.
실시예 10. APP/PS1 상호작용의 블로킹은 세포내 Aβ42 아밀로이드 펩타이드 생성의 억제를 유도한다
전술한 실시예는 SecPS2NT의 발현이 APP와 PS1 또는 돌연변이체 PS1의 상호작용을 블로킹할 수 있음을 설명했다. 본 실시예는 아밀로이드 펩타이드, 특히 Aβ40 및 Aβ42 두가지 형태의 생성 억제 결과를 분석한다. 특히, 프리세닐린(PS1 또는 PS2)의 병리학적 돌연변이는 Aβ 펩타이드의 긴 형태, Aβ42 형태 대 Aβ40 형태의 비, Aβ42/Aβ40 비의 증가를 초래한다는 것이 문헌에서 이미 설명되었다(Borchelt et al., 1996 and, for review, Hardy, 1997).
SPA4CT는 wt PS1(도 13a, 레인 1 및 3) 또는 돌연변이체 PS1(도 13a, 레인 2 및 4)로 SecPS2NT(레인 3 및 4)의 존재 또는 부재하에 공-발현된다. 세포 용해물과 조건화된 세포 배지가 아밀로이드 펩타이드 생성에 대해 분석된다. Aβ40과 Aβ42 형태는 특히 Aβ40(FCA3340) 또는 Aβ42(FCA3542, Barelli et al., 1997)의 C-말단을 인식하는 항체로 면역침강함으로써 분석되고 면역침강물은 두가지 형태를 인식하는 항체로 면역블로팅함으로써 분석된다. 세포 용해물에서, 돌연변이체 PS1의 발현은 기대되는 대로 실제로 wt PS1과 약간 상이한 수준의 Aβ40(도 13a, 레인 1 및 2, Aβ42 및 Aβ40 세포 용해물 패널 비교)에 비해 Aβ42(1.5 내지 2배)의 생성 및 이들의 다량체 형태의 생성의 증가를 유도한다. SecPS2NT의 존재하에, Aβ42(및 다량체)의 농도는 wt PS1과 돌연변이체 PS1과 함께 상당히 감소한다(도 13a, 레인 3 및 4). 세포외 매질에서, Aβ42의 농도 또한 더 조금 감소하는 것 같다. 상이한 조건 사이에 Aβ40 아밀로이드 펩타이드의 농도에서의 차이는 없고, 이는 Aβ42에 대한 효과가 특이적이고 이는 발현수준에서의 전체적인 변화때문이 아니라는 것을 설명한다. 이는 형질감염된 다양한 유전자의 발현 분석으로 확인된다: SPA4CT, SecPS2NT 및 PS1(도 13b). 본 실시예에서, 결국 PS1/APP 상호작용을 유전적 우성 SecPS2NT로 억제하는 것은 돌연변이체 PS1과 wt PS1 모두로 세포내 Aβ42의 생성수준을 감소시킨다는 것이 설명되었다. 알츠하이머병의 발생에서 Aβ42의 근본적인 역할에 관해, 이 실시예는 APP/PS 상호작용의 억제가 결국 병의 유전형 및 산발형 모두에 대한 치료상 중요한 표적이 됨을 설명한다.
실시예 11. 약리학적 치료를 이용하는 COS 세포의 내생성 APP와 PS2의 상호작용 검출
본 실시예의 목적은 전술한 실시예에서 수득된 결과(세포에서 이러한 결과는 상호작용의 두 파트너:APP와 PS(PS1 또는 PS2)의 과발현에 관계한다) 또한 비-과발현되거나 내생성 단백질로도 유효하다는 것을 설명하는 것이다. 특히, 두 단백질의 강력한 과발현은 상호작용 인공물을 유도할 수 있다. 두 파트너의 동시 과발현을 포함하지 않는 조건하에서 상호작용의 검출은 본 실시예에서 조사된다.
COS 세포는 내생적이지만 낮은 수준으로 APP를 발현한다. 따라서, COS 세포는 따라서 PS2만으로 형질감염된다. 세포 용해물은 PS2 N-말단 펩타이드에 대한 항체로 면역침강해서 분석하고 안티-APP 항체, WO2로 면역블로팅해서 나타낸다. 도 14의 상부 패널은 PS2만으로 형질감염시켜서는 공-면역침강에 의해 내생성 APP와의 상호작용을 검출할 수 없음을 보여준다(도 14, 레인 1).
더욱이, APP/PS 상호작용은 Aβ42 아밀로이드 펩타이드의 생성을 유도해서(전술한 실시예), 소포체에서 APP의 이화를 유도하기 때문에, 이 세포 구획에서 단백질 분해 시스템인 프로테아좀이 포함될 수 있다. 프로테아좀의 선택적 억제제인 락타시스틴의 효과가 분석된다. PS2로 형질감염된 세포를 락타시스틴의 존재하에 배양한 후, COS 세포의 내생성 APP는 PS2 면역침강물에서 확실히 검출될 수 있다(도 14, 레인 5, 110 kDa 에서의 밴드). 내생성 APP와의 이러한 상호작용은 전술한 바와 같이 용량-의존 효과와 함께 유전적 우성 SecPS2NT(도 14, 레인 6 및 7)로 대 치될 수 있는 동일한 특징을 가진다. 특히, 레인 7은 내생성 APP에 해당하는 낮은 강도의 밴드인 SecPS2NT의 보통 함량이 항상 보임을 도시한다. 내생성 APP에 해당하는 밴드인 SecPS2NT(레인 6)의 고함량은 매우 약하게 나타나고 함량-의존 특징을 나타낸다. 약한 잔기 APP 시그널은 항상 존재하고(약 110 kDa에서의 밴드) 이는 빠르게 분비되는(SecPS2NT가 막횡단 고정 도메인을 가지지 않기 때문에) APP와 SecPS2NT 간의 복합체 때문이고 결국 세포내에 축적되지 않는다
도 14(중간 및 하부 패널)은 락타시스틴으로의 처리가 세포 내 또는 분비되는 APP의 전체 농도에 영향끼치지 않는다는 것을 도시한다. 특히, APP의 발현수준에 해당하는 밴드는 확실히 강도면에서 일정하다. 락타시스틴 효과의 특이성은 결국 PS2와 상호작용하는 APP의 아집단에서 증명된다.
이 결과로부터, 프로테아좀이 억제될 경우 APP/PS2 상호작용이 COS 세포의 내생성 APP로 검출될 수 있음이 설명될 수 있다. 게다가, 이러한 결과는 APP/PS2 상호작용이 덜 인위적인 조건하에서 확인될 수 있음을 설명한다. 그러나, 이러한 상호작용은 매우 불안정하다. 그래서, 더 확실한 검출을 수득하기 위해서, 본 실시예에서 단백질 분해의 억제 또는 전술한 실시예에서 두 파트너의 과발현이 사용된다. 결국 이 실시예는 상호작용의 두 파트너(APP와 PS1 또는 PS2)의 세포내 과발현으로 수득된 결과가 비-과발현 또는 내생성 단백질로 또한 유효하다는 것을 설명한다.
실시예 12. PS2는 Aβ 이외의 APP의 제 2 절편과 상호작용한다
본 실시예의 목적은 APP의 다른 절편이 PS2와 상호작용함을 설명하는 것이 다.
SecPS2NT가 세포외 배지에서 APP의 분비형과 상호작용한다는 것이 전술되었다(도 3a, 레인 4). APP의 분비형은 Aβ 펩타이드의 출발부위에 해당하는 β부위(595부위)에서, 또는 이 펩타이드 내의 α부위(612부위)에서 절단 후 방출된다. 이 결과는 PS2NT는 또한 Aβ 이외의 APP의 N-말단 부위와 상호작용한다는 것을 제시한다. APP의 절단된 형태는 정지코돈을 β부위(β-sAPP)와 α부위(α-sAPP)로 삽입함으로써 작제되고 시험된다. 전체 PS2와 SecPS2NT는 효과적으로 α-sAPP(도 15, 레인 3 및 5)와 β-sAPP(도 15, 레인 4 및 6)와 상호작용한다. 이러한 결과는 1 내지 595 사이의 APP 단편(Aβ가 아닌) 또한 PS2 및 PS2NT와 상호작용할 수 있다는 것을 보여준다. 이러한 결과는 또한 PS2NT/APP 상호작용이 두 파트너를 막에 고정시키지 않고 및 세포의 루미날(또는 세포외) 구획에서 일어날 수 있음을 확인하게 한다.
참조문헌
서열목록
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- (i) 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 갖는 프리세닐린 또는 서열번호 1 또는 2의 아미노산 1번 내지 87번을 포함하는 프리세닐린 단편과,(ii) 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 β-아밀로이드 펩타이드 전구체, 또는 서열번호 3의 아미노산 1번 내지 596번을 포함하는 상기 전구체의 단편, 또는 서열번호 3의 아미노산 1번 내지 42번의 β-아밀로이드 펩타이드(Aβ1-42)사이의 상호작용을 억제할 수 있는 화합물을 검출 또는 분리하는 방법으로서,(a) 프리세닐린 또는 이의 단편, 또는 (b) β-아밀로이드 펩타이드 전구체, 서열번호 3의 아미노산 1번 내지 596번을 포함하는 상기 전구체의 단편, 또는 서열번호 3의 아미노산 1번 내지 42번의 β-아밀로이드 펩타이드(Aβ1-42)를 표지하는 적어도 하나의 단계, 및하기 중 어느 하나의 사이의 상호작용의 억제를 검출하는 하나의 단계를 포함하는 방법.- 서열번호 3의 아미노산 1번 내지 42번의 β-아밀로이드 펩타이드(Aβ1-42)와, 프리세닐린 또는 이의 단편의 N-말단 사이; 또는- β-아밀로이드 펩타이드 전구체 전체 또는 서열번호 3의 아미노산 1번 내지 596번을 포함하는 이의 단편과, 프리세닐린 또는 이의 단편 사이.
- 제 23 항에 있어서, 상기 방법에 의해 분리된 화합물이 서열번호 3의 아미노산 1번 내지 42번의 β-아밀로이드 펩타이드(Aβ1-42)와, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 프리세닐린 또는 아미노산 1번 내지 87번을 포함하는 이의 단편의 N-말단 간의 상호작용을 억제할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 23 항 또는 제 24 항에 있어서, 하기 단계를 수행함을 특징으로 하는 방법.- 서열번호 3의 아미노산 1번 내지 42번의 β-아밀로이드 펩타이드(Aβ1-42)를 배양(incubation)에 의해 니트로셀룰로스 막에 예비흡착시키는 단계;- 프리세닐린 또는 이의 단편을 함유하는 박테리아 추출물을 분자와, 또는 각종 시험 분자를 함유하는 혼합물과의 배양을 위해 첨가하는 단계;- 니트로셀룰로스 필터상 서열번호 3의 아미노산 1번 내지 42번의 β-아밀로이드 펩타이드(Aβ1-42)와 프리세닐린 또는 이의 단편과의 상호작용을 프리세닐린-표지 단백질의 도움하에 검출하는 단계(여기에서 목적하는 화합물은 상기 상호작용을 억제하고 따라서 표지 단백질로부터의 시그널 강도를 감소시킴).
- 제 25 항에 있어서, 마커 단백질 중 하나가 알칼라인 포스파타제에 커플링된 S-tag-결합 단백질임을 특징으로 하는 방법.
- 제 23 항 또는 제 24 항에 있어서, 하기 단계를 수행함을 특징으로 하는 방법:- 서열번호 3의 아미노산 1번 내지 42번의 β-아밀로이드 펩타이드(Aβ1-42)를 96 이상의 웰의 플레이트 상에서 예비배양하는 단계,- 배양을 위해, 정제된 재조합 프리세닐린 또는 이의 단편을 분자와, 또는 각종 시험 분자를 함유하는 혼합물과 첨가하는 단계,- 세척 후, 프리세닐린 또는 이의 단편과 상기 플레이트 내 서열번호 3의 아미노산 1번 내지 42번의 β-아밀로이드 펩타이드(Aβ1-42) 사이의 상호작용을 프리세닐린-표지 단백질의 도움하에 검출하는 단계,상기 프리세닐린 또는 이의 단편과 서열번호 3의 아미노산 1번 내지 42번의 β-아밀로이드 펩타이드(Aβ1-42) 간의 상호작용의 손실은 측색 기질로 노출시킨 후, 분광측광법으로 검출한다).
- 제 27 항에 있어서, 마커 단백질 중 하나가 알칼라인 포스파타제에 커플링된 S-tag-결합 단백질이고, 상호작용 손실의 규명을 450 nm에서 수행함을 특징으로 하는 방법.
- 제 23 항 또는 제 24 항에 있어서, 하기 단계가 수행됨을 특징으로 하는 방법:- 분자 또는 각종 분자를 함유하는 혼합물을 합성된 서열번호 3의 아미노산 1번 내지 42번의 β-아밀로이드 펩타이드(Aβ1-42)와 함께, 바이오틴 및 이의 N-말단의(위치 1의 상류) 세개의 β-알라닌 또는 세개의 라이신의 아암과 접촉하여 배치시키는 단계,- 상기 반응 혼합물을 제 1 플루오로포어로 표지한 정제된 프리세닐린 또는 이의 단편과 배양하는 단계,- 제 2 플루오로포어에 커플링된 스트렙타비딘을 가하는 단계, 여기에서 이러한 제 2 플루오로포어는 제 1 플루오로포어의 방출 파장에서 여기될 수 있어 두 플루오로포어가 함께 근접해 있을 경우 형광 전달로부터 이득을 얻음,- 상호작용을 억제하는 신규 화합물의 검출이 제 1 플루오로포어의 방출 파장에서 분광형광측정법에 의해 또는 제 2 플루오로포어의 방출 파장에서 시그널의 감소를 측정함에 의해 수행되는 단계.
- 제 29 항에 있어서, 제 1 플루오로포어가 유로피움 크립테이트이고 제 2 플루오로포어가 XL665임을 특징으로 하는 방법.
- 제 30 항에 있어서, 상호작용의 손실 규명을 620 nm에서 수행하거나 665 nm에서의 시그널 감소를 측정함으로써 수행함을 특징으로 하는 방법.
- 제 23 항 또는 제 24 항에 있어서, 하기 단계를 포함하는 방법.- 혼합물을,(a) 프리세닐린 또는 이의 단편을 함유하는 세포 용해물,(b) 바이러스로 감염된 세포로부터 수득된 서열번호 3의 아미노산 서열을 가진 β-아밀로이드 펩타이드 전구체, 서열번호 3의 아미노산 1번 내지 596번을 포함하는 상기 전구체의 단편, 또는 서열번호 3의 아미노산 1번 내지 42번의 β-아밀로이드 펩타이드(Aβ1-42)를 함유하는 세포 용해물,(c) 시험 분자 또는 다양한 시험 분자를 함유하는 혼합물과 접촉하여 배치시키는 단계;- 프리세닐린, 이의 단편, 서열번호 3의 아미노산 서열을 가진 β-아밀로이드 펩타이드 전구체, 서열번호 3의 아미노산 1번 내지 596번을 포함하는 상기 전구체의 단편, 또는 서열번호 3의 아미노산 1번 내지 42번의 β-아밀로이드 펩타이드(Aβ1-42)에 상응하는 가용화 단백질을 적당한 항체의 도움하에 면역공침시키는 단계;- 프리세닐린 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 가진 β-아밀로이드 펩타이드 전구체, 서열번호 3의 아미노산 1번 내지 596번을 포함하는 상기 전구체의 단편, 또는 서열번호 3의 아미노산 1번 내지 42번의 β-아밀로이드 펩타이드(Aβ1-42)의 면역공침 손실을 표지 항체로 웨스턴 블로팅하여 규명하는 단계(여기에서 시험분자가 목적하는 억제 특성을 지니고 있음을 나타냄).
- 제 32 항에 있어서, 상기 b)의 세포 용해물은 배큘로바이러스로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.
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